MXPA99004795A - Anticuerpos anti-cd11a, humanizados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CDlla, humanizados y varios usos de los mismos. Los anticuerpos anti-CDlla, humanizados se pueden unir específicamente a un I-dominio de CDlla humano, tiene un valor de IC50(nM) de no más de aproximadamente 1 nM, para prevenir la adhesión de células Jurkat a queratinocitos epidérmicos, humanos, normales que expresan ICAM-1,y/o un valor IC50(nM) de no más de aproximadamente 1 nM en el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CDlla, HUMANIZADOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general a anticuerpos anti-CDlla, humanizados.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El antigeno 1 asociado con la función de los linfocitos (LFA-1; CDlla/CDl8) está comprendido en la adhesión de los leucocitos durante las interacciones celulares esenciales para las respuestas inmunológicas y la inflamación (Larson et al., Immunol. Rev. 114:181-217 (1990)). El LFA-1 es un miembro de la familia de las ß2-integrinas y consiste de una a-subunidad única, la CDlla, y una ß-subunidad, la CD18, común a otros receptores de ß2-integrina, Mac-1 y pl50, 95. Los ligandos de LFA-1 incluyen la molécula-1, de adhesión intracelular, ICAM-1, expresada en los leucocitos, endotelio y fibroblastos dérmicos (Dustin et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)), la ICAM-2 expresada en REFF.: 30388 el resto en el endotelio restante y los linfocitos (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 174:253-267 (1991)), y la ICAM-3 expresada en los monocitos y los linfocitos restantes (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 179:619-629 (1994)). Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales (MAb) contra LFA-1 y las ICAM, in vitro, inhiben varias funciones inmunitarias dependientes de las células T, que incluyen la activación de las células T (Kuypers et al., Res Immunol. 140:461 (1989)), la proliferación de las células B dependiente de las células T (Fischer et al., J. Immunol. 136:3198-3203 (1986)), la lisis de células objetivo (Krens y et al., J. Immunol. 131:611-616 (18983)), y la adhesión de las células T al endotelio vascular (Lo et al., J. Immunol 143:3325-3329 (1989)). En los ratones, los MAb anti-CDlla inducen tolerancia a los antigenos proteicos (Tanaka et al., Eur. J. Immunol. 25:1555-1558 (1995)) y prolongan la supervivencia de los aloinjertos cardiacos (Cavaz zana-Calvo et al., Transplantation 59:1576-1582 (1995); Nakakura et al,., Transplantation 55:412-417 (1993)), médula ósea (Cavazzana-Calvo et al., Transplantation 59:1576-1582 (1995); van Dijken et al., Transplantation 49:882-886 (1990)), corneal (He et al., Invest. Opthaml . Vis,. Sci 35:3218-3225 (1994)), de islote (Nishihara et al., Transplantation Proc. 27:372 (1995)) y de tiroides (Talento et al., Transplantation 55:418-422 (1993)). En los humanos, los MAb anti-CDlla previenen la falla del injerto después del transplante de la médula ósea (Fischer et al., Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al . , Transplant Intl. 4:3-7 (1991)) y los estudios clínicos preliminares de los aloinjertos renales tratados profilácticamente con MAb anti-CDlla, además de los corticosteroides y azatioprina, son promisorios (Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994) ) . Las terapias corrientes contra el rechazo del injerto incluyen el uso de OKT3, un MAb anti-CDlla humano, murino y ciclosporina A. la terapia con OKT3 es efectiva, pero tiene varios efectos laterales indeseables; su uso da por resultado la liberación de numerosas citocinas que incluyen el factor -OÍ de necrosis de tumor, el interferon-ß , interleucina-2 , e interleucina-6, dando por resultado fiebre, escalofríos y aflicción gastrointestinal (para una revisión ver Parlevliet et al., Transplant Intl. 5:234-246 (1992); Dantal et al., Curr. Opin Immunol. 3:740-474 (1991)). La ciclosporina A es efectiva, pero también tiene serios efectos laterales (para una revisión ver Barry, Drugs, 44:554-566 (1992)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos anti-CDlla, humanizados. Los anticuerpos preferidos se unen al I-dominio del CDlla humano (por ejemplo, al "epitope MHM24" como se define en la presente) y/o se unen a CDlla con una afinidad de aproximadamente 1 x 10~8 M ó más fuerte. En las modalidades preferidas, el anticuerpo tiene un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM para prevenir la adhesión de células Jurkat a los queratinocitos epidérmicos, humanos, normales que expresan la ICAM-1. Los anticuerpos humanizados, preferidos, son aquellos que tienen un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM en el ensayo de respuesta a linfocitos mezclados (MLR) . Esta IC50 para un anticuerpo humanizados en el ensayo de MLR es significativamente mejor que aquella para el MAb 25.3 murino, que se ha probado previamente in vivo (Fischer et al., Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1944)) . El anticuerpo anti-CDlla humanizado puede tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDFR1 (GYSFTGH MN; SEQ ID No. 10) y/o CDR2 (MIHPSDSETRYNQKFKD; , SEQ ID No. 11) y/o CDR3 (GIYFYGTTYFDY; SEQ ID No. 12) del anticuerpo humanizado MHM24 F(ab)-8 en la Figura 1 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (RASKTISKYLA; SEQ ID No. 13) y/o CDR2 (SGSTLQS; SEQ ID No. 14) y/o CDR3 (QQHNEYPLT; SEQ ID No. 15) del anticuerpo humanizado MHM24 F(ab)-8 en la Figura 1. En otras modalidades, el anticuerpo comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de uno ó más de los CDR del anticuerpo F(ab)-8 de MHM24, humanizado, variante que comprende una o más inserciones de aminoácidos dentro de o adyacentes a un residuo de CDR y/o supresión (es ) dentro de o adyacente a un residuo de CDR y/o subst i tución ( es ) del residuo(s) de CDR (con subst itución ( es ) que son el tipo preferido de alteración de aminoácidos para generar estas variantes) . Estas variantes normalmente tendrán una afinidad de unión para el CDlla humano que no es más de aproximadamente 1 x 10"8 M. En modalidades preferidas, el anticuerpo humanizado incluye una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la cadena de aminoácidos de SEQ ID No. 5 del anticuerpo humanizado MHM24 F(ab)-8 en la Figura 1 y/o las variantes de la secuencia de aminoácidos, del mismo. Como se describe en la presente, ha sido posible manejar genéticamente un anticuerpo humanizado que se une al antigeno de CDlla humano, pero no significativamente al antigeno de CDlla de rhesus, para conferir una capa acida de unión al CDlla de rhesus (es decir, un anticuerpo "rhesusizado") . En esta modalidad, el anticuerpo que se une al CDlla de rhesus puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CDR2 en SEQ ID No. 23. Los otros CDR pueden ser los mismos como aquellos para el anticuerpo F(ab)-8 MHM24 humanizado. De esta manera, el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada "rhesusizada" en SEQ ID No. 24, opcionalmente combinada con una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos en SEQ ID No. 2. Se contemplan en la presente las varias formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CDlla puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tenga una región constante de inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un F(ab')2). Adicionalmente, el anticuerpo se puede marcar con una marca detectable, inmovilizar en una fase sólida y/o conjugar con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico) . Los usos terapéuticos y de diagnóstico para el anticuerpo se contemplan. En una aplicación de diagnóstico, la invención proporciona el método para determinar la presencia de la proteina de CDlla que comprende exponer una muestra sospechosa de que contiene la proteina de CDlla al anticuerpo CDlla y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. Para este uso, la invención proporciona un equipo que comprende el anticuerpo e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteina de CDlla. La invención proporciona adicionalmente: un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo; un vector que comprende ese ácido nucleico, opcionalmente enlazado de manera operable a las secuencias de control reconocidas por una células huésped transformada con el vector; una célula huésped que comprende ese vector; un proceso para producir el anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de modo que se exprese el ácido nucleico y de manera opcional, recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped (por ejemplo del medio de cultivo de la célula huésped) . La invención también proporciona una composición que comprende el anticuerpo anti-CDlla humanizado y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para el uso terapéutico es estéril y se puede liofilizar. La invención proporciona adicionalmente un método para tratar un mamífero que sufre de un desorden mediado por LFA-1, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva del anticuerpo-CDlla, humanizado al mamífero. Para estos usos terapéuticos, se pueden co-administrar otros agentes inmunosupresores o antagonistas de la molécula de adhesión (por ejemplo, otro antagonista de LFA-1 ó un antagonista de VLA-4) al mamífero ya sea antes, después, o simultáneamente con, el anticuerpo CDlla, humani zado .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de MHM24 murino (SEQ ID No. 1), la cadena ligera del MHM24 F(ab)-8, humanizada, SEQ ID No. 2), las secuencias de consenso, humanas del subgrupo kl de cadena libera (humkl) (SEQ ID No. 3) .

La Figura IB muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de MHM24 murino (SEQ ID No. 4), la cadena pesada de MHM24 F(ab)-8, humanizado (SEQ ID No. 5), las secuencias de consenso, humanas del subgrupo III de cadena pesada (SEQ ID No. ß) y la cadena pesada del mutante de anticuerpos "rhesusizado" del ejemplo (SEQ ID No. 24) .

En las Figuras ÍA y IB, las regiones hipervariables basadas en la hipervariabilidad de la secuencia (Kabat et al., Sequen ces of Pro teins of Imm un ol ogi ca l In teres t 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) se encierran dentro de corchetes y las asas hipervariables basadas en la estructura de los complejos del F (ab) -antigeno (Chothia et al., Nature 342:8767 (1989)) están en cursivas. La numeración de los residuos de acuerdo con Kabat et al., con inserciones mostradas como a, b, y c.

La Figura 2 muestra las secuencias del I-dominio de CDlla humano (SEQ ID No. 7) y del I-dominio del CDlla de rhesus (SEQ ID No. 8) . Las ß-hebras y a-hélices están subrayadas y marcadas de acuerdo con Qu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 92:10277-10281 (1995). La secuencia del I y un domino de rhesus (rhCDlla) muestra solo las cuatro diferencias del I-dominio humano. El epitope de unión para el MAb MHM24 (SEQ ID No. 9) se muestra en negritas (Champe et al. J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) ) .

La Figura 3 representa la inhibición de las células T Jurkat humanas a los queratinocitos humanos normales por el MHM24 murino (circuios rellenados), MHM24 quimérico (triángulos abiertos), MHM24 humanizado (HuIgGI) (cuadrado rellenado), y un control de isotipo de IgGl humano ( + ) . El por ciento de unión medida por fluorescencia de células Jurkat marcadas.

Las Figuras 4A-4C muestran la inhibición de la unión de los linfocitos rhesus a los queratinocitos humanos, normales (Figura 4A) , los linfocitos rhesus a ICAM-1 humanas, recombinantes revestidas en placas (Figura 4B), y células 293 transfectadas con quimera de CDlla rhesus/humano a queratinocitos humanos, normales (Figura 4C). La inhibición por MHM24 de unión a rhesus (RhlgGl) (cuadrados rellenados), MHM24 anti-CD18 (circuios rellenos), un control de isotipo de IgGl humano (+) (Figuras 4A y 4C) y un control de isotipo de IgG murino ( + ) (Figura 4B) . El por ciento de unión medido por fluorescencia de los linfocitos marcados (Figuras 4A y B) o células 293 marcadas (Figura 4C) .

La Figura 5 muestra el ensayo de la respuesta de los linfocitos mezclados, humanos (MLR) se bloquea por el MHM24 murino (circuios rellenos), MHM24 humanizado (HuIgGl) (cuadrados rellenos), y el control de IgG de isotipo humanizado (diamante relleno) . El Índice del por ciento de estimulación (% SI) es la relación de la respuesta a una concentración dada de MAb a la respuesta máxima sin MAb presente. Los datos son representativos de múltiples ensayos usando al menos dos diferentes pares de estimulador/respondedor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS 1. Definiciones A menos que se indique de otra manera, el término "CDlla" cuando se usa en la presente se refiere a la subunidad alfa de LFA-1 de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. El CDlla se puede aislar de una fuente natural de la molécula o se puede producir por medios sintéticos (por ejemplo, usando tecnología de ADN recombinante) . La secuencia de aminoácidos para el CDlla humano se describe en EP 362 526 Bl, por ejemplo. El término "I-dominio" de CDlla se refiere a la región de esta molécula delineada en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1955) y/o Qu et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 92:10277-10281 (1995). Las secuencias de aminoácidos del I-dominio de CDlla humano (SEQ ID No. 7) y el I-dominio de CDlla de rhesus (SEQ ID No. 8) se representan en la Figura 2 en la presente. El término "epitope MHM24" cuando se usa en la presente, a menos que se indique de otra manera, se refiere a la región en el I-dominio del CDlla humano al cual se une el anticuerpo de MHM24 (ver ejemplo posterior). Este epitope comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 9 y opcionalmente, otros residuos de aminoácidos de CDlla y/o CD18. El término "desorden mediado por LFA-1" se refiere a un estado patológico provocado por las interacciones de la adherencia celular que comprende al receptor de LFA-1 en los linfocitos. En los ejemplos estos desórdenes incluyen las respuestas inflamatorias de las células T tal como las enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen psoriasis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa); síndrome de la aflicción respiratoria en adultos; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; condiciones alérgicas tal como eczema y asma; condiciones que comprenden la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; reacciones de hipersensibilidad de la piel (que incluyen hiedra venenosa y roble venenoso); aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocitos; enfermedades autoinmunitarias tal como artritis reumatoides, lupus eritematoso sistémico (SLE), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud tiroiditis autoinmune, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, síndrome de Sjorgens, diabetes de comienzo juvenil, y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad retrasada mediada por citocitas y T-linfocitos encontrados típicamente en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis , granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa; enfermedad pulmonar obstructiva, crónica (COPD); bronquitis; insulinitis; rinitis; urticaria; glomerulonefritis ; enfermedades que comprenden diaperesis de leucocitos, desorden inflamatorio del CNS; síndrome de daño de órganos múltiples secundario a septicemia o trauma; anemia hemolitica autoinmunitaria; mietemia gravis; enfermedades mediadas por el complejo antigeno-anticuerpo; síndrome nefrótico; malignidades (por ejemplo, malignidades de la célula B, tal como leucemia linfocitica crónica o leucemia de células vellosas); todos los tipos de transplantes, que incluyen enfermedad del injerto contra el huésped o huésped contra el injerto; HIV e infección de rinovirus; fibrosis pulmonar; invasión de células de tumor en órganos secundarios, etc. El término "agente inmunosupresor" como se usa en la presente para la terapia auxiliar se refiere a substancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario del huésped en el cual se está transplantando el injerto. Esto incluirá substancias que supriman la producción de citocinas, regulen descendentemente o supriman la autoexpresión de antigeno, o enmascara los antigenos de MHC. Los ejemplos de estos agentes incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituidas (ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si existe una reacción adversa a azatioprina); bromocriptina ; glutaraldehido (que enmascara los antigenos de MHC, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotipicos para antigenos de MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A esteroides tal como glucocorticosteroides , por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; citocina o antagonistas del receptor de citocina que incluyen anticuerpos anti-interferon-?-ß o -o¡; anticuerpos anti-factor a de necrosis de tumor; anticuerpos anti-factor-ß de necrosis de tumor; anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti-receptor de IL-2; anticuerpos anti-L3T4; anticuerpos anti-globulina de linfocitos; pan-T, heterólogos, preferentemente anticuerpos anti-CD3 ó anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión de LFA-3 (WO 90/08187 publicada el 7/26/90; estreptocinasa; TGF-ß; est reptodomasa ; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; desoxipergualina; rapamicina; receptor de células T (Patente de los Estados Unidos No. 5,114,721); fragmentos del receptor de células T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/(11294; y WO 91/01133)) y anticuerpo del receptor de células T(EP 340,109) tal como T10B9. Estos agentes se administran al mismo tiempo o en tiempos separados del anticuerpo de CDlla, y se usan a las mismas o menores dosis que las expuestas en la técnica. El agente inmunosupresor auxiliar, preferido dependerá de muchos factores, que incluyen el tipo de desorden que se trata incluyendo el tipo de trasplante que se realice, asi como la historia del paciente, pero una preferencia completa general es que el agente se seleccione de ciclosporina A, un glucocorticosteroide (más preferentemente prednisona o metilprednisolona) , el anticuerpo monoclonal de OKT-3 azatioprina, bromocriptina, globulina anti-linfocitos, heteróloga o una mezcla de los mismos. "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos sin necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el desorden asi como aquellos en los cuales se va a prevenir el desorden . "Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológicos, deportivos o de mascota, tal como perros, caballos, gatos, vacas, etc. De manera preferente, el mamífero es humano. El término "injerto" como se usa en la presente se refiere al material biológico derivado de un donador para el transplante en un receptor. Los injertos incluyen material diverso tal como por ejemplo, células aisladas tal como las células islote y las células derivadas de los nervios (por ejemplo, células de Sch ann), tejido tal como membrana amniótica de un recién nacido, médula ósea, células precursoras hematopoyéticas, y órganos tal como piel, corazón, higado, bazo, páncreas, lóbulo tiroides, pulmón, riñon, órganos tubulares (por ejemplo, intestino, bazos sanguíneos, o esófago), etc. Los órganos tubulares se pueden usar para reemplazar porciones dañadas del esófago, bazos sanguíneos o conductos biliares. Los injertos de piel se pueden usar no solo para quemaduras, sino también como un depósito para el intestino dañado o para cerrar ciertos defectos tal como la hernia diafragmática . El injerto se deriva de cualquier tipo de mamífero, incluyendo humano, ya sea de cadáveres o donadores vivos. De manera preferente, el injerto es médula ósea o un órgano tal como corazón y el donador del injerto y el huésped están correspondidos para los antigenos de la clase II de HLA. El término "donador" como se usa en la presente se refiere a especies de mamífero, muertas o vivas, de las cuales se deriva el injerto. De manera preferente, el donador es humano. Los donadores humanos son preferentemente roedores relacionados sanguíneamente, voluntarios, que son normales en el examen físico y del mismo grupo sanguíneo ABO principal, debido a que las barreras de cruce de los grupos sanguíneos principales perjudican principalmente la supervivencia del aloinjerto. Sin embargo, es posible para el transplante, por ejemplo, un riñon de un donador tipo A en un receptor tipo A, B o AB . El término "transplante" o variaciones del mismo se refiere a la inserción de un injerto en un huésped, si el transplante es singeneico (donde el donador y el receptor son genéticamente idénticos), alogeneico (donde el donador y el receptor son de diferentes orígenes genéticos, pero de la misma especie) o xenogeneico (donde el donador y el receptor son de especies diferentes) . De esta manera, en un escenario tipico, el huésped es humano y el injerto es un isoinjerto, derivado de un humano del mismo o diferente origen genético. El otro escenario, el injerto se deriva de una especie diferente de aquella en la cual se transplanta, tal como un corazón de mandril transplantado en un huésped receptor humano, y que incluye animales de especies ampliamente separadas, de manera filogenética, por ejemplo, una válvula de corazón de cerdo, o beta-células de islote animales o células neuronales t ransplantadas en un huésped humano.

"Incremento de la tolerancia de un injerto transplantado" por un huésped se refiere al prolongar la supervivencia de un injerto en un huésped del cual se transplanta, es decir, suprimir el sistema inmunitario del huésped de modo que tolerará mejor un transplante extraño. Dosificación "intermitente" o "periódica" es una dosificación que es continua durante un cierto periodo de tiempo y es a intervalos regulares que se separa preferentemente por uno o más dias. "Tolerancia selectiva" el desorden se refiere a una tolerancia por el sistema inmunitario del huésped para el agente especifico que causa el desorden, pero que retiene la capacidad del huésped para rechazar un segundo injerto alogeneico o xenogeneico. De manera preferente, la tolerancia es tal que el sistema inmunitario se deja intacto de otra manera. El término "antagonista de LFA-1" se refiere a una molécula que actúa como un inhibidor competitivo de la interacción de LFA-1 con ICAM-1. Los ejemplos de estas moléculas incluyen anticuerpos dirigidos contra ya sea CDlla (por ejemplo, anticuerpo anti-CDlla humanizados descritos en la presente) o CD18 ó ambos, anticuerpo a ICAM-1, y otras moléculas tal como péptidos (por ejemplo, antagonistas peptidomiméticos). El término "antagonista de VLA-4" se refiere a una molécula que actúa como un inhibidor competitivo de la interacción de VLA-4 con VCAM. Los ejemplos de estas moléculas incluyen anticuerpos dirigidos contra ya sea VLA-4 ó VCAM y otras moléculas (por ejemplo, antagonistas peptidomiméticos) . El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos mult iespecificos (por ejemplo, anticuerpos específicos), y fragmentos de anticuerpos mientras que exhiban la actividad biológica deseada. "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general la región variable o de unión al antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab A F(ab')2r y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena individual; y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpo . El término "anticuerpo monoclonal" como se usan en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpo substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de forma natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste a las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual en el antígeno.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población substancialmente homogénea de anticuerpo, y no se va a construir como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar por el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se puede elaborar por métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulina) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que corresponden a una subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena es idéntica con, u homologa a, secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que corresponden a otra clase o subclase del anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antigeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabhat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethsda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de una "asa hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H12) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Armazón" o residuos de "FR" son aquellos los residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable como se define en la presente. Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad deseada, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se elaboran para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o substancialmente todas las asas hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera opcional alguna porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Fragmentos de anticuerpos de "Fv de cadena individual" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo en donde aquellos dominios están presentes en una cadena individual de polipéptido. En general, el polipéptido de Fv es adicionalmente un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antigeno. Para una revisión de Fv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antigeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena del polipéptido (VH-VL) . Al usar un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). La expresión "anticuerpos lineales" cuando se usa a todo lo largo de esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng. 8(10:1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (V -CH1-VH-CH1 ) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecífieos o monoespecí fieos . Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural con materiales que interferirán con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95 % en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y en forma más preferente más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o de manera preferente, tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, de manera ordinaria, el anticuerpo aislado se preparará por al menos un paso de purificación. El término "epitope etiquetado" cuando se usa en la presente se refiere al anticuerpo anti-CDlla fusionado a una "etiqueta de epítope". El polipéptido de etiqueta de epítope tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual se puede elaborar un anticuerpo contra éste, aún siendo suficientemente corto tal que no interfiera con la actividad del anticuerpo de CDlla. La etiqueta de epítope de manera preferente es suficientemente única de modo que el anticuerpo contra esta no reacciones de manera substancialmente cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos de etiqueta adecuados tienen en general al menos 6 residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácidos (de manera preferente, entre aproximadamente 9-30 residuos) . Los ejemplos incluyen el polipéptido de etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al. Mol. Cell. Biol. 89:2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 a ésta (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5 (12) : 3610-3616 (1985)); la etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas modalidades, la etiqueta de epítope es un "epítope de unión al receptor de salvamento". Como se usa en la presente, el término "epítope de unión al receptor, de salvamento" se refiere a un epitope de la región Fe de la molécula de IgG (por ejemplo IgGj., IgG2, IgG3 ó IgG4) que es responsable del incremento en la vida media sérica in vivo de la molécula de IgG. El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una substancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa destrucción de las células. El término se propone para incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tal como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, o fragmentos de las mismas. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, Citosina-arabinosido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotero (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantranona, Vincreistina , Vinorelbine, Carboplat in, a , Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dact inomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver, Patente de los Estados Unidos No. 4,675,187), Melfelan y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a una forma de precursor o derivado de una substancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a las células de tumor en comparación al fármaco de origen y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en la forma de origen más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp . 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp . 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan, a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactam, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente substituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitocína y otros profármacos de fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre, citotóxico, más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para el uso en esta invención, incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto detectable o composición detectable que se conjuga directamente o de manera indirecta al anticuerpo. La marca se puede detectar por si misma (por ejemplo, radiomarcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto de substrato o composición que es detectable. Por "fase sólida" se quiere decir una matriz no acuosa a la cual se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcados en la presente incluyen aquellos formados parcialmente o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agente tensioactivo que es útil para la distribución de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-CDlla descritos en la presente y opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes de liposoma se arreglan comúnmente en una formación de bicapa, similar al arreglo lipidico de las membranas biológicas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula aislada de ácido nucleico es diferente de aquella en la forma o asentamiento en la cual se encuentra la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan ordinariamente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales .

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para las procariotas, por ejemplo, incluyen, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación, e intensificadores. El ácido nucleico "se enlaza operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o guia secretoria se enlaza operablemente al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteina que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o intensificador se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si se coloca para facilitar la traducción. En general, "enlazado operablemente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan están continuas, y en el caso de un guia secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. El enlace se logra por la ligación en sitios de restricción conveniente. Si estos sitios no existen, se usan adaptadores o ligadores de oligonucleótidos, sintéticos, de acuerdo con la práctica convencional. Como se usa en la presente, la expresión "célula", "linea celular", y " cultivo celular" se usan de manera intercambiable y todas estas designaciones incluyen la progenie. De esta manera, las palabras "transformante" y "células transformadas" incluyen las células sujetas principales y los cultivos principales de las mismas sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se detecta para la célula originalmente transformada, se incluyen también. Donde se proponen designaciones distintas, será claro del contexto.

II. Modos para Llevar a Cabo la Invención A. Preparación del Anticuerpo Se describe en el ejemplo a continuación un método para humanizar un anticuerpo de CDlla no humano. A fin de humanizar un anticuerpo anti-CDlla, se prepara el material de inicio del anticuerpo no humano. Las técnicas de ejemplo para generar estos anticuerpos se describirán en las siguientes secciones. (i) Preparación de Antígeno El antígeno de CDlla que se va a usar para la producción de anticuerpos puede estar, por ejemplo, en una forma soluble del dominio extracelular del CDlla u otros fragmentos de CDlla (por ejemplo, un fragmento de CDlla que comprende el "epitope MHM24", tal como el fragmento de I-dominio de CDlla. De manera alternativa, las células expresan CDlla en su superficie celular se pueden usar para generar anticuerpos. Estas células se pueden transformar para expresar CDlla, y opcionalmente, CD18 ó pueden ser otras células que se presenten de manera natural (por ejemplo, células linfoblastoides humanas, ver Hildreth et al Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983)) ó Jurkat (ver ejemplo posterior. Será aparente para aquellos expertos en la técnica otras formas de CDlla útiles para generar anticuerpos . (ii) Anticuerpos Policlonales Se formulan de manera preferente anticuerpos policlonales en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y adyuvante. Puede ser útil para conjugar el antígeno pertinente a una proteina que es inmunogénica en la especia que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobuina bovina o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida, (a través de residuos de licina), glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, ó R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos , o derivados al combinar, por ejemplo, 100 µg ó 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmica en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días después, los animales se sangran y el suero se valora para el titulo de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta la meseta del titulo. De manera preferente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una diferente proteina y/o a través de un diferente reactivo de reacción de enlace cruzado. Los conjugados también se pueden elaborar en cultivo de células recombinantes como funciones proteicas. También, agentes de agregación tal como alum se usa de manera adecuada para mejorar la respuesta inmunitaria. (iii) Anticuerpos Monoclonales Se pueden elaborar anticuerpos monoclonales usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden , elaborar por métodos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, o mono macaco, se inmuniza como se describe anteriormente para producir linfocitos que producen, o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal antiodies; Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986)) . De esta manera, las células de hibridoma preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma, de origen, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), substancias que previenen el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células seleccionadas que producen anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como el medio de HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma, preferidas están las lineas de mieloma murinas, tal como aquellas derivadas de M0P-21 y los tumores de ratón M.C.-ll disponibles del Salk Institute Cell distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 ó X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las lineas de células de mieloma humana y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpo monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New Yord, 1987)). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se valora para - la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. De manera preferente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RÍA) o al ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis de Scatchard de Morrison et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar al limitar los procedimientos de dilución y cultivar por métodos normales (Goding, Monoclonal Antibodies; Principies and Practice, pp . 59-103 (Academi Press, 1986)) . Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640.

Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de asitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, el fluido de asitis, o suero o por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tal como por ejemplo, proteina A-cefarosa, cromatografía de hidroxil apatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifica para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclónales . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tal como células de E. coli, células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Se describirá en más detalle posteriormente la producción recombinante de anticuerpos . (iv) Humanización y Variantes de la Secuencia de Aminoácidos El ejemplo a continuación describe un procedimiento para la humanización de un anticuerpo anti-CDlla. En ciertas modalidades, puede ser deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado, particularmente donde estas mejoran la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CDlla humanizado se preparan al introducir cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del anticuerpo anti-CDlla humanizado, o por síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para el F(ab)-8 anti-CDlla, humanizado (por ejemplo, como en SEQ ID Nos. 2 y 5) . Cualquier combinación de supresión, inserción y substitución, se hace para arribar a la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos pos-transduccionales del anticuerpo anti-CDlla humanizado, tal como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido del anticuerpo anti-CDlla humanizado que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis de exploración de alanina", como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, un residuo o grupo de los residuos objetivos se identifican (por ejemplo, residuos cargados tal como arg. asp, his, lys, y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutral o negativamente cargado (de manera más preferente, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antigeno de CDlla. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las substituciones que se redefinen al introducir variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de substitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos se predetermina, no se necesita predeterminar per se la naturaleza de la mutación. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria de exploración de ALA se llevó a cabo en el codón o región objetivo y se detectan para la actividad deseada las variantes del anticuerpo anti-CD11 humanizado, expresado. Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen funciones amino-y/o carboxi-terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen un ciento más residuos, así como inserciones intrasecuencia de múltiples o individuales residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpo anti-CDlla humanizado con un residuo de metionilo N-terminal en anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítope. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CDlla humanizado incluyen la función al N- o C-término del anticuerpo anti-CDlla humanizado de una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media cerca del anticuerpo (ver posteriormente) .

Otro tipo de variante es una variante de substitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-CDlla humanizado removida y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de substitución incluyen las azas hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de FR. La Tabla IV en el ejemplo posterior proporciona guia en cuanto a los residuos de la región hipervariable que se pueden alterar. Los residuos de la región hipervariable a los residuos de FR comprendidos en la unión al antígeno se substituyen en general de una manera relativamente conservadora. Estas substituciones conservadoras se muestra en la Tabla I bajo el encabezado de "Substituciones Preferidas". Si estas substituciones dan un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más substanciales, denominados "substituciones de ejemplo" en la Tabla I, o como se describe adicionalmente de manera posterior en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos detectados .

TABLA 1 Las modificaciones substanciales y las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar substituciones que difieren de manera significante en su efecto al mantener (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación de hoja helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presionan de manera natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral. (1) hidrofóbico; norleucina, met, ala, val, leu, ile , (2) hidrófilos neutrales: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básico; asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos; trp; tyr, phe.

Las substituciones no conservadoras implicarán intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no comprendido en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-CDlla humanizado también se puede substituir, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula para prevenir el enlace cruzado anormal. Contrariamente, se puede adicionar el enlace (s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv) . Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración se quiere decir supresión de una o más porciones de carbohidratos encontradas en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos es típicamente N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unidad donde la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-creolina, donde X es cualquier aminoácido excepto creolina, son las secuencias de Reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripept ídicas en un polipéptido crea el sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina , galactosa, o xilosa, a un hidroxiaminoácido , más comúnmente serina o trionina, aunque también se puede usar ciclo 5-hidroxiprolina ó 5-hidroxilisina . La adhesión de los sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contenga una o más de las secuencias tripeptidicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también se puede hacer por la adición de, o substitución por, uno o más residuos de serina o trionina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación 0-enlazados ) . Las moléculas de ácido nucleico que modifican para las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CDlla humanizado se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos que se presentan de manera natural) o la preparación por la mutagénesis ligada por oligonucleótidos (o dirigida a la secuencia), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cartucho de una variante anteriormente preparada o una versión no variante del anticuerpo anti-CDlla humanizado . De manera ordinaria, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-CDlla humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CDlla humanizado original de ya sea la cadena pesada o la cadena ligera (por ejemplo, como el SEQ ID No. 2 ó 5), de manera más preferente al menos 80 %, y en forma más preferente al menos 85 %, en forma más preferente al menos 90 %, y de manera más preferente al menos 95 %. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos anti-CDll humanizados, después de la alineación de las secuencias y las separaciones de introducción, si es necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia, y no considerando ninguna substitución conservadora (como se define en la Tabla 1 anterior) como parte de la identidad de la secuencia. Ninguna de las extensiones, supresiones, o inserciones N-terminales) C-terminales o internas en la secuencia de anticuerpo se deben considerar como que afecten la integridad u homología de la secuencia. (v) Detección de las Propiedades Biológicas Los anticuerpos que tienen las características identificadas en la presente como que son deseable en un anticuerpo anti-CDlla humanizado se detecta. Para detectar los anticuerpos que se unen al epítope en CDlla unido por un anticuerpo de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión del anticuerpo MHM24 a CDlla), se puede realizar un ensayo de rutina de bloqueo cruzado tal como aquel escrito en Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . De manera alternativa, la correlación del epítope, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), se puede analizar para determinar si el anticuerpo se une a un epítope de interés.

Se pueden determinar las afinidades el anticuerpo (por ejemplo, para CDlla humano o CDlla de rhesus) por unión con saturación usando ya sea células mononucleares de sangre periférica o leucocitos de rhesus como se describe en el ejemplo posterior. De acuerdo con este método para determinar la afinidad del anticuerpo, se adicionan los linfocitos o leucocitos de rhesus a las placas en un volumen de 170 µl por pozo y donde se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se recolectan las células y se lavan 10 veces. Luego se cuentan las muestras. Los datos se transforman en las cuentas por minuto a nonamolaridad y luego se realizan gráficas de cuatro parámetros de ajuste a la curva de saturación (unión contratotal) para determinar los valores de Kd (app) los anticuerpos humanizados preferidos son aquellos que se unen a CDlla humano con un valor de Kd de no más de aproximadamente 1 x 10~7, de manera preferente, no más de 1 x 10~8; de manera más preferente no más de aproximadamente 1 x 10"9; y en forma más preferente no más de aproximadamente 2 x 10'10. También es deseable seleccionar anticuerpos humanizados que tengan propiedades benéficas ante adhesión en el "ensayo de adhesión monocapa de queratinocitos". Los anticuerpos preferidos son aquellos que tienen un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 250 nM; de manera preferente no más de aproximadamente 100 nM; de manera preferente no más de aproximadamente 1 nM y en forma más preferente no más de aproximadamente 0.5 nM para prevenir la adhesión de células Jurkat a queratinocitos epidérmicos humanos, normales que expresan ICAM-1. De acuerdo con este ensayo, se remueven los queratinocitos epidérmicos, humanos, normales de los matraces de cultivo y se dispersan en el medio del ensayo de linfocitos a una concentración de 5 x 105 células viables/ml. Luego se cultivan durante la noche alícuotas de 0.9 ml/pozo en placas de 96 pozos de fondo plano. Se estimulan los pozos apropiados por la adición de interferon-gamma a 100 unidades /pozo . Se marcan las células E6-1 del clon Jurkat, se lavan, se dispersan a 1 x 106 células/ml, y se incuban con diluciones seriales de dos veces iniciando a 500 ng/ml de anticuerpo a 4°C durante 30 minutos. Después de la remoción del medio de la monocapa de queratinocitos, se adicionan 0.1 ml/pozo de las células marcadas y se incuban a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavan para remover las células no unidas y se mide la fluorescencia. Los anticuerpos anti-CDlla humanizados, deseados son aquellos que tienen un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 100 nM; de manera preferente no más de aproximadamente 50 nM; de manera más preferente no más de aproximadamente 5 nM y en la forma más preferente no más de aproximadamente 1 nM en el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados (MLR) , usando linfocitos humanos. Tanto para los MLR humanos y de rhesus, los linfocitos de la sangre periférica de dos donadores no relacionados se aislaron de la sangre heparinizada, completa y se dispersaron a una concentración de 3 x 106 células/ml en RPMI 1640 (GIBCO) con aditivos como se describe en le ejemplo posterior. Las células estimuladoras se hacen insensibles por irradiación. Las células respondedoras a una concentración de 1.5 x 105 células por pozo se cocultivaron un número igual de células estimuladoras en placas de fondo plano, y 96 pozos. Las diluciones seriales de dos veces del anticuerpo iniciando una concentración de 10 nM se adicionan a los cultivos para dar un volumen total de 200 µl/pozo. Los cultivos se incuban a 37°C en C02 al 5 % durante 5 días y luego se tratan con impulsos con 1 µCi/pozo de [3H]timidina durante 16 horas y se mide la incorporación de [3H] timidina . (vi) Fragmentos de anticuerpo En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CDlla humanizado es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas. De manera tradicional, estos fragmentos se derivaron via la digestión proteolitica de anticuerpos intactos (ver por ejemplo Morimoto et al., Journal of biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992 y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplar químicamente para acoplar fragmento F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992). De acuerdo con otro planteamiento, los fragmentos de F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Serán aparentes para un practicante experto otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. 'vü) Anticuerpos Multiespecificos En algunas modalidades, puede ser deseable generar anticuerpos de CDlla, humanizados, multiespecífieos (por ejemplo, biespecí fieos ) que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecificos de ejemplo pueden unirse a dos epítopes diferentes de la proteina de CDlla. De manera alternativa, se puede combinar un brazo anti-CDlla con un brazo que se una a una molécula de activación en un leucocito tal como la molécula del receptor de células T (por ejemplo CD2 ó CD3), o los receptores Fe para IgG (Fc?R) tal como Fc?lR (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa CDlla. También se pueden usar anticuerpos biespecí fieos para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan CDlla. Estos anticuerpo poseen un brazo de unión a CDlla y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferon-a, vinca alcaloide, cadena de resina A, metrotexato o hapetno de isótopo radioactivo) . Se pueden preparar anticuerpos biespecí fieos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos de F(ab')2). De acuerdo con otro planteamiento para elaborar anticuerpos biespecificos , la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede manejar genéticamente para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena (s) de lateral grande se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodimero sobre otros productos terminales no deseados tal como homodimeros. Ver WO 96/2701 publicada el 26 de Septiembre de 1996. Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos enlazados de manera cruzada o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado se puede acoplar a amidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconj ugados se pueden elaborar usando cualquier método conveniente de enlace cruzado. Los agentes adecuados de enlace cruzado son bien conocidos en la técnica, se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4.676,980, junto con un número de técnicas de enlace cruzado. Las técnicas para generar anticuerpos biespecí fieos de los fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecí fieos usando el enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde se escinden proteoliticamente los anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente formador de complejos de ditiol, arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir la formación intermoleucular de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados luego se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Luego se reconvierte uno de los derivados de Fab'-TNB al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad etiomolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecí fieos . Los anticuerpos biespecí fieos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos de Fab ' ó SH de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecí fieos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2, completamente humanizado. Cada fragmento de Fab1 se segregó de manera separada de E. coli y se sometió al acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecifico . El anticuerpo formado de esta manera fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor de HER2 y las células T humanas, normales, así como acciona la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumor de pecho humano. Varias técnicas para elaborar y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente del cultivo de células recombinantes también se han descrito. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 ( 5 ): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones de Fab ' de dos diferentes anticuerpos por fusión génica. Los homodimeros del anticuerpo se redujeron a la región de articulación para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodimeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena lateral (VL) con un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios V y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión al antigeno. Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de los dimeros de Fv (sFv) de cadena individual también se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). De manera alternativa, el anticuerpo biespecifico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como se describe en Zapata et al., Protein Eng. Los anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpo triespecí fieos . Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). (viii) Otras Modificaciones Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo anti-CDlla humanizado. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar o intensificar la efectividad del anticuerpo del tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, el residuo(s) de cisteina se puede introducir en la región Fe, permitiendo de este modo la formación del enlace de sulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una aniquilación celular incrementada, mediada por complemento y una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al., J. EXP. Med. 176: 1191- 1195 (1992) Y Shopes, B.J. Im unol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpo homodiméricos con actividad antitumor mejorada también se pueden preparar usando ligadores cruzados heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560- 2565 (1993) . De manera alternativa, se puede manejar genéticamente un anticuerpo que tiene regiones duales de Fe y se puede mejorar de tener de este modo una lisis de complemento mejorada y capacidades de ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Desing 3:219-230 (1989). La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en la presente, conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente óptima de origen bacteriano, fungal, planta o animal, o fragmentos del mismo) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconj ugado ) . Se han descrito anteriormente agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos inmunoconjugados. Las toxinas y fragmentos enzimáticamente activos de los mismos que se pueden usar incluyen la cadena de difteria A, los fragmentos activos no de unión de la toxina de difteria, la cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena de resina A, la cadena de avina A, la cadena de mmodesina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de monomomordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina , fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Están disponibles una variedad de radionúclidos para la producción de los anticuerpo anti-CDlla radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 13 1 I n , 90Y y 1 8 6Re . Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se elaboran usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncionales tal como propionato de N-succinimidil-3- ( 2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolieno), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de resina como se describe en vitetta et al., science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante de ejemplo para la conjugación del radionucleótico al anticuerpo. Ver la WO 94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el pre-apuntamiento del tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la remoción del conjugado no unido de la circulación usando un agente de limpieza y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido). Los anticuerpos anti-CDlla descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas . Las liposomas que contienen anticuerpos se preparan por métodos conocidos en la técnica, como se describe en Epstein et al. Proc. 6ß Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77.4030 (1980); y en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045, y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase invertida con una composición lipidica que comprende fosfat idilcolina , colesterol y fosfat idiletanolamina derivatizada por PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros del tamaño del poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmento de Fab' del anticuerpo de la presente invención se puede conjugar a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol Chem. 257:286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina) está contenida opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81 (19) : 1481 (1989) . El anticuerpo de la presente invención también se puede usar en ADEPT al conjugar el anticuerpo a una enzima de activación de profármaco y convierte en profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidílico, de la WO 81/01145) a un profármaco anti-cáncer, activo. Ver por ejemplo, la WO 88/07378 y la Patente de los Estados Unidos No. 4,975,278. El componente de la enzima del inmunoconj ugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de activarse en un profármaco de una manera tal para convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citocina-diaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluoroacilo; proteasas, tal como serratia-proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir los profármacos que contienen un substituyente de D-aminácido; enzimas de escisión de carbohidratos tal como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir los fármacos derivatizados con ß-lactamas en fármacos libres, y penicilina-amidasas , tal como penicilina V-amidasa o peniciolina G amidasa, útil para convertir los fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. De manera alternativa, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" se pueden usar para convertir los profármacos de la invención en los fármacos activos libres (ver, por ejemplo Massey, Nature 328457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima se pueden preparar como se describe en la presente para la distribución de la abzima a una acumulación de células de tumor. Las enzimas de esta invención se pueden unir covalentemente a los anticuerpo anti-CElla por técnicas bien conocidas en la técnica tal como el uso de reactivos heterobifuncionales de enlace cruzado discutidos anteriormente. De manera alternativa, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención enlazada a una porción funcionalmente activa y la enzima de la invención se pueden construir usando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) ) . En ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para incrementar la penetración al tumor, por ejemplo, en este caso, puede ser deseable modificar un fragmento de anticuerpo a fin de incrementar su vida media sédica. Esto se puede lograr, por ejemplo, por la incorporación de un epítope de unión al receptor de salvamento en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o por la incorporación del epitope en una etiqueta de péptido que luego se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el punto medio, por ejemplo, por síntesis de ADN o peptídica) . Ver la WO 96/32478 publicada el 17 de Octubre de 1996) . El epítope de unión al receptor de salvamento constituye en general una región en donde cualquiera o más residuos de aminoácidos de una o dos asas de un dominio Fe se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. En forma aún más preferente, tres o más residuos de una o dos asas del dominio de Fe se transfieren. Aún más preferido, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fe (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 ó VH, o más de una región, del anticuerpo. De manera alternativa, el epitope se toma del dominio CH2 de la región Fe y se transfiere a la región CL o la región VL o ambas, del fragmento de anticuerpo. En una modalidad más preferida, el epítope de unión al receptor de salvamento comprende la secuencia (5' a 3'). PKNSSMISNTP (SEQ ID No. 16), y comprende opcionalmente de manera adicional una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de HQSLGTQ (SEQ ID No. 17), HQNLSDGK (SEQ ID No. 18), HQNISDGK (SEQ ID No. 19), ó VISSHLGQ (SEQ ID No. 20), particularmente donde el fragmento de anticuerpo es Fab o F(ab')2. En otra modalidad más preferida, el epítope de unión al receptor de salvamento es un polipéptido que contiene la secuencia(s) (5' a 3'): HQNLSDGK (SEQ ID No. 18), HQNISDGK (SEQ ID No. 19), o VISSHLGQ (SEQ ID No. 20), la secuencia: PKNSSMISNTP (SEQ ID No. 16).

También se incluyen modificaciones covalentes del anticuerpo de CDlla humanizado dentro del alcance de esta invención. Se pueden elaborar por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Se introducen otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo de una molécula al hacer reaccionar los residuos objetivo de aminoácidos del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales . Los residuos de cisteína se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético o cloroacetamida , para dar derivados de carboximetil o carboxiamidometilo . Los residuos de cisteinilo también se derivatizan por la reacción con bromotrifluoroacetona , ácido a-bromo-ß- ( 5-imidozoil ) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquimaleimidas , disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol. Los residuos de histidilo se derivatizan por la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7.0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidina. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se desempeña preferentemente en cacodilato de sodio 0.1 M a pH 6.0. Los residuos de histidilo y amino-terminal se hace reaccionar con anhídrido succinicos u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivat ización con estos agentes tiene el efecto de invertir el cambio de los residuos de lisina. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, cloroborhidruro , ácido trinitrobencensulfónico , O-met ilisourea , 2 , -pentanodiona , y reacción catalizada con transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo se modifican por la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre estos fenilglioxal , 2,3-butanodiona, 1 , 2-ciclohexanodiona , y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al pKa alto del grupo funcional guanidina. Adicionalmente, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo de arginina epsilon-amino . Las modificaciones específicas de los residuos de tirosilo se pueden elaborar, con interés particular en la introducción de marcas espectrales en los residuos de tirosilo por la reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano . De manera más común, se usan N-acet ilimidazol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I ó 131I para preparar proteínas marcadas para el uso en el radioinmunoensayo. Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tal como l-ciclohexil-3- (2 -morfolinil- 4 -etil ) carbodiimida ó l-etil-1-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil ) carbodiimida. Adicionalmente los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten a residuos de asparaginilo y glutaminilo por la reacción con iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente para los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, de manera respectiva. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutrales o básicas. La forma desamidada de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp . 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente comprende el acoplamiento de manera química o enzimática de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación N- u O-enlazada. Dependiendo del medio de acoplación usado, el (los) azúcar (es) se puede unir a (a) arginina a histidia, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfidrilos libres tal como aquellos de cisteína, • (d) grupos hidroxilo libres tal como aquellas de serina, trionina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tal como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofano, o (f) el grupo amina de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, pp . 259-306 (1981) . La remoción de cualquiera de las porciones de carbohidratos presentes en el anticuerpo se puede lograr de manera química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico , o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucasamina o N-acetilgalactosamina) , mientras que deja intacto el anticuerpo. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al. Anal. Biochem. 118:131 (1981). La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en los anticuerpos se puede lograr por el uso de una variedad de endo-y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende el enlace del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteinicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos , de la manera expuesta en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4, 179, 337.

B. Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes La invención también proporciona el ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo anti-CDlla humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo. Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que codifica para éste se aisla y se inserta en un vector reaplicable para la clonación adicional (amplificación de ADN) o para la expresión. El ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos). Muchos vectores están disponibles. Los componentes de vector incluyen en general, pero no se limitan a, uno o más de lo siguiente: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de Secuencia de Señal El anticuerpo anti-CDlla de esta invención se puede producir de manera recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el N-término de la proteina madura o el polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procariót icas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del anticuerpo anti-Clla nativo, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, un lpp o guías de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción por levadura, la secuencia de señal nativa se puede substituir por, por ejemplo, la guia de invertasa de levadura, la guía del a-factor (que incluye las guias del a-factor de Saccharomyces y Kluyveromyces ) , o la guía de fosfatasa acida, la guía de glucoamilasa de C-albicans, y la señal descrita en la WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como las guías secretorias virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex, están disponibles. El ADN para esta región precursora se liga en el cuadro de lectura al ADN que codifica para el anticuerpo anti-CDlla. (ii) Origen del Componente de Replicación Ambos vectores de expresión de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en la clonación de vectores esta secuencia es una que permite que el vector se replique de manera independiente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 µ es adecuado para varios orígenes virales y de levadura (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el origen de componente de replicación no se necesita para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 se puede usar típicamente solo debido a que contiene el promotor anterior) . (iii) Selección del Componente Génico Los vectores de expresión de clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para las proteínas que (a) confían resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, (b) deficiencias auxotrópicas de complemento, o (c) nutrientes críticos de suministro no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para racemasa para D-alanina racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para paralizar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteina que confiere resistencia a fármaco y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección de dominio usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e hidromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables, adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico del anticuerpo anti-CDlla, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneina-I y -II, en forma preferente genes de metalotioneina de primate, adensina, deaminasa, ornitina-descarboxsilasa, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican primero al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metrotexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea el DHFR tipo silvestre es la linea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR. De manera alternativa, las células huésped (particularmente los huésped tipo silvestre que contienen el DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con las secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo anti-CDlla, la proteína de DHFR tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3'-fos fot rans ferasa (APH) se puede seleccionar por el crecimiento celular en el medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosidico , por ejemplo, canamicina, neomicina, o G418. Ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para el uso en la levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRP7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979) ) . El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de la levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC no. 44076 ó PEP4-1. Jones, genetics, 85:12 (1977) . La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura entonces proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano. De manera similar, cepas de levadura deficiente son Leu2 (ATCC 20, 622 ó 38,626) que se complementan por plásmidos conocidos que tienen el gen Leu2. Además, los vectores derivados a partir del plásmido circular pKDl de 1.6 µm se pueden usar para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. De manera alternativa, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimocina debe ser recombinante se reportó por K. lactis. Van den Berg, Bio/Technologies , 8:135 (1990). Los vectores de expresión de multicopia, estables para la secreción de albúmina de suero humano, recombinante, madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito Fleer et a., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991) . (iv) Componente Promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usuario un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza operablemente al ácido nucleico del anticuerpo anti-CDlla. Los promotores adecuados para el uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los esquemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, o un sistema promotor de triptofano (trp) , y promotores híbridos tal como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para el uso en los sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado operablemente la ADN que codifica para el anticuerpo anti-CDlla. Las secuencias promotoras se conocen para las eucarióticas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en la dirección 5' desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases en la dirección 5' desde el inicio de la dirección de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' y en la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la extremidad poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucarióticos. Los ejemplos de secuencias de promoción adecuadas para el uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato-cinasa u otras encimas glicólicas, tal como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa , triosefosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para el alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, encimas degradadoras asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneina , glicerilaldehido-3-fosfato-deshidrogenasa y encimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y promotores para el uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en la EP 73,657. Los intensificadores de levadura también se usan ventajosamente con los promotores de levadura. La transcripción del anticuerpo anti-CDlla de los vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tal como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B y en forma más preferente el virus 40 de Simio (SV40), los promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, con la condición que estos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral SV40 de replicación. El promotor temprano, inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar el ADN en huésped mamíferos usando el virus de papiloma o bovino como un vector se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,601,978. También ver Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en la expresión del ADNc del ß-interferon humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina-cinasa del virus del herpes simplex. De manera alternativa, se puede usar como el promotor la repetición terminal larga del virus de sarcoma de rous . (v) Componente del Elemento Intensificador La transcripción de un ADN que codifica para el anticuerpo anti-CDll de esta invención por eucariotas superiores se incrementa frecuentemente al insertar una secuencia intensificadora en el vector. Muchas secuencias intensificadoras se conocen ahora de genes mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteina e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador para un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de pioloma en el lado tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en los elementos intensificadores para la activación de promotores eucarióticos. El intensificador se puede empalmar en el lector en una posición 5' ó 3 a la secuencia que codifica al anticuerpo anti-CDlla, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor. (vi) Componente de Terminación de Transcripción Los vectores de expresión usados en las células huésped eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, planta, animal, humano o nucleadas a partir de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas de 5' y ocasionalmente 5' de los ADN eucarióticos o virales los ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para el anticuerpo anti-CDlla. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Ver la WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en la misma. (vii) Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente son las células procarióticas , de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen Eubacteria, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter , Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtillis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989). Pseudomonas tal como P. euroginosa y Streptomyces.

Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tal como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tal como los hongos filamentosos o levadura son adecuados huéspedes de clonación o expresión para los vectores que codifican para el anticuerpo-CDUA . Saccharomyces cerevisiae, a la levadura del cervecero común, es de los microorganismos huésped eucarióticos inferiores más comúnmente usados. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y útiles en la presente, tal como Schizosacchartomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tal como por ejemplo K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicermii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906, K. thermotolerans, y K. marxanus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schawanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis ; y hongos filamentosos tal como por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tal como A. nidulans y A. niger. Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-CDlla glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de planta e insecto. Numerosas cepas y variantes baculovirales y las células huésped de insectos permisivas correspondientes de los huéspedes tal como spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypt (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila elanogaster (mosca del fruto) y Bombyx mori se han identificado. Están públicamente disponible una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-l de autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de bombyx mori NPV, y estos firus se puede usar como los virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de plantas celulares de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes. Sin embargo, ha sido más grande el interés en células de invertebrados, y en la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) ha llegado a ser -un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles, son la línea CV1 de riñon de mono transformada pro SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñon embriónico humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en el cultivo de suspensión Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); las células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70) ; las células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células de higado de rata búfalo .(BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562K, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); las células MRC 5; las células FS4, y la linea de hepatoma humana (Hep G2 ) Las células huésped se transforman con la expresión descrita anteriormente o los vectores de clonación para la producción del anticuerpo anti-CDlla, en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de las Células Huésped Las células huésped usadas para producir el anticuerpo anti-CDlla de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tal como Ham's FIO (Sigma), el medio esencial mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y el medio de Eagles modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth Enz. 58.44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,767,704; 4,657,866, 4,927,7862; 4,560,655; ó 5,122,469, WO 90/034530; WO 87/00195; y la Patente de los Estados Unidos No. Re 30,985 se pueden usar como medio de cultivo para las células huésped.

Cualquiera de estos medios se puede complementar como sea necesario con hormonas y/o factores de crecimiento (tal como insulina, transfer ina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) amortiguadores (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como el fármaco GENTAMYCINMR) , elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente equivalente de energía. También se pueden incluir cualquiera de otros complementos necesarios a concentraciones apropiadas que serian conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH, y similares, son aquellas usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán aparentes para una persona experta en la técnica. (ix) Purificación del anticuerpo anti-CDlla Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de manera intracelular, en el espacio periplasmát ico , o segregar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, los desechos de partículas, ya sea células huésped o fragmento Usados, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración . Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se segregan en el espacio periplasmático de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Se pueden remover los desechos celulares por centrifugación. Donde se segrega el anticuerpo en el medio, se concentran en general primero los sobrenadantes de estos sistemas de expresión usando un filtro de concentración de proteína, comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración en Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y antibióticos se pueden incluir para prevenir el crecimiento de los contaminantes inesperados. La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La adecuabilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basen en las cadenas pesadas gl, g2, g4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62.1-13 (1983)) . La proteina G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la g3 humana (Guss et al., EMBO J. 65:15671575 (1986) ) . La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tal como el vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos más cortos de procesamiento que se pueden lograr con agarosa. Donde el anticuerpo comprende una linea de CH3, la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tal como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con el calor, HPLC de frase invertida, cromatografía en silice, cromatografía en heparina, cromatografía en SEPHAROSAMR, en duna resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar . Después de cualquier paso(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a la cromatografía de interacción hidrófoga de pH bajo usando un amortiguador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25 M) de sal.

C. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para almacenamiento al mezclar anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores fisiológicamente aceptables, opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tal como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácidos fólico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimet ilbencilamonio ; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico, alquil-parabenos tal como metil o propil-parabeno ; catecol; resorcinol, ciclohexanol ; -pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal -como glicina, glutamina, asparagina, histidina, argiina, o lisina, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohiratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal comió EDTA; azúcares tal como sucrosa, manitol, trealosa o sorbitol; contra iones formadores de sal tal como sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína ) ; y/o agentes tensioactivos no iónicos tal como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG). , La formulación de la presente también puede contener más bien compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trate, de manera preferente aquellos con actividades complementarias que o afecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente inmunosupresor. