NL1001972C2 - Biologisch aktieve samenstellingen en hun gebruik. - Google Patents

Description

BIOLOGISCH AKTIEVE SAMENSTELLINGEN EN HUN GEBRUIK

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op verschillende biologisch aktieve verbindingen en samenstellingen, met therapeutische en/of profylactische eigenschappen.

5 Verrassenderwijze werd volgens de uitvinding gevonden dat plantemateriaal dat afkomstig is van Glvcerrhi-za glabra L. een grote verscheidenheid van verbindingen omvat waarvan bewezen is dat zijn een breed spectrum aan biologische aktiviteiten hebben. Glvcerrhiza glabra L. is 10 een gras dat met name wijd verspreid is op natuurlijke en gecultiveerde gronden in Rusland, een aantal CIS-landen en een aantal andere staten. De aktieve verbindingen en samenstellingen worden zowel in de bladeren van het gras als in de wortels gevonden.

15 De samenstellingen volgens de uitvinding kunnen op verschillende wijze geïsoleerd worden. De verschillende samenstellingen verkregen door het uitvoeren van de verschillende werkwijzen hebben eveneens verschillende eigenschappen en aktiviteiten. Alle samenstellingen en verbindin-20 gen hebben hun oorsprong, namelijk de plant Glvcerrhiza glabra L., gemeenschappelijk.

In eerste uitvoeringsvorm wordt het gras zonder de wortels geëxtraheerd met methyleenchloride onder vacuüm, waarna het extractiemiddel verdampt wordt. Het overblijvende 25 materiaal is een harsachtige donkergroene substantie die in deze aanvrage verder zal worden aangeduid als "Glycefungi-ne".

In een tweede uitvoeringsvorm wordt een samenstelling genaamd "Esefsol" bereid door het drogen van het ruwe 30 materiaal, dat overblijft na isolatie van Glycefungine, om het methyleenchloride volledig te verwijderen en dit gedroogde ruwe materiaal vervolgens te extraheren door middel van extractie met 70% aceton. Na verdamping en droging wordt Esefsol verkregen als licht, zandachtig materiaal.

1 0 u 1 9 7 2 2

Vervolgens wordt het ruwe materiaal dat overblijft na volledige verwijdering van aceton geëxtraheerd met heet water bij een verhoogde temperatuur, bij voorkeur tussen 80 en 90eC. De extractie wordt tweemaal herhaald, waarna het 5 extractiemiddel afgedampt wordt en het zo verkregen materiaal verder gedroogd. Het resulterende materiaal is een aromatische, dikke, visceuze, donkerbruine massa, "Vodexol” genoemd. Dit vormt de derde uitvoeringsvorm van de uitvinding.

10 Een polysaccharidecomplex, met de naam "Polysol" wordt verkregen door van een nieuwe hoeveelheid gehakt gras lipofiele en fenolcomponenten af te scheiden door middel van methyleenchloride. Na volledige verwijdering van het methy-leenchloride door droging wordt het gras verder geëxtraheerd 15 met een alcohol, zoals 82% ethylalcohol, en gedroogd. Vervolgens wordt het extract geconcentreerd onder vacuüm. Het neerslaan uit het geconcentreerde extract wordt uitgevoerd door middel van zuivere alcohol. De verkregen neerslag wordt gescheiden en gezuiverd door opnieuw neerslaan en gewassen 20 met aceton. Na droging en verpulvering wordt Polysol verkregen.

Door het extraheren van het gras met zuivere watervrije aceton wordt een samenstelling verkregen waarna verder verwezen zal worden als "Glycacet".

25 Chloroformextractie van het gras leidt tot een samenstelling genaamd "Glycoclor".

Een verdere karakterisering van de verschillende samenstellingen en details met betrekking tot hun bereidingswijzen worden gegeven in de voorbeelden.

30 Uitgebreid onderzoek leidde tot de conclusie dat de verbindingen en samenstellingen die geïsoleerd kunnen worden uit de bladeren fungicide, anti-bacteriële, anti-virale, anti-ontstekings-, anti-tumor, anti-protozoïsche, anti-allergische, immuunstimulerende en andere effecten 3 5 hebben.

De toepassingen voor de samenstellingen en verbindingen zijn talrijk.

1001972 3

Onder hen is de behandeling van schimmelinfecties en ziekten veroorzaakt door bijvoorbeeld Trichophyton ru-brum. T. interdiaitale. T. aypseum. Microsporum canis. Candida albicans. Rhizoous orysae, Fusarium heterosporum.

5 Penicillium. Aspergillus etc.. De aktiviteit van een aantal van de samenstellingen volgens de uitvinding, in het bijzonder van Glycefungine, overtreft de aktiviteit van de bekende anti-schimmelmiddelen Nystatine, Levorine en Clotrimazol.

Een aantal van de samenstellingen, in het bijzon-10 der Glycefungine, Glycacet en Glycochlor, heeft anti-bacte-riële eigenschappen. Glycefungine blijkt aktief te zijn tegen Staphylococcus aureus en S. epidermis, terwijl Glycacet eveneens aktief is tegen S. aureus en Bacillus polvmvxa.

Anti-virale en anti-protozoïsche effecten worden 15 in het bijzonder vertoond door Glycefungine. Deze samenstelling kan bijvoorbeeld gebruikt worden bij afwijkingen van de cervicale vagina, veroorzaakt door het virus Herpes simplex, en de protozoën Chlamidium. Gardnerella. Een aantal van de samenstellingen remt HIV-1, in het bijzonder zijn absorptie 20 aan lymfoblastoïde cellen.

Anti-tumor effecten zijn aangetoond op de experimentele modellen lymfocytisch leukemie P-388, Erlich's tumor, sarcoma 37, adenocarcinoma van de melkklier Ca-755, melanoma B-16, sarcoma 180, in het bijzonder voor Glycefun-25 gine.

Onder de andere effecten zijn anti-ontstekingsak-tiviteit, immuunstimulerende aktiviteit en anti-allergische effecten gevonden in verschillende samenstellingen.

Verder kan Glycefungine gebruikt worden als een 30 profylactisch en genezend middel in dermatologie voor het behandelen van candidosis, rubrophytosis, microsporia, andere schimmel- en bacteriële ziekten, atopische en con-tactdermatitis, huidkanker, ontstekings- en allergische afwijkingen van de huid en slijmvliezen in gynaecologie voor 35 behandeling van intravaginale virale en bacteriële infecties, in de oncologie voor behandeling van verschillende typen tumoren, als een desinfecterend middel epidemiologie, voor de behandeling van paradontose, gingivitis, stomatitis too 19 72 4 en andere intraorale ziekten in de stomatologie, in de keel, neus- en oorkunde voor het behandelen van infectieuze rhinitis, tonsillitis, laryngitis etc.

In de voedingsindustrie kan Glycefungine gebruikt 5 worden als een bioaktief supplement (met bijvoorbeeld immuunstimulerende effecten, of als een anti-tumormiddel, anti-oxidant etc.), natuurlijk conserveringsmiddel etc..

Glycefungine en Esefsol zijn eveneens zeer bruikbaar als additief in cosmetische samenstellingen, zoals 10 lotions, zepen, crèmes, sprays etc.. Het effect van Glycefungine is anti-schimmel en anti-bacterieel en het is derhalve zeer bruikbaar in de behandeling van acne en een aantal andere huidafwijkingen die veroorzaakt en/of gecompliceerd kunnen worden door schimmels, staphylococci etc..

15 Vodexol kan gebiuikt worden in anti-acne-, anti-rimpel- en voedende crèmes en lotions en is zeer bruikbaar in anti-roosshampoo. Een combinatiesamenstelling bestaande uit Glycefungine, Vodexol en Esefsol is zeer effectief in het behandelen van acne vulgaris, acne juveniles, acne rosaceae, 20 atopische en contact dermatitis en huid candidosis. Alle cosmetische samenstellingen kunnen eveneens gebruikt worden voor therapeutische doeleinden in de dermatologie en als een profylactische samenstelling in de cosmetologie.

De samenstellingen van de uitvinding kunnen even-25 eens gebruikt worden in de diergeneeskundige praktijk, bijvoorbeeld voor de behandeling van infectieuze en ontste-kingshuidziekten, of voor behandeling van schimmel-, proto-zoïsche, virale en bacteriële ziekten.

De samenstellingen van de uitvinding kunnen ge-30 bruikt worden voor het inpregneren van verschillende weefsels en vezels voor het vervaardigen van kleding, inlegzolen voor schoenen en sportkleding, maandverband en tampons met antischimmel-, antibacteriële, anti-virale effecten voor gebruik als bescherming, voor het behandelen van zweetvoe-35 ten, in de chirurgie en gynaecologie etc..

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de werkwijze voor het bereiden van de verschillende samenstellingen en op de verschillende toepassingen.

