MXPA99007769A - Apoptosis auto-regulada de celulas inflamatorias mediante terapia genica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la inducción terapéutica de la apoptosis en células inflamatorias activadas, o en células al sitio de la inflamación, mediante la introducción en aquellas células de un gen quimérico que contiene un gen que induce la apoptosis (AIG) accionado por un promotor del un gen inducible activado en la inflamación y de un incrementador promotor de manera que las células inflamatorias son fijadas. En una modalidad, el gen quimérico comprende al menos un incrementador promotor TNFalfa unido a una copia funcional de un promotor TNFalfa mínimo y además unido al menos a una copia de un gen que induce apoptosis, en donde la expresión del gen es accionada por el promotor TNFalfa. Se puede unir directo, distal, próximo o en combinaciones de las mismas. Los ejemplos de genes que inducen apoptosis incluyen Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzima B. Ventajosamente, el gen quimérico TNFp-AIG se expresa solamente en aquellas células que producen la citocina inflamatoria TNFalfa. Además, el gen quimérico TNFp-AIG también secuestra factores de transcripción TNFp inducibles, con ello reduce la producción endógena de TNFalfa.

Description

APOPTOSIS AUTO-REGULADA DE CÉLULAS INFLAMATORIAS MEDIANTE TERAPIA GENICA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la naucc cr. terapéutica de apoptosis en células inflamatorias mediante la introducción en aquellas células de un gen, el cual ínauce -a apcptosis (muerte celular programada o muerte celular no necrctica) en estas células. El gen que inauce la apoptcs s ?el cual algunas veces se referirá aqu como AIG, es accionado por un promotor TNFa (TNFp) u otro gen maucible activado en la inflamación. En una moaai aad, la apcptcsis es maucida selectivamente en aquellas células capaces ae proauc r TNFa. El TNFp-AIG u otro gen quimérico cuecen convenientemente introducirse in vi ve usando técnicas convencionales de terapia de gen. Ventajosamente, er. una mcaal aaa er. aonae el gen quimérico es TNFp-AIG, este se expresa solamente er. aquellas células que producen _a c tocma ipr..amatoria, TNFa. Ademas, puesto que el gen quimérico TNFp-AIG contiene los elementos promotores TNFa, es tamciep un maucible segregador o separador, factor ae transcripción T F-p selectivo. La presente invención se reí-ere espec camente a TNFp-A.IG y constructes del ger.

REF.: 031101 similares, células que contienen genes quiméricos, métodos para inducción de apoptosis en células transfectadas con genes quiméricos, composiciones farmacéuticas que contienen genes quiméricos, métodos para la selección in vi tro de variantes de células somáticas no productoras de TNFa, dentro de una población celular que produce TNFa y ios similares, un método para identificar genes supresivos dominantes/negativos dominantes responsables de la inhibición de la producción TNFa y métodos terapéuticos usando el gen quimérico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En muchas condiciones inflamatorias, las citocinas tales como IL-1, IL-10, GM-CSF y TNFa son producidas excesivamente como un resultado de la segregación de masas y la acumulación de células inflamatorias (Brennan F.M. et al . , Bri ti sh Medi cal Bull eti n 1995, 51/2, 368-384). La sobrerregulación y/o ia disregulación de citocinas en tejido inflamado puede ser directamente o indirectamente responsable de la exacerbación de las enfermedades inflamatorias crónicas. Por ejemplo, la patología más marcada en artritis reumatoidea (RA) se presenta al sitio local de la inflamación (es decir, uniones o articulaciones sinoviales) . Por lo tanto, es probable que las citocipas producidas en las uniones o articulaciones smoviales de pacientes RA jueguen un papel en el procese oe la 5 enfermedad. De estas citocinas, IL-1 y TNFa se creer son las responsables para la devastación de ia destrucción del cartílago y la erosión ósea las cual caracteriza d RA (Dayer J.M. et 'al . , J. Exp . Med. , 1985, 162, 120b-1215; Go en M. et al . , Na ture, 1983, 306, 378-380). La presencia de cantidades excesivas de IL-1 y TNF-a en las uniones o articulaciones ha mostrado acelerar el desarrolle ae artritis ínaucida por colágeno en roedores (Brennan F.M., et al., Cli n . Expt . Immunol . , 1994, 97/1, 1-3). Se producen cantidades excesivas de TNFa y IL-1 en el tejido smovial mediante una variedad de tipos celulares en la unión o articulación del cartílago paño, incluyendo células de linaje macrófago, sinoviocitos similares al macrofaqo, células T activadas, y posiblemente, sinoviocitos similares al fibroblastos (Chu C. Q. et al . , Arthri ti s & Rheuma ti sm, 2 1991, 34, 1125-1132; Deleuran B.W., et ai., Arthri ti s í Rl^euma ti sm, 1992, 35, 1170-1178) .

Además de los efectos inflamatorios descritos anteriormente, el TNFa juega un papel clave y ubicuo en una l í variedad de eventos pro-inflamatorios, tales como indicción de la actividad IL-1 en minocitos. En realidaa, les anticuerpos neutralizantes ant-TNF-a han mostrado reaucir la producción total del IL-1 (Portillo, et al . , Imirrunol . , 1989, 66, 170-175; Brennan F.M., et al . , Bri ti sh Medi cal Boull etin 1995, 51/2, 368-384) . Asi, un beneficio adicional para bloquear el efecto de la citocina inflamatoria TNFa es la reducción en la producción del mediador igualmente destructivo pro-inflamatorio IL-1. Además, es bien concciao que el TNFa es un activador transcripcional de otros genes relacionados con la inflamación. Por ejempio, ia presencia de TNFa estimula la producción de otras citocinas (tal como GM-CSF) y receptores de la superficie celular, incluyendo antigenos II de la clase HLA, y moléculas de adhesión (Alvaro-Garcia J.M., et al., J. Exp . Med. , 1989, 146, 865-875) , ios cuales, resultan en un continuo aislamiento de células T activadas y neutrofilas resultando e'i una inflamación sinovial e hiperplasia y finalmente, en una destrucción aumentada del cartílago y del hueso .Alien J.B., J. Exp . Med. , 1990, 171, 231).

Convencionalmente, ia terapia contra enfermedades inflamatorias es dirigida típicamente contra la inflamación sintomática. Tales terapias proporcionan solamente alivio temporal sin retardar significantemente el progreso de la enfermedad. En contraste, el objetivo ae las terapias TNFa y otros factores inducidos en el proceso inflamatorio son probablemente más prometedoras. For ejemplo, en modelos animales la artritis inaucida por colágeno, un anticuerpo anti-TNFa y una quimera IsG del receptor TNFa soluble, reducen efectivamente la dilatación o expansión de la pata, complicación de la articulación y destrucción del cartílago y hueso (Williams R.O. et. ai., Proc . Na ti , Acad. Scí . , 1992, 89, 9784-9788!. Ensayos humanizados usando ambos anticuerpos humanizados anti-TNFa y moléculas quiméricas IgG del receptor TNFa producen resultados dramáticos (Elliott, M.J., et al . , Arthri ti s and Rneu a ti sm, 1993, 36, 1681-1690; Elliott M. J., et. ai., Lancet , 343, 1105-1110) . A pesar que el tratamiento con estos antagonistas TNFa parece ser bien tolerado, también resulta en la producción de anticuerpos contra las proteínas recombinantes. Asi, estas terapias no pueden ser adecuadas por un tratamiento de largo término y no realizan una disminución verdadera de las enfermedades. Para modificar actualmente el progreso de la enfermedad, podrá el TNFa fijarse continuamente usando terapias TNFa especificas. Tal protocolo terapéutico no es práctico con estos agentes biológicos y podrá dificultarse al administrarse en largo término.

En una opción terapéutica alterna, ei sipovio inflamado podrá removerse usando cirugía ?erold N. y Schroder H.A., Acta Orthop. Scand. , 1995, 66 , 252-254; Ogilvie-Harps D.J. y Weisieder L., Arthrosccpy, 1995, 11, 91-95), química (Cruz-Esteban C. Y Wiike W.S., Bai l l i ere ' s 5 Ciini cal Rheuma tol . , 1995, 9, 787-801) o sinovectc ia inducida por radiación (Cruz-Esteban C. y Wiike W.S., Bailliere ' s Clinícal Rheuma tol . , 1995, 9, 78"-801 < . s siguientes resultados de smovectomia quirúrgica artroscópica son buenos, muestran mejoramiento de la condición pre-opertiva a la condición post-operativa . La sinovectomia no quirúrgica se realiza usando varios agentes químicos tales como ácido ósmico, agentes alquilantes tales como mostaza de nitrógeno y tiotepa, metotrexato. Desafortunadamente, las sinovectomias no quirúrgicas ir \ incluyendo química e inducida por radiación) son procedimientos complicados, que proporcionan solamente alivio de corto término y muestran solamente reducción irregular de la hiperplasia smovial. Además, la mayoría de las alternativas no quirúrgicas son teratógenos 2C potenciales. Además, el daño químico afecta al tejido en ia sinovectomia no quirúrgica, asi también como el aano en ei tejido inducido quirúrgicamente, a menudo, causan as mismo, una respuesta inflamatoria. Finalmente, deberá notarse que estos alcances padecen los riesgos y efectos 1 laterales comúnmente asociados con terapias convencionales farmacéuticas y procedimientos quirúrgicos invasores, incluyendo los costos e inconveniencias de ia hospitalización y rehabilitación.

En consecuencia, existe aún una necesidad j un alcance terapéutico efectivo para tratar enfermedades inflamatorias en general y RA en particular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención supera las desventajas asociadas con terapias previas para tratar enfermedades inflamatorias al proporcionar un nuevo alcance terapéutico. De conformidad con una modalidad de esta invención, ia apoptosis es inducida selectivamente en células inflamatorias que producen TNF-a, causando la destrucción de estas células sin una reacción inflamatoria asociaca.

Un objetivo de esta invención, es proporcionar un método terapéutico que comprende la etapa de inducir en las células inflamatorias de un mamífero, o células al sitie de ia inflamación, un gen quimérico que contiene un gen que induce la apoptosis auto regulante (AIG) . El AIG está accionado por un promotor tal como un promotor TNFa ÍTNFp; ver las Figuras 1 y 2), y, preferiblemente, un mcrementador promotor. Por lo tanto, se expresa en todas y solamente aquellas células capaces de producir TNFa.

Otro objetivo de esta invención, es proporcionar TNFp-AIG y los constructos de gen quiméricos similares, procedimientos para elaborar a los mismos, metoaos ae usarlos, y preparaciones que los contienen.

Aún otro objeto de esta invención, es proporcionar un método para la inducción de apoptosis en células transfectadas con el gen quimérico TNFp-AIG, un método para la selección m vi tro de variantes de células somáticas no productoras de TNF-a en una población, un método para identificar genes dominantes/negativos responsables de la génesis de una población no productora de TNF-a y un método para identificar productos responsables de la regulación de la producción TNF-a ( Figura 10 ¡ .

Estos y otros objetivos serán fácilmente apreciados por aquellos expertos en la técnica, basados soore ia siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un representación esquemática de genes quiméricos TNFp-AIG de esta invención. El gen que induce Apoptosis (AIG) podrá ser cualquiera, pero no limitarse a los genes listados, vi z . , Caspasas 1 a 10, Granzima B, FasLigand, etc .

