NL1004948C2

NL1004948C2 - Method and device for freezing living cells, in particular sperm.

Info

Publication number: NL1004948C2
Application number: NL1004948A
Authority: NL
Inventors: Henri Woelders
Original assignee: Instituut Voor Dierhouderij En
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 1998-07-08
Also published as: WO1998030089A1; AU5499198A

Description

Titel: Werkwijze en inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma.Title: Method and device for freezing living cells, in particular sperm.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, van de in de aanhef van de hoofdconclusie beschreven soort. Een dergelijke werkwijze is bekend uit de parktijk en wordt 5 bijvoorbeeld toegepast voor het voor bewaring geschikt maken van sperma voor gebruik bij kunstmatige inseminatie en dergelijke.The invention relates to a method for freezing living cells, in particular sperm, of the type described in the preamble of the main claim. Such a method is known from the field of art and is used, for example, for making sperm suitable for storage for use in artificial insemination and the like.

Voor het kunstmatig insemineren van bijvoorbeeld runderen, varkens en mensen, wordt op daartoe geeigende 10 plaatsen sperma ingevroren voor later gebruik. Daartoe wordt steeds een groot aantal, elk een monster bevattende houders sterk afgekoeld in een invriestraject, zodanig dat de levende cellen snel worden ingevroren. Als gevolg daarvan kan ten minste een deel van de ingevroren cellen op een 15 later tijdstip weer worden ontdooid en in levende toestand worden gebruikt voor bevruchting. Op vergelijkbare wijze kunnen levende cellen voor andere doeleinden zoals bijvoorbeeld onderzoek worden opgeslagen. Daarbij is het steeds van het grootste belang dat een zo groot mogelijk 20 percentage van de levende cellen de voornoemde behandeling levend en in tact zal doorstaan. Zo is het voor het toepassen van kunstmatige inseminatie het groot belang dat een zo groot mogelijk percentage van de ingevroren spermacellen het invriezen en ontdooien overleeft en intact 25 blijft, omdat daardoor de kans op een succesvolle bevruchting wordt vergroot.For the artificial insemination of, for example, cattle, pigs and humans, semen is frozen at suitable places for later use. To this end, a large number of containers, each containing a sample, are strongly cooled in a freezing section, such that the living cells are frozen quickly. As a result, at least a portion of the frozen cells can be thawed again at a later time and used alive for fertilization. Similarly, living cells can be stored for other purposes such as, for example, research. In addition, it is always of the utmost importance that the largest possible percentage of the living cells will survive the aforementioned treatment alive and intact. For example, it is very important for the application of artificial insemination that the largest possible percentage of the frozen sperm cells survive the freezing and thawing and remain intact, because this increases the chance of a successful fertilization.

Het is bekend voor het invriezen van sperma gebruik te maken van invriesapparatuur waarbij een relatief grote hoeveelheid houders met daarin een spermamonster, 30 tegelijkertijd sterk wordt afgekoeld. Daarbij wordt in een vat waarin de houders zijn opgesteld vloeibare stikstof gevoerd, zodanig dat warmte aan de houders en het daarin opgenomen monster wordt onttrokken. De temperatuur in het vat wordt daaroij zo veel mogelijk constant gehouden. Eik 1004948 2 monster wordt vanaf een temperatuur boven 0°C snel afgekoeld tot een temperatuur van bijvoorbeeld -120°C en vervolgens opgeslagen in een opslaginrichting, voor later gebruik.It is known to use freezing equipment for freezing sperm, in which a relatively large amount of containers containing a sperm sample are simultaneously strongly cooled. Liquid nitrogen is thereby introduced into a vessel in which the containers are arranged, such that heat is extracted from the containers and the sample contained therein. The temperature in the vessel is therefore kept as constant as possible. Oak 1004948 2 sample is rapidly cooled from a temperature above 0 ° C to a temperature of, for example, -120 ° C and then stored in a storage facility for later use.

Deze bekende werkwijze heeft als nadeel dat het 5 temperatuurverloop in de houders en daarmee in elk monster sterk afhankelijk is van bijvoorbeeld het aantal houders dat in het vat wordt geplaatst, de begintemperatuur van de houders en de afkoelsnelheid. Met name deze laatste factor kan van grote invloed zijn op het temperatuurverloop in elk 10 monster. En juist dit temperatuurverloop binnen deze substantie blijkt van grote invloed op het aantal spermacellen dat de behandeling van invriezen en ontdooien intact overleeft.This known method has the drawback that the temperature trend in the containers and thus in each sample is strongly dependent on, for example, the number of containers that are placed in the vessel, the initial temperature of the containers and the cooling rate. The latter factor in particular can have a major influence on the temperature trend in every 10 samples. And it is precisely this temperature variation within this substance that appears to have a major influence on the number of sperm cells that survive the treatment of freezing and thawing intact.

Teneinde dit percentage te verhogen is voorgesteld 15 de temperatuur van het vat over het gehele invriestraject in hoge mate constant te houden, door het periodiek in werking stellen van het koelmechanisme van de invriesapparatuur; steeds wanneer de temperatuur in het vat meer dan een toegestane marge afwijkt van de gewenste temperatuur wordt 20 het koelmechanisme in werking gesteld. Bij deze bekende werkwijze wordt uitgegaan van een doorgaande temperatuurdaling van elk monster in de houders. Daarbij is de temperatuurgradiënt tijdens het invriestraject niet constant en in de houders onderling verschillend. Daardoor 25 wordt toch nog een relatief ongestuurde en daarmee ongecontroleerde afkoeling verkregen van monsters. De resultaten van een dergelijke bekende werkwijze zijn dan ook voor verbetering vatbaar.In order to increase this percentage, it has been proposed to keep the temperature of the vessel to a high degree constant over the entire freezing range, by periodically activating the cooling mechanism of the freezing equipment; the cooling mechanism is actuated whenever the temperature in the vessel deviates by more than a permitted margin from the desired temperature. This known method assumes a continuous temperature drop of each sample in the containers. The temperature gradient is not constant during the freezing range and differs in the holders. As a result, a relatively uncontrolled and thus uncontrolled cooling of samples is still obtained. The results of such a known method can therefore be improved.

De uitvinding beoogt een werkwijze van de beschreven 30 soort, waarbij de genoemde nadelen zijn vermeden, met behoud van de voordelen daarvan. Daartoe wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens de hoofdconclusie.The invention contemplates a method of the type described, wherein the drawbacks mentioned are avoided, while the advantages thereof are retained. For this purpose, a method according to the invention is characterized by the measures according to the main claim.

In deze aanvrage dient het begrip temperatuur-35 gradiënt ten minste te worden geacht te omvatten een verandering van de temperatuur in de tijd (°C/min). Deze kan bijvoorbeeld worden verkregen door verandering van de 1004948 3 temperatuur bij een stilstaande houder, verplaatsing van een houder langs een traject met afnemende temperatuur of een combinatie daarvan. Ook op andere wijzen kan een temperatuurgradiënt worden verkregen.In this application, the term temperature gradient should at least be understood to include a change in temperature over time (° C / min). It can be obtained, for example, by changing the temperature 1004948 3 at a stationary container, moving a container along a decreasing temperature range or a combination thereof. A temperature gradient can also be obtained in other ways.

5 De uitvinding berust op het verrassende inzicht dat sturing van de temperatuurgradiënt tijdens ten minste het optreden van kristallisatie in een levende cellen bevattend monster van grote invloed is op de resultaten daarvan. Uit onderzoek van aanvraagster is gebleken dat wanneer tijdens 10 de kristallisatie in een monster temperatuurstijging in het monster slechts in relatief geringe mate, bij voorkeur niet wordt tegengegaan een betere overlevingskans geboden wordt voor de in te vriezen en later te ontdooien levende cellen, welke cellen dan bovendien een grotere levendigheid 15 vertonen.The invention is based on the surprising insight that control of the temperature gradient during at least the occurrence of crystallization in a living cell-containing sample has a major influence on the results thereof. Research by the applicant has shown that if during crystallization in a sample the temperature rise in the sample is only slightly reduced, preferably it is not prevented that a better chance of survival is offered for the living cells to be frozen and subsequently thawed, which cells then moreover, exhibit greater vibrancy.

