MXPA99009121A - Proceso para procesar sacarosa a glucosa y fructosa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa a partir de sacarosa, un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y una polifructana a partir de sacarosa, un reactor para practicar el mismo, un proceso para preparar cantidades comerciales de fructosa y una poliglucana a partir de sacarosa y un reactor para practicar el mismo.

Description

PROCESO PARA PROCESAR SACAROSA A GLUCOSA Y FRUCTOSA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa a partir de sacarosa y un reactor para practicar el mismo. En particular, la presente invención se refiere a un proceso para preparar glucosa/o fructosa a partir de sacarosa poniendo en contacto sacarosa con una fructosiltransferasa y/o una glucosiltransferasa, seguido por el aislamiento de la glucosa y una polifructana, fructosa y una poliglucana, o ambos.

DESCRIPCIÓN DE LOS ANTECEDENTES La glucosa y fructosa son sacáridos que se encuentran a través de la naturaleza, ya sea como monosacáridos o y incorporados a polisacáridos. La glucosa es utilizada clínicamente como un fluido y un proveedor de nutriente, como una fuente de carbono en el cultivo de microorganismos y es ampliamente utilizada como un aditivo alimenticio. La fructosa también es clínicamente utilizada como un fluido y proveedor de nutriente y ampliamente como un aditivo alimenticio.

La glucosa ha sido preparada en forma comercial a partir de almidón (Dean, Gottfried, Advan. Carbohyd. Chem. 5,127 (1950) y a través de hidrólisis con ácido de sacarosa. La fructosa ha sido preparada a través de hidrólisis de insulina (Bates y otros, Natl. Bur. Std. (U. S.) Circ. C440, 39 (1942)), a partir de dextrosa (Cantor, Hobbs U. S. 2,354,664) y enzimáticamente a partir de sacarosa (Koepsell y otros, U. S. 2,729,587). A pesar de la disponibilidad de los materiales de partida para preparar glucosa y fructosa, el costo de estos materiales permanece alto, con relación al costo de los materiales de partida. Por consiguiente, se pueden mejorar las síntesis comerciales tanto de glucosa como de fructosa. Las inulinas son polisacáridos que pertenecen a algún grupo de polifructana y ocurren en muchas diferentes plantas incluyendo, por ejemplo, alcachofas de Jerusalén, tubérculos de dalia, y raíces de achicoria. Las inulinas están compuestas de cadenas de fructosa enlazadas a ß-2,1, enlazadas a un a-D-glucósido; tienen una estructura lineal y típicamente comprenden muchas unidades ß-O-fructofuranosa. La longitud de cadena promedio y la distribución de peso molecular dependerán tanto de la especie de la planta, la fase de crecimiento, como el método de preparación. La longitudes de cadena promedio de 10 a 25 son comunes, en cuyo caso las unidades individuales tienen aproximadamente de 9 a 24 unidades de fructosa.

Las propiedades de una inulina variarán dependiendo de la longitud de cadena. Se han utilizado composiciones que comprenden inulinas de cadena corta teniendo un grado de polimerización de aproximadamente 3 a 7 unidades de fructosa, como substituyentes de azúcar con un bajo contenido de calorías (DE 4,003,140). Las poliglucanas son polisacáridos de unidades de glucosa, típicamente conectados a través de enlaces a-1,3, a-1, 6, ß-1,2, ß-1,3, y ß-1,4. Una clase de poliglucanas compuestas de enlaces a-1,3 y a-1, 6 son producidos por naturaleza a través de muchas flores bacterianas florales, tales como S. Mutans, y se cree que ayudan en la colonización de la cavidad oral a través de estos organismos, que producen el estado de enfermedad de caries dental. La poliglucana basada completamente en enlaces ß-1,4 es producida por plantas, tales como celulosa. La poliglucana basada completamente en enlaces ß-1,3 producido por plantas, como calosa. Otra poliglucana con base en enlaces aleatorios, típicamente terminando con un sorbitol, es conocida como polidextrosa y se utiliza como un agente a granel alimenticio. Stoudt y otros. U. S. 4,340,673 reportan una glucana modificada preparada biosintéticamente a partir de una glucosíltransferasa, sacarosa y un endo-a-1 ,3-glucan-3-glucanohidrolasa para la modificación del desarrollo de placa dental. Gaffar y otros, U. S. 5,095,106 y U. S. 5,002,759 reportan un oligosacárido que tiene por lo menos una porción de fucosa o una porción de galactosa, dicho oligosacárido, el cual está libre de digalactosa y N-acetilneuraminil lactosa, para inhibir la adherencia de Streptococcus pyogenes a las células de la mucosa de la faringe y oral.

Taubman y otros U. S. 4,150,116 reportan que la colonización de Streptococcus mutan puede ser inhibida a través de la inmunización con una forma purificada de glucosiltransferasa. Eigen y otros, U. S. 4,619,825 reportan inhibición de placa a través del tratamiento con una dispersión de agua de emulsan. Hillman v otros, U. S. 4,133,875 reportan que una cepa efectora de Streptococcus mutans puede ser efectiva para controlar la incidencia y severidad de caries dental. En el área de producción de fructosa, Kerkhoffs y otros U. S. 4,277,563 reportan el aislamiento de fructosa a través de hidrólisis de una polifructana tal como inulina. Bichsel y otros. U. S. 4,263,052 reportan la producción de fructosa a través de hidrólisis de una f ructofuranosida tal como sacarosa y enriquecimiento en fructosa a través de la precipitación de un complejo de calcio-fructosa. Fan y otros U. S. 4,774,183 reportan que la fructosa puede ser aislada a partir de una mezcla de fructosa y glucosa poniendo en contacto con un microorganismo tal como Pullularia pullulans el cual preferencialmente utiliza glucosa. Brinqer y otros, U. S. 4,742,006 reportan la producción de fructosa a partir de mezclas de fructosa y glucosa poniendo en contacto con un mutante de descomposición de glucosa de Zymomonas mobilis. En el área de producción de glucosa Nagle y otros, U. S. 4,647,835 reportan la preparación de glucosa y otros sacáridos a partir de una a-celulosa utilizando un catalizador de cloruro de calcio y iones de hidrógeno. Miyawaki y otros, U. S. 5,524,075 reportan la producción de glucosa de alta pureza a través de la sacarinización de almidón licuado con una enzima. Venkatasubramanian y otros, U. S. 4,299,677 reportan la separación directa de fructosa y glucosa a partir de una mezcla de glucosa y fructosa a través de membranas de intercambio de ion. Harada y otros, U. S. 5,169,679 reportan el uso de polifrucanas compuestas principalmente de enlaces ß-2,1 teniendo un peso molecular de 2,000 a 20,000,000 como aditivo alimenticios tales como, por ejemplo, agentes suministradores de volumen o substitutos de grasa, para producir alimentos con un bajo contenido de calorías.

