MXPA97009194A - Antigenos del helicobacter pylori y composiciones de vacuna - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos recombinantes los cuales sustituyen antígenos expuestos superficialmente del Helicobacter pylori, con un peso molecular aproximado de 29 kDa. La invención proporciona además la codificación de moléculas deácido nucleico para los polipéptidos, asícomo vectores y células huésped que comprenden tales moléculas deácido nucleico. Dichos polipéptidos recombinantes sonútiles para el diagnóstico de las infecciones provocadas por el H. pylori y para la fabricación de composiciones de vacuna las cuales producirán una respuesta inmune protectora contra tales infecciones, las composiciones de vacuna son adecuadas para uso tanto terapéutico como profiláctico.

Description

AN IGENOS DEL HELICOBACTER PYLORI Y COMPOSICIONES DE VACUNA CAMPO TÉCNICO La presente invención proporciona polipéptidos recombinantes los cuales constituyen antígenos del Helicobacter pylori, los antígenos son expresados sobre la superficie tanto de las formas divisorias (bacilares) como de las formas de restablecimiento (cocoideas) del H. pylori, y ocasionan una producción tanto sistémica como local (de la mucosa) de anticuerpos. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos, así como los vectores y las células huésped que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Dichos polipéptidos recombinantes son útiles para el diagnóstico de las infecciones provocadas por el H. pylori y para la fabricación de composiciones de vacuna las cuales producirán una respuesta inmune protectora contra tales infecciones, las composiciones de vacuna son adecuadas para uso tanto terapéutico como profiláctico.

Rßf.026195 ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA La bacteria gram-negativa Helicobacter pylori es un patógeno humano importante, involucrado en varias enfermedades gastroduodenales. La colonización del epitelio gástrico por las bacterias conduce a la inflamación activa y a la gastritis crónica progresiva, con un riesgo mejorado ampliamente de progresión hacia la enfermedad de la úlcera péptica. Para colonizar la mucosa gástrica, el H. pylori utiliza un número de factores de virulencia. Tales factores de virulencia comprenden varias adhesinas, con las cuales la bacteria se asocia con el moco y/o se une a las células epiteliales; las ureasas las cuales ayudan a neutralizar el medio ambiente ácido; y las enzimas proteolíticas las cuales hacen al moco más fluido. A pesar de una respuesta inmune del huésped aparentemente fuerte hacia el H. pylori, con la producción de anticuerpos tanto locales (de la mucosa) así como sistémicos, el patógeno persiste en la mucosa gástrica, normalmente durante toda la vida del huésped. La razón para esto es probablemente que la respuesta inmune inducida espontáneamente es inadecuada o dirigida hacia los epítopes erróneos de los antígenos. Par entender la patogénesis y la inmunología de las infecciones provocadas por el H. pylori, es de una gran importancia definir la estructura antigénica de esta bacteria. En particular, existe una necesidad de una caracterización de la superficie expuesta (semejante a las adhesinas) y las proteínas secretadas las cuales, en muchos patógenos bacterianos, se ha mostrado que constituyen los factores de virulencia principales, y las cuales pueden ser útiles para el diagnóstico del H. pylori y en la fabricación de composiciones de vacuna. La clonación del gen hpaA, el cual codifica para una subunidad de unión del receptor de 20 kDa de la hemaglutinina fibrilar de unión de la N-acetilneuraminil-lactosa (NLBH) del H. pylori, ha sido descrita por Evans et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 674-683. Los anticuerpos monoclonales (MAbs) contra las preparaciones del H. pylori, han sido descritos por Bólin et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33, 381-384. Uno de estos MAbs, designado HP30-1:1:6, se hizo reaccionar con una proteína de 30 kDa la cual se mostró que va a estar expuesta sobre la superficie de las bacterias intactas y tiene propiedades semejantes a aquellas de una adhesina. En cualquier lugar en el que estén sometidas a tensión o amenazadas, la célula de H. pylori se transforma desde una " forma bacilar hasta una forma cocoidea. En la forma cocoidea, la célula de H. pylori es mucho menos sensible a los antibióticos y a otros agentes antibacterianos. La evidencia circunstancial indica que el H. pylori podría ser transmitido entre los individuos de esta forma, posiblemente por medio del agua o del contacto directo. Una composición de vacuna eficiente debe producir por lo tanto una respuesta inmune hacia la forma tanto cocoidea como bacilar del H. pylori. Puesto que la inmunidad sistémica probablemente solo juega un papel limitado en la protección contra las infecciones de la mucosa, también es importante que la composición de la vacuna mejorará los mecanismos inmunes protectores localmente en el estómago.

PROPÓSITO DE LA INVENCIÓN El propósito de esta invención es proporcionar un polipéptido de H. pylori antigénico el cual puede ser útil i. a. para producir una respuesta inmune protectora contra, y para el diagnóstico de, la infección provocada por el H. pylori. Este propósito ha sido logrado por la clonación recombinante del gen del H. pylori el cual codifica para una proteína expuesta superficialmente. La secuencia del ácido nucleico de este gen es similar a la secuencia del gen hpaA como se publicó por Evans et al (1993) en el Journal of Bacteriology, vol. 175, 674-683.

Sin embargo, mientras que el gen hpaA se reportó que codifica para una proteína de 20 kDa, se ha encontrado sorprendentemente que la molécula de ADN de acuerdo con la invención codifica para un polipéptido con un peso molecular de 29 kDa. El polipéptido de 29 kDa se mostró que va a ser una proteína antigénica la cual es expresada en todas las cepas del H. pylori, también en las formas cocoideas de la bacteria, y la cual es capaz de inducir una respuesta de la mucosa así como una respuesta inmune sistémica en un huésped, medida como una producción de anticuerpos. El polipéptido de 29 kDa es expresado por todas las cepas del H. pylori probadas y los anticuerpos creados hacia esta proteína no reaccionan en forma cruzada con las bacterias humanas endógenas comunes de otras especies o con los tejidos humanos seleccionados que incluyen la mucosa gástrica. Por consiguiente siendo una adhesina bien conservada, esencial, con propiedades inmunogénicas, el polipéptido de 29 kDa será útil tanto para la detección de las infecciones provocadas por el H. pylori así como para la fabricación de composiciones de vacuna, las cuales cuando se administran en una formulación farmacéutica apropiada producirán una respuesta inmune protectora o terapéutica contra tales infecciones. Los datos experimentales de abajo indican por consiguiente que la proteína del H. pylori de 29 kDa es importante para la colonización y/o la persistencia de la infección provocada por el H. pylori, puesto que la unión de un anticuerpo monoclonal para la proteína de H. pylori de 29 kDa conduce a la inhibición completa de la colonización del H. pylori en los ratones. Además, la proteína del H. pylori de 29 kDa, cuando se utiliza como un inmunógeno oral, actúa como un estimulador de una respuesta inmune que conduce a una reducción significativa de la colonización del H. pylori en ratones los cuales fueron infectado con el H. pylori 1 mes previo a la inmunización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Mapa de la enzima de restricción del plásmido pAEl que contiene el fragmento de 1.7 kb del H. pylori que codifica para el polipéptido de 29 kDa. La barra con rayas indica la posición del gen estructural. La localización de las secuencias del promotor de T3 y T7 son mostradas arriba de las barras negras que indican el vector.

Figura 2: Mapas del plásmido de pS860, pS861, pS862 y pS863. Flechas rellenas: promotor del operon lac (Plac) o promotor de la Polimerasa del ARN del bacteriófago T7 (promotor T7). Relleno gris: extremo 3' o extremo 5' generador por PCR del gen de 29 kDa. Terminador: terminador de la transcripción T7. Ori: origen de replicación del plásmido pBR322.

Fig. 3: Efecto de los anticuerpos monoclonales sobre la colonización del H. pylori en ratones BALB/c.

Figura 4: Inmunización oral terapéutica de los ratones BALB/c infectados por el H. pylori.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En toda esta descripción y en particular en los siguientes ejemplos, los términos "protocolos estándares" y "procedimientos estándares", cuando se utilicen en el contexto de las técnicas de clonación molecular, se va a sobreentender que son los protocolos y los procedimientos encontrados en un manual de laboratorio ordinario tal como: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2/a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. En un primer aspecto importante, esta invención proporciona un polipéptido recombinante el cual tiene una secuencia de aminoácidos idéntica con, o substancialmente similar a, un antígeno expuesto superficialmente del Helicobacter pylori con un peso molecular aproximado de 29 kDa. El antígeno expuesto superficialmente de acuerdo con la invención tiene i.a. las siguientes propiedades importantes: • Es una adhesina, la cual es importante para la colonización de la mucosa gástrica: • Es expresada sobre la superficie tanto de las formas divisorias (bacilares) así como de las formas res- tantes (cocoideas) del H. pylori; • Es un antígeno fuerte que conduce tanto a la producción sistémica como local (de la mucosa) de anticuerpos; • Es conservada en todas las cepas probadas del H. pylori; • Los anticuerpos para el polipéptido de 29 kDa no reaccionan en forma cruzada con un número de diferentes bacterias no del helicobacter, o con tejidos humanos seleccionados, incluyendo la mucosa gástrica; • El polipéptido de 29 kDa es lipidado y por consiguiente modificado pos-translacionalmente. Esta característica del polipéptido puede ser de importancia para su inmunogenicidad y para su exposi- ción apropiada sobre la superficie del H. pylori. Se sabe en la técnica que la modificación de los lípidos puede ser esencial para las propiedades inmunológicas de las lipoproteínas bacterianas (véase Weis, J.J. et al. (1994) Infection and I munity, vol. 62, 4632-4636). • Es un factor de virulencia putativo, por lo cual el término "factor de virulencia" se va a sobreentender como una molécula involucrada específicamente en la adherencia del H. pylori a la superficie epitelial de la mucosa gástrica y/o en el estableci- miento y mantenimiento de la infección provocada por el H. pylori.