Met name voor sperma is het toestaan van een slechts geringe temperatuurstijging tijdens het optreden van kristallisatie van bijzonder belang omdat daardoor tijdens gebruik voor inseminatie een betere kans op bevruchting 20 wordt verkregen. Doordat een hoger percentage van de spermacellen intact overleeft kan met een kleiner aantal zaadcellen per houder worden volstaan, zodat een groter aantal houders uit één ejaculaat kan worden verkregen.For sperm in particular, allowing only a slight rise in temperature during the occurrence of crystallization is of particular importance because it provides a better chance of fertilization during use for insemination. Because a higher percentage of the sperm survives intact, a smaller number of sperm per container suffices, so that a larger number of containers can be obtained from one ejaculate.

Bovendien is voor de gebruikers van de inhoud van 25 een houder de kans dat een succesvolle bevruchting wordt verkregen groter, zodat de kans dat de procedure dient te worden herhaald kleiner is, hetgeen betekent dat uit kostenoverweging een werkwijze volgens de uitvinding voor zowel de gebruiker als de aanbieder van het sperma voordelig 30 kan zijn. Met name voor sperma van individueel als bijzonder geschikt geachte donoren, zoals bijvoorbeeld een specifieke partner is dit van groot belang dat de kans op een succesvolle bevruchting maximaal is.Moreover, for the users of the contents of a container, the chance that a successful fertilization is obtained is greater, so that the chance that the procedure has to be repeated is smaller, which means that, for reasons of cost, a method according to the invention for both the user and the semen provider may be beneficial. In particular for sperm from donors individually considered to be particularly suitable, such as a specific partner, this is of great importance that the chance of successful fertilization is maximized.

Anders dan bij de bekende werkwijzen wordt bij een 35 werkwijze volgens de uitvinding derhalve gebruik gemaakt van het verrassende inzicht dat een zogenaamde kristallisatie-pauze tijdens het invriestraject, waarbij derhalve niet 1004948 4 wordt uitgegaan van een voortdurend dalend temperatuur-verloop over het gehele invriestraject, een aanmerkelijke verbetering van het resultaat oplevert.Contrary to the known methods, in a method according to the invention use is therefore made of the surprising insight that a so-called crystallization pause during the freezing range, whereby it is therefore not assumed that a continuously decreasing temperature trend over the entire freezing range, provides a significant improvement in the result.

Zodra kristallisatie start zal de temperatuur in de 5 betreffende cellen of delen van het monster naar het voor de betreffende oplossing geldende vriespunt verschuiven. Zolang de kristallisatie niet althans grotendeels volledig is kan de temperatuur in de houder niet, althans nagenoeg niet van buiten af worden beïnvloed, anders dan door het op gang 10 houden van de kristallisatie. Bij de bekende werkwijzen en inrichtingen wordt steeds ook tijdens het optreden van de kristallisatie de omgevingstemperatuur verder verlaagd, wordt doorgekoeld. Verrassenderwijs is gebleken dat deze omgevingstemperatuur tijdens het kristalliseren juist niet 15 of slechts minimaal moet dalen, teneinde te grote temperatuurverschillen tussen de inhoud van de houder en de omgeving te verhinderen. Als dit verschil te groot wordt kunnen grote spatiële verschillen optreden in de voortgang van de kristallisatie, bijvoorbeeld tussen een zone nabij de 20 buitenwand van de houder en een zone in het hart van de houder. Dergelijke ongewenste verschillen zullen tevens ongewenste verschillen in afkoelsnelheid veroorzaken. Bovendien heeft een tijdens de kristallisatie doorgezette afkoeling van de omgeving tot gevolg dat wanneer de 25 kristallisatie volledig is het temperatuurverschil tussen de houder en de omgeving onaanvaardbaar groot is, met als gevolg dat de daarop volgende afkoeling te snel verloopt.As soon as crystallization starts, the temperature in the relevant cells or parts of the sample will shift to the freezing point applicable for the respective solution. As long as the crystallization is not at least largely complete, the temperature in the container cannot be influenced, at least substantially from the outside, other than by keeping the crystallization going. In the known methods and devices, the ambient temperature is further lowered during the crystallization, and cooling is continued. Surprisingly, it has been found that this ambient temperature should not drop to a minimum or only minimal during crystallization, in order to prevent excessive temperature differences between the contents of the container and the environment. If this difference becomes too large, large spatial differences can occur in the progress of the crystallization, for example between a zone near the outer wall of the container and a zone in the center of the container. Such undesired differences will also cause undesired differences in cooling rate. In addition, an ambient cooling continued during the crystallization results in that when the crystallization is complete, the temperature difference between the container and the environment is unacceptably large, with the result that the subsequent cooling proceeds too quickly.

Tijdens het afkoelen dient met name nabij het vriespunt c.q. -traject van de oplossing ijsvorming binnen 30 de cellen (intracellulaire ijsvorming) te worden verhinderd daar dit dodelijk is voor de betreffende cellen. De oorzaak dat dit wordt voorkomen is een efflux van water uit de cel, dat wil zeggen door het celmembraan wegstromen naar de omgeving. Daardoor daalt de waterconcentratie in de cel, dat 35 wil zeggen het aandeel water in het celvolume wordt minder, waardoor het vriespunt daalt.During cooling, ice formation within the cells (intracellular ice formation), in particular near the freezing point or range of the solution, should be prevented as this is lethal for the cells concerned. The cause of this is prevented is an efflux of water from the cell, that is to say flow away through the cell membrane to the environment. As a result, the water concentration in the cell decreases, ie the share of water in the cell volume decreases, so that the freezing point falls.

1004948 51004948 5

Bij te hoge afkoelsnelheden zal de efflux van water zeer snel plaatsvinden, hetgeen op zichzelf reeds ongunstig lijkt voor de cellen. Bovendien bestaat een grote kans dat de water-efflux, relatief ten opzichte van de 5 afkoelsnelheid, daarbij niet snel genoeg plaatsvindt, dat wil zeggen dat de daling van het vriespunt daarbij minder snel verloopt dan de daling van de temperatuur. De temperatuur komt daardoor ver onder het vriespunt waardoor toch intracellulair ijs ontstaat.At too high cooling rates, the efflux of water will occur very quickly, which in itself already seems unfavorable for the cells. Moreover, there is a great chance that the water efflux, relative to the cooling rate, does not take place fast enough, that is to say that the drop in the freezing point proceeds less quickly than the drop in temperature. As a result, the temperature falls well below freezing point, which still creates intracellular ice.

10 Bij te lage afkoelsnelheden treedt juist het omgekeerde effect op. De ijskristallisatie buiten de cellen (intercellulair) en de efflux van water uit de cellen kunnen rustig verlopen, zodat deze processen nabij het thermodynamisch evenwicht zullen geraken. Dit evenwicht ligt 15 bij een zeer lage waterconcentratie in de cellen. Zowel intercellulair als intracellulair zal de dehydratie derhalve zeer snel optreden. De dehydratie en zout- en metaboliet-concentraties in de cellen worden daarbij zodanig hoog dat de cellen daardoor worden beschadigd. Bovendien raken de 20 cellen vervormd door afname van het volume, en beschadigd door de snel groeiende intercellulaire ijskristallen. Verder verblijven de cellen bij een te lage invriessnelheid te lang in de instabiele toestand. Pas bij zeer lage temperaturen, bijvoorbeeld onder -80°C zullen geen (bio)chemische reacties 25 of fysische transities meer plaatsvinden.10 When the cooling rates are too low, the opposite effect occurs. The ice crystallization outside the cells (intercellular) and the efflux of water from the cells can proceed smoothly, so that these processes will approach the thermodynamic equilibrium. This equilibrium is at a very low water concentration in the cells. Dehydration will therefore occur very quickly both intercellular and intracellular. The dehydration and salt and metabolite concentrations in the cells thereby become so high that the cells are damaged thereby. In addition, the 20 cells become deformed due to the decrease in volume and damaged by the rapidly growing intercellular ice crystals. Furthermore, at too low a freezing rate, the cells remain in the unstable state for too long. Only at very low temperatures, for instance below -80 ° C, no (bio) chemical reactions or physical transitions will take place anymore.

Door een geschikte keuze van het temperatuurprofiel tijdens het afkoeltraject, kan steeds een zodanige momentane afkoelsnelheid worden gerealiseerd dat de bovengenoemde nadelen worden vermeden. Een dergelijke sturing van het 30 temperatuurverloop is bijzonder goed mogelijk door gebruik van een inrichting volgens de uitvinding.By a suitable choice of the temperature profile during the cooling range, such a momentary cooling speed can always be realized that the above-mentioned drawbacks are avoided. Such a control of the temperature variation is particularly well possible by using an apparatus according to the invention.

In een nadere uitwerking wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 3.In a further elaboration, a method according to the invention is characterized by the measures according to claim 3.

35 Door in het eerste en derde koeltraject relatief snel te koelen, terwijl in het tweede traject de temperatuur op de kristallisatie wordt afgestemd en nagenoeg constant 1004948 6 wordt gehouden, worden condities verkregen voor het invriezen van een een hoeveelheid levende cellen bevattend monster, of althans delen daarvan, die een nog betere kans op het intact overleven van de werkwijze bieden en derhalve 5 bijvoorbeeld een nog betere kans bieden op een succesvolle bevruchting via kunstmatige inseminatie.By cooling relatively quickly in the first and third cooling stages, while in the second stage the temperature is adjusted to the crystallization and is kept virtually constant 1004948 6, conditions are obtained for freezing a sample containing a quantity of living cells, or at least parts thereof, which offer an even better chance of intact survival of the method and therefore, for example, offer an even better chance of a successful fertilization via artificial insemination.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 5.In a preferred embodiment, a method according to the invention is characterized by the measures according to claim 5.

10 Het optreden van kristallisatie, in het bijzonder de aanvang daarvan in de houders is een proces dat in hoofdzaak afhankelijk is van toeval, bijvoorbeeld van toevallig in de substantie aanwezige kristallisatiekernen. Door het plaatselijk gedurende relatief korte tijd sterk onderkoelen 15 van een gedeelte van het monster wordt kristallisatie actief op gang gebracht aan het begin van het tweede koeltraject.The occurrence of crystallization, in particular the initiation thereof in the containers, is a process which mainly depends on chance, for example on crystallization nuclei that are present in the substance. By strongly subcooling part of the sample locally for a relatively short period of time, crystallization is actively initiated at the beginning of the second cooling section.

Feitelijk wordt daarmee het begin van het tweede koeltraject bepaald waardoor het voordeel wordt bereikt dat sturing van de temperatuur in de houders en in elk monster daarmee beter 20 kan worden geregeld, waardoor een verdere verbetering van de resultaten van de werkwijze wordt verkregen. Juist doordat het begin van het tweede koeltraject, dat de kristallisatiepauze omvat, in tegenstelling tot bij de bekende werkwijzen is vastgelegd kan de omgevingstemperatuur 25 tijdens de gehele kristallisatiepauze goed gestuurd, in het bijzonder nagenoeg constant worden gehouden.In fact, this determines the start of the second cooling range, whereby the advantage is achieved that control of the temperature in the containers and in each sample can thereby be better controlled, whereby a further improvement of the results of the process is obtained. Precisely because the start of the second cooling section, which comprises the crystallization pause, is fixed in contrast to the known methods, the ambient temperature can be kept well controlled, in particular practically constant, throughout the crystallization pause.

In een bijzonder voordelige uitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 8.In a particularly advantageous embodiment, a method according to the invention is further characterized by the measures according to claim 8.

30 Bij een dergelijke werkwijze kunnen de monsters met name tijdens het derde koeltraject relatief snel worden afgekoeld doordat de kristallisatie relatief rustig verloopt. Dit maakt dat de afkoelsnelheid in met name het derde koeltraject minder kritisch is en eventueel hoger kan 35 liggen dan bij de bekende werkwijze.In such a method, the samples can be cooled relatively quickly, especially during the third cooling section, because the crystallization proceeds relatively quietly. This means that the cooling speed, in particular in the third cooling range, is less critical and can possibly be higher than in the known method.

Een werkwijze volgens de uitvinding is met name geschikt voor het invriezen van rundersperma, in het 1004948 7 bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 9, voor invriezen van berensperma (boar sperm), in het bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 10 en voor het invriezen van menselijk sperma, in 5 het bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 11.A method according to the invention is particularly suitable for freezing bovine semen, in particular using the measures according to claim 9, for freezing bear semen (boar sperm), in particular using the measures according to claim 10 and for freezing human sperm, in particular using the measures according to claim 11.

In een verdere voordelige uitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 12.In a further advantageous embodiment, a method according to the invention is further characterized by the measures according to claim 12.

10 Bij de bekende werkwijze is het gebruikelijk het of elk monster, voorafgaand aan het eigenlijke invriezen, voor te koelen tot een temperatuur van ongeveer 5°C of minder. Algemeen wordt aangenomen dat dit noodzakelijk is om een goed resultaat te verkrijgen en dat bij een hogere 15 begintemperatuur de overlevingskansen en de levendigheid van de cellen in te hoge mate nadelig worden beïnvloed. Uit onderzoek van aanvraagster is verrassenderwijze gebleken dat, met name maar niet uitsluitend voorafgaand aan een invriestraject volgens de uitvinding, een in te vriezen 20 monster minder dient te worden afgekoeld. Een monster wordt derhalve bij een hogere begintemperatuur, bijvoorbeeld tussen 5 en 18°C, meer in het bijzonder tussen 9 en 15°C aan een inrichting voor het doorvoeren van een invriestraject volgens de uitvinding toegevoerd. Het verdient daarbij de 25 voorkeur dat, althans bij invriezen van een spermamonster, deze voorkoeltemperatuur ongeveer 13°C bedraagt. Het zal duidelijk zijn dat deze exacte temperatuur afhankelijk van de soort in te vriezen cellen kan worden geoptimaliseerd. Deze optima zijn daarbij uiteraard mede, in belangrijke 30 mate, afhankelijk van de samenstelling van de oplossing, vloeistof of suspensie waarin het monster, althans de cellen zijn opgenomen.In the known method it is customary to pre-cool the or each sample to a temperature of about 5 ° C or less prior to the actual freezing. It is generally believed that this is necessary to obtain a good result and that at a higher initial temperature the chances of survival and the vividness of the cells are unduly affected. Research by the applicant has surprisingly shown that, in particular, but not exclusively prior to a freezing path according to the invention, a sample to be frozen must be cooled less. A sample is therefore fed at a higher initial temperature, for example between 5 and 18 ° C, more in particular between 9 and 15 ° C, to a device for carrying through a freezing path according to the invention. It is preferred that, at least when a sperm sample is frozen, this pre-cooling temperature is about 13 ° C. It will be clear that this exact temperature can be optimized depending on the type of cells to be frozen. These optima are of course partly to an important extent dependent on the composition of the solution, liquid or suspension in which the sample, at least the cells, are contained.

De uitvinding heeft voorts betrekking op de toepassing van een kristallisatiepauze tijdens het invriezen 35 van een aantal levende cellen bevattende monsters, gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 13, en op de toepassing van een voorkoeling van ten minste één levende 1004948 8 cellen bevattend monster, voorafgaand aan een invrieswerkwijze voor het of elk monster, zoals gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 14.The invention further relates to the use of a crystallization pause during freezing of a number of living cell-containing samples, characterized by the measures according to claim 13, and the use of a pre-cooling of at least one living 1004948 8-cell sample, prior to to a freezing method for the or each sample, as characterized by the features of claim 14.

De uitvinding heeft bovendien betrekking op een 5 inrichting voor het invriezen van levende cellen bevattende monsters, in het bijzonder spermamonsters, welke inrichting in het bijzonder geschikt is voor gebruik bij een werkwijze volgens de uitvinding en wordt gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 15.The invention furthermore relates to a device for freezing samples containing living cells, in particular sperm samples, which device is particularly suitable for use in a method according to the invention and is characterized by the features according to claim 15.

10 Een dergelijke inrichting maakt het op bijzonder eenvoudige en nauwkeurige wijze mogelijk de tenmperatuur van de houders en daarin opgenomen monsters te sturen tijdens het verblijf daarvan in de inrichting. Daardoor kunnen bij elk soort monsters optimale resultaten worden bereikt door 15 afstemming van een afkoelprotocol op onder meer de soort cellen, de overige inhoud van de houders, de begintemperatuur en de gewenste eindtemperatuur van de houders en de monsters en het aantal tegelijkertijd in de inrichting aanwezige monsters.Such a device makes it possible in a particularly simple and accurate manner to control the temperature of the containers and samples contained therein during their residence in the device. As a result, optimal results can be achieved for each type of sample by adapting a cooling protocol to, inter alia, the type of cells, the other contents of the containers, the initial temperature and the desired final temperature of the containers and the samples and the number of simultaneously present in the device. monsters.

20 Alternatieve uitvoeringsvormen van werkwijzen en inrichtingen volgens de uitvinding zijn beschreven in de overige conclusies en de beschrijving.Alternative embodiments of methods and devices according to the invention are described in the other claims and the description.

