MXPA99007688A - Anticuerpo monoclonales anti-cd23 humano gamma-1y gamma-3 y el uso de los mismos como agentes terapeuticos - Google Patents

Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales, los cuales se unen específicamente al CD23 humano al receptor de baja afinidad para la IgE (FceRII/CD23), y que contiene cualquiera de un dominio constante gamma-1 humano o gamma-3 humano. Los anticuerpos sonútiles para modular o inhibir la expresión de la IgE inducida. En consecuencia, tienen utilidad particular en el tratamiento o profilaxis de condiciones de enfermedad de la inhibición de la producción de la IgE inducida es terapéuticamente deseable, incluyendo condiciones alérgicas, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.

Description

i-NTICUERPOS MONOCLONAES ANTI-CD23 HUM&NO GAMMA-1 Y GAMMA-3 Y EL USO DE LOS MISMOS COMO AGENTES TERAPÉUTICOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona con anticuerpos monoclonales, los cuales se unen específicamente al CD23 humano, el receptor de baja afinidad para IgE (FceRII/CD23) , y que contiene un dominio constante gamma-1 humano o gamma-3 humano, y su uso como agentes terapéuticos.

Antecedes de la Invención La IgE es un miembro de la familia de la inmunoglobulina que media respuestas alérgicas tales como el asma, alergias a alimentos, hipersensibilidad del tipo 1 e inflamación del seno familiar con la rinitis alérgica y conjuntivitis, y como resultado, causa la difusión del sufrimiento a través de la población general. La IgE es secretada por, y expresada sobre la superficie de las células B. La IgE sintetizada por las células B puede anclarse a la membrana de las células B por medio de un dominio transmembranal corto ligado a la secuencia de la IgE madura. Las versiones membranal y secretada de la IgE se forman en la misma células pero empalmando de manera diferencial el transcripto de ARN de la IgE.

REF.: 31163 La IgE también puede unirse a las células B (y células T, monocitos, células de Langerhans, células dendriticas foliculares, células killer naturales, eosinófilos y plaquetas) a través de su región Fc a un receptor de IgE de baja afinidad (FceRII, aqui posteriormente "FCEL") , y a los mastocitos y a los basófilos a través de su región Fc al receptor de IgE de alta afinidad FceRI, (aqui posteriormente "FCEH") . El receptor de la IgE de baja afinidad se refiere de manera general en la literatura como CD23. Después de la exposición de un mamífero a un alérgeno, las células presentadoras de antigenos procesan el antigeno para presentarlos a las células T helper. Esas células T helper secretan citocinas tales como la IL-4 la cual ayuda a las células B a experimentar amplificación clonal y secretar IgE especifica más alergénica. Está IgE recién sintetizada a su vez es liberada a la circulación donde se une a los mastocitos y basófilos a través del receptor de alta afinidad sobre su superficie células. Tales mastocitos y basófilos son por lo tanto sensibilizados al alérgeno especifico. La exposición posterior al mismo alérgeno provoca la unión a la IgE especifica sobre la superficie de los mastocitos, y basófilos, reticulando por lo tanto el FceRI sobre esas células y activando de este modo su liberación de histamina y otros factores que son responsables de la hipersensibilidad y anafilaxis clínica. La técnica ha reportado anticuerpos capaces de unirse al FCEL (CD23) unido a la IgE pero no IgE unida al FCEH (véase, por ejemplo, WO 89/00138 y la Patente Estadounidense 4,940,782). Esos anticuerpos se describen como clínicamente ventajosos debido a que se unen a la IgE la cual se une al receptor de baja afinidad (FCEL) o a las IgE circulantes, pero no se unen a la IgE unida al receptor de alta afinidad (FCEH) . Por lo tanto, esos anticuerpos no activarán a los mastocitos o basófilos. Además, se ha reportado que los anticuerpos anti-CD23 tienen potencial como agente terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos alérgicos, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, Bonnefoy et al., WO 9612741, reporta que los ligandos que se unen al CD23, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, son útiles en el tratamiento o profilaxis de enfermedades inflamatorias, autoinumes y alérgicas. El uso de anticuerpos monoclonales para el CD23, tanto como agonistas como antagonistas de la IgE ya ha sido reportado. Se ha reportado que los antagonistas de la IgE tienen utilidad potencial en el tratamiento de condiciones o enfermedades donde las supresión de la IgE es terapéuticamente deseable, por ejemplo, condiciones alérgicas tales como la rinitis alérgica y la conjuntivitis, dermatitis atópica y asma. Por ejemplo, Bonnefoy et al., WO 8707302 (1987), reportan anticuerpos monoclonales para el CD23 humano, los cuales son utilizados acertadamente para ensayar la presencia de receptores de la IgE sobre tipos de células y como agentes terapéuticos en enfermedades donde la modulación de la IgE es terapéuticamente deseable. En parte debido a su potencial como agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico, muchos grupos han reportado la generación de anticuerpos monoclonales para el CD23. Véase, por ejemplo, Rector et al., Immunol . , 55:481-488 (1985); Suemura et al., J. Immunol . , 137:1214-1220 (1986); Noro et al., J. Immunol . , 137:1258-1263 (1986); Bonnefory et al., J. Immunol . , 138:2170-2178 (1987); Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1046 (1993); Sherr et al.; J. Immunol . , 142:481-489 (1989); y Pene et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 85:6880-6884 (1988). Además, como se discutió supra , también ha sido reportado el uso de tales anticuerpos especificamente para inhibir la producción de IgE en sistemas donde la sintesis de la IgE es inducida por citocina (IL-4) . (Flores-Romo et al (Id. ) ; Sherr et al (Id. ) ; Bonnefoy et al. (WO 8707302); Bonnefoy et al. (WO 8707302); Bonnefoy et al. (WO 9612741)); Bonnefoy et al., Eur . J. Immunol 20:139-144 (1990); Sarfati et al., J. Immunol 141:2195-2199 (1988) y Wakai et al., Hybridoma 12:25-43 (1993). También, Flores-Romo et al (Id. ) describen que los Fabs preparados a partir de anticuerpos anti-CD23 inhiben las respuestas de la IgE inducidas de manera especifica por antigenos in vivo en la rata. Sin embargo, a pesar de lo que ha sido reportado, el mecanismo mediante el cual los anticuerpos anti-CD23 modulan la expresión de la IgE y en particular, la forma en la cual bloquean la producción de IgE inducida por la IL-4 sigue sin aclararse. Se ha sugerido que los anticuerpos anti-CD23 inhiben la producción de IgE señalando a través del CD23 presente sobre la superficie de las células B que secreta el IgE. Se ha propuesto que la función del CD23, la cual es sobrerregulada sobre las células B que se secretan IgE, es la inhibición por retroalimentación de la producción de IgE (Yu, et al. Na ture 369, 753-756 (1994)). Esto ha sido utilizado debido a que en los ratones en los cuales el gen del CD23 ha sido removido tiene la producción de IgE mayor y sostenida en comparación con c »ontroles (Yu. Et al.). Además, se ha reportado que la unión al CD23 por complejos de IgE o por un anticuerpo monoclonal al anti-CD23 suprime la sintesis del IgE en curso por un linaje de células linfoblastoides que secreta de manera constitutiva IgE (Sher et al. (Id. ) ) . Parece ser que esto se debe a la desregulación del ARN mensajero por la cadena pesada de la IgE secretada en esta célula (Saxon et al., J. Immunol . , 147:4000-4006 (1991)). Sin embargo, el mecanismo exacto mediante el cual la expresión de la IgE es inhibida ya ha sido explicado en sistemas en los cuales la secreción de la IgE es inducida por la IL-4. También se ha reportado que la reticulación del Fc gamma RII con la Ig superficial (receptor células B) sobre las células B conduce a la desregulación de la expresión de la Ig. (D'Ambrosia et al. Science, 268:293-297 (1995). Puede proponerse un mecanismo similar para las células B que secretan IgE las cuales también tiene CD23 y Fc gamma RII en la superficie celular. Un anticuerpo anti-CD23 humano unido a una célula por un antigeno (CD23) y también unido al Fc gamma RII a través de interacciones de la Fc podria transmitir una señal para suprimir la secreción de IgE a través del Fc gamma RII. Han sido propuestos los mecanismos implicados en la inhibición de la IgE por anticuerpos anti-CD23 que incluyen el bloque de interacciones diferentes a la interacción entre el CD23 membranal y la IgE. Con relación a esto, el CD23, el cual es un miembro de la familia de la lectina tipo C, ha mostrado interactuar con varios otros ligandos tales como el CD21, CDllb y CDllc presentes sobre una variedad de tipos celulares, incluyendo las células T y monocitos. En este contexto el CD23 puede ser precedido como una molécula de adhesión celular.

Por lo tanto, se ha propuesto que la interacción CD21-CD23 puede estar implicada en la presentación de un antigeno y la producción de IgE subsecuente. Los modelos sugieren que el CD21 sobre las células B envian una señal de activación para la producción de IgE después de la unión al CD23 sobre células T activadas presentes principalmente en individuos atópicos. (Leconant et al., Immunol . , 88:35-39 (1996); y Bonnefoy et al., Int . Amer. Allergy Immunol . , 107:40-42 (1995)). El bloqueo de esta interacción con un anti-CD23 podria bloquear la producción de IgE inducida. (Aubry et al., Na ture, 358:505-507 (1992) e Immunol . , 5:944-949 (1993); Grosjean et al. (1992); Bonnefoy et al., Curr. Opin. Eur. J. Immunol . , 24:2982-298 (1994); Henchoz-Lecoanet et al., Immunol . , 88:35-39 (1996) Nambu et al., Immunol . Lett . , 44:163-167 (1995); Bonnefoy et al., In t . Amer. Allergy Immunol . , 107:40-42 (1995). También es posible que la presentación del antigeno sea sobrerregulada por el CD23 sobre las células B presentadoras de antigenos que se unen al CD21 sobre las células T. Otro mecanismo el cual podrían explicar potencialmente los efectos del CD23 sobre la producción de IgE implican formas solubles del CD23. Se ha reportado que el CD23 es escindido o separado de la superficie células liberando varias formas diferentes de CD23 soluble o factores que se unen a la IgE. (Sarfati et al., Immunol 53:197-205 (1984)). El CD23 soluble es una citocina, con una de sus actividades reportadas siendo el aumento de la producción de IgE inducida por la IL-4 de las células B. (Pene et al., J. Cell . Biochem . , 39:253-269 (1989); Pene et al., Eur. J. Immunol . , 18:929-935 (1988); Sarfati et al., J. Immunol . , 141:2195-2197 (1988); Sarfati et al. (1984) (Id. ) ; (Saxon et al., J. Clin . Immunol . Allergy, 86 (3 pt 1 ) 333-344 (1990). También, se ha reportado que ciertas formas del CD23 soluble inhiben la producción de IgE (Sarfati et al., Immunol 76:662-667 (1992) ) . En consecuencia, los anticuerpos anti-CD23 pueden bloquear potencialmente la producción de IgE 1) inhibiendo la IgE que aumenta los efectos del CD23 soluble y/o 2) bloqueando la liberación proteolitica del CD23 soluble de la superficie celular. De este modo, en base a lo anterior, está claro que existe una complejidad e incertidumbre significativas en la técnica con respecto a las funciones del CD23 más especificamente y los efectos sobre la producción de IgE, y ademas con respecto a los medios por los cuales los ligandos específicos afectan la producción de IgE.

Objetos de la Invención De este modo, un objeto de la invención es producir ligandos (anticuerpos) novedosos específicos para el CD23 y utilizar tales anticuerpos para descubrir el mecanismo mediante el cual los anticuerpos anti-CD23 modulan la expresión de la IgE. Otro objeto de la invención es producir ligandos (anticuerpos) novedosos los cuales se unan al CD23, en particular el CD23 humano, que tengan una mejor capacidad para inhibir la expresión de la IgE inducida. Un objeto más especifico de la invención es producir anticuerpos anti-CD23 humano que contengan dominios constantes gamma-1 humano o gamma-3 humano. Otro objeto de la invención es producir anticuerpos anti-CD23 humano multivalentes que puedan ser más efectivos en virtud de su mayor potencial para reticular el CD23 y los receptores Fc. Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que contengan anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos que comprendan dominios constantes gamma-1 o gamma-3 humanos, que sean capaces de inhibir la producción de IgE inducida. Otro objeto de la invención es utilizar un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano que comprende un dominio constante de gamma-1 humano o gamma-3 humano para el tratamiento o profilaxis de condiciones de enfermedad donde la inhibición de la producción de IgE inducida es terapéuticamente deseable.

IO De manera más especifica, un objeto de la invención es tratar o prevenir condiciones alérgicas, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano que comprende toda de un dominio constante gamma-1 humano o gamma-3 humano.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 compara la actividad inhibidora de la IgE in vi tro de un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano (MHM6) , para cinco anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos de primate (5E8, 6G5, 2C8, B3B11, y 3G12) ; La Figura 2 muestra que los anticuerpos monoclonales de primate 5E8 y 6G5 se unen a un epitopo sobre el CD23 humano que es distinto al del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano MHM6 comercialmente disponible (panel medio, figura 2) y que compiten entre si (panel inferior, figura 2) . Los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos de primate 2C8 y B3B11 compiten con el MHM6 del panel superior, figura 2) . La Figura 3 compara la actividad inhibidora de la IgE in vi tro de un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate particular 5E8 para cuatro versiones PRIMATIZED® diferentes del anticuerpo monoclonal de primate, las secuencias de las cuales se describen a continuación. p5E8G4P- Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene las siguientes secuencias: Región constante de la cadena ligera kappa humana y una región constante gamma-4 humana la cual contiene una mutación P (Angal et al., Mol . Immunol . , 30:105-108 ) 1993) ) ; p5E8G4PN- Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene la región constante de la cadena ligera kappa humana y una región constante gamma-4 humana que contiene una mutación P (Angal et al. Mol . Immunol . , 30:105-108 (1993)). Este anticuerpo también contiene una mutación en la región variable de la cadena pesada la cual cambia un residuo de asparagina (sitio de unión de carbohidrato potencial) a una lisina; p5E8Gl- Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene la región constante de la cadena ligera kappa humana y una región constante gamma-1 humana; p5E8GlN- Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene la región constante de la cadena ligera kappa humana y la región constante gamma-1 humana. Este anticuerpo también contiene una mutación en la región variable de la cadena pesada, la cual cambia un residuo de asparagina (sitio de unión de carbohidrato) a una lisina; La Figura 4 contiene una tabla la cual compara los Kd aparentes en nM de los anticuerpos identificados en la Figura 3 y resume su actividad supresora de IgE. Ls Figura 5 compara la actividad inhibidora de la IgE in vi tro de un anticuerpo monoclonal anti-CD23 de primate particular, 6G5, para dos versiones PRIMATIZED® diferentes del 6G5 las cuales se describen a continuación: p6G5Gl Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene la región constante de la cadena ligera lambda humana y la región constante gamma-1 humana; p6G5G4P Este anticuerpo PRIMATIZED® contiene la región constante de la cadena ligera lambda humana y la región constante gamma-4 humana con una mutación P (Angal et al. Mol . Immunol . , 30:105-108 (1993)); La Figura 6 compara la actividad inhibidora de la IgE ín vi tro del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano 2C8 para el F(ab')2 derivado del 2C8; La Figura 7 muestra que el F(ab')2 derivado del 2C8 antagoniza la supresión de la actividad de IgE in vi tro del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 2C8. La Figura 8 muestra la actividad inhibidora de la IgE in vivo de un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate particular, 5E8, en un modelo animal SCID; La Figura 9 compara la actividad inhibidora in vivo del anti-6G5 humano de primate y una versión PRIMATIZED® del mismo p6GSG4P. La Figura 10 muestra la actividad inhibidora de la IgE in vivo del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 y una versión PRIMATIZED® del mismo p6G5Gl.

Definición de los Términos Utilizados en Esta Solicitud Anticuerpo Quimérico : Un anticuerpo contaminante que contiene regiones de dos anticuerpos diferentes, usualmente anticuerpos de dos especies diferentes, de manera más típica secuencias variables de roedor y secuencias de dominio constante humano.

Anticuerpo Anti-CD23 Humano Gamma-1 Un anticuerpo que se une especificamente al CD23 humano, el cual contiene una región constante gamma-1 humana o un fragmento o modificación de la misma, el cual inhibe la producción de IgE inducida. Esto incluyen, en particular, anticuerpos que contienen los dominios variables o porciones de unión de antigeno de roedor o primate, anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano humanizados, PRIMATIZED® y humanos, los cuales comprenden un dominio constante gamma-1 humano, fragmento, o modificación del mismo, los cuales inhiben la producción de IgE inducida in ví tro.

Anticuerpo Anti-CD23 Humano Gamma-3 Un anticuerpo que se une especificamente al CD23 humano, el cual contiene una región constante gamma-3 humana o un fragmento o modificación de la misma, el cual inhibe la producción de IgE inducida. Esto incluye, en particular, * anticuerpos que contienen dominios variables o porciones de unión de antigeno de roedor o primate, anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos humanizados, PRIMATIZED® y humanos, los cuales comprenden un dominio constante gamma-3 humano, fragmento, o modificación del mismo, los cuales inhiben la producción de IgE inducida in vi tro.

Modificaciones de los Dominios Constantes del Anticuerpo Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención contienen mutaciones, sustituciones o supresiones de la región constante, que pueden crear un cambio deseado en el nivel de eficiencia, es decir en la unión del FcR, sin cambiar las funciones efectoras básicas mediadas por la región constante.

Anticuerpo PRIMATIZED® Un anticuerpo recombinante que contiene secuencias variables o porciones de unión de antigeno de primate, y secuencias de dominio constante humanas.

Anticuerpo Humanizado: Un anticuerpo recombinante que contiene una región variables o porción de unión de antigeno no humana la cual ha sido modificada para imitar de manera más exacta una región variable del anticuerpo humano y por lo tanto eliminar o reducir al minimo el potencial inmunogénico si se administra a humanos sin sacrificar la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina. Existen varios métodos conocidos de humanización, incluyendo, el "enchapado" el cual comprende seleccionar la modificación de residuos superficiales, reemplazo del marco, (injerto de CDR) y modelado molecular.

Dominio Constante Gamma-1 : Un tipo particular de secuencia de unión constante la cual confiere a un anticuerpo actividades efectoras especificas. En la presente solicitud, el dominio constante gamma-1 se refiere a un dominio constante gamma-1 humano, fragmento o modificación del mismo, el cual retiene las funciones efectoras del gamma-1 en combinación con las secuencias de dominio variable o porciones de unión de antigeno del anti-CD23. Las modificaciones incluyen dominios constantes gamma-1 humanos, las cuales comprenden la supresión, sustitución o adición de uno o más aminoácidos residuales. Esta función efectora es manifestada por la capacidad de un anticuerpo que contiene tal dominio constante para inhibir la producción de IgE inducida.

Dominio Constante Gamma-3 : Un tipo particular de secuencia de unión constante la cual confiere a un anticuerpo actividades efectoras especificas. En la presente solicitud, el dominio constante gamma-3 se refiere a un dominio constante gamma-3 humano, fragmento o modificación del mismo, el cual retiene las funciones efectoras del gamma-3 en combinación con . las secuencias de dominio variable o porciones de unión de antigeno del anti-CD23. Las modificaciones incluyen dominios constantes gamma-3 humanos, las cuales comprenden la supresión, sustitución o adición de uno o más aminoácidos residuales. Esta función efectora es manifestada por la capacidad de un anticuerpo que contiene tal dominio constante para inhibir la producción de IgE inducida.