En una forma preferida, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las posiciones 1-260, o 28-260, en la SEQ ID NO: 2 o 4 del Listado de la Secuencia. Como se describe adicionalmente en la Sección Experimental, se cree que las posiciones 1-260 en las SEQ ID NO: 2 y 4 representan la proteína no separada o no desdoblada, mientras que las posiciones 1-27 representan una secuencia de la señal y las posiciones 28-260 representan el polipéptido maduro. La única diferencia entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4 es que la SEQ ID NO: 2 tiene un residuo Ser en la posición 222, mientras que la SEQ ID NO: 4 tiene un residuo Arg en la misma posición. Sin embargo, el polipéptido de acuerdo con la invención no está limitado estrictamente a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos idéntica con las posiciones mencionadas anteriormente en las SEQ ID NO: 2 o 4 en el Listado de la Secuencia. En lugar de que la invención abarque los polipéptidos que llevan modificaciones semejantes a las substituciones, deleciones, inserciones o inversiones pequeñas. Tales polipéptidos sin embargo, tienen substancialmente las propiedades del polipéptido de 29 kDa de acuerdo con la invención. Tales propiedades incluyen: la capacidad para producir una respuesta inmune de la mucosa así como una respuesta inmune sistémica contra el H. pylori en un huésped mamífero; la capacidad para trabajar como una adhesina; y la presencia del polipéptido tanto en las formas bacilar como cocoidea del H. pylori. Incluidos en la invención están consecuentemente los polipéptidos, la secuencia de aminoácidos de los cuales al menos 90% es homologa, preferiblemente al menos 95% homologa, con la secuencia de aminoácidos mostrada como las posiciones 1-260, o las posiciones 28-260, en las SEQ ID NO: 2 o 4, en el Listado de la Secuencia, tales polipéptidos sin embargo tienen substancialmente las actividades biológicas del polipéptido de 29 kDa de acuerdo con la invención. Están incluidos también en la invención los péptidos, con una longitud de al menos 5 aminoácidos, los cuales comprenden un epítope inmunogénico del polipéptido de 29 kDa de acuerdo con la invención y retienen la capacidad de producir una respuesta inmune contra las bacterias de H. pylori en un huésped mamífero. Tal (es) epítope (s) pueden ser presentados solos o en la forma de proteínas de fusión, en donde el epítope es fusionado a un polipéptido portador inerte o activo inmunológicamente. La identificación de estos epítopes estará basada en la presencia de los anticuerpos generados por el huésped hacia los diferentes segmentos del polipéptido de 29 kDa. Una manera de obtener información estructural sobre los epítopes de! polipéptido de 29 kDa es la producción y caracterización de los anticuerpos monoclonales que se unen al polipéptido, seguido por la conformación en mapas de los epítopes por ejemplo por Análisis de Pepscan. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por métodos estándares, tales como aquellos descritos por De St. Groth (1980) en J. Immunol. Methods, vol. 35, 1-21. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada y purificada la cual tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido como se definió anteriormente. En una forma preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN la cual tiene una secuencia de nucleótidos idéntica con las SEQ ID NO: 1 o 3 del Listado de Secuencias. Sin embargo, la molécula de ADN de acuerdo con la invención no va a estar limitada estrictamente a la secuencia mostrada como las SEQ ID NO: 1 o 3. En lugar de esto, la invención abarca las moléculas de ADN que llevan substituciones semejantes a modificaciones, deleciones pequeñas, inserciones o inversiones, las cuales sin embargo codifican polipéptidos que tienen substancialmente la actividad bioquímica del polipéptido de 29 kDa de acuerdo con la invención. Será conocido por la persona experta en la técnica que las substituciones A <-» G y T ++ C, sin efecto sobre la secuencia de aminoácidos, no son inusuales en el H. pylori. La única diferencia entre la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3 es que la SEQ ID NO: 1 tiene un residuo A en la posición 1458, mientras que la SEQ ID NO: 3 tiene un residuo C en la misma posición. También están incluidas en la invención las moléculas de ADN cuyas secuencias de nucleótidos son degeneradas, a causa del código genético, hasta la secuencia de nucleótido mostrada como las SEQ ID NO: 1 o 3. Puesto que existen 64 codones posibles, pero solamente 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los aminoácidos son codificados por más de un codón. Esta "degeneración" natural, o "redundancia", del código genérico, es bien conocida en la técnica. Será apreciado por consiguiente que la secuencia de ADN mostrada en el Listado de las Secuencias es solamente un ejemplo dentro de un grupo grande pero definido de las secuencias de ADN que codificarán el polipéptido como se describió anteriormente .

En consecuencia, la invención incluye una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (a) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos la cual es idéntica a aquella de, o substancialmente similar a, las posiciones 796-1572 o 874-1572 en las SEQ ID NO: 1 o 3 en el Listado de las Secuencias; (b) las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridación hasta una secuencia de nucleótidos complementaria con la región de codificación del polipéptido de una molécula de ADN como se definió en (a) y las cuales codifican para un polipéptido de acuerdo con la invención, o una forma modificada equivalente funcionalmente de la misma; y (c) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como un resultado del código genético hasta una secuencia de nucleótidos como se definió en (a) o (b) y la cual codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención, o una forma modificada funcionalmente equivalente del mismo. Un aspecto adicional de la invención es un vector el cual comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tal vector puede ser preferiblemente el vector del plásmido pAEl (Depositado bajo el Tratado de Budapest bajo el acceso No. NCIMB 40732) .

Un vector de conformidad con la invención también puede ser un vector de expresión replicable el cual lleva y es capaz de mediar la expresión de una molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención. En el presente contexto, el término "replicable" significa que el vector es capaz de replicarse en un tipo dado de célula huésped dentro de la cual ha sido introducida. Los ejemplos de los vectores son virus tales como bacteriófagos, cósmidos, plásmidos y otros vectores de recombinación. Las moléculas de ácido nucleico son insertadas en genomas del vector por los métodos estándares conocidos en la técnica. Un vector de expresión de acuerdo con la invención puede ser preferiblemente uno de los vectores pAL30:l, pAL30:2, pAL30:3, pAL30:4 o, más preferiblemente, el pS863. Incluida en la invención también está una célula huésped que alberga un vector de acuerdo con la invención. Tal célula huésped puede ser una célula procariótica, una célula eucariótica unicelular o una célula derivada de un organismo multicelular. La célula huésped puede ser así por ejemplo una célula bacteriana tal como una célula de E. coli; una célula de una levadura tal como la Saccharomyces cervisiae o Pichia pastoris, o una célula de mamífero. Los métodos empleados para efectuar la introducción del vector en la célula huésped son los métodos estándares bien conocidos por una persona familiarizada con los métodos del ADN recombinante. En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para la producción de un polipéptido como se definió anteriormente, el método comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión como se definió anteriormente, bajo condiciones por las cuales el polipéptido ' es producido, y recuperar el polipéptido. El medio utilizado para hacer crecer las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el propósito. Un vector adecuado puede ser cualquiera de los vectores descritos anteriormente, y una célula huésped apropiada puede ser cualquiera de los tipos de la célula listados anteriormente. Los métodos empleados para construir el vector y efectuar la introducción del mismo en la célula huésped, pueden ser cualquiera de los métodos conocidos para tales propósitos dentro del campo del ADN recombinante. El polipéptido recombinante expresado por las células puede ser secretado, es decir exportado a través de la membrana de la célula, dependiendo del tipo de célula y de la composición del vector.' Si el polipéptido es producido intracelularmente por el huésped recombinante, es decir, no es secretado por la célula, el mismo puede ser recuperado por procedimientos estándares que comprenden la ruptura de la célula por medios mecánicos, por ejemplo, sometiéndola a la acción del sonido o por homogeneización, o por medios enzimáticos o químicos seguido por purificación. Para que sea secretada, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido debe estar precedida por una secuencia que codifica para un péptido de la señal, la presencia del cual asegura la secreción del polipéptido a partir de las células de modo que al menos una proporción significativa del polipéptido expresado sea secretada hacia el medio de cultivo y recuperada. Un aspecto adicional de la invención es un polipéptido de acuerdo con la invención para su uso en terapia, para su uso en el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori en un mamífero, incluyendo el ser humano, y para su uso como una vacuna terapéutica o profiláctica. Otro aspecto importante de la invención es una composición de una vacuna para inducir una respuesta inmune protectora en un mamífero, incluyendo los seres humanos, contra la forma bacilar o cocoidea del Helicobacter pylori. Tal composición de vacuna comprende una cantidad efectiva inmunogénicamente de un polipéptido como se definió anteriormente, incluyendo al menos una parte del polipéptido de 29 kDa que comprende un epítope inmunogénico, o una forma modificada del polipéptido la cual retiene la capacidad para inducir la inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori. El término "forma modificada" incluye, pero no está restringida a, las formas del polipéptido las cuales son modificadas pos-translacionalmente, por ejemplo, lipidadas. Se cree que la proteína de 29 kDa está lipidada, cotéjese el Ejemplo 4 posterior. La composición de la vacuna comprende opcionalmente también un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente, • u otros antígenos activos inmunológicamente para uso profiláctico o terapéutico. Los portadores y diluyentes aceptables fisiológicamente son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen por ejemplo, la solución salada amortiguada con fosfato (PBS), o, en el caso de vacunas orales, formulaciones a base de HC03" o formaciones en polvo recubiertas entéricamente. La composición de la vacuna puede incluir opcionalmente o ser administrada junto con los inhibidores de la secreción acida, preferiblemente inhibidores de bomba de protones (PPIs), por ejemplo omeprazol. La vacuna puede ser formulada en sistemas de suministro conocidos tales como liposomas, ISCOMs, cochleatos, etc. (véase por ejemplo Rabinovich et al. (1994) Science 265, 1401-1404) o puede ser fijada a o incluida en las microesferas poliméricas de naturaleza degradable o no degradable. Los antígenos podrían estar asociados con bacterias, virus o fagos, atenuados, activos, o con vectores exterminados o muertos de la misma clase. Como será demostrado en la Sección Experimental posterior, una composición de vacuna de acuerdo con la invención puede ser utilizada para propósitos tanto terapéuticos como profilácticos. La composición de vacuna de acuerdo con la invención es administrada preferiblemente a cualquier mucosa de mamífero ejemplificada por las mucosas bucal, nasal, tonsilar, gástrica, intestinal (intestino delgado y grueso), rectal y vaginal. Las vacunas para la mucosa pueden ser administradas junto con los adyuvantes apropiados para este propósito. La vacuna también puede ser administrada parenteralmente, por la vía subcutánea, intracutánea o intramuscular, opcionalmente junto con el adyuvante apropiado. Un enfoque alternativo para crear una respuesta inmune contra el polipéptido de 29 kDa es utilizar el enfoque conocido como "vacunación de ácido nucleico" o vacunación de "ADN sin protección". Se sabe en la técnica que la inyección en el músculo del ADN del plásmido que codifica un antígeno de interés puede conducir a una expresión sostenida del antígeno y a la generación de una respuesta inmune (véase por ejemplo Rabinovich et al, supra) . Son posibles varias rutas de administración, tales como parenteral, mucosal o por medio de una "pistola de genes" que suministra cantidades diminutas de perlas o glóbulos de oro recubiertos con ADN (Fynan et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90, 11478-11482). Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser expresada en un plásmido que comprende un promotor eucariótico adecuado. Este "ADN sin protección" puede ser inyectado entonces intramuscularmente o se administra intradérmicamente por medio de una "pistola de genes". Los epítopes de la proteína expresada, serán expresados por las moléculas de MHC sobre la superficie de las células y activarán o provocarán una respuesta inmune. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico y los vectores que se describen en los párrafos previos para su uso en terapia, en particular para su uso como una vacuna, son aspectos adicionales de la invención. El uso de tales moléculas y vectores de ácido nucleico en la fabricación de composiciones para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori también son aspectos adicionales de la invención.