Ter verduidelijking van de uitvinding zal een uitvoeringsvoorbeeld van een inrichting, te zamen met 25 voorbeelden van werkwijzen, onder verwijzing naar de tekening, worden beschreven, daarin toont: fig. 1 een inrichting volgens de uitvinding, schematisch, in doorgesnede zij-aanzicht; fig. 2 een alternatieve inrichting volgens de 30 uitvinding, schematisch, in doorgesneden zij-aanzicht en vooraanzicht; fig. 3 een tijd-temperatuurprotocol voor het invriezen van rundersperma, zoals beschreven in voorbeeld I; fig. 4 een tijd-temperatuurprotocol voor het 35 invriezen van berensperma (boar sperm), zoals beschreven in voorbeeld II; 1004948 9 fig. 5 een tijd-temperatuurprotocol voor het invriezen van menselijk sperma, zoals beschreven in voorbeeld III.To clarify the invention, an exemplary embodiment of a device will be described, together with examples of methods, with reference to the drawing, in which: Fig. 1 shows a device according to the invention, schematically, in cross-sectional side view; fig. 2 shows an alternative device according to the invention, schematically, in cross-sectional side view and front view; FIG. 3 is a time-temperature protocol for freezing bovine semen as described in Example I; FIG. 4 is a time-temperature protocol for freezing bear sperm (boar sperm), as described in Example II; 1004948 9 Figure 5 is a time-temperature protocol for freezing human sperm, as described in Example III.

Een inrichting volgens fig. 1 omvat een blok 2, 5 vervaardigd uit warmtegeleidend materiaal zoals metaal, bijvoorbeeld aluminum, koper of legeringen daarvan, waarin een aantal koelleidingen 5 is opgenomen. De koelleidingen 5 zijn via een aantal regelkleppen 7 aangesloten op een aanvoerleiding 6 voor een koelmiddel, bijvoorbeeld vloeibaar 10 stikstof. In het oppervlak 3 van het blok 2 zijn temperatuurmeetmiddelen 8 opgenomen, aangesloten op een centrale regeleenheid 10. Met behulp van de centrale regeleenheid 10 kunnen de regelkleppen 7 worden aangestuurd voor het door de koelleidingen 5 voeren van een hoeveelheid 15 koel-medium afgestemd op de op dat moment gewenste temperatuur van het oppervlak 3, afhankelijk van de gemeten temperatuur. Daarmee kan een in de centrale regeleenheid 10 ingevoerd koelprotocol KP, afgestemd op de te koelen levende cellen, worden overgebracht op het blok 2 en daarmee op 20 daarop geplaatste houders 16.A device according to Fig. 1 comprises a block 2, 5 made of a heat-conducting material such as metal, for instance aluminum, copper or alloys thereof, in which a number of cooling pipes 5 are included. The cooling pipes 5 are connected via a number of control valves 7 to a supply pipe 6 for a coolant, for example liquid nitrogen. Temperature measuring means 8, which are connected to a central control unit 10, are included in the surface 3 of the block 2. With the aid of the central control unit 10, the control valves 7 can be actuated for passing a quantity of cooling medium through the cooling pipes 5, adapted to the desired temperature of the surface 3 at that moment, depending on the measured temperature. Thus, a cooling protocol KP introduced in the central control unit 10, adapted to the living cells to be cooled, can be transferred to block 2 and thus to containers 16 placed thereon.

Over het bovenvlak 3 van het blok 2 is een dunne, flexibele en thermisch isolerende film 17 aangebracht, bijvoorbeeld HDPE- of PTFE-film. Deze film 17 isoleert de houders 16 van de omgeving en vormt te zamen met het blok 2 25 voor een gesloten behuizing 18. Het verdient daarbij de voorkeur dat het verdampende medium in de richting van de invoerzijde 119, dat wil zeggen het warmste einde van de inrichting stroomt, zodat de houders daardoor niet onbedoeld weer worden opgewarmd. Bovendien zal eventuele lucht binnen 30 de inrichting de neiging vertonen in de bewegingsrichting van de houders 16 mee te stromen. Het is daarom voordelig de stikstof in hoofdzaak in tegengestelde richting te doen stromen voor het verdringen van die lucht. Door een relatief klein deel van de stikstof echter met de houders 116 mee te 35 laten bewegen wordt ook de lucht nabij het koude einde van de inrichting verdreven.A thin, flexible and thermally insulating film 17 is applied over the top surface 3 of the block 2, for example HDPE or PTFE film. This film 17 isolates the containers 16 from the environment and together with the block 2 forms 25 for a closed housing 18. It is thereby preferred that the evaporating medium is directed towards the inlet side 119, that is to say the hottest end of the device flows, so that the containers are not accidentally heated up again. Moreover, any air within the device will tend to flow in the direction of movement of the holders 16. It is therefore advantageous to cause the nitrogen to flow substantially in the opposite direction to displace that air. However, by allowing a relatively small part of the nitrogen to move with the holders 116, the air near the cold end of the device is also expelled.

1004948 101004948 10

Tijdens gebruik ligt een aantal houders 16 op het oppervlak 3, zodanig dat de houders 16 met een deel van het buitenoppervlak daartegen aanliggen, zoals duidelijk blijkt uit fig. 1. In het getoonde uitvoeringsvoorbeeld worden de 5 houders 16 gevormd door kunststof foliezakjes, waarin een monster is opgenomen. Elk monster omvat een aantal levende, in te vriezen cellen, in het bijzonder sperma, in een hoeveelheid oplosvloeistof.During use, a number of holders 16 lie on the surface 3, such that the holders 16 abut against it with a part of the outer surface, as is clear from Fig. 1. In the exemplary embodiment shown, the 5 holders 16 are formed by plastic foil bags, in which a sample is included. Each sample comprises a number of live cells to be frozen, especially sperm, in an amount of solvent.

De houders 16 liggen in rijen en kolommen in de vorm 10 van een matrix op het blok 2, stationair ten opzichte van de inrichting en van elkaar. De houders kunnen eventueel tegen elkaar zijn gelegen doch de voorkeur verdient dat de houders met enige onderlinge afstand van elkaar zijn geplaatst, zodat zij elkaar tijdens het afkoelen niet beïnvloeden.The containers 16 lie in rows and columns in the form of a matrix on the block 2, stationary with respect to the device and from each other. The containers can optionally be located against each other, but it is preferable that the containers are placed at some mutual distance from each other, so that they do not influence each other during cooling.

15 Figuur 2 toont een alternatieve uitvoeringsvorm van een inrichting 101 volgens de uitvinding. Gelijke delen hebben daarbij corresponderende verwijzingscijfers.Figure 2 shows an alternative embodiment of a device 101 according to the invention. Equal parts have corresponding reference numerals.

Een inrichting 101 volgens fig. 2 omvat een blok 102, vervaardigd uit warmtegeleidend materiaal, bijvoorbeeld 20 aluminium of een aluminiumlegering. Het blok 102 heeft een ten opzichte van zijn breedte B een grote lengte L, terwijl de dikte D relatief klein is. De bovenzijde 103 van het blok 102 is voorzien van een reeks evenwijdige, zich in de lengterichting uitstrekkende groeven 104, waarvan het doel 25 en de uitvoeringsvorm nog nader zullen worfden toegelicht.A device 101 according to Fig. 2 comprises a block 102 made of heat-conducting material, for example aluminum or an aluminum alloy. The block 102 has a great length L relative to its width B, while the thickness D is relatively small. The top 103 of the block 102 is provided with a series of parallel, longitudinally extending grooves 104, the purpose of which and the embodiment will be explained in more detail.

Door het blok 102 strekt zich onder het bovenvlak 3 een aantal koelleidingen 105 uit, in hoofdzaak dwars op de lengterichting van het blok 102, over de volle breedte B daarvan. Een aantal naast elkaar gelegen koelleidingen 105 30 is steeds gezamenlijk verbonden met een aanvoerleiding 106 voor een koelmedium, bijvoorbeeld vloeibare stikstof. In elke aanvoerleiding is een regelklep 107 opgenomen voor het doseren van de hoeveelheid koelmedium die door de betreffende koelleidingen 105 wordt geleid. De regelklep 107 35 wordt gestuurd door een in het oppervlak 103 ter hoogte van de betreffende koelleidingen 105 aangebrachte thermostaat of andersoortige temperatuurmeetmiddelen 108. De koelleidingen 1004948 11 105 die te zamen door één aanvoerleiding 106 en één regelklep worden gevoed vormen te zamen één koelstation 109, waarin de temperatuur wordt geregeld op basis van signalen van de bijbehorende temperatuurmeetmiddelen 108. In de 5 getoonde uitvoeringsvorm is een negental van dergelijke koelstations 109A-109I in de lengterichting van het blok 102 gezien achter elkaar aangebracht.Through the block 102, a number of cooling pipes 105 extends, substantially transverse to the longitudinal direction of the block 102, under the top surface 3, over the full width B thereof. A number of adjacent cooling pipes 105 are always jointly connected to a supply pipe 106 for a cooling medium, for example liquid nitrogen. A control valve 107 is included in each supply line for dosing the amount of cooling medium which is passed through the respective cooling lines 105. The control valve 107 35 is controlled by a thermostat or other temperature measuring means 108 arranged in the surface 103 at the level of the relevant cooling lines 105. The cooling lines 1004948 11 105, which are fed together by one supply line 106 and one control valve, together form one cooling station 109, wherein the temperature is controlled on the basis of signals from the associated temperature measuring means 108. In the embodiment shown, nine of such cooling stations 109A-109I are arranged one behind the other in the longitudinal direction of the block 102.

De temperatuurmeetmiddelen 108 zijn gezamenlijk instelbaar met behulp van een centrale regeleenheid 110, met 10 behulp waarvan de gewenste temperatuur in elk koelstation 109 kan worden ingesteld, zodanig dat een gewenst temperatuurprofiel over het blok 102 kan worden verkregen. Dit gewenste temperatuurprofiel zal nog nader worden toegelicht.The temperature measuring means 108 are jointly adjustable by means of a central control unit 110, by means of which the desired temperature can be set in each cooling station 109, such that a desired temperature profile can be obtained over the block 102. This desired temperature profile will be further elucidated.

15 De inrichting is voorzien van een aandrijfinrichting 112, omvattende een ketting of band 14 met zich over het bovenvlak 103 van het blok 102, over de groeven 4 uitstrekkende duwstangen 115.The device is provided with a drive device 112, comprising a chain or belt 14 with push rods 115 extending over the top surface 103 of the block 102, over the grooves 4.

Ook de inrichting 101 volgens fig. 2 is afgedekt 20 door een isolerende afdekfilm 117. Deze inrichting 101 is met name geschikt voor gebruik in samenwerking met monsters welke zijn opgenomen in langwerpige rietjes, vervaardigd uit kunststof. De koelkanalen 105 monden aan bijvoorbeeld de van de aanvoerleiding 106 afgekeerde zijde of door kleine 25 doorgangen naar het oppervlak 103 uit onder de film 117, binnen de genoemde behuizing 118. Bij het verlaten van de koelleidingen 105 verdampt de vloeibare stikstof en verdringt alle lucht uit de behuizing 18 of althans tussen de film 117 en het oppervlak 103 van het blok 102. Daardoor 30 wordt verhinderd dat condensatie optreedt binnen de behuizing 118, welke condensatie thermisch ongunstig zou zijn. Het verdient daarbij de voorkeur dat het verdampende medium in de richting van de invoerzijde 119, dat wil zeggen het warmste einde van de inrichting stroomt, zodat de 35 houders daardoor niet onbedoeld weer worden opgewarmd. Bovendien zal eventuele lucht binnen de inrichting de neiging vertonen in de bewegingsrichting van de houders 16 1004948 12 mee te stromen. Het is daarom voordelig de stikstof in hoofdzaak in tegengestelde richting te doen stromen voor het verdringen van die lucht. Door een relatief klein deel van de stikstof echter met de houders 116 mee te laten bewegen 5 wordt ook de lucht nabij het koude einde van de inrichting verdreven.The device 101 according to Fig. 2 is also covered by an insulating cover film 117. This device 101 is particularly suitable for use in conjunction with samples contained in elongated straws made of plastic. The cooling channels 105, for example on the side remote from the supply line 106 or through small passages to the surface 103, open out under the film 117, within said housing 118. When leaving the cooling lines 105, the liquid nitrogen evaporates and all air displaces out the housing 18 or at least between the film 117 and the surface 103 of the block 102. Thereby, condensation is prevented from occurring within the housing 118, which condensation would be thermally unfavorable. It is preferred that the evaporating medium flows in the direction of the inlet side 119, that is to say the warmest end of the device, so that the containers are not unintentionally reheated thereby. In addition, any air within the device will tend to flow in the direction of movement of the holders 16 1004948 12. It is therefore advantageous to cause the nitrogen to flow substantially in the opposite direction to displace that air. However, by allowing a relatively small part of the nitrogen to move with the holders 116, the air near the cold end of the device is also expelled.

Inrichtingen volgens fig. 1 en 2 zijn nader beschreven in de door aanvraagster mee ingediende (co-pending) Nederlandse octrooiaanvrage getiteld 10 "Invriesinrichting". Deze aanvrage wordt geacht hierin door verwijzing te zijn opgenomen.Devices according to Figs. 1 and 2 are further described in the co-pending Dutch patent application entitled 10 "Freezing device", co-pending by the applicant. This application is deemed to be incorporated herein by reference.

Tijdens gebruik ligt een aantal houders 16 in de groeven 4, zodanig dat de houders 16 met een deel van het buitenoppervlak aanliggen tegen het binnenoppervlak van de 15 groeven 4, zoals duidelijk blijkt uit fig. 2. In het getoonde uitvoeringsvoorbeeld worden de houders 16 gevormd door dunwandige rietjes, waarin een monster is opgenomen.During use, a number of holders 16 lie in the grooves 4, such that the holders 16 bear a part of the outer surface against the inner surface of the grooves 4, as is clear from Fig. 2. In the exemplary embodiment shown, the holders 16 are formed through thin-walled straws, in which a sample is contained.

Elk monster omvat een aantal levende, in te vriezen cellen, in het bijzonder sperma, in een hoeveelheid oplosvloeistof. 20 De rietjes liggen in de lengterichting naast elkaar, waarbij steeds een duwstang 15 aanligt tegen het in bewegingsrichting achterliggende einde van de houders 16. Tijdens het aandrijven van de aandrijfinrichting 12 worden de houders derhalve in de lengterichting door de groeven 4 bewogen 25 tussen de beide einden van het blok 2, daarbij innig contact makend met het oppervlak 3 van het blok 2, in het bijzonder de binnenzijde van de groeven 4.Each sample comprises a number of live cells to be frozen, especially sperm, in an amount of solvent. The straws lie in the longitudinal direction next to each other, whereby a push rod 15 always rests against the end of the holders 16 lying in the direction of movement. During the driving of the drive device 12, the holders are therefore moved longitudinally through the grooves 4 between the two ends of the block 2, thereby making intimate contact with the surface 3 of the block 2, in particular the inside of the grooves 4.

Bij deze inrichting wordt een temperatuurprofiel over het oppervlak (of de gezamenlijke oppervlakken) 30 aangelegd, zodanig dat bij transport van de houders over het of elk oppervlak de houders in de richting van het koudste einde worden gevoerd. Het verdient daarbij de voorkeur een constante aandrijfsnelheid in te stellen, waarbij het temperatuurprofiel tezamen met de aandrijving zorgt voor het 35 verkrijgen van het gewenste afkoelprotocol. Met name is daarbij van belang dat het tweede (of althans een tussengelegen) koelstation 109b een zeer kleine spatiële 1004948 13 temperatuurgradiënt heeft, bijvoorbeeld een constante temperatuur over zijn gehele oppervlak. Daardoor wordt automatisch het tweede koeltraject verkregen, meer in het bijzonder de gewenste kristallisatiepauze.In this device, a temperature profile is applied over the surface (or the joint surfaces) 30, such that when the containers are transported over the or each surface, the containers are guided towards the coldest end. It is preferred to set a constant drive speed, the temperature profile together with the drive ensuring the desired cooling protocol. In particular, it is important here that the second (or at least an intermediate) cooling station 109b has a very small spatial temperature gradient, for example a constant temperature over its entire surface. As a result, the second cooling section is obtained automatically, more particularly the desired crystallization pause.

5 Een inrichting volgens de uitvinding omvat ten minste één contactvlak waarvan de temperatuur regelbaar is met behulp van koel- en/of verwarmingsmiddelen. Een contactvlak dient in deze te worden begrepen als een oppervlak dat door direct of althans nagenoeg direct contact de tempera-10 tuur van houders kan beïnvloeden. Daarbij kan de temperatuur van het of elk contactvlak zelf bijvoorbeeld door contact met een koel medium, door convectie of door straling worden geregeld, waarbij de of elke houder kan aan liggen tegen het contactvlak of bijvoorbeeld op zeer geringe afstand daarvan 15 kan liggen, bijvoorbeeld gedragen door een film van koelmedium.A device according to the invention comprises at least one contact surface, the temperature of which is adjustable with the aid of cooling and / or heating means. A contact surface is to be understood herein as a surface which can influence the temperature of containers by direct or at least almost direct contact. The temperature of the or each contact surface itself can herein be controlled, for example by contact with a cool medium, by convection or by radiation, the or each holder being able to lie against the contact surface or, for example, be located at a very small distance therefrom, for example carried through a film of cooling medium.

Overigens kan een werkwijze volgens de uitvinding ook met andersoortige inrichtingen worden toegepast, bijvoorbeeld een inrichting omvattende middelen voor het 20 door direct contact tusen vloeibare, althans verdampende stikstof of andere vloeistoffen of gassen koelen van de houders.Incidentally, a method according to the invention can also be used with other devices, for instance an device comprising means for cooling the containers by direct contact between liquid, at least evaporating nitrogen or other liquids or gases.

Dergelijke inrichtingen maken een exacte sturing van de omgevingstemperaturen echter minder eenvoudig mogelijk.Such devices, however, make precise control of the ambient temperatures less easy.

25 Toepassingen van inrichtingen volgens de uitvinding voor het uitvoeren van werkwijzen volgens de uitvinding zullen in een aantal voorbeelden worden toegelicht, welke voorbeelden geenszins als beperkend dienen te worden uitgelegd.Applications of devices according to the invention for carrying out methods according to the invention will be elucidated in a number of examples, which examples should in no way be construed as limiting.

3030

Voorbeeld IExample I

Sperma van vijf ongeselecteerde stieren werd opgevangen in een KI-station van de Faculteit der Diergeneeskunde, 35 Universiteit Utrecht en werd bewaard bij 31°C. Het sperma werd verdund met vier delen standaard invries medium van 31°C. Dit medium bestond uit 200 mM Tris base 1004948 14 (tris(hydroxymethyl)-aminomethaan), 66.7 mM citroenzuur, 55.5 mM fructose, 581 mM glycerol, 0.475 g/1 = 800.000 units/1 sodium penicilline, 0.8 g/1 streptomycin sulfaat en 200 ml eigeel per liter medium. Een buis met het genoemde 5 mengsel werd geplaatst in een bekerglas water van 31°C en werd vervolgens in dit bekerglas weggezet bij een temperatuur van 7°C.Sperm from five unselected bulls was collected in an AI station of the Faculty of Veterinary Medicine, 35 Utrecht University and was stored at 31 ° C. The sperm was diluted with four parts of standard 31 ° C freezing medium. This medium consisted of 200 mM Tris base 1004948 14 (tris (hydroxymethyl) aminomethane), 66.7 mM citric acid, 55.5 mM fructose, 581 mM glycerol, 0.475 g / 1 = 800,000 units / 1 sodium penicillin, 0.8 g / 1 streptomycin sulfate and 200 ml egg yolk per liter of medium. A tube with the said mixture was placed in a beaker of water at 31 ° C and then placed in this beaker at a temperature of 7 ° C.

Het verdunde sperma werd in zogenaamde Franse rietjes 10 (French straws, interne diameter 1.6mm; IMV, France) verpakt, welke werden gesloten met een plug van polyvinylalcohol. De helft van de rietjes werd volgens een bekend invriesprotocol ingevroren, de andere helft werd ingevroren volgens een invriesprotocol volgens de 15 uitvinding.The diluted sperm was packed in so-called French straws (French straws, internal diameter 1.6mm; IMV, France), which were closed with a plug of polyvinyl alcohol. Half of the straws were frozen according to a known freezing protocol, the other half were frozen according to a freezing protocol according to the invention.

Bij het bekende invriesprotocol werden de rietjes en het sperma relatief langzaam afgekoeld tot 5°C, waarna de rietjes c.q. invrieszakjes in een vrieskabinet werden 20 gebracht bij een initiële temperatuur van -110°C. Steeds wanneer de temperatuur in het kabinet steeg boven de ingestelde temperatuur werd de koeling van het kabinet in werking gesteld. Bij het bereiken van een temperatuur van ongeveer -110°C werden de rietjes c.q. invrieszakjes in een 25 vat vloeibare stikstof gebracht. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.In the known freezing protocol, the straws and the sperm were cooled relatively slowly to 5 ° C, after which the straws or freezing bags were placed in a freezer cabinet at an initial temperature of -110 ° C. When the temperature in the cabinet rose above the set temperature, the cooling of the cabinet was activated. When the temperature was reached at about -110 ° C, the straws or freezing bags were placed in a vessel of liquid nitrogen. Subsequently, the straws or freezing bags were thawed in the usual manner and the motility of the sperm cells was determined.

30 Bij het invriesprotocol volgens de uitvinding werden de rietjes in een eerste koeltraject met een snelheid van 50°C/min afgekoeld vanaf ongeveer 7°C tot onder het vriespunt, tot ongeveer -10°C. Bij onderkoeling werd bij het optreden van ijsnucleatie een lichte stijging van de 35 temperatuur in de rietjes c.q. zakjes gemeten, tot nabij het vriespunt. Het sperma werd in een tweede koeltraject gedurende ongeveer 1 minuut op deze temperatuur gehouden, 1004948 15 waarbij de ijsvorming in de rietjes werd voltooid onder constante afvoer van de gegenereerde warmte. Aansluitend werden de rietjes in een derde afkoeltraject verder afgekoeld tot -100°C, met een afkoelsnelheid van 120°C/min.In the freezing protocol of the invention, the straws were cooled in a first cooling range at a rate of 50 ° C / min from about 7 ° C to below freezing point, to about -10 ° C. In the case of hypothermia, a slight rise in the temperature in the straws or pouches was measured, near the freezing point, when ice nucleation occurred. The sperm was held at this temperature in a second cooling range for about 1 minute, 1004948, completing the ice formation in the straws with constant dissipation of the generated heat. Subsequently, the straws were further cooled in a third cooling range to -100 ° C, at a cooling rate of 120 ° C / min.

5 Aansluitend werden de rietjes overgebracht in vloeibare stikstof van -196°C. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.The straws were then transferred to liquid nitrogen at -196 ° C. Subsequently, the straws or freezing bags were thawed in the usual manner and the motility of the sperm cells was determined.

10 De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het bekende protocol ingevroren rietjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 48% (minimaal 40%, maximaal 63%). De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de uitvinding ingevroren rietjes was 15 gemiddeld ongeveer 64% (minimaal 58%, maximaal 75%).The sperm motility in the straws frozen according to the known protocol after thawing averaged about 48% (minimum 40%, maximum 63%). The sperm motility in the straws frozen according to the protocol of the invention averaged about 64% (minimum 58%, maximum 75%).

Voorbeeld IIExample II

"Equex" is een mengsel van verschillende detergentia, 20 hoofdzakelijk natrium- en ethanolamine-laurylsulfaat, en verder verschillende hulpstoffen. Het werd oorspronkelijk vervaardigd en geleverd door Procter and Gamble. Het wordt momenteel geleverd door Nova Chemicals (P.O. Box 144, Scituate, MA 02066 U.S.A.). De overige chemicaliën waren 25 alle van pro analysi kwaliteit. Eieren voor het invriesmedium werden meestal betrokken van een vast adres met vastzittende kippen. De eieren worden vlak voor gebruik gereinigd. De eidooiers worden gescheiden van het eiwit en worden over filtreerpapier droog gerold, waarna het vlies 30 wordt gebroken om het zuivere eigeel te winnen. De gebruikte 0,25 ml rietjes waren van IMV. De invrieszakjes waren zelfgemaakt uit 40|im dik HDPE (Hoge dichtheid polyethyleen) folie. Het sperma werd verkregen van KI station Centraal Nederland te Bunnik. Het sperma werd gevangen voor gewone 35 produktiedoeleinden op de voor het KI station gebruikelijke wijze. De beren werden niet geselecteerd."Equex" is a mixture of various detergents, mainly sodium and ethanolamine lauryl sulfate, and further various excipients. It was originally manufactured and supplied by Procter and Gamble. It is currently supplied by Nova Chemicals (P.O.Box 144, Scituate, MA 02066 U.S.A.). The other chemicals were all of proanalysis quality. Eggs for the freezing medium were usually obtained from a permanent address with stuck chickens. The eggs are cleaned just before use. The egg yolks are separated from the egg white and rolled dry on filter paper, then the web is broken to recover the pure egg yolk. The 0.25 ml straws used were from IMV. The freezer bags were homemade from 40 µm thick HDPE (High density polyethylene) film. The semen was obtained from KI station Central Netherlands in Bunnik. The semen was captured for normal production purposes in the usual manner for the AI station. The bears were not selected.

1004948 161004948 16

De volgende media zijn gebruikt: 1. Beltsville Thawing Solution (BTS): 205 mM glucose, 24 mM natriumcitraat, 3,5 mM natrium-EDTA, 15mM natriumbicarbonaat, 10,3 mM kaliumchloride, 0.6 g/1 5 natrium penicilline en 1 g/1 streptomycinesulfaat.The following media were used: 1. Beltsville Thawing Solution (BTS): 205 mM glucose, 24 mM sodium citrate, 3.5 mM sodium EDTA, 15mM sodium bicarbonate, 10.3 mM potassium chloride, 0.6 g / 1 sodium penicillin and 1 g / 1 streptomycin sulfate.

2. BTS-eigeel (BE): 4 volumedelen BTS plus 1 deel eigeel. Vanwege de lage pH van het eigeel wordt de pH bijgesteld met 1 M NaOH tot pH 7,2.2. BTS egg yolk (BE): 4 volume parts BTS plus 1 part egg yolk. Due to the low pH of the egg yolk, the pH is adjusted with 1 M NaOH to pH 7.2.

3. BTS-eigeel-glycerol-Equex (BEGE): Aan 93 ml BE wordt 5,35 10 g glycerol (± 87%) toegevoegd en 2,08 g Equex toegevoegd.3. BTS egg yolk glycerol Equex (BEGE): 5.35 10 g glycerol (± 87%) is added to 93 ml BE and 2.08 g Equex is added.

Dit maakt ± 100 ml.This makes ± 100 ml.

Sperma van ongeselecteerde beren (Boarsperm) werd opgevangen op een KI station te Bunnik en werd direct verdund met 1.5 15 volume BTS, bij 32°C. Het sperma werd vervolgens overgebracht in een wijde beker met een maximum laagdikte van 1 cm en relatief snel afgekoeld, twintig minuten bij kamertemperatuur en vervolgens 30 minuten bij 17°C. Aansluitend werd het verdunde sperma 10 minuten 20 gecentrifugeerd bij 1100 G. Het zaadsediment werd voorzichtig geroerd met een glazen roerstaaf en daarbij geresuspendeerd door druppelsgewijze toevoeging van BE-medium. Hierna werd het sperma in een centrifugebuis 90 minuten weggezet, bij 13°C. Hierna werd aan twee volumedelen 25 sperma in BE medium druppelsgewijs één volumedeel BEGE medium met een temperatuur van 13°C toegevoegd, onder zachtjes roeren met een magneetroerder. De eindconcentraties zijn dan 0.2 M glycerol en 6.9 g/1 Equex. Rietjes werden gevuld met deze suspensie en afgedicht met afdichtpoeder 30 (Polyvinylalcohol). Bovendien werden invrieszakjes gevuld en geseald. De rietjes werden aansluitend ingevroren met een Cryoson programmeerbare invrieskamer, de zakjes werden ingevroren met een zelfgemaakt programmeerbaar invriesapparaat.Sperm from unselected boars (Boarsperm) was collected at an AI station in Bunnik and immediately diluted with 1.5 volume BTS, at 32 ° C. The sperm was then transferred to a wide beaker with a maximum layer thickness of 1 cm and cooled relatively quickly, twenty minutes at room temperature and then 30 minutes at 17 ° C. The diluted sperm was then centrifuged at 1100 G for 10 minutes. The seed sediment was gently stirred with a glass stirring rod and resuspended by dropwise addition of BE medium. The sperm were then placed in a centrifuge tube for 90 minutes at 13 ° C. After this, one volume part of BEGE medium with a temperature of 13 ° C was added dropwise to two volume parts of sperm in BE medium, with gentle stirring with a magnetic stirrer. The final concentrations are then 0.2 M glycerol and 6.9 g / 1 Equex. Straws were filled with this suspension and sealed with sealing powder 30 (Polyvinyl alcohol). In addition, freezer bags were filled and sealed. The straws were subsequently frozen with a Cryoson programmable freezing chamber, the bags were frozen with a homemade programmable freezing apparatus.

De invriesprotocollen voor de rietjes en invrieszakjes waren gelijk. De helft van de rietjes en zakjes werd met het 35 1004948 17 bekende invriesprotocol ingevroren. De andere helft volgens een invriesprotocol volgens de uitvinding.The freezing protocols for the straws and freezing bags were the same. Half of the straws and sachets were frozen with the known freezing protocol. The other half according to a freezing protocol according to the invention.

Bij het bekende invriesprotocol werden de rietjes en het 5 sperma relatief langzaam afgekoeld tot 5°C, waarna de rietjes c.q. invrieszakjes in een vrieskabinet werden gebracht bij een initiële temperatuur van -110°C. Steeds wanneer de temperatuur in het kabinet steeg boven de ingestelde temperatuur werd de koeling van het kabinet in 10 werking gesteld. Bij het bereiken van een temperatuur van ongeveer -110°C werden de rietjes c.q. invrieszakjes in een vat vloeibare stikstof gebracht. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen 15 bepaald.In the known freezing protocol, the straws and the sperm were cooled relatively slowly to 5 ° C, after which the straws or freezing bags were placed in a freezer cabinet at an initial temperature of -110 ° C. When the temperature in the cabinet rose above the set temperature, the cooling of the cabinet was activated. When the temperature was reached at about -110 ° C, the straws or freezing bags were placed in a vessel of liquid nitrogen. Subsequently, the straws or freezer bags were thawed in the usual manner and the motility of the sperm cells was determined.

Bij het invriesprotocol volgens de uitvinding werden de rietjes c.q. invrieszakjes met een snelheid van 50°C/min afgekoeld vanaf 13°C tot onder het vriespunt. Bij 20 onderkoeling werd bij het optreden van ijsnucleatie een lichte stijging van de temperatuur in de rietjes c.q. zakjes gemeten, tot nabij het vriespunt. Het sperma werd gedurende ongeveer 1 minuut op deze temperatuur gehouden, waarbij de ijsvorming in de rietjes c.q. invrieszakjes werd voltooid 25 onder constante afvoer van de gegenereerde warmte.In the freezing protocol according to the invention, the straws or freezing bags were cooled at a rate of 50 ° C / min from 13 ° C to below freezing point. Under hypothermia, a slight rise in the temperature in the straws or pouches was measured, near the freezing point, when ice nucleation occurred. The sperm was kept at this temperature for about 1 minute, completing the ice formation in the straws or freezer bags with constant removal of the generated heat.

Aansluitend werden de rietjes c.q. invrieszakjes verder af gekoeld tot -12 0°C, met een af koelsnelheid van 50°C/min. Aansluitend werden de rietjes c.q. invrieszakjes overgebracht in vloeibare stikstof van -196°C. Vervolgens 30 werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.Subsequently, the straws or freezing bags were further cooled to -12 0 ° C, with a cooling rate of 50 ° C / min. The straws or freezer bags were then transferred to liquid nitrogen at -196 ° C. Subsequently, the straws or freezing bags were thawed in the usual manner and the motility of the sperm cells was determined.

De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het 35 bekende protocol ingevroren rietjes c.q. invrieszakjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 45%. De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de 1004948 18 uitvinding ingevroren rietjes was gemiddeld ongeveer 51.5%. De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de uitvinding ingevroren invrieszakjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 52%.The sperm motility in the straws and / or freezer bags frozen according to the known protocol was an average of about 45% after thawing. Sperm motility in the straws frozen according to the protocol of the 1004948 18 invention averaged about 51.5%. The sperm motility in the freezing bags frozen according to the protocol of the invention averaged about 52% after thawing.

55

De uitvinding is geenszins beperkt tot de inrichtingen en werkwijzen zoals als voorbeelden beschreven. Vele variaties daarop zijn mogelijk.The invention is by no means limited to the devices and methods as described as examples. Many variations on this are possible.

Zo kan, afhankelijk van de soort en hoeveelheid in 10 te vriezen cellen, de gewenste nauwkeurigheid, de gewenste overlevingskans, de samenstelling van de vloeistof of andersoortige omgeving waarin de levende cellen zijn opgenomen en worden ingevroren, de gewenste eindtemperatuur en dergelijke, een ander invriesprotocol worden gekozen. Bovendien 15 kunnen andersoortige contactoppervlakken worden toegepast. Ook kunnen combinaties van oppervlakken worden toegepast. Voorts kan een inrichting zijn opgebouwd uit een combinatie van een inrichting volgens de uitvinding voor het eerste, over het algemeen meest kritische gedeelte van het invries-20 traject, en een inrichting van de bekende soort voor een gedeelte van het invriestraject na de kristallisatiefase, dat wil zeggen dat deel van het invriestraject nadat althans nagenoeg volledige kristallisatie in de houders is opgetreden. Verder kunnen andere koelmiddelen worden 25 toegepast en kunnen andere houders worden gebruikt. Ook kunnen meerdere contactvlakken tegenover elkaar worden geplaats, waarbij de houders tussen de betreffende contactvlakken worden opgenomen of doorgevoerd. Het koelprotocol kan handmatig of (semi)automatisch worden geregeld. In elk 30 afkoeltraject kan de temperatuur constant zijn of volgens een gewenst patroon verlopen c.q. worden gestuurd, waarbij meer dan drie koeltrajecten kunnen worden onderscheiden, elk met afzonderlijke temperatuurgradiënten. Deze en vele vergelijkbare varianten vallen binnen het raam van de 35 uitvinding.For example, depending on the type and quantity in 10 cells to be frozen, the desired accuracy, the desired chance of survival, the composition of the liquid or other environment in which the living cells are incorporated and frozen, the desired final temperature and the like, a different freezing protocol be chosen. In addition, other types of contact surfaces can be used. Combinations of surfaces can also be used. Furthermore, a device can be built up from a combination of a device according to the invention for the first, generally most critical part of the freezing process, and a device of the known type for a part of the freezing process after the crystallization phase, which that is, part of the freezing range after at least substantially complete crystallization has occurred in the containers. Furthermore, other coolants can be used and other containers can be used. Several contact surfaces can also be placed opposite each other, the holders being received or fed through between the respective contact surfaces. The cooling protocol can be controlled manually or (semi) automatically. In each cooling range, the temperature may be constant or proceed or be controlled according to a desired pattern, with more than three cooling ranges distinguishable, each with separate temperature gradients. These and many comparable variants are within the scope of the invention.

10049481004948

Claims

Method for freezing live cells, in particular sperm, in which the cells in at least one sample are cooled during a freezing range to near a storage temperature, characterized in that during a part of the freezing range in which crystallization occurs in the or each sample a controlled temperature gradient is applied which is smaller than at least the temperature gradient in a preceding or subsequent part of the freezing range.

2. A method according to claim 1, wherein during the occurrence of crystallization in the or each sample, a decrease in the temperature in the or each sample is substantially prevented and preferably during the crystallization the temperature around the or each sample is kept substantially constant. .

3. Method according to claim 1 or 2, wherein the freezing section comprises a first, a second and a third cooling section, wherein the temperature gradient is actively controlled in each cooling section, the temperature gradient being kept relatively large in the first and third cooling section, during the intermediate second cooling range is adjusted to at least such a temperature that crystallization substantially occurs therein.

4. The method of claim 3, wherein the second cooling range begins approximately at the beginning of crystallization in the or a sample and is preferably terminated when substantially complete crystallization has occurred in the or each sample.

A method according to any one of claims 1 to 3, wherein crystallization in the or each sample is initiated by causing local subcooling for a short time in at least a portion of the or each sample in the 1004948 or each container such that crystallization initialization occurs.

6. A method according to any one of claims 3-5, wherein during the second cooling stage a temperature is set such that the transferability over time is sufficient to dissipate the heat of crystallization from the or each container, while the crystallization is carried out so quickly such dehydration is prevented from damaging the cells due to excessive salt and / or metabolite concentration, and is performed so slowly that the freezing point drop of the solution during crystallization proceeds at least as fast and preferably faster than the drop of the temperature.

A method according to claim 6, wherein the temperature in the second cooling range is set between -4 ° C and -25 ° C, preferably between -5 ° C and -15 ° C, more in particular at an average of about -10 ° C, wherein the crystallization is almost completely completed within a time between 10 sec. and 60 seconds, preferably between 15 seconds. 20 and 45 seconds, especially in about 20 seconds. after the start of crystallization.

8. A method according to any one of claims 3-7, wherein the temperature gradient in the first and third cooling range is selected depending on at least the type of cells to be frozen and the composition of the or each sample.

A method according to any one of claims 3-8, wherein the temperature gradient in the first cooling range is at least equal to and preferably smaller than in the third cooling range.

A method according to any one of claims 3 to 9, in particular for freezing of beef spread, wherein the temperature gradient in the first cooling range is set between -20 ° C / min and -100 ° C / min, more in particular between -35 ° C / min and -80 ° C / min and preferably about -50 ° C / min, wherein the or each sample is cooled in the first cooling range to a temperature between -4 ° C and -20 ° C, at preferably about -10 ° C, in the third 1004948 cooling range a temperature gradient is set between -50 ° C / min and -170 ° C / min, more particularly between -80 ° C / min and -150 ° C / min and preferably about -120 ° C / min.

11. A method according to any one of claims 3-9, in particular for freezing pig semen, wherein the temperature gradient in the first cooling range is set between -20 ° C / min and -100 ° C / min, more in particular between - 35 ° C / min and -80 ° C / min and preferably about -50 ° C / min, wherein the or each sample is cooled in the first 10 cooling range to a temperature between -4 ° C and -20 ° C, preferably about -10 ° C, in the third cooling range a temperature gradient is set between -10 ° C / min and -100 ° C / min, more particularly between -30 ° C / min and -70 ° C / min and preferably about -50 ° C / min.

Method according to any one of the preceding claims, in particular for freezing human sperm, wherein the temperature gradient in the first cooling range is set between -20 ° C / min and -100 ° C / min, more in particular between -35 ° C / min and -80 ° C / min and preferably about -50 ° C / min, wherein the or each sample in the first cooling range is cooled to a temperature between -4 ° C and -20 ° C, preferably about -10 ° C, in the third cooling stage a temperature gradient is set between -10 ° C / min and -100 ° C / min, more particularly between 25 -30 ° C / min and -70 ° C / min and preferably about -50 ° C / min. [Note: it may be wise to choose the last value (optimally -50 ° C / min) a little less, for example -40 ° C / min. In any case, this indicates that it may be more critical than for cattle and pigs.]

13. A method according to any one of claims 3-12, wherein the first cooling section is preceded by a pre-cooling section with a temperature gradient which is relatively small compared to the first cooling section, wherein the or each sample in the pre-cooling section is cooled to a pre-cooling temperature of more than 5 ° C, preferably between 5 ° C and 18 ° C, especially between 9 ° C and 15 ° C, more particularly about 13 ° C. 1004948

14. Use of a crystallization pause during freezing of a number of living cells containing samples, crystallization occurring in the or each sample during the crystallization pause, whereby temperature drop during crystallization by controlling the cooling of the or each sample during the crystallization pause becomes essential. and the temperature around the or each sample is preferably kept constant during the crystallization pause.

15. Use of a pre-cooling of at least one living cell-containing sample, prior to a freezing process for the or each sample, wherein the or sample is cooled relatively slowly during the pre-cooling to a temperature of more than 5 ° C, at preferably between 6 and 18 ° C, in particular between 11 and 15 ° C and more in particular up to about 13 ° C, from which temperature a freezing range is started in which the or each sample is cooled relatively quickly.

16. Device for freezing live cells, in particular sperm, comprising means for cooling samples contained in containers, which samples comprise live cells, means being included for controlling the cooling rate of each sample during at least one three time intervals, wherein the control means are arranged for being actively controlled: maintaining a relatively high temperature gradient in a first time interval; maintaining a relatively low temperature gradient in a subsequent second time interval, preferably keeping the ambient temperature of each sample constant; and again maintaining a relatively high temperature gradient in a subsequent third time interval.

17. Device as claimed in claim 16, wherein at least one contact surface and cooling means are provided for the or each contact surface, the device being arranged for contacting at least one contact surface with at least a part of 1004948 during use in at least one number of the containers, such that cooling of the containers or at least a sample contained therein is obtained, wherein the cooling means are arranged for controlled cooling of the or each contact surface and thus of the sample in the or each container. 1004948