La Figura 2 es un diagrama esquemático demostrando los resultados de la terapia de gen usando genes quiméricos TNFp-AIG de esta invención.

La Figura 3 es un resumen de ios constructos de supresión usados para la identificación de los elementos cis inducibies del promotor TNF-a usando la expresión del gen luciferasa (Luc) como el sistema reportero.

La Figura 4 (a y b) proporciona un resumen de resultados obtenidos usando los constructos descritos en la Figura 3. La expresión temporal de los constructos se valoró en dos diferentes lineas celulares que producen TNF-a, viz., Jurkat (Figura 4a) y THP-i (Figura 4b! . Los histogramas en cada figura mostraron el Índice de estimulación como una medida de la inductibiiidad meaiante ios agentes activantes o de activación tal como FMA .Figura 4a) o LPS (Figura 4b) para experimentos individuales. La linea sobrepuesta en cada figura indica la maucio^liaaa principal promedio de 4 a 6 experimentos.

La figura 5 es un diagrama de flujo para la preparación del TNFpAIG usando elementos nativos o naturales seleccionados del promotor TNFa y AIGs prodominio suprimido (los AIGs usados son Caspasa y Caspasa 4/5) .

La Figura 6 (a, b, y c) proporcionan un resumen de resultados de experimentos representativos realizados para ver ia expresión de los TNFpAIGs quiméricos. La apoptosis en cequias Jurkat transfectadas temporalmente (Figura 6a y 6b) y células THP-1 (Figura 6c) se ensayaron usando Elisa de Muerte Celular (ensayo CDE) . En las tres figuras, los histogramas con lineas esparciaas representan el control de transfeccion, en donde las células se trataron con ei agente de transfección en la ausencia de DNA, Los histogramas con lineas densas representan los elementos TNFp que accionan ia expresión del gen luciferasa y los histogramas solidos representan los mismos elementos TNFp que accionan las expresión de cualquiera de AIG.l o AIG.2. El numero entre paréntesis arriba de los histogramas sólidos representan el factor de enriquec iento (proporción de apoptosis inducida por TNFpAIG al vector ae control TNFpLuc) .

La Figura 7 (a y b) es una representación diagramática de un gen quimérico TNFp-AIG de esta invención que comprende múltiples copias de elementos cis inducibles del promotor TNFa el cual, en turno, acciona la expresión del AIG (Figura 7a) . Una representación diagramática de un gen quimérico TNFpAIG, comprende múltiples copias de elementos cis mducibles del promotor TNFa, que accionan la expresión del AIG, descendentemente del cual son la región 3' no traducida del gen TNFa (TNF3'UTR) (Figura b) . El 3'UTR del gen TNFa está implicado en la regulación de la expresión inducidle del TNFa (Han, J., et al . , J. Immunol ogy, 1991, 146, 1843-1843, Crawford, E.K., et ai., J. Bi ol . Chem . , 1997, 272, 21120-21137, y la Figura S).

La Figura 6 (a y b) son diagramas de flupo de esquemas para la preparación de constructos quiméricos AIG superpromotores TNFa.

La Figura 9 muestra un resumen de los restltaacs ae dos experimentos mostrando el efecto regulador del TNF3'UTR en la expresión mducible del gen reportero luciferasa. La transfeccion temporal se realizo en una linea celular de fibroblastos. Los histogramas punteados representan la mducibilidad de TNFpLuc en la ausencia a^ TNF3'UTR y ios histogramas solidos representa! ^a mducibilidad del TNFpLuc en la presencia de TNF3 JTR. Se obtienen resultados similares en la célula Jurkat.

La Figura 10 es una representación diagramatica para la selección de variantes de celuias somáticas no productoras de TNFa dentro de una población celular que produce TNFa y la identificación de genes supresores negativos dominantes responsables de la inhibición de la producción de TNF-a.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa sobre la evidencia que la apoptosis de células inflamatorias en ciertas enfermedades inflamatorias es benéfica terapéuticamente. La invención se refiere específicamente a la apoptosis auto regulada mediante terapia de gen. Hablando ampliamente, er la practica de la invención, un gen quimérico que comprende al rrenos un mcrementador promotor unido al menos a und copia funcional de un promotor mínimo, el promotor es un aen o una combinación de genes activados en las células inflamatorias o en las células al sitio de ia inflamación, unido ai menos a una copia de un gen que induce apoptosis (AIGj , de manera tal que, la expresión del gen que macee apoptosis se acciona mediante el promotor, asi, se finan en las células inflamatorias. Ejemplos de promotores de genes inducibles activados en la inflamación incluyen, pero no se limitan a citocinas, mterleucinas y sus receptores, moléculas de adhesión celular y sus ligandos, quimocmas y sus receptores, enzimas pro-mfiamatopas y las similares. Los genes quiméricos de conformidad con la invención, comprenden mcrementadores, promotores, y elementos A.IG en directo, distante o próximos adjuntos, y combinaciones de los mismos. Como se menciono anteriormente y se discutirá en más detalle posteriormente, en algunas modalidades. Múltiples copias de mcrementadores, promotores y/o AIG son empleadas para máxima eficacia.

Para que la invención aqui descrita pueda ser completamente entendida, se expone la siguiente descripción detallada, con énfasis en los genes quiméricos que comprenden al menos, un promotor TNFa unido al menos a una copia funcional ae un promotor TNFa mínimo y, ademas, unido al menos a una copia de un AIG solamente para proposites ae ilustración. A través de los ejemplos siguientes, amóien se emplean estos tipos de construcciones, se apreciara para aquellos expertos que los constructos básicos descritos que pueden alterarse para proporcionar otras modalidades que utilizan productos, procedimientos, métodos, y composiciones de la invención con otros promotores que comprenden genes mducibles activados en la inflamación tal como los tipos listados anteriormente, presentan funciones similares que pueden ser usadas para fijar células al sitio de la infección.

Por ejemplo, las citocinas e mterleucmas empleadas como promotores en la construcción de genes quiméricos de la invención incluyen, pero no están limitados a TNF-a, TNFß, IL-la, IL-lß, 11-6, IL-9, GM-CSF, mterferon?, y los similares, y fragmentos funcionales y mezclas de los mismos. Las moléculas de adhesión ceJular y sus ligandos incluyen, pero no están limitados a, selectmas, mtegrinas y miembros de la superfamilia de inmunoglobulina tal como ICAM-1, V-CAM, y las similares, y los fragmentos funcionales y variantes y mezclas de los mismos. Las quimocmas y sus receptores incluyen, pero no están limitados a, los miembros de la familia C-X-C y C-C tal como MlP-la, MlP-lß, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, 1P10, Gro a-? y los similares, y los fragmentos funcionales y variantes y mezclas de los mismos. Las enzimas pro-inflamatorias incluyen, pero no están limitadas a COX-2, iNOS, fosfolipasas, proteasas (incluyendo metaloproteasas de matriz) , y las similares y fragmentos funcionales y mezclas de las mismas. c Para aclarar la discusión posterior oe genes quiméricos TNF-pAIG ejemplificados de esta invención, se ilustran las siguientes secuencias: 0 SEC ID NO:l Es la secuencia nucieotida correspondiente a la longitud completa, referencia de la secuencia promotora TNFa humana, como la publicada en (Takashiba S . , et al . , Gene , 1993, 131, 307-308 . Los números de nucleotidos usados aquí, se refieren a la 5 numeración de esta secuencia.

SEC ID NO: 2 Es la secuencia promotora TNFa nativa u original del gen que se uso en esta invención 1-1077 nucleotidos del sitio inicial de transcripción, i TSS i . Hay unas cuantas diferencias en la secuencia del TNFp en la SEC ID NO:l y la SEC ID NO:2. Tales diferencias en las secuencias nuc_eot?das del promotor TNFa han siao reportadas (Takashiba S., et ai., Gene, 1 993, 131, 307- 308; .

SEC ID NO: 3 Es la secuencia promotora TNFa mínima nativa u original (nucleotido - 120 a través - TSS, la cual incluye al menos un elemento mcrementador (sitio kl; ver Pauli, U., Cri t . Rev. , in Eucaryoti c Gene Expresi ón , 1994, 4, 323-344; Rhoades K.L., et al . , J. Bi ol . Chem . , 1992, 267, 22102-22107; y Takashiba S., et al . , Gene, 13L, 307-308) .

SEC IND NO: 4 Es el gen quimérico TNFpl20 AIG.l (que contienen -120 TNFp que acciona la expresión de la variante de prodominio suprimido del gen CPP32 (Caspasa 3, publicada por Tewari M. et al . , Cell , 1995 81(5), 801-809, con la variación siendo de V239A) .

SEC ID NO: 5 Es el gen quimérico TNFp706 AIG.l (que contienen -706TNFp que acciona ia expresión del gen CPP 32 de prodommio suprimido.

SEC ID NO: 6 Es el TNFpl005 AIG.l (que contiene -1005 TNFp que acciona la expresión del gen CPP 32 de prodominio suprimido) .

SEC ID NO: 7 Es el gen quimérico TNFpl20 AIG.2 ique contiene -120TNFp que acciona la expresión del gen Ty/x de prodominio suprimido. Los genes (Secuencias de Ty (Caspasa 5) y Tx (Caspasa 4) están publicados en la referencia Faucheu, C, et al . , Eur. J. Bi ochem . , 236, 207-213, 1996; Faucheu, C, et al . , EMBO J. , 14, 1914-1922, 1995) .

SEC ID NO: 8 es el gen quimérico TNFp706 AIG.2 (que contiene -706TNFp que acciona la expresión del gen Ty/x de prodominio suprimido.

SEC ID NO: 9 es el TNFpl005 AIG.l (que contiene - 1005 TNFp que acciona la expresión del gen Ty/x de prodominio suprimido.

SEC ID NO: 10 es la región incrementadora 1 ¡ER 1) del promotor TNFa que abarca los nucleótidos -1005 a -905.

SEC ID NO: 11 es la región incrementadora 2 (ER 2) del promotor TNFa que abarca los nucleotidos -706 a -517.

SEC ID NO: 12 Es el sitio de clonación múltiple adicional (MCS) diseñado qenéticamente contracorriente del promotor TNFa -120 mínimo en el constructo -120pGL3.

SEC ID NO: 13 Es la región 3' no traducida (3'UTR) del gen TNFa (Nedwin, G.E., et. al . , Nuclei c Acid Research , 1985, 13, 6361-6373) .

Los elementos del promotor TNFa para la preparación de constructos de gen quimérico de conformidad con esta invención se seleccionan a partir de elementos los cuales son capaces de inducir la expresión de un gen terapéutico accionado por el promotor TNFa. Estos elementos promotores se referirán aqui como "elementos cis mducibles", "elementos cis-inducibles" o "elementos mcrementadores" del promotor TNFa.

Los elementos mcrementadores pueden estar físicamente enlazados a la secuencia promotora mínima, o separarse del promotor minimo mediante una secuencia enlazadora la cual puede o no puede tener sitios únicos de restricción. Asi, como se resumió anteriormente, los elementos incrementadores pueden unirse directamente, distalmente, próximamente, o cualquier coiuoinacion de los mismos, a genes quiméricos de la invención. Estos se construyen típicamente contracorriente del promotor. Ejemplos de elementos mcrementadores TNFa se exponen en la SEC ID NO: 10 y la SEC ID NO: 11; se pueden emoiear fragmentos funcionales o variantes y coiaomaciones del mismo. Algunos constructos de gen preferidos de conformidad con esta invención, incluyen aquellos que tienen copias múltiples de los elementos incrementadores, es decir, 2 o más copias. Algunas modalidades tienen aproximadamente 2 a , más estrechamente 2 a 10, y aún más estrechamente, 2 a 5 copias.

