MXPA99011528A - Composiciones de vacuna que comprenden el polipeptido flge de helicobacter pylori - Google Patents
Composiciones de vacuna que comprenden el polipeptido flge de helicobacter pyloriInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a los polipéptidos y a las composiciones de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora contra la infección por Helicobacter pylori. La invención se refiere además al uso de los polipéptidos de Helicobacter pylori en la fabricación de composiciones para el tratamiento o profilaxis de infección por Helicobacter pylori.
Description
COMPOSICIONES DE VACUNA QUE COMPRENDEN EL POLIPEPTIDO FlgE DE HELICOBACTER PYLORI
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a los polipéptidos y a las composiciones de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora para la infección por Helicobacter pylori. La invención se refiere además al uso de polipéptidos de Helicobacter pylori en la fabricación de composiciones para el tratamiento o profilaxis de infección por Helicobacter pylori ..
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Helicobacter pylori
La bacteria gram-negativa Helicobacter pylori (H. Pylori) es un patógeno humano importante, involucrado en diversas enfermedades gas troduodenales . La colonización del epitelio gástrico por la bacteria conduce a la inflamación activa y a la gastritis crónica progresiva, con un riesgo muy aumentado de. progresión a la enfermedad de REF.: 32167 úlcera péptica. Una inflamación de larga vida de la mucosa, gástrica está muy estrechamente correlacionada con un riesgo significativamente aumentado para cáncer gástrico. Con el fin de colonizar la mucosa gástrica,
H. pyl ori utiliza un número de factores de virulencia. Tales factores de virulencia comprenden diversas adhesinas, con las cuales la bacteria se asocia con el moco y/o se enlaza a las células epiteliales; la ureasa que ayuda a neutralizar el ambiente ácido; y las enzimas proteolíticas que hacen el moco más fluido. Además H. pyl ori es altamente móvil, nadando en el moco e introduciéndose dentro de las criptas. Se ha mostrado que la otilidad es un factor de virulencia esencial, ya que ningún H. pyl ori móvil ha fallado en infectar la mucosa en modelos experimentales, Eaton y colaboradores (Infection & Immunity 64(7), 2445-2448, 1996). Existen muchas posibles razones para esto, la más obvia es una incapacidad para nadar hacia abajo y acoplarse a las células mucosales, y la incapacidad para evitar los agentes nocivos en el ' estómago. A pesar de una respuesta inmune del huésped aparentemente fuerte contra H. pyl ori , con la producción de anticuerpos locales (mucosales) así como sistémicos, el patógeno persiste en la mucosa gástrica, normalmente por toda la vida del huésped. La razón para esto es probablemente que las respuestas inmunes espontáneamente inducidas son inadecuadas o están dirigidas hacia epítop^es erróneos de los antígenos. Alternativamente, la respuesta inmune podría ser del tipo erróneo, ya que el sistema inmune puede tratar a H. pyl ori como un comensal (como es indicado de la relación del tiempo de vida del huésped/bacteria) . Con el fin de comprender la patogénesis y la inmunología de las infecciones por H. pyl ori , es de gran importancia el definir la estructura antigénica de esta bacteria. En particular, existe una necesidad para la caracterización de la exposición superficial, la superficie asociada así como las proteínas secretadas las cuales, en muchos patógenos bacteriales, han mostrado constituir los principales factores de virulencia, y los cuales pueden ser útiles para el diagnóstico de iT. pyl ori , y en la fabricación de composiciones de vacuna. Si tales
' proteínas además de estar asociadas a la superficie también son esenciales para la supervivencia y/o la colonización, se incrementa su utilidad como un objetivo para la inmunoterapia mediada por vacuna. Cuando se somete a tensión o se ve amenazada, la célula de H. pyl ori se transforma de una forma bacilar a una forma cocoide. En la forma cocoide, la célula de H. pyl ori es mucho menos sensible a los antibióticos y a otros agentes antibacterianos. La evidencia circunstancial indica que H. pyl ori puede ser transmitida entre individuos en esta forma, posiblemente en el agua o por contacto directo (oral-oral; fecal-oral) . Una composición de vacuna eficiente debería por lo tanto promover una respuesta inmune hacia la forma cocoide y la forma bacilar de H. pyl ori . Ya que la inmunidad sistémica probablemente juega únicamente un papel limitado en la protección contra infecciones mucosales, es también importante que la composición de vacuna mejore los mecanismos inmunes protectores, localmente en el estómago.
Pro t eina de Ganch o Flagel ar
> Los ganchos flagelares de H. pyl ori han mostrado estar compuestos de las subunidades de FlgE de 78 kDa (O'Toole y colaboradores Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994) . El papel del gancho flagelar es conectar al flagelo con el motor flagelar submembranoso . La parte del gancho que se proyecta hacia fuera de la membrana es corto, de aproximadamente 60 nanómetros (en comparación aproximadamente a los 10 micrómetros para los flagelos) . Como el flagelo de H. pyl ori , el gancho está probablemente cubierto con una lámina (Geis y colaboradores (1993) J. Med. Microbiol. 38(5), 371- 377) . La secuencia de aminoácidos del polipéptido de FlgE tiene semejanza significativa con aquella de otras proteínas de gancho conocidas, incluyendo la homología limitada a otras especies de Heli cobac ter como mus tel ae (O'Toole y colaboradores, supra ) . Los anticuerpos policlonales producidos contra el polipéptido FlgE mostraron reactividad cruzada contra las proteínas flagelares A y B, indicando posiblemente la existencia de epítopes compartidos. La producción de H. pyl ori con ausencia de FlgE, dio como resultado una bacteria no móvil, aflagelar, donde el polipéptido FlgE fue todavía producido pero ' pudo únicamente estar recubierto en el citoplasma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1:
Efecto de la inmunización terapéutica de ratones infectados con H. pyl ori (n=9-l O/grupo ) con el polipéptido FlgE. Los resultados se dan como la media±SEM del número de H. pyl ori asociado con el antro (=A) , cuerpo (=B) o totalmente (A+C) (=C) . Abreviaturas: CFU, unidades formadoras de colonia (número de bacteria) ; barras no sombreadas=DOC + CT, solución salina amortiguada con Fosfato con 0.5% de desoxicolato administrada con la toxina del cólera a 10 µg/ratón; barras sombreadas=FlgE + CT, ratones administrados con 100 µg de FlgE y 10 µg de toxina del cólera. La disminución en cfu fue significativa en el antro y es calculada para el estómago completo. **p<0.01; *p<0.05 (prueba del rango del signo de Wilcoxon-Mann-Whittney) .