Kurz y otros, U. S. 5,478,732 reportan un método para obtener inulinas de cadena intermedia (por ejemplo, un grado de polimerización de 10-12) a través de tratamiento de suspensiones de inulina cruda con una enzima de hidrolasa. Durante el tratamiento enzimático, los componentes de cadena corta son degradados a mono y disacáridos, mientras que las inulinas de cadena larga son separadas, y después convertidas a una forma seca. Adachi y otros, reportan en U. S. 4,681,771 que cuando la sacarosa (G-F) se pone en contacto con una enzima teniendo una actividad de transferencia de fructosa (de aquí en adelante denominada como una fructosiltransferasa), se obtiene una composición edulcorante, baja cariogénica. con un bajo contenido calórico, la cual comprende glucosa, sacarosa, el trisacárido (GF2), el tetrasacárido (GF3), así como cantidades menores de fructosa, pentasacárido (GF ) y hexasacárido (GF5). La cantidad de inulinas superiores cae dramáticamente, la fracción mayoritaria siendo la inulina GF2-3. Kono y otros, U.S. 5,314,810 reportan que la vida media de una fructosiltransferasa inmovilizada utilizada en la reacción de sacarosa puede ser mejorada a través del soporte sobre un portador granular tal como un derivado de quitosán o una resina de intercambio de anión. Dicha enzima soportada se reporta para permitir la producción industrial de una composición edulcorante baja cariogénica. Heady U. S. 4,317,880 reporta la producción de polímeros de fructosa novedosos y jarabes con un alto contenido de fructosa a partir de sacarosa a través de la acción combinada de una enzima de fructosiltransferasa y una preparación de enzima de isomerasa de glucosa. Heady U. S. 4,335,207 reporta un proceso de dos pasos para la preparación de polímeros de fructosa y alcohol etílico a partir de sacarosa poniendo en contacto con una enzima de fructosiltransferasa seguido por fermentación con una preparación de levadura. Sin embargo, los métodos de la presente para preparar glucosa y fructosa han presentado una pobre eficiencia, de manera que la producción de cantidades comerciales de glucosa y fructosa puede ser mejorada.

Además, existe la necesidad de procesos para preparar cantidades comerciales de polisacáridos tales como inulinas y en particular GF4.5, y poliglucanas tales como substitutos de polidextrosa, celulosa, almidón y aquellos que pueden ser utilizados para el tratamiento de caries dental.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa a partir de sacarosa. Es otro objeto proporcionar un proceso para preparar cantidades comerciales de la glucosa y una polifructana a partir de sacarosa. Es otro objeto proporcionar un proceso para preparar cantidades comerciales de la fructosa y una poliglucana a partir de sacarosa. Estos y otros objetos pueden lograrse con un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa que comprende poner en contacto la sacarosa con una fructosiltransferasa y/o una glucosiltransferasa en un reactor y aislar las cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa del mismo. Los objetos anteriores también pueden lograrse con un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa, poniendo en contacto glucosa con una fructosiltransferasa en un reactor para producir un producto de reacción que comprende glucosa y una polifructana, seguido por el aislamiento de cantidades comerciales de glucosa. Los objetos anteriores también pueden ser logrados con un proceso para preparar cantidades comerciales de fructosa, poniendo en contacto sacarosa con glucosiltransferasa en un reactor para producir un producto de reacción que comprende fructosa y una poliglucana, seguido por ei aislamiento de cantidades comerciales de fructosa. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las glucosiltransferasas pueden ser utilizadas para preparar cantidades comerciales de glucosa a partir de sacarosa (GF) y que las glucosiltransferasas pueden ser utilizadas para preparar cantidades comerciales de fructosa a partir de sacarosa (GF). Además, las polifructanas producidas durante la formación de glucosa a través de la reacción de sacarosa y una fructosiltransferasa y poliglucanas producidas durante la formación de fructosa a través de la reacción de sacarosa con una glucosiltransferasa, pueden ser aislados en cantidades comerciales para mejorar adicionalmente el valor económico del proceso de la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Una apreciación más completa de la invención y muchas de las ventajas de la misma serán fácilmente obtenidas a medida que se entiendan mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada cuando se consideren junto con los dibujos anexos, en donde: La Figura 1 representa un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a glucosa y una polifructana; La Figura 1a representa un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a glucosa y una polifructana en un recipiente de reactor equipado con un separador externo para glucosa; La Figura 2 ilustra un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a glucosa y una polifructana en dos recipientes de reacción; La Figura 2a ¡lustra un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a glucosa y una polifructana en dos recipientes de reacción, cada uno equipado con separadores externos para glucosa; La Figura 3 es un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a fructosa y una poliglucana; La Figura 4 ¡lustra un diagrama de flujo en donde la sacarosa es convertida a fructosa y una poliglucana en dos recipientes de reacción; y La Figura 5 ilustra un diagrama esquemático de un proceso integrado para producir glucosa y fructosa a partir de sacarosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La glucosa es un artículo de materia prima de comercio y se vende para usos farmacéuticos y alimenticios. La fructosa es un artículo de materia prima de comercio y se vende para usos farmacéuticos alimenticios; GF4.5 tiene utilidad como un agente proporcionador de volumen para composiciones alimenticias. Cuando se utiliza en combinación con un edulcorante, se puede obtener una composición edulcorante teniendo un volumen y textura de tipo de azúcar. GF4.5 tiene poca o nada de dulzura. Las poliglucanas compuestas de enlaces a-1,3 y a-1, 6 pueden ser útiles para el tratamiento y prevención de caries dentales. Una poliglucana ß-1,4 sintética es una fuente de celulosa de alta pureza, la cual puede ser utilizada para fabricar papel de alta calidad. Una poliglucana sintética compuesta de 5 a 11 unidades de glucosa, compuesta de más de un tipo de enlace glicosídico e incluyendo enlaces de ramificación, puede ser utilizada como un agente proporcionador de volumen para alimentos como un substituto de polidextrosa. Por consiguiente, los métodos y aparatos para la preparación de glucosa, fructosa, polifructanas y poliglucanas tienen utilidad. Como se utiliza en la presente, el término "fructosiltransferasa" se refiere a cualquier a cualquier enzima o enzimas capaces de transferir porciones de fructosa a sacarosa o a otro sacárido (por ejemplo, una polifructana). Un resultado de transferir la porción de fructosa de sacarosa es la producción de una unidad de glucosa. En una modalidad preferida, la fructosiltransferasa transfiere la porción de fructosa de sacarosa y forma enlaces ß-2,1, con el fin de producir inulinas tales como GF .5 a partir de sacarosa. Ejemplos no limitantes de fructosiltransferasas adecuadas se pueden obtener a partir de microorganismos del género Aspergilus tales como A. oryzae ATCC 20498; sp. ATCC 20524; A. sydowi y A. niger ATCC 20611 del género penicilina tales como P. Jancezewskii ATCC 10115 y 26546; P. nigricans, del género Fusarium tales como F. lini lAM 5011; y del género Aureobasidium tales como A. pullulans ACTT 9348; Streptococcus mutans ATCC 25175 y A. pullulans var, melanigenum A-8 ATCC 20612. También se pueden obtener enzimas adecuadas a partir de levaduras y otros microorganismos tales como el género Saccharomyuces, tal como S. cerevisiae, el género Rhodotorula tal como R. lutinis, el género Pichia tal como P. miso, el género Hansenula tal como H. miso, el género Cándida tal como C. tropicalis, y de plantas superiores tales como espárrago, tubérculos de dalia, raíces de achicoria, y alcachofas de Jerusalén, como se describe en JP-A-56-154967 y JP-B-59-53834. Otra fructosiltransferasa (también conocida como una sintasa de levano) teniendo un enlace ß-2,6 formando actividad, también puede ser utilizada. Una combinación de fructosiltransferasa teniendo una actividad formadora del enlace tanto ß-2,1 como ß-2,6, puede ser utilizada conjuntamente, para formar ya sea una polifructana teniendo una distribución homogénea de enlaces ß-2,1 y ß-2,6 o bloques comprendiendo enlaces ß-2,1 y bloques comprendiendo enlaces ß-2,6. Una enzima particularmente preferida es una fructosiltransferasa bacteriana, la cual puede ser obtenida a partir de un gen aislado de Streptococcus mutans. En particular, S. mutans ATCC 25175 puede ser una fuente de un gen de fructosiltransferasa. La fructosiltransferasa puede ser obtenida como una construcción de fusión con una secuencia de proteína heteróloga. Una proteína de fusión adecuada es, por ejemplo, la fructosiltransferasa aislada de Streptococcus mutans fusionada a la C-terminal de S-transferasa de glutationa. La secuencia de codificación de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans, carente de la secuencia de señal pronosticada, puede ser aislada a partir de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 a través de PCR, que puede ser utilizada para formar un transformante que expresa una proteína de fusión de fructosiltransferasa. Otra secuencia de gen de fructosiltransferasa adecuada de Streptococcus mutans cepa GS-5 es reportada por Shiroza, T. y Kuramitsu, J. Bacteriol., 170, 810-816 (1988). La fructosiltransferasa puede ser inmovilizada en un portador teniendo una amina primaria a cuaternaria como se describe en la patente de E. U. A. 5,314,810. En una modalidad preferida, la fructosiltransferasa está por lo menos parcialmente purificada. Como se utiliza en la presente, el término "purificado" significa que la enzima ha sido purificada, por lo menos parcialmente a partir del organismo huésped a partir del cual se produjo en forma natural. La purificación preferiblemente da como resultado la remoción por lo menos parcial de enzimas de degradación tales como inulasas, las cuales podrían degradar la polifructana, y proteasas las cuales pueden degradar la enzima de fructosiltransferasa. De preferencia, la enzima es purificada a un grado de manera que existe la ausencia de enzimas de degradación. Cuando la fuente de la enzima es un microorganismo de E. coli transfectado, se puede utilizar un lisato de célula cruda, cuando el E. co// transfectado no tiene enzimas de degradación. En una modalidad preferida, la fructosiltransferasa purificada tiene una relación de actividad sintética a degradación de >_ 1,000 a 1, de preferencia de >_ 1,500 a 1 y aún preferiblemente de >_ 2,000 a 1 (por ejemplo, para cada escisión de un enlace de polifructana existe de preferencia por lo menos 1,000 enlaces de fructosa formados). Cuando una unidad es igual a µmol de monosacárido transferido a un aceptor por minuto, un sobrenadante de crecimiento de A. niger crudo contiene aproximadamente 90 unidades/mg de proteína, y una preparación de A. niger purificado con DEAE tiene aproximadamente 2,000 unidades/mg de proteína. 250 mililitros de la preparación purificada con DEAE tiene una actividad suficiente para convertir completamente un litro de sacarosa al 50% a glucosa y una polifructana en aproximadamente 2.5 días a 50°C. Alternativamente, la misma preparación de enzima puede operar continuamente y sin ninguna caída en eficiencia, pero durante por lo menos 2 semanas a 50°C, mientras que la sacarosa es continuamente agregada.

La fructosiltransferasa puede ser purificada a una actividad de 90 a 3,000 U/mg, de preferencia de 100 a 2,000 U/mg. En una modalidad preferida, la fructosiltransferasa tendrá una actividad de >_ 100 U/mg, de preferencia >. 150 U/mg, y muy preferiblemente de > 200 U/mg. Como se utiliza en la presente, el término "glucosiltransferasa" se refiere a cualquier enzima o enzimas capaces de transferir porciones de glucosa a glucosa o a otro sacárido (por ejemplo, una poliglucana). La glucosiltransferasa puede comprender una pluralidad de enzimas capaces de transferir porciones de glucosa, proporcionando una poliglucana teniendo más de un tipo de enlace. En una modalidad, la glucosiltransferasa transfiere la porción de glucosa de sacarosa para formar una poliglucana. Un resultado de transferir la porción de glucosa de sacarosa es la producción de una unidad "de fructosa. En una modalidad preferida, la glucosiltransferasa forma enlaces a-1, 4 y/o a-1, 6, con el fin de producir poiiglucanas que pueden ser utilizadas para tratar caries dental. En otra modalidad preferida, la glucosiltransferasa forma una pluralidad de enlaces lineales y ramificados, con el fin de producir un substituto de polidextrosa. En otra modalidad preferida, la glucosiltransferasa forma enlaces ß-1,4, con el fin de producir celulosa. En otra modalidad preferida, la glucosiltransferasa forma enlaces ß-1,3, con el fin de producir calor. En otra modalidad preferida, la glucosiltransferasa forma enlaces a-1, 4 o a-1, 6, con el fin de producir almidones. En otra modalidad preferida, una mezcla de glucosiltransferasa forma enlaces tanto a-1, 4 como a-1, 6, con el fin de producir almidones. Se pueden obtener glucosiltransferasas adecuadas a través de cualquier medio convencional conocido por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las glucosiltransferasas se describen por J.F.

Robvt en Adv Carbohydr. Chem. Biochem. 1995, 51:133-168. La clonación de una sintasa de celulosa de planta se describe por J. R.

Pear y otros. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, (22), 12637- 12642. El aislamiento de una sintasa de calosa de planta se describe por Kamat y otros, Arch Biochem. Biophys, 298(2):731 -739 y por Kudlicka y Brown Plant Physiol (1997) 115(2):643-656. La clonación de sintetasa de Streptococcus mutans es reportada por Ueda y otros.

Gene (1988)69, (1) 101-109, por Shiroza y otros, J. Bacteriol. (1987) (9), 4263-4270 y por Honda y otros, J. Gen. Microbiol. (1990) 136, 2099-2105. La clonación de un glicogen bacteriano (amilasa) se describe por Buttcher y otros, J. Bacteriol. (1997) 179 (10) 33244- 3330. Ejemplos no limitantes de glucosiltransferasas adecuadas también pueden ser obtenidos a partir de Streptococcus mutans como se describe en la patente de E. U. A. 4,438,200 y Pullularia pullulans como se describe en la patente de E. U. A. 4,774,183. La glucosiltransferasa puede ser inmovilizada sobre un portador teniendo una amina de primaria a cuaternaria en una forma análoga a aquella descrita en la patente de E. U. A. 5,314,810. En una modalidad preferida, la glucosiltransferasa es por lo menos parcialmente purificada. Como se utiliza en la presente, el término "purificada" significa que la enzima ha sido purificada, por lo menos parcialmente a partir del organismo huésped a partir del cual se produjo en forma natural. La purificación preferiblemente da como resultado la remoción por lo menos parcial de enzimas de degradación tales como amilasas, las cuales podrían degradar la poliglucana, y proteasas las cuales pueden degradar ia enzima de glucosiltransferasa. Preferiblemente, la enzima es purificada a un grado de manera que existe la ausencia de enzimas de degradación. Cuando la fuente de la enzima es un microorganismo E. coli transfectado, se puede utilizar un lisato de célula cruda, cuando el E. coli transfectado no tiene enzimas de degradación nativas. En una modalidad preferida, la glucosiltransferasa purificada tiene una relación de actividad sintética a degradación de > 1,000 a 1, de preferencia > 1,500 a 1 y muy preferiblemente de = 2,000 a 1 (por ejemplo, para cada escisión de un enlace de poliglucana, existen preferiblemente al menos 1,000 enlaces de glucosa formados). La- glucosiltransferasa puede ser purificada a una actividad de 90 a 3,000 U/mg, de preferencia de 100 a 2,000 U/mg. En una modalidad preferida, la glucosiltransferasa tendrá una actividad de >100 U/mg, de preferencia > 150 U/mg, y muy preferiblemente de > 200 U/mg. El material de partida del proceso de la presente será sacarosa o una composición que contenga sacarosa. La sacarosa se refiere al disacárido en forma refinada o en bruto, como una solución, o seca a partir de cualquier fuente de material en bruto de sacarosa, por ejemplo, caña de azúcar, o remolachas. Preferiblemente, la cantidad de sacarosa contenida en el material en bruto de sacarosa es de > 10% en peso, muy preferiblemente de > 20% en peso y de preferencia de > 50% en peso, muy preferiblemente de > 70% en peso. El material alimenticio puede contener otros materiales siempre que no interfieran significativamente con la conversión de sacarosa a glucosa y/o fructosa. La sacarosa puede ser introducida en cualquiera de las formas como se describió anteriormente. Con el fin de mantener la resistencia iónica total y la concentración del medio de reacción, sin embargo, la sacarosa es contigua o intermitentemente introducida en forma seca o en solución. La velocidad y secuencia de adición de sacarosa a la mezcla de reacción serán tales que mantengan un alto grado de producción de polisacárido y en parte dependerán de la naturaleza y actividad específica de la enzima de transferasa, la temperatura de reacción y se realiza o no la remoción de glucosa y polifructana. La determinación de la velocidad y frecuencia óptimas de la adición de sacarosa puede lograrse a través de experimentación de rutina y está dentro del nivel de la experiencia de aquellos expertos en la técnica. El proceso de la presente invención preferiblemente es conducido en solución acuosa. La concentración de sacarosa en el medio de reacción no está particularmente limitada y puede ser de 50 mm hasta saturación. En términos de porcentaje en peso, la cantidad de sacarosa en la solución de reacción puede ser de 1 a 80% en peso, con base en el peso total de la mezcla de reacción, típicamente de 40 a 80% p/p, y de preferencia de 50 a 70% p/p y muy preferiblemente alrededor de 60% p/p. Con el fin de obtener una eficiente conversión de sacarosa al monosacárido deseado, es preferible conducir la reacción en por lo menos dos etapas, iniciando la reacción de la transferasa con sacarosa utilizando aproximadamente 50% en peso de sacarosa. Por ejemplo, cuando una fructosiltranferasa se utiliza para formar glucosa, la reacción inicial de sacarosa con la fructosiltransferasa producirá una mezcla de reacción comprendiendo principalmente glucosa, y polifructanas inferiores tales como GF2 y GF3. En esta etapa, la glucosa de preferencia es removida a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica. La mezcla de reacción comprendiendo principalmente polifructanas y opcionaimente glucosa después se pone en contacto con fructosiltransferasa y sacarosa adicional. Durante la segunda adición de sacarosa, la mayoría de las moléculas de sacarosa que están reaccionan con polifructanas con el fin de producir glucosa y polifructana superior, opuesto a las moléculas de sacarosa que actúan como un receptor para una transferasa de fructosa. En la producción de FG2. un mol de glucosa se forma a partir de dos moles de sacarosa, mientras que en la formación de polifructanas superiores, la glucosa es producida más eficientemente, como se ilustra a continuación: G-F + G-F ? G-F-F + G G-F + G-F + G-F ? G-F-F-F + 2 G G-F + G-F + G-F + G-F - G-F-F-F-F + 3 G G-F + G-F + G-F + G-F + G-F ? G-F-F-F-F-F + 4 G Cuando GF2 es producido a partir de dos moles de sacarosa, solamente se recuperan alrededor de 25% en peso de sacarosa como glucosa. Cuando GF3 es producido a partir de tres moles de sacarosa, aproximadamente 33% en peso de sacarosa es recuperado como glucosa. Para GF4 la recuperación como glucosa es de aproximadamente 37% en peso, para GF5 de aproximadamente 40% en peso y para GF6 aproximadamente 41.6% en peso. Por consiguiente, practicando una reacción de dos etapas, se puede obtener un alto rendimiento de glucosa (>25% en peso basado en la sacarosa en reacción), proveyendo la síntesis comercial de glucosa.

Las polifructanas GF2 y GF3 están compuestos de tres y cuatro unidades de monosacárido, respectivamente, y por consiguiente, genéricamente pueden ser denominados como DP3 y DP4, indicando el número de unidades de monosacárido, independiente de su identidad. También se pueden identificar polifructanas superiores a través del número de unidades de monosacárido, por ejemplo DP5, DP6 y DP7 correspondiendo a GF4, GF5 y GF6, respectivamente.