Los términos "promotor TNF", "promotor TNFa" y "TNFp" son usados intercambiablemente aqui. A menos que se note lo contrario, estos términos se refieren a la secuencia nucleótida completa correspondiente a la secuencia promotora mínima TNFa nativa u original unida a uno o más elementos incrementadores contracorriente (cualquiera presente naturalmente, es decir, nativo u original o diseñado genéticamente en el laboratorio) . Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, las SEC ID N0:1, SEC ID NO:2, y SEC ID NO:3, y fragmentos funcionales, variantes, y mezclas de algunos de estos. Muchos fragmentos funcionales y variantes de estas secuencias TNFa y otras descritas aqui participan en una homología de secuencia de al menos 80B, y en algunos casos sobre 90-. , a sus contrapartes nativas u originales o diseñadas genéticamente, pero est s son conocidas por los expertos y se definen en las referencias citadas aqui.

Cualquier gen que induce apoptosis puede usarse en los genes quiméricos y métodos descritos aqui. El gen que induce apoptosis usado para los genes terapéuticos quiméricos de esta invención puede ser el mismo o diferente a partir del tipo de gen que induce la apoptosis presente en ia secuencia nativa u original de las células inflamatorias que producen TNF-a (si aquellas contienen naturalmente células en un gen aprótico) . Los AIGs preferidos incluyen, pero no están limitados a, miembros oe la familia ICE/CED3 de las proteasas que inducen apoptosis (tales como Caspasa-1 (ICE), hICE, ICE-LAP45, Mch2a) , Caspasa-2 (ICH1), Caspasa-3 (CPP32, Yama, Apopama) , Caspasa-4 (Tx, ICH2, ICE reí II), Caspasa-5 (ICE reí III, TY), Caspasa-6 (Mch-2); Caspasa-7 (Mch-3, ICE-LAP3, CMH-1); Caspasa-8 (MACH, FLICE, Mch-5) , Caspasa-9 ( ICE-LAP6,Mch6) y Caspasa-10 (Mch4)), miembros de la faminia granzi a (tal como Granzima A y Granzima B) , Ligando Fas (FasL) , y fragmentos funcionales, variantes y mezclas de algunos de estos. Algunas modalidades emplean Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzyma B, y fragmentos funcionales, variantes y mezclas de los mismos. Con la excepción de FasL, estos genes, cuando sobre expresan la transfección siguiente, inducen apoptosis en células transfectadas (Miura M., et al . , Cell , 1993, 75, 653-660: Chinnayan A.M., et al . , Cell , 1995, 81, 505-512; Los, et ai., Na ture, 1995, 375, 81; Muzío, et al . , Cell , 1996, 85, 817-827).

En el caso de FasL, la apoptosis se induce iva sea en una forma autocrina o paracrina) solamente en aquellas células que expresan Fas. Por lo tanto, ei constructo de gen quimérico TNFp-FasL ofrece un segundo nivel de selectividad. Otra ventaja del gen quimérico TNFp-FasL, es la fijación selectiva de aquellas células que producen enfermedades en el sinovio que no expresan TNFa (con ello carecen del accionamiento de la expresión del gen que induce la apoptosis) , pero no expresan Fas en la superficie. En este caso, el FasL se expresará per aquellas células que son capaces de producir TNFa tal como los macrófagos activados y las células T. Estas células entonces inducirán la apoptosis en las células que expresan Fas tal como células T peligrosamente activadas y en sonoviocitos que expresan Fas.

Esta invención proporciona un nuevo método terapéutico que comprende la etapa de introducir en las células de un mamífero, un gen quimérico que comprende un gen que induce apoptosis (AIG) accionado por el promotor TNFa (TNFp) . Ejemplos de genes quiméricos de la invención, se exponen en las SEC ID NOs, 4, 5, 6, 7, 8 y 9; se pueden emplear también, fragmentos funcionales o variantes de estos. Sin desear limitarlo por la teoría, como un resultado de estar controlado por el TNFp, el AIG se expresa solamente en aquellas que producen la citocipa inflamatoria, TNFa. Por lo tanto, algunas células que expresan TNFa serán autodestructivas, mientras iae células que no expresan TNF-a, no serán afectadas. Ventajosamente, esta metodología puede fijar algunas células que producen TNF-a (tal como los macrófagos activados, ceuuas T activadas y similares a los macrófagos y posiblemente sinoviocitos similares a los fíbroplastos) sin referirse al tipo celular. Verdaderamente, la célula que produce TNF-a objetivo, puede solamente ser una, la cual normalmente hace o normalmente no lleva o expresa un gen de apoptosie en su forma nativa u original no alterada. Por lo tanto, usanoo los genes quiméricos y métodos de esta invención, las fuentes celulares del TNFa pueden destruirse en una iranera altamente selectiva.

Otra ventaja de usar el gen quimérico TNFp-AIG oe esta invención, es que los factores de transcí ípcion secuestradores TNFp necesarios para el TNFp endógeno, con ello, conducen a una reducción en ia producc_.cn TNF endoqeno. En una modalidad preferida, el TNFp esta presente en la célula terapéuticamente objetivo en cantidades en exceso, Esto puede abarcarse por la introducción de múltiples copias del gen transfectado en la célula. Alternativamente, el gen quimérico TNFp-AIG ae conformidad con la invención, puede contener copias múltiples de ios elementos cis mducibles del promotor TNFa. Come se menciono anteriormente, las copias múltiples de os "elementos mcrementadores mducibles" de TNFp están presentes en algunas modalidades de los genes quiméricos TNFp-AIG de esta invención. Al incluir copias múltiples de los elementos cis mducibles del constructo TNFp, los factores transcripcionales necesarios para que la célula transfectada produzca TNFa, son secuestrados por la secuencia exogenamente introducida. Este constructo TNFp-AIG quimérico preferido se caracteriza por una efectividad incrementada en la competencia para los factores de transcripción TNFp específicos como los comparados ccn los genes quiméricos de esta invención, que contienen so Lamente un solo elemento incrementador unido al TNFp. El "promotor super mducible" construido de esta manera, es capaz de (1) competir mas efectivamente para los factores de transcripción mducibles TNFa específicos y (2) accionar la expresión del gen que induce apoptosis en una forma aumentada en virtud de los elementos de incrementación múltiples .

Por ejemplo, en pacientes con aitritis reumatoidea, la emovectomia, es decir, la eliminación del tejioo smovia , ha sido mostrada por ser clínicamente benéfica. De una manera diferente, los procedimientos de smovectomia quirúrgica y convencional, al método terapéutico de la célula objetivo describen aquí objetivos solamente en las células que producen TNFa. Asi, ventajosamente, la introducción y expresión del gen quimérico TNFp-AIG, y la subsecuente inducción de apoptosis no se induce una respuesta inflamatoria. En consecuencia, los métodos de esta invención son comparativamente selectivos y resultan en un daño mínimo al tejido y en una reducción en la inflamación.

Los productos y métodos descritos aquí, son empleados para el tratamiento también de otras enfermedades inflamatorias. Tales enfermedades inflamatorias incluyen, pero no están limitacos a, esclerosis múltiple, síndrome de Guillam-Barre, mal de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis, enfermedad del huésped contra el implante o transplante, lupus entematoso, diabetes melitus dependiente de la insulina, artritis psoriatica, sarcoidosis, neumonitis hipersensitiva, espondilitis anquilosante y espoldiloartropatias relacionadas. Síndrome de Reiter y esclerosis sistémica. Asi, esta invención abarca métodos para tratar una enfermedad inflamatoria en un paciente mediante la inducción de la apoptosis en células inflamatorias o células a un sitio de la inflamación oe^ paciente mediante la introducción en las células oe al menos un gen quimérico de la invención. Esto esta abarcado típicamente mediante la preparación oe una composición farmacéutica que contiene al menos un gen quimerice de ia invención y típicamente un portador farmacéuticamente aceptable, y administrar la composición a un paciente usando métodos estándares. En algunas modalidades, _.a composición farmacéutica es liberada directamente en el sitio de la inflamación usando métodos tópicos, intravenosos, mtraperitoneales y similares. Ademas, la metodología se discute a continuación.

Además de las indicaciones terapéuticas, los genes y células de conformidad con esta invención, pueden usarse en una variedad de métodos de selección y clasificación. En un método tai, las variantes de células somáticas no productoras de TNF-a, dentro de una población celular que produce TNFa, pueden seleccionarse m vitro mediante la introducción de un gen quimérico de TNFp-AIG en la población celular que produce TNF-a. Las células que producen TNFa se someterán a apoptosis. Las células que no producen TNFa sobrevivirán. La selección de estas variantes que poseen el fenotipo de sobrevivencia es una for s fácil para identificar células no productoras de TNF-a. Tal proceso de selección puede usarse para determinar la expresión de genes que actúan in trans para regular la actividad del promotor TNF-a, con ello reducen ia producción TNF-a. Tales genes se caracterizan come genes supresivo dominante/negativo dominante (DN) en otros sistemas (Behrends S., et al . , J. Bi ol . Chem . 1995, 2~0, 21109-21113; Zhang S., et al . , J. Bi ol . Chem . , 1995, 270, 23934-23936; Watowich S.S., et al . , Mol . Cell . Bi ol . , 1994, 14/6, 3535-3549) .

En un método in vi tro adicional, un gen quimérico TNFp-AIG de conformidad con esta invención, puede usarse para identificar genes negativos dominantes responsables de la génesis de una población celular que no produce TNFa. De conformidad con este método, un gen quimérico TNFp-AIG de conformidad con esta invención, se introduce en las células que producen TNF-a. Exceptuando la presencia de un gen negativo dominante, aquellas células deberán someterse a apoptosis sobre activación. Por lo tanto, podrá deducirse que las variantes sobrevivientes poseen un gen negativo dominante capaz de regular descendentemente la producción TNFa. El gen negativo dominante puede ser rápidamente identificado al producir una biblioteca cDNA y lineas celulares transfectantes (por ejemplo, Jurkat y THP-1). Estas células son ya sea transfectantes estables de un gen quimérico TNFp-AIG mducible o células transfectadas TNFp-AIG del gen TNFp luciferasa que se seleccionaran para el fenotipo de sobrevivencia siguiendo la activación m vi tro; el fenotipo de sobrevivencia es indicativo del efecto de los genes DN . En las células transfectadas con el gen TNFp luciferasa, la reducción en la actividad luciferasa sera indicativa del efecto del gen DN. Los genes nesativos dominantes identificados usando este protocole pueden usarse como los mismos agentes terapéuticos futuros. Tales agentes serán los candidatos para la terapia de gen para reducir la producción TNFa.

Los métodos utilizados para transferir el gen están agrupados en dos categorías amplias: 1. Alcance directo: transduccion m si t u de. gen terapéutico en las células objetivo tal como smoviocitos usando un vector adecuado come un portador para el gen terapéutico. El vector que contiene el gen terapéutico es inyectado directamente en el área afectada (por ejemplo, una articulación artrítica) . 2. Alcance indirecto: transfeccion ex-vi vo del gen terapéutico en células objetivo tal como smovioeitos .

En este alcance, el sinovio es removido ae las articulaciones, los smoviocitos son aislados y cultivados m vi tro . Las células cultivadas m vi trc son transfectadas con el gen terapéutico, \ les smoviocitos genéticamente modificados son transp-.antados nuevamente en el smovio.

Para la transferencia m vi vo, se han evaluado varios vectores por su eficacia en la liberación cel gen (Nita, et al., Arthp ti s & Rheu a ti sm, 1996, 39/5, 820-828) . Entre los vectores usados para la terapia de gen, los vectores liberados de los retrovirus son a lo mucho los mas desarrollados. Son capaces de insertar el material genético en el genóma huésped y producir transfectantes estables. Estos vectores, sin embargo, son incapaces de infectar células no divididas y, puesto que se insertan en el genoma huésped, no puede estandarizarse la posibilidad de mutagenesis insercional. En comparación, los vectores derivados de los adenovirus infectan la división asi también como a las células que no se dividen y liberan episomalmente DNA. La desventaja de los vectores basados en adenovirus es que estos vectores continúan proaucienao proteínas virales en células infectadas haciéndolas antigénicas potencial ente . Un tercer tipo de vectores de base viral se libera de los virus del Herpes simple (HSV) , los cuales también son capaces de infectar la división asi también como en células que no se dividen.

Entre los sistemas de vectores no virales, se han evaluado los liposomas catiónicos y los plasmidios DNA puros o simples. Las liposomas son el estado mas avanzado de desarrollo, a pesar que solo se toman ciertos tipos de células tales como del músculo y la piel, retienen y expresan el DNA. plasimidio puro o simple.

El sistema de liberación del gen mediado por la partícula es también posible (Rakhmilevicj , et ai., PNAS, 1996, 93, 6291) y es un alcance prometedor.

Los siguientes protocolos de liberación oei gen "?rj vi vo" pueden usarse para liberar genes quiméricos de esta invención: ?l) Nita et al., Arthp ti e and Rheuma ti sm, 1996, 39, 820- 823 Experimentos m vi vo en conejos: Cada vector es inyectado mtra-articularmente en 1 articulación de la rodilla. Para vectores virales, se inyectaron por rodilla entre 10" y 10' partículas suspendidas en 0.5 mi de una solución de sal balanceada.

Se inyectaron por rodilla, complejos de liposoma-DNA (200 nmoles de complejos DC-Chol con 20 µl de DNA/ml) en 1 ml de solución de sal balanceada. (2) Métodos en Medicina Molecular: Gene Therapy Prozocol s, Paul Robbins, ed., 1997, Barr et al., páginas 205-212 Vector basado en adenovirus para liberar hepatocitos: hepatocitos de rata 1X101" PFU en lOOg de animal . En perros (12-17 kg) , se penetraron venas portales con aproximadamente 1.5X10"" PFU/kg dando 1 copia de genoma adenovirus por copia diploide de DNA huésped.

En conejos (2-4 kg) , partículas de virus 1.5X10" (aproximadamente 1.5X10"" PFU) dieron una transducción de hepatocitos al 100%; partículas de virus 4X10" dieron una transducción de 50-75" .

Yang N-S, et al . , 281-296 Liberación del gen que media las partículas doradas: La transformación del tejido de la piel de mamíferos, 0.1, 0.5, 1.0 y 2.5 µg de partículas DNA/mg dieron relaciones lineales con niveles de expresión de transgenes Nabel, et al . , 297-305 Liberación del gen que media las liposomas en humanos : Protocolo 1: 15nmol de liposomas DC-Chol/Dope se combinaron con 1 µg de DNA en 0.7 ml . Se inyectó 0.2 ml de la mezcla anterior, en el nodulo del melanoma del paciente. Para liberar el catéter, se liberaron en la arteria 0.6 ml de la solución.

Protocolo 2: 15 nmol de liposomas DMRIE/Dope se combinaron con 5 µg de DNA en 1.0 ml .

Para inyecciones intra-tumorales directas, el rango de concentraciones DNA a partir de un complejo de 3 µg con 4.5 nM DMRIE/Dope a un complejo 300 µg con 450 nM dmrie/Dope. (3) Roessler et al . , 369-374 Transferencia de gen al sinovio: Se usó un rango de dosis, de partículas de adenovirus de 109-1012 que contienen gen terapéutico/uniones. Sin embargo, se usaron las dosis óptimas para algunas series experimentales particulares necesarias para determinarse empíricamente, \ ser dependientes de cualquiera de las propiedades del esqueleto genomico adenoviral recombmante asi también como el transgen que es expresado.

Para el alcance indirecto, están bien establecidos una variedad de métodos, que incluyen la utilización de la transfección a base de polimero cationico o lipido catiónico y electroporación.

Algunas de estas técnicas referenciadas anteriormente, pueden alterarse para adecuar las necesidades particulares de aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones están bien dentro de los niveles de poseen los expertos mediante prácticas ordinarias y no requieren experimentación indebida. Estas variaciones obvias están dentro del ámbito de esta invención .

Ejemplos Para que esta invención sea más completamente entendida, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para los propósitos de ilustrar algunas modalidades preferidas de esta invención, y no están construidos como limitantes del ámbito de esta invención en forma alguna.

EJEMPLO 1 Producción de constructos TNFp-AIG Para accionar el constructo AIG quimérico mediante los elementos cis incrementadores del promotor TNF, ya sea en una sola copia o múltiples copias de la misma región o en varias regiones, se realiza la identificación de las regiones de interés responsables para la expresión óptima mducible del gen reportero.

Selección de los elementos promotores TNF-a para ia construcción de un gen quimérico Las regiones del promotor TNFa son amplificadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando primeros que abarcan varios constructos oe supresión del promotor TNFa (Figura 3) . Las regiones identificaaas por otros investigadores en varios otros sistemas celulares son usadas como referencias (Rhoades, et al . , J. Bi oi . Chem . , 1992, 267, 22102-22107; Leitman, et al . , Mo l . Cei l Bi ol . , 1992, 12, 1352-1356; Pauli U., Cp t . Revi ews Eukaryotic Gene Expressi on, 1994, 4, 323-344^. Los genes amplificados PCR son entonces clonados contracorriente de un gen reportero, tal como iuciferasa, en un vecto- menos promotor comercialmente disponible. Estos constructos son ensayados por su expresión constitutiva e maucible en varias lineas celulares tal como Jurkat (lmfoblastoide T) , U973 (mielomonocitico) , THP-1 (monocitico) , fibroblastos y en sinoviocitos de cultivos humanos m vitrc. La identificación de las regiones responsables de la expresión inducible del gen reportero están basadas principalmente en ios resultados obtenidos usando dos lineas celulares que producen TNF-a, bis Jurkat (siguiendo la estimulación con PMA y THP-1 (siguiendo la estimulación con LPS > (F gura 4 a y b) . Estas células son transfectadas temporalmente usanoo métodos bien establecidos y reactivos comercialmente disponibles, por ejemplo, dextran DEAE y Superfectcs. Los elementos cis ce- promotor TNFa que son responsac ee de la expresión mducible del gen reportero son entonces usados para construir genes quiméricos TNFp-AIG.

Construcción de genes quiméricos TNFp-AIG. De los genes que inducen apoptosis descritos aqui, se prefieren los siguientes genes: i) proteasa cisterna - CPP32 (también conocida como Yama, apopaina o Caspasa 3) y íi) proteasa cisteina - Tx/Ty (Caspasa 4/Caspasa 5) Los AIGs son usados como truncaciones "predominio suprimido" para aumentar potencialmente la autocatalisis de Caspasas. Este es esencial para la conversión de la Caspasa inactiva a la forma activa.

El prodo imo suprimido CPP32 es amplificado usando primeros correspondientes a los codones 29-36 y 271-278 (el 278 es un codon de aetencion) . La forma truncada de CPP32 se refiere aqui como "aCPP32" o "AIG.l".

Para la amplificación PCR para los prodominios suprimidos Ty, los primeros correspondientes a las secuencias en el gen Ty son sintetizadas. Todas las Caspasas ampliamente descubiertas tienen homología a los otros miembros de la familia Caspasa. El primero 3' ccrresponae a los codones 359-365 (el codon 378 es un codon de detención) porciones ai 100. de homología de secuencia a los codones 372-378 (el codon 378 es un codón de detención) en el gen Tx. Sin embargo, el primero 5' que corresponde a los codones 81-87 en el gen Ty no tiene porción ai 100 oe homología con la región correspondiente en el gen Tx (codones 94-100 Tx) . El residuo 87 (Alamna1 en el gen Ty difiere del residuo 100 (Glicina) en el gen Tx . El producto amplificado PCR generado a partir de cDNA preparaóc a partir de Iinfocitos de sangre periférica humana activada poseen la secuencia de Tx, debido a la aparente abundancia de transcriptos Tx . Por lo tanto, la forma truncada del AIG generada usando primeros oligonucleótidos sintéticos que corresponden a las secuencias en Ty, aseguran secuencias iguales en Tx, aunque flanqueadas por las secuencias Tv de los primeros. Las secuencias Ty de los primeros usadas también se igualan con la secuencia de Tx, excepto para un codon. Asi, el gen usado en esta invención iguala el gen Tx truncado con el residuo del cambio G100 a A. Este gen es referido aqui como "?Ty/x" o "AIG.2".

Los AIG.l y AIG.2 se insertan descendentemente oel promotor TNFa mediante el reemplazo del gen reportero luciferasa en los constructos de supresión (-120, -70o y -1500) del promotor TNFa (figura 5). Estos constructos son ensayados por la inducción de la apoptosis después de la estimulación de las células Jurkat temporalmente infectadas y THP-1, (Figuras 6 a, b, y e). 3~? Construcción de los genes quiméricos AIG del superpromotor TNFa. Dos regiones ampliamente preferidas, bis, ERI '-1005 a -905) (SEC ID 10) y ER2 (-706 a -517) (SEC ID NO : 1 i ) del promotor TNFa, contienen elementos responsables de la expresión mducible del gen reportero descrito anteriormente (Figura 4a y 4b) son PCR amplificados y están ligados contracorriente del promotor nativo o de opaen mínimo (-120 a través de TSS, SEC ID NO: 3), ya sea como una sola copia o múltiples copias. Dos o mas regiones (-234 a -120) y (-234 a -65) del promotor TNFa están también identificadas como una región mcrementadora potencial 3 (ER3) y región mcrementadora 4 (ER4), respectivamente, las cuales pueden emplearse en los constructos quiméricos usando las estrategias descritas anteriormente. El superpromotor contiene múltiples casetes (2-10) de .as regiones mencionadas anteriormente, que contienen elementos promotores mducibles (Figura 7). Esta se realiza mediante las amplificaciones PCR de las regiones de ínteres usando primeros sintetizados con sitios de restricción insertados en el extremo 5' de cada uno de los primeros. Estos sitios únicos de restricción flanquean el gen amplificado producto de ínteres. Preferiblemente, el AIG de la PRC amplificada es clonado descendentemente ael TNF- (super promotor, reemplazando el gen reportero luciferasa en el constructo original como se describe para el promoter TNFa nativo u original .

Los esquemas para construcción ce un superpromotor TNFa y las secuencias enlazadoras que representan los sitios únicos de restricción (estos sitios de restricción están ausentes en los elementos seleccionados del promotor TNF-a y el AIG en cuestión) para la - inserción direccional eficiente se listan a continuación y se demuestran en la Figura 8: Esquema 1 : ETAPA 1: Inserción del promotor TNF-a (-120 a TSS) en el vector (Promega) luciferasa básico (menos promotor) pGL3: Los elementos de los vectores básicos pGL3 que son usados para la construcción del gen quimérico T Fp-AIG se muestran a continuación: Kpnl.SacI.MluI.Nhel. Smal. Xhol. BglII .HindIII. [luciferasa] .Xbal El promotor terminal es la PCR amplificada que usa primeros que contienen sitios Xhol y BglII .HindI II, de manera que el Xhol está en el extremo 5' y los sitios BglII .HindIII estén al extremo de 3' del producto amplificado. Este fragmento se inserta en el polieniazador del vector básico pGL3 usando estos mismos sitios de restricción. Este constructo se refiere como "Ccnstructo Al" y es como sigue: Kpnl.SacI.MluI.NhelSmalXhol. (-120 a TSSBglII ) .HindIII . [luciferasa] . Xbal ETAPA 2: El fragmento incrementador (ER1 o ER2 ) es la PCR amplificada que usa el primero que contiene varios sitios de restricción. El fragmento resultante tendrá sitios de restricción Kpnl .AatlI .BssHII al extremo 5' y Nsl . Spe I .Mlul al extremo 3' como sigue: 5' Kpnl .AatlII .BssHII . (ER1 o ER2) .Nsil .Spel .Mlul 3". El fragmento se inserta en el "Constructo A 1" generado en la ETAPA 1 usando los sitios de restricción Kpnl y Mlul. Este constructo se refiere como "Constructo B 1" y es como sigue: Kpnl.AatlI.BssHII (ER1 o ER2 ), Nsil . Spel .Mlul .Nhel . Smal .Xhol (- 120 a TSS BglII) .HindIII. [luciferasa] .Xbal_ ETAPA 3: El fragmento incrementador TNFa (ER1 o ER2 ) se amplifica usando ios primeros que contienen los sitios de restricción AatlI y BssHII para generar el producto PCR como sigue: 5' AatII.(ERl o ER2).BssHII 3'. Este fragmento es clonado en el "Constructo Bl" usando los mismos sitios de restricción. Este constructo se refiere como "Constructo Cl" y es como sigue: ípnl.AatlI. (ER1 o ER2 ) . BssHII . (ER1 o ER2 ) .Nsil . Spel .Mlul . Nhel . Smal . Xhol (- 120 a TSS BglII) .HmdlII. [luciferasa] .Xbal ETAPA 4: El fragmento incrementador TNFa (ER1 o ER2) se amplifica usando los primeros que contienen los sitios de restricción Nsil y Spel para generar el producto PCR como sigue : 5' Nsil.(ERl o ER2).Spel 3'. Este fragmento se clonará en el "Constructo Cl" usando los mismos sitios de restricción.

Este constructo se refiere como "Constructo DI" y es como sigue : Kpnl.AatlI: (ER1 o ER2 ) .BssHII . (ER1 o ER2 ) .Nsil . (ER1 o ER2) .Spel.Mlul.Nhel. Smal.Xhol (-120 a TSSBglII) .HmdlII. [luciferasa] .Xbal ETAPA 5: Las regiones que codifican AIG.l o AIG.2 (preferidas pero no limitadas a AIG.l y AIG.2; alguna AIG de la lista puede usarse) son las PCR amplificadas que usan los primeros que contienen sitios de restricción BglII y Xbal que general el fragmento siguiente: 5' BgIII.(AIG.l o AIG.2).XbaI 3". Este fragmento se inserta en el "Constructo DI" usando los mismos sitios de restricción. El constructo de restricción se refiere como "Constructo El" y es como sigue: Kpnl.AatlI. (ERl o ER2 ) .BssHII . (ER1 o ER2 ) . sil . (ER1 o ER2) .Spel. lul.Nhel. Smal.Xhol. (-120 a TSS. BglII) [AIG.1 o AIG.2] . Xba Alternativamente el esquema 2 es como sigue: Esquema 2 : ETAPA 1: El mismo como en el esquema I apareciendo como "Constructo A 1", el cual es como sigue: Kpnl. Sacl .Mlul. Nhel. Smal. Xhol. (-120 a TSS BglII ) . HindIII . [luciferasa] .Xbal ETAPA 2: Inserción de MCS adicional. Dos oligonucleótidos complementarios fosforilados ) proporcionando Nhel . Scall .EcorV. AfIII .AatlI .Avrll . Spel . PvuII .Xhol se sintetizan usando fuentes comerciales. Estos oligonucleótidos son fortalecidos y después clonados en los sitios Nhel y Xhol del "Constructo A 1". El constructo resultante se refiere como "Constructo B2" y es como sigue: JKpnl.SacI.Mlul. Nhel .SacII :EcorV.AfIII .Aa lI .Avrll . Spel . PvuII . Xhol . -,-120 a TSS BglII) .HindIII. [luciferasa] .Xbal ETAPA 3: El fragmento incrementador TNF-a (ERi o ER2) se amplifica usando los primeros que contienen los sitios de restricción Spel.PvuII al extremo 5', y Xhol al extremo 3' para generar el producto PCR como sigue: 5' Spel.PvuII. (ER 1 o ER2 ) . Xhol 3' . Este fragmento es clonado en el "Constructo B2" usando sitios de restricción Spel y Xhol. Este constructo se refiere como "Constructo C2" y es como sigue : _ Kpnl. Sacl.Mlul. Nhel. SacII .EcorV.AflII .AatlI .Avrll . Spel. PvuII: (Eri o EP.2 i Xhol. (-120 a TSSBglII ) .HindIII . [luciferasa] . Xbal ETAPA 4: El fragmento incrementador TNF-a ÍER1 o ER2 ) se amplifica usando los primeros que contienen los sitios de restricción Avrll. Spel al extremo 5', y PvuII al extremo 3' para generar el producto PCR como sigue: 5' Avrll .Spel . (ER1 o ER2).PvuII 3'. Este fragmento se c.ona en el "Constructo C2" usando sitios de restricción Avrll y PvuII. Este constructo se refiere como "Constructo D2" y es como sigue: _Kpnl.SacI.Mlul. hel. ?acII . EcorV.AflII .AatlI .AvrlISpel . (Erl o ER2 i PvuII: (ER1 o ER2 Xhol. (-120 a TSS BglII ). HindIII . [luciferasa] .Xbal Asi, usando esta estrategia, al menos siete copias de las regiones mcrementadoras (ERl, ER2 o ER3, individualmente o en combinación) , una a la vez, se pueden agregar usando más de un sitio de restricción contracorriente de uno previo en la amplificación PCR de las regiones incrementadoras de selección.

Una vez que se agrega el numero deseado de copias de las regiones mcrementadoras, el AIG se inserta descendentemente del superpromotor como se describe en la ETAPA 5 del esquema 1.

La expresión mducible del gen quimérico TNFp-AIG es ensayada mediante transfección temporal de la misma linea celular. La expresión de la superficie celular del FasL mediante células transfectas es cuantificada usando anticuerpos enlazantes anti-FasL como se detecta mediante la inmunofluorescencia directa y mediante ia medición de inducción de la apoptosis de células Fas positivas.

Regulación de la expresión accionada por TNFp de un gen reportero. La región no traducida del gen TNFa juega un papel importante en la regulación de la biosintesis del TNF-a. Se involucra en la expresión de translación del gen TNF-a en estados normales no activados. Importantemente, estos elementos permiten la de-represión ocurrida cuando son activadas las células que producen TNF-a mediante estimulo externo (Han, J., et. al . , J. Immunol ogy, 1991, 146, 1843-1848; Crawford, F.K., et al . , J. Bi ol . Chem . , 1996, 271, 22383-22390) .

Se elaboran los constructos genéticos en los cuales la región no traducida 3' completa (SEC ID NO: 13) se inserta descendentemente del gen luciferasa accionada por los fragmentos de supresión, bis, -120, -706 y -1005 del promotor TNF-a. Los resultados de la expresión temporal de estos constructos están resumidos en la Figura 9.

Protocolos de ensayo Métodos m vi tro .

Ensayo luciferasa: Se determinó la actividad luciferasa usando reactivos comercialmente disponibles iPro eqai .

Expresión del gen AIG.l y AIG.2: a) Se desarrollaron manchados Western de lisados de células transfectadas, usando anticuerpos ant?-CPP32 asi ;amb?én como anticuerpos anti-PRAP. Ei anticuerpo anti-PRAP detectó ambos hidrolizados, asi también como productos no hidrolizados del PRAP como una acción enzimat ca del CPP32. b) Ensayo de la enzima CPP32: Este ensayo detecto la reacción enzimática del CPP32 y la desintegración del substrato fluorogénico o colopmetrico . Se uso un equipo comercialmente disponible (Clonotech, Pnarmmgen) para este ensayo. c) Apoptosis de células transfectadas: La apoptosis de células transfectadas debido al AIG.l y AIG.2 se determino mediante el teñido del núcleo por yoduro de propidio (Krishan, A., J. Cell Bio. 66, 1994, 188-193) y por el equipo de Elisa de Muerte Celular, comerciaimente disponible (Boehringer Mannheim) Modelos animales El modelo conejo de artritis inducida por IL-1 (Pettipher E.R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 1986, 83, 8749-8753) : El 11-1 se inyecta en las articulaciones de la rodilla de conejos blancos de Nueva Zelanda. La inyección intra-articular de IL-1 causa infiltración de dosis dependiente de leucocitos en el espacio de la articulación y una pérdida del proteoglicano a partir del cartílago articular. La artritis inducida por el antigeno: inyección intra-articular del antigeno (ovalbúmma) en articulaciones de la rodilla, induce la acumulación de leucocitos y degradación del cartílago que se asemeja cercanamente a la artritis reumatoidea en humanos. La expansión o dilatación de las articulaciones después de ia inyección se sostuvo por 14 dias.

El modelo de smoviocitos humanos de ratón Scid ÍHouri J.M., et al., Current Opimons m Rheumatol., 1995, 7, 201-205; Sack U., et al., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58; Geiler T., et al. , Arhritis & Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671); Estos son modelos desarrollados recientemente para artritis, en los cuales el tejido smovial fresco ae paciente RA se implanta con cartílago humano normal en ratones scid ya sea subcutáneamente, ba o la capsula renal (Geiler T., et al . , Artnp ti s & Rheuma ti sm, 1994, 37, 1664-1671), o en las articulaciones de la rodilla (Sack U., et al . , J. Autoimmuni ty, 1995, 9, 51-58). Los implantes crecieron con características similares a la artritis, incluyendo la formación de tejido paño de alta densidad celular, erosión del cartílago y del hueso, desarrollo ae células gigantes ultmucleares, e invasión del cartílago por el fibroblasto sinovial.

Método indirecto: Los smoviocitos se transfectaron m vi tro con el gen terapéutico y se implantaron nuevamente en conejos. Se induce la artritis en estos conejos mediante la inyección de IL-1 y la expresión del gen terapéutico después que la activación es valorada. La expresión inducida por activación del gen quimérico, induce la apoptosis en células implantadas.