1 0 0 1 9 7 2 5

Geschikte extractiemiddelen worden gekozen uit de groep die bestaat uit methyleenchloride, water, een mengsel van 70% aceton en 30% water, aceton, chloroform, of combinaties daarvan. Een aantal andere produkten was afgeleid van 5 Glvcerrhiza glabra L. gras door extractie met glycerine, polyethyleenoxide-400, olijfolie, diethy1ether, petroleume-ther.

De onderhavige uitvinding zal verder verduidelijkt worden in de volgende voorbeelden die slechts gegeven zijn 10 voor illustratiedoeleinden en op geen enkele wijze de bedoeling hebben de omvang van de uitvinding te beperken.

VOORBEELDEN VOORBEELD 1 15 Glycefungine 1. Bereiding

Het gras van Glvcerrhiza glabra L. werd gehakt door een gecombineerde procedure met gebruik van een rollen-pletmachine gedurende 2 passages en een maalinrichting DKJ 20 met een zeef van 0,2 mm. Het op deze wijze verkregen materiaal wordt geëxtraheerd door methyleenchloride onder vacuüm door middel van het filtratieprincipe gebaseerd op een continue stroom van vers extractiemiddel gedurende 2 uur.

De verhouding tussen ruw materiaal en extractie-25 middel is 1:7. Vervolgens wordt het extract drooggedampt onder vacuüm in een Simax apparaat tot een restvochtgehalte van 22-23%. Daarna wordt het gedroogd in een vacuümdroogbox onder een temperatuur van 50-55°C. Het verkregen materiaal is een harsachtige donkergroene substantie met een vochtge-30 halte van 14-16%.

2. Chemische samenstelling

De chemische samenstelling van het verkregen materiaal werd als volgt bepaald.

35 Beta-sitosterine, terpenoïden, chlorofyl, harsen, vetzuren worden ontdekt door een kwalitatieve analyse van de samenstelling door middel van papierchromatografiemethoden, 1001972 6 dunne laag chromatografie (TLC) op silufolplaten met refe-rentiemoleculen en kwalitatieve chemische reacties.

De papierchromatografie-analyse op steroïden en terpenoïden werd uitgevoerd met behulp van chloroform als 5 mobiele fase en methanol-formamide (1:1) als stationaire fase. De verzadigde oplossing van antimoon(III)chloride in chloroform werd als de ontwikkelaar genomen. Voor TLC werd een chloroform-methanol-water (65:35:10) systeem gebruikt. Chromatogrammen werden ontwikkeld met 1% oplossing van 10 Vanilline in geconcentreerd zwavelzuur. De hoeveelheid harsen in Glycefungine werd bepaald door een gravimetrische bepaling gebaseerd op het oplossen van het materiaal in kokende alcohol.

Het gehalte aan onverzadigde vetzuren werd bepaald 15 door het verhitten van een precies afgewogen hoeveelheid verpulverd extract met een dertigvoudige hoeveelheid chloroform voor volledige oplossing. Vervolgens werd de homogene oplossing gewassen met water in een scheidtrechter. Vervolgens werd een 10% natriumhydroxideoplossing toegevoegd aan 20 de gewassen chloroform-oplossing, nog steeds in de scheidtrechter. De verschillende fasen werden gedurende 5 minuten met elkaar in contact gebracht. Vervolgens werd de alkalische oplossing, die de vetzuren bevatte, afgegoten. De scheiding werd tweemaal herhaald. De gecombineerde alkali-25 sche oplossingen werden tweemaal gewassen met chloroform en de pH ingesteld op 2 met behulp van een verdunde zoutzuurop-lossing. De zure oplossing die zo verkregen werd, werd driemaal geëxtraheerd met chloroform. De chloroformfracties werden gecombineerd, 50 ml gezuiverd water, 50 ml 0,1 mol/1 30 joodmonochlorideoplossing werden toegevoegd en gedurende 1 uur met rust gelaten met periodiek mengen en schudden. Vervolgens werden 10 ml 10% oplossing kaliumjodide toegevoegd. Vrijgemaakt moleculair jood werd getitreerd met een 0,1 mol/1 oplossing natriumthiosulfaat met zetmeel als 35 indicator. Het controle-experiment werd tegelijkertijd uitgevoerd. Het gehalte aan onverzadigde vetzuren werd bepaald door berekening ten opzichte van het oleïnezuurge-halte.

1001972 7

De hoeveelheid chlorofyl in de samenstelling werd bepaald door spectrofotometrie (285 nm) en fotocolorimetri-sche bepalingen. Als standaard werd een mengsel van chlorofyl (85 mg/1) gebruikt.

5 De houdbaarheid van de samenstelling is tenminste 3 jaar.

De volgende componenten werden gedetecteerd: 1. Chlorofyl A en B 6-8% 2. Fytosterolen: beta-sitosterine en sigmasterine 2,0- 10 2,5% 3. Fosfolipiden (lecithine, choline) 1,0% 4. Onverzadigde vetzuren (oleïne-, linoleenzuren) 7,1% 5. Coumarines 1,8% 6. Harsen worden weergegeven door harszuren met de 15 diterpenoïdestructuur en koolwaterstoffen van diterpenoïdeseries. De algemene hoeveelheid van de harsen is ongeveer 4% 7. Carotinoïden (beta-carotine) 10- 12% 20 3. De biologische eigenschappen 3.1. Algemene effecten

De acute toxiciteit van Glycefungine werd bepaald door de methode van Wilcokson, Litchfield op de Toxicologi-25 sche Afdeling van het Russische Nationale Onderzoekscentrum van Biologisch Aktieve Verbindingen (St. Kupavna). De LD50 van de oplossing werd bepaald op witte muizen van een onbekende stam door middel van intraperitoneale en orale toediening en bleek meer dan 5000 mg/kg te zijn.

30 De studie van de irritatie-inducerende en allerge- ne effecten werd uitgevoerd in de laboratoria van de Pyatigorsk Farmaceutische Staatsacademie. Daarbij bleek dat een 3% zalf met Glycefungine de huid niet irriteert en sensiti-seert gedurende plaatselijke toediening op cavia's.

35 3.2. Antischimmeleffect

De experimenten om de antischimmeleffecten vast te stellen werden uitgevoerd op de Mycology Afdeling van het 1 0 0 1 9 7 2 8

Centrale Huid Venerologie Instituut (Moskou). Gevonden werd dat Glycefungine sterk fungicide en fungistatische effecten bezit die onthuld werden door de diskmethode op de testkwe-ken Rhizopus orvsae, Fusarium heterosporum. Candida albi-5 cans» Voor dit werd 1 ml suspensie roet sporen van de test-schimmels in een concentratie van 1 mln/ml gezaaid op Petrischalen met Chapek's medium. Papieren schijven (10 mm doorsnede) werden geweekt in 5% en 10% alkali-oplossingen van Glycefungine, gedurende 3 minuten gedroogd en op het opper-10 vlak van de media met de schimmelkweken geplaatst, de schalen werden gedurende 7 dagen bij 28°C in een thermische doos geïncubeerd. Het effect van het geneesmiddel werd geschat door het meten van de grootte van de groeivertragingszone. Als referenties werden Levorine en Nystatine gebruikt.

15 Glycefungine overtrof deze samenstellingen 5-12 maal in aktiviteit.

Zalven die Glycefungine bevatten werden bereid door het mengen van de volgende componenten: polyethyleenoxide-400 45 delen 20 polyethyleenoxide-1500 33 delen dimethylsulfoxide 17 delen aerosil 2 delen

Glycefungine 3 delen 25 De zalven met Glycefungine werden getest in de concentraties 1,5; 3,0; 5,0; en 10,0%. De antischimmelwerking werd bestudeerd in twee stadia (als referentiesamenstelling werd Canesten (Clotrimazol) gebruikt): 1. Door agardiffusiemethode in vitro op de derma-30 tofytkweken Trichophyton rubrum. T. interdiaitale. T. gyp- seum. Microsporum canis. Candida albicans, de zwamachtige schimmels Penicillium en Aspergillus (8 testkweken van elk).

2. op een experimenteel Trvchophvton model in vivo in cavia's. Er werd vastgesteld dat het aanbrengen van een 35 zalf met 3% Glycefungine gedurende 14 dagen leidde tot de volledige onderdrukking van de ontwikkeling van Trvchophvton 1001972 9 schimmels. Dit resultaat is vergelijkbaar met Canesten (Clotrimazol) .

De zalf wordt derhalve niet slechts aanbevolen voor profylaxe maar ook voor therapie.

De zalf op Glycefungine basis werd eveneens getest 5 op een beperkte schaal in mensen op 20 patiënten met derma-tofytosis en vertoonde een antischimmel-, anti-jeuk- en keratolytisch effect.

Het meest effectieve gebruik van Glycefungine is de behandeling van onbehaarde-huidcandidosis, rubrofytosis 10 etc.. De samenstelling wordt goed geabsorbeerd door de huid en heeft geen neveneffecten (geen plaatselijke irritatie en sensitisatie).