Asimismo, las poliglucanas pueden ser identificadas a través del número de unidades de monosacárido contenidas en los mismos, tales como DP3, DP4, DP6 para poliglucanas conteniendo 3, 4, 5 y 6 unidades de monosacárido, respectivamente. En una forma análoga, la síntesis de fructosa a partir de sacarosa bajo la acción de una glucosiltransferasa puede ser efectuada por lo menos en dos etapas. La reacción de sacarosa con fructosiltransferasa o glucosiltransferasa puede ser conducida sobre una amplia variedad de temperaturas. La temperatura de reacción puede ser de temperatura ambiente, es decir de 18 a 25°C, hasta temperaturas justo por debajo de la temperatura en donde ocurre una rápida inactivación de la fructosiltransferasa o glucosiltranferasa. Una escala de temperatura preferida es de 25 a 60°C. De preferencia, la reacción es conducida a una temperatura de 35 a 55°C. Muy preferiblemente, la temperatura es de 30 a 50°C. Las soluciones de reacción acuosas pueden estar no reguladas en su pH o reguladas en su pH al pH apropiado utilizando componentes reguladores de pH bien conocidos, tales como citrato, fosfato, y reguladores de pH TRIS. El uso de un regulador de pH es preferido cuando la reacción es conducida durante un periodo extendido, tal como dos semanas. La reacción de sacarosa con fructosiltransferasa o glucosiltransferasa es conducida durante un tiempo suficiente para producir cantidades comerciales de glucosa y/o fructosa. El tiempo de reacción puede ser de dos a 48 días, dependiendo del tamaño del lote. Cuando se conduce en una forma continua, un volumen de 10 ml puede reaccionar a una velocidad de 2.5 g/hora, sin ninguna pérdida significativa de la actividad, durante un período de 2 a 4 semanas. El pH de la reacción de sacarosa con fructosiltransferasa o glucosiltransferasa no está particularmente limitado y el pH óptimo de la reacción puede variar dependiendo de la enzima específica utilizada. Típicamente, el pH será de 4.0 a 8.0, de preferencia de 5.0 a 7.5, y muy preferiblemente alrededor de 6.0. El proceso de la presente puede ser conducido ya sea en una modo intermitente o continuo. La reacción continua puede ser conducida haciendo circular una mezcla de reacción a través de un aparato de ultrafiltración, por lo que los productos son continuamente removidos a medida que penetran de los ultrafiltros, una enzima de transferasa siendo retenida en el retentato de los ultrafiltros. El substrato fresco y la enzima fresca pueden ser agregados, según sea necesario, para reemplazar aquellos que quedan inactivados, además de la mezcla de reacción que está por lo menos a la misma velocidad en donde los productos de penetración son removidos de los ultrafiltros. La reacción puede ser conducida en un reactor o una serie de reactores, los cuales también pueden estar equipados con reactivos de entrada y salidas para productos adecuados. Las salidas pueden ser selectivas para la remoción de un producto específico. La selectividad puede ser obtenida proporcionando separadores adecuados que permiten la remoción del producto y el regreso de otros productos al reactor. Un separador puede estar en la forma de una membrana o una columna de cromatografía. En algunos casos, un separador puede comprender una pluralidad de membranas y/o columnas de cromatografía proporcionando la remoción selectiva del producto deseado. Después de la reacción para producir glucosa y/o fructosa, la fructosiltransferasa y/o glucosiltransferasa puede ser inactivada calentando una mezcla de reacción a aproximadamente 100°C durante 10 a 15 minutos. Si se desea, la enzima puede ser removida de la mezcla de reacción ya sea antes o después de la inactivación con calor a través de ultrafiltración mediante un filtro de tamaño adecuado. Para los propósitos de ilustración, se proporcionan detalles específicos para la preparación de glucosa a partir de sacarosa utilizando una fructosiltransferasa. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que en una forma análoga, se puede preparar fructosa a partir de glucosa mediante la acción de una glucosiltransferasa. La sacarosa y una fructosiltransferasa se hacen reaccionar en una reactor. El reactor puede comprender una entrada para sacarosa y una salida para glucosa. A medida que el grado de polimerización se incrementa, la concentración de glucosa también se incrementará, de manera que es posible que la velocidad de reacción de formación de glucosa se reducirá. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la glucosa es removida del medio de reacción durante la reacción. La glucosa puede ser removida a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica tales como a través de filtración por membrana o cromatografía. Dentro del contexto de la presente invención, la cromatografía incluye técnicas de intercambio de ion y de exclusión de gel, conocida por aquellos expertos en el campo. Se puede utilizar una bomba para incrementar la presión contra la membrana o columna de cromatografía. En una modalidad preferida, la salida para glucosa comprende una membrana que permite el flujo de glucosa a partir del medio de reacción, sin permitir que la sacarosa, polifructana o fructosiltransferasa pase. La glucosa puede ser removida continuamente, en forma intermitente o semi-intermítente, sin embargo, en una modalidad preferida, la glucosa es removida continuamente del medio de reacción. La glucosa puede ser aislada y purificada a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica tales como a través de filtración, que también puede ser seguido por cristalización . En una modalidad preferida, la polifructana también es removido a partir de la mezcla de reacción, muy preferiblemente, la polifructana es removida continuamente de la mezcla de reacción. Una polifructana puede ser removida a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como mediante filtración de membrana o cromatografía, tal como intercambio de ion o exclusión en gel. En una modalidad preferida, una salida para polifructana comprende una membrana que permite el flujo de polifructana a partir del medio de reacción, sin permitir que la sacarosa, glucosa o fructosiltransferasa pase. Alternativamente, la polifructana puede ser separada de la mezcla de reacción, regresando sacarosa y glucosa a la mezcla de reacción. En una modalidad preferida, la cantidad de polifructana producida, con base en el peso de partida de sacarosa es de > 10% en peso, de preferencia de > 20% en peso, preferiblemente de > 30% en peso, de preferencia de >40% en peso, y muy preferiblemente de = 50% en peso. En una modalidad preferida, el rendimiento de glucosa producida, con base en el peso en reacción de la sacarosa, es de 25 a 50% en peso, de preferencia > 25% en peso, preferiblemente > 33% en peso, muy preferiblemente >37% en peso, y aún muy preferiblemente >- 40% en peso, y de preferencia alrededor de 50% en peso. Dentro del contexto de la presente invención, las cantidades comerciales son definidas como una velocidad de producción de glucosa de 103 a 105 kg/día y preferiblemente será una cantidad de > 1,000 kg/día, de preferencia > 2,000 kg/día, y muy preferiblemente > 5,000 kg/día. Además, la velocidad de producción de cantidades comerciales es relativa a la cantidad de material de partida de sacarosa. Por lo tanto, las velocidades anteriormente identificadas de producción se basan en un procesamiento unitario de 6,000 kg de sacarosas. Por consiguiente, el término "cantidades comerciales" no se refiere a una cantidad absoluta, sino que más bien se refiere a una velocidad de producción comercialmente aceptable.

Ahora haciendo referencia a la Figura 1, en donde 1 ilustra un reactor, 2 ilustra una entrada para sacarosa, 3 ilustra una salida para glucosa, 4 ilustra una salida para una polifructana y 5 iiustra un separador que es permeable a glucosa pero no permeable a, sacarosa, una fructosiltransferasa o una polifructana. La sacarosa es introducida al reactor a través de la entrada 2 hacia una porción del reactor 1, que contiene una fructosiltransferasa. En dicha configuración, se crea una división de manera que las polifructanas son concentrados sobre un lado del separador. El reactor está equipado con una salida de glucosa 3, ubicada sobre el lado de glucosa del separador 5. La salida para polifructana 4, puede estar equipada con un separador (no mostrado), el cual permite el paso de polifructana, pero no permite el paso de sacarosa, glucosa o fructosiltransferasa. Ahora haciendo referencia a la Figura 1a, en donde 1 ilustra un reactor, 1a ilustra una porción de reactor separador, 2 iiustra una entrada para sacarosa, 3 ilustra una salida para glucosa, 4 ilustra una salida para una polifructana y 5 ilustra un separador para glucosa. La sacarosa es introducida al reactor a través de la entrada 2 hacia una porción de reactor 1a del reactor 1, el cual contiene una fructosiltransferasa. En dicha configuración, ia glucosa es separada del medio de reacción a través del separador 5, antes de ser removida a través de la salida de glucosa 3. Durante la separación de glucosa, los materiales restantes pueden ser recirculados hacia la porción de reactor 1a. La salida para polifructana 4, puede estar equipada con un separador (no mostrado), el cual permite el paso de polifructana, pero no permite el paso de sacarosa, glucosa o fructosiltransferasa. En otra modalidad, un reactor comprendiendo una entrada para sacarosa está equipado con un separador externo, el cual separa tanto la glucosa como una polifructana de las sacarosas. La sacarosa sin reaccionar, si hay alguna, puede ser regresada al reactor. Ahora haciendo referencia a la Figura 2, en donde 1 representa un primer reactor, 2 y 11 representan entradas para sacarosa, 3 y 8 representan salidas para glucosa, 4 representa una salida para un GF2-3 o polifructana superior, 5 y 10 representan separadores que son permeables a glucosa pero no permeables a sacarosa, una fructosiltransferasa o una polifructana, 6 representa un segundo reactor, 7 representa una entrada para GF2.3, polifructana y 9 representa una salida para un GF4.5 o polifructana superior. Se utilizan dos reactores, cada uno dividido con separadores 5 y 10, los cuales son permeables a glucosa pero impermeables a sacarosa, una fructosiltransferasa o a polifrucanas de GF2 y superiores. En el primer reactor 1, la concentración de sacarosa es tal que proporciona la síntesis de GF2, el producto después es transferido al segundo reactor 6 a través de la entrada para un GF2.3 o polifructana superior. En el segundo reactor 6, una fructosiltransferasa está contenida en una porción de un segundo reactor 6 y un GF2.3 o polifructana superior se hace reaccionar con sacarosa, en donde la concentración de sacarosa es menor que en el primer reactor 1. La concentración de sacarosa es mantenida a un nivel deseado a través de la introducción de sacarosa vía la entrada 11. La baja concentración de sacarosa favorece la síntesis de polifructanas superiores y por consiguiente, la síntesis efectiva de glucosa. Se permite que la glucosa pase a través del separador 10 y sea removida a través de la salida de glucosa 8. Durante la separación de glucosa, los materiales restantes pueden ser recirculados hacia la porción de reactor 6. La polifructana superior puede ser removido a través de la salida de polifructana 9. La salida para polifructana 9, puede estar equipada con un separador (no mostrado), el cual permite el paso de polifructana, pero no permite el paso de sacarosa, glucosa o fructosiltransferasa. Ahora se hace referencia a la Figura 2a, en donde 1 representa un primer reactor y 1a representa una porción de reactor separada, 2 y 11 representan entradas para sacarosa, 3 y 8 representan salidas para glucosa, 4 representa una salida para un GF2.3 o polifructana superior, 5 y 10 representan separadores externos los cuales son permeables a glucosa pero no permeables a sacarosa, una fructosiltransferasa o una polifructana, 6 representa un segundo reactor y 6a representa una porción de reactor separada, 7 representa una entrada para GF2.3, polifructana y 9 representa una salida para un GF4.5 o polifructana superior. Se utilizan dos reactores, equipados con separadores externos 5 y 10, los cuales son permeables a glucosa pero impermeables a sacarosa, una fructosiltransferasa o a polifrucanas de GF2 y superiores. En la primera porción de reactor 1a, la concentración de sacarosa es tal que proporciona la síntesis de GF2, el producto después es transferido a la segunda porción de reactor separada 6a a través de la entrada para un GF2-3 o polifructana superior 7. En ei segundo reactor 6, una fructosiltransferasa está contenida en la porción de reactor separada 6a y un GF2.3 o polifructana superior se hace reaccionar con sacarosa, en donde la concentración de sacarosa es menor que en el primer reactor 1. La concentración de sacarosa es mantenida a un nivel deseado a través de la introducción de sacarosa mediante la entrada 11. La baja concentración de sacarosa favorece la síntesis de polifructanas superiores y por consiguiente, la síntesis efectiva de glucosa. Se permite que la glucosa pase a través del separador 10 y sea removida a través de la salida de glucosa 8. La polifructana superior puede ser removido a través de la salida de polifructana 9. La salida para polifructana 9, puede estar equipada con un separador (no mostrado), el cual permite el paso de polifructana, pero no permite el paso de sacarosa, glucosa o fructosiltransferasa. Ambos separadores 5 y 10 están representados con una línea de recirculación para regresar los materiales diferentes a glucosa, tales como sacarosa y polifructana, si es necesario. El proceso de la presente invención preferiblemente es conducido en un reactor adecuado para hacer cantidades comerciales de GF4.5. Preferiblemente, el reactor comprende una o más entradas para introducir sacarosa y/o la fructosiltransferasa y medios para aislar cantidades comerciales de GF4.5 del reactor. El reactor puede comprender recipientes múltiples, como se ilustra en las Figuras 2 y 2a, funcionando como un sistema de reactor. Ahora se describirán los detalles de un proceso para preparar fructosa a partir de sacarosa. En reactor, se hacen reaccionar sacarosa y un glucosiltransferasa. El reactor puede comprender una entrada para sacarosa y una saiida para fructosa. A medida que el grado de polimerización se incrementa, la concentración de fructosa también se incrementará de manera que es posible que la velocidad de reacción de formación de fructosa se reducirá. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la fructosa es removida del medio de reacción durante la reacción. La fructosa puede ser removida a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica tales como a través de filtración de membrana o cromatografía tal como técnicas de intercambio de ion y de exclusión de gel. Se puede incluir una bomba en el sistema para incrementar la presión de fluido contra el separador. En una modalidad preferida, la salida para fructosa comprende una membrana que permite el flujo de fructosa desde el medio de reacción, sin permitir que la sacarosa, poliglucana o glucosiltransferasa pasen. La fructosa puede ser removida continuamente, en forma intermitente o semi-intermitente. Sin embargo, en una modalidad preferida, la fructosa es removida continuamente del medio de reacción.