Método directo: Inyección mtra-articular de los genes quiméricos. Se pueden usar algunos de los metoaos de liberación del gen descritos anteriormente, que incluyen DNA plasmidio puro o simple, liberación mediada del liposoma cationico. Para uso de la liberación a case de un vector viral, se clonan en vectores adecuados los genes quiméricos. Los vectores son modificados entonces por la eliminación del promotor eucapótico presente en estos vectores. La inyección intra-articular ae los genes terapéuticos insertados en los vectores apropiados, puede entonces hacer la valoración terapéutica asi también como ia eficacia profiláctica.

EJEMPLO 3 Selección de las Variantes de Células Somáticas no productoras de TNF-a Las células (THP-1, Jurkat) son transfectadas establemente m vi tro con el gen quimérico TNFp-AIG. Después de varios ciclos de estimulación, los cuales inducen la apoptosis en las células que expresan el gen TNFp-AIG, se colectan entonces las células sobrevi ientes. Se construye una biblioteca cDNA a partir de estas células, las cuales se usan para clonación funcional (Legerski R y Peterson C, Na ture, 1992, 359, 70-73; Jaattela M., et al . , Oncogene, 1995, 10, 2297-2305) .

EJEMPLO 4 Identificación y Caracterización de los Genes Negativos Dominantes (DN) Las células THP-1 y Jurkat transfectadas establemente con TNFp-AIG son sometidas a ciclos repetidos de estimulación para activar la expresión del TNFp-AIG. Las células, las cuales no expresaban los genes reguiadores negativos, se sometían a apoptosis, mientras aquellas que expresaban los genes negativos dominantes sobrevivían. En estas células sobrevivientes, los productos del gen DN actúan in-trans con el promotor TNF-a, con ello, inhiben su activación al transcribir AIG, finalmente, resultando en el fenotipo de sobrevivencia. La biblioteca cDNA se construye usando mRNA poliadenilado a partir de estas células. Los genes DN los cuales rescatan las células THP-1 o Jurkat TNFp-AIG trasnfectadas a partir de la apoptosis, son identificadas mediante clonación funcional como se describe para otros genes (Legerski R. y Peterson C, Na ture, 1992, 359, 70-73; Jaattela M., et al . , Oncogene, 1995, 10, 2297-2305) .

La descripción anterior es para el propósito de mostrar al experto en la técnica como practicar la presente invención, y no está sugerida para detallar todas las modificaciones y variaciones obvias las cuales llegan a ser aparentes al experto sobre la lectura de la descripción. Verdaderamente, sin embargo, todas las modificaciones y variaciones obvias se incluyen dentro del ámbito de la presente invención, el cual está definido por las siguientes reivindicaciones. Las reivindicaciones están pensadas por cubrir los componentes y etapas reivindicadas en algunas de las secuencias las cuales son efectivas para sugerir los objetivos pensados, a menos que el ccntexto específicamente indique lo contrario.

Los documentos aqui citados, están expresamente incorporados en su totalidad para referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS il) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Revati J. Tatake, Steven D. Marlm y Randall W. Barton (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Apoptosis Auto-Regulada de Células Inflamatorias Mediante Terapia de Gen iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 13 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Boehringer Ingelheim Corporation (B) CALLE: 900 Ridgebury Road, P.O. Box 368 (C) CIUDAD: Ridgefield (D) ESTADO: Connecticut (E) PAÍS: Estados Unidos de América (F) CÓDIGO POSTAL: 06877-0368 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Diskette 3.5" 1.44 Mb (B) COMPUTADORA: IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) SOFTWARE: Procesador Word (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Se asignará (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Junto con esta (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 60/038,266 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-FEB-1997 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Robert P. Raymond (B) NUMERO DE REGISTRO: 25089 (C) NUMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: 9/121PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) NUMERO DE TELEFONO: 203-798-4865 (B) NUMERO DE TELEFAX: 203-791-6183 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: i: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1178 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE / CLAVE : promotor TNFa humano de referencia (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: Takashiba, S., et al. (B) DIARIO: Gen (C) VOLUMEN: 131 (D) PAGINAS: 307-308 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:l: GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA 50 GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGQCCACAT GTAGCGGCTC 100 TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 150 GTAGGAGAAT GTCCAGGsCT ATGGAAGTCG AGTATCGGGG ACCCCCCCTT 200 AACGAAGACA GGGCCATGTA GAGGGCCCCA GGGAGTGAAA GAGCCTCCAG 250 GACCTCCAGG TATGGAATAC AGGGGACGTT TAAGAAGATA TGGCCACACA 300 CTGGGGCCCT GAGAAGTGAG AGCTTCATGA AAAA?ATCAG GGACCCCAGA 350 GTTCCTTGGA AGCCAAGACT GAAACCAGCA TTATGAGTCT CCGGGTCAGA 400 ATGAAAGAAG AAGGCCTGCC CCAGTGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 450 TCACTCCCCG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 500 TCCTGAGGCC TCAAGCTGCC ACCAAGCCCC CAGCTCCTTC TCCCCGCAGA 550 CCCAAACACA GGCCTCAGGA CTCAACACAG CTTTTCCCTC CAACCCCGTT 600 TTCTCTCCCT CAAGGACTCA GCTTTCTGAA GCCCCTCCCA GTTCTAGTTC 650 TATCTTTTTC CTGCATCCTG TCTGGAAGTT AGAAGGAAAC AGACCACAGft 700 CCTGGTCCCC AAAAGAAATG GAGGCAATAG GTTTTGAGGG GCATGGGGAC 750 GGGGTTCAGC CTCCAGGGTC CTACACACAA ATC?GTCAGT GGCCCAGAAG 800 ACCCCCCTCG GAATCGGAGC AGGGAGGATG GGGAGTGTGA GGGGTATCCT 850 TGATGCTTGT GTGTCCCCAA CTTTCCAAAT NCCCGCCCCC GCGATGGAGA 900 AGAAACCGAG ACAGAAGGTG CAGGGCCCAC TACCGCTTCC TCCAGATGAG 950 CTTATGGGTT TCTCCACCAA GGAAGTTTTC CGCTGGTTGA ATGATTCTTT 1000 CCCCGCCCTC CTCTCGCCCC AGGGACATAT AAAGGCAGTT GTTGsCACAr 1050 CCAGCCAGCA GACGCTCCCT CAGCAAGGAC AGCAGAGGAC CAGCTAAGAG 1100 GGAGAGAAGC AACTGCAGAC CCCCCCTGAA AACAACCCTC AGACGCCACA 1150 TCCCCTGACA AGCTGCCAGG CAGGTTCT 1178 ;3) FORMACIÓN PARA LA ?EC ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1096 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA ;ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen promotor TNFa humano ;x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (D) AUTORES: Takashiba, S., et ai. (E) DIARIO: Gen (F) VOLUMEN: 131 (G) PAGINAS: 307-308 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: GAGGCCGCCA GACTGCTGCA GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA 50 AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT 100 ATGGCCACAT GTAGCGGCTC TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG 150 AGATGTGACC ACAGCAATGG GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ?TGGAAGTCG 200 AGTATGGGGA CCCCCCCTTA ACGAAGACAG GGCCATGTAG AGGGCCCCAG 250 GGAGTGAAAG AGCCTCCAGG ACCTCCAGGT ATGGAATACA GGGGACGTTT 300 AAGAAGATAT GGCCACACAC TGGGGCCCTG AGAAGTGAGA GCTTCATGAA 350 AAAAATCAGG GACCCCAGAG TTCCTTGGAA GCCAAGACTG ???CCAGCAT 400 TATGAGTCTC CGGGTCAGAA TGAAAGAAGA AGGCCTGCCC CAGTGGGGTC 450 TGTGAATTCC CGGGGGTG?T TTCACTCCCC GGGGCTGTCC CAGGCTTGTC 500 CCTGCTACCC CCACCCAGCC TTTCCTGAGs CCTCA?GCCT GCCACCAAGC 550 CCCCAGCTCC TTCTCCCCGC AGGGACCCAA ACACAGGCCT CAGGACTC?? 600 CACAGCTTTT CCCTCCAACC CCGTTTTCTC TCCCTCAAGG ACTCAGCTTT 650 CTGAAGCCCC TCCCAGTTCT AGTTCTATCT TTTTCCTGCA TCCTGTC GG 700 AAGTTAGAAG GAAACAGACC ACAGACCTGG TCCCCAAAAG AA?TGGAGGC 750 AATAGGTTTT GAGGGGCATG GGGACGGGGT TCAGCCTCCA GGGTCCTACA 800 CACAAATCAG TCAGTGGCCC AGAAGACCCC CCTCGGAATC GGAGCAGGGA 850 GGATGGGGAG TGTGAGGGGT ATCCTTGATG CTTGTGTGTC CCCAACTTTC 900 CAAATCCCCG CCCCCGCGAT GGAGAAGAA? CCG?GACAGA ?GGTGCAGGG 950 CCCACTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG 1000 TTTTCCGCTG GTTGAATGAT TCTTTCCCCG CCCTCCTCTC GCCCCAGGG? 1050 CATATAAAGG CAGTTGTTGG CACACCCAGC CAGCAGACGC TCCCTC 1096 !4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 139 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/ CLAVE : promotor TNFa mínimo nativo u or iginal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50 CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100 AGGCAGTTGT ATGGCACACC CGCCAGCAGA CGCTCCCTC 3.39 (5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 4 : (1) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 904 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFpl20 AIG.l (D) OTRA INFORMACIÓN: Los residuos 1 a 139 comprenden la secuencia promotora; los residuos 140 a 151, la secuencia enlazadora, y los residuos restantes, comprenden la secuencia AIG.1. ¡xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4: CCGCTTCCTC CAGATGAGCT C?TGGGTTTC TCC?CCAAGG AACTTTTCCG 50 CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCC?C GG?CATATA? 100 AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAG? CGCTCCCTC? GCAG?TCC?C 150 CATGTCTGGA ATATCCCTGG ACAACAGTT? TAAAATGG?T T?TCCTGAGA 200 TGGGTTTATG TATAATAATT AATAAT??GA ATTTTC?T?? ??GC?CTGGA 250 ATGACATCTC GGTCTGGTAC AGATGTCGAT GC?GCAAACC TCAGGGAAAC 300 ATTCAGAAAC TTGAAATATG AAGTCAGGAA TAAAA?TG?T CTT?C?CGTG 350 AAGAAATTGT GGAATTGATG CGTGATGTTT CTA?AGAAGA TCACAGCAA? 400 AGGAGCAGTT TTGTTTGTGT GCTTCTGAGC C?TGGTGAAG AAGGAAT??T 450 TTTTGGAACA AATGGACCTG TTGACCTGAA AAAAATA?C? ??CTTTTTCA 500 GAGGGGATCG TTGTAGAAGT CTAACTGGAA AACCCAAACT TTTC?TTATT 550 CAGGCCTGCC GTGGTACAGA ACTGGACTGT GGC?TTGAGA CAG?CAGTGG 600 TGTTGATGAT GACATGGCGT GTCATAAAAT ACCAGTGGAG GCCGACTTCT 650 TGTATGCATA CTCCACAGCA CCTGGTTATT ATTCTTGGCG AAATTCAAAG 700 GATGGCTCCT GGTTCATCCA GTCGCTTTGT GCCATGCTG? ?ACAGTATGC 750 CGACAAGCTT GAATTTATGC ACATTCTTAC CCGGGCTAAC CGAAAGGTGG 800 CAACAGAATT TGAGTCCTTT TCCTTTGACG CTACTTTTC? TGCAAAGAAA 850 CAGATTCCAT GTATTGTTTC CATGCTCAC? ?AAGAACTCT ?TTTTTATCA 900 CTAA 904 NFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1490 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFp706 AIG.l (B) OTRA INFORMACIÓN: Los residuos 1 a 724 comprenden la secuencia promotora: los residuos 725 a 736, la secuencia enlaz;adora, y los residuos restantes, comprenden la secuencia AIG.1. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50 GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100 TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150 TTCCTGAGGC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 200 GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 250 GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 300 TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 350 AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 400 GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 450 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650 TTTCcccscc CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC 750 CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA 800 TA?TTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT 850 GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA 900 ?TATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT 950 TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAQGAG CAGTTTTGTT 1000 TGTGTGCTTC TGAGCCATGG .TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAA?TGG 1050 ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1100 GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTC? TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1150 ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1200 GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1250 CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1300 ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT TGCTGAAACA GTATGCCGAC AAGCTTGAAT 1350 TTATGCACAT TCTTACCCGG GCTftACCGAA AGGTGGCAAC AGA?TTTGAG 1 00 TCCTTTTCCT TTGACGCTAC TTTTCATGCA AAGAAACAGA TTCCATGTAT 1450 TGTTTCCATG CTCACAAAAG AACTCTATTT TTATCACTAA 1 90 ;7) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1789 (B) TIPO: ácido nucleico ¡O TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFpl005 AIG.l (B) OTRA INFORMACIÓN: Los residuos 1 e. 1023 comprenden la secuencia promotora; los residuos 1024 a 1036, la secuencia enlazadora, y los residuos restantes comprenden la secuencia AIG.l.

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6 GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50 AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100 AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150 GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200 CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250 GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300 CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350 AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400 CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450 TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500 GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550 GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600 TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650 AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700 GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950 TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGAC? TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1 000 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC 1 050 CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAG?TGGGT TTATGTATAA 1100 TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ?TCTCGGTCT 1 150 GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGA? 1200 ?TATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ?CGTGAAGAA ATTGTGG??T 1250 TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATC?C? GCAAAAGG?G CAGTTTTGTT 13 00 TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGA?GAAGG? ATAATTTTTG G?ACAAATGG 13 50 ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG G?TCGTTGTA 14 00 GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1450 ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1500 GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1550 CAGCACCTGG TTATTATTCT TGsCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1600 ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT GCTGAAACAG TATGCCGACA AGCTTGAATT 1650 TATGCACATT CTTACCCGGG CTAACCGAAA GGTGGCAACA GAATTTGAGT 1700 CCTTTTCCTT TGACGCTACT TTTCATGCAA AGAAACAGAT TCCATGTATT 1 50 GTTTCCATGC TCACAAAAGA ACTCTATTTT T?TCACTAA 1789 NFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1008 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (íx) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFpl20 AIG.2 (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos 1 a 138 comprenden la secuencia promotora, los residuos 139 a 150, la secuencia enlazadora, y los residuos restantes comprenden la secuencia AIG.2 ¡xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG CTGGTTGAAT AAGTTTTCCG GATTCTTTCC 50 CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG AGGCAGTTGT GGACATATAA TGGCACACCC 100 AGCCAGCAGA GCTCCCTCAG ATGGCTGGAC CAGATCCACC CACCTGAGTC 150 AGCAGAATCT ACAGATGCCC TCCTCATGAA TCAAGCTTTG GAATTCCTGA 200 GACTATGTAA AGAAAGAGCT ACCCAATAAA GAAGAGATCT GGAGAGAAAC 250 AACCGCACAC GCCTGGCTCT CATCATATGC AATACAGAGT 300 TTGACCATCT GCCTCCGAGG AATGGAGCTG ?CTTTGACAT CACAGGGATG AAGGAGCT?C 350 TTGAGGGTCT GGACT?T?GT GTAGATGTAG AAGAGAATCT 400 GACAGCCAGG GATATGGAGT CAGCGCTGAG GGC?TTTGCT ACCAGACCAG AGCACAAGTC 450 CTCTGACAGC ACATTCTTGÍ T?CTCATGTC TCATGGCATC CTGGAGGGAA 500 TCTGCGGAAC TGTGCATG?T CAGATGTGCT GAGAAAAAAC GCTTTATGAC 550 ACCATCTTCC AGAT?TTCA? TGCCTCAGTC CAACCGCA?C TGAAGGACAA 600 ACCCAAGGTC ATCATTGTC AGGTGCAAAC AGGCCTGCAG CGTGGGGAAC 650 TGTGGGTCAG AG?CTCTCC? AAGTGGCCTC GCATCCTTGG TTCACAGTCA 700 TCTGAGAACC TGGAGG??G? AAGACCCACG 7G TGTTTAC TGGAGAAGGA 750 CTTC?TTGCT TTCTGCTCTT CAACGTGTCC CAACGCCACA TGGAGAGACA 800 T»""? *? "** **•/•"• GCACAATGGG CTCTATCTTC ?TCACACAAC TCATCACATG TATTCTTGGT GCTGCCAC T AGAGGAAGT? 900 TTTCGGAAGG TACAGCAATC ATTTGAAACT CCAAGGGCCA AAGCTCAAAT 950 GCCCACCATA GAACGACTGT CCATGACAAG AT?TTTCTAC CTCTTTCCTG IODO scAATTGA j Q y 1008 (9) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1587 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFp706 AIG.2 (B) OTRA INFORMACIÓN: Los residuos 1 a 724 comprenden la secuencia promotora; los residuos 725 a 736 la secuencia enlazadora, y los residuos restantes comprenden la secuencia AIG.2. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50 GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100 TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150 TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT TCTCCCCGCA 200 GGGACCCAAA CACAGGCCTC AGGACTCAAC ACAGCTTTTC CCTCCAACCC 250 CGTTTTCTCT CCCTCAAGGA CTCAGCTTTC TGAAGCCCCT CCCAGTTCGA 300 GTTCTATCTT TTTCCTGCAT CCTGTCTGGA AGTTAGAAGG AAACAGACCA 350 CAGACCTGGT CCCCAAAAGA AATGGAGGCA ATAGGTTTTG AGGGGCATGG 400 GGACGGGGTT CAGCCTCCAG GGTCCTACAC ACAAATCAGT CAGTGGCCCA 450 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650 TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 750 TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 800 TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 850 AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 900 CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT GACATCACAG GATGAAGGAG 950 TACTTGAGGG TCTGGACTAT GTGTAGATGT GAAGAGAATC GACAGCCAGG 1000 ATATGGAGTC AGCGCTGAGG GCATTTGCTA CCAGACCAGA GCACAAGTCC 1050 TCTGACAGCA CATTCTTGGT ACTCATGTCT C?TGGCATCC TGGAGGGAAT 1100 CTGCGGAACT GTGCATGATG AGAAAAAACC AGATGTGCTG CTTTATGACA 1150 CCATCTTCCA GATATTCAAC AACCGCAACT GCCTCAGTCT GAAGGACAAA 1200 CCCAAGGTCA TCATTGTCCA GGCCTGCAGA GGTGCAAACC GTGGGGAACT 1250 GTGGGTCAGA GACTCTCCAG CATCCTTGGA AGTGGCCTCT TC?CAGTCAT 130 CTGAGAACCT GGAGGAAGAT GCTGTTTAC? AGACCC?CGT GGAGAAGGAC 1350 TTCATTGCTT TCTGCTCTTC AACGCCACAC AACGTGTCCT GGAGAGACAG 1 00 CACAATGGGC TCTATCTTCA TCACACAACT CATCACATGC TTCC?GAAAT 1450 ATTCTTGGTG CTGCCACCTA GAGGAAGTA TTCGGAAGGT ACAGCAATC? 1500 TTTGAAACTC CAAGGGCCAA AGCTCAAATG CCCACCATAG AACGACTGTC 1550 CATGACAAGA TATTTCTACC TCTTTCCTGG CAATTGA 15B7 (10) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1894 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (C) NOMBRE/CLAVE: gen quimérico TNFpl005 AIG.2 (D) OTRA INFORMACIÓN: Los residuos 1 a 1024 comprenden la secuencia promotora; los residuos 1025 a 1036 la secuencia enlazadora, y los residuos restantes comprenden la secuencia AIG.2. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50 AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100 AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150 GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200 CTCCAGGT?T GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250 GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300 CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350 AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGsTGATTT 400 CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450 TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500 GGACCCAAAC ACAGGCCTCA -GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550 GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600 TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAOAAGGA AACAGACCAC 650 AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700 GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950 TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1000 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAG? TCCACCATGG CTGGACCACC 1050 TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 1100 TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGACCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 1150 AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAsTTTGA 1200 CCATCTGCCT CCGAGCAATG GAGCTGACTT TGACATCACA GGGATGAAGG 1250 AGCTACTTGA GGGTCTGGAC TATAGTGTAG ATGTAGAAGA GAATCTGACA 1300 GCCAGGGATA TGGAGTCAGC GCTGAGGGCA TTTGCTACCA GACCAGAGCA 1350 CAAGTCCTCT GACAGCACAT TCTTGGTACT CATGTCTCAT GGCATCCTGG 1400 AGGGAATCTG CGGAACTGTG CATGATGAGA AAAAACCAGA TGTGCTGCTT 1450 T?TGACACCA TCTTCCAGAT ATTCAACAAC CGCAACTGCC TCAGTCTGAA 1500 GGACAAACCC AAGGTCATC? TTGTCCAGGC CTGCAGAGGT GCAAACCGTG 1550 GGGAACTGTG GGTCAGAGAC TCTCCAGCAT CCTTGG?AGT GGCCTCTTCA 1600 CAGTCATCTG AGAACCTGGA GGAAGATGCT GTTTACAAGA CCC?CGTGGA 1650 GAAGGACTTC ATTGCTTTCT GCTCTTCAAC GCCACACAAC GTGTCCTGG? 1700 GAGACAGCAC AATGGGCTCT ATCTTCATCA CACAACTCAT CACATGCTTC 1750 CAGAAATATT CTTGGTGCTG CCACCTAGAG GAAGTATTTC GGAAGGTACA 1800 GCAATCATTT GAAACTCCAA GGGCCAAAGC TCAAATGCCC ACCAT?GAAC 1850 QGACTGTCCAT GACAAGATAT TTCTACCTCT TTCCTGGCAA TTG? 1B94 (11) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 123 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: región 1 incrementadora del promotor TNFa (ER1) . ¡xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: GGGGCOGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC 50 TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG ' 100 GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATG 123 0 (12) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 190 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (C) NOMBRE/CLAVE: región 2 incrementadora del promotor TNFa ¡xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50 GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100 TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150 TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT 1 0 (13) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1223 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (C) NOMBRE/CLAVE: sitios de clonación múltiples (D) OTRA INFORMACIÓN: los sitios de clonación múltiples diseñados genéticamente contracorriente del promotor TNFa mínimo en el constructo -120pGL3. (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12: GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCGCG GATATCTTAA GACGTCCTAG 50 GACTAGTCAG CTGCTCGAGC CGCTTCCTCC AGATGAGCTC ATGGGTTTCT 100 CCACCAAGGA AGTTTTCCGC TGGTTGAATG ATTCTTTCCC CGCCCTCCTC 150 TCGCCCCAGG GACATATAAA GGCAGTTGTT GGCACACCCA GCCAGCAGAC 200 GCTCCCTCAG CAGATCTAAG CTT 223 (14) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 787 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIPCIÓN: DNA (ix) CARACTERÍSTICA: (C) NOMBRE/CLAVE: región no traducida TNFa (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13: TCTAGAGGAG GACGAACATC CAACCTTCCC AAACGCCTCC CCTGCCCCAA 50 TCCCTTTATT ACCCCCTCCT TCAGACACCC TCAACCTCTT CTGGCTCAAA 100 AAGAGAATTG GGGGCTTAGG GTCGGAACCC AAGCTTAGAA CTTTAAGCAA 150 CAAGACCACC ACTTCGAAAC CTGGGATTCA GGAATGTGTG GCCTGCACAG 200 TGAAGTGCTG GCAACCACTA AGAATTCAAA CTGGGGCCTC CAGAACTCAC 250 TGGGGCCTAC AGCTTTGATC CCTGACATCT GGAATCTGGA GACCAGGGAG 300 CCTTTGGTTC TGGCCAGAAT GCTGCAGGAC TTGAGAAGAC CTCACCTAGA 350 AATTGACACA AGTGGACCTT AGGCCTTCCT CTCTCCAGAT GTTTCCAGAC 400 TTCCTTGAGA CACGGAGCCC AGCCCTCCCC ATGGAGCCAG CTCCCTCTAT 450 TTATGTTTGC ACTTGTG?TT ATTTATTATT TATTTATTAT TTATTTATTT 500 ACAGATGAAT GTATTTATTT GGGAGACCGG GGTATCCTGG GGGACCCAAT 550 GTAGGAGCTG CCTTGGCTC? GACATGTTTT CCGTG?AAAC GGAGCTGAAC 600 AATAGGCTGT TCCCATGTAG CCCCCTGGCC TCTGTGCCTT CTTTTGATTA 650 TGTTTTTTAA AATATTTATC TGATTA?GTT GTCTAAACAA TGCTGATTTG 700 GTGACCAACT GTCACTCATT GCTG?GCCTC TGCTCCCCAG GGG?GTTGTG 750 TCTGTAATCG CCCTACTATT CAGTGGCGAG ?TCTAGA 787 Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito ia invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Un gen quimérico caracterizaao porque comprende al menos un incrementador promotor unido a una copia funcional de un promotor TNFa inimo y ademas umao al menos a una copia de un gen que induce apoptosis, en donde la expresión del gen que induce apoptosis es accionada por el promotor TNFa.