Todavía otro aspecto de la invención es utilizar un polipéptido como se definió anteriormente, o una forma modificada del polipéptido la cual retiene la capacidad de inducir una inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, en la fabricación de composiciones para el tratamiento, la profilaxis o el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori. " Tales composiciones incluyen en particular una composición de vacuna que produce una respuesta inmune protectora contra la forma bacilar y/o cocoidea del Helicobacter pylori. Incluido en la invención también está el uso en la fabricación de un juego o conjunto de diagnóstico para el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori. Tal juego o conjunto de diagnóstico es descrita posteriormente en forma adicional. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir en un mamífero, incluyendo el ser humano, una respuesta inmune protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, el método comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad efectiva inmunológicamente de una composición de vacuna como se definió anteriormente. El término "cantidad efectiva inmunológicamente" está propuesto para que signifique una cantidad la cual produce una respuesta contra el Helicobacter pylori, protectora, significativa, la cual erradicará una infección provocada por el Helicobacter pylori en un mamífero infectado o prevendrá la infección en un mamífero susceptible. Típicamente una cantidad efectiva inmunológicamente podría comprender aproximadamente 1 µg hasta 100 mg, preferiblemente en forma aproximada 10 µg hasta 10 mg, del antígeno del H. pylori para la administración oral, o aproximadamente menos de 100 µg para la administración parenteral. Otro aspecto de la invención es un método de diagnóstico in vitro de la infección provocada por el Helicobacter pylori, que comprende al menos un paso en donde un polipéptido como se definió anteriormente, que incluye una parte del polipéptido de 29 kDa, comprendiendo tal parte un epítope inmunogénico, es utilizado. El polipéptido puede ser etiquetado y/o unido opcionalmente a un soporte sólido. Un método de diagnóstico puede comprender por ejemplo, los pasos de (a) poner en contacto dicho polipéptido, unido opcionalmente a un soporte sólido, con un fluido corporal tomado de un mamífero; y (b) detectar los anticuerpos del fluido corporal que se unen al polipéptido. Los métodos preferidos para detect'ar los anticuerpos son los métodos ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido o enlazado por la enzima) los cuales son bien conocidos en la técnica.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un juego o conjunto de diagnóstico para la detección de la infección provocada por el Helicobacter pylori en una mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende los componentes los cuales hacen posible que un método de diagnóstico como se ejemplificó anteriormente, sea llevado a cabo.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Clonación y expresión de un polipéptido de 29 kDa a partir del H. pylori 1.1. Cepas bacterianas, vectores y condiciones de crecimiento El H. pylori CCUG 17874 (= NTCC 11673) se hizo crecer en placas de agar de sangre de caballo en una atmósfera microaerofílica. Las cepas XLl-Blue MRF' y XLOLR del E. coli (Stratagene, La Jolla, California) se utilizaron como cepas huésped para experimentos de clonación y se hicieron crecer en un caldo de Luria-Bertani (LB) o en un medio NZY suplementado con maltosa al 0.2% y 10 mM de MgS04 cuando se utiliza para la infección lambda. El vector de expresión lambda ZAP ExpressR y su derivado de fagemido pBK-CMV fueron obtenidos de Stratagene. 1.2. Técnicas de ADN El ADN cromosómico del H. pylori 17874 se preparó suspendiendo las bacterias de las placas incubadas durante 48 h en Tris-Cl 50 mM, pH 8.0, sucrosa al 25%, EDTA 50 mM que contiene 10 mg/ml de lisozima, y 5 ng/ml de RNasa libre de DNasa (Boehringer Mannheim Scandinavia AB, Bromma, Suecia) . La suspensión se incubó durante 10 minutos a +37°C. Un volumen igual del amortiguador de la lisis (0.4% de Tritón X100 en Tris-Cl 50 mM, pH 8.0; y 62.5 mM EDTA) es agregado y la suspensión se incuba a temperatura ambiente hasta que una lisis apreciable de las bacterias ha ocurrido. La suspensión se extrajo entonces en tres pasos, con fenol amortiguado (pH 8.0), fenol/cloroformo y cloroformo, respectivamente. El ADN se precipitó de la fase acuosa y se disolvió en la solución amortiguadora de TE (Tris-Cl 10 M, pH 8.0; y EDTA 1 mM) . Las enzimas de restricción fueron compradas de Boehringer Mannheim Scandinavia AB y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los plásmidos y el ADN lambda se purificaron con juegos o conjuntos Wizard (Promega, Madison, Wisconsin) . El secuenciamiento se efectuó utilizando el juego o conjunto Sequenase 2.0 (Amersham Sweden AB, Solna, Suecia). Los oligonucleótidos fueron comprados de Innovagen, Lund, Suecia. La PCR se efectuó utilizando la Taq ADN polimerasa (Boehringer-Mannheim Scandinavia AB) . 1.3. Construcción de una bibioteca genómica de H. pylori Los fragmentos de ADN cromosómicos en el intervalo de tamaño de 2-12 kb fueron purificados del ADN 17874 del H. pylori separado o desdoblado por Sau3A parcialmente y se clonó en el vector ZAP ExpressR digerido por BamHl como se describió en el protocolo de Stratagene. A continuación del envasado o empacado in vitro, la biblioteca se tituló infectando la cepa XL-1 Blue MFR y se colocó en placas sobre placas indicadoras que contienen isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido (X-Gal) . La concentración de la biblioteca fue de 1.2 x 106 PFU/ml con 85% de recombinantes. Las placas que expresan el polipéptido de 29 kDa se detectaron por la selección inmunológica utilizando MAb HP30-1:1:6 (BOlin et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33, 381-384) de acuerdo con los métodos estándares. Las placas positivas fueron aisladas y la colocación en placas y la selección con el MAb se repitió hasta que se obtuvo la pureza de la placa. La conversión a la forma de fagemido de los clones ZAP Express se efectuó utilizando el protocolo ExAssist (Stratagene) . 1.4. Inmunomanchado y prueba de manchado con puntos Los cultivos durante toda la noche del E. coli XLOLR que contienen los plásmidos con los insertos clonados del H. pylori 17874 mostrados en la Figura 1, se diluyeron 1:100 en 5 ml de medio LB con 50 mg/ml de kanamicina. Los cultivos fueron incubados a +37°C hasta que el OD a 600 nm fue de 0.7. La IPTG se agregó a una concentración final de 1 mM y las bacterias se hicieron crecer durante 2 h adicionales. Los cultivos sin IPTG se hicieron crecer en forma similar. Los cultivos fueron centrifugados y se volvieron a suspender en 1/10 del volumen. Diez µl de la suspensión se mezclaron con un volumen igual de la solución amortiguadora de la muestra 2X, se hirvieron y se analizaron por SDS-PAGE. La cepa XLOLR, hecha crecer de la misma manera pero sin kanamicina, sirvió como un control negativo. Una suspensión del H. pylori 17874 en PBS (OD a 600 nm = 1.0) se utilizó como un control positivo. Después de la inmovilización de los perfiles de la proteína sobre hojas de nitrocelulosa, la reacción con la MAb HP30-1:1:6 específica del polipéptido de 29 kDa diluida a 1:10 se llevó a cabo como se describió previamente (Bólin et al., 1995) y los anticuerpos unidos se detectaron utilizando IgG anti-ratón etiquetado con peroxidasa. Los filtros fueron revelados con un substrato de peróxido de hidrógeno y cromógeno de 4-cloronaftol (BioRad Svenska AB) . La prueba de manchado por puntos se efectuó utilizando cultivos de toda la noche de las cepas anteriores. Dos µl de una suspensión se colocaron como puntos o manchas sobre filtros de nitrocelulosa, secados con aire e incubados con MAb HP30-1:1:6 diluido al 1:10 durante una hora. Los pasos subsiguientes se llevaron a cabo como se describió para el inmunomanchado. 1.5. Clonación molecular El ADN cromosómico digerido parcialmente de la cepa 17874 del H. pylori se clonó en un vector de expresión lambda (ZAP Express™) . Cuatro placas que expresan el polipéptido de 29 kDa se detectaron después de la tamización o selección de 24,000 placas para la reacción con MAb específico para el polipéptido de 29 kDa. Las placas positivas fueron purificadas y el tamaño de los insertos clonados fue examinado por digestión de las preparaciones de ADN con Xbal y Salí. Los insertos fueron de 3.7 a 1.78 kb de tamaño. Después de la excisión in vivo de los fagemidos de pBK-CMV de las cuatro placas positivas, se construyeron los mapas de la enzima de restricción y se compararon con los insertos en el vector lambda. Las fagemidos se encontró que contienen fragmentos de ADN superpuestos con el mismo tamaño que en el vector lambda. La mayoría de las enzimas de restricción probadas, excepto para Smal y Nhel, no separaron o desdoblaron los fragmentos clonados. El mapa de restricción del fragmento 1.7 clonado más pequeño (pAEl) que fue analizado adicionalmente se muestra en la Figura 1. Uno de los insertos clonados estuvo en la dirección opuesta con respecto al promotor del vector. Cuando los extractos de la célula completa de las cepas del E. coli que contienen estos plásmidos fueron analizados en la prueba de inmunomanchado con MAb HP30-1:1:6, los mismos se encontró que todos expresan al polipéptido con el mismo peso molecular que el H. pylori 17874. No se observó ninguna diferencia en la expresión del polipéptido de 29 kDa cuando el promotor del vector fue inducido con IPTG. Esto indica que el gen fue transcrito a partir de su propio promotor. Tres subclon'es que contienen los fragmentos de ADN indicados en la Figura 1 fueron construidos y examinados para la expresión del polipéptido de 29 kDa. Ninguno de estos clones expresó el polipéptido. Cuando el XLOLR (pAEl) se probó en el ensayo de manchado por puntos (Bólin et al., 1995) y se comparó con el H. pylori, se encontró que va a ser débilmente positivo indicando que algunos de los polipéptidos expresados pueden estar expuestos sobre la superficie. 1.6. Análisis de la secuencia de ADN Ambas hebras del inserto de 1.7 kb de pAEl y los subclones fueron secuenciados utilizando los cebadores específicos para T3 y T7 y, cuando fue necesario, suplementados con cebadores específicos para cubrir regiones de la secuencia no disponibles con los cebadores estándares. El análisis de la computadora mostró que la secuencia (SEQ ID NO: 1) contuvo un marco de lectura abierta (ORF) de 780 bp en una hebra, que extiende los sitios de la enzima de restricción utilizadas para la subclonación (Figura 1) . Un sitio de unión del ribosoma putativo podría ser identificado (posiciones 782-785 de la SEQ ID NO: 1). El ORF codificó para los 260 aminoácidos de un polipéptido de un peso molecular de 29,126 DA (SEQ ID NO: 2). La secuencia de aminoácidos se encontró que contiene una secuencia de señal posible de 27 aminoácidos. La secuencia de Leu-Val-Gly-Cys (posiciones 25 a 28 en la SEQ ID NO: 2 y 4) es una de las secuencias de consenso general (Leu-X-Y-Cys) asignada como un sitio de reconocimiento para la peptidasa II de la señal de la enzima. La peptidasa II de la señal separa o desdobla las secuencias de la señal ante el residuo de cisteína en las prolipopropteínas. Las características de la secuencia de la señal sugieren así que la proteína de 29 kDa es una lipoproteína y que la proteína madura comprende los aminoácidos 28 a 260. 1.7. Expresión del polipéptido de 29 kDa recombinante en el E. coli El polipéptido de 29 kDa recombinante se produjo en una concentración elevada en el E. coli N4830-1 a partir de la construcción pAL30 del vector de expresión, la cual contiene el gen completo del polipéptido de 29 kDa (posiciones 771-1667 en la SEQ ID NO: 1 y 3) . El vector utilizado para la construcción fue el pML-LCTB ?7 (obtenido de Michael Lebens, University of Gothemburg, Suecia) el cual contiene un promotor ?PL fuerte. El vector también comprende un gen de ß-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina. El gen de LCTB (que codifica la toxina del cólera y su péptido de señal), el cual es insertado entre el promotor ?PL y una región terminada en el vector, fue escindida del vector por separación con las enzimas de restricción Smal y HindIII.

El gen estructural que codifica el polipéptido de 29 kDa, incluyendo su secuencia de la señal, se amplificó por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) . Los cebadores utilizados fueron HP30N (GGC GTA GAA ATG GAA GCG C; que corresponden a las posiciones 522 a 540 en la SEQ ID NO: 1 y 3) los cuales se unen a 271 bp corriente arriba del codón de partida de ATG y HP30C (CCC AAG ATT CAT CAG CCC TTA AAT ACÁ CG) los cuales reconocen un fragmento de ADN 855 bp corriente abajo del codón de partida (que corresponde a las posiciones 1648 a 1667 en las SEQ ID NO: 1 y 3) . El cebador de HP30C contuvo un sitio de escisión HindIII el cual por la reacción de PCR fue agregado a la secuencia del gen del polipéptido de 29 kDa. El producto de PCR resultante fue de 1.1 kb. Este fragmento de ADN fue separado o escindido por SspI y HindIII el cual dio un fragmento de 0.9 kb que fue ligado o unido al fragmento del vector (2.7 kb) . La construcción del vector ahora llamado pAL30 (3.6 kb) fue transformado en el E. coli N-4830-1 por electroporación. Cuatro clones positivos fueron encontrados (pAL30:l, 2, 3, 4). Para inducir la expresión del polipéptido recombinante, las células de N4830-1 que contienen el pAL30: 1 a 4 se hicieron crecer durante la noche a +30°C (el represor cl lambda inhibe la transcripción a esta temperatura) en 1 x LB con ampicilina (100 µg/ml). Una parte pequeña de este cultivo de toda la noche se inoculó en 5 ml 1 x LB con ampicilina y las células se hicieron crecer a +30°C hasta que el O.D. a 600 nm, fue de aproximadamente 0.7. La temperatura fue elevada entonces a +42°C, por lo cual el represor fue inactivado, y se incubó durante dos horas adicionales. Las muestras tomadas antes y después de la inducción se analizaron sobre SDS-PAGE al 14% y por inmunomanchado, utilizando el anticuerpo monoclonal HP30-1:1:6 el cual es específico para el polipéptido de 29 kDa. La totalidad de los tres clones inducidos, utilizados en el inmunomanchado (pAL30: 1, 3 y 4) expresaron una cantidad grande del polipéptido recombinante después de la inducción. La suspensión a partir de las células no inducidas contuvo solamente una cantidad pequeña del polipéptido de 29 kDa. El clon pAL30:l se eligió para análisis adicional. Para verificar que el clon realmente contuvo el gen que codifica el polipéptido de 29 kDa, los extremos del fragmento insertado en el vector fueron secuenciados. Se verificó que la secuencia insertada en el vector de expresión correspondiera con la secuencia esperada del fragmento de PCR clonado.

EJEMPLO 2: Características cinéticas de la expresión del polipéptido de 29 kDa durante varias condiciones de cultivo Dos cepas de H. pylori fueron utilizadas, especialmente CCUG 17874 (una cepa de laboratorio) y Hel 73 (aislada recientemente de un paciente que padece de úlcera duodenal) . El cultivo se efectuó sobre placas de agar de sangre, así como en un Caldo Brucella suplementado con la ciclodextrina. Todos los cultivos fueron incubados en una atmósfera microaerofílica que consiste de 5% de 02, 10% de C02 y 85% de N2. Las bacterias fueron recolectadas después de 2, 4 y 7 días, se lavaron una vez con PBS y se mantuvieron a -20°C para análisis subsiguiente. La expresión del polipéptido superficial de 29 kDa se analizó por el ELISA de inhibición empleando anticuerpos monoclonales específicos como los utilizados previamente para la detección de los antígenos de la superficie del E. coli (Lopez-Vidal, Y y Svennerholm, A-M, J. Clin. Microbiol. 28, 1906-) contra el polipéptido. Estos anticuerpos también fueron utilizados en microscopía inmunoelectrónica. Cuando el CCUG 17874 ha sido cultivado durante 7 días, sobre placas de agar de la sangre así como en un caldo brucella, aproximadamente 70% de las bacterias se han convertido desde la forma espiral hasta la forma cocoidea. Esta conversión ocurrió casi después de 3 días en Hel 73. La inhibición-ELISA mostró una concentración bastante constante del polipéptido de 29 kDa en las muestras tanto desde los cultivos de la placa como desde el caldo, durante los 7 días. La presencia del polipéptido fue confirmada por microscopía inmunoelectrónica. El polipéptido de 29 kDa se encontró que va a ser bien preservado en las formas cocoideas del H. pylori. El polipéptido de 29 kDa se encontró que va a ser más abundante en Hel 73 que en CCUG 17874.

EJEMPLO 3: Respuestas de anticuerpos contra el polipéptido de 29 kDa Las respuestas de los anticuerpos contra el polipéptido de 29 kDa se determinaron en las substancias gástricas aspiradas y el suero de los pacientes con úlceras duodenales (n=19), en portadores de H. pylori asintóticos (n=18) y en controles de igual edad no infectados (n=20) . Los niveles de anticuerpos contra el polipéptido de 29 kDa se probaron en substancias aspiradas gástricas y en el suero de los tres grupos de sujetos, por medio de métodos ELISA diferentes. Una mayoría de los sujetos infectados tuvieron niveles significativamente más elevados, comparado con las personas de control sanas, de los anticuerpos específicos contra el polipéptido de 29 kDa tanto en el suero como en las substancias aspiradas gástricas. Las concentraciones de los anticuerpos en los portadores asintóticos fueron comparables con aquellas de los paciente sintomáticos.

EJEMPLO 4: Etiquetación de polipéptidos con [3H]palmitato Puesto que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de 29 kDa contuvo un péptido de señal posible típico para las lipoproteínas, la etiquetación de la proteína con el ácido palmítico radioactivo fue investigada: el E. coli N4830-1, ya se careciendo de o llevando el pAL30:l, se hizo crecer a +30°C en caldo de LB suplementado con 50 µg de carbencilina/ml. A una densidad celular de 108 bacterias/ml, el ácido [3H]palmítico (5 Ci/ml; Dupont NEN, Boston, MA) fue agregado a una concentración final de 50 µCi/ml. La temperatura se elevó a +42°C y los cultivos se incubaron durante otras 12 h. Las células fueron colectadas por centrifugación y se usaron en una solución amortiguadora de lisis de SDS-PAGE. Después de la electrofóresis, el gel fue procesado para fluografía sumergiendo el gel en AmplifyR (Amersham International, UK) durante 30 minutos, secándolo entre hojas de celofán y exponiendo el gel a una película de rayos X a -70°C durante 36 horas. Los resultados indicaron que el polipéptido de 29 kDa es lipidado y por consiguiente modificado pos-translacionalmente.

EJEMPLO 5: Repartición del Tritón X-114 del E. coli que expresa el polipéptido de 29 kDa recombinante Las células de E. coli que llevan elpAL30:l se hicieron crecer a +30°C en un caldo de LB suplementado con 50 µg de carbencilina/ml. A una densidad celular de 108 bacterias/ml, la temperatura se elevó a +42°C y los cultivos fueron incubados durante otras 3 horas. Las células fueron colectadas por centrifugación (11.300 x g, 10 minutos, +4°C) y se volvieron a suspender en 25 ml de PBS por gramo de pildora de la célula. La suspensión se congeló y luego se descongeló a temperatura ambiente, y se agregaron 25 µl de DNAsa I (10 µg/µl) . La muestra se agitó suavemente por inversión durante 30 minutos a temperatura ambiente y se enfrió a 8-12°C seguido por la adición de Tritón X-114 (concentración final de 0.3%). Después de la incubación por inversión suave a +4°C durante 3 horas, el material insoluble se colectó por centrifugación (18.900 x g, 10 minutos, +25°C) .

Las fases se analizaron por SDS-PAGE y la identidad del polipéptido de 29 kDa se verificó por manchado de Western utilizando MAb HP30-1:1:6. Los resultados indican que el polipéptido de 29 kDa apareció en la fase detergente, lo cual confirmó que es una lipoproteína. Se sabe en la técnica que las proteínas de la membrana integral son recuperadas normalmente en la fase detergente (Bordier, C.(1981) J. Biol. Chem., vol. 256, 1604-1607). Este experimento también verificó que un plásmido insertado en el E. coli podría expresar y producir la proteína de 29 kDa. Esto es importante para la producción futura de una vacuna a gran escala, puesto que el H. pylori no creció muy bien o muy rápido.

EJEMPLO 6: Construcción del vector de expresión pS863 para la producción de niveles elevados de la proteína de 29 kDa del H. pylori 6.1. Preparación de la pS860 Para generar los sitios de restricción convenientes para la extremidad 5' del gen de 29 kDa, dos oligonucleótidos sintéticos para la amplificación del PCR fueron sinterizados. El plásmido pS852 (idéntico al pAL30:l del plásmido descrito en el Ejemplo 1.7) fue utilizado como un modelo para la amplificación del PCR. La secuencia de estos dos oligonucleótidos son listadas posteriormente .

-Tc-oRI M-teX -a---?AATtCC?TA sAGAGCAAATAATCATrTTA--AC-3 ' La amplificación por PCR fue efectuada y el fragmento amplificado por 169 bp se ligó o unió en el vector de TA (Mead, D.A. et al. (1991) Bio/Technology), 657-663) . El plásmido construido fue designado como pS860 (Figura 2) . La secuencia de la construcción se confirmó por el secuenciamiento didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). 6.2. Preparación del pS861 Para cambiar los sitios de restricción en el extremo 3' del gen de 29 kDa, dos oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por PCR fueron sintetizados. El plásmido pS852 (pAL30:l) se utilizó como un modelo o plantilla para la amplificación por PCR. Las secuencias de los dos oligonucleótidos son listadas enseguida: -EcoRI -t-mtl 5 ' -a*_-A?trccccc»m*p- t--tc-cAa ' -•-reí aa-HI La amplificación por PCR fue efectuada y el fragmento amplificado se digirió con Xmal y BamHl generando un fragmento de 357 bp. Este fragmento se clonó en el pUC19, el plásmido construido se designó pS861 (Figura 2) . La secuencia de la construcción se confirmó por el secuenciamiento de didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). 6.3 Preparación del plásmido pS862 El ADNc que codifica la parte intermedia del gen de 29 kDa se aisló por electrofóresis del gel como un fragmento de Nhel/Xmal de 280 bp a partir del plásmido pS852 (pAL30:l). Este fragmento se ligó junto con un fragmento de Xmal/BamHl a partir de pS861 y un fragmento de Nhel/BamHI de 4061 pb a partir de pS861. El plásmido generado se designó como pS862 (Figura 2). 6.4. Preparación del plásmido pS863 Después de esto, un fragmento de restricción de Ndel y BamHl de 795 bp se aisló de pS862 y se ligó o unió a un fragmento de Ndel/BamHl de 4 kb a partir del vector T7 del pS637 (pET-3a) (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzimol. 185, 60-89). El vector de expresión resultante se designó pS863 (Figura' 2).

EJEMPLO 7: Purificación de la lipoproteína de 29 kDa del H. pylori recombinante 7.1 Cepas del huésped y cultivos bacterianos El vector de expresión pS863 se transformó en las siguientes cepas huésped del E. coli; BL21(DE3) BL21 (DE3)pLysS; y BL21 (DE3) pLysE. Los experimentos de la expresión se llevaron a cabo esencialmente como se describió por Studier et al. (Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990) . Las bacterias se hicieron crecer en un medio LB (Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley / Sons. New York, 1992) que contienen 50 µg/ml de' carbencilina. Además, cuando las BL21 (DE3)pLysS y BL21 (DE3) pLysE fueron utilizadas, el medio se suplemento con 30 µg/ml de cloranfenicol. Para la inducción del sistema de expresión T7, los cultivos se hicieron crecer hasta una densidad de aproximadamente OD6oo = 0.5, y luego se suplementaron con 0.4 nM IPTG para inducción. Las células fueron colectadas aproximadamente a los 180 minutos después de la inducción. La cepa huésped que dio el nivel de expresión más elevado fue BL21(DE3)pLysS. 7.2. Purificación de la lipoproteína de 29 kDa del H. pylori Los cultivos del BL21 (DE3)pLysS del E. coli transformados con el plásmido pS863 se hicieron crecer como se describió anteriormente y las células fueron colectadas por centrifugación y se volvieron a suspender en una solución amortiguadora fría (Tris-HCl 50 mM, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, pH 8.0). Para cada gramo de la pildora (peso húmedo) 35 ml de solución amortiguadora fueron agregados. 7.2.1. Extracción con Tritón X-114 Para extraer la lipoproteína, el Tritón X-114 (TX-114) fue agregado a una concentración final de 1.5% (v/v) y la suspensión se agitó durante una hora a 0°C. El material insoluble de tritón se convirtió en pildoras por la centrifugación a 18,900 x g durante 10 minutos. En algunos casos las pildoras o microesferas fueron extraídas una vez más pero con la mitad del volumen de la solución amortiguadora que contiene el TX-114. Después de la segunda extracción del TX-114, las pildoras o microesferas fueron desechadas. La repartición de fases del sobrenadante a partir de la extracción del TX-114 se obtuvo por incubación de la misma ' durante 15 minutos a +30°C con mezclado adicional. La solución turbia se centrifugó a 31,300 x g durante 30 minutos a +30°C. La fase detergente inferior se colectó y se diluyó hasta 1% de TX-114 con una solución amortiguadora fría (Tris-HCl 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 10 mM, pH 8.0) . 7.2.2. Q-sepharose, pH 8.0 La fase de TX-114 diluida se aplicó a una columna de Q-sepharose (Pharmacia) (20 ml/3 g microesferas de la célula) equilibrada con solución amortiguadora (Tris-HCl 50 mM, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.1% Tritón X-100, pH 8.0). La lipoproteína de 29 kDa se colectó como la fracción no aglutinante. Esta fracción se repartió en fases incubándola a +30°C con mezclado ocasional hasta que la solución se hizo turbia. Las dos fases se separaron por centrifugación a 31,300 x g durante 30 minutos a +30°C. La fase detergente inferior se colectó y se diluyó hasta el 1% de TX-114 con una solución amortiguadora fría (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.6) . 7.2.3. Q-sepharose, pH 8.6 La fase TX-114 diluida se aplicó a una columna de Q-sepharose de 100 ml (Pharmacia) equilibrada con una solución amortiguadora (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.6). La fracción no aglutinante contuvo el TX-114. La columna se lavó con la solución amortiguadora A (10 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0.1% Tritón X-100, pH 8.6). La lipoproteína de 29 kDa se colectó por un gradiente de sal con la solución amortiguadora B (10 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0.1% Tritón X-100, 1 M NaCl, pH 8.6). El gradiente fue como sigue; 0-50%B, 40 ml; 50-100%B, 100 ml. La lipoproteína de 29 kDa se eluyó entre 60-70% de B. 7.2.4. SDS-PAGE y electromanchado de la proteína Las muestras de proteína de los diferentes pasos de purificación se solubilizaron en la solución amortiguadora de la muestra (50 mM Tris HCl, pH 6.8, 8% de glicerol, 1.6% de SDS, 4% de ß-mercaptoetanol, 0.02% de azul de bromofenol) y se separaron sobre geles de gradiente prefundido Novex (4-20% de poliacrilamida) o geles de gradiente prefundido BioRad (10-20 de poliacrilamida) . El amortiguador para hacer funcionar la electrofóresis contuvo 25 mM Tris, 192 mM glicina, 0.5% de SDS, pH 8.3. Los geles fueron teñidos con 0.1 % de Azul Brillante Coomassie R-250 en metanol al 40%, ácido acético al 10% y se destiñó con 10% de metanol, 10% de ácido acético. Los geles propuestos para el electromanchado en condiciones de Semisequedad no estuvieron teñidos pero fueron remojados en una solución amortiguadora Transfer (48 mM Tris, 38 mM glicina, 0.075 % SDS, 20 % de MeOH) y las proteínas fueron transferidas sobre las membranas PVDF (ImmobilonR, Millipore, EUA) por medio de un aparato de electromanchado en condiciones de Semisequedad (BioRad) . La inmunodetección se efectuó bloqueando primero la membrana de PVDF durante una hora en 2% de BSA en TBS (50 mM Tris-HCl, 2.5 M NaCl, pH 8.2) y después de esto la membrana se incubó durante una hora con un anticuerpo monoclonal específico (IgGl) contra la lipoproteína de 29 kDa diluida al 1:10 con 1% de BSA en TBS. Después de un paso de lavado con TBS la membrana se incubó durante una hora con un anticuerpo de IgG antiratón conjugado con fosfatasa alcalina (Dakopatts, Dinamarca) . Después de un lavado adicional, la membrana se desarrolló con los substratos adicionales (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y nitroazul tetrazolio (NBT) (Sigma)). 7.2.5. Concentración de proteína y pirogenicidad La concentración de la proteína total se determinó por el método del ácido bicinchonínico (Ensayo de Proteína de BCA. Pierce Chemical Company, EUA) . El contenido de la endotoxina se evaluó por una prueba de lisato del amebocito de Limulus cromogénico (LAL) (LAL C0AMATICR Endotoxin. Endosafe Inc. EUA). Los geles de SDS teñidos fueron explorados (BioRad Imager GS-) para determinar la cantidad relativa de los contaminantes de proteína en las preparaciones finales. Las preparaciones contuvieron < 10% de contaminantes de la proteína.

EJEMPLO 8: Análisis de la proteína de 29 kDa del H. pylori para su uso como una vacuna 8.1. Materiales y Métodos 8.1.1. Animales Ratones BALB/c SPF hembras fueron comprados del centro Bromholt Breeding (Dinamarca) . Los mismos fueron mantenidos en jaulas de macrolon ordinarias con un suministro libre de agua y alimentos. Los animales tenían 4-6 semanas a su llegada. 8.1.2. Infección Después de como mínimo una semana de aclimatación, los animales fueron infectados con una cepa del tipo 2 del H. pylori (cepa 244, aislada originalmente de un paciente con úlcera) . Esta cepa ha probado previamente que va a ser un buen colonizador del estómago del ratón. Las bacterias se hicieron crecer toda la noche en un caldo de Brucella suplementado con 10% de suero de bovino fetal, a 37°C en una atmósfera microaerofílica (10% C02, 5% 02) . A los animales se les suministró una dosis oral de omeprazol (400 mmoles/kg) y después de 3-5 horas una inoculación oral del H. pylori (aproximadamente 108 cfu/animal) . La infección se verificó en animales de control 2-3 semanas después de la inoculación. 8.1.3. Inmunizaciones Los animales' fueron inmunizados 4 veces durante un período de 34 días (día 1, 15, 25 y 35) . El antígeno purificado fue suministrado a una dosis de 100 µg/ratón y las proteínas de la membrana (MP) a una dosis de 0.5 mg/dosis. Las proteínas de la membrana fueron preparadas por la aplicación de sonido a las bacterias en PBS. Los desechos fueron removidos por centrifugación del material al cual se le aplicó el sonido a +4°C, 2000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a +4°C, 15,000 rpm durante 20 minutos. Las microesferas se recuperaron y se almacenaron a -70°C hasta que se utilizaron.' Como un adyuvante, a los animales también se les administraron 10 µg/ratón de toxina del cólera (CT) con cada inmunización. El omeprazol (400 µmoles/kg) fue administrado oralmente a los animales 3-5 horas previo a la inmunización como una forma de proteger a los antígenos de la degradación por el ácido. Los animales fueron sacrificados 4 semanas después de la inmunización final. 8.1.4. Protección pasiva Para analizar el efecto de los anticuerpos monoclonales (MABs) sobre la capacidad del H. pylori para colonizar el estómago del ratón, los MABs con diferentes especificidades se mezclaron con el H. pylori 10 minutos previo a la inoculación como se describió anteriormente. Los MAbs realzados o elevados contra la proteína de 29 kDa (HP30-1:1:6) , contra la ureasa (Ure 8:1); y contra la proteína estable térmicamente del E. coli (ST 1:3), fueron utilizados. Los MAbs fueron titulados en un ELISA para permitir que iguales cantidades de cada MAb sean utilizadas en el experimento. Un número de 107 bacterias por ratón fueron utilizadas para la inoculación. Los ratones fueron sacrificados 2 semanas pos-inoculación. 8.1.5. Análisis de la infección Los ratones fueron sacrificados por C02 y dislocación cervical. El abdomen fue abierto y se removió el estómago. Después de cortar el estómago a lo largo de la curvatura más grande, el mismo se enjuagó en agua salada. La mucosa del antro y el corpus de un área de 25 mm2 fue raspada separadamente con un escalpelo quirúrgico. La mucosa raspada se suspendió en el caldo de Brucella y se colocó en placas sobre placas de Blood Skirrow. Las placas se incubaron bajo condiciones microaerofílicas durante 3-5 días y el número de las colonias fueron contadas. La identidad del H. pylori fue averiguada por la prueba de la ureasa y la catalasa y por microscopía directa o teñido de Gram. 8.2. Resultados 8.2.1. Protección pasiva Tres grupos con 10 animales en cada uno fueron administrados con una mezcla de la cepa 244 del H. pylori y MAb, y un grupo fue administrado solamente con H. pylori. La mezcla de MAb y de las bacterias se permitió que reaccionara durante 10 minutos antes de que sea inoculada en el ratón. Ninguno de los MAbs utilizados tuvieron ningún efecto claro sobre las bacterias in vitro. Dos semanas después de la inoculación, los ratones fueron sacrificados y la velocidad de la infección se determinó para cada grupo (Fig. 3) . La totalidad de los ratones en el grupo de control y aquellos inoculados con el MAb ST fueron infectados. En el grupo de MAb de la ureasa todos los ratones fueron infectados, pero a un grado significativamente inferior comparado con los controles. En el grupo inoculado con el MAb contra la proteína de 29 kDa, ninguno de los ratones fueron infectados. 8.2.2. Inmunización terapéutica Los animales en este estudio fueron infectados con la cepa 244 del H. pylori un mes previo a las inmunizaciones. Los ratones en grupos de diez fueron inmunizados entonces ya sea con la toxina del cólera (CT) o el CT junto con proteínas de la membrana, ureasa o la proteína de 29 kDa. Los animales de control recibieron solamente el vehículo (PBS) . Un mes después de la inmunización final, los animales fueron sacrificados y se determinó la CFU (Figura 4) . Todos los animales de control, así como aquellos inmunizados solamente con CT, fueron infectados. Los animales inmunizados activamente con la ureasa o CT, o' con proteína de 29 kDa y CT, tuvieron valores de CFU reducidos significativamente, comparado con los controles. Solamente un animal en el grupo inmunizado con la ureasa fue curado completamente de la infección. 8.3. Conclusiones Los resultados anteriores indican que la proteína del H. pylori de 29 kDa es importante para la colonización y/o la persistencia de una infección, puesto que la unión de un MAb a esta estructura conduce a la inhibición completa de la colonización. Además, la proteína del H. pylori de 29 kDa, cuando se utiliza como un inmunógeno oral en conjunción con la toxina del cólera como un adyuvante oral, actúa como un estimulador de una respuesta inmune que conduce a una reducción significativa del grado de colonización del H. pylori en el modelo de animal utilizado.

Tomados conjuntamente, estos resultados soportan o apoyan fuertemente el uso de la proteína del H. pylori de 29 kDa en una formulación de vacuna oral para el uso en seres humanos para tratar y prevenir las infecciones provocadas por el H. pylori.

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS El plásmido pAEl ha sido depositado bajo el Tratado de Budapest en el National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) , Aberdeen, Scotland, UK, y bajo el número de acceso NCIMB 40732. La fecha del depósito es del 16 de mayo de 1995.

LISTADO DE LAS SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: ASTRA AB (B) CALLE: Vástra Malarehamnen 9 (C) CIUDAD: Sódertálje (E) PAÍS: Suecia (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : S-151 85 (G) TELÉFONO: +46 8 553 260 00 (H) TELEFAX: +46 8 553 288 20 (I) TELEX: 19237 astra s (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Antígenos Bacterianos y Composiciones de Vacuna (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEÍBLE POR LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: Compatible con IBM PC (C) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1670 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 793..1575 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_?eptide (B) LOCALIZACIÓN: 793..1572 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : GA CCTATCC COCCAAACCT GGT?TT?OC? ?T?AG?GCTT GATTATTAAT CICCCTOGT? 60 ?CTCCAAAA? CTATTA-----CA ATOCTTAGAO GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TT?TTCCCTC 120 CATT GATTT TACOC??TT? C?T--C??CTC AATO?????A AC?TTC??GC GTT GCCCCC 180 AA?C??T??G GT??????TC CCACTCACTC ATTTGAATGA AG????TC?? CCTAAAATOC 240 TOG?TAT?GC OGAT???G?? ?CC?CTS ?? GAATCOCTCT AGCAAGCOCT CGT?TC?CC? 300 TC??T???G? OGCTT?TG?C CCT?TT?TC? ?TC?TOCCGT C?????OOGT CCOGT?TT?C 360 AAACTGCTAT TATTOCTOGC ATTATGGGGC CTAAAAAGAC ??ßCG??CTC ATTCCCATCT 420 GCCATCC??T CATGCTCA?T GGGGTOG?T? TTG?T?TTTT ?GA?---????? GAG?CTTOTA 480 GTTTTA??CT CT?TGCGAC? GTC????CTC ??CCT????C GOCCCTAGAA ?TCG??GCGC 540 TAATGAGTGT GAGCGT?GGG CTTTTA?CC? TTT?TG?C?T GGTG???GCC ATTGATAAGA 600 GC?TSAC??T TAGCGGTCTG ATGCTGG??T AT????GTGG ?OGC????GT GGGGATT?T? 660 ACGCTAAAAA ?T?G?????G ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGT????T AACATTTTGA 720 CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTT CTTGTTAT?G ??CTCT???? TATT?CAATC 780 AAGGATAGAA CC ATC AG? GC? AAT A?T C?T TTT ??? G?T TTT GC? TGC 828 Mßt ?rg ?la ?sn Asn His Ph* Lyß ?sp Ph* ?la Trp 1 5 10 ??A AAA TOC CTT TTA GGC GCG ?GC GTG GTG GCT TT? TT? GTG GC? TOC 876 Lys Lys Cys L«u L*u Gly ?la S*r Val Val ?la Lau Lau Val Gly Cys 15 20 25 ?GC CCC C?T ?TT ?TT G?? ?CC ??T G?? GTC GCT TTC ??? TTG ??T T?C 924 Sar Pro His II* Xl* Glu Thr ?sn Glu Val ?la Lau Lys Lau ?sn Tyr 30 35 40 C?T CC? GCT ?GC G?G ??? CTT C?? GCC TT? G?T G?? AAG ATT TTG CTT 972 His Pro ?la S r Glu Lys Val Gln ?la Lau ?sp Glu Lys XI* L*u L*u 45 50 55 60 TT? ?GC CC? GCT TTC C?? T?T ?GC C?T A?T ATC GCT A?? C?C T?T G?? 1020 Lau ?rg Pro ?la Pha G n Tyr Ser ?sp ?sn lia ?la Lys Glu Tyr Glu 65 70 75 AAC AAA TTC ??G ??T C?? ?CC GCC CTC AAC GTT G?? C?G ?TT TTG C?? 1068 ?sn Lys Ph* Lys ?sn Gln Thr ?la Lau Lys Val Glu ßln X * Leu Gln 80 85 90 ??T CAA GGC T?T ??G GTT ?TT ?GC GT? G?T ?GC ?GC G?T ??? G?C G?T 1116 ?sn G n Gly Tyr Lys Val XI* S*r Val ?sp Sar Sar ?sp Lys ?sp ?sp 95 100 105 TTT TCT TTT GC? CAÁ ??? ??? G?? CGC T?T TTC GCC CTT GCT ?TG ??T 1164 Phß Ser Ph* ?la Cln Lys Lys Ciu Cly Tyr Lau ?la Val ?la Mßt ?sn 110 115 120 CGC C?? ?TT CTT TT? CCC CCC C?T CCT ??? AGG ACC ?T? C?C ??? ??? 1212 Cly Ciu XI* Val L*u ?rg Pro ?sp Pro Lys ?rg nur XI* Cln Lys Lys 125 130 135 140 TCA CA? CCC OOC TT? TT? TTC TCC ACC CGT TTC G?C ??? ?TC G?? OQC 1260 S*r Ciu Pro Cly L*u Leu Ph* S*r Thr Cly Leu ?sp lys Mat Ciu Gly 145 150 155 CIT TT? ?TC CCC GCT GGG TTT ?TT ??G GTT ?CC ?T? CT? CAC CCT ?TC 1308 Val Leu XI* Pro ?la Gly Pha Xlß Lys Val Thr Xlß Lau Glu Pro Mßt 160 165 170 ?GT GGG G?? TCT TTG G?T TCT TTT ?CG ?TC G?T TTC AGC G?C TTG GAC 1356 Ser Gly Glu Ser Leu ?sp Ser Phe Thr Met ?sp Leu Ser Glu Leu ?sp 175 180 185 ?TT C?? C?? ??? TTC TT? AAA ACC ?CC C?T TC? ACC C?T ACC GGC CGG 1404 Xle Gln Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly 190 195 200 TT? GTT ?GC ?CT ?TC GTT ??G GG? ?CC GAT A?T TCT ??T CAC GCC ATC 1452 Leu Val Ser Thr Met Val Lys Cly Thr ?sp ?sn Ser ?sn ?sp ?la Xle 205 210 215 220 ?AG AGC GCT TTG A?T AAC ATT TTT GCA AAT ATC ATC CAA CA? ATA CAC 1500 Lys Ser ?la Leu ?sn Lys Xle Ph* ?la ?sn X * Mßt Gln Ciu X * Asp 225 230 235 A?? AAA CTC ACT C?? AAC A?T TT? C?? TCT TAT CAÁ AAA GAC CCC A?? 1548 Lys Lys Leu Thr Cln Lys ?sn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys ?sp Ala Lys 240 245 250 G?? TT? ??? GGC ??? AGA AAC CG? T?? AAACAAATAA CCC?T??GA? 1595 Ciu Leu Lys Cly Lys ?rg ?sn ?rg 255 260 ??G??CGCTT C??TAAACTC CTT?????GG GTTTTTT?GC GTIVlTmx; ?GCGTGT?TT 1655 T??OGGCTC? TCATC 1670 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2.

Mßt ?rg ?la ?sn ?sn His Phß Lys ?sp Phe ?la Trp Lys Lys Cys Leu 1 5 10 15 Leu Cly ?la Ser Val Val ?la Leu Lau Val Cly Cys Sar Pro His Xle 20 25 30 Xla Glu Tfcr ?sn Glu Val ?la Lau Lys Leu ?sn Tyr His Pro ?la Ser 35 40 45 Ciu Lys Val Gln ?la Leu ?sp Ciu Lys Xle Leu Leu Leu ?rg Pro ?la 50 55 60 Phß Cía Tyr Sar ?sp ?sa Xle ?la Lys Ciu Tyr Ciu ?sn 1-yß Phß Lys 65 70 75 80 ?sn Gln Thr ?la Leu Lyß Val Ciu Cía XI* L*u Gla ?sa Ola Cly Tyr 85 90 95 Lys Val XI* Ser Val ?sp Ser Ser ?sp Lys ?sp ?sp Phe Ser Phß ?la 100 105 110 Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu ?la Val ?la Mßt ?sn Gly Glu Xle Val 115 120 125 Leu ?rg Pro ?sp Pro Lys ?rg Thr Xle Gln Lys Lys Ser Ciu Pro Gly 130 135 140 Leu Leu Phe Ser Thr Cly Leu ?sp Lys Mßt Glu Cly Val Leu Xle Pro 145 150 155 160 ?la Cly Phß Xle Lys Val Thr Xle Leu Glu Pro Met Se; Gly Glu Ser 165 170 175 Leu ?sp Ser Phe Thr Met ?sp Leu Ser Glu Leu ?sp Xle Gln Glu Lys 180 185 190 Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser T r 195 200 205 Met Val Lys Gly Thr ? p ?sn Ser ?sn ?sp ?la Xle Lys Ser ?la Leu 210 215 220 ?sn Lys Xlß Phß ?la ?sn Xle Met Gln Glu Xle ?sp Lys Lys Leu Thr 225 230 235 240 Cln Lys ?sn Leu Ciu Ser Tyr Gln Lys ?sp ?la Lys Ciu Lau Lys Gly 245 250 255 Lys ?rg ?sn ?rg 260 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1670 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (b) LOCALIZACIÓN: 793..1575 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 793..1572 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: G?TCCT?TCC CGCC???OGT OCTATT?CC? AT??G?GCTT CATTATTAAT CTCCCTOGT? 60 ?CTCC????? GT?TT?G?G? ?TOCTT?C?G 0----GTTTTTC C?GCG?TTCC TTATTCCCTG 120 GATTTG?TTT T?GOG??TT? C?TGC??GTC ??TGA????? ?C?TTC??GC GTTTCCCCCC 180 ???CAAT??G CTA?????TC CC?CTC?CTC ATTTG??TG? AG????TC?? CCT????TQG 2 0 TCGAT?T?GG GGAT???G?? ?CC?CTC??? G??TCCCTCT AGC??GCGCT CGT?TC?GC? 00 TC??T???C GGCTT?TG?C GCT?TT?TC? ?TC?TGGCsT C?????GGGT CCGGTATT?C 360 AAACTGCT?T T?TTGCTGGG ?TT?TGGGGG CT?????G?C AACCG??CTC ?TTCCCATGT 420 GCCATCCA?T CATCCTC??T --GGGTCG?T? TTG?T?TTTT ?GA?G????? CACACTTCTA 480 CTTTTAAACT CT?TGCGAG? GTCAAAACTC A?GCT????C CGGCCTAGAA ?TCGAAGCGC 540 T??TG?GTGT G?CCCT?CCG CTTTT?ACCA TTT?TG?C?T GGTC???GCC ?TTCATAAGA 600 GC?TG?C??T TAGCOGTGTC ATCCTGG??T ?T????GTCG ?GGC????CT GGGGATT?T? 60 ?CGCT????? ATAGAAAAAG ACTCATAATC TAAAGATATT ACGGT??A?T ??C?TTTTC? 720 C??C????CC GTCTTÜGTTG CTTCOCATTT CTTGTT?T?C ??GTCTAA?? TATT?CAATC 780 ??CG?T?G?? CC ATC AG? GC? ??T ??T C?T TTT ??? G?T TTT GC? TCG 828 Met ?rg ?la ?sn ?sn His Phe Lys ?sp Phe ?la Trp 1 5 10 ??? ??? TCC CTT TT? GGC GCG AGC GTC CTC GCT TTA TTA CTC GG? TCC 876 Lys Lys Cys Leu Leu Gly ?la Ser Val Val ?la Leu Leu Val Gly Cys 15 20 25 ?GC CCG C?T ?TT ?TT C?? ?CC ??T CAA GTC GCT TTG ??? TTG ??T T?C 924 Ser Pro His Xle Xle Glu Thr ?sn Glu Val ?la Leu Lys Leu ?sn Tyr 30 35 40 CAT CC? GCT ACC G?G ??? CTT CAA GCG TTA G?T G?? AAC ATT TTC CTT 972 His Pro ?la Ser Glu Lys Val Gln ?la Leu ?sp Glu Lys Xle Leu Leu 45 50 55 60 TT? ?GC CC? GCT TTC CA? T?T AGC G?T ??T ?TC GCT ??? C?G T?T G?? 1020 Leu ?rg Pro ?la Phe Cln Tyr Ser ?sp ?sn Xle ?la Lys Glu Tyr Ciu 65 70 75 ??C ??? TTC AAC ??T CAÁ ACC GCC CTC AAC GTT GA? C?G ?TT TTC C?? 1068 ?sn Lys Pha Lys ?sn Gln Thr ?la Leu Lys Val Glu Gln Xla Leu Cln «0 85 90 ??T C?? GCC T?T ??G GTT ?TT ?GC GT? G?T ?GC ?GC C?T ??? C?C G?T 1116 ?sn Gla Cly Tyr Lys Val Xle Ser Val ?sp Sar Ser ?sp Lys ?sp ?sp 95 100 105 TTT TCT TTT GC? C?? ??? ??? C?? GOG T?T TTG OCC GTT CCT ?TC ??T 1164 Ph* Ser Ph* ?la Cía Lys Lys Glu Cly Tyr Leu ?la Val ?la Nat ?sn 110 115 120 CGC G?? ?TT CTT TT? CCC CCC C?T CCT????GC?CC?T?C-?C ?????? 1212 Ol OÍ" II* Val Lau Arg Pro ?sp Pro Lys ?rg Thr Ha ein Lyß Lyß 125 130 135 140 TC? G?? CCC GGG TT? TT? TTC TCC ?CC GGT TTG G?C AAA ATG GA? COG 1260 S*r Glu Pro Gly Leu Leu Ph* Ser Thr Gly Leu ?sp Ly» Met Glu Cly 145 150 155 GTT TT? ?TC CCG OCT OOG TTT ?TT AAC GTT ACC ?T? CT? G?C CCT ?TC 1308 Val Leu Xle Pro ?la Cly Phe Xle Lys Val Thr Xle Leu Glu Pro Met 160 165 170 ?GT CGG GAA TCT TTC GAT TCT TTT ?CG ?TG G?T TTG ?OC GAG TTG G?C 1356 Ser Gly Glu Ser Leu ?sp Ser Phe Thr Met ?sp Leu Ser Glu Leu ?sp 175 180 185 ?TT C?? GAA ??? TTC TT? ??? ACC ACC C?T TC? ?GC C?T ?GC GGG GGG 1404 Xle Gln Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser Hiß Ser Gly Gly 190 195 200 TTA GTT ACC ACT ATG GTT A?C CG? ?CG C?T ??T TCT ??T C?C GCG ?TC 1452 Lau Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr ?sp ?sn Ser ?sa ?sp ?la ?le 205 210 215 220 AAC ACÁ GCT TTG A?T ??G ?TT TTT GC? ??T ?TC ?TC C?? G?? ?T? G?C 1500 Lys ?rg ?la Leu ?sn Lys Xle Phe ?la ?sn Xlß Mßt Cía Glu Xle ?sp 225 230 235 ??? ??? CTC ?CT CAA ??G ??T TT? GAA TCT T?T CAÁ ??? G?C GCC ??? 1548 Lys Lys Leu Thr Cln Lys ?sn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys ?sp ?la Lys 240 245 250 G?? TT? ??? GGC ??? ?C? ??C CC? T?? AAACAAATAA CJXA?AAGAA 1595 Glu Leu Lys Gly Lys ?rg ?sn ?rg • 255 260 ??C??CGCTT G??T???CTC CTT?????OC GTTTTTT?GC OTlVl l'pU ?CCGTGT?TT 1655 T??OCGCTC? TG?TC 1670 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 Mßt ?rg ?la ?sn ?sa His Pha Lyß ?sp Pha ?la Trp Lys Lys Cvß i-m 1 5 l 1o0 „ 15 Leu Cly ?la Sar Val Val ?la Lau Lau Val Cly Cys Sar Pro His Xlß 20 25 30 Xlß Glu Thr ?sn Glu Val ?la Leu Lys Leu ?sn Tyr His Pro ?la Ser 35 40 45 Glu Lys Val Gln ?la Leu ?sp Glu Lys Xle Leu Leu Leu ?rg Pro ?la 50 55 60 Phe Gln Tyr Ser Asp ?sn Xle ?la Lys Glu Tyr Glu ?sn Lys Phe Lys 65 70 75 80 ?sn Gln Thr ?la Leu Lys Val Glu Gln Xle Leu Gln ?sn Gln Gly Tyr 85 90 95 Lys Val Xlß Ser Val \sp Ser Ser ?sp Lys ?sp ?sp Phe Ser Phe ?la 100 105 110 Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu ?la Val ?la Mat ?sn Gly Glu Xle Val 115 120 125 Leu ?rg Pro ?sp Pro Lys ?rg Thr Xle Gln Lys Lys Ser Glu Pro Gly 130 135 140 Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu ?sp Lys Met Ciu Cly Val Leu Xle Pro 145 150 155 160 ?la Cly Phe Xle Lys Val Thr Xlß Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser 165 170 175 Leu ?sp Ser Phe Thr Met ?sp Leu Ser Glu Lau ?sp Xle Gln Glu Lys 180 185 190 Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr 195 200 205 Met Val Lys Gly Thr ?sp ?sn Sar ?sn ?sp ?la Xle Lys ?rg ?la Leu 210 215 220 ?sn Lys Xle Phe ?la ?sn Xle Met Gln Ciu Xlß ?sp Lys Lys Leu Thr 225 230 235 240 Cln Lys ?sn Lau Ciu Ser Tyr Gln Lys ?sp ?la Lys Glu Leu Lys Cly 245 250 255 Lys ?rg ?sn ?rg * INDICACIONES QUE SE REFIEREN ? ON MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regla 13bis del PCT) A. La indicación hecha posteriormente se refiere al microorganismo referido en la descripción en la página 30 línea 17-22 b . IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Los depósitos adicionales son identificados en en una hoja adicional D Nombre de la institución depositaría The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) 23 St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scotland, UK Fecha de depósito Número de acceso 16 Mayo 1995 NCIMB 40732 C. INDICACIONES ADICIONALES (deje en blanco si no es aplicable Esta información es continuada en una hoja adicional D Con respecto a todos los estados designados en los cuales tal acción es posible y hasta el grado que sea permisible legalmente bajo la ley del estado designado, se requiere que una muestra del microorganismo depositado sea hecha disponible solamente por la presentación de la misma a un experto independiente, de acuerdo con la legislación de patente relevante, por ejemplo la Regla 28(4) EPC, y las provisiones generalmente similares mutatis mutandis para cualquier otro estado designado.

D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SON HECHAS LAS INDICACIONES (si las indicaciones no son para todos los Estados designados) E. PROVISIÓN SEPARADA DE INDICACIONES (deje en blanco si no es aplicable) Las indicaciones listadas posteriormente serán presentadas a la Oficina Internacional posteriormente (especifique la naturaleza general de las indicaciones por ejemplo, "Número de Acceso de Depósito") Solamente para uso de la Solamente para uso de la Oficina receptora Oficina Internacional [X] Esta hoja fue recibida D Esta hoja fue recibicon la solicitud da por la Oficina internacional Internacional Funcionario Autorizado: Funcionario Autorizado: (RUBRICA) Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es idéntica con, o substancialmente similar a, las posiciones 1-260 o 28-260 en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 en el Listado de las Secuencias.

2. Un péptido con una longitud de al menos 5 aminoácidos, caracterizado porque comprende un epítope inmunogénico de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque se selecciona de: (a) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleóti'dos la cual es idéntica con, o substancialmente similar a, las posiciones 796-1572 o 874-1572 en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 en el Listado de las Secuencias; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizarse hasta una secuencia de nucleótidos complementaria con la región de codificación del polipéptido de una molécula de ácido nucleico como se definió en (a) y la cual codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, o una forma modificada equivalente funcionalmente de la misma; y (c) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como un resultado del código genético hasta una secuencia de nucleótidos como se definió en (a) o (b) y la cual codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, o una forma modificada equivalente funcionalmente del mismo.

5. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3 o 4.

6. Un vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es el vector del plásmido pAEl (NCIMB 40732).

7. Un vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es un vector de expresión capaz de mediar la expresión de una molécula de ADN de conformidad con las reivindicaciones 3 o 4.

8. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es el vector del plásmido pS863 mostrado en la Figura 2.

9. Una célula huésped, caracterizada porque contiene un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

10. Un proceso para la producción de un polipéptido el cual es un antígeno de 29 kDa expuesto superficialmente del Helicobacter pylori, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de conformidad con las reivindicaciones 7 o 8 bajo las condiciones por las cuales el polipéptido es producido, y recuperar el polipéptido.

11. Un polipéptido o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque se utiliza en terapia.

12. Un polipéptido o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque se utiliza en el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori.

13. Un polipéptido o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque se usa como una vacuna.

14. Una composición de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora para la infección provocada por el Helicobacter pylori, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva inmunogénicamente de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, o una forma modificada del polipéptido la cual retiene la capacidad de inducir una inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, opcionalmente junto con un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente.

15. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque se utiliza como una vacuna terapéutica en un mamífero, incluyendo el ser humano, el cual está infectado por el Helicobacter pylori.

16. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque se utiliza como una vacuna profiláctica para proteger a un mamífero, incluyendo el ser humano, de la infección provocada por el Helicobacter pylori.

17. El uso de un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, o una forma modificada del polipéptido la cual retiene la capacidad de inducir una inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, en la fabricación de una composición para el tratamiento, la profilaxis o el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori.

18. El uso de un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, o una forma modificada del polipéptido que retiene la capacidad para inducir la inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, en la fabricación de un juego o conjunto de diagnóstico, para el diagnóstico de la infección provocada por el Helicobacter pylori.

19. El uso de un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, o una forma modificada del polipéptido la cual retiene la capacidad de inducir la inmunidad protectora contra la infección provocada por el Helicobacter pylori, en la fabricación de una vacuna para su uso en la producción de una respuesta inmune protectora contra el Helicobacter pylori.

20. Un método de diagnóstico in vitro de una infección provocada por el Helicobacter pylori, caracterizado porque comprende al menos un paso en donde un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, etiquetada opcionalmente o unida a un soporte sólido, es utilizado.

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) poner en contacto dicho polipéptido, unido opcionalmente a un soporte sólido, con un fluido corporal tomado de un mamífero; y (b) detectar los anticuerpos del fluido corporal que se unen al polipéptido.

22. Un juego o conjunto de diagnóstico para la detección de la infección provocada por el Helicobacter pylori en un mamífero, incluyendo el ser humano, caracterizado porque comprende componentes los cuales hacen posible que el método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24 sea llevado a cabo.