La fructosa puede ser aislada y purificada a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como a través de filtración, cromatografía o cristalización. En una modalidad preferida, la poliglucana también es removida de la mezcla de reacción. En una modalidad aún muy preferida, la poliglucana, la polifructana es removida continuamente de la mezcla de reacción. Una poliglucana puede ser removida a través de métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como mediante filtración de membrana o cromatografía, tal como intercambio de ion o exclusión en gel. En una modalidad preferida, una salida para poliglucana comprende una membrana que permite el flujo de poiiglucana a partir del medio de reacción, sin permitir que la sacarosa, fructosa o glucosiltransferasa pase. En una modalidad preferida, la cantidad de poliglucana producida, con base en el peso de partida de sacarosa es de > 10% en peso, de preferencia de > 20% en peso, preferiblemente de > 30% en peso, de preferencia de >40% en peso, y muy preferiblemente de > 50% en peso. En una modalidad preferida, el rendimiento de fructosa producida, con base en el peso en reacción de la sacarosa, es de 25 a 50% en peso, de preferencia > 25% en peso, preferiblemente > 33% en peso, muy preferiblemente >37% en peso, y aún muy preferiblemente > 40% en peso, y de preferencia alrededor de 50% en peso.

Dentro del contexto de la presente invención, las cantidades comerciales son definidas como una velocidad de producción de glucosa de 103 a 105 kg/día y preferiblemente será una cantidad de = 1,000 kg/día, de preferencia > 2,000 kg/día, y muy preferiblemente = 5,000 kg/día. Además, la velocidad de producción de cantidades comerciales es relativa a la cantidad de material de partida de sacarosa. Por lo tanto, las velocidades anteriormente identificadas de producción se basan en un procesamiento unitario de 6,000 kg de sacarosas. Por consiguiente, el término "cantidades comerciales" no se refiere a una cantidad absoluta, sino que más bien se refiere a una velocidad de producción comercialmente aceptable. Ahora se hace referencia a la Figura 3, en donde 12 representa un reactor, 13 representa una entrada para sacarosa, 14 representa una salida para fructosa, 15 representa una salida para una poliglucana y 16 representa un separador que es permeable a fructosa pero no permeable a sacarosa, una glucosiltransferasa o una poliglucana. La sacarosa es introducida al reactor a través de la entrada 13 hacia una porción del reactor 12, que contiene una glucosiltransferasa. En dicha configuración, se crea una división de manera que las poliglucanas quedan concentradas sobre un lado del separador. El reactor está equipado con una salida de fructosa 14, ubicada sobre el lado de fructosa del separador 16. La salida de la poliglucana 15, puede ser equipada con un separador (no mostrado), el cual permite el paso de poliglucana, pero no permite el paso de sacarosa, fructosa o glucosiltransferasa.

Ahora se hace referencia a la Figura 4, en donde 12 representa un primer reactor, 13 y 22 representan entradas para sacarosa, 14 y 19 representan salidas para fructosa, 15 representa una salida para un DP3.4 o poliglucana superior, 16 y 21 representan separadores, los cuales son permeables a fructosa pero no permeables a sacarosa, una glucosiltransferasa o una poliglucana, 17 representa un segundo reactor, 18 representa una entrada para un DP3.4, o poliglucana superior y 20 representa una salida para un GF5.6 o poliglucana superior. Se utilizan dos reactores, cada uno dividido con separadores 16 y 21, los cuales son permeables a fructosa pero impermeables a sacarosa, una glucosiltransferasa o una poliglucana de DP3 y superior. En el primer reactor 12, la concentración de sacarosa es tal que proporciona la síntesis de DP3, el producto después es transferido al segundo reactor 6 a través de la entrada para un DP3-4, poliglucana 18. En el segundo reactor 17, una glucosiltransferasa está contenida en una porción del segundo reactor 17 y un DP3.4 o poliglucana superior se hace reaccionar con sacarosa, en donde la concentración de sacarosa es menor que en el prímer reactor 12. La concentración de sacarosa es mantenida a un nivel deseado a través de la introducción de sacarosa mediante la entrada 22. La baja concentración de sacarosa favorece la síntesis de poliglucanas superiores y por consiguiente, la síntesis efectiva de fructosa. Se permite que la fructosa pase a través del separador 21 y es removida a través de la salida de fructosa 19. La poliglucana superior puede ser removida a través de la salida de poliglucana 20.

También está dentro del alcance de la presente invención conducir modificaciones adicionales de polifructana o poliglucana enzimáticamente producido, ya sea a través de modificación química convencional o modificación enzimática adicional. Ejemplos no limitantes de modificación química pueden incluir alquilación, esterificación, deshidratación, ciclización e hidrólisis parcial. Ejemplos no limitantes de modificación enzimática pueden incluir glicosilación. El proceso de la presente también proporciona un proceso integrado para producir tanto glucosa como fructosa a partir de sacarosa a través de la acción tanto de una fructosiltransferasa como de una glucosiltransferasa. En dicho proceso, se proporciona una corriente de alimentación de sacarosa para separar los reactores conteniendo una fructosiltransferasa y una glucosiltransferasa. Los reactores individuales en forma separada proporcionan la producción de glucosa y fructosa, respectivamente. En la Figura 5 se proporciona un diagrama de flujo de dicho proceso. Los reactores conteniendo ia fructosiitransferasa y glucosiltransferasa pueden ser como se describió anteriormente o como se ilustra en las Figuras 1, 1a, 2, 2a, 3 y 4. El proceso y aparato de ia presente también proporciona una tremenda flexibilidad, en la producción de glucosa y un polifructana y/o fructosa y una poliglucana, a partir de sacarosa, la identidad y cantidades relativas de monosacárido a polisacárido siendo libremente ajustables dependiendo de la enzima específica que se utiliza y las condiciones de reacción seleccionadas. Por ejemplo, la relación relativa de glucosa a polifructana puede ser ajustada cambiando la concentración de sacarosa, el tiempo de reacción o el número de unidades de enzima. Al incrementar la concentración de sacarosa se favorece la producción de polifructanas de bajo peso molecular, reduciendo la concentración de sacarosa, incrementando el tiempo de reacción e incrementando el número de unidades de enzima que favorece la producción de polifructanas de peso molecular más alto y glucosa. El oligosacárido específico también puede ser cambiado para satisfacer las demandas, simplemente cambiando la enzima que se está utilizando. Por consiguiente, el proceso de la presente puede ser rápidamente adaptado para satisfacer las demandas de cambio para monosacáridos y polisacáridos específicos, sin la necesidad de hacer grandes cambios al aparato. Se puede utilizar una poliglucana para tratar caries dental administrando a la cavidad oral. La políglucana soluble en agua preferiblemente tiene una estructura lineal o ramificada comprendiendo residuos de glucosa enlazados con ß-1,3, residuos de glucosa enlazados con ß-1,6, o una combinación de residuos de glucosa enlazados con ß-1,3 y ß-1,6. El peso molecular de la poliglucana preferiblemente será de 1,000 a 1,000,000 daltons. La poliglucana contra caries puede ser administrada a través de técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el campo para suministrar un agente a la cavidad oral. Por ejemplo, se puede administrar una composición comprendiendo la poliglucana en un enjuague bucal, pasta de dientes o polvo, un alimento, una bebida, una goma de mascar, un dulce, un trocisco, una tableta o en solución. Las cantidades adecuadas de poliglucana son suficientes para mantener una concentración oral de 1 a 1,000 mg/ml, de preferencia de 10 a 50 mg/ml. La poliglucana compuesta de enlaces a-1, 4 puede ser utilizada como una celulosa uitrapura sintética para aplicaciones médicas. Dicha poliglucana enlazada en a-1, 4 preferiblemente tendrá un peso molecular de 2,000 a 10,000 daltons. Una polifructana de GF4-5 puede ser utilizada como un agente proporcionador de volumen para alimentos y edulcorantes alimenticios. Una poliglucana que comprende múltiples enlaces que incluyen enlaces ramificados, comprendiendo de 5 a 11 unidades de glucosa puede ser utilizada como un substituto para polidextrosa. Dicha poliglucana no comprende una unidad de sorbitol bloqueada en su extremo. Habiendo descrito generalmente esta invención, se puede obtener un entendimiento adicional haciendo referencia a ciertos ejemplos específicos, los cuales se proporcionan en la presente con el propósito de ilustrar solamente, y no pretenden limitar a menos que se especifique otra cosa.

Procedimiento de Clonación y Expresión: La secuencia de codificación de la fructosiltransferasa de Streptococcus mutans, carente de la señal de secuencia pronosticada, puede ser aislada de la cepa Streptococcus mutans ATCC 25175 a través de PCR. Diseñaron y sintetizaron dos iniciadores. El primero 5'- TCTGCGGGATCCCAGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3', contuvo un sitio de restricción BamHl seguido por la secuencia idéntica a la secuencia inmediatamente siguiendo el extremo de la secuencia de señal pronosticada en la secuencia de codificación de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans. El segundo 5'-TCTGCGAAGCTTTTATTTAAAACCAATGCTTACACA-3', contuvo un sitio de restricción Hindlll seguido por la secuencia de complemento, inversa que corresponde al extremo C-terminal de la secuencia de codificación de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans. Ambos iniciadores fueron combinados con ADN genómico aislado de la cepa Streptococcus mutans ATCC 25175 y se utilizaron en la PCR. El fragmento de ADN resultante fue digerido con BamHl y Hindlll y ligado al plásmido digerido con BamHI-Hindl 11 , pGEX.KT-ext. Esta ligación dio como resultado la secuencia de codificación de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans descrita anteriormente, siendo colocada inmediatamente corriente abajo, en marco, con la secuencia de codificación de S-transferasa de glutationa (GST)- El plásmido de pGEX-KT-ext-Sfrepfococct/s muíans-fructosiltransferasa se transformó a células BL21 de E. coli. La expresión de proteína del transformante resultante dio como resultado la acumulación intracelular de una proteína de fusión de GST-ext Streptococcus mtvfans-fructosiltransferasa. Obviamente, son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se debe entender que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede ser practicada de otra manera como la descrita aquí específicamente.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1.- Un proceso para preparar glucosa a partir de sacarosa, que comprende: i) poner en contacto sacarosa con una fructosiltransferasa para producir glucosa; y ií) aislar la glucosa de la misma.

2.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha fructosiltransferasa se obtiene a partir de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii y plantas superiores.

3.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha fructosiltransferasa se obtiene a través de la expresión de un gen de fructosiltransferasa no nativo.

4.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glucosa es aislada continuamente o en forma semi-intermitente.

5.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el producto de reacción además comprende una polifructana y dicho proceso además comprende aislar dicha polifructana.

6.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde ia polifructana es continuamente aislada.

7.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glucosa es aislada a través de filtración de membrana o cromatografía.

8.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la polifructana es aislada a través de filtración de membrana o cromatografía.

9.- Un proceso para preparar cantidades comerciales de glucosa y una polifructana, que comprende: i) poner en contacto sacarosa con una fructosiltransferasa para producir un producto de reacción comprendiendo glucosa y una polifructana; y ¡i) aislar la glucosa de la polifructana.

10.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la polifructana es DP5.6.

11.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la glucosa es aislada continuamente.

12.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la glucosa es aislada continuamente a través de filtración de membrana o cromatografía.

13.- Un proceso para preparar fructosa a partir de sacarosa, que comprende: i) poner en contacto la sacarosa con una glucosiltransferasa para producir fructosa, y ii) aislar la fructosa de la misma.

14.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la glucosiltransferasa es obtenida a partir de un organismo seleccionado del grupo que consiste de S. mutans y plantas superiores.

15.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la fructosa es continuamente aislada.

16.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el producto de reacción además comprende una poliglucana y dicho proceso además comprende aislar la poliglucana.

17.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la poliglucana es continuamente aislada.

18.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la fructosa es aislada a través de filtración de membrana o cromatografía.

19.- El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la poliglucana es aislada a través de filtración de membrana o cromatografía.

20.- Un proceso para preparar cantidades comerciales de fructosa y una poliglucana, que comprende: i) poner en contacto la sacarosa con una glucosiltransferasa para producir un producto de reacción que comprende fructosa y una poliglucana; y ii) aislar la fructosa de dicho poliglucana.

21.- Un proceso para preparar glucosa y fructosa a partir de sacarosa, que comprende: i) poner en contacto sacarosa con una fructosiltransferasa para producir glucosa; ii) poner en contacto sacarosa con una glucosiltransferasa para producir fructosa; y iii) aislar glucosa y fructosa.

22.- Un reactor para preparar cantidades comerciales de glucosa, que comprende: (a) un recipiente de reactor; (b) una entrada para sacarosa; (c) una salida para glucosa; y (d) una fructosiltransferasa.

23.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende además una salida para una polifructana.

24.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la entrada para sacarosa es una entrada continua.

25.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la salida para la polifructana es una salida continua.

26.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la salida para glucosa es una salida continua.

27.- Un reactor para preparar cantidades comerciales de fructosa que comprende: (a) un recipiente de reactor; (b) una entrada para sacarosa; (c) una salida para fructosa; y (d) una glucosiltransferasa.

28.- Un reactor para preparar glucosa y fructosa a partir de sacarosa, que comprende: (a) un recipiente de reactor que comprende: (i) una entrada para sacarosa; (¡i) una salida para glucosa; y (iii) una fructosiltransferasa; y (b) un recipiente de reactor que comprende: (i) una entrada para sacarosa; (ii) una salida para fructosa; y (¡ii) una glucosiltransferasa.

29.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende además un separador ubicado entre el recipiente de reactor y la salida para glucosa.

30.- El reactor de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende un separador ubicado entre el recipiente de reactor y la salida para polifructana.