De samenstelling werd eveneens bestudeerd voor mogelijke toepassingen in de cosmetica. Als resultaat werden 15 recepten voor crèmes, lotions en sprays ontwikkeld, die de groei van Trvchophvton rubrum. T. avoseum (1,0-3,7 mm groei-remmingszone's) in vitro sterk onderdrukten en voetmycosis genazen.

20 3.3. Antibacterieel effect

Het antibacteriële effect werd getest bij het Instituut voor Mediscche en Biologische Problemen (Moskou) door de schijf methode op testkweken van Staphylococcus aureus. St. eoidermidis. Pseudomonas aeruginosa. Bacillus 25 licheniformis.

Een 5-10% water-alkali-oplossing van Glycefungine produceerde een breed spectrum bacteriostatisch effect met betrekking tot Staphylococcus (3,0; 5,5; 2,0; 3,0 ml groei-remmingszones).

30 3.4. Anti-ontstekingseffect

Aangetoond werd op Farmacologie Afdeling van Perm Staats Farmaceutisch Instituut dat een zalf met 3% Glycefungine acute ontstekingsreacties (rattepoot-oedeem) remde bij 35 32,6% van de geteste ratten.

1 C 0 1 9 72 10 3.5. Anti-tumoreffeet

De anti-tumoreffecten werden bestudeerd bij het Onderzoeksinstituut van Tumor Diagnose en Behandeling van Russisch Nationaal Oncologisch Centrum (Moskou).

5 De samenstelling werd onderzocht in een ruime verscheidenheid aan doses, zowel voor intraperitoneale als orale toediening op 6 verschillende tumoren geïmplanteerd in muishybride eerste generatie BDF1 (C57B1/6 x DBA/2) en SHK). De geëvalueerde tumoren omvatten lymfocytische leukaemie P-10 388, Erlich's tumor, Sarcoma 37, adenocarcinoma van de melkklier Ca-755, melanoma B-16, en sarcoma 180. Gevonden werd dat Glycefungine 5 van de 6 geteste tumoren onderdrukte. Het remde de groei van sarcoma 37 in 59-63% van de dieren in een dosisbereik van 6-100 mg/kg wanneer zowel 15 intraperitoneaal als oraal behandeld werd gedurende 5 tot 10 dagen, eenmaal per dag. 29-43% van de dieren werd genezen.

De oplossing remde niet de groei van sarcoma-180, maar genas de dieren in 62,5% van de gevallen. Het onderdrukte de groei van carcinoma 755 en melanoma B-16 in res-20 pectievelijk 56% en 52% van de dieren, verlengde het leven van het dier met Ca-755, melanoma B-16, Erlich's tumor in 36%, 34% en 40% van de gevallen, in vergelijking met de controledieren die niet behandeld werden met de samenstelling.

25 De verkregen gegevens geven niet slechts de direc te werking van de samenstelling op tumorcellen weer maar zijn potentieel stimulerend effect op het immuunsysteem.

3.6. Anti-HIV effect 30 Dit effect werd gedemonsteerd bij het Laboratoriu, voor Geassocieerde Infecties van het Epidemiologie en Microbiologie Onderzoeksinstituut (Moskou). De remming van HIV-l adsorptie aan lymfoblastoïde cellen MT-4 werd bestudeerd door de indirecte immuno-fluorescentiemethode na 7 dagen 35 incubatie van de cellen met Glycefungine. Azidothymidine werd gebruikt als controle.

Het HIV-1 virus (HTHIV27 species) werd gekweekt in dit laboratorium en is het onderwerp van het Russiche oc- 1001972 11 trooi verleend op aanvrage N 94002006/13, ingediend op 31 januari 1994. Ontdekt werd dat de samenstelling zeer potente anti-HIV aktiviteit bezit vergelijkbaar met Azidothymidine. 100% remming van HIV-1 werd tot stand gebracht door een 5 concentratie van 1 mg per ml (1 gamma). De samenstelling bezit geen cytotoxisch effect.

4. Moaeliike toepassing voor gebruik in mensen 4.1. Anti-bacteriële en anti-schimmel vezels 10 Het is mogelijk weefsels te impregneren met een wateralkali-oplossing van de samenstelling voor het verkrijgen van een doek die een anti-bacterieel en anti-schimmel-effect heeft.

Vezels geschikt voor kleding (ruwe calico, vilt, 15 viscose, etc.) werden geïmpregneerd met Glycefungine in verschillende concentraties. De tests werden uitgevoerd op de Textiel Academie (Moskou). De geïmpregneerde vezels kunnen vervaardigd worden in textiel- of handgemaakte vezel-fabrieken gebaseerd op een continue produktiecyclus.

20 Vezels geïmpregneerd met Glycefungine werden bestudeerd in termen van een effect op pathogene flora en mensen en het vermogen het effect te behouden na verschillende typen verwerking. De geteste behandelingen waren 10-20 maal wassen in alkalisch of neutraal medium, gammabestraling 25 bij 25 kGr, 10 maal autoclaveren gedurende 30 minuten onder 1,5 atm., opslag gedurende 3 maanden. Geen van deze behandelingen veranderende hun eigenschappen.

De aktiviteit van de vezels werd getest op 12 testkweken omvattende S. marcescens. E. coli. P. aeruginosa. 30 B. subtilis. S. aureus etc.. Het meest effectieve waren de vezels geïmpregneerd met 0,02% en 0,04% water-alkalische-oplossingen van Glycefungine met betrekking tot B. subtilis en S. aureus♦

Anti-schimmel inlegzolen geïmpregneerd met 2,5; 35 5,0 en 10% water-alkali-oplossingen van Glycefungine werden gemaakt op basis van verschillende materialen voor het voorkomen van slechte schoenen en voetengeur. Zij kwamen succesvol door klinische laboratoriumtests op dermatomycosis Ï 0 0 1 9 7 2 12 patiënten bij het Centraal Huid Venerologie Onderzoeksinstituut (Moskou). In vitro en in vivo tests toonden aan dat inlegzolen geïmpregneerd met de samenstellingoplossing anti-schimmeleffect hebben tegen Trvchophvton rubrum. de belang-5 rijkste oorzaak van voetmycosis, Trvchophvton qypseum en Microsporum canis. De inlegzolen verwijderen slechte geur, verzachten een jeukende huid, veroorzaken geen irritatie en kunnen succesvol gebruikt worden om mycose van de voeten te voorkomen.

10 Inlegzolen geïmpregneerd met Glycefungine werden getest bij het Instituut voor Fysieke Cultuur (Moskou) dat aanbevolen heeft dat het binnenopppervlak van sportschoenen geïmpregneerd is met Glycefungine-oplossing tijdens het produktieproces ((Opinie van het Russisch Olympisch Comité 15 van 12 November 1992).

4.2. Klinische proeven in gynaecologie

De tests werden uitgevoerd bij het 15e Vrouwen Consultatie Centrum (Moskou).

20 27 vrouwen die leden aan vaginale infecties werden onderzocht en behandeld met een 10% olie-oplossing van Glycefungine (10 behandelingen). De samenstelling werd lokaal aangebracht in de vorm van irrigaties en tampons geïmpregneerd met de samenstelling.

25 Het bacteriële en virale gehalte van het cervicale kanaal van de vagina en urinebuis werden geanalyseerd door de directe immunofluorescentiemethode voor en na behandeling. Het bleek dat de samenstelling de slijmvliesweefsels van de vagina niet irriteert, de ontwikkeling van Candidosis 30 voorkomt, de klinische symptomen van infectie-ontsteking (uitscheidingen, jeuk, pijn) effectief onderdrukt, en het bateriogram normaliseert. Het dominerende effect van de samenstelling werd getoond in de behandeling van patiënten met cervicale vagina-afwijkingen veroorzaakt door Herpes 35 simplex virus, en de protozoën Chlamidium. Gardnerella. die volledig verminderd werden door de olie-oplossing van Glycefungine gedurende 10 behandelingen. Combinatie van de samenstelling met een aantal geneesmiddelen (Polygenax, Macmiror, 1001972 13

Dardum, Fortum, Ciprobay) bracht de volledige genezing van gemengde vaginale infecties.

5. Veterinaire toepassingen 5 5.1. Proeven in veterinaire klinieken

Een zalf met 10% Glycefungine werd bestudeerd in het Pyatigorsk Veterinair Station bij 30 katten en 25 honden die leden aan microsporia. Vastgesteld werd dat de samen-10 stelling welke gedurende 7 dagen werd aangebracht (3 keer per dag) de symptomen van microsporia volledig genas. Aangetaste huidzones werden hersteld, het haar groeide aktief. De samenstelling wordt aanbevolen in de diergeneeskundige praktijk als antischimmel-, genezend middel.

15 5.2. Het effect op Leptospira. Salmonella en luchtmicroflora

De proeven om dit effect te testen werden uitgevoerd bij het Staats Russisch Wetenschappelijk Onderzoeksinstituut voor Controle, Standardisatie en Certificering van 20 Veterinaire Geneesmiddelen.

De tests werden uitgevoerd op virulente produktie-series van Leptospira van 6 serologische groepen: Pomona, Tarassovi, Grippotyphosa, Icterohaemorragi, Canicola,

Sejroe. Deze groepen worden gebruikt voor de produktie en 25 controle van vaccins tegen leptospirosis in dieren.

De groep van Salmonella enteritidis en luchtmicrof lora Staphylococcus album. S. aureus. Sarcina werd eveneens gebruikt.

10% Glycefungine als een wateralkalische oplossing 30 werd gebruikt voor studie op Leptospira. De controle was een 0,4% wateralkali-oplossing. Glycefungine oplossing werd toegevoegd in consistent afnemende concentraties (van 10*1 tot 10‘10) aan het speciale waterserum voedingsmedium voor Leptospirakweek. Aan elke lijn van opeenvolgende verdunnin-35 gen werden de verschillende series van Leptospira toegevoegd in een concentratie van 10%. De uitzaaiingen werden gedurende 10 dagen bij 28°C gekweekt. Op dagen 3, 5, 7 en 10 werd 1001972 14 de groei bepaald in een Petrov-Chausser's berekeningscamera met behulp van een microscoop.

Glycefungine werd opgelost in DMSO en in 0,4% natriumhydroxide-oplossing die gebruikt werd voor de studie 5 op Salmonella en luchtmicroflora. De controle-oplossing was hetzelfde oplosmiddel zonder samenstelling.

Aangetoond werd dat Glycefungine in een concentra-tiebereik van 10"1 tot 10'10 in 0,4% water-alkali- oplossing en van 2*10'3 tot 2*10*12 in DMSO-oplossing geen bactericide 10 en bacteriostatisch effect op Leptospira en Salmonella vertoont. De samenstelling in een concentratie van 10'1 opgelost in 0,4% water-alkali-oplossing onderdrukt de groei van Staphylococcus en Sarcina. Deze resultaten tonen de echte mogelijkheden van 10% Glycefungine in een water-alka-15 li-gebruiksvorm als een biosupplement aan het speciale voedingsmedium voor Leptospira kweek tijdens vaccin vervaardiging in de biofabrieken. Het selectieve bacteriostatische effect van 10% Glycefungine-oplossing op luchtmicroflora en het ontbreken van zijn invloed in Leptospira groei in vitro 20 zijn een zeer gunstige eigenschap van Glycefungine voor het voorkomen van het verschijnen nadelige microfloragroei in kolven met zuivere vaccinkweken.

De extra tests uitgevoerd bij het Epidemiologie en Microbiologie Onderzoeksinstituut (Moskou) met Glycefungine 25 toonden aan dat het bij verschillende doses (1-100 mg/kg, p.o.) dieren (muizen, ratten) beschermt tegen dood veroorzaakt door sommige infectieuze agentia ((Salmonella tvphi. etc.).

Het immuunstimulerende effect van Glycefungine 30 werd onthuld door agar-vrije lokale haemolyse in erythrocyt monolagen. De samenstelling bij een dosis van 10 mg/kg verhoogt haemagglutinine titers in muizebloedserum en het aantal antilichaamproducerende cellen in de milt van de rat significant.

35 6. Therapeutische samenstellingen

De samenstelling kan gebruikt worden in dermatologie, gyneacologie, oncologie, epidemiologie als een potent 1001972 15 niet-toxisch plante-agens met een ruim bereik aan biologische aktiviteiten, voor profylaxis en behandeling van bacte-riële, protozoïsche, schimmel- en virale infecties, verschillende soorten tumoren, lokale ontstekingen, immuunaf-5 wijkingen.

De therapeutische samenstelling kan toegepast worden in de veterinaire praktijk voor lokaal gebruik (zalven, olie-oplossingen, crèmes, sprays, etc.) en voor gebruik in mensen, bijvoorbeeld cosmetologie (als een bioaktief 10 concentraat toegevoegd aan lotions, zepen, sprays, crèmes, etc.), voor kleding, maandverband, tampons en schoeiselpro-duktie geïmpregneerd met de samenstelling, en in de voedingsindustrie als natuurlijk conserveringsmiddel.

15 VOORBEELD 2 Vodexol 1. Bereiding

Het gehakte ruwe gras (tenminste 1,0 mm) werd eerst bewerkt met methyleenchloride en vervolgens met 70% 20 aceton. Vervolgens werd het zo verkregen materiaal geëxtraheerd gedurende 1 uur met heet water bij een temperatuur van 80-90eC. De verhouding tussen extractiemiddel en ruw materiaal is 1:8. Het verkregen extract werd afgegoten en een tweede extractie werd onder analoge omstandigheden uitge-25 voerd, behalve voor de verhouding die 1:5 was. Vervolgens werd de extractie een derde maal (1:5) herhaald. De verkregen tweede en derde extracten werden aan de eerste toegevoegd en drooggedampt in een vacuümapparaat tot een uiteindelijk vochtgehalte van 30-32%.

30 De quantitatieve opbrengst van het produkt is 35,5%. Het produkt is een zeer aromatische dikke massa die in donkerbruine draden getrokken kan worden.

2. Chemische samenstelling 35 De kwalitatieve analyse van het produkt werd uitgevoerd met behulp van chromatografie. De aanwezigheid van 4 glycosidische terpeneoïden werd vastgesteld. TLC werd uitgevoerd op een geïnactiveerd aluminiumoxide, de mobiele 1001972 16 fase is chloroform en benzolazijnzuur (90:10, 98:2, 97:3). Als ontwikkelaar werd joodnevel gebruikt.

De quantitatieve bepaling van saponines werd uitgevoerd door een gravimetrische bepaling met neerslag van 5 diethylether uit alcoholoplossing. Het saponinegehalte is 29,8%.

Verder werd het produkt geanalyseerd op flavono-idegehalte. Het onderzoek werd uitgevoerd door middel van een twee-fase chromatografiemethode (Zaprometov M.N. Phen-10 olie compounds and its investigation method. In: "Biochemical methods of plant physiology". Moscow, 1971, pl86-207).

De flavonoïden, zoals astragaline, kempferol, isoquercetine, etc., werden als referenties gebruikt. De mobiele fase was ofwel water/azijnzuur (85:15) of n-butanol/azijnzuur/water 15 (4:1:2).

De kwalitatieve analyse van de aminozuren werd uitgevoerd door papierchromatografie op "Filtrak" (nummer 1) papier met behulp van 0,5 g Vodexol in 5 ml gezuiverd water. De gebruikte mobiele fase was n-butanol/azijnzuur/water 20 (4:1:2). Als referentie werden standaardmonsters van aminozuren, zoals arginine, asparaginezuur, alanine, valine, serine, glycine, etc. gebruikt. Een 0,2% alcoholoplossing van ninhydrine was de ontwikkelaar. 7 aminozuren werden gedetecteerd. Door de ninhydrinemethode van quantitatieve 25 bepaling werd 64,5 mg aminostikstof gedetecteerd in 100 g produkt.

De quantitatieve bepaling van oxycinneminezuren werd uitgevoerd door ionenwisselaarschromatografie met verdere titratie. Ionenwisseling werd uitgevoerd op catio-30 niet KU-2 welke een adsorbtieve waarde heeft op natrium-chloride van 1,8 mg/equiv., op natriumhydroxide van 8,0 mg/equiv. Een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid Vodexol werd in een maatkolf gedaan en water werd toegevoegd tot een beperkt volume. Het bepaalde volume oplossing werd genomen 35 en door een kolom geleid die gevuld was met cationiet KU-2 (V = 2 ml/min). Vervolgens werd de kolom gewassen met een zesvoudig volume water.

1001972 17

Eluaat en doorloopwater werden gecombineerd, 1 ml broomthymol donkerblauw werd toegevoegd en getitreerd met 0,1 N oplossing van natriumhydroxide tot een donkerblauwe kleur.

5 De controletest werd tegelijkertijd uitgevoerd waar dezelfde hoeveelheid water getitreerd werd.

De quantitatieve bepaling van monosacchariden werd als volgt uitgevoerd. Een precies afgewogen hoeveelheid Vodexol werd gemengd met 80% ethylalcohol in een verhouding 10 van 1:50 op een kokend waterbad in een kolf met terugvloei-koeling gedurende 1 uur voor de scheiding van alcoholoplos-bare suikers. Het verkregen alcoholextract werd na koelen gescheiden van de neerslag. De niet-koolhydraatverbindingen werden verwijderd uit de filtraat door een 10% oplossing van 15 Pb(CH3COO)2 (loodacetaat). Het gefilterde alcoholextract werd vervolgens door een laag natriumsulfaat geleid, gedroogd en de rest werd opgelost in een vijfvoudig volume (ten opzichte van de Vodexolmassa) methanol. Suikers werden neergeslagen uit de methanoloplossing met een gelijk volume 20 aceton. De neerslag werd gescheiden en geanalyseerd door chromatografiebepaling. De identificatie van vrije monosacchariden werd uitgevoerd door een chromatografiebepaling op FN-11 papier in de volgende systemen: n-butanol-pyridine-water (6:4:3), ethylacetaat- azijnzuur-mierezuur-water 25 (18:3:1:4), en eveneens door dunne laag chromatografie op Silufol UF-254 platen. De chromatografie werd uitgevoerd in de volgende systemen: ethyl-acetaat-pyridine-water-n-butyl-alcohol-azijnzuur (5:4:4:10:2). Als ontwikkelreagentia werden in beide gevallen anilineftaalreagens (voor gehy-30 drogeneerde suikers), en Bonner's reagens (voor niet-gehy-drogeneerde suikers) gebruikt.

De volgende monosacchariden werden geïdentificeerd: glucose, galactose, arabinose, xylose, galacturon-zuur.

35 Het produkt bleek de volgende samenstelling te hebben: 1. Triterpeen saponines (glycerretinezuur, 24-oxyglycerretinezuur, uraletinezuur) 1 0 0 1 9 7 2 18 (totale hoeveelheid: 29,8%) 2. Flavonoïden (isoquercitine, astragaline, kempferol en glifoside) (totale hoeveelheid: 6,5%) 5 3. Oxycinnaminezuren (ferruline, chlorogenine, caffeïnezuren) (totale hoeveelheid: 4,82%) 4. Pectine-achtige substanties (totale hoeveelheid: 40,5%) 10 5. Polysacchariden (totale hoeveelheid: 24,61%) monosacchariden (glucose, galactose, arabinose, xylose, galacturonzuur) (totale hoeveelheid: 7,6%) 15 6. Aminozuren (valine, serine, glycine, alanine, asparagine, arginine, asparaginezuur).

(totale hoeveelheid: 1,7-2,0%) 3. Biologische eigenschappen 20 3.1. Algemeen

De acute toxiciteit is zeer laag. LDS0 werd berekend met behulp van Kerber's methode met gebruikmaking van witte muizen. LD50 voor orale toediening was 4666 mg/kg, en voor intraperitoneale toediening 4833 mg/kg.

25 3.2. Anti-ontstekingseffecten

De experimenten werden uitgevoerd bij de Pyatigo-resk Staats Farmaceutische Academie. Onthuld werd dat de samenstelling bij een dosis van 50 mg/kg, p.o. acuut oedeem 30 van de rattepoot remde, welke geïnduceerd was door een 10% oplossing kaoline, in 22% van de gevallen. Ortofeen werd gebruikt als standaard.

De samenstelling remde de ontstekingsreactie bij 10 mg/kg in 18,5% van de gevallen.

35 Vodexol werd bestudeerd in lokale toediening in de vorm van een zalf. 0,5% Prednisolon zalf werd toegepast als standaardgeneesmiddel. De bestudeerde monsters verschilden niet van het standaardgeneesmiddel wat betreft hun aktivi- 1001972 19 teit. Vodexol toonde 16% remming, terwijl de Prednisolon zalf 4,4% vertoonde gedurende de eerste 2 uur. Daarna waren de resultaten respectievelijk 21-26% en 20-29%.

5 3.3. Anti-allergisch effect

Dit effect werd aangetoond op de passive cutane anafylaxis in de rat (RPCA) gemedieerd door IgE-antilichamen (type I overgevoeligheidsreactie). De samenstelling in een dosis van 50 mg/kg, p.o., remde RPCA in 58,4% van de geval-10 len (enkele toediening) en in 71,2% van de gevallen (5 toedieningen voor antigeen challenge) en overtrof de stan-daardgeneesmiddelen (Diasolion en Glyceram) in aktiviteit.

3.4. Immuun-stimulerend effect 15 De studie werd uitgevoerd bij de Pyatigorsk Staats

Farmaceutische Academie. Aangetoond werd door agar-vrije lokale haemolyses in erythrocyt monolagen dat de samenstelling in een dosis van 50 mg/kg significant de haemagglutini-ne titers in muizebloedserum verhoogde en het aantal antili-20 chaam producerende cellen in de milt van de rat.

3.5. Anti-HIV tests

Aangetoond werd dat de samenstelling de virus HIV-1 absorptie (HTHIV27) op lymfoblastoïde cellen MT-4 remde 25 met 100% in een concentratie van 100 μΐ/ml (100 gamma). Deze proeven werden uitgevoerd bij het Laboratorium voor Geassocieerde Infecties van het Epidemiologie en Microbiologie Onderzoeksinstituut (Moskou).

30 4. Cosmetische samenstellingen

Op basis van de samenstellingen werden cosmetische middelen ontwikkeld (anti-acnecrème, anti-rimpelcrème en voedende crème; anti-roosshampoo met hyposensitisatie en anti-ontstekingseigenschappen, sprays) en werden beperkte 35 klinische proeven uitgevoerd.

De shampoo die de samenstelling bevat heeft anti-ontstekings-, wondgenezende, anti-allergische en tonische effecten. Het verschaft zachtheid aan huid en haar, geeft 1001972 20 het een aangename geur, verwijdert jeuk en voorkomt het verschijnen van roos. De concentratie Vodexol in de shampoo is 0,5%, 1,0% en 2,0%.

De voedende crème die de samenstelling bevat heeft 5 anti-ontstekings- en verzachtende effecten, de huid wordt zeer zacht en fluweelachtig.

5. Therapeutische en cosmetische samenstellingen

De Vodexol samenstelling kon gebruikt worden als 10 anti-ontstekings-, anti-allergisch middel in de geneeskunde en cosmetologie.

VOORBEELD 3 Esefsol 15 1. Bereiding

Het ruwe materiaal dat overbleef na extractie door methyleenchloride werd onder vacuüm geëxtraheerd met 70% aceton tot uitputting van het ruwe materiaal. De uitputting werd gevolgd door specifieke reacties op triterpenen. De 20 extractietijd is 3 uur. Het extract werd drooggedampt tot 1/4 van het volume in een vacuümapparaat (type "Simax"). Het residue werd gedroogd in een speciale dispersiedroogdoos met een ingangstemperatuur van 160-180eC en een uitgangstempera-tuur van 110-120°C. De droogtijd is 1 uur. De verkregen 25 substantie is een licht zandachtig poeder.

2. Chemische samenstelling

Een kwalitatieve analyse werd uitgevoerd door middel van papierchromatografie in een systeem van n-butyl-30 alcohol/ethylalcohol/1 N ammonium (6:1:3).

Als de ontwikkelaars voor triterpenoïde werd een 1% alcoholoplossing van silicium-wolfraamzuur en een 0,1% methyleenvioletoplossing gebruikt. De referentie was een glycerrizininezuuroplossing.

35 De aanwezigheid van flavonoïden werd kwalitatief bepaald door middel van papierchromatografie in de systemen verdund azijnzuur/water (85:15) en n-butanol/azijnzuur/water (4:1:2). Daarna werden de chromatogrammen onderzocht on 1001972 21 ultra-violetlicht en bewerkt met ammoniumnevels. Als de ontwikkelaar werd rutine-standaard gebruikt.

Kwantitatieve analyse van flavonoïden werd uitgevoerd door spectrofotometrische bepaling (λ-374 nm), rutine-5 oplossingen werden gebruikt als de standaards. De samenstelling moet niet minder dan 14% flavonoïde bevatten.

Kwantitatieve analyse van saponines werd eveneens uitgevoerd door spectrofotometrische bepaling. Voor de constructie van een kaliber diagram werd een oplossing van 10 glycerrizininezuur (λ-258 nm) gebruikt. De hoeveelheid saponines is 24%.

De standarisatie van Esefsol op triterpeen saponines werd uitgevoerd met behulp van reverse phase HPLC. De scheiding van de componenten werd uitgevoerd in een multi-15 plan detectieregime (in een interval van 210 tot 250 nm).

De aglyconen van triterpenoïde werden bepaald na zure hydrolyse in methanol-glycerretinezuur, uraleninezuur, 24-oxyglycerretinezuur (de vierde spot op de chromatogram-men, 11, 13 (18)-dieen-3,2,4-diol-30inezuur).

20 Kwantitatief gehalte aan aglyconen na hydrolyse is 6,6%. Het absorptiespectrum van terpenoïde werd opgenomen in een flow stop regime (bereik 210-250 nm) . Het aantal pieken, zijn maten van verdunning en asymmetrische coëfficiënt werden gebruikt als geoptimaliseerde kriteria. Het aangeven 25 van het substantiegehalte (280 nm) werd uitgevoerd door de methode van interne normalisatie in een automatisch regime zonder achtergrondcorrectie. Er werden 4 saponines gevonden, het relatieve gehalte waarvan bepaald werd met een nauwkeurigheid van +3%. Het relatieve triterpenoïdegehalte is 24% 30 (het gemiddelde van 16,3%; 39,4%; 21,8%; en 22,5%).

De volgende componenten werden gedetecteerd: 1. Triterpenoïden (glycerretinezuur-16,3%, uralenine-zuur-39,4%, 24-oxyglycerretinezuur-21,8% (totale hoeveelheid: 24%).