Figura 2 :
IgG en suero proveniente de ratón, medida mediante la técnica de ELISA: respuesta a la infección y a la inmunización con FlgE. Los valores son expresados como los títulos ±SEM. N=9-10/grupo . ELISA recubierta con H. pyl ori cepa 244: como un signo de anticuerpos específicos para H. pyl ori en la infección, pudo ser encontrado en sueros de animales tratados con DOC + CT (=A, Control/244). Después de la inmunización con FlgE + toxina del cólera (=B, FlgE/244 esta reactividad se incrementó 4 veces (**p<0.01; prueba de rango de signo de Wilcoxon-Mann-Whittney) . C=FlgE específico. La IgG específica de FlgE se incrementó en animales a los que se les administró FlgE + CT, pero no pudo ser detectada en animales control.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El propósito de esta invención es proporcionar un polipéptido de H. pyl ori antigénico que puede ser útil para promover una respuesta inmune protectora contra, y para el diagnóstico de, infección por H. pyl ori'. Este propósito ha sido logrado mediante clonación recombinante de un gen de H. pyl ori el cual codifica para un polipéptido esencial bien conservado. La secuencia de ácido nucleico de este gen es similar a la secuencia del gen f'l gE como fue publicado por O'Toole y colaboradores, Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994. Siendo una proteína esencial para la motilidad, el gen fl gE es expresado por- todas las cepas de H. pyl ori . Se ha encontrado sorprendentemente que. el polipéptido FlgE de H. pyl ori , a pesar del hecho de que únicamente una parte de la proteína de gancho es existente fuera de la bacteria y de que ésta es probablemente cubierta por una lámina, puede servir como un agente terapéutico en un modelo de ratón infectado por H. pyl ori , cuando se administra junto con la toxina del cólera como adyuvante. Los datos experimentales siguientes indican de este modo que el polipéptido de FlgE de H. pyl ori , cuando se utiliza como un inmunógeno oral, actúa como un estimulador de una respuesta inmune que conduce a una reducción significativa de la colonización de H. pyl ori en ratones los cuales fueron infectados con H. pyl ori un mes antes de la inmunización. Estos resultados apoyan fuertemente el uso del polipéptido de FlgE de H. pyl ori en una formulación de vacuna oral para el uso en humanos, para tratar y prevenir las infecciones por H. pyl ori .
Como tal, el polipéptido FlgE será útil para la detección de infecciones por H. pyl ori así como para la fabricación de composiciones de vacuna, las cuales, cuando se administran en una formulación farmacéutica apropiada promoverán una respuesta inmune protectora o terapéutica contra tales infecciones. En consecuencia, en un aspecto la presente invención proporciona un polipéptido FlgE de Hel i cobacter pyl ori para el uso en la inducción de una respuesta inmune protectora a la infección por Heli coba cter pyl ori . El término 'polipéptido FlgE de Heli coba ct er pyl ori" se pretende que signifique el polipéptido que es descrito por O'Toole y colaboradores, en Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994, y el cual es codificado por el gen cuya secuencia nucleotídica se describe como SEQ ID NO : 1 , o puede ser obtenida del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (National Center for Biotechnology Information) (Número de acceso U09549), o una forma modificada substancialmente similar del mencionado polipéptido, que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente. El término 'respuesta inmune protectora" se debe entender como una respuesta inmune que hace a la composición adecuada para fines terapéuticos y/o profilácticos.
El término 'antigenicidad funcionalmente equivalente" se debe entender como la habilidad para inducir una respuesta inmune sistémica y mucosal, al tiempo que disminuye el número de células de H. pyl ori asociadas con la mucosa gástrica. La persona experta en la técnica será capaz de identificar las formas modificadas del polipéptido FlgE que conservan antigenicidad funcionalmente equivalente, mediante el uso de métodos conocidos, tales como el trazado del mapa del epítope con anticuerpos inducidos in vi vo . En una forma preferida de la invención, el polipéptido FlgE de Hel i coba ct er pyl ori , para el uso en la inducción de una respuesta inmune protectora para la infección por Heli cobacter pyl ori , tiene substancialmente la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO. 2 en el Listado de Secuencias, o es una forma modificada de la misma que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente. Se debe entender de este modo que las definición de polipéptido FlgE de Heli cobact er pyl ori no está limitada estrictamente a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO. 2 en el Listado de Secuencias. Mas bien, la invención abarca los polipéptidos que llevan modificaciones tales como substituciones, supresiones pequeñas, inserciones o inversiones, cuyos polipéptidos no obstante tienen substancialmente las actividades biológicas del polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori y conservan antigenicidad funcionalmente equivalente. Incluidos en _ la definición el polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori están consecuentemente los polipéptidos, la secuencia de aminoácidos de los cuales es al menos 90% homologa, preferentemente al menos 95% homologa, con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO. 2 en el Listado de Secuencias. En otro aspecto mas, la invención proporciona una composición de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora para la infección por Heli coba ct er pyl ori , que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un polipéptido FlgE de Hel i cobact er pyl ori . como se define anteriormente, opcionalmente junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En el presente contexto el término 'cantidad inmunológicamente efectiva" se debe entender como una cantidad que promueve una respuesta protectora significativa contra Heli cobac t er pyl ori , la cual erradicará una infección por Heli cobacter pyl ori en un mamífero infectado o prevendrá la infección en un mamífero susceptible. Típicamente, una cantidad inmunológicamente efectiva comprenderá aproximadamente 1 µg a 1000 mg, preferentemente aproximadamente 10 µg a 100 mg de antígeno de H. pyl ori para la administración oral, o aproximadamente menos de 100 µg para la administración parenteral. La composición de vacuna comprende opcionalmente además de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, uno o mas de otros antígenos inmunológicamente activos para el uso terapéutico o profiláctico. Los portadores y diluyentes fisiológicamente aceptables son bien conocidos por aquellos de experiencia en la técnica e incluyen por ejemplo solución salina amortiguada con fosfato (PBS), o, en el caso de vacunas orales, formulaciones basadas en HC03 o formulaciones de polvo con recubrimiento entérico. La composición de vacuna puede incluir opcionalmente o ser administrada junto con inhibidores de la secreción de ácido, preferentemente inhibidores de la bomba de protones (PPIs), por ejemplo omeprazol. La vacuna puede ser formulada en
' sistemas de administración conocidos tales como liposomas, ISCOMs, cocleatos, etc. (ver por ejemplo Rabinovich y colaboradores (1994) Science 265, 1401-1404) o ser acoplados a o incorporados en microesferas poliméricas de naturaleza degradable o no degradable. Los antígenos podrían estar asociados con bacterias atenuadas vivas, virus o fagos o con vectores muertos del mismo tipo. Los antígenos pueden estar química o genéticamente acoplados a proteínas portadoras de tipos inertes o adyuvantes (por ejemplo subunidad B de Cólera) . En consecuencia, la invención proporciona, en un aspecto adicional, una composición de vacuna de acuerdo a lo anterior, además de comprender un adyuvante, tal como la toxina del cólera. Tales formas farmacéuticamente aceptables de la toxina del cólera son conocidas en la técnica, por ejemplo de Rappuoli y colaboradores (1995) Int. Arch. Allergy & Immunol. 108(4), 327-333; y Dickinson y colaboradores (1995) Infection and Immunity 63(5), 1617-1623. Una composición de vacuna de acuerdo a la invención puede ser utilizada para fines terapéuticos y profilácticos . En consecuencia, la invención incluye una composición de vacuna de acuerdo a como se define anteriormente, para el uso como una vacuna terapéutica o profiláctica en un mamífero, incluyendo el hombre, el cual está infectado por Heli coba c ter pyl ori . En este contexto el término 'propósito o fin profiláctico" significa el inducir una respuesta inmune la cual protegerá contra la infección futura contra Heli coba cter pyl ori , mientras que el término 'fin o propósito terapéutico" significa el inducir una respuesta inmune que puede erradicar una infección existente por Heli cobacter pyl ori . La composición de vacuna de acuerdo a la invención es preferentemente administrada a cualquier mucosa de mamífero ejemplificada por la mucosa bucal, nasal, tonsilar, gástrica, intestinal (intestino delgado y grueso)., rectal y vaginal. Las vacunas mucosales pueden ser administradas junto con los adyuvantes apropiados para el propósito. La vacuna puede también ser administrada oralmente o parenteralmente, mediante la ruta subcutánea, intracutánea o intramuscular, opcionalmente junto con el adyuvante apropiado. La composición de vacuna puede opcionalmente ser administrada junto con agentes terapéuticos antimicrobianos. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un polipéptido FlgE de Heli coba cter pyl ori , como se define anteriormente, en la fabricación de: (i) una composición para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de infección por
Helicobacter pylori, ; (ii) una vacuna para el uso en la promoción de una respuesta inmune protectora contra
Helicobacter pylori; y (iii) un equipo de diagnóstico para diagnosticar infección por Helicobacter pylori.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de diagnóstico in vitro de infección por Helicobacter pylori, que comprende al menos un paso en donde es utilizado un polipéptido FlgE de Helicobacter pylori , co o se define anteriormente, opcionalmente marcado o acoplado a un soporte sólido. El método mencionado podría comprender los pasos de (a) poner en contacto el polipéptido FlgE de Helicobacter pylori, opcionalmente enlazado a un soporte sólido, con un fluido corporal tomado de un mamífero; y (b) detectar los anticuerpos provenientes del fluido corporal que se enlazan al polipéptido FlgE. Los métodos preferidos para la detección de anticuerpos son los métodos de ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a enzimas) los cuales son bien conocidos en la materia.
En otro aspecto mas la invención proporciona un equipo de diagnóstico para la detección e infección por Heli coba c t er pyl ori en un mamífero, incluyendo el hombre, que comprende componentes que hacen posible llevar a cabo el método de diagnóstico in vi tro como se describe anteriormente. El mencionado equipo de diagnóstico podría comprender por ejemplo: (a) un polipéptido FlgE de Heli cobact er pyl ori ; y (b) reactivos para detectar anticuerpos que se enlazan al polipéptido FlgE. Los mencionados reactivos para la detección de anticuerpos podrían ser por ejemplo una anti-inmunoglobulina marcada con enzima, y un substrato cromogénico para la mencionada enzima. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para promover en un mamífero, incluyendo humanos, una respuesta inmune protectora contra la infección por Heli cobacter pyl ori , el método comprende el paso de administrar a dicho mamífero una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori como se define anteriormente, o administrar alternativamente
/ a dicho mamífero una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de vacuna como se define anteriormente.
MÉTODOS EXPERIMENTALES
A todo lo largo de esta descripción, los términos 'protocolos estándares" y 'procedimientos estándares" , cuando se utilizan en el contexto de las técnicas de clonación molecular, tienen que ser entendidos como protocolos y procedimientos encontrados en un manual de laboratorio ordinario tales como: Current Protocols in Molecular Biology, editores F. Ausubel y colaboradores, John Wiley and Sons, Inc. 1994, o Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
Preparación de polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori , recombinante
Informaci ón de l a secuenci a de ADN
La información secuencial para el gen que codifica para el polipéptido FlgE fue obtenida del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (National Center for Biotechnology Information) (Número de acceso U09549; SEQ ID NO. 1) .
Amplifi caci ón por PCR y cl onaci ón de secuencias de ADN que conti enen ORF' s para proteínas membranal es y secretadas proveni entes de la Cepa J99 de Heli coba cter pyl ori
Las secuencias fueron clonadas de la cepa J99 de H. Pyl ori mediante clonación por amplificación utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Fueron diseñados cebadores oligonucleotídicos sintéticos (ver mas adelante) específicos para los extremos 5'- y 3' de las estructuras de lectura dentro de los genes, y comprados también (GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) . Los cebadores delanteros (específicos para el extremo 5' de la secuencia) para FlgE fueron diseñados para incluir un sitio de clonación Ncol en el extremo 5', mientras que los cebadores inversos incluyeron un sitio EcoRI en el extremo 5' para permitir la clonación de cada secuencia de H. Pyl ori dentro de la estructura de lectura del vector pET28b. Los insertos clonados dentro los sitios NcoI-EcoRI del vector pET-28b están fusionados a una secuencia de ADN vector que codifica para un tramo adicional de 20 aminoácidos carboxilo-terminal, incluyendo seis residuos de histidina (en el extremo C) .