2. 2. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unión del incrementador al promotor y del promotor al gen que induce apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de unión directa, unión distal, unión próxima y combinaciones de las mismas.
3. 3. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende 2 o más copias del mcrementador promotor TNFa.
4. 4. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mcrementador promotor INFa es la SEC ID NO: 10 o la SEC ID NO: 11, o fragmentos funcionales o variantes del mismo.
5. 5. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor TNF-a se selecciona a partir del grupo que consiste de la SEC ID NO:l, la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 3, y fragmentos funcionales o variantes del mismo.
6. 6. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen que induce apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de Caspasa-1, Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-4, Caspasa-5, Caspasa-6, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Caspasa-10, Granzyma A, Granzima B, ligando F, y fragmentos funcionales, variantes y mezclas de algunos de estos.
7. 7. Un gen de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque ei gen que induce apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste de Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzima B y fragmentos funcionales, variantes y mezclas de algunos de estos.
8. 8. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona a partir del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, ?EC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, y fragmentos funcionales o variantes del mismo.
9. 9. Un gen de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona a partir del grapo que consiste de la SEC ID NO:4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SE ID NO: 7, ?EC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, y fragmentos funcionales o variantes del mismo, en donde el 3'UTR del gen TNFa esta ligado descendentemente del gen que induce apoptosis.
10. 10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un gen de conformidad con la reivindicación 1.
11. 11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un gen de conformidad con la reivindicación 9.
12. 12. Un método para tratar una enfermeaaa inflamatoria en un paciente, caracterizado porque comprenae la etapa de inducir la apoptosis en células inflamatoi las o células a un sitio de la inflamación del paciente mecíante la introducción en las células de un gen quimérico ae conformidad con la reivindicación 1.
13. 13. Un método de conformidaa ccn la reivindicación 12, caracterizado porque la induccior de la apoptosis no induce una respuesta inflamatoria en el paciente .
14. 14. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula inflamatoria es una célula que produce TNFa.
15. 15. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las enfermeaades inflamatorias se seleccionan a partir del grupo que consiste de artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, síndrome Guillam-Barre, mal de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis, enfermedad del huésped contra el implante, lupus eritematosos, diabetes melitus dependiente de la insulina, artritis psoriática, sarcoidosis, pneumonitis hipersensitiva, espondilitis alquilosante, síndrome Reiter, y esclerosis sistémica.
16. 16. Un método de conformidad con ia reivindicación 15, caracterizado porque el mal inflamatorio es la artritis reumatoidea.
17. 17. Un gen quimérico, caracterizado porque comprende de 2 a 10 casetes de un incrementador promotor TNFa unido al menos a una copia de un promotor TNFa mínimo, y al menos a una copia de un gen que induce apoptosis, seleccionado a partir del grupo que consiste de Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzima B y fragmentos funcionales, variantes y mezclas de algunos de estos, en donde la expresión del gen que induce apoptosis es accionada por el promotor TNF.
18. 18. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un gen de conformidad con la reivindicación 17.
19. 19. Un método para inducir la apoptosis en una célula inflamatoria que produce TNFa, caracterizado por la mtroauccion en la célula de un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 17.
20. 20. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un paciente, caracterizado porque comprende inducir la apoptosis en células inflamatorias o en células al sitio de la inflamación del paciente mediante la introducción en las células de un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 17 sin inducir una respuesta inflamatoria en el paciente.
21. 21. Un proceso para construir un gen quimérico, comprende al menos un mcrementador promotor TNFa undo a una copia funcional de un promotor TNFa mínimo y además unido al menos a una copia de un gen que induce la apoptosis, en donde la expresión del gen que induce la apoptosis es accionada por el promotor TNFa, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) amplificar un promotor TNFa mediante una reacción en cadena de la polimerasa usando primeros que abarcan les constructos de supresión del promotor TNFa: (b) clonación de los genes PCR amplificaaos obtenidos en la etapa (a) contracorriente de un gen reportero; 5 (c) ensayar los constructos odtenidos en la etapa (b) para su expresión constitutiva e mducible en al menos una linea celular que produce TNFa; (d) seleccionar el promotor TNFa responsable de 10 la expresión mducible del reportero en la linea celular; y ya sea (e) las regiones promotoras TNFa amplificanao la PCR que incrementan la expresión del reportero para obtener un mcrementador y 15 ligando al menos una copia del mcrementador contracorriente del promotor; o (f) insertar al menos una copia de un gen que induce la apoptosis de prodominio suprimido, 20 descendente ael promotor TNFa mediante el reemplazo del gen reportero con los constructos de supresión del gen que induce la apoptosis para obtener un gen quimérico o (g) la amplificación de la PCR en un TNFo-3'UTR 25 y ligando descendentemente el gen reportero o algunas combinaciones de estos procedimientos .
22. 22. Un proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizaao porque 2 o mas copias de los mcrementadores se insertan contracorriente ael promotor.
23. 23. Un procedimiento de conformidaa con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen reportero es la luciferasa.
24. 24. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el mcrementador comprende la SEC ID NO: 10 o la SEC ID NO: 11.
25. 25. Un proceso de conformidad ccn xa reivindicación 21, caracterizado porque el gen que induce la apoptosis de prodomimo suprimido se selecciona a partir del grupo que consiste de Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzima B, y fragmentos funcionales y variantes de los mismos. 27. Un proceso de conformidad con la reivindicación 21, para producir un gen seleccionado a partir del grupo que consiste de las SEC ID NO: 4, SEC ID N0:5, SEC ID NO:6, SEC ID N0:7, SEC ID N0:8, SEC ID NO:9 y fragmentos funcionales o variantes del mismo. 28. Un proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque las lineas celulares para el ensayo de los constructos se seleccionan a partir del grupo que consiste de linfoblastoides T, mielomonociticos, monociticos, fibroblastos y sinoviocitos humanos cultivados. 29. Un gen quimérico, caracterizado porque comprende : (a) al menos, un incrementador promotor unido a una copia funcional de un promotor mínimo, siempre que el promotor sea un gen o una combinación de genes activados en las células inflamatorias o en las células al sitio de la inflamación. (b) Unido además al menos a una copia de un gen que induce apoptosis en donde la expresión del gen que induce apoptosis se conduce por el promotor, y el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de citocinas, interleucinas y sus receptores, moléculas de adhesión celular y sus ligandos, quimocinas y sus receptores, enzimas pro- inflamatorias, y mezclas de las mismas. 31. Un gen de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el promotor se selecciona a. partir del grupo que consiste de TNFß, IL-la, IL-lß, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, interferon?, fragmentos funcionales y variantes de los mismos y mezclas de algunos ae estos. 32. Un gen de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de selectinas, integrinas, ICAM-1, V-CAM, fragmentos funcionales y variantes de los mismos, y mezclas de algunos de estos. 33. Un gen de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de MlP-la, MlP-lß, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, 1P10, Gro a-?, fragmentos funcionales y vanantes del mismo, y mezclas de algunos de estos. 34. Un gen de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de COX-2, iNOs, fosfoiipasas, proteasas, fragmentos funcionales y variantes del mismo, y mezclas de algunos de estos. 35. Un gen de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la unión del mcrementador al promotor y el promotor al gen que induce la apoptosis se selecciona a partir del grupo que consiste ae unión directa, unión distal, unión próxima, y combinaciones de los mismos. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la terapéutica de la apoptosis en células inflamatorias activadas, o en células al sitio ae la inflamación, mediante la introducción en aquellas células de un gen quimérico que contiene un gen que induce la apoptosis (AIG) accionado por un promotor de un gen mcucic_e activaao en la inflamación y de un incrementado! promotor de manera que las células inflamatorias son fijadas. En una modalidad, el gen quimérico comprende ai menos un incrementador promotor TNFa unido a una copia funcional ae un promotor TNFa mínimo y además unido al menos a una copia de un gen que induce apoptosis, en donde la expresión aei gen es accionada por el promotor TNFa. Se puede unir directo, dista!, próximo o en comoinaciones ae las mismas. Los e emplos ae genes que inducen apoptosis incluyen Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Granzima B. Ventajosamente, ei gen quimérico TNFp-AIG se expresa solamente en aquellas células que producen la citocma inflamatoria TNFa. Además, el gen quimérico TNFp-AIG también secuestra factores de transcripción TNFp maucibles, con ello reauce la producción enaogena de T?'Fa. La invención también se refiere a métodos de elarcra usar los genes quiméricos de la apoptosis auto resu_aaa composiciones farmacéuticas que ios contienen para tratamiento de una enfermedad inflamatoria.