35 2. Flavonoïden (rutine, kempferol, astragaline, nico- tiflorine) (totale hoeveelheid: 14,3%).

1001972 22 3. Biologische eigenschappen 3.1. Algemeen

De acute toxiciteit is laag, de LD50 was meer dan 5000 mg/kg, er werden geen allergene en lokale irriterende 5 eigenschappen waargenomen.

3.2. Anti-ontstekingseffect

De experimenten werden uitgevoerd in witte ratten. 10% Caoline-oplossing induceerde acute ontstekingsreactie na 10 subplantaire injectie. Een zalf met 5% van de samenstelling (gebaseerd op lanoline en vaseline 1:1) werd lokaal aangebracht. De samenstelling verminderde het oedeem aan de rattepoot gedurende het eerste uur met 11,2%, gedurende het tweede met 11,9%, gedurende het vierde met 20,1%, en gedu-15 rende het vijfde met 26,6%.

3.3. Hepatobeschermend effect

Dit werd onthuld in experimentele hepato-dystrophy geïnduceerd door 50% olie-oplossing van CCL4. De samenstel-20 ling in een dosis van 25 mg/kg, p.o., verminderde choleste-rinegehalte in bloed statistisch significant met 50%, en triglyceride met 60%. Het verhoogde het totale eiwit met 12,5%, en hepatisch glycogeen met 400%. De samenstelling overtrof Legalon voor wat betreft aktiviteit. De tests 25 werden uitgevoerd bij de Pyatigorsk Staats Farmaceutische Academie.

3.4. Anti-HIV-tests

Aangetoond werd dat de samenstelling in de concen-3 0 tratie van 50 /ig/ml (50 gamma) de adsorptie van virus HIV-1 (HTHIV27) op lymphoblastoïdecellen MT-4 met 100% verminderde. De proeven werden uitgevoerd in het Laboratorium voor Geassocieerde Infecties van het Epidemiologie en Microbiologie Onderzoeksinstituut (Moskou).

35 3.5. Hypolipidemisch effect

Flavonoïdes vertonen hypolipidemische effecten onder de omstandigheden van "twin-60 probe". Hyperlipemie in 1001972 23 ratten werd geïnduceerd door intraperitoneale injectie van twin-60 (80-200 mg/100 kg lichaamsgewicht). Het zogeheten "Vitamine-model" werd eveneens gebruikt: orale toediening gedurende 4 dagen van 2 ml alcohol- en olie-oplossingmeng-5 seis van vitamine B2 in een dosis van 200 mg/kg (80000 ED/110 g lichaamsgewicht).

Cholesterine (2,54+0,11) en triglyceriden (2,03+0,15) gehaltes werden bepaald met op zichzelf goed bekende methoden. Polysponine werd gebruikt als de standaard 10 (2,49+0,04 en 1,04+0,14).

De afname van cholesterine in bloed met 50% en van triglyceriden met 60%, en een totale eiwitafname van 12,5% werden aangetoond in ratten met toxische hepatitis geïnduceerd door orale toediening van vitamine in een hoeveelheid 15 van 25 mg/kg. De verlaging van cholesterine met 23%, en van triglyceriden met 41% in vergelijking met de controle werd aangetoond in hepatisch weefsel. De enzym-aktiviteit werd gereduceerd met 35,2% en 46,1% en het glycogeenniveau in lever werd verhoogd met 400% in vergelijking met de contro-20 le.

4. Therapeutische samenstellingen

De Esefsol-samenstelling zou gebruikt kunnen worden in de geneeskunde als hypolipidemisch, hepato-be-25 schermend, lipidemetabolisme-modulerend middel.

Het zou eveneens geschikt zijn om de samenstelling te gebruiken in cosmetologie als een biologisch actieve component in crèmes met anti-ontstekings-, capillaire beschermende eigenschappen (in liposomale structuren), sham-30 poos (een goed oplossend effect wordt verschaft door triter-penoïdesaponines).

VOORBEELD 4

Polysaccharidecomplex (Polysol) 35 1. Bereiding

Monsters van het ruwe materiaal gehakt tot 1 mm met een massa van 250 g werden geladen in een laboratorium- 1001972 24 extractor (filtratietype). De scheiding van lipofiele en fenolsubstanties uit het ruwe materiaal werd uitgevoerd.

Verwijdering van het vet werd uitgevoerd door toevoegen van een zevenvoudige hoeveelheid methyleenchloride 5 ten opzichte van de massa van de ruwe materialen. Het verkregen extract (1,5 1) werd gebruikt voor de produktie van Glycefungine.

Het gras ontdaan van het vet werd uitgeladen uit de extractor en gedroogd aan de lucht bij 20°C tot volledige 10 verwijdering van het extractiemiddel uit het ruwe materiaal. Daarna werd het gedroogde ruwe materiaal in een extractor gedaan en gemengd met 82% waterige alcohol voor het verkrijgen van alcoholoplosbare suikerfractie. Deze fractie werd gescheiden van niet-suiker (fenol) componenten met behulp 15 van een 10% oplossing van Pb(CH3COO)2 en natriumsulfaat. Precipitatie werd uitgevoerd en filtratie van het sediment uitgevoerd van het natriumsulfaat. Het sediment werd gescheiden, het filtraat werd gecondenseerd tot 100 ml en opgelost in een vijfvoudige hoeveelheid methanol. Suikers 20 werden neergeslagen door aceton (1:3). Het sediment werd na een half uur uitzakken gefiltreerd onder vacuüm, gewassen met aceton en gedroogd, gebrand aan de lucht, daarna in een vacuüm droogdoos tot een constante massa bij 105°C voor het volledig verwijderen van de aceton. De opbrengst van deze 25 fractie is 1,2%.

De rest van de ruwe materialen werd tweemaal gedroogd en tweemaal geëxtraheerd met heet water (1:20) op een kokend bad voor de scheiding van wateroplosbare polysac-chariden. Een waterfractie werd gecondenseerd onder vacuüm 30 tot een half volume. Een drievoudig volume methanol werd aan het extract toegevoegd. De verkregen neerslag is een complex van wateroplosbare polysacchariden (opbrengst: 6,5%).

2. Chemische samenstelling 35 De quantitatieve karakterisering van het produkt werd uitgevoerd door gravimetrische bepaling van wateroplosbare polysacchariden in het complex. Hiervoor werd een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid Polysol opgelost in water 1001972 25 onder verhitting op een kookbad tot verdwijning van de troebelheid van de oplossing. De hete oplossing (90°C) werd in porties in sterke ethylalcohol gegoten onder constant mengen. Het verkregen sediment werd gescheiden door filtra-5 tie onder vacuüm (bij een restdruk van 13-16 kPa) door glasfilter PDR-16 en gedroogd tot een constant gewicht. Het sediment op het filter werd gewassen met 70% ethylalcohol, vervolgens met watervrije aceton en op een constant gewicht gebracht in een droogkast.

10 De onderzoekingen van de polysacchariden werden uitgevoerd na hydrolyse in 10% zwavelzuuroplossing bij 100 ± 5°C. Identificatie van vrije monosacchariden werd uitgevoerd door een chromatografiemethode (op papier FN-11) in een systeem n-butanol/pyridine/water (6:4:3) en door een dunne 15 laag chromatograf ie in het systeem ethylacetaat/pyridine/wa-ter/n-butylalcohol/azijnzuur (5:4:4:4:10:2).

De ontwikkelaar is een aniline-ftalinereagens en Bonner's complex. Polysacchariden werden bepaald door een gravimetrische methode, gehydrogeneerde en zure suikers door 20 een spectrofotometrische bepaling met picrinezuur en carbo-zol.

Voor de bepaling van het monosaccharidegehalte van wateroplosbare polysacchariden werd de hydrolyse uitgevoerd in een 10% oplossing zwavelzuur bij 102 ± 2,5°C. De identi-25 ficatie van monosacchariden werd uitgevoerd door chromatograf iebepaling zoals eerder beschreven. Het quantitatieve gehalte aan gehydrogeneerde en zure suikers werd bepaald door een spectrofotometrische bepaling op apparaat SF-42. Voor de quantitatieve schatting van gehydrogeneerde suikers 30 werd de reactie met picrinezuur gebruikt, en voor zure suikers een met carbozol.

Eiwitcomplex werd geanalyseerd door de methode van Louri. Het as-gehalte van wateroplosbare polysaccharidefrac-tie werd berekend door de Pharmacopeia.

35 De verkregen gegevens worden weergegeven in tabel 1.

1001972 26

Tabel 1

Totale Monosaccharidegehalte Hoeveelheid suikers, Hoeveel- Ashoeveelheid % heid eiwit- gehalte % 5 polysacchari- ---- bestandde- neutraal zuur gehydro- zuur % geneerd % 35.5-40-0 galactose, galacturon- 3.5-3.9 arabinose, zuur 12.6-13.0 11.0-11.4 10 glucose, 22.2-22.4 xylose glucose - 29.97 - 16.9-17.2 15 Wateroplosbare polysacchariden zijn verwant aan de groep van glucuronaglyconen. Vrije suikers worden weergegeven door glucose, galactose en saccharose.

De samenstelling van Polysol is als volgt: 1. monosacchariden (glucose, galactose, arabino- 20 se, xylose, galacturonzuur) (hoeveelheid: 16,1%); 2. polysacchariden (hoeveelheid: 35,56%); 3. gehydrogeneerde suikers 25 (hoeveelheid: 12,65%); en 4. zure suikers (hoeveelheid: 3,44%).

3. Biologische eigenschappen 30 3.1. Antitumor-effect

De samenstelling in een dosis van 10-15 mg/kg door middel van intraperitoneale injectie gedurende 5 dagen onderdrukte de groei van sarcoma 37 met 59%. Bij dezelfde doses remde de samenstelling die gedurende 10 dagen werd 35 toegediend de groei van melanoma B-16 met 54% en verhoogde de levensduur van genezen dieren met 25% en eveneens met Erlich's tumor met 38%. De samenstelling in een hoeveelheid ,01972 27 van 100 mg/kg gedurende 10 dagen toediening verhoogde de levensduur van muizen met melanoma B-16 met 36% en met ascites Erlich's tumor met 66%.

5 VOORBEELD 5 eiycacet 1. Bereiding

Deze samenstelling werd afgeleid uit de extractie van gehakt gras (0.2 mm grootte, methode dezelfde zoals 10 boven beschreven) met watervrije aceton (verhouding tussen ruw materiaal en extractiemiddelen is 1:7). Het extractiemiddel werd onder vacuüm verdampt en het extract werd gedroogd bij 50-55°C.

15 2. Chemische samenstelling

De chemische samenstelling werd bepaald zoals beschreven in Voorbeeld 1.

Het carotenoïde-gehalte van Glycacet werd uitgevoerd door hoge-prestatie-vloeistofchromatografie (HPLC) op 20 MILIOHROM-E apparaat. De kolom van het apparaat werd gevuld met Silasorb-600. Als mobiele fase werd heptaan-isopropanol (8:2) gebruikt bij 326 nm (golflengte). De standard was een 0,002% oplossing van zuivere beta-caroteïnepropanol. De berekening werd uitgevoerd door de calibratiemethode.

25 De bepaling van isoflavonoïden werd uitgevoerd door dunne-laag-chromatografiebepaling in een vaste laag van silicagel in een systeem van chloroform verzadigd met water; chloroform-ethanol (3:1) en eveneens door papierchromatogra-fie op papier merk M in het systeem: n-propanol - azijn-30 zuur - water (1:1:7); n-butanol - azijnzuur - water (4:1:5). Er werden twee spots ontdekt. Een daarvan werd gekarakteriseerd als prunetine, de tweede als fytoalexine.

De quantitatieve bepaling van isoflavonoïden werd uitgevoerd met behulp van de methode van Wilson met een 35 modificatie van A. Guseva, gebaseerd op het verschijnen van geel gekleurde complexen met boorzuur in een verhouding van 1:1. Citroenzuur werd gebruikt als supplement dat de kleur versterkt en stabiliseert. Verdere analyse werd uitgevoerd 1001972 28 door een fotometrische bepaling op polyfotometersysteem LABOR (Hongarije) met een groen licht filter.

De bepaling van phytosterines werd uitgevoerd door dunne-laagchromatografie in een vaste laag van silicagel in 5 het systeem van: chloroform - methanol - water (65:30:10).

Na drogen werd het chromatogram ontwikkeld met Sanye reagens (5% alcoholoplossing van vaniline), verhit bij 110°C gedurende 10 min in een droogkast en werd vervolgens besprenkeld met een 50% oplossing van zwavelzuur en opnieuw verhit.

10 Er werden twee spots vastgesteld, een van hen kwam overeen met de standaard-beta-sitosterin (geelbruin gekleurde spot).

De quantitatieve analyse van phytosterines werd als volgt bepaald: een 10% aceton-oplossing van een fractie 15 in concentraties 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 μΐ en 0,1% oplossing betasitosterine werden op een chromatografische plaat "Sorbfil" aangebracht. Chromatografie werd uitgevoerd in een systeem van heptaan/isopropanol (9:1). Zij werden vervolgens ontwikkeld in jooddampen.

20 De samenstelling was als volgt: 1. chlorofyl A en B (hoeveelheid: 4,0-4,5%) 2. harsen (harszuren van de diterpeenserie, koolwaterstoffen) 25 (hoeveelheid: 2,0-2,5%) 3. onverzadigde vetzuren (oleïne, linoleen, palmitine) (hoeveelheid: 36,29-40,11%) 4. carotinoïden 30 (hoeveelheid: 0,27-0,28%) 5. isoflavonoïden (hoeveelheid: 3,22-3,26%) 6. sitosterines (beta-sitosterine, stigmasteri-ne) 35 (hoeveelheid: 1,9-2,1%) 1001972 29 3. Biologische eigenschappen

De tests om de biologische aktiviteit te bepalen werden uitgevoerd bij het Instituut voor Medische en Biologische Problemen (Moskou) en het Centraal Huid Venerologie 5 Instituut (Moskou). Ontdekt werd dat Glycacet een sterke anti-bacteriële en anti-schimmelaktiviteit bezit.

De experimenten werden uitgevoerd in vitro door de agardiffusiemethode op kweken van dermatofyt, schimmel, Staphylococcus aureus. Bacillus polvmvxa. Onthuld werd dat 10 het extract leidt tot vertraagde groeizönes van pathogene schimmels (Trichophyton rubrum - 0,3 mm, T. interdiqitale -2,6 mm, T. ovpseum - 2,6 mm, Microsoorum canis - 3,2 mm) en bacteriën (Staphylococcus aureus - 4,0 mm, B. polvmvxa - 5,0 mm) .

15 VOORBEELD 6 Glycochlor 1. Bereiding

De samenstelling was afgeleid van het gehakte (0,2 20 mm groot) gras door extractie met chloroform (verhouding 1:7). Het extractiemiddel werd afgedampt onder vacuüm, vervolgens werd natriumhydroxide (0,4% oplossing) toegevoegd aan het extract bij 50°C en het werd gedroogd.

25 2♦ Chemische samenstelling

De chemische samenstelling werd bepaald zoals beschreven in Voorbeeld 1. De bepaling van natriumzouten van onverzadigde vetzuren in de chloroform-fractie werd uitgevoerd door titermetrische bepaling. Een nauwkeurig afgewogen 30 hoeveelheid van het extract werd opgelost in 50 ml pure ethylalcohol onder verhitting. Na volledige oplossing daarvan werd de oplossing ontwikkeld met heptaan in een scheid-trechter. De gewassen ethanoloplossing werd verdund met water tot 100 ml volume, 25 ml chloroform werd toegevoegd en 35 de resulterende oplossing werd getitreerd met 0,1 mol/1 HCl-oplossing (zoutzuur).

Voor de bepaling van het equivalentiepunt werd de potentiometer gebruikt.

1001972 30

De samenstelling was als volgt: 1. Natriumzout van chlorophyl 4,0-4,2% 2. beta-sitosterine 0,02% 3. natriumzouten van onverzadigde vetzuren 5 (palmitaten, oleaten) 33,9-37,5% 3. Biologische eigenschappen

De sterke antibacteriële en antischimmeleffecten werden gedemonstreerd in de laboratoria van het Instituut 10 voor Medische en Biologische Problemen (Moskou) en het

Centraal Huid Venerologie Instituut (Moskou) door dezelfde methode als boven geschreven.

VOORBEELD 7 15 Cosmetische samenstellingen

Er werden verschillend cosmetische samenstellingen bereid volgens de volgende recepten. Deze samenstellingen werden klinisch getest.

1. Profylactische anti-acne crème 20 Glycefungine 3,0

Vodexol 3,0

Polyethyleenoxide-4 00 43,0

Polyethyleenoxide-1500 51,0 25 2. Voedende anti-rimpel crème

Vodexol 0,5

Esefsol 0,5

Was 6,0

Stearine 5,0 30 Stearaten 3,0

Olijfolie 40,0 3-Ethanolamine 1,0

Nipagine 0,2

Vitamine E 0,5 35 Water tot aan 100,0 1 Ü 0 1 9 7 2 31 3. Antischimmelsorav

Glycefungine-oplossing 70% ethylalcohol 3,0

Twin-80 1,0 5 10% oplossing Polyvinyl- pyrrolidon 3,0 10% oplossing sorbitum 2,0

Ethylalcohol 30% 9,0%

Essentiële muntolie 2 druppels 10 4. AntischimmelDOtlood

Glycefungine 1,0

Polyethyleenoxide-400 1,0

Polyethyleenoxide-1500 6,0 15 Roze-olie 2 druppels 5» Anti-acne, anti-ontstekinas-. anti-alleraische. anti-bac-teriële. anti-schimmelcrème voor ruime toepassing in dermatologie 20 Glycefungine 6,6

Vodexol 2,4

Esefsol 3,0

Emulgator 88,0

Bijewas 25,0 25 Olijfolie 200,0

Dimethylsulfoxide 10,0

Ethylalcohol 96% 50,0

Water 630,0 30 De klinische proeven met deze crème werden uitge voerd op de Mycologie-afdeling van het Centraal Huid Venero-logie Instituut (Moskou). De efficiëntie van de crème werd bewezen op 46 patiënten die leden aan acne vulgaris (12), acne juveniles (14), acne rosaceae (2), atopische dermatitis 35 (11), contact dermatitis (4), candidosis van huidplooien (3) .

De crème werd gedurende 1-3 weken tweemaal per dag gebruikt op aangedane delen van de huid. Na behandeling werd 1001972 32 gedemonstreerd dat 12 patiënten volledig genezen waren, ll patiënten een opmerkelijke verbetering van hun conditie hadden, 21 patiënten een echte verbetering vertoonden, 2 patiënten geen veranderingen hadden. De beste resultaten 5 werden gevonden in patiënten die lijden aan contact dermatitis, atopische dermatitis en acne vulgaris.

De crème van de uitvinding overtreft sommige steroïdehormooncrèmes in klinische efficiëntie en vertoonde geen neveneffecten. De cosmetische samenstellingen worden 10 aangeraden als krachtige anti-bacteriële, anti-schimmel-, anti-ontstekings- en anti-allergische crèmes in dermatologische praktijk.

1 0 0 1 9 72

Claims (21)

1. Biologisch actieve samenstelling te verkrijgen door het extraheren van het gras van Glvcerrhiza glabra L. of een extract daarvan met een geschikt extractiemiddel.

2. Biologisch actieve samenstelling volgens con- 5 clusie 1, waarin het extractiemiddel gekozen is uit de groep die bestaat uit methyleenchloride, water, een mengsel van aceton en water (70%/30% (v/v)), aceton, chloroform, glycerine, polyethyleenoxide-400, olijfolie, diethylether, en petroleumether, of combinaties daarvan.

3. Biologisch actieve samenstelling volgens con clusie 1 of 2, waarin het gehakte gras zonder de wortels geëxtraheerd wordt met methyleenchloride onder vacuüm, waarna het extractiemiddel verdampt wordt voor het verkrijgen van een substantie die "Glycefungine” genoemd wordt.

4. Biologisch actieve samenstelling volgens con clusie 1 of 2, waarin het gehakte gras zonder de wortels eerst geëxtraheerd wordt met methyleenchloride, waarna het methyleenchloride afgedampt wordt, om een droog materiaal te leveren, dat vervolgens geëxtraheerd wordt met 70% aceton, 20 waarna het aceton verdampt wordt om een substantie te verschaffen met de naam "Esefsol".

5. Biologisch actieve samenstelling volgens conclusie 1 of 2, waarin het gehakte gras zonder de wortels eerst geëxtraheerd wordt met methyleenchloride, waarna het 25 methyleenchloride afgedampt wordt, om een droog materiaal te verschaffen dat vervolgens geëxtraheerd wordt met 70% aceton, waarna de aceton verdampt wordt en het zo verkregen materiaal vervolgens geëxtraheerd wordt met heet water bij een verhoogde temperatuur, bij voorkeur tussen 80 en 90°C, 30 de extractie eventueel tweemaal herhaald wordt, het extractiemiddel verdampt wordt en het materiaal gedroogd wordt voor het verkrijgen van een aromatische, dikke, visceuze, donkerbruine massa, genaamd "Vodexol".

6. Biologisch actieve samenstelling volgens con-35 clusie, waarin de lipophiele en fenolcomponenten gescheiden worden van het gehakte gras, het zo verkregen materiaal 1001972 behandeld wordt met een alcohol om de oplosbare suikerfrac-tie te extraheren, de suikers gezuiverd worden door neerslag met azijnzuur en natriumsulfaat, de verkregen neerslag vervolgens opgelost wordt in een alcohol en een polysaccha-5 ridecomplex met de naam "Polysol", in aceton opnieuw geprecipiteerd wordt.

7. Biologisch actieve samenstelling volgens conclusie 1 of 2, waarin het gras geëxtraheerd wordt met zuivere watervrije aceton voor het verkrijgen van een samenstel- 10 ling met de naam "Glycacet".

8. Biologisch actieve samenstelling volgens conclusie 1 of 2, waarin het gras geëxtraheerd wordt met chloroform, welke extractie leid tot een samenstelling met de naam "Glycochlor".

9. Werkwijze voor het bereiden van Glycefungine, omvattende het extraheren van de bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L. met methyleenchloride onder vacuüm, en het afdampen van het extractiemiddel.

10. Werkwijze voor het bereiden van Vodexol, 20 omvattende het bewerken van de bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L. met methyleenchloride en 70% aceton in water, het vervolgens extraheren van het zo verkregen materiaal met heet water bij een verhoogde temperatuur, bij voorkeur tussen 80 en 90°C, het eventueel tweemaal herhalen 25 van de extractie, het af dampen van het extractiemiddel en het drogen van het materiaal.

11. Werkwijze voor het bereiden van Efesol, omvattende het extraheren van bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L. met methyleenchloride, het extraheren van het ruwe 30 materiaal dat overblijft na methyleenchloride-extractie met 70% aceton in water, het verdampen van het extractiemiddel en drogen.

12. Werkwijze voor het bereiden van Polysol, omvattende het scheiden van de lipofiele en fenolbestandde- 35 len uit bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L., het behandelen van het zo verkregen materiaal met een alcohol voor het extraheren van oplosbare suikerfractie, het zuiveren van de suikers door precipitatie met azijnzuur en natri- 1001972 umsulfaat, het vervolgens oplossen van het verkregen preci-pitaat in een alcohol en het opnieuw precipiteren van het Polysol in aceton.

13. Werkwijze voor het bereiden van Glycacet, 5 omvattende het extraheren van de bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L. met zuivere watervrije aceton.

14. Werkwijze voor het bereiden van Glycochlor, omvattende het extraheren van bladeren van het gras Glvcerrhiza glabra L. met chloroform.

15. Gebruik van elk van de samenstellingen volgens één van de conclusies 1 tot 8 als biologisch actief middel.

16. Gebruik van elk van de samenstellingen volgens één van de conclusies 1 tot 8, of combinaties daarvan, voor de bereiding daarvan voor de bereiding van een therapeuti- 15 sche samenstelling voor de behandeling van schimmel-, bacte-riêle, virale, ontstekings-, tumor, protozoa-, allergische ziekten.

17. Weefsel geïmpregneerd met elk van de samenstellingen volgens één van de conclusies 1 tot 8, of combi- 20 naties daarvan.

18. Inlegzolen geïmpregneerd met één van de samenstellingen volgens één der conclusies l tot 8, of combinaties daarvan.

19. Cosmetische samenstelling omvattende elk van 25 de samenstellingen volgens één der conclusies 1 tot 8, of combinaties daarvan, en een geschikt excipiënt.

20. Therapeutische samenstellingen, omvattende elk van de samenstellingen volgens één van de conclusies l tot 8, of combinaties daarvan en een geschikt excipiënt.

21. Gebruik van Glycefungine voor de preventie van ongewenste microbiële groei in vaccinvervaardigingsproces-sen. 1001972 aAMfcN«6rtMNu5ita.'iUh«va· ',rw >.j- . ...... . ........ _ RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHE1DSONDERZOEK VAN INTERNATIONAAL TYPE ΙΙΟΕΝΠΡΙΚΑΤΙΕ VAN DE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van M aanvrager of ven 0· gemicnogoe L PS/MM/1 _ Neoenanose aanvrage nr. inoienngsaaijm 1001972 i. december 1995 In ge roepen voorrangïaaojm kan vrager (Naam) PARBOLD INVESTMENTS N.V. teum van nat verzoek voor een onoerzoex van mtemaaonaai type Door oe maanee voor intemaionaai Onoerzoek (ISA) aan net verzoek voor een onoerzoek van ntemaoonaai type eegeneno nr. 21 december 1995 SM 27004 ML·_ CLASSIFICATIE VAN HET ONDERWERP (bij ce passing van verscfrt ten oe etassifleaees. alle dassiticaoesymöolen opgeven) 'eigens oe mamaoonaie oassihcase (IPC) Cnt.C1.6: A 61 K 35/78, A 61 K 7/00, A 01N 65/00 ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK Onoerzocme minimum documentatie Classificatiesysteem I Classtficatiesvmpoten nt.Cl.6; A 61 K Onoerzocme an oer» cocumenao# can oe minimum oocumenaoe voor zover oergef jke ooeumanan at Oe onoerzoenta georeoen zin opgenomen * ^ Hl. 1 i GEEN ONOERZOEK MOGELUK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (opmerwngen op aanvullingsblad) | IV..' X 1 GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmenongen op aanvullingsoiad) _ J ?orm PCT/ISATPIfaiCS 19&i