Cebador delantero (SEQ ID NO. 3) : 5' -TAC ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3'
Cebador inverso (SEQ ID NO. 4) : 5' -GCG AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3'
El ADN genómico preparado a partir de la cepa J99 de Hel i coba ct er Pyl ori fue utilizado como la fuente ' de ADN plantilla para las reacciones de amplificación por PCR (Current Protocols in Molecular Biology, editores F. Ausubel y colaboradores, John Wiley and Sons, Inc. 1994) . Para amplificar una secuencia de ADN que contiene un ORF de H. Pyl ori , el ADN genómico (50 ng) se introdujo dentro de un frasco de reacción que contenía MgCl2 2 mM, cebadores oligonucleotídicos sintéticos 1 µM (cebadores delanteros e inversos) complementarios y flanqueando a un ORF de H. Pyl ori definido, 0.2 mM de cada uno de trifosfato desoxinucleótido dATP, dGTP, dCTP, dTTP, y 2.5 unidades de ADN-polimerasa estable al calor
(A plitaq, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg,
NJ, USA) en un volumen final de 100 µl . Las
- condiciones de ciclamiento térmico siguientes fueron utilizadas - para obtener los productos de ADN amplificados para cada ORF utilizando un ciclador térmico Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600:
Desnaturalización a +94°C por 2 minutos; 2 ciclos a +94°C por 15 segundos, +30°C por 15 segundos y +72°C por 1.5 minutos; 23 ciclos a +94°C por 15 segundos, +58°C por 15 segundos y +72°C por 1.5 minutos; Las reacciones fueron concluidas a +72°C por 6 minutos .
Después de la terminación de las reacciones de ciclamiento térmico, cada muestra del ADN amplificado fue lavada y purificada utilizando el equipo de purificación de PCR Quiaquick Spin (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA) . Las muestras de ADN amplificadas fueron sujetas a digestión con las endonucleasas de restricción Ndel y EcoRI _ de acuerdo a procedimientos estándares. Las muestras de ADN fueron luego sujetas a electrofo-resis sobre geles de agarosa al 1.0% NuSeive (FMC BioProducts, Rockland, ME USA) . El ADN fue visualizado mediante exposición a bromuro de etidio y a irradiación de UV de longitud de onda larga. El ADN contenido en rebanadas aisladas del gen de agarosa fue purificado utilizando el protocolo del equipo Bio 101 de GeneClean Kit (Bio 101 Vista, CA, USA) .
Cl onaci ón de secuencias de ADN de H. Pyl ori en el vector de expresi ón procari óti co pET-28b
El vector pET-28b fue preparado para la clonación mediante digestión con Ncol y EcoRI de acuerdo a procedimientos estándares. Después de la digestión, los insertos de ADN fueron clonados de acuerdo a los procedimientos estándares dentro del vector de expresión pET-28b previamente digerido. Los productos de la reacción de ligadura fueron luego utilizados para transformar la cepa BL21 de E . coli como se describe más adelante.
Transformaci ón de bacterias competentes con pl ásmi dos recombinantes
Bacterias competentes, E . coli cepa BL21 o
E . coli cepa BL21(DE3), fueron transformadas con plásmidos de expresión pET recombinantes que poseen
/ las secuencias de H. pyl ori clonadas de acuerdo a los métodos estándares. En resumen, se mezcló 1 µl de reacción de ligadura con 50 µl de células electrocompetentes y se sujetó a pulso de alto voltaje, después de lo cual, las muestras fueron incubadas en 0.45 ml de medio SOC (0.5% de extracto de levadura, 2.0% de triptona, NaCÍ 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM y glucosa 20 mM) a +37°C con agitación por 1 hora. Las mezclas fueron esparcidas sobre placas de agar LB que contenían 25 µg/ml de sulfato de Kanamicina para el desarrollo toda la noche. Las colonias transformadas de BL21 fueron luego recogidas y analizadas para evaluar los insertos clonados, como se describe más adelante.
Identifi caci ón de l os plásmidos de expresión pET recombinantes que poseen secuencias de H. pylori
Clones individuales de BL21 transformados con los genes de H. pyl ori pET-28b recombinantes, fueron analizados mediante amplificación de PCR de los insertos clonados, utilizando los mismos cebadores delanteros e inversos, específicos para cada secuencia de H. pyl ori , que fueron utilizados en las reacciones originales de clonación . de amplificación por PCR. La amplificación exitosa verificó la integración de las secuencias de H.
pyl ori en el vector de expresión de acuerdo a procedimientos estándares.
Ai sl ami ento y Preparaci ón del ADN pl asmí di co a partir de transformantes BL21
Clones individuales de los vectores pET-28b recombinantes que poseen los OLRFs de H. pyl ori adecuadamente clonados, fueron recogidos e incubados en 5 ml de caldo LB más 25 ' µg/mg de sulfato de kanamicina toda la noche. Al siguiente día el ADN plasmídico fue aislado y purificado utilizando el protocolo de purificación de plásmidos de Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA).
Expresi ón de secuencias de H. pyl ori recombinantes en E . coli
El vector pET puede ser propagado en cualquier cepa de E . col i YL- 2 , por ejemplo, HMS174,
HB101, JM109, DH5a, etc. para fines de clonación o preparación de plásmidos. Los huéspedes para la
/ expresión incluyen cepas de E. coli que contienen una copia cromosómica del gen para la ARN-polimerasa T7. Estos huéspedes son lisógenos del bacteriófago DE3, un derivado lambda que posee el gen lacl, el promotor lacUV5 y el gen para la ARN-polimerasa T7. La ARN-polimerasa T7 es inducida por la adición de isopropil-ß-D-tiogalactósido (IPTG), y la ARN-polimerasa T7 describe cualquier plásmido objetivo, tal como pET-28b, que posee su gen de interés. Las cepas utilizadas en nuestro laboratorio incluyen: BL21 (DE3) (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., y Dubendorff, J.W. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89) . Para expresar secuencias de H. pyl ori recombinantes, se utilizaron 50 ng del ADN plasmídico aislado como se describe anteriormente, para transformar bacterias BL21(DE3) competentes, como se describe anteriormente (proporcionado por Novagen como parte del equipo del sistema de expresión pET) . Las células transformadas fueron cultivadas en medio SOC por 1 hora, y el cultivo se colocó en placas de LB que contenían 25 µg/ml de sulfato de kanamicina. Al siguiente día, las colonias bacterianas fueron combinadas y desarrolladas en medio LB que contenía sulfato de kanamicina (25 µg/ml) a una densidad óptica a 600 nm de 0.5 a 1.0 Unidades de Densidad
Óptica (D.O.), punto en el cual se agregó IPTG 1 mM al cultivo por 3 horas, para inducir la expresión del gen de las construcciones de ADN recombinantes de H. pyl ori . Después de la inducción de la expresión del gen con IPTG, las bacterias fueron concentradas mediante centrifugación en una centrífuga Sorvall RC- 3B a 3500 x g por 15 minutos a 4°C. Las pellas o botones celulares fueron resuspendidos en 50 ml de Tris-HCl 10 mM frío, pH 8.0, NaCÍ 0.1 M y EDTA 0.1 mM (amortiguador STE) . Las células fueron luego centrifugadas a 2000 x g por 20 minutos +4°C. Los botones húmedos fueron pesados y congelados a -80°C hasta que estuvieron listos para la purificación de proteína .
Métodos Analí ti cos
Las concentraciones de las preparaciones de proteína purificada fueron cuantificadas espectrofotométricamente utilizando coeficientes de absorbancia calculados a partir del contenido de aminoácidos (Perkins, S.J. 1986 Eur. J. Biochem. 157, 169-180) . Concentraciones de proteína fueron también - medidas mediante el método de Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254, y Lowry, O.H., Rosebrough, N., Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951), utilizando albúmina sérica bovina como un estándar. Geles de dodecilsulfato de sodio- poliacrilamida (SDS-PAGE) (12% o 4 a 25% de gradiente de acrilamida) fueron adquiridos de BioRad (Hercules, California, Estados Unidos de América), y se tiñeron con el Azul Brillante de Coomassie. Los marcadores de marca molecular incluyeron miosina de músculo esquelético de conejo (200 kDa), ß-galactosidasa de E . col i (116 kDa), fosforilasa B de músculo de conejo (97.4 kDa), albúmina sérica bovina (66.2 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica bovina (31 kDa), inhibidor de tripsina de soya (21.5 kDa), lisozima de clara de huevo (14.4 kDa) y aprotinina bovina (6.5 kDa) .
Purifi caci ón de Fl gE a partir de cuerpos de incl usi ón
Se llevaron a cabo los siguientes pasos a +4°C. Los botones celulares fueron resuspendidos en amortiguador de lisis con 10% de glicerol, 200 µg/ml de lisozima, EDTA 5mM, PMSF 1 M y ß-mercaptoetanol
' al 0.1%. Después del paso a través del desorganizador celular, el homogeneizado resultante fue constituido a 0.2% DOC, agitado 10 minutos, luego centrifugado (10,000 g x 30 minutos) . Los botones fueron primeramente lavados con amortiguador de lisis que contenía 10% de glicerol, EDTA 10 mM, 1% de Tritón X-100, PMSF 1 mM y 0.1% de ß-mercaptoetanol, luego con amortiguador de lisis que contenía urea 1 M, PMSF 1 mM y 0.1% de ß-mercaptoetanol. El botón blanco resultante estuvo compuesto principalmente de cuerpos de inclusión, libres de células no rotas y de materiales membranosos. Se llevaron a cabo los siguientes pasos a temperatura ambiente. Los cuerpos de inclusión fueron resueltos en 20 ml de urea 8 M en amortiguador de lisis con PMSF 1 mM y 0.1% de ß-mercaptoetanol, e incubados a temperatura ambiente por 1 hora. Los materiales que no se disolvieron fueron eliminados mediante centrifugación (100,000 x g por 30 minutos). El sobrenadante claro se filtró y se cargó sobre una columna de agarosa Ni2+-NTA equilibrada en urea 8 M en amortiguador de lisis. La columna se lavó con 250 ml (50 volúmenes de lecho) de amortiguador de lisis que contenía urea 8 M, PMSF 1 mM, y 0.1% de ß- mercaptoetanol y revelados con pasos secuenciales de
' amortiguador de lisis que contenía urea 8 M, PMSF 1 mM, 0.1% de ß-mercaptoetanol e imidazol 20, 100, 200, y 500 mM. Las fracciones fueron verificadas mediante absorbancia a DO280 nm, y las fracciones pica fueron analizadas mediante SDS-PAGE. Fueron visualizadas dos bandas mediante tinción con Azul Brillante de Coomassie, una banda mayor Mr=78 kDa y una banda menor Mr=60 kDa. La pureza del FlgE recombinante (78 kDa) fue evaluada a mas de 90%. Como con la purificación de las proteínas solubles, las fracciones que contenían la proteína recombinante eluyeron en imidazol 100 mM. La urea fue eliminada lentamente del polipéptido FlgE mediante diálisis contra TBS que contenía 0.5% DOC, con reducción secuencial en urea como sigue; 6 M, 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 0.5 M luego 0 M. Cada paso de diálisis fue llevado a- cabo por un mínimo de 4 horas a temperatura ambiente. Después de la diálisis, las muestras fueron concentradas mediante filtración a presión utilizando celdas agitadas Amicon. Las concentraciones de proteína fueron luego medidas mediante los métodos de Perkins, Bradford y Lowry.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1: INMUNIZACIÓN TERAPÉUTICA
Ma t eri al es y Mé t odos
1.1 Animal es
Se adquirieron ratones hembra SPF BALB/c del centro Bomholt Breeding (Dinamarca) . Éstos fueron mantenidos en jaulas de makrolon ordinarias con suministro libre de agua y alimento. Los animales tenían de 4 a 6 semanas de edad al arribar.
1 . 2 Infecci ón
Después de un mínimo de una semana de aclimatamiento, los animales fueron infectados con una cepa tipo 2 de H. pyl ori (cepa 244, originalmente aislada de un paciente con úlcera) . Esta cepa ha probado ser un buen colonizador del estómago de ratón. Las bacterias provenientes de una cepa mantenida a -70°C fueron desarrolladas toda la noche en caldo Brucella suplementado con 10% de suero fetal de ternera, a +37°C en una atmósfera microaerofílica (10% de C02, 5% de 02) . los animales se les administró una dosis oral de omeprazol (400 µmol/kg) y después de 3 a 5 horas una inoculación oral de H. pyl ori (aproximadamente 107-108 CFU/ani al) . La infección fue verificada en animales control 2 a 3 semanas después de la inoculación.
1 . 3 Inmuni zad o nes
Un mes después de la infección, dos grupos de ratones (10 ratones/grupo) fueron inmunizados 4 veces en un periodo de 34 días (día 1, 15, 25 y 35) . El FlgE recombinante purificado, disuelto en PBS más 0.5% de desoxicolato (DOC) fue administrado a una dosis de 100 microgramo/ratón . Como un adyuvante, los animales en el control así como en el grupo FlgE fueron también administrados con 10 µg/ratón de toxina del cólera (CT) con cada inmunización. El omeprazol (400 µmol/kg) fue administrado oralmente a todos los animales de 3 a 5 horas antes de la inmunización como una manera para proteger los antígenos de la degradación por ácido. Los animales fueron sacrificados de 1 a 2 semanas después de la inmunización final.
Grupo 1: 300 µl de PBS con 0.5% de DOC que contenía 10 µg de CT Grupo 2: 300 µl de PBS con 0.5% de DOC que contenía
100 µg de FlgE y 10 µg de CT.
1 . 4 Análisi s de la Infecci ón
Los ratones fueron sacrificados mediante C02 y dislocación cervical. El abdomen y la cavidad del pecho fueron abiertos y se tomaron muestran de sangre mediante punción cardiaca. Subsecuentemente, el estómago fue retirado. Después de cortar el estómago a lo largo de la curvatura más grande, éste se enjuagó en solución salina y subsecuentemente se cortó en dos piezas idénticas. Un área de 25 mm2 de la mucosa del antro y el cuerpo o corpus fue rascado separadamente con una escalpelo quirúrgico. El rascado de la mucosa fue suspendido en caldo de Brucella, diluido y sembrado sobre placas Blood Skirrow. Las placas fueron incubadas bajo condiciones microaerofílicas por 3 a 5 días y se contó el número de colonias. La identidad de H. i pyl ori fue averiguada mediante la prueba de ureasa y de catalasa y mediante microscopía directa o tinción de Gram.
1 . 5 Medi ci ones de anti cuerpo
Se recolectaron _ anticuerpos de suero a partir de la sangre. Antes de la centrifugación, la sangre fue diluida con una cantidad igual de PBS. El suero fue mantenido a -20°C hasta el análisis. Los anticuerpos en suero fueron medidos utilizando una prueba de ELISA donde las placas fueron recubiertas ya sea con una fracción particulada de H. pyl ori cepa 244 o con FlgE seguido por la adición de diferentes diluciones de suero. El ensayo ELISA fue revelado con anticuerpos Ig anti-ratón, marcados con fosfatasa alcalina. Los anticuerpos anti-Ig fueron de un tipo anti-cadena pesada/anti-cadena ligera, los cuales deben detectar todos los tipos de anticuerpos.
Resul tados 2. 1 Inmunizaci ón Terapéutica : efectos sobre CFU
Los animales en este estudio fueron infectados con H. pyl ori cepa 244 un mes antes de las inmunizaciones. Ratones en grupos de diez fueron luego inmunizados ya sea con la toxina del cólera (CT) o CT junto con el polipéptido FlgE recombinante.
Cuatro semanas después de la inmunización final, los animales fueron sacrificados y se determinaron las CFU (Figura 1) . Los animales tratados con CT solo, fueron altamente infectados, ya sea en el cuerpo (corpus) y el antro. Los animales inmunizados activamente con el polipéptido FlgE recombinante y con CT tuvieron valores de CFU significativamente disminuidos en el antro y en el estómago como un todo en comparación con los animales tratados con CT (p<0.01 y p<0.05, respectivamente; prueba de rango de signo Wilcoxon-Mann-Whittney) .
2. 2 Inmuni zaci ón terapéuti ca : efectos sobre la formaci ón y secreci ón de anti cuerpos
Como un signo de infección pueden ser encontrados anticuerpos específicos para H. pyl ori en el suero (Control/244) . En animales administrados con FlgE + CT el título contra la cepa 244 (como proteínas membranales) se incrementó 4 veces (p<0.01) . Únicamente en animales administrados con FlgE + CT pudo ser medido un título de IgG en suero específico contra FlgE (Figura 2) .
La IgG específica de FlgE se incrementó en animales administrados con FlgE + CT, pero no pudo ser detectada en animales control. Los resultados presentados muestran que el polipéptido de FlgE de H. pylori es altamente inmunogénico cuando se administra oralmente, junto con la toxina del cólera, como un adyuvante, medido como un incremento en los anticuerpos Ig sistémicos específicos de FlgE. La inmunización con FlgE también dio como resultado un incremento significativo en los títulos de . Tg contra una fracción particulada de H. pyl ori . Además, se encontró una disminución dramática en el número de H. pyl ori colonizantes en la mucosa gástrica de los ratones infectados, después de la inmunización con FlgE junto con toxina del cólera.
LI S TADO DE SECUENC IAS INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Astra AB (B) CALLE: Vastra Malarehamnen 9 (C) CIUDAD: Sodertalje (E)PAIS: Suecia (F) CÓDIGO POSTAL: S-151 85 (G) TELEFONO: +46 8 553 260 00 (H)FAX: +46 8 553 288 20 (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones V de Vacuna (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC Compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión 1.30 (EPO)
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2550 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helicobacter pylori (ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 321. .2477 (C) OTRA INFORMACIÓN: /producto= "proteina de gancho flagelar FlgE' (x) INFORMACIÓN PARA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: O'Toole, Paul . Kostrzynska, Magdalena Trust, Trevor J. (B) TITULO: Mutantes no móviles de . pylori y Helicobacter ptustelae defectuoso en la producción de gancho flagelar. (C) REVISTA: Mol. Microbiol. (D) VOLUMEN: 14 (E) FASCÍCULO: 4 (F) PAGINAS: 691-703 (G) FECHA: 1994 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1: AACAAAGCGA TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC 60
GCGCTTCAGC CGAAGAGATT CAAGATCATG AATGCGCGAT TTTGCACTAA AGCGAGTTAG 120
ATTCTTAAAT TTGAGCGATA ACCTTTAAAA AGCGTAATTA AGGGGTGGTG TTACAAAACC 180 CCCTATCCCC TTATGAATTT GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT 240 CAATCATTCT AAAAAGCTAT TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT 30C
CTTTAAATTA AAGGATAACC ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT 350 Met Leu Arg Ser Leu Trp Ser Gly Val Asr. 1 5 , 10 GGG ATG CAA GCC CAC CAA ATC GCT TTG GAT ATT GAG AGT AAC AAT ATT 398 Glv Met Gln Ala His Gln He Ala Leu Asp lie Glu Ser Asn Asn He 15 20 25 GCG AAC GTG AAT ACC ACT GGT TTT AAG TAT TCT AGG GCT TCT TTT GTG 446 Ala Asn Val Asn Thr Thr Gly Phe Lys Tyr Ser Arg Ala Ser Phe Val 30 35 40 GAT ATG CTT TCT CAA GTC AAA CTC ATC GCT ACC GCA CCC TAT AAA AAC 494 Asp Met Leu Ser Gln Val Lys Leu He Ala Thr Ala Pro Tyr Lys Asn 45 50 55 GGG TTA GCA GGG CAG AAT GAT TTT TCT GTG GGG CTT GGG GTA GGC GTG 54 Gly Leu Ala Gly Glr. Asr. ASD Phe Ser Val Gly Leu Gly Val Gly Val 60 65 70 GAT GCG ACG ACT AAA ATC TTT TCA CAA GGC AAT ATC CAA AAC ACA GAT 59C As» Ala Thr Thr Lys He Phe Ser Glr. Gly Asn He Gln Asn Thr Asp 75 80 85 90 GTC AAA ACC GAT CTA GCG ATT CAA GGC GAT GGC TTT TTT ATC ATT AAC 638 Val Lys Thr Asp Leu Ala He Gln Gly Asp Glv Phe Phe He He Asn 95 100 105 CCT GAT AGG GGG ATC ACG CGC AAT TTC ACT AGA GAT GGG GAG TTC CTT 686 Pro Asp Arg Gly He Thr Arg Asn Phe Thr Arg Asp Gly Glu Phe Leu 110 115 120 TTT GAC TCG CAA GGG AGT TTG GTT ACC ACC GGC GOG CTT GTG GTG CAA 734 Phe Asp Ser Gin Gly Ser Leu Val Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Gln 125 130 135 GGG TGG GTG AGA AAT GGG AGC GAT ACC GGC AAT AAA GGG AGC GAT ACA 782 Gly Trp Val Arg Asn Gly Ser Asp Thr Giy Asn Lys Gly Ser ASD Thr 140 145 150 GAC GCT TTA AAA GTG GAT AAC ACC GGT CCT TTA GAA AAC ATT AGG ATT 830 Asp Ala Leu Lys Val Asp Asn Thr Gly Pro Leu Glu Asn He Arg He 155 160 165 170 GAT CCT GGA ATG GTG ATG CCA. GCC AGA GCG AGT AAC CGC ATT TCT ATG 878 Asp Pro Giy Mee Val Met Pro Ala Arg Ala Ser Asn Arg He Ser Met 175 180 185 AGG GCG AAT TTA AAC GCT GGA AGG CAT GCC GAT CAA ACA GCG GCG ATA 926 Ars Ala Asn Leu Asn Aia Gly Arg His Ala Asp Gln Thr Ala Ala He 190 195 200 TTC GCT TTG GAT TCT TCA GCC AAA ACC CCT TCA GAT'GGC ATT AAT CCG 974 Phe Ala Leu Asp Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly He Asn Pro 205 210 215 GTG TAT GAT TCA GGC ACG AAT CTT GCT CAA GTC GCC GAA GAC ATG GGA 1022 Val Tyr Asp Ser Gly Thr Asr. Leu Ala Gln Val Ala Glu Asp Met Gly 220 225 230 TCT TTA TAC AAT GAA GAT GGC GAC GCT CTT TTG TTG AAT GAA AAT CAA 1070 Ser Leu Tyr Asn Glu Asp Gly Asp Ala Leu Leu Leu Asn Glu Asr. Gln 235 240 245 250 GGG TGG GTG AGC TAT AAG AGT CCA AAA ATG GTC AAA GAC ATC CTC 111S Gly He Trp Val Ser Tyr Lys Ser Pro Lys Mer. Val Lys Asp He Leu 255 260 265 CCT TCT GCA GAA AAC AGC ACG GAA TTG AAT GGC GTT AAG ATT TCT Pro Ser Ala Glu Asn Ser Thr Leu Glu Leu Asn Gly Val Lys He Ser 270 275 280 ACA AAC GAT TCA GCG GTG AGC CGG ACT TCA AGC TTA GTG GCG GCT 1214
Phe Thr Asn Asp Ser Ala Val Ser Arg Thr Ser Ser Leu Val Ala Ala 285 290 295 AAA AAT GCG ATC AAT GCA GTC AAA AGC CAA ACA GGC ATT GAA GCT TAT Lys Asn Ala He Asn Aia Val Lys Ser Gln Thr Gly He Glu Ala Tyr 300 305 310 TTA GAC GGC AAG CAA TTG CGT TTG GAA AAC ACC AAT GAA TTA GAC GGC 1310 Leu Asp Gly Lys Gln Leu Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly 315 320 325 330 GAT GAA AAG r.rprt? AAA AAC ATT GTA GTT ACT CAA scc GGA ACC GGA GCG .358 Asp Glu ys Leu Lys Asn Xle Vai Val Thr Glr. Aia Giy Thr Gly Ala 335 340 345 TC GCT AAC TTA GAC GGC GAT AAA GAT GTA ACG GCT mm AAA TAC 1406 Pne Aia Asn Phe Leu Asp Gly Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Lys Tyr 350 355 360 AGC TAC ACG CAT TCT ATT AGC CCT AAC GCC AAT AGC GGG CAG TT AGO 1454 Ser Tyr Thr His Ser He Ser Pro Asn Ala Asn Ser Gly Gln Phe Arg 365 370 375 ACC ACT GAA GAC TTG OCC ivrn * ATC CAG CAT GAC GCT AAT ATC GTT 1502 Thr Tnr Glu Asp Leu Arg Ala Leu He Glr. His Asp Ala Asn He Val 380 385 390 AAA GAT CCT AGC CTA r.r.rr GAC AAT TAC CAA GÁC TCA GCC GCT TCT ATA 1550 Lys Asp Pro Ser Leu Ala Asp ASR Tyr Gin Asp Ser Ala Ala Ser He 395 400 405 410 GGA GTT ACA ATC AAC CAA TAC ssc ATG GAA ATC AAC AAT AAA GAC 1598 Gly Val Thr He Asn Gl. Tyr Gly Met Phe Glu He Asn Asn Lys Asp 415 420 425 AAT AAA AAT GTC ATT AAA GAA AAT CTT AAT ATC TTT GTG AGC sss TAT 1646 Asn Lys Asn Val He Lys Glu Asn Leu Asn He Phe Val Ser Gly Tyr 430 435 440 TCT TCA GAC AGC GTA ACG AAC AAT GTT TTG AAA AAT GCG ATG AAA 1694 Ser Ser Asp Ser Val Thr Asr. Asn Val Leu Phe Lys Asn Ala Met Lys 445 450 455 GGG AAT ACC GCT TGT TTA ATT GAA GGG GG? :G TCA Grt AGC AGT 174Í
Gly Leu Asn Thr Ala s>. - Leu He Glu Gly Gl . a Ser A., i Ser Ser 460 465 ,70 TCT AAA TTC ACC CAC GCT ACG CAT GCG ACA AGC ATT GAT GTG ATA GAC 1790 Ser Lys Phe Thr His Ala Thr Kis Ala Thr Ser He Asp Val He Asp 475 480 485 490 AGC TTA GGC ACT AAA CAC GCC ATG CGC mm GAG rpm TAT AGG AT GGO 1838 Ser Leu Giy Thr Lys His Ala Met Arg lié Giu Phe Tyr Arg Ser Gly 495 500 505 1886 1934 1982 2030 20 S 2126 2174 2222 2270 2 18 2366 2414 2462 2517 2550
325 330 335 lie Val Val Thr Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe Ala Asn Phe Leu Asp 340 345 350 Gly Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Lys Tyr Ser Tyr Thr His Ser He 355 360 365 Ser Pro Asn Ala Asn Ser Gly Gln Phe Arg Thr Thr Glu Asp Leu Arg 370 375 380 Ala Leu He Gln His Asp Ala Asn He Val Lys Asp Pro Ser Leu Ala 385 390 395 400
Asp Asn Tyr Gln Asp Ser Ala Ala Ser He Gly Val Thr He Asr. Glp 405 410 415
Tyr Gly Met Phe Glu He Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Val He Lys 420 425 430 Glu Asn Leu Asn -He Phe Val Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Ser Vai Thr 435 440 445 Asn Asr. Vai Leu Phe Lys Asp Ala Met Lys Gly Leu Asr. Thr Ala Ser 450 455 460 Leu i: .e Glu Gly Gly Aia Ser Ala Sex Ser Ser Lys Phe Thr His Ala
465 470 475 480
Thr His Ala Thr Ser He Asp Val He ASD Ser Leu Gly Thr Lvs His 485 490 495
Ala Met Arg He Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Gly Ala Asp Trp Asn Phe 500 505 510 Arg Val lie Vai Pro Glu Pro Gly Glu Leu Val sly Glv Ser Ala Ala 515 520 525 Arg Pro Asn Vai Phe Glu Gly Gly Arg Leu His Phe Asn Asn Asp Gly 530 535 540 Ser Leu Ala. Oly Met Asn Pro Pro Leu Leu Oln Phe Asp Pro Lys Asr. 545 ' 550 555 560
Oly Ala Asp Ala Pro Oln Arg He Asn Leu Ala Phe Gly Ser Ser siy 565 570 575
Ser Phe Asp Gly Leu Thr Ser Val Asp Lys He Ser Glu Thr Tyr Ala 580 585 590 He Glu Gln Asn Oly Tyr Oln Ala Gly Asp Leu Met ASD Val Arg Phe 595 600 605 Asp Ser Asp Oly Val Leu Leu Gly Ala Phe Ser Asr. Gly Arg Thr Leu 610 615 620 Ala Leu Ala Gln Val Ala Leu Ala Asn Phe Ala Asn Asp Ala Gly Leu 625 630 635 640
Gln Ala Leu Gly Gly Asn Val Phe Ser Gln Thr Gly Asn Ser Glv Gln 645 650 655
Ala Leu He Gly Ala Ala Asr. Thr Gly Arg Arg Gly Ser He Ser Gly 660 665 670 Ser Lys Leu Giu Ser Ser Asn Val Asp Leu Ser Arg Ser Leu Thr Asn 675 680 685 Leu He Val Val Gln Arg Gly Phe Gln Ala Asn Ser Lys Ala Val Thr 690 695 ' 700 Thr Ser Asp Gln He Leu Asn Thr Leu Leu Asn Leu Lys Gln * 705 710 — 715
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "aprestador de PCR'
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 3: TATACCATGG TGCTTAGGTC TTTAT 25
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "aprestador de PCR'
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4: GCGAATTCAA TTGCTTAAGA TTCAA 25
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (29)
1. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori , o una forma modificada del mismo que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente, para inducir en un mamífero una respuesta inmune protectora contra la infección por Heli cobacter pyl ori .
2. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido FlgE comprende substancialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 2 en el Listado de Secuencias.
3. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% homologa a la SEQ ID NO. 2.
4. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% homologa a la SEQ ID NO. 2.
5. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque incluye un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
6. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende un adyuvante.
7. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el adyuvante es una forma farmacéuticamente aceptable de la toxina del cólera.
8. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque incluye una substancia /'seleccionada de liposomas, ISCOMs, coquelatos y microesferas poliméricas.
9. La~ composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, caracterizada porque comprende un vector seleccionado de bacterias atenuadas vivas, virus y fagos.
10. El uso de un polipéptido FlgE de Hel i coba cter pyl ori , o una forma modificada del mismo, que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente, en la fabricación de una composición para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de infección por Heli cobacter pyl ori en un mamífero.
11. El uso de un polipéptido FlgE de Heli coba ct er pyl ori , o una forma modificada del mismo, que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente, en la fabricación de una composición de vacuna para el uso en la promoción de una respuesta inmune protectora en un mamífero, contra Heli cobacter pyl ori .
12. El uso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde el polipéptido FlgE-/ es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 4.
13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 12, en donde el mamífero es un humano.
14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 13, en donde la composición incluye un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
15. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 14, en donde la composición comprende un adyuvante.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el adyuvante es una forma farmacéuticamente aceptable de la toxina del cólera.
17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 16, en donde la composición incluye una substancia seleccionada de liposomas, ISCOMs, coquelatos y microesferas poliméricas .
18. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 16, que comprende un vector seleccionado de bacterias atenuadas vivas, virus y fagos.
19. Un método de diagnóstico in vi tro de infección por Heli coba ct er pyl ori en un mamífero, el método está caracterizado porque comprende los pasos de : (a) el poner el contacto un polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori , o una forma modificada del mismo que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente, con un fluido corporal tomado del mamífero; y (b) la detección de los anticuerpos de dicho fluido corporal que se enlazan al polipéptido FlgE.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido FlgE es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 4.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque el polipéptido FlgE está unido a un soporte sólido.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a la 21, caracterizado porque el mamífero es un humano.
23. Un equipo de diagnóstico para el uso en el método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado el equipo porque comprende un polipéptido FlgE de Heli cobacter pyl ori , o una forma modificada del mismo, que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente.
24. El equipo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polipéptido FlgE es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 4.
25. El uso de un polipéptido FlgE de Heli coba ct er pyl ori , o una forma modificada del mismo que conserva antigenicidad funcionalmente equivalente, en la fabricación de una composición de vacuna administrable a un mamífero, para promover en el mamífero una respuesta inmune protectora contra la /infección por Heli cobacter pyl ori .
26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el polipéptido FlgE es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 4.
27. El uso de conformidad con la reivindicación 25 ó 26, en donde el mamífero es un humano .
28. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a la 27, en donde la composición de vacuna es una composición profiláctica.
29. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a la 27, en donde la composición de vacuna es una composición terapéutica.
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