CD23: Este se refiere al receptor de baja afinidad para la IgE, FceRII/CD23.

Anticuerpo Anti-CD23: Un anticuerpo que se une especificamente al CD23, especificamente el CD23 humano.

Descripción Detallada de la Invención Como se discutió, supra, aunque muchos grupos han reportado anteriormente la producción de anticuerpos anti-CD23 y el uso de los mismos como antagonistas y agonistas para modular la producción de IgE, el mecanismo exacto mediante el cual tales anticuerpos modulan la expresión de la IgE en sistemas donde la producción de IgE inducida por la IL-4 sigue sin aclararse. De este modo, seria benéfico si se descubrieran los medios por los cuales tales anticuerpos modulan la expresión de la IgE, o al menos si se explicara mejor, puesto que tal información seria potencialmente útil para diseñar agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades donde la modulación de la producción de IgE es terapéuticamente deseable. En particular, seria benéfico si se obtuvieran anticuerpos específicos mejorados para el CD23 que tuvieran mejor capacidad para inhibir la producción de IgE inducida, puesto que se cree que los niveles de IgE incrementados están implicados en los procesos de numerosas enfermedades, por ejemplo, condiciones alérgicas, condiciones inflamatorias y enfermedades autoinmunes. Tales enfermedades incluyen a manera de ejemplo, la dermatitis atópica, eczema, rinitis alérgica y conjuntivitis, síndrome de Job y asma. Hacia ese punto, los inventores de la presente han descubierto de manera sorprendente que los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos que contienen dominios constantes de gamma-1 humanos inhiben la producción de IgE en sistemas donde la producción de IgE es inducida por un IL-4 de manera significativamente mejor que los anticuerpos monoclonales del CD23 de otros tipos de efector, por ejemplo, aquéllos que comprenden dominios constantes gamma-4 humanos o anticuerpos monoclonales CD23 o fragmentos de anticuerpos que carecen de todas las funciones efectoras. Debido a que los dominios constantes gamma-3 humanos han mostrado mediar las mismas funciones efectoras que el gamma-1 humano, los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos que contienen los dominios constantes gamma-3 humanos están también incluidos. Actualmente existen cinco funciones efectoras definidas para la clase de anticuerpos IgG (gamma) . Dos de esas funciones, activación del complemento e interacción de Fc?RN, no se encuentran en los ensayos in vi tro descritos en la presente invención, y por lo tanto probablemente no estén implicadas en el mecanismo molecular. Han sido identificados otros tres receptores Fc?R los cuales interactúan con la clase de anticuerpos IgG: Fc?RI, Fc?RII (de los cuales existen al menos seis proteínas diferentes) y Fc?RIII (con al menos dos proteínas diferentes) . Tres de esos receptores interactúan con la IgGl y la IgG3. El Fc?RI es el único de los tres que tiene una afinidad apreciable por la IgG. Este se une al gamma-1 y gamma-3 monomérico con una Ka de aproximadamente 5 X 108 M"1. Sin embargo, su afinidad por el gamma-4 es aproximadamente 10 veces menor, y no se une al gamma-2 humano del todo (Fries et al., 1983, J. Immunol. 129: 1041-1049; Kurlander y Batker, 1982, J. Clin. Invest. 69: 1-8; Woof, 1986, G. Mol. Immunol. 21: 523-527; véase también Burton y Woof, 1992, Human Antibody Effector Function, Adv. Immunol. 51: 1-84). Aunque la afinidad del Fc?RII y Fc?RIII humanos por la IgG humana es generalmente muy baja (Ka<107 M"1) , la afinidad por la IgGl humana y la IgG3 humana se incrementa significativamente (Ka« 2 a 5 X 107 M"1) cuando se une al antigeno (Karas et al., 1982, Blood 60: 1277-1282). La afinidad del Fc?RII humano por la IgG2 humana unida al antigeno ha dado resultados conflictivos . El Fc?RIII humano no se une a la IgG2 humana. El Fc?RII humano y el Fc?RIII humano no se unen a la IgG4 (Van de Winkel y Anderson, 1991, J. Leuk. Biol. 49: 511-524; Huizinga et al., 1989, J. Immunol. 142: 2359-2364). Aunque las funciones efectoras mediadas por la Fc son algunas veces significativas para la actividad terapéutica de los anticuerpos, este descubrimiento fue sorprendente en el caso de los anticuerpos anti-CD23 debido a que el papel de la función efectora en la actividad inhibidora de la IgE de los anticuerpos anti-CD23 no habla sido reportada anteriormente. En efecto, evidencias anteriores han sugerido que la función efectora del anticuerpo no era significativa para la capacidad de los anticuerpos anti-CD23 para inhibir la producción de IgE inducida. Por ejemplo, Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1046 (1993) reportaron que Fabs preparados a partir de un anticuerpo policlonal anti-CD23 inhibieron una respuesta especifica del antigeno de la IgE inducida in vivo. El descubrimiento de que las funciones efectoras mediadas a través de la región constante de los anticuerpos anti-CD23 están aparentemente implicadas se hizo después de que los inventores de la presente aislaron varios anticuerpos de primate específicos para el CD23 que tienen actividad inhibidora anti-IgE y compararon esos anticuerpos con versiones PRIMATIZED® con respecto a su capacidad para inhibir la producción de IgE inducida por la IL-4 in vi tro e ín vivo . Los anticuerpos construidos con una región constante gamma-4 humana no inhibieron las respuestas especificas del antigeno IgE in vitro, mientras que los anticuerpos que contenían una región constante gamma-1 humana fueron exitosos. Debido a que una (o más) de las tres clases de los receptores FC?R, FC?RI, FC?RII o FC?RIII, está probablemente implicada en la función efectora especifica mediada a través del dominio gamma-1, y debido a que esas clases de receptores también se unen al anticuerpo que contienen dominios gamma-3, es lógico que los anticuerpos anti-CD23 que contienen dominios gamma-3 también sean exitosos en la inhibición de la respuesta especifica del antigeno IgE in vi tro. De manera más especifica, y como se describe con mayor detalle infra , se aislaron cinco anticuerpos monoclonales de primate los cuales se unen especificamente al CD23 celular y soluble de un mono del Viejo Mundo (macaco) de acuerdo a la metodología que se describe en la Solicitud comúnmente asignada, No. de Serie 08/379,072 (ahora liberada) , solicitud la cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad. Esta solicitud describe en detalle medios para producir anticuerpos monoclonales para los antigenos deseados, antigenos humanos deseables, en monos del Viejo Mundo y sus ventajas en relación a los anticuerpos de otras especies como agentes terapéuticos, por ejemplo inmunogenicidad reducida o potencialmente ausente en humanos debido a la cercanía filogenética de los humanos y los monos del Viejo Mundo. En efecto, debido a la cercanía filogenética de esas especies, es dificil distinguir las inmunoglobulinas del mono del Viejo Mundo de las inmunoglobulinas humanas comparando la secuencia. Cuatro de esos cinco anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos de primate demostraron ser capaces de inhibir la producción de IgE inducida por la IL-4 en un ensayo de células B in vitro descrito en detalle infra y el más potente también demostró inhibir la IgE inducida por la IL-4 en un modelo animal de ratón SCID (también descrito en detalle infra ) . En base a esta actividad inhibidora de la IgE, y la inmunogenicidad baja esperada en humanos, tales anticuerpos son potencialmente adecuados como agente terapéuticos para tratar enfermedades donde la inhibición de la producción de IgE es terapéuticamente deseable. Sin embargo, para reducir aún más la inmunogenicidad, se seleccionó PRIMATIZED® 2 anticuerpos monoclonales de primate (un tipo de quimerización de anticuerpos) de acuerdo a la metodología, la cual, también se describe en la solicitud de Patente No. de Serie 08/379,072 .(ahora liberada), incorporada aqui como referencia. La PRIMATIZACION® se refiere esencialmente a la producción de anticuerpos recombinantes desarrollados por IDEC Pharmaceuticals Corporation, los cuales comprenden regiones variables de primate y regiones constantes de humano. La primatización de los dos anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate (5E8 y 6G5) que tienen actividad inhibidora de IgE potente, se efectuó para eliminar cualquier inmunogenicidad potencial atribuible a los dominios constantes de primate en humanos .

Nuevamente, debido a la expectación inicial de los inventores, de la literatura publicada de que la función efectiva de la Fc no era necesaria para la inhibición de la IgE inducida, se produjeron inicialmente versiones del gamma 4 humano de esos anticuerpos particulares. Sin embargo, de manera muy sorprendente, se encontró que las versiones gamma-4 producidas a partir de ambos de esos anticuerpos monoclonales de primate no eran efectivas, es decir, que requerirían concentraciones significativamente mayores de anticuerpo gamma 4 PRIMATIZED® que el anticuerpo de primate para inhibir la producción de IgE inducida por la IL-4 en ensayos in vi tro. Además, aún más sorprendente fue el descubrimiento de que cuando los mismos dos anticuerpos de primate fueron convertidos entonces a versiones gamma-1 humana (mediante la sustitución de los dominios constantes de primate con dominios constantes gamma-1 humanos) , que esos anticuerpos gamma-1 inhibieron de manera muy efectiva la producción de IgE inducida in vi tro. De este modo, nuestros resultados sugieren que la función efectora de la Fc es aparentemente significativa para la capacidad del anticuerpo anti-CD23 humano para inhibir la producción de IgE inducida. Esta hipótesis fue confirmada cuando el tercer anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate, es decir, el anticuerpo 2C8, el cual nosotros demostramos inhibe la producción de IgE in vitro, fue convertido a un F(ab')2, el cual se encontró, era sustancialmente incapaz de inhibir la producción de IgE inducida in vi tro. En efecto, se encontró que este F(ab')2 antagoniza los efectos supresores sobre la actividad bloqueadora de la IgE inducida del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 2C8. Además, se encontró que la remoción de un sitio de glicosilación en la región variable de la cadena pesada de uno de los anticuerpos (5E8) no tuvo efecto sobre la unión del anticuerpo en CD23 (de acuerdo a lo evidenciado por los valores de Kd obtenidos) , o sobre la inhibición de la IgE inducida. De este modo, las diferencias en la inhibición de la IgE demostraron aparentemente no implicar diferencias en la glicosilación. Se encontró que la versión gamma 1 PRIMATIZED del 6G5 de primate inhibe la expresión de la IgE inducida en ratones SCID, mientras que la misma concentración de cualquiera del 6G5 de primate o el p6G5F4p PRIMATIZED® no inhibe la expresión de la IgE inducida. Por lo tanto, se encontró que un anticuerpo que contiene dominios constantes gamma-1 humanos es aún más efectivo en el modelo animal in vivo que el anticuerpo monoclonal de primate. Además, los inventores anticipan que los anticuerpos anti-CD23 que contienen dominios constantes gamma-3 humanos serán tan efectivos como aquéllos que tienen dominios constantes gamma-1, debido a que los dominios constantes gamma-1 y gamma-3 tienen afinidad por las mismas clases de receptores de Fc. En consecuencia, en base a esos resultados, se ha descubierto de manera sorprendente que una región Fc activa, en particular la del gamma-1 humano o gamma-3 humano, está implicada de manera significativa en el mecanismo de la inhibición de la IgE inducida por la IL-4 por los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano. Este descubrimiento es muy inesperado especialmente en base a los primeros reportes de que los Fabs derivados de anticuerpos policlonales anti-CD23 eran capaces de inhibir la producción de IgE inducida, y también en base a las diferentes teorías de como el CD23 afecta la expresión de la IgE inducida. En consecuencia, la presente invención se relaciona con anticuerpo anti-CD23 humano que contienen dominios constantes gamma-1 o gamma-3 humanos y su uso como agentes terapéuticos en base a su capacidad para inhibir efectivamente la expresión de IgE. Los expertos en la técnica pueden preparar anticuerpo anti-CD23 humano que contengan dominios constantes gamma-1 o gamma-3 humanos por los métodos que son bien conocidos en la técnica para la manufactura de anticuerpos quiméricos. Esencialmente, tales métodos comprenden producir anticuerpo anti-CD23 humano en un huésped deseado in vi tro, clonando un hibridoma o linaje celular que produzca un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano que exhiba características deseables, por ejemplo, afinidad de unión al CD23 adecuada, clonar las secuencias de ácido nucleico que codifican para tal anticuerpo de tal hibridoma o linaje celular, por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los cebadores adecuados, aislando los dominios variables contenidos en ellas, recombinar tales dominios variables con los dominios constantes gamma-1 o gamma-3 humanos y una constante de la cadena ligera humana apropiada, y expresando la secuencia de ácido nucleico resultante que codifica para una inmunoglobulina gamma-1 o gamma-3 anti-CD23 humana, quimérica, en un sistema de expresión adecuado. De manera preferible, los anticuerpos anti-CD23 humano de la invención tendrán afinidades de unión al CD23 aparentes que fluctúan de 0.1 nM a 1000 nM, de manera más preferible de al menos 50. nM, y de manera más preferible de al menos 5 nM. Las células huésped adecuadas para la expresión de las inmunoglobulinas recombinantes son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden ser expresados en células de ovario de hámster chino (CHO) , DG44 o DUXB11; o células CHO CHO K-l; células de mieloma de ratón SP2/0 o X63-Ag8.653 o NSO; células de mieloma de rata YB2/0; células de riñon de hámster bebe, BHK; linaje de riñon embriónico humano, 293; células de riñon de mono, CVl; fibroblastos de pulmón humano; W138; células de carcinoma cervical humano, HELA; células de insecto, células de plantas, levaduras o en bacterias. Además, los vectores adecuados para la expresión de las inmunoglobulinas también son conocidas en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles. Un sistema de vector particularmente preferido es el sistema de vector translacionalmente dañado descrito en la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/147,696 (ahora liberada) , el cual comprende un marcador seleccionable dominante translacionalmente dañado (neo) , que contiene un intrón en el cual se inserta un ADN heterólogo deseado. Se ha encontrado que este sistema de vector proporciona muy altos rendimientos de proteínas recombinantes, por ejemplo, inmunoglobulinas. Sin embargo, los anticuerpos anti-CD23 objeto, pueden ser producidos en cualquier sistema de vector que sea adecuado para la expresión de inmunoglobulinas funcionales . También, la presente invención abarca anticuerpos monoclonales humanos de los tipos gamma-1 o gamma-3 los cuales son específicos para el CD23 humano. Los métodos para el aislamiento de los anticuerpos monoclonales humanos también son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos in vi tro, por ejemplo, inmunización in vi tro de células B humanas en cultivos tisulares, y métodos in vivo, por ejemplo, sintesis de anticuerpos monoclonales en ratones SCID. Los medios preferidos para producir anticuerpos monoclonales humanos son los ratones SCID, los cuales combinan el cebado in vitro de células de baso humano, las cuales a continuación son introducidas en los ratones SCID como se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/488,376 (incorporada aqui como referencia en su totalidad) . Este método es ventajoso, puesto que proporciona la recuperación reproducible de anticuerpos monoclonales que tienen alta afinidad contra un antigeno deseado, por ejemplo, un antigeno humano. También, la presente invención abarca anticuerpos monoclonales humanos, los cuales compiten con los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate 5E8 y 6G5 para unirse al CD23.

EJEMPLO 1 Producción de los Anticuerpos Anti-CD23 de Primate Se aislaron cinco anticuerpos monoclonales de primates específicos para el CD23 de macacos sustancialmente de acuerdo a la metodología descrita en la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/379,272, la cual ha sido incorporada aqui como referencia. Las técnicas exactas utilizadas se describen en detalle más adelante.

Metodología para el Aislamiento y Caracterización de los Anticuerpos Monoclonales Anti~CD23 Humano Purificación del Inmunógeno sCD23 de células 8866 Durante la purificación, el CD23 soluble (sCD23) fue cuantificado por un ELISA de tres pasos utilizando un anticuerpo anti-CD23 murino (Sitio de Unión; catálogo # MC112) como una captura. El antigeno fue parcialmente purificado de los cultivos de las células 8866 mantenidas en biorreactores en suspensión utilizando RPMI 1640 (JRH Biosciences; catálogo # 56-509) suplementado con 10% de suero bovino fetal (JRH Biosciences) y 4 mM de glutamina (JRH Biosciences; catálogo # 90114) a 37°C. Se utilizó dióxido de carbono para mantener el pH en 7.1. Después de remover las células por filtración a través de un filtro de 0.45 µm, se agregaron fluoruro de fenilmetil sulfonilo (concentración final de 0.2 mM, Sigma Chemical Co.; catálogo # P-7626) y ácido etilendiamintetraacético (concentración final de 3 mM, Sigman Chemical Co.; catálogo # EDS) al sobrenadante y la solución se almacenó a 2-8 °C. El sobrenadante libre de células se concentró aproximadamente 15 a 20 veces utilizando un cartucho de ultrafiltración de fibra hueca (A/T Technology; catálogo # UFP-10-C-9A; 10,000 d MWCO) o cartucho de ultrafiltración de flujo tangencial (Filtron Corporation; 10,000 d MWCO) a temperatura ambiente. El sobrenadante concentrado se filtró en forma estéril y se almacenó a -70 °C. Los concentrados descongelados se deslipidaron agregando SM-2 BioBeads (BioRad Industries; catálogo # 152-3920) a 5 g/L y agitando durante la noche a 2-8 °C. La resina se removió por filtración y la solución se almacenó a 2-8 °C. Para algunas preparaciones de sCD23, los concentrados se fraccionaron utilizando sulfato de amonio (35-70% (Peso/volumen) ; Fischer; catálogo # A702-3) antes o después de la deslipidación. La solución deslipidada fue purificada posteriormente utilizando cromatografia de afinidad a 2-8 °C. La matriz de afinidad se preparó enlazando covalentemente un anticuerpo monoclonal anti-CD23 murino (BU38) a Sepharose utilizando Sepharose 4B activada con CNBr (Sigma Chemical Co.; catálogo # C-9142). El anticuerpo BU38 fue purificado a >90% de homogeneidad de los ascitos (Sitio de Unión, catálogo # CUS830) utilizando cromatografia con Proteina A. La solución deslipidada se aplicó a la columna de afinidad (1.5 x 5 cm) equilibrada con 1XPBS (Gibco BRL; catálogo # 70013-0.32), pH 7.2 y la columna se lavó con 1XPBS, pH 7.2, con un contenido de 0.05% de NP40 (Sigma Chemical Co) para remover la proteina no unida. El CD23 soluble se eluyó utilizando MgCl2 3.5 M (Fischer; catálogo # M33-500) . Las fracciones que contenían el sCD23 se combinaron y dializaron (Baxter Spectra/Por; catálogo # D1615-1) contra 1XPBS, pH 7.2 a 2-8 °C. Después de la diálisis, la solución de proteina se concentró por centrifugación utilizando filtros de centrifugación Centriprep 10 (Amicon Corporation; MWCO 10,000 d) y las preparaciones se almacenaron a -70 °C. Se estimó que la pureza del sCD23 era >70% utilizando el análisis SDS-PAGE (geles prevaciados a 4-20%, Novex Corporation) y tinción de Coomasie.

Inmunización de Primates y Aislamiento de Células Inmunes Se inmunizaron monos sinomólogos (White Sands Research Center, Alamogordo, New México) con CD23 soluble el cual habla sido purificado del sobrenadante de células RPMI 8866 humanas (linfoma de células B, Hassner y Saxon, J. Immunol . , 132:2844 (1984)). Cada mono fue inmunizado cada tres semanas con 200 µg de CD23 soluble en 500 µl de PBS mezclados con 167 µl de Temuritida (péptido adyuvante) (Sigma, St. Louis, MO, Catálogo # A-9519) y 333 µl de 3X PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals Corporation) . La inmunización se efectuó intradérmicamente, intraperitonealmente, intramuscularmente y subcutáneamente. El titulo de los anticuerpos anti-CD23 en el suero de los monos se midió por ELISA sobre células 8866 y se comparó con un presangrado de los mismos monos. El mono PRO 978, con un titulo de suero de cincuenta mil se sacrificó, y el bazo y los nodos linfáticos se removieron quirúrgicamente, y se transportaron sobre hielo a IDEC pharmaceuticals, se sumergieron en RPMI-1640 estéril (Gibco BRL, Gaithesburd, MD Catálogo # 21870-050) suplementado con 10% de suero de carnero fetal, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 mM y 50 µg/ml de gentamicina. Inmediatamente después del arribó el bazo fue homogeneizado pasando ésta a través de una malla de alambre con un pistilo de vidrio. Las células rojas sanguíneas fueron Usadas en un amortiguador hipotónico a base de cloruro de amonio y los linfocitos restantes se recolectaron y lavaron el RPMI-1640 al menos tres veces. Los nodos linfáticos se homogeneizaron de manera similar en una suspensión celular única, se recolectaron y se lavaron al menos tres veces en RPMI-1640.

Producción de Hibridomas Después del último lavado, las células fueron contadas, y las células de primate obtenidas anteriormente fueron entonces fundidas somáticamente al linaje celular de hetexohibridoma de ratón-humano H6K6/B5 (Carrol et al., J. Immunol . Methods, 89:61 (1986)) utilizando las técnicas estándar (Boerner et al., J. Immunol . , 147:86) (1991)) y se cultivaron en placas en discos de 96 pozos (175 discos o 14,700 pozos para el bazo, y 17 discos o 1386 pozos para los nodos linfáticos) a 300,000 células por pozo. Este procedimiento implicó el mezclado de los linfocitos y el origen de fusión identificado anteriormente, a una relación' de 2:1, células las cuales fueron resuspendidas lentamente en PEG 1500 al 50% (Sigma, Catálogo # P5402) durante 1 minuto. Esas células se dejaron entonces reposar durante 1 minuto y a continuación se resuspendieron aún más lentamente en un exceso de RPMI-1640. Posteriormente, las células se dejaron reposar nuevamente, esta vez durante 15 minutos antes de una centrifugación ligera a 250 x g. Las células fueron entonces resuspendidas en medio de crecimiento RPMI-1640, el cual habla sido suplementado en 20% de Suero de Carnero fetal, L-Glutamina 2 mM, Piruvato de Sodio, Aminoácidos No Esenciales y 50 µg/ml de Gentamicina, con un contenido de 100 µM de Hipoxantina, 16 µM de Timidina (BoehringerMannheim Alemania, # 623091) y 5.8 µM de Azaserina (Sigma, Catálogo # A 1164) (HTA) . La HTA es un agente de selección el cual proporciona la sobrevivencia de células fundidas exitosamente (linfocito de primate fundido con el origen de fusión del heterohibridoma) .

Aproximadamente el 65% de los pozos mostraron crecimiento (10,500 pozos). Esos pozos fueron seleccionados entonces para detectar la presencia de anticuerpo anti-CD23 humano por un ELISA celular de tres pasos.

Procecfi.n73.ento de la ELISA El primer paso de la ELISA comprendió la transferencia de cincuenta microlitros de sobrenadante de cada pozo a placas de noventa y seis pozos las cuales hablan sido previamente recubiertas con 105 'células 8866 (linaje celular positivo al CD23) por pozo. Esas placas se hicieron primero recubriendo las placas con 50 µl de solución acuosa con un contenido de veinte µg/ml de Poli L-Lisina (Sigma Catálogo # P1399, MW 150,000 - 300,000) durante treinta minutos a temperatura ambiente. La solución remanente fue removida ("retirada rápidamente") y las placas se dejaron secar. Una vez secas, se transfirieron cincuenta µl. de células 8866 en PBS y se centrifugó a 600 g durante cinco minutos. Las células 8866 fueron unidas covalentemente a la placa agregando cincuenta µl de glutaraldehido al 0.5% (Sigma, Catálogo # G6257) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) durante 15 minutos. El glutaraldehido fue removido (retirado rápidamente) y las placas bloqueadas con ciento cincuenta µl de glicina 100 mM (Sigma, Catálogo # G- 2879) en BSA - PBS al 0.1%. después de la adición de los sobrenadantes, las placas fueron incubadas a 37 °C durante una a dos horas y lavadas de siete a nueve veces con agua corriente, y se agregó un anticuerpo anti-lgG humana de cabra acoplado a la peroxidasa de rábano (HRPO) (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Catálogo # 2040-05) diluido 1:2000 en leche descremada seca al 1% (Vons) en PBS - Tween 20 al 0.05% (Sigma, Catálogo # P1379) . Las placas se incubaron durante cuarenta y cinco minutos a 37 °C, y nuevamente se lavaron siete a nueve veces en agua corriente. La presencia de la HRPO se detectó mediante el desarrollo de color después de la adición de un reactivo TMB (Kirkegaard & Perry, Gaithesburg, MD, Catálogo # 50-76-02 y 50-65-02), 100 µl/pozo. La reacción se detuvo mediante la adición de veinticinco µl de H2S04 4N. La densidad óptica (DO) se midió a 470 nM sobre un espectrofotómetro (Titertek Multiscan) . Los valores de DO mayores de dos veces en el fondo se reportaron como positivos . El segundo paso en el ELISA se efectuó para confirmar que los sobrenadantes que hablan sido calificados como positivos en el primer ELISA reaccionaron con el CD23 y no con algún antigeno relevante. Esto se efectuó probando los sobrenadantes sobre células SupTl (ERC BioServices Corporation, Rockville, MD, Catálogo # 100), un linaje celular de humano negativo al CD23, utilizando el mismo procedimiento de la ELISA. Los sobrenadantes que se calificaron igualmente en ambas pruebas fueron desechados. Esos resultados indicaron que cincuenta y seis de los 10,500 pozos con crecimiento mostraron la presencia de un anticuerpo monoclonal de primate que se une a las células 8866 en dos sitios separados a diferentes tiempos y no se une a las células SupTl. El tercer paso en el ELISA se condujo para determinar si los sobrenadantes identificados de acuerdo al primero de los dos pasos de la ELISA, reaccionaron con el CD23 soluble. En este tercer ELISA, se recubrieron placas de 96 pozos a 4 °C durante la noche con 2 µg/ml de BG-6 (Biosource International, Camarillo, CA, Catálogo # CT-CD23-CF) , un anticuerpo monoclonal de ratón que se une al CD23 soluble pero no bloquea la unión del CD23-IgE, contenido en un amortiguador de bicarbonato 50 mM, pH 9.3. Después de remover el amortiguador de recubrimiento, se agregaron cincuenta µl de CD23 soluble semipurificado a una dilución predeterminada en PBS a la placa y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con agua corriente de siete a nueve veces, se agregaron 50 µl de sobrenadante de los pozos seleccionados. Después de lavar la placa en agua corriente siete a nueve veces, se agregaron 50 µl de HRPO anti-lgG humana de conejo (adsorbida de ratón) (Southern Biotech, Catálogo # 6145-05) diluido 1:4000 en leche descremada seca al 1% en PBS con Tween 20 al 0.05%, se incubó durante dos horas a 37 °C, se lavó de siete a nueve veces en agua corriente y se reveló con TMB como se describió anteriormente. Los pozos con OD mayores de dos veces en fondo se calificaron nuevamente como positivos. Veintiuno de los cincuenta y seis pozos mostraron que la unión de las células 8866 también se unió al sCD23 en el ELISA. Esos pozos se expandieron y subclonaron al menos dos veces cultivando las células a una células con tres pozos. Después de aproximadamente tres meses, se obtuvieron cinco hibridomas estables productores de anticuerpos monoclonales de primate para el CD23.

Purificación del Anticuerpo por Métodos con Proteína A Esencialmente, los anticuerpos son purificados por centrifugación del sobrenadante de cultivo para remover las células y restos. Las muestras centrifugadas resultantes se filtraron a continuación a través de un filtro de 0.2µm. a continuación se preparó una Columna de flujo rápido de sepharose y proteina A y se 'equilibró utilizando PBS (pH 7.4) . el sobrenadante se cargó a continuación sobre la columna a una velocidad de flujo apropiada (2 ml/min) .

Después de cargar, la columna se lavó con 10 volúmenes de la columna de PBS (pH 7.4) . El anticuerpo se eluyó a continuación de la columna con amortiguador de elución (ácido acético 0.2 M, glicina 0.1 M, pH 3.5) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. A continuación se recolectaron fracciones de un mililitro/tubo (Tris-Hcl 2.0 M, pH 10.0) incluyendo 100 µl de Tris. Posteriormente, se tomaron las lecturas del espectrofotómetro a 280 nm. Las fracciones resultantes con alta absorbancia a 280 nm que contenían el anticuerpo se recolectaron y dializaron a continuación contra PBS durante la noche. El producto se esterilizó entonces por filtración a través de una membrana de 0.22µm y se almacenó a -20°C. Cuatro de esos cinco anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate (1H6, 2C8, 5E8, y 6F5) demostraron inhibir la producción de IgE en un ensayo in vi tro, el cual inhibe la producción de IgE de cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) inducidos con IL4-hidrocortisona . Esos resultados se muestran en la Figura 1. Las condiciones del ensayo se describen más adelante. El quinto anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate B3B11 estuvo inactivo en este ensayo .

Producción de IgE Estimulada por la IL-4 por Células Mononucleares de Sangre Periférica Como se discutió supra, los anticuerpos de primate objeto y formas PRIMATIZED® de los mismos, se evaluaron por su capacidad para inhibir la producción de IgE en un ensayo in vi tro, el cual midió el efecto de tales anticuerpos sobre la producción de IgE por células mononucleares de sangre periférica estimuladas por IL-4.

Materiales para el Ensayo de IgE de IL-4 in vitro Placas de agrupamiento de fondo plano de cuarenta y ocho pozos (Costar, Catálogo # 3548) (1.5 millones de PBMCs por ml por pozo (placa de 48 pozos) ) . IL-4 recombinante humano (Genzyme Catálogo # 2181-01; 10 µg (2.5 x 107 unidades). Acms anti-CD23: Acm murino (MHM6; DAKO. Catálogo # M763) Acms de primate (no preservativos) PRIMATIZED® (no preservativos) . Medio basal HB 101: (Irvine Scientific Catálogo # T000) . Suplemento HB101: (Irvine Scientific Catálogo # T151' Suero Bovino Fetal: (FBS; Bio-Whittaker Catálogo # 14-501F) . Dimetiisulfóxido: (DMSO; Fisher Scientific Catálogo # D128-500) . Hidrocortisona: (Sigma Catálogo # H-0888) . Puromicina: (Sigma Catálogo # P-7255) . Ciclohexámida: (Sigma Catálogo '# C-7698) . Histopaque®: (Sigma Catálogo # H-8889) . Solución Salina Amortiguada de Hank: (HBSS; Irvine Scientific Catálogo # 9232) . FBS al 1% en HBSS. Solución salina amortiguada de fosfato de Dulbecco concentrada (lOx DPBS; Bio-Whittaker Catálogo # 17-517Q) . Baño Microbicida Claro (Fisher, Catálogo # 13-641-334) en DPBS.

Soluciones : Solución de puromicina: 40 µg/ml en medio de crecimiento HB101. , Solución de ciclohexamida: 200 µg/ml en medio de crecimiento HB101. Solución de hidrocortisona: solución 0.1 M en DMSO. Los Acms murinos anti-CD23 fueron dializados exhaustivamente para remover preservativos.

Medio de crecimiento HB101 Medio basal HB101 500 ml Suplemento HB101 en 10 ml de H20 destilada, filtrada, estéril 5 ml FBS 10 ml solución de hidrocortisona (concentración final de 5 µM) 0.25 ml Procedimiento de Ensayo In Vitro Células recubiertas, aterciopeladas 1:4 se diluyeron utilizando HBSS a temperatura ambiente. Esas células se derivaron de sangre completa después de una incubación durante la noche a temperatura ambiente para resolver y separar los componentes del plasma, plaquetas coaguladas y fibrina, y células recubiertas aterciopeladas. Treinta microlitros del recubrimiento aterciopelado diluido se recubrieron entonces sobre quince microlitros de Histopaque en tubos cónicos de cincuenta ml . Esos tubos se centrifugaron a continuación durante veinte minutos a 1700 rpm a temperatura ambiente sin freno (rotor de alabes giratorios IEC 216) . La capa de PBMC blanca se recolectó entonces utilizando una pipeta estéril, teniendo cuidado en no perturba las otras capas. Las PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) son las células recubiertas aterciopeladas, las cuales han sido sedimentadas por centrifugación parcialmente a través de un gradiente de densidad HISTOPAQUE para formar la capa blanca de células distintivamente visible. Esas células se recolectaron con una pipeta, se enjuagaron con HBSS, y a continuación se contaron utilizando un hemocitómetro. Típicamente, pueden recuperarse de 300 a 600 millones de PBMCs de un solo paquete de recubrimiento aterciopelado de 450 ml . Las PBMCs recolectadas son entonces lavadas tres veces en FBS al 1%/HBSS. Las células lavadas se recolectaron por centrifugación durante siete minutos a 1300 rpm a 7°C. El número de células recolectadas se determinó entonces utilizando un hemocitómetro. La concentración celular se ajustó a aproximadamente tres millones de células por mililitro de medio de crecimiento HB101. A continuación se agregaron aproximadamente 1.5 millones de células (0.5 ml) a cada pozo de una placa de 48 pozos. En general, se prepararon cinco muestras por duplicado por cada experimento. Los pozos del perímetro de cada placa no se utilizaron para muestras de células. En consecuencia, esos pozos se llenaron, por ejemplo, utilizando 0.5 ml de BañoClaro al 0.05%/DPBS. A continuación se agregaron 0.5 ml de medio de crecimiento HB101 que contenia las cantidades deseadas de IL-4 y Acm a los pozos. La IL-4 utilizada es la interleucina 4 humana generada con ADN recombinante. El Acm utilizado en el ensayo es un anticuerpo murino, de primate o PRIMATIZED . Típicamente, la IL-4 se agregó a una concentración final de 100 U/ml y el Acm se agregó a una concentración final que fluctúa de 0.01 a 3 µg/ml. Las células se incubaron a continuación de nueve a once dias a 37 °C en un incubador húmedo a 5% de C02. Después de la incubación, los fluidos sobrenadantes se recolectaron y se midió el contenido de IgE.

ELISA de la IgE La siguiente lista identifica los materiales y soluciones utilizadas en los ELISA de IgE.

Materiales y Soluciones Necesarias para el ELISA de IgE Acido sulfúrico, 4 M Amortiguador de recubrimiento: amortiguador de bicarbonato de sodio 10 mM, pH 9.6 Solución salina patrón amortiguada con fosfatos, concentrada (lOx PBS) : NaH2P0 26.6 gm Na2HP04 289 gm NaCl 1064 gm H20 destilada 10 L Amortiguador de bloqueo: FBS al 10%/PBS Amortiguador de dilución: BSA al 1%/Tween 20 al 0.05%/PBS Amortiguador de lavado: Tween 20 al 0.05%/PBS Anti-IgE humana de cabra (especifica de la cadena épsilon), no marcada: (Tago Catálogo # 4104) IgE humana estándar: (The Binding Site Catálogo # BP094) Anti-IgE humana de cabra, marcada con HRP: (Tago Catálogo # AHÍ 0504) Sustrato de peroxidasa TMB: (KPL Catálogo # 50-76-02) Solución de peroxidasa B: (KPL Catálogo # 50-65-02) Solución de sustrato de trabajo: sustrato de mezclado y Solución B a una relación 1:1 Placas microtituladoras Immulon II (Dynatech Labs Catálogo # 011-010-3455) .

Procedí mi ento del ELISA de la IgE Cada pozo de una placa microtituladora se recubrió utilizando 100 µl de un amortiguador de recubrimiento que contenia 2 µg/ml de anti-IgE humana de cabra.

La placa recubierta se incubó a continuación durante la noche a 4°C. Después de la incubación, cada pozo en la placa se lavó entonces tres veces con 200 µl de Tween 20/PBS. Después de lavar, los sitios de unión no específicos se bloquearon con 20 µl de amortiguador de bloqueo/pozo durante 1 hora a 37°C. A continuación se agregaron cien µl de muestras o estándares a cada pozo; pozos los cuales se incubaron a continuación durante la noche a 4°C. Después de la incubación, las muestras se probaron con o sin dilución. Se preparó una curva de concentración estándar para cada placa utilizando varias diluciones de IgE que fluctuaron de 0.1 a 50 ng/ml. Después de la incubar durante la noche, cada placa se lavó cinco veces con Tween 20/PBS. A continuación se agregaron cien µl de anti-IgE humana de cabra marcada con peroxidasa de rábano (HRP) diluida 1:10,000 en amortiguador de dilución a cada pozo drenado. La placa se incubó a continuación durante 4 horas a 37°C. Las placas se lavaron entonces 5 veces con Tween 20/PBS y 3 veces con agua.

A continuación se agregaron cien µl de solución de sustrato de trabajo de 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbencidina a cada pozo. La placa se incubó a continuación durante veinticinco minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción de revelado se detuvo mediante la adición de cincuenta µl de ácido sulfúrico 4 M. A continuación se midió a absorbancia a 450 y 540 nm. Los valores de la absorbancia a 540 nm se listaron como fondo.

Ensayo para la medición de los Kd de los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate Proced±m±ento del Análisis de Scatchard 1. Procedimiento de Marcado Radioactivo Las YODO-BEADS se lavaron con Amortiguador de Fosfato lOOmN, pH 7.4 dos veces utilizando 1 mL de amortiguador por dos perlas. Las perlas se secaron a continuación sobre papel filtrante. Las dos perlas se agregaron entonces a 100 µl de solución de 125I, con un contenido de aproximadamente lmCi de I, diluido con 200 µl de amortiguador de fosfato, y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos.

El anticuerpo (50 µgs) se agregó a las perlas precargadas. El tiempo de reacción para la incorporación máxima de radioactividad es de 6 minutos. La reacción se detuvo removiendo el anticuerpo marcado radioactivamente del recipiente de reacción. A continuación se efectuó la filtración sobre gel para remover el exceso de 125I o 125I no incorporado de la solución de anticuerpo marcado radioactivamente. Esto se efectuó haciendo pasar el anticuerpo marcado radioactivamente sobre una columna constituida de 1.5mL de Sephadex-G25, 1.5 mL de DEAE Sephadex-A25 y 0.5mL de Amberlite. El anticuerpo marcado radioactivamente se eluyó en un volumen total de 5 mL a una concentración de aproximadamente 10 µg/mL. (Amortiguador de Elución: 1XPBS con un contenido del 10% de Gelatina, 2% de Azida de Sodio y 1% de BSA) . 2. Ensayo de Optimización (Estudio de Unión Directa) La actividad especifica de la solución marcada radioactivamente 10 µg/mL se determinó tomando 1 µl de muestra y ensayando la muestra sobre un contador gamma.

Ejemplo • 1x10 cpm/µl x 1000 µl/lOµg de anticuerpo 1x10 cpm/µg de anticuerpo lxlO4 cpm/ng de anticuerpo • Peso molecular del anticuerpo = 75,000 ng/mol • Actividad Especifica lxlO4 cpm/ng x 75,000 ng/nmol = 7.5xl08 cpm/nmol La placa recubierta con antigeno se bloqueó (para eliminarla unión no especifica, por ejemplo, con mB7.1-CHO) y el fondo de la placa (es decir, CHO Sin transfectar) durante una hora a temperatura ambiente con 200 µl/pozo de amortiguador de bloqueo (Amortiguador de Bloqueo: lxPBS con un contenido de 10% de Gelatina, 2% de Azida de Sodio, 1% de BSA y 10% de FBS) . Las placas se lavaron a continuación, típicamente diez veces manualmente con agua corriente. El anticuerpo marcado radioactivamente 10 µg/mL (50 µls) se tituló a continuación diluyendo dos veces en serie a través de la placa utilizando una pipeta de canales múltiples. Se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente durante aproximadamente 6-7 minutos con 200 µl/pozo de amortiguador de lavado (Amortiguador de Lavado: --IxPBS con un contenido del 10% de Gelatina y 2% de Azida de Sodio) . Los conteos de radioactividad en cada pozo se determinaron entonces ensayando o corriendo los pozos en un contador gamma.

La concentración óptima del anticuerpo marcado radioactivamente es la concentración a la cual la diferencia entre los conteos específicos y los conteos de fondo está en un máximo. 3. Análisis de Scatchard del Ensayo Competitivo La solución marcada radioactivamente 10 µg/mL se diluyó a la concentración óptima determinada en el experimento de Unión Directa. La placa recubierta con antigeno y la placa de fondo se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 200 µl/pozo de amortiguador de bloqueo. Las placas se lavaron a continuación, por ejemplo, aproximadamente 10 veces, manualmente con agua corriente. El anticuerpo "frió" (no marcado radioactivamente) se tituló entonces diluyendo dos veces en una placa microtituladora de fondo en forma de U. La concentración inicial del anticuerpo "frío" debe ser al menos 100 veces mayor que la concentración óptima del anticuerpo marcado radioactivamente.

Ejemplo: Concentración Óptima Marcada Radioactivamente: 0.5 µg/mL • Concentración del Anticuerpo "Frío": 100 µg/mL (Nota: titulación 1:2 en el primer pozo con ajuste de la concentración de anticuerpo "frío" a 50 µg/mL) . A continuación se agregaron cincuenta µl/pozo de anticuerpo óptimo marcado radioactivamente a los pozos que contenían anticuerpo "frío". A continuación se transfirieron cien µl/pozo de la solución mezclada a los pozos correspondientes de la placa recubierta con antígeno, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. También, es deseable que se efectúen los siguientes controles : a) Unión directa del anticuerpo marcado radioactivamente a la placa recubierta con antígeno (5 pozos) , b) Unión directa del anticuerpo marcado radioactivamente a la placa de fondo (5 pozos) . Después de la incubación, las placas se lavaron, por ejemplo, aproximadamente 6-7 veces, con 200 µl/pozo de amortiguador de lavado. Los conteos de radioactividad en cada pozo se determinaron entonces ensayando los pozos en un contador gamma .

Esos cálculos se determinaron calculando los conteos específicos en cada pozo probado sustrayendo los conteos de fondo de los conteos unidos a la placa recubierta con antígeno. 4. Cálculos para el Análisis de Scatchard La Concentración Molar del Anticuerpo unido [B] puede determinarse entonces como sigue: Ejemplo: A 50 µg/mL de "anticuerpo frío" Conteos específicos unidos: 4382 cpm Conteos unidos en presencia de 50 µg/mL de anticuerpo "frío": 215 cpm Diferencia: 43882 cpm - 215 cpm = 4167 cpm Actividad Específica (anticuerpo marcado radioactivamente): 5.54 x 109 cpm/nmol 4167 cpm -r 5.54 x 109 cpm/nmol = 7.52 x 10"7 nmol 7.53 x 10"7 nmol - 0.05 mL (volumen de muestra) . = 1.50 x 10"5 nmol/mL = 1.50 x 10"8 µmol/mL EB] = 1.50 x 10"n mol/mL (M) Concentración Molar Total [T] se determinó como sigue : 50 µg/mL x 1 µmol/75, 000 µg = 6.67 x 10"4 µmol/mL = 6.67 x 10"7 mmol/mL (M) [T] = 66667 x 10"11 mmol/mL (M) El anticuerpo libre [F] se determinó como sigue: Concentración Molar Libre = Total menos Unido [F] = (66667 x 10_11)-(1.50 x 10~n) = 66665.5 x 10"11 mmol/mL (M) Calcular B/F. Graficar B versus B/F en el programa Cricket Graph.

Actividad y Afinidad de los Anticuerpos Anti-CD23 de Acuerdo a la Invención Se encontró que cuatro de los cinco anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate aislados (B3B11, 2C8, 5E8 y 6F5) inhibieron la producción de IgE en el ensayo in vi tro identificado anteriormente que mide la producción de IgE por cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) inducidas por IL4-hidrocortisona . Esos resultados se muestran en la Figura 1. El quinto anticuerpo moncclonal anti-CD23 humano de primate 3G12 estuvo inactivo en este ensayo. Se encontró que dos de los cuatro anticuerpos monoclonales anti-CD23 humano de primate (B3B11 y 2C8) estaban activos en este ensayo in vi tro para competir con un anticuerpo anti-CD23 humano de ratón MHM6 comercialmente disponible (CAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, Catálogo # M763), (Figura 2, panel superior) . Sin embargo, en los ensayos repetidos esos anticuerpos no fueron inhibidores de la IgE tan potentes como el MHM6 (no se muestran los datos) . En contraste, se encontró que los otros anticuerpos monoclonales anti-CD23 de primate (5E8 y 6G5) competían entre sí y no competían con MHM6. (Figura 2, paneles medio e inferior) . Además, se encontró que el anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 era un potente - inhibidor de la IgE inducida por la IL-4 en el ensayo in vi tro. (Véase las Figuras 1 y 3) .

I Modelo de Ratón Hu-SCID Modificado para la Síntesis de IgE Humana y Medir la Inhibición de la Producción del IgE Inducida por IL-4 por Anticuerpos Anti-CD23 In Vivo También se desarrolló un modelo de ratón hu-PBMC-SCID modificado para detectar el efecto de los anticuerpos objeto sobre la producción de IgE humana inducida in vivo . Se cultivaron PBMC obtenidas de dos donadores con IL-4 in vi tro durante dos días. Las PBMC se reunieron y utilizaron para reconstituir grupos de ratones C.B. -17 SCID con y sin anticuerpos. Los ratones fueron sangrados los días 14, 21, 28 y 35 y los niveles de IgG e IgE en suero se determinaron por ELISA. Este modelo in vivo se utilizó para ensayar anticuerpos de primate y dos versiones de anticuerpos PRIMATIZED® para el CD23 por su capacidad para inhibir la producción de IgE. Se utilizó un modelo de ratón SCID modificado debido a que se sabe que los ratones SCID con inmunodeficiencia combinada scid/scid (SCID), C.B. -17 (Bosma et al., Na ture, 301:527 (1983)) reconstituidos con células mononucleares de sangre periférica humana (hu-PBMC-SCID) pueden producir cantidades significativas de inmunoglobulinas humanas (Ig) (Moiser et al., Na ture, 335:256 (1988); Moiser et al., J. Clin . Immunol . , 10:185 (1990); Abedi et al., J. Immunol . , 22:823 (1992); y Mazingue et al., Eur. J. Immunol . , 21:1763 (1991)). El isotipo predominante de la inmunoglobulina (Ig) humana producida en ratones hu-PBMC-SCID es la IgG. De manera general, los isotipos IgM, IgA e IgE se encuentran en niveles muy bajos o no detectables excepto en casos donde las PBMC se obtienen de donadores con ciertas condiciones de enfermedad autoinmune o alérgica. También se ha reportado que la manipulación del modelo de ratón hu-PBMC SCID con ciertas citocinas puede proporcionar la generación de niveles significativos de isotipo no IgG, incluyendo la IgE (Kilchherr et al., Cellular Immunology, 151:241 (1993); Spiegelberg et al., J. Clin . Investigation, 93:711 (1994); y Carballido et al., J. Immunol . , 155:4162 (1995)). Los hu- PBMC-SCID, también han sido utilizados para generar IgE específica para el antígeno siempre que el donador haya sido cebado para el antígeno in vivo . Por lo tanto, el propósito principal de los inventores de la presente se enfocó en el establecimiento de un modelo de ratón hu-PBMC-SCID productor de IgE humana adecuado que pudiera ser utilizado para probar la eficacia del agente terapéutico para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la IgE, tales como trastornos alérgicos, incluyendo los anticuerpos anti-CD23 objeto.

Materiales y Métodos : Los siguientes materiales y métodos se utilizaron en el modelo de ratón hu-PBMC-SCID descrito a continuación. Ratones SCID: Los ratones inmunodeficientes C.B-17 scid/scid se obtuvieron de Taconic (C.B. -17/IcrTac-scidfDF) y se mantuvieron en las instalaciones para animales de IDEC Pharmaceuticals. Los ratones se alojaron en unidades con microbarreras esterilizadas con lechos esterilizados. Los estudios de los animales se efectuaron de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" especificada por el Committee on Care of Laboratory Animal Resources Commission on Life Science-National Research Council (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, DHHS Publ. No. (NIH) 86-23, Bethesda, MD, NIH, 1985) . PBMC Humano: Las PBMC se aislaron de recubrimientos aterciopelados obtenidos de una banco de sangre por centrifugación a través de Ficoll-Hypaque (Histopaque-1077) de acuerdo a lo recomendado por el fabricante (Sigma Diagnostics, Catálogo # 1077-1) . La preparación de linfocitos en la interfaz del gradiente se cosechó y lavó tres veces en Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) (Bio-Whittaker, Catálogo # 10-527F) . Por cada experimento las PBMC se obtuvieron de dos donadores separados y se cultivaron por separado in vi tro . Las PBMC se resuspendieron a una concentración 1-3 x 106 células/ml en medio HB-Basal más 1% de suplemento liofilizado HB101 (Irvine Scientific, Catálogo # T000 & T151) con un contenido de 5% de FCS más 1000 IU/ml de IL-4 (Genzyme, Inc. Catálogo # 2181-01) y se incubaron durante 48 horas a 37 °C con 5% de C0 . Después de la incubación, las células de diferentes recubrimientos aterciopelados se cosecharon, se reunieron y utilizaron para reconstituir ratones SCID.

Condiciones de Ensayo In Vivo Grupos de ratones (cuatro a cinco por grupo) se inyectaron con cincuenta y seis x 106 linfocitos en un volumen de 200-300 µl de HBSS intraperitonealmente (i.p.) el día cero. Para los grupos que recibieron anticuerpo anti-CD23, el dia cero, las PBMC se mezclaron con anticuerpos anti-CD23 (200 a 400 µg/ratón) antes de la inyección i.p. y la segunda inyección se dio al séptimo día. Todos los ratones recibieron 5000 IU por ratón de IL-4 i.p., entre el día cero al día cinco. Un grupo el cual no fue' inyectado con anticuerpo sirvió como el grupo control. Los ratones fueron sangrados de una vena retroorbital y el suero se analizó para detectar IgG e IgE a los catorce, veintiuno, veintiocho y treinta días por ELISA. Le Figura 8 muestra que el anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 es efectivo para inhibir la producción de IgE inducida por IL-4 in vivo en un modelo de ratón SCID.

Clonación de la Expresión de Anticuerpos Monoclonales anti- CD23 humano PRIMATIZED .f' Para clonar dominios variables de inmunoglobulina de primate, el Poli A+ ARN se aisló por separado de aproximadamente 2xl06 células de heterohibridomas de primate que secretaban los anticuerpos monoclonales anti-CD23 humanos 6G5 y 5E8 utilizando el Equipo de aislamiento de ARNm Micro-FastTrack (Invitrogen Catálogo # K1520-02) de acuerdo a los métodos expuestos por el fabricante. La primer hebra del ADNc se sintetizó a partir del poli A+ ARN utilizando el Equipo de Ciclo de ADNc (Invitrogen Catálogo # L1310-01) de acuerdo a los métodos convencionales. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada del 6G5 y el 5E8 se aislaron a continuación por PCR a partir de ADNc utilizando cebadores de PCR que fueron seleccionados en base a familias de consenso diferentes de inmunoglobulinas humanas. Se seleccionaron los -cebadores 5' que correspondieron al comienzo de las secuencias líder de la región variable ligera y pesada y se seleccionaron los cebadores 3' que correspondieron a la región J (Los cebadores específicos utilizados para la PCR amplifican el dominio variable de la cadena ligera lambda del 6G5, los dominios variables de la cadena ligera kappa del 5E8, y los dominios variables de la cadena pesada del 6G5 y 5E8 se exponen en las Tablas 1-3) . La PCR se efectuó utilizando los métodos estándar (30 ciclos con 1 minuto a 94 °C, 1.5 minutos a 54 °C y 2 minutos a 72°C en un tubo Hot star caliente (Gibco BRL Catálogo # 10332-013) . La PCR se estableció en reacciones de 50 µl que contenían 5 µl de 80 µl de ADNc (de 2xl06 células) como un patrón, 2 µl de dNTP 5 nM, 1 µl de polimerasa Taq, 5 µl de amortiguador de polimerasa Taq, 2 µl del cebador 5' (25 pmoles/µiy 2 µl del cebador 3' (25 pmoles/µl ) , y 36 µl de agua. (La polimerasa Taq y el amortiguador se obtuvieron de Stratagene Catálogo # 600131, dNTP de Boehringer Manheim Catálogo #1581295) .

A) Construcción de los plásmidos N5LG1 + 6G5 y N5LG4P + 6G5 1) Clonación del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 por PCR La primera amplificación por PCR de la región variable de la cadena ligera del ADNc del anticuerpo monoclonal de primate 6G5 mostró bandas, las cuales fueron consistentes in si tu con la región variable de la cadena ligera lambda. Esas bandas aparecieron en todas las reacciones utilizando los tres cebadores de la secuencia líder inicial diferente. (Véanse las Tablas 1-3) . Sin embargo, el producto de la PCR obtenido utilizando el cebador 745 (familia 2) , se consideró más específico debido a la intensidad relativamente mayor de la banda del producto de la PCR. Este producto de la PCR se aisló utilizando un equipo de Extracción de Gel Qiaquick (Qiagen, Catálogo # 28704). El fragmento de la PCR purificado se digirió con endonucleasas de restricción Bgl II y Avr II, y se ligó en el vector de expresión de mamífero N5LG1, el cual se digirió con las mismas endonucleasas de restricción. Veinte microlitros de la mezcla de ligación que contenía el producto de la PCR purificado de una reacción de PCR de cincuenta microlitros, 100 mg de vector N5LG1, dos microlitros de amortiguador de ligación lOx (NEB, Catálogo # 202S) y dos microlitros de ligasa T4 (NEB Catálogo # 202S) , se incubaron a continuación a 14 °C durante la noche. El vector de expresión del mamífero N5LG1 contiene secuencias genéticas (por ejemplo, secuencias reguladoras, secuencias codificadoras) las cuales proporcionan la expresión de cuatro proteína separadas en una célula de mamífero. Ellas son: (i) una cadena ligera de inmunoglobulina parcial con la región constante de la cadena ligera lambda humana y sitios de endonucleasa de restricción únicos para insertar los dominios variables de la cadena ligera; (ii) una cadena pesada de inmunoglobulina parcial con las secuencias codificadoras de la región constante de la cadena gamma 1 humana y los sitios de endonucleasa de restricción únicos para insertar los dominios variables de la cadena pesada; (iii) un gen de neomicin fosfotransferasa utilizado para seleccionar las células que han incorporado el plásmido y son resistentes al antibiótico Geneticina (Gibco BRL, Catálogo # 10131-1209) ; y (iv) un gen de dihidrofolato reductasa murino (DHFR) el cual proporciona la selección y amplificación genómica cuando las células son cultivadas en presencia de metotrexato (MTX, Sigma, Catálogo # A-6770) (Reff et al., Blood, 83:433-445 (1994). Después de la ligación, la mezcla se digirió utilizando la endonucleasa de restricción Pme, la cual digiere el plásmido N5LG1 original, pero no el plásmido N5LG1 que ha sido ligado al dominio variable ligero del 6G5. Después de la digestión, la mezcla se transformó en células competentes Epicurían coli XLl-Blue (Stratagene, Catálogo # 200249) como sigue. Cien microlitros de las células competentes se mezclaron con 10 µl de la mezcla de ligación anterior, montada sobre hielo durante 30 minutos, a continuación se calentó a 45°C durante 30 segundos. Esta mezcla se colocó sobre hielo durante 2 minutos, y a continuación se agregaron 900 µl de SOC, precalentado a temperatura ambiente. (El SOC es el caldo LB de Gibco BRL, Catálogo # 10855-013, más MgCl2 0,02 M, MgS04 0.02 M, y D-glucosa 0.02 M) . Después de la incubación a 37°C durante una hora, la mezcla se centrifugó a 4000 g durante un minuto, y los 800 µl del sobrenadante se desecharon. El resto de la mezcla se cultivó sobre un disco de agar LB (Gibco BRL, Catálogo # 1294-044) que contenía 50 µg/ml de ampicilina (Amp. Gibco BRL, Catálogo # 13075-015) . El ADN plasmídico se aisló en colonias individuales de E. coli que crecieron en la placa de Amp utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard Miniprep (Promega, Catálogo # A7510) . El ADN plasmídico aislado se caracterizó entonces por digestión con Bgl II y Avr II seguidos por electroforesis sobre gel de agarosa. Una banda de ADN teñida con etidio de 400 pb fue indicativa de una clonación exitosa potencial del dominio variable de la cadena ligera. Para confirmar esto se efectuó el secuenciamiento del dominio variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina utilizando el Equipo de Secuenciamiento de 'ADN Sequenase 7-Deaza -dGTP (USb, Catálogo # 70990) con los cebadores de secuenciamiento 607 y GE 108. (Véanse los Cebadores de Secuenciamiento en la Tabla 4) . Se efectuó una segunda amplificación por PCR independiente de la cadena ligera del ADNc en el anticuerpo monoclonal de primate 6G5 utilizando una secuencia líder inicial del cebador 5' de la familia 2 de la cadena ligera lambda (cebador 745) y el cebador de la región J 3' 926.

(Véanse los Cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena ligera lambda del 6G5 en las tablas 1-3) . El producto de la PCR aislado (véase la técnica anterior) se clonó en el vector TA utilizando el Equipo de Clonación TA Original (Invitrogen, Catálogo # K2000-01) . El ADN mniprep aislado (véase la técnica más arriba) se examinó bajo electroforesis sobre gel de agarosa después de la digestión con la endonucleasa de restricción EcoR I. El " producto de la PCR resultante comprendido en el vector TA fue secuenciado entonces (como se describió anteriormente) utilizando los cebadores hacia adelante Sp6 y I3" (-40) (Véanse los cebadores de Secuenciamiento en la Tabla 4) . La secuencia de la cadena ligera resultante fue idéntica a la de la cadena ligera de la primer PCR. Esta secuencia completa del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 se presenta a continuación.

Región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 Lider Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Val Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr ATG GCC TGG ACT CTG CTC CTC GTC ACC CTC CTC ACT CAG GGC ACÁ -1 Gly Ser Trp Ala GGA TCC TGG GCT Proteína Madura (La Numeración es la de Kabat) Marco 1 1 9 11 Gln Ser Ala Pro Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly CAG TCT GCC CCG ACT CAG CCT CCC TCT GTG TCT GGG TCT CCT GGA 20 23 Gln Ser Val Thr lie Ser Cys CAG TCG GTC ACC ATC TCC TGC CDR 1 24 27 27A 27B 27C 28 34 Thr Gly Thr Ser Asp Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser ACT GGA ACC AGC GAT GAC GTT GGT GGT TAT AAC TAT GTC TCC Marco 2 35 40 49 Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met lie Tyr TGG TAC CAA CAC CAC CCA GGC AAA GCC CCC AAA CTC ATG ATT TAT CDR2 50 56 Asp Val Ala Lys Arg Ala Ser GAT GTC GCT AAG CGG GCC TCA Marco 3 57 60 70 Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala GGG GTC TCT GAT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC 80 Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr TCC CTG ACC ATC TCT GGG CTC CAG GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT Tyr Cys TAC TGT CDR 3 89 90 95 95A 96 97 Cys Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Thr Leu Leu TGT TCA TAT ACÁ ACC AGT AGC ACT TTG TTA Marco 4 98 100 106 106a 107 Phe Gly Arg Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly TTC GGA AGA GGG ACC CGG TTG ACC GTC CTA GGT 2) Clonación del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 por PCR La primer amplificación por PCR del dominio variable de la cadena pesada del ADNc del anticuerpo monoclonal de primate 6G5 se efectuó utilizando el conjunto de cebadores de la secuencia líder inicial descritos supra y el cebador de la región J 3' GE244. Esos cebadores se encuentran en las Tablas 1-3 infra. Esta reacción dio como resultado un producto de la PCR de 350 bases. Este producto de 350 bases (purificado como se describió supra) , se digirió con Nhe I y Sal I, y se ligó en el N5LG1 y se digirió con las mismas endonucleasas en la primer amplificación por PCR. La mezcla de ligación resultante fue transformada en las células huésped utilizando las mismas técnicas para clonar la cadena ligera. El plásmido N5LG1 contenía el producto de la PCR de 350 bases se aisló y secuenció entonces (utilizando los cebadores de secuenciamiento 266 y 268). (Esos Cebadores de secuenciamiento se exponen en la Tabla 4). El secuenciamiento reveló que el producto de la PCR contenía únicamente una parte del dominio variable pesado y que contenía una supresión en su amino terminal (La secuencia comenzó en el marco 2, codón 36) . Se condujo una segunda reacción de la PCR independiente para amplificar y aislar el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de primate 6G5 utilizando un cebador de la secuencia líder inicial 5' para la familia 1 (MB1503) y un cebador de la región J' 3' GE244. (Esos cebadores también están contenidos en las Tablas 1-3). El producto de la PCR resultante se clonó entonces en el N5LG1 utilizando las mismas técnicas descritas supra . Se encontró que su secuencia era idéntica a la del primer producto de la PCR. Por lo tanto, para clonar el dominio variable de la cadena completa del 6G5 incluyendo el 5' terminal ausente se utilizó entonces un cebador 3' más largo novedoso (MB1533) el cual incluía las regiones CDR3 y el marco 4 de la cadena variable pesada 6G5 en una tercer reacción de PCR independiente con el cebador 5' de la familia 1 (MB1503) . (Esos cebadores también están contenidos en las Tablas 1-3) . Después de la PCR, se observó un producto de la PCR de 420 bases más grandes sobre el gel de agarosa. Este producto de la PCR se aisló de acuerdo a lo descrito anteriormente, y se clonó un vector TA. El producto de la PCR resultante contenido en el vector de la TA fue entonces secuenciado. El secuenciamiento reveló que este ADN contenía todo el dominio variable pesado y que la parte 3' fue idéntica a la del dominio variable de la cadena pesada parcialmente clonado de las dos primeras reacciones de la PCR.

Se efectuó una cuarta PCR independiente utilizando los mismos cebadores que para la tercera amplificación por PCR. Esta dio como resultado un producto de la PCR el cual se aisló y clonó en el vector TA como se describió anteriormente. Se encontró que el cuarto producto de la PCR independiente era idéntico al obtenido en la tercer amplificación por PCR. Esta secuencia, la cual comprende el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5, se representa a continuación .

Región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 6G5 Líder Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCT CCC AGA Trp Val Leu Ser TGG GTC CTG TCC Proteína Madura (La Numeración es la de Kabat) Marco 1 1 10 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Lys Pro Ser CAG CTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA GTG GTG AAG CCT TCG 20 30 Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Val Ser GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC GCT GTC TCT GGT GGC TCT GTC AGC CDR 1 31 35 35A Ser Ser Asn Trp Trp Thr AGT AGT AAC TGG TGG ACC Marco 2 36 40 49 Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT GGA CDR2 50 52 52A 53 60 Arg lie Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu CGT ATC TCT GGT AGT GGT GGG GCC ACC AAC TAC AAC CCG TCC CTC 65 Lys Ser AAG AGT Marco 3 66 70 80 Arg Val lie lie Ser Gln Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu CGA GTC ATC ATT TCA CAA GAC ACG TCC AAG AAC CAG TTC TTC CTG 82 82a 82b 82c 83 90 Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AAC CTG AAC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 94 Ala Arg GCC AGA CDR 3 95 100 100a 100b 100c lOOd 101 102 Asp Trp Ala Gln lie Ala Gly Thr Thr Leu Gly Phe GAT TGG GCC CAA ATA GCT GGA ACÁ ACG CTA GGC TTC Marco 4 103 110 113 Trp Gly Gln Gly Val Leu Va Thr Val Ser Ser TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3) Construcción de los vectores de expresión de mamífero Para insertar los dominios variables de la cadena pesada clonados del 6G5 en un vector de expresión de mamífero, el dominio variable de la cadena pesada en el vector TA (obtenido en la 3er PCR independiente) se digirió con Nhe I y Sal I y se clonó en el vector N5LG1 el cual se digirió con las mismas enzimas de restricción y vector el cual ya contiene el dominio variable de la cadena ligera. El vector de expresión de mamífero resultante se nombró N5LG1 + 6G5. Para construir el vector N5LG4P + 6G5, ambos dominios variables de la cadena ligera y pesada fueron aislados del N5LG1 + 6G5 mediante la digestión de Bgl II y Avr II, y Nhe I y Sal I, respectivamente. El vector N5LG4P de expresión de mamífero es idéntico al vector N5LG1 descrito anteriormente, excepto que la región gamma 1 humana fue reemplazada con la región constante gamma 4 humana, que contiene una mutación de una serina a una prolina en la región del asa para incrementar la estabilidad de la inmunoglobulina y mejorar la farmacocinética in vivo (mutación "P") . EL dominio variable de la cadena ligera se clonó en el plásmido primero, y el dominio variable de la cadena pesada se clonó en el vector que contiene el dominio variable de la cadena ligera, utilizando las técnicas anteriormente descritas. Este vector de expresión de mamífero se nombró N5LG4P + 6G5.

B. Construcción de los plásmidos N5KG4P + 5E8 , N5KG1 + 5E8, N5KG4P + 5E8N-, y N5KG1 + 5E8N- 1. Clonación del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 por PCR La primer reacción PCR del dominio variable de la cadena ligera del ADNc del 5E8, se llevó a cabo utilizando un conjunto de cebadores de la secuencia líder inicial kappa y el cebador de la región J 3' GE204. (Véanse los cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena ligera kappa del 5E8 en las Tablas 1-3) . Se obtuvo un producto de la PCR de 420 bases. El producto de la PCR de 420 bases aislado, se digirió por las endonucleasas de restricción Bgl II y BsiW I, se clonó en el vector de expresión de mamífero N5KG4P y se secuenció utilizando los cebadores GE108 y 377 (los cuales están contenidos en la Tabla 4). El vector de expresión de mamífero N5KG4P es idéntico al vector N5LG4P, excepto que contiene la región constante de la cadena ligera kappa humana en lugar de la región constante de la cadena ligera lambda humana. El secuenciamiento de este ADN polinucleotídico 420 revelo que contiene todo el dominio variable de la cadena ligera kappa. Se efectuó una segunda PCR independiente de la región variable de la cadena ligera utilizando del cebador de la familia 1 5' GE201 y el cebador 3' GE204. (Véanse los cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena ligera káppa del 5E8 en las' Tablas 1-3). El producto de la PCR aislado, se clonó en el vector TA (utilizando los métodos anteriormente descritos) y se secuenció utilizando los cebadores promotores Sp6 y T7. El secuenciamiento reveló que este producto de la PCR era idéntico al obtenido de la primer PCR. Toda la secuencia del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 se presenta a continuación .

Región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 Líder Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTT CTG CTC -1 Trp Leu Pro Gly Ala Arg Cys TGG CTC CCA GGT GCC AGA TGT Proteína Madura (La Numeración es la de Kabat) Marco 1 1 10 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCT TCC CTG TCT GCA TCT GTA 20 23 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CDR 1 24 20 34 Arg Ala Ser Gln Asp lie Arg Tyr Tyr Leu Asn AGG GCA AGT CAG GAC ATT AGG TAT TAT TTA AAT Marco 2 35 40 49 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT CDR2 50 56 Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser GTT GCA TCC AGT TTG CAA AGT Marco 3 57 60 70 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACÁ GAG TTC 80 Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr ACT CTC ACC GTC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT Tyr Cys TAC TGT CDR 3 89 90 97 Leu Gln Val Tyr Ser Thr Pro Arg Thr CTA CAG GTT TAT AGT ACC CCT CGG ACG Marco 4 98 100 107 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 2) Clonación del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 por PCR La primer PCR del dominio variable de la .cadena pesada del 5E8 se efectuó utilizando un conjunto de cebadores de la secuencia de la cadena pesada líder inicial 5 ' y el cebador 3' GE210. (Véanse los cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena pesada del 6G5 y el 5E8 en la Tabla 1) . El producto de la PCR de 420 bases apareció en la reacción del cebador de la familia 3. El producto de la PCR se purificó y a continuación se digirió con Nhe I y Sal I y se clonó en el vector N5KG4P del vector de expresión de mamífero (como se describió anteriormente) . El producto de la PCR se secuenció utilizando los cebadores 268 y 928. (Véanse los cebadores de secuenciamiento en la Tabla 4). Se efectuó un segundo PCR independiente para el dominio variable de la cadena pesada del 5E8 utilizando el cebador 5' GE207 de la familia 3 y el cebador 31 GE210.

(Véanse los cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena pesada del 6G5 y el 5E8 en las Tablas 1-3) . El producto de la PCR aislado se clonó en el vector TA utilizando las mismas técnicas anteriormente descritas y se secuenció utilizando los cebadores Sp6 y T7. El secuenciamiento reveló que el TAC del codón 91 había cambiado a TGC. Para determinar el codón apropiado 91, se efectuó una tercera PCR independiente utilizando los mismos cebadores que en la segunda PCR (véase más arriba) . El producto de la PCR se clonó nuevamente en un vector TA y se secuenció utilizando los cebadores Sp6 y T7. Se encontró que la secuencia era idéntica a la secuencia variable de la cadena pesada obtenida en el primer PCR. Por lo tanto, el TGC en la posición 91 en el segundo producto de la PCR independiente es aparentemente el resultado de un error introducido durante la PCR. Esta secuencia completa del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 se presenta a continuación.

Región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de primate 5E8 Líder Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Pro Leu Leu Lys ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT CCT CTT TTG AAA -1 Gly Val Gln Cys GGT GTC CAG TGT Proteína Madura (La Numeración es la de Kabat) Marco 1 1 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGC GGC TTG GCA AAG CCT GGG 20 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCC GGG TTC AGG TTC ACC CDR 1 31 35 35a 35b Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Asp TCC AAT AAC TAC TAC ATG GAC Marco 2 36 40 49 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG CAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA CDR 2 50 52 52A 53 60 Arg lie Ser Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val CGT ATT AGT AGT AGT GGT GAT CCC ACÁ TGG TAC GCA GAC TCC GTG 65 Lys Gly AAG GGC Marco 3 66 70 80 Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe Leu AGA TTC ACC ATC TCC AGA GAG AAC GCC AAC AAC ACÁ CTG TTT CTT 82 82a 82b 82c 83 90 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys CAÍ. ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT 94 Ala Ser GCG AGC CDR 3 95 100 101 Leu Thr Thr Gly Ser Asp Ser TTG ACT ACÁ GGG TCT GAC TCC Marco 4 103 110 113 Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3) Construcción de los vectores de expresión de mamífero El dominio variable pesado en N5KG4P se digirió con Nhe I y Sal I, se purificó, y se clonó en el N5KG4P el cual contiene el dominio variable de la cadena ligera del 5E8. Este plásmido fue entonces digerido con las endonucleasas de restricción como se describió anteriormente. Esto dio como resultado un vector que contiene ambos de los dominios variables ligero y pesado del 5E8. Este vector fue nombrado N5KG4P + 5E8. Los dominios variables pesado y ligero del N5KG4P + 5E8 fueron entonces ambos insertados en el vector de expresión de mamífero N5KG1 para crear el vector N5KG1+ 5E8. 4) Alteración de un aminoácido en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de primate 5E8 por mutagénesis específica y construcción de vectores de expresión de mamífero En base a la secuencia del dominio variable pesado del 5E8, existe un sitio de glicosilación potencial de la inmunoglobulina en el codón de la asparagina 75. Este sitio de glicosilación potencial corresponde a un motivo de glicosilación ligado a la asparagina conservado que tiene la siguiente secuencia tripeptídica: (Asp) - (Cualquier aminoácido excepto prolina) - (Serina o treonina) . Por lo tanto, se. generó un mutante de glicosilación del 5E8, el cual sería incapaz de ser glicosilado en esta posición debido a la modificación de este motivo de glicosilación, reemplazando el codón de la asparagina 75 con una lisina (la cual se 11 encuentra en muchas inmunoglobulinas humanas en esta posición) . La mutagénesis específica del sitio se efectuó por los siguientes métodos. Se efectuó un primer PCR utilizando N5KG4P + 5E8 como patrón y un cebador 3' (correspondiente al codón 71 a 79) y que contiene una mutación en el codón 75 (AAC cambió a AAG, Cebador MB1654, y un cebador 5' al inicio de la secuencia líder (Cebador MB1650) . (Véanse los Cebadores de la PCR Utilizados para l'a Generación de un Mutante de Glicosilación de la Región Variable de la Cadena Pesada del 5E8 expuestos en la Tabla 5) . Se efectuó una segunda PCR sobre el mismo patrón utilizando un cebador 5' (que corresponde al codón 71 a 79) que contiene la misma mutación (Cebador MB1653) y un cebador 3' del extremo del marco 4 (Cebador MB1651) (Véanse los Cebadores de la PCR Utilizados para la Generación de un Mutante de Glicosilación de la Región Variable de la Cadena Pesada del 5E8 en la Tabla 5) . Esos dos productos de la PCR se aislaron y mezclaron en relaciones molares iguales. A continuación se llevó a cabo una tercera PCR independiente utilizando la mezcla del primer y segundo productos de la PCR como patrón con un cebador 5' utilizado en la primera PCR (MB1650) y un cebador 3' utilizando en la segunda PCR (MB 1651) . (Véanse los Cebadores de la PCR Utilizados para la Generación de un Mutante de Glicosilación de la Región Variable de la Cadena Pesada en la Tabla 5) . Se encontró que el producto de la PCR obtenido en la tercera PCR contiene la región que codifica para el dominio variable pesado del 5E8, donde la asparagina 75 había cambiado a lisina. El tercer producto de la PCT fue purificado, digerido con las endonucleasas de restricción Sal I y Nhe I, y clonado en el N5KG4P que contiene el dominio variable ligero únicamente. El producto de la PCR fue secuenciado para confirmar que estaba comprendido del dominio variable pesado mutante. Este plásmido de expresión de mamífero se nombró como N5KG4P + 5E8N-. Para el constructo de N5KG4P + 5E8N-, ambos dominios variables ligero y pesado del N5KG4P + 5E8N- se digirieron con Bgl II y BsiW I, y Nhe I y Sal I, respectivamente. El dominio variable ligero se clonó primero y a continuación se insertó el dominio variable pesado en el plásmido de expresión de mamífero N5KG1, para crear el plásmido N5KG1 + 5E8N-.

Tabla 1 Cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena ligera kappa del 5E8 NOMBRE Cadena ligera V -lider inicial 5' (Bgl II) FAMILIA -22 -21 -20 -19 -18 -17 -16 -15 -14 GE201 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG 3' 1 GE200 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG AGG CTC CCC GCT CAG 3' 2 GE202 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG GAA ¡A/GJCC CCA GC ÍT/G) CAG 3' 3' GE203 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC Cadena ligera Vk-cebador 3' (BsiW I) 113 112 112 110 109 108 107 106 105 104 103 GE204 5' GG TGC'AGC CAC CGT AGC TTT GAT (C/TJTC CA(G/C) CTT 3' Tabla 2 Cebadores para la PCR del dominio variable de la cadena ligera lambda del 6G5 NOMBRE Cadena ligera V-lider inicial 5' (Bgl II) FAMILIA -20 -19 -18 -17 -16 -15 744 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG (G/AiCC TG(G/C) TCC CCT CT 1 745 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG GCC TGG (A/G) CT C(T/C)G CT 2 910 5' AT CAC AGA TCT CTC ACC ATG GC(A/C) TGG A(T/C)C CCT CTC 3 Cadena ligera Vl-cebador 3' (Ayr II) 110 109 108 107 106 105 104 926 5' (AO10 CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT 3' Tabla 3 Cebadores para la PCR de los dominios variables de la cadena pesada del 6G5 y el 5E8 NOMBRE Cadena pesada-lidares inxciales 5' (Sal I) FAMILIA -20 -19 -18 -17 -16 -15 MB1503 5' GCG ACT AAG TCG ACC ATG GAC TGG ACC TGG MB1502 5' GCG ACT AAG TCG ACC ATG AAA CAC CTG TGG 2,4 GE207 5' GCG ACT AAG TCG ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC 3' GE208 5' GCG ACT AAG TCG ACC ATG GGG TCA ACC GCC ATC 3' GE209 5' GCG ACT AAG TCG ACC ATG TCT GTC TCC TTC CTC 3' Cadena pesada-cebador 3' (Nhe I) 110 120 119 118 117 116 115 114 113 112 111 GE244 5' GC CAG GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GCT AGC TGA GGA GAC GG 3' GE210 5' GA TGG GCC CTT GGT GCT AGC TGA GGA GAC GG 3' MB1533 5' GGT GCT AGC TGA GGA GAC GGT 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 99 GAC CAG GAC TCC CTG GCC CCA GAA GCC TAG 3' Tabla 4 Cebadores de Secuenciamiento cebador Sp6 5' AT TTA GGT GAC ACT ATA Cebador hacia adelante M13 (-40) 5' GTT TTC CCA GTC ACG A Cebador Promotor T7 5' AT ATA CGA CTC ACT ATA GGG Cebador GE 108 5' CCG TCA GAT CGC CTG GAG ACG CCA Cebador 377 5' GCA GTT CCA GAT TTC AACG TG CEBADOR 607 5' CCA GGC CAC TGT CAC GGC TTC 3' CEBADOR 266 5' CAG AGC TGG GTA CGT CCT CA 3' CEBADOR 268 5' GCC CCC AGA GGT GCT CTT GG 3' CEBADOR 876 5' ACÁ CAG ACC CGT CGA CAT GG 3' CEBADOR 928 5' GCT CTC GGA GGT GCT CCT GG 3' Tabla 5 Cebadores de la PCR Utilizados para la Generación de un Mutante de Glicosilación de la Región Variable de la Cadena Pesada del 5E8 Sal I -20 -19 -18 -17 -16 ME 1650 5' ACÁ GAC CCG TCG ACC ATG GAG TTT GGG CTG 3' Nhe I 118 117 116 115 114 113 112 111 110 MB 1651 5' CCC CTT GGT GCT AGC TGA GGA GAC GGT 3' 71 72 73 74 75 76 77 78 79 MB 1653 5' AGA GAG AAC GCC AAG AAC ACÁ CTG TTT 3' 79 78 77 76 75 74 73 72 71 MB 1654 5' AAA CAG TGT GTT CTT GGC GTT CTC TCT C) Construcción de vectores gamma-3 Existen numerosos métodos para la conversión de anticuerpos murinos a quimeras en los cuales las regiones constantes de la cadena pesada y ligera son sustituidas con versiones humanas o en las cuales todas excepto los CDR (regiones que determinan la complementaridad) están sustituidas con sus equivalentes humanas. (Véase Biochem. J. 281:317, 1992; Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:10029, 1989; Methods Enzymol. 178:515, 1989; Cáncer Res. 51:181, 1991; Biotechniques 7:360, 1989; J. Immunol. 143:3589, 1989; Int. J. Cáncer 44:424, 1989; Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:3833, 1989) . Además, las secciones anteriores demuestran específicamente que la construcción de vectores para la expresión de anticuerpos gamma-1 y gamma-4 PRIMATIZED® puede efectuarse amplificando el ADN que codifica para las regiones variables de las cadenas ligera y pesada utilizando la PCR, y clonando esas regiones en un vector o vectores de expresión que codifican para los dominios de la región constante humana apropiada. De este modo, sería claro que pueden hacerse constructos similares los cuales codifican para otros dominios de la región constante humana, en tanto estén disponibles vectores de expresión de un mamífero apropiados que también contengan sitios de clonación que permitan la inserción de la región variable amplificada del ADN de los anticuerpos de primate. También deberá ser evidente que los cebadores de la PCR utilizados para amplificar el ADN de la región variable pueden ser diseñados para acomodar varios sitios de clonación por restricción dependiendo del vector utilizado. Los vectores que codifican para el dominio de la región constante de la IgG3 humana son variables en la técnica, y pueden ser utilizados para construir los anticuerpos PRIMATIZED de la presente invención. Por ejemplo, Co et al., han utilizado vectores separados que expresan las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada humanas para construir anticuerpos quiméricos y humanizados, y proporcionar vectores de cadena pesada para el gamma-1 y el gamma-3 humanos. Para clonar las regiones de dominio variable del anticuerpo de interés en esos vectores, un sitio de restricción Xbal se localiza convenientemente justo antes de la región constante en los segmento intrónicos Jk4 y JH3 para las cadenas ligera y pesada, respectivamente (Co et al., 996, Cáncer Res. 56: 1118-1125; Co et al., 1992, J. Immunol. 148: 1149-1154). De este modo, diseñando cebadores de PCR los cuales incorporen los sitios de restricción Xbal , o sitios que creen las mismas asas de una sola hebra como la enzima de restricción Xbal (es decir, Nhel , Spel ) , las regiones variables de un anticuerpo de primate pueden ser asociadas con el dominio de la región constante gamma-3' humano utilizando los vectores descritos en Co et al. De manera alternativa, pueden utilizarse enlazantes o adaptadores para facilitar la clonación. También es posible construir una versión de ADNc de la región constante gamma-3 humana utilizando técnicas de síntesis de ADN e insertar este en los vectores N5KG1 descritos aquí en lugar de la región constante gamma-1 humana entre los sitios Nhel y BamHl . Dependiendo de cuales sitios de restricción sean más convenientes para clonar la región variable particular de interés, existen también otros vectores gamma-3 que han sido descritos en la técnica, y cualquiera de esos puede utilizarse para construir y expresar los anticuerpos gamma-3 de la presente invención. (Véase por ejemplo, Parren et al., 1992, J. Immunol . 148(3) : 695-701; Steplewski et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 4852-4856; y la Patente Estadounidense No. 4,975,369, incorporados aquí como referencia) .

D) Variaciones de los anticuerpos PRIMATIZED La presente invención también abarca anticuerpos PRIMATIZED que contienen mutaciones, sustituciones o supresiones de la región constante. Tales mutaciones pueden ser construidas utilizando las técnicas de mutagénesis dirigida en sitio como se describió anteriormente para el mutante de glicosilación, las cuales son técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos mutante de la presente invención se diseñaron con el propósito de crear un cambio deseado a nivel de la eficiencia terapéutica, es decir una unión del FcR. Sin embargo, deberá comprenderse que cualquier mutación en la región constante de los anticuerpos no deberá alterar las funciones efectoras básicas mediadas por los dominios de la región constante gamma-1 o gamma-3. También es posible alterar otras subclases de anticuerpos gamma por mutagénesis de modo que tengan funciones efectoras similares como un anticuerpo que contiene un dominio gamma-1 o gamma-3. Tales anticuerpos también son abarcados por la presente invención. Por ejemplo, las regiones de la región constante de la IgG implicadas en la unión del FcR y la interacción con el componente del complemento Clq han sido caracterizadas, y se han identificados mutaciones las cuales incrementan o disminuyen la afinidad de la unión. Como se describe en la Patente Estadounidense 5,648,260, incorporada aquí como referencia, cambiar la Leu 235 a Glu en la región constante de la IgG3 humana destruye la interacción del mutante para el receptor Fc gamma Rl humano. Por lo tanto, las mutaciones sobre sitios adyacentes o cercanos en la región de enlace d y la bisagra (es decir reemplazar los residuos 234, 236 ó 235 or Ala) indica que las alteraciones en los residuos 234, 235, 236 y 237 afectan por lo menos la afinidad del receptor Fc gamma Rl . De manera similar, la Patente Estadounidense 5,348,876, también incorporada aquí como referencia, mostró que mediante el incremento de la longitud de la región de la bisagra de la región constante de la IgG3 humana y la alteración de la secuencia de aminoácidos de esta región, la unión de Clq y de este modo la citólisis mediada por el complemento mejoraron aún más. En efecto, las variantes se unieron más al Clq que la IgG3 natural y mucho más que la IgGl. De este modo, está claro en la técnica que pueden utilizarse mutaciones para crear anticuerpos terapéuticos con mayor afinidad por los receptores Fc humanos, quizá para el tratamiento de condiciones médicas más moderadas. Además, pueden ser identificadas las mutaciones que incrementan la actividad de la función efectora, conduciendo por lo tanto a versiones más fuertes para uso terapéutico. Debe reconocerse que se contemplaron mutaciones de la secuencia genética para crear alteraciones en la eficiencia de fármacos, y que también están dentro del espíritu y alcance de la presente invención.

E) Expresión de Anticuerpos PRIMATIZED® en Células de Ovario de Hámster Chino Para aislar los anticuerpos PRIMATIZED®, los vectores que codifican para los anticuerpos se expresaron en células de Ovario de Hámster Chino utilizando el siguiente protocolo. Se purificó un ADN plasmídico a gran escala utilizando el Sistema de Purificación de ADN WIZAR® Maxipreps (Promega, Catálogo # A7421) . El ADN purificado se digirió con Ssp I y BspLUll I, se precipitó con etanol una vez, y se resuspendió en TE estéril. El ADN plasmídico restringido con endonucleasa, purificado, se introdujo entonces en células de ovario de hámster Chino (CHO) DG44 sin hidrofolato reductasa utilizando electroporación. La técnica de electroporación utilizada se describe a continuación. Se centrifugaron aproximadamente 1.6 x 108 células CHO en un tubo Corning estéril de tamaño apropiado durante un minuto a 1000 RPM. Los medios se removieron y las células fueron lavadas en quince mililitros de SBS (solución amortiguada de sucrosa estéril en sucrosa 272 mM, fosfato de sodio 7 mM pH 7.4, MgCl2 1 mM) enfriada en hielo, estéril y se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 RPM. La SBS fue removido y las células fueron suspendidas utilizando SBS estéril enfriada en hielo, fresca a una concentración celular de lxlO7 células por ml y se dejó sobre hielo durante 15 minutos. Elelectroporador BTX 600 se encendió y prefijó a 230 volts, con la perilla de voltaje máximo siendo colocada a 500 volts/capacitancia y resistencia. La capacitancia se fijó en 400 microfaradios y la resistencia se fijó en 13 ohms (comenzando en Rl) . A continuación se colocaron el ADN plasmídico (4 µg de ADN o 2 µg de ADN) y 0.4 ml de células (4 x 106 células) en cubetas de 0 . 4 ml de BTX (BTX, Catálogo # 620). Las células se pusieron en choque colocando la cubeta en el gabinete del BTX 600 y presionando el botón fijador de carga automática. Se efectuaron aproximadamente 20 electroporaciones separadas con cada plásmido de expresión de mamífero. Después del choque, las cubetas se dejaron a temperatura ambiente durante quince minutos. Las células y el ADN de cada cubeta fueron resuspendidas en 20 ml de CHO-SSFMII que no contenía hipoxantina o timidina (Gibco BRL, Catálogo # 31033-012) a la cual se había agregado suplemento HT (100X de suplemento en hipoxantina sódica 10 mM, timidina 1.6 mM, Gibco BRL, Catálogo # 11067-014). Las células de una sola cubeta electroporadas se cultivaron entonces en placas de 96 pozos (200 µl/pozo) y se colocaron en un incubador a 37 °C con C02. La selección comenzó dos a tres días más tarde cambiando los medios a los medios anteriores con la adición de 400 mg/ml de Geneticin® (G418, Gibco BRL, Catálogo # 10131-019) . Las células se hicieron crecer a 37°C y los medios celulares se cambiaron cada 3-5 días. Dieciséis días después aparecieron clonas resistentes G418 en los pozos y los sobrenadantes se ensayaron para la expresión del anticuerpo por ELISA. Las clonas de mayor expresión se expandieron entones individualmente. Los anticuerpos monoclonales se purificaron como se describe más adelante.

ELISA de la Inmunoglobulina Las placas (Immulon 2, Dynatech Laboratories, Inc.

Catálogo # 011-010-3455) se recubrieron durante la noche a 4°C con 200 ng de anticuerpo anti-lgG humana de cabra sin marcar a 100 µl/pozo. Esto se efectuó utilizando veinte mililitros de anti-lgG humana de cabra sin marcar/10 mis de Amortiguador de Recubrimiento/placa (Boehringer Mannheim Ab, Catálogo # 605 400). (Dilución 1:500 de patrón de ~ lmg/ml) . El amortiguador de recubrimiento se removió entonces de las placas y se secó utilizando una toalla de papel. A continuación se agregaron cien microlitros de un amortiguador de dilución/pozo.

Las soluciones y estándares de anticuerpo (100 ng/ml - 2.5 ng/ml) se agregaron entonces por triplicado a 100 µl/pozo directamente a 100 ml de amortiguador de dilución. Las soluciones y estándares de anticuerpo están contenidas en el amortiguador de dilución. Las soluciones resultantes se incubaron entonces durante al menos 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, el contenido de cada placa se removió y las placas se lavaron cinco veces con agua corriente. Las placas se secaron entonces sobre una toalla de papel. Después de secar las placas, se agregó entonces un segundo anticuerpo a 100 µl/pozo. Este segundo anticuerpo es anti-kappa humana-HRPO de cabra: agregado a una dilución 1/10,000 o 1 µl de Ac/10 mis de amortiguador de dilución/placa, disponible de Southern Biotechnology Associates, Inc. Catálogo # 2060-05 o un anti-lambda humana-HRPO de cabra; utilizado a una dilución de 1/20,000 o 1 µl de Ac/20 ml de amortiguador de dilución/2 placas (disponible de Southern Biotechnology Associates, Inc. Catálogo # 2070-05) . El anticuerpo y el contenido de la placa se dejaron incubar durante una hora a 37 °C. Después de la incubación se removió el contenido de cada placa. Las placas se lavaron nuevamente cinco veces con agua corriente, y las placas lavadas se secaron. A las placas secas se agregó el sustrato HRPO (Micropozo TMB - dos componentes) en una cantidad de 100 µl/pozo. (Cinco mililitros de Sustrato de Peroxidasa TMB + cinco mililitros de Solución de Peroxidasa B/placa (Kirdgaard y Perry Labs, reactivos de dos componentes del Micropozo TMB, Catálogo # 50-76-00) . La reacción se detuvo mediante la adición de cien microlitros de H2S04 2M a cada pozo cuando el estándar más débil (2.5 ng/ml) es visible sobre el fondo. La densidad óptica de los pozos en las placas se leyó entonces utilizando un lector de placas, por ejemplo, el lector de microplacas de precisión Molecular Devices Emax fijado a una longitud de onda: DO 450 y OPT2 (DO 540) .

AMORTIGUADORES PARA EL ELISA Amortiguador de Recubrimiento Carbonato de Sodio 0.8 gramos / litro Bicarbonato de Sodio 1.55 gramos / litro Ajustar pH a 9.5 con ~ lml de HCl ÍN Amortiguador de Dilución 0.5% de Leche Seca Desgrasada en PBS más 0.01% de Timerosal (5 gm/L) (100 mg/L) Los ejemplos de los valores de ELISA obtenidos utilizando el ensayo descrito anteriormente se describe a continuación.

Estándar DO 450 DO 450 Promedio 100 ng/ml 0.805 ' 0.876 0.841 50 ng/ml 0.395 0.472 0.434 25 ng/ml 0.213 0.252 0.233 10 ng/ml 0.089 0.105 0.097 5 ng/ml 0.054 0.055 0.055 2.5 ng/ml 0.031 0.035 0.033 0 ng/ml 0.004 0.006 0.005 ESTÁNDARES DEL AMORTIGUADOR DE DILUCIÓN La dilución apropiada de patrón AB (filtrada estéril en la solución salina normal, determinación de proteína por DO) para dar 1 mg/ml EJEMPLO : El anti-CD4 de mono/humano quimérico (CE9.1) es 4.18 mg/ml 24 µl del anterior en 76 µl de Amortiguador de Dilución es 1 mg/ml 50 µl de Ac Patrón (1 mg/ml) en 450 µl de Amortiguador de Dilución (D.B.) es 100 µg/ml 50 µl de la mezcla anterior en 450 µl de D.B. es 10 µg/ml 200 µl de la mezcla anterior en 1.8 mis de D.B. es 1 µg/ml 1 ml de la mezcla anterior en 9 mis de D.B. es 100 ng/ml 5 ml de la mezcla anterior en 5 ml de D.B. es 50 ng/ml 5 ml de la mezcla anterior en 5 ml de D.B. es 25 ng/ml 4 ml de la mezcla anterior en 6 ml de D.B. es 10 ng/ml * 5 ml de la mezcla anterior en 5 ml de D.B. es 5 ng/ml * 5 ml de la mezcla anterior en 5 ml de D.B. es 2.5 ng/nl * ^Estándares utilizados en el ELISA Purificación del Anticuerpo por Proteína A Procedimiento El sobrenadante del cultivo se centrifugó para remover células y restos. El centrifugado se filtró entonces a través de un filtro de 0.2µm. A continuación se preparó una Columna de flujo rápido de sepharose y proteína A (Flujo rápido de sepharose y proteína A recombinante) (Pharmacia Biotech, Catálogo # 71-5000-09) y se equilibró utilizando PBS (pH 7.4) . El sobrenadante se cargó sobre la columna a una velocidad de flujo apropiada (por ejemplo, 2 ml/min). Después de cargar, la columna se lavó con 10 volúmenes de la columna de PBS (pH 7.4.). El anticuerpo se eluyó de la columna utilizando un amortiguador de elución (ácido acético 0.2M, glicina 0.1 M pH 3.5) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. A continuación se recolectaron fracciones de un mililitro/tubo que incluían 100 µl de Tris. A continuación se tomó la lectura de la absorbancia de espectrofotómetro a 280 nm. A continuación se recolectaron las fracciones de anticuerpo y se dializaron contra el PBS (pH 7.9) durante la noche. El dializado se esterilizó entonces por filtración a través de una membrana de 0.22 µm y se almacenó a -20 °C.

Resultados del Ensayo Los anticuerpos anti-CD23 humano gamma-4 PRIMATIZED® que se describieron supra , se purificaron y ensayaron para la actividad inhibidora de la IgE inducida in vi tro. Esos resultados están contenidos en las Figuras 3 y 5.

Esto se efectuó utilizando el ensayo de IgE de IL-4 in vi tro descrito supra . Los resultados de esos ensayos indican de manera sorprendente que ambos anticuerpos anti-CD23 humano gamma-4 humano no fueron tan activos como los anticuerpos anti-CD23 humano de primate correspondientes, es decir, que no inhibieron significativamente la producción de IgE inducida in vitro. Sin embargo, debido a que el 5E8 y p5E8G4P de primate tienen un sitio de glicosilación ligado a la asparagina potencial en la región variable de la cadena pesada, se investigaron los efectos de la glicosilación en este sitio. (Se encontró que ambos anticuerpos contiene oligosacáridos N-ligados en este sitio. (No se muestran los datos) ) . Por lo tanto, para prevenir la glicosilación, la asparagina en el sitio de glicosilación fue cambiada a una lisina para eliminar la adición de carbohidrato. Este anticuerpo mutante fue nombrado p5E8G4PN-. Los resultados del ensayo demostraron que este anticuerpo se comportó idénticamente al p5E8G4P en el ensayo de IgE de IL-4 (véase la Figura 3) y que también exhibió una Kd de afinidad aparente idéntica por el CD23 humano. (Véase la Figura 4). Por lo tanto, esos resultados indicaron que la diferencia en la inhibición de la IgE observada del anticuerpo PRIMATIZED® gamma 4 5E8 en comparación con el anticuerpo 5E8 de primate no fue atribuible a las diferencias en la glicosilación. Los tres anticuerpos de primate (p5E8G4P, p5E8G4PN-y pGG5G4P) fueron entonces expresados como versiones gamma-1 humanas utilizando sustancialmente la misma metodología. Se encontró que los tres anticuerpos anti-CD23 humano gamma-1 humana, designados respectivamente como p5E8Gl, p5E8GlN- y pGGSGl, son activos en el ensayo de IL-4/IgE in vitro (Figuras 3 y 5) . Se encontró que el p5E8Gl es estadísticamente más supresor que el p5E8G4P a una con de 0.3 µg/ml (P[T,t] una cola + 0.0055) y a 3 µg/ml (p[T<t] una cola + 0.0019). además, el p5E8GlN- es estadísticamente más supresor que el 5E8G4PN- tanto a 0.3 µg/ml (p[T<t] una cola + 0.0392) y a 3 µg/ml (p[T<t] una cola + 0.0310) (Figura 3). De manera similar, el p6G5Gl inhibió completamente la producción de IgE inducida a 3 mg/ml, mientras que el p6G5G4P no. (Esos resultados están en la Figura 5) . De este modo, esos resultados sugirieron que una región Fc activa, en particular las de la gamma-1 humana, es significativa para la inhibición de la IgE inducida por los anticuerpos anti-CD23 humano. Esos resultados también sugieren que los anticuerpos anti-CD23 humano que contienen las regiones constantes gamma-3 humanas serán significativos para la inhibición de la IgE inducida debido a que una región constante gamma-3 se une a los mismos receptores Fc?R a los que se une la gamma-1, y probablemente mediará el mismo resultado.

EJEMPLO 2 Para confirmar nuestra hipótesis de la implicación de la porción efectora Fc en la inhibición de la IgE de anticuerpos anti-CD23 humano, un tercer anticuerpo de primate, designado como 2C8, que también muestra inhibir la IgE in vi tro) se convirtió a un F(ab')2. La actividad inhibidora de la IgE se determinó utilizando el mismo ensayo de IL-4/IgE descrito anteriormente.

Materiales Se utilizaron los siguientes materiales en este ejemplo. Equipo de Preparación de F(ab')2 ImmunoPure (Pierce, Catálogo # 44888) amortiguador de digestión: amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH .5 ácido cítrico 0.1 M, pH 3.0 (ajustar pH con NaOH) azida de sodio al 0.1% en agua tubo de diálisis; corte de 50,000 MW (Spectra Por, Catálogo # 132 128) baño de agua con agitación capaz de mantenerse a 37°C tubos de cultivo de poliestireno, 17 X 100 mm (Fisher, Catálogo # 14-956-6B) ensayo de proteína BCA (Pierce, Catálogo # 23224) concentradores Centricon-50 (Amicon, Catálogo # 4225) .

Equilibrio de la Pepsina Inmovilizada 0.25 mililitros de la suspensión al 50% de Pepsina Inmovilizada se agregaron a un tubo de prueba de 17 x 100 mm (0.125 ml de gel) . A continuación se agregaron cuatro mililitros de amortiguador de digestión. La pepsina se separó a continuación del amortiguador utilizando el separador de suero. El amortiguador se desechó entonces y el procedimiento de lavado se repitió utilizando otros cuatro mililitros de amortiguador. La pepsina inmovilizada se resuspendió entonces a 0.5 ml de amortiguador de digestión .

Preparación de la Columna de Proteína A Inmovilizada Las columnas de proteína A AffinityPak y los amcrtiguadores de Unión y Elusión ImmunoPure se llevaron a temperatura ambiente.

Preparación de los Fragmentos F(ab') de 2C8 Los fragmentos F(ab')2 del 2C8 se prepararon por los métodos bien conocidos en la técnica de los anticuerpos. Los inventores seleccionaron utilizar un equipo comercialmente disponible, Equipo de Preparación de F(ab')_ ImmunoPure (Pierce, Catálogo # 44888), utilizando los protocolos del fabricante. Diez miligramos de anticuerpo 2C8 liofilizados se disolvieron en un mililitro de un amortiguador de digestión (amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 4.5) . A continuación se agregó un mililitro de la muestra que contenía en anticuerpo a un tubo que contenía pepsina inmovilizada . El anticuerpo y la pepsina inmovilizada se incubaron entonces durante cuatro horas en un baño de agua con agitación a alta velocidad a 37°C (a alta velocidad), teniendo cuidado de mantener el mezclado constante durante la incubación.

Los fragmentos F(ab')2 y Fc solubilizados resultantes y las IgGs no digeridas se recuperaron entonces de gel de pepsina inmovilizada utilizando separador de suero. El digerido crudo se decantó entonces en un tubo limpio. Para aumentar la recuperación de fragmentos F(ab')2, la pepsina inmovilizada se lavó de manera deseable entonces con 1.5 mililitros de amortiguador de unión de IgG ImmunoPure. El lavado se agregó entonces al digerido crudo. Los fragmentos de anticuerpo fueron entonces recuperados utilizando una columna de proteína A. Esto se efectuó abriendo una columna de proteína A inmovilizada. Con cuidado de evitar formar burbujas de aire en el gel. La solución de almacenamiento (la cual contiene 0.02% de azida de sodio) se desechó. La columna de proteína A inmovilizada se equilibró entonces utilizando doce mililitros de amortiguador de unión (contenido en el Equipo de Preparación ImmunoPure) . La columna fue entonces transferida a un tubo de prueba de 17 x 100 mm contenido en el equipo (marcado con "F(ab')2") para recolectar el eluato. Tres mililitros del digerido crudo se aplicaron entonces a una columna y se dejaron fluir completamente hacia el gel. El uso de columnas AffinityPak es deseable, puesto que esas columnas detienen el flujo automáticamente cuando el nivel alcanza la frita superior. La columna se. lavó entonces utilizando seis mililitros de amortiguador de unión. El eluato, el cual contiene los fragmentos F(ab')2 se recolectó a continuación. Este eluato también contiene pequeños fragmentos Fc que no pueden unirse ya a la proteína A (los cuales no están unidos a la columna de proteína A) . Sin embargo, la porción sustancial de los mismos, se eliminó por diálisis. La diálisis se efectuó tomando el eluato que contenía F(ab')2 y dializando el eluato contra solución salina amortiguada con fosfato pH 7.4, utilizando un tubo de diálisis con un corte de peso molecular de 50,000 para eliminar el contenido de los pequeños fragmentos de Fc (Spectra Pur., Catálogo # 132 128). Esto dio como resultado una fracción de F(ab')2 que tiene una densidad óptica de 280 nm de 0.707 (6 ml).

' Después de la diálisis y concentración con concentradores Centricon-50 (Amicon, Catálogo # 4225), el producto F(ab')2 del 2C8 se ensayó para determinar el contenido de proteína utilizando un ensayo de proteína BCA (Pierce, Catálogo # 23224). Se encontró que el contenido de proteína era de 3.76 mg por litro. Los F(ab')2 del 2C8 se ensayaron para determinar la actividad inhibidora de la IgE y se encontró que eran sustancialmente incapaces de inhibir la producción de IgE en los mismos ensayos, in vi tro descritos anteriormente. Esos resultados están contenidos en la Figura 6. En efecto, se encontró que el F(ab')2 antagoniza los efectos supresores de la IgE inducida sobre el anticuerpo monoclonal 2C8. Esos resultados se encuentran en la Figura 7.

EJEMPLO 3 Se evaluaron ambas versiones gamma 1 y gamma 4P PRIMATIZED® del 6G5 monoclonal de primate por su efecto sobre la producción de IgE inducida in vivo en el modelo de ratón SCID descrito anteriormente. Se encontró que el p5E8GlN era tan eficiente como el 5E8 de primate en la inhibición de la IgE inducida. (Véanse las Figuras 8 y 9) . Aunque ni el 6G5 de primate ni el p6G5G4P primatizado fueron efectivos para inhibir la IgE inducida in vi vo, el p6G5Gl primatizado inhibió la producción de IgE inducido. (Véanse las Figuras 9 y 10) . Esos resultados alimentan aún más nuestra conclusión de que una región Fc activa es significativa para la capacidad de un anticuerpo anti-CD23 humano para inhibir efectivamente la producción de IgE inducida .

Mecanismo Propuesto Aunque los resultados de la presente invención demuestran de manera concluyente que una región Fc activa es significativa para la capacidad de un anticuerpo anti-CD23 humano para inhibir efectivamente la producción de IgE inducida, el mecanismo molecular no ha sido descubierto. Sin embargo, pueden hacerse varias hipótesis. Primera, puede ser que los anticuerpos anti-CD23 de la presente invención funcionen para activar una vía de transducción de señales similar como la que es aparentemente activada por la reticulación del receptor de la célula B con los anticuerpos anti-BCR gamma-1. Se tiene la hipótesis de que la desregulación de la señalización del receptor del antígeno en este caso resulta de la coligación de Fc gamma RII y la Ig superficial (receptor de la célula B) sobre la misma célula B, induce a la desregulación de la expresión de la IgE. (D'Ambrosia et al., 1995, Science, 268:293-297 ; Ono et al., 1997, Cell 90: 293-301). En realidad, el CD23 es sobrerregulado sobre la superficie de las células B que expresan IgE, de modo que es posible que la coligación del CD23 y el receptor Fc?RII-B vía la región constante gamma-1 resulte en una vía de transducción de señales similar. De manera alternativa, la inhibición de la expresión de la IgE inducida puede ocurrir a través de la reticulación de la IgE superficial sobre las células B al mismo tiempo que la región Fc ínteractúa con el receptor Fc?R apropiado sobre otro tipo de célula, es decir, una célula T killer, la cual puede entonces "instruir" a la célula B para experimentar apoptósis o conducir a la muerte de la célula de alguna otra manera (es decir, fagocitosis). Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,543,144, incorporada aquí como referencia, propone un mecanismo similar para inhibir células B que expresan IgE con anticuerpos anti-IgE . Como se discute allí, los anticuerpos de ciertas subclases de IgG, tales como el IgG2a de ratón y el IgGl y el IgG3 de humano, pueden mediar la ADCC (Citotoxicidad Celular Dependiente del Anticuerpo) llevada a cabo por ciertos leucocitos fagocíticos que contienen el receptor Fc. Por ejemplo, el OKT3, un anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón específico para el antígeno de la superficie de la célula T humana (la cual fue el primer producto de anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA para comercializarse como una gente terapéutico) es utilizado en pacientes para proporcionar una rápida disminución de las células T en la sangre y para inducir el estado inmunosuprimido (para transplante de riñon) . (Rusell, P. S. et al., Transpl. Proc. 17:39-41 (1985)). El OKT3, a una dosis de 5 mg/día/sujeto, puede agotar completamente las células T circulantes. Los anticuerpos monoclonales descritos en la Patente Estadounidense 5,543,144, especialmente en forma de anticuerpos gamma 2a de ratón o anticuerpos humanos o humanizados que contienen cadenas gamma-1 o gamma-3 humanas, son propuestos para agotar las células B que expresan IgE por el mecanismo ADCC en una forma similar. Pero cualquiera que sea el mecanismo molecular real para inhibir la expresión de la IgE utilizando anticuerpos anti-CD23, está claro que la región Fc, y en consecuencia la función efectora, de los anticuerpos anti-CD23 son consideraciones importantes. Como se discutió anteriormente, puesto que el complemento no está presente en los ensayos in vitro de la presente invención, el fenómeno probablemente implica uno o más receptores Fc?R. Una vez que sean identificados los componentes moleculares relevantes, así como las moléculas internas a las células implicadas en las vías de transducción de señales, será posible diseñar otros agentes terapéuticos que también puedan ser utilizados para inhibir la expresión de la IgE inducida.

Utilidad Debido a su capacidad para inhibir efectivamente la producción de IgE, los anticuerpos anti-CD23 humano objeto que comprenden los dominios constantes gamma-1 humanos, y aquéllos que también pueden ser construidos conteniendo gamma-3, son efectivos para el tratamiento de cualquier enfermedad donde la inhibición de la producción de IgE sea terapéuticamente deseable. Tales enfermedades incluyen a manera de ejemplo enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. Las condiciones específicas que son potencialmente tratables mediante la administración de los anticuerpos que contienen el dominio constante gamma-1/gamma-3 humano anti- CD23 humano incluyen a las siguientes: Aspergilosis broncopulmonar elérgica; Rinitis y conjuntivitis alérgica anemia hemolitica autoinmune; Acantosis nigricans; Dermatitis de contacto alérgica; Enfermedad de Addison; Dermatitis atópica; Alopecia areata; Alepecia universalis; Amiloidosis; Púrpura anafilactoide; Reacción Anafilactoide; Anemia aplástica; Angioedema, hereditario; Angioedema, idiopático; Espondilitis anquilosante; Arteritis, craneal; Arteritis de células gigantes; Arteritis de Tkayasu; Arteritis temporal; Asma; Ataxia-telangiectasia; Ooforitis autoinmune; Orquitis autoinmune; Deficiencia poliendócrina autoinmune; Enfermedad de Behcet; Enfermedad de Berger; Enfemedad de Buerger; bronquitis; Pemfigo buloso; Candidiasis mucocutánea crónica; Síndrome de Caplan; Síndrome de infarto postmiocárdico; Síndrome postpericardotomía; Cerditis; Esproe celiaca; Enfermedad de Chaga; Síndrome de Chediak-Higashi; Enfermedad de Churg-Strauss; Síndrome de Cogan; Enfermedad de aglutinina fría; Síndrome de CREST; Enfermedad de Crohn; Crioglobulinemia; Alveolitis fibrosante criptogénica; Dermatitis herpetiforrae; Dermatomiositis; Diabetes melitus; Síndrome de Diamond-Blackfan; Síndrome de DiGeorge; Lupus eritomatoso discoide; Fascitis eosinofílica; Episcleritis; Dritema elevatum diutinum; Eritema marginal; Eritema multiforme; Ritema nodoso; Fiebre Mediterránea Familiar; Síndrome de Felty; Fibrosis pulmonar; Glomerulonefritis, anafilactoide; Glomerulonefritis, autoinmune; Glomerulonefritis, postestreptocócica; Glomerulonefritis, posttransplante; Glomerulpatía, membranosa; Síndrome de Goodpasture; Enfermedad injerto vs huésped; Granulocitopenia, mediada inmune; Granuloma anular; Granulomatosis, alérgica; Miositis granulomatosa; Enfermedad de Grave; Tíroiditis de Hashimoto; Enfermedad hemolítica del recién nacido; Hemocromatosis, idiopática; Púrpura de Henoch-Schoenlein; Hepatitis, crónica activa y crónica progresiva; Hístiocitosis_X; Síndrome Hipereosinofílico; Púrpura Tromdocitopénica ídiopática; Síndrome de Job; Dermatomiositis juvenil; Artritis reumatoide juvenil (Artritis crónica juvenil); Enfermedad de Kawasaki; Queratitis; Quratoconjuntivitis sica; Síndrome de Landry-Guillain-Barre-Strohl; Lepra, lepromatosa; Síndrome de Loeffler; lupus; Síndrome de Lyell; Enfermedad de Lyme; Granulomatosis linfomatoide; Mastocitosis, sistémica; Enfermedad del tejido conectivo mezclada; Mononeuritis múltiple; Síndrome de Muckle-Wells; Síndrome de nodo linfático mucocutáneo; Síndrome del nodo linfoide mucocutáneo; Reticulohistiocitosis multicéntrica; Esclerosis múltiple; Miastenia gravis; Micosis fungoide; Vasculitis necrosante, sistémica; Síndrome nefrótico; Síndrome superpuesto; Paniculitis; Hemoglobinuria fría paroxismal; Hemoglobinuria nocturna paroxismal; Pemfigoide; Pénfigo; Pénfigo eritematoso; Pénfigo foliáceo; Pénfigo vulgar; Enfermedad del alimentador de palomas; Neumonitis, hipersensibilidad; Poliarteritis nodosa; polimialgia reumática; Polimiositis; Polineuritis, idopática; Polineuropatía familiar portuguesa; Preeclampsia/eclampsia; Cirrosis biliar primaria; Esclerosis sistémica progresiva (Escleroderma) ; Psoriasis; Artritis psoriática; proteinosis alveolar pulmonar; Fibrosis pulmonar, fenómeno/síndrome de Raynaud; Tiroiditis de Reidel; Síndrome de Reiter; Policrondritis recurrente; Fiebre reumática; Artritis reumatoide; Sarcoidosis; Escleritis; Colangitis esclerosante; Enfermedad del suero; Síndrome de Sezary; Síndrome de Sjogren; Síndrome de Stevens-Johnson; Enfermedad de Still; Panencefalitis esclerosante subcutánea; Oftalmía simpática; Lupus eritomatoso sistémico; Rechazo de transplantes; Colitis ulcerativa; Enfermedad del tejido conectivo no diferencia; Urticaria, crónica; Urticaria por frío; Uveitis; Vitíligo; Enfermedad de Weber-Christian; Granulomatosis de Wegener; Síndrome de Wiskott-Aldrich. De esas, las indicaciones preferidas tratables o presentables por la administración de los anticuerpos anti-CD23 incluyen a la rinitis y conjuntivitis alérgicas, dermatitis atópica, eczema; síndrome de Job, asma; condiciones alérgicas; y enfermedades y condiciones inflamatorias crónicas, incluyendo la leucemia linfocítica crónica CLL, caracterizadas típicamente por altos niveles de CD23 membranal y altos niveles en circulación de sCD23 (Sarfart et al., Blood 71: 94-98 (1988)). La cantidad de anticuerpo útil para producir un efecto terapéutico puede ser determinada por técnicas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos generalmente serán proporcionados por la técnica estándar dentro de un amortiguador farmacéuticamente aceptable, y pueden ser -administrados por cualquier ruta deseada. Debido a la eficacia de los anticuerpos reclamados hasta ahora y su tolerancia por los humanos es posible administrar esos anticuerpos repetidas veces para combatir varias enfermedades o estados de enfermedad dentro de un humano . Un experto en la técnica podría, por la experimentación de rutina, determinar que una cantidad efectiva, no tóxica, de anticuerpo sirve del propósito de afectar enfermedades alérgicas y condiciones inflamatorias. De manera general, sin embargo, una dosis efectiva estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal por día. Los anticuerpos de la invención pueden ser administrados a un humano u otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir el efecto a un grado terapéutico o profiláctico. Tales anticuerpos de la invención pueden ser administrados a tal humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo de la invención con un portador o diluente farmacéuticamente aceptable convencional, de acuerdo a las técnicas conocidas. Se ha reconocido por un experto en la técnica que la forma y carácter del portador o diluente farmacéuticamente aceptable está dictada por la cantidad de diluente activo con el cual va a ser combinado, la ruta de administración y otras variables bien conocidas. La ruta de administración del anticuerpo de la invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral como se utiliza aquí incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. La forma intravenosa de la administración parenteral es generalmente la preferida.

Los regímenes de dosificación parenteral y oral diaria para emplear los compuestos de la invención para inducir inmunosupresión profiláctica o terapéuticamente generalmente estarán en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 100, pero de manera preferible de aproximadamente 0.5 a 10, miligramos por kilogramo de peso corporal por día. El anticuerpo de la invención también puede ser administrado por inhalación. "Inhalación" significa la administración intranasal e inhalación oral. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tales como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis medida, pueden prepararse por las técnicas convencionales. La cantidad de la dosificación preferida de un compuesto de la invención a ser empleada generalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 10 a 100 miligramos. El anticuerpo de la invención también puede ser administrado tópicamente. Administración tópica significa administración no sistémica e incluye la aplicación de un compuesto de anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención externamente a la epidermis, a la cavidad bocal e instilación de tal anticuerpo en el oído, ojo y nariz, y donde no entra significativamente la corriente sanguínea. La administración sistémica significa administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La cantidad de anticuerpo requerida para el efecto terapéutico o profiláctico por supuesto, variará con el anticuerpo elegido, la naturaleza y severidad de la condición que esté siendo tratada y el tratamiento al que sea sometido el animal, y está finalmente al discreción del médico. Una dosis tópica adecuada de un anticuerpo de la invención generalmente estará dentro del intervalo de aproximadamente 1 a 100 miligramos por kilogramos de peso corporal por día.

Formul aciones Aunque es posible administrar un anticuerpo o fragmento del mismo sólo, se prefiere presentar este como una formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica, del 0.001% al 10% en peso/peso, por ejemplo, del 1% al 2% en peso de la formulación, aunque puede comprender a lo mucho el 10% en peso/peso pero de manera preferible no exceder del 5% en peso/peso de manera más preferible del 0.1% al 1% en peso/peso de la formulación. Las formulaciones tópicas de la presente invención, comprenden un ingrediente activo junto con uno o más portadores aceptables del mismo y opcionalmente cualesquier otros ingredientes terapéuticos. El portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de la formulación y no dañino al receptor del mismo.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para penetrar a través de la piel al sitio donde se requiere el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, ungüentos o pastas, y gotas adecuadas para administrarse al ojo, oído o nariz. Las gotas de acuerdo a la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles y pueden prepararse disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro preservativo adecuado, y de manera preferible incluir un agente tensoactivo. La solución resultante puede entonces ser aclarada por filtración, transferida a un recipiente adecuado el cual es entonces sellado y esterilizado en un autoclave o mantenerse a 90°-100°C durante una hora y media. De manera alternativa, la solución puede ser esterilizada por filtración y transferida al recipiente por una técnica aséptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para incluirse en las gotas son el nitrato o acetato fenilmercúrico (0.002%), cloruro de benzalconio (0.01%) y acetato de clorohexidina (0.01%). Los solventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen al glicerol, alcohol diluido y propilen glicol.

Las lociones de acuerdo a la presente invención incluyen aquéllas adecuadas para aplicarse a la piel o al ojo. Una loción para los ojos puede comprender una solución acuosa estéril que opcionalmente contenga un bactericida puede prepararse por métodos similares a aquéllos para la preparación de las gotas. Las lociones o linimentos para aplicarse a la piel también pueden incluir un agente para asegurar el secado y para enfriar la piel, tales como un alcohol o acetona y/o un humectante tal como el glicerol o un aceite tal como el aceite de ricino o aceite de arachis. Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo a la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden hacerse mezclando el ingrediente activo ,o en forma de polvo finamente dividido, solas en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, y con la ayuda de la maquinaria adecuada, con una base grasosa o no grasosa. Las bases pueden comprender hidrocarburos tales como parafina líquida dura o suave glicerol, cera de abejas, jabón metálico; mucílago; un aceite de origen natural tal como al aceite de almendras, maíz, arachis, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados, o un ácido graso tal como el ácido estérico u oleico junto con un alcohol tal como el propilen glicol o macrogeles. Las formulación puede incorporar cualquier agente tensoactivo adecuado tal como un tensoactivo aniónico, catiónico o no iónico activo tal como los esteres de sorbital o derivados de polioxietilen de los mismos. Los agentes suspensores tales como gomas naturales, derivados de sólidos o materiales inorgánicos tales como las sílices siláceas, y otros ingredientes tal como una la lanolina, también pueden ser incluidos Será reconocido por un experto en la técnica que la cantidad y separación óptima de las dosis individuales de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención será determinada por la naturaleza y grado de la condición que esté siendo tratada, la forma, ruta y sitio de administración, y el animal particular que esté siendo tratado, de modo que tal óptimo puede determinarse por técnicas convencionales. También será apreciado por un experto en la técnica que el curso óptimo del tratamiento, es decir, el número de dosis de una anticuerpo o fragmento del mismo de la invención dada por día durante un número definido de días, puede ser determinado por aquellos expertos en la técnica utilizando el curso convencional de las pruebas de determinación del tratamiento. Sin mayor elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior, utilizar la presente invención en toda su extensión. Por consiguiente, por lo tanto, no se constituirán simplemente en ejemplos ilustrativos y no limitantes del alcance de la presente invención de ninguna manera.

Composición de la Cápsula Una composición farmacéutica de esta invención en forma de una cápsula se prepara llenando una cápsula de gelatina dura de dos piezas estándar con 50. mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, en forma pulverizada, 100 mg de lactosa, 32 mg de talco y 8 mg de estearato de magnesio.

Composición Parenteral Inyectable Una composición farmacéutica de esta invención en una forma adecuada para administrarse por inyección se prepara agitando 1.5k en peso de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en lOk en volumen de propilen glicol y agua. La solución se esteriliza por filtración.

Composición del Ungüento El anticuerpo o fragmento del mismo de la invención g. Parafina blanca suave hasta 100.0 g. El anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, se dispersa en un pequeño volumen el vehículo para producir un producto, uniforme, homogéneo. A continuación se llenan tubos de metal colapsables con la dispersión.

Composición de la Crema Tópica Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 1.0 g. Polawax GP 200 20.0 g. Lanolina Anhidra 2.0 g. Cera de Abejas Blanca 2.5 g. Hidroxibenzoato de metilo 0.1 g. Agua Destilada para 100.0 g. El polawax, la cera de abejas y la lanolina se calientan juntas a 60°C. Se agrega una solución de hidroxibenzoato de metilo y la homogeneización se logra utilizando agitación a alta velocidad. A continuación se deja que la temperatura caiga a 50°C. A continuación se agrega anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, y se dispersa perfectamente, y la composición se deja enfriar con agitación a baja velocidad.

Composición de la Loción Tópica Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 1.0 g. Monolaurato de Sorbitan 0.6 g. Polisorbato 20 0.6 Alcohol Cetoestearílico 1.2 g. Glicerina 6.0 g. Hidroxibenzoato de metilo 0.2 g. Agua Purificada B. P. para 100.00 ml . (B.P. = Farmacopea Británica) . El hidroxibenzoato de metilo y la glicerina se disuelven en 70 ml de agua a 75°C. El monolaurato de sorbitan, polisorbato 20 y alcohol cetoesterarílico se funden juntos a 75°C y se agregan a la solución acuosa. La emulsión resultante se homogeneiza, se deja enfriar con agitación continua y el anticuerpo o fragmento de la invención se agrega a una suspensión en el agua restante. Toda la suspensión se agita hasta homogeneizar.

Composición de las Gotas para los Ojos Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 0.5 g. Hidroxibenzoato de metilo 0.01 g. Hidroxibenzoato de propilo 0.04 g. Agua Purificada B. P. para 100.00 ml . Los hidroxibenzoatos de metilo y propilo se disuelven en 70 ml de agua purificada a 75°C y la solución resultante se deja enfriar. A continuación se agrega un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, y la solución se esteriliza por filtración a través de un filtro de membrana (tamaño de poro de 0.022 Am) , y se empaca asépticamente en recipientes estériles adecuados.

Composición para la Administración por Inhalación Para un recipiente de aerosol con una capacidad de 15-20 ml : mezclar 10 mg . de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención con 0.2-0.5k de un agente lubricante, tal como el polisorbato 85 o ácido oléico, y dispersar tal mezcla en un propelente, tal como el freón, de manera preferible en una combinación de (1,2 diclorotetrafluoroetano) y difluoroclorometano y colocar en un recipiente de aerosol apropiado adaptado para la administración intranasal o inhalación oral. La composición para la Administración por Inhalación. Para un recipiente de aerosol con una capacidad de 15-20 ml : disolver 10 mg . de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en etanol (6-8 ml ) , agregar 0.1-0.2k de un agente lubricante, tal como el polisorbato 85 o ácido oléico; y dispersar en un propelente, tal como el freón, de manera preferible en una combinación de (1,2 diclorotetrafluoroetano) y difluoroclorometano, y colocar en un recipiente de aerosol apropiado adaptado para la administración intranasal o por inhalación oral.

Composiciones de Anticuerpo Ad i ni str able s Par enter almen te Las composiciones de anticuerpos y farmacéuticas de la invención, son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Las composiciones para la administración parenteral, comúnmente comprenderá una solución de un anticuerpo de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, de manera preferible un portador acuoso. Pueden emplearse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina 0.4k (solución salina normal), glicina al 0.3%, y similares. Se prefiere el uso de la solución salina normal. Esas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia particulada. Esas soluciones pueden ser esterilizadas por las técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y amortiguadores, etc. La concentración del anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente. Tales concentraciones serán seleccionadas principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo al modo particular de administración seleccionado. De manera general, las concentraciones intravenosas adecuadas, fluctúan de aproximadamente uno a cien miligramos por mililitro. De este modo, una composición farmacéutica de la invención para la inyección intravenosa podría comprender 10 ml de solución salina normal con un contenido de 40-50 mg de un anticuerpo anti-CD23 humano de la invención. Los métodos para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos o serán evidentes a aquellos expertos en la técnica, y se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington s Pharmaceutical Science, 15ava. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, incorporado aquí como referencia. Los anticuerpos de la invención pueden ser liofilizados para almacenarse y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha mostrado ser efectiva con las globulinas inmunes convencionales y pueden emplearse las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Dependiendo del resultado pretendido, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos contrarrestar parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen presentes los anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que aún no está en un estado de enfermedad para aumentar la resistencia del paciente. Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones farmacéuticas pueden llevarse a cabo con dosis y patrones de dosis seleccionados por el médico tratante. En cualquier caso, la composición farmacéutica de la invención deberá proporcionar una cantidad de los anticuerpos anti-CD23 objeto suficiente para tratar efectivamente al paciente. También deberá notarse que los anticuerpos de esta invención pueden ser utilizados para diseñar y sintetizar cualquier péptido o compuestos no peptídicos (miméticos) , que puedan ser útiles en la misma terapia que el anticuerpo. Véase, por ejemplo Saragovi et al., Science, 253:792-795 (1991) . De lo anterior, deberá apreciarse que, aunque han sido descritas modalidades específicas de la invención aquí para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. En consecuencia, la invención no es limitada por las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: REEF, Mitchell E. KLOETZER, William S NAKAMURA, Takehiko (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-CD23 HUMANO "GAMMA-1 Y GAMMA-3 Y EL USO DE LOS MISMOS COMO AGENTES TERAPÉUTICOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 35 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: BURNS, DOANE, SWECKER & MATHIS (B) CALLE: P. O. Box 1404 (C) CIUDAD: Alexandria (D) ESTADO: Virginia (E) PAÍS: Estados Unidos (F) CÓDIGO POSTAL: 22313-1404 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/803,085 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-FEBRERO-1997 (C) CLASIFICACIÓN: [viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE: (A) NOMBRE: Teskin, Robin L. (B) NUMERO DE REGISTRO: 35,030 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 012712-353 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (703) 836-6620 (B) TELEFAX: (703) 836-2021 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 390 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..390 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 58..390 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ATG GCC TGG ACT CTG CTC CTC GTC ACC CTC CTC ACT CAG GGC ACÁ GGA 48 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Val Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly -19 -15 -10 -5 TCC TGG GCT CAG TCT GCC CCG ACT CAG CCT CCC TCT GTG TCT GGG TCT 96 Ser Trp Ala Gln Ser Ala Pro Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser -1 1 5 10 CCT GGA CAG TCG GTC ACC ATC TCC TGC ACT GGA ACC AGC GAT GAC GTT 144 Pro Gly Gln Ser Val Thr He Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asp Asp Val 15 20 25 GGT GGT TAT AAC TAT GTC TCC TGG TAC CAA CAC CAC CCA GGC AAA GCC Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala 30 35 40 45 CCC AAA CTC ATG ATT TAT GAT GTC GCT AAG CGG GCC TCA GGG GTC TCT 240 Pro Lys Leu Met He Tyr Asp Val Ala Lys Arg Ala Ser Gly Val Ser 50 55 60 GAT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TCC CTG ACC ATC 288 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr He 65 ' 70 75 TCT GGG CTC CAG GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT TAC TGT TGT TCA TAT 336 Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr 80 85 90 ACÁ ACC AGT AGC ACT TTG TTA TTC GGA AGA GGG ACC CGG TTG ACC GTC 384 Thr Thr Ser Ser Thr Leu Leu Phe Gly Arg Gly Thr Arg Leu Thr Val 95 100 105 CTA GGT 390 Leu Gly 110 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 423 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..423 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 58.-423 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCT CCC AGA TGG 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp -19 -15 -10 -5 GTC CTG TCC CAG CTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA GTG GTG AAG 96 Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Lys -1 1 5 10 CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC GCT GTC TCT GGT GGC TCT GTC 144 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Val 20 25 AGC AGT AGT AAC TGG TGG ACC TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGA 192 Ser Ser Ser Asn Trp Trp Thr Trp He Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 30 35 40 45 CTG GAG TGG ATT GGA CGT ATC TCT GGT AGT GGT GGG GCC ACC AAC TAC 240 Leu Glu Trp He Gly Arg He Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr 50 55 60 AAC CCG TCC CTC AAG AGT CGA GTC ATC ATT TCA CAA GAC ACG TCC AAG 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val He He Ser Gln Asp Thr Ser Lys 65 70 75 AAC CAG TTC TCC CTG AAC CTG AAC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC 336 Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90 GTG TAT TAC TGT GCC AGA GAT TGG GCC CAA ATA GCT GGA ACÁ ACG CTA 384 . Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Ala Gln He Ala Gly Thr Thr Leu 95 100 105 GGC TTC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 423 Gly Phe Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 387 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..387 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 67..387 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 ; ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG • CTC CTG GGG CTC CTT CTG CTC TGG 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp -22 -20 -15 -10 CTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCT TCC 96 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser -5 -1 1 5 10 CTG TCT GCA TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCA AGT 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 CAG GAC ATT AGG TAT TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA AAA 192 Gln Asp He Arg Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 30 35 40 GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GTT GCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC 240 Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 45 50 55 CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACÁ GAG TTC ACT CTC ACC 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 60 65 70 GTC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC TGT CTA CAG 336 Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 75 80 85 90 GTT TAT AGT ACC CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC 384 Val Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He 95 100 105 AAA 387 Lys (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: : CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 411 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..411 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 58..411 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT CCT CTT TTG AAA GGT Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Pro Leu Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GÁG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGC GGC TTG GCA AAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys -1 1 5 10 CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TGG TGC GCA GCC TCC GGG TTC AGG TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Trp Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe 15 20 2.5 ACC TTC AAT AAC TAC TAC ATG GAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG CAG 192 Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 30 35 40 45 GGG CTG GAG TGG GTC TCA CGT ATT AGT AGT AGT CGT GAT CCC ACÁ TGG 240 Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg He Ser Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp 50 55 60 TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC AGA TTC ACC ATC TCC AGA GAG AAC GCC 286 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala 65 70 75 AAC AAC ACÁ CTG TTT CTT CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG 336 Asn Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 80 85 90 GCT GTC TAT TAC TGT GCG AGC TTG ACT ACÁ GGG TCT GAC TCC TGG GGC 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Thr Gly Ser Asp Ser Trp Gly 95 100 105 CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 411 Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: ATCACAGATC TCTCACCATG GACATGAGGG TCCCCGCTCA G 41 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : ATCACAGATC TCTCACCATG AGGCTCCCTG CTCAG 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 24 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 24 es N, donde N = A/G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 32 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 32 es N, donde N = T/G" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 ATCACAGATC TCTCACCATG GAANCCCCAG CNCAG 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: ATCACAGATG TCTCACCATG GTGTTGCAGA CCCAGGTC 38 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal [ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 24 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 24 es N, donde N = C/T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 29 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 29 es N, donde N = G/C" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GGTGCAGCCA CCGTAGCTTT GATNTCCAN 29 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 21 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 21 es N, donde N = G/A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 26 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 26 es N, donde N = G/C" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: ATCACAGATC TCTCACCATG NCCTGNTCCC CTCT 34 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 27 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 27 es N, donde N = A/G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 31 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 31 es N, donde N = T/C" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGNCTC NGCT 34 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 23 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 23 es N, donde N = A/C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 29 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El nucleótido 29 es N, donde N = T/C" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: ATCACAGATC TCTCACCATG GCNTGGANCC CTCTC 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: CTTGGGCTGA CCTAGGACGG T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: [i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14 GCGACTAAGT CGACCATGGA CTGGACCTGG 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GCGACTAAGT CGACCATGAA ACACCTGTGG 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: GCGACTAAGT CGACCATGGA GTTTGGGCTG AGC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 GCGACTAAGT CGACCATGGG GTCAACCGCC ATC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:lí GCGACTAAGT CGACCATGTC TGTCTCCTTC CTC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 19 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: GCCAGGGGGA AGACCGATGG GCCCTTGGTG CTAGCTGAGG AGACGG 46 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: GATGGGCCCT TGGTGCTAGC TGAGGAGACG G 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: GGTGCTAGCT GAGGAGACGG TGACCAGGAC TCCCTGGCCC CAGAAGCCTA G 51 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22 ATTTAGGTGA CACTATA 17 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: [i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23 GTTTTCCCAG TCACGA 16 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24 ATATACGACT CACTATAGGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:' ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25 CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCA 24 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GCAGTTCCAG ATTTCAACTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27 CCAGGCCACT GTCACGGCTT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2í CAGAGCTGGG TACGTCCTCA 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: GCCCCCAGAG GTGCTCTTGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30: [i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: ACACAGACCC GTCGACATGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31 GCTCTCGGAG GTGCTCCTGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32 ACAGACCCGT CGACCATGGA GTTTGGGCTG 30 . (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal [ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33 CCCCTTGGTG CTAGCTGAGG AGACGGT 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34 AGAGAGAACG CCAAGAACAC ACTGTTT 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: AAACAGTGTG TTCTTGGCGT TCTCTCT 27 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (39)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano, caracterizado porque comprende una región constante que se une a los receptores Fc gamma humanos e inhiben la expresión de la IgE.

2. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una porción de unión de antígeno de primate.

3. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es ya sea un anticuerpo monoclonal gamma-1 humano o gamma-3 humano.

4. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una porción de unión de antígeno de roedor.

5. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado.

6. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la expresión de la IgE in vitro.

7. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque inhibe la expresión de la IgE inducida por la IL-4 por las células B in vi tro.

8. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la expresión de la IgE inducida por la IL-4 in vivo.

9. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una afinidad que fluctúa de 0.01 nM a 1000 nM.

10. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una afinidad de unión por el CD23 de al menos 5nM.

11. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque tiene una afinidad de unión por el CD23 de al menos lOOnM.

12. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dominios variables se derivan de 5E8, 6G5 ó 2C8.

13. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es capaz de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano 5E8 ó 6G5 al CD23.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 1.

15. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 2.

16. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 3.

17. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 4.

18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 5.

19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 6.

20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 7.

21. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 8.

22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 9.

23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23" humano de conformidad con la reivindicación 10.

24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 11.

25. El anticuerpo anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque es capaz de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano 5E8 al CD23.

26. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

27. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2.

28. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3.

29. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4.

30. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar .una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5.

31. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6.

32. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7.

33. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8.

34. Un método para tratar o prevenir una condición de enfermedad, donde la inhibición de la IgE es terapéutica o profilácticamente benéfica, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12.

35. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la condición de enfermedad es un trastorno alérgico.

36. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la condición de enfermedad es una enfermedad autoinmune.

37. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la condición de enfermedad es una enfermedad inflamatoria.

38. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal gamma-1 humano.

39. El anticuerpo monoclonal anti-CD23 humano de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal gamma-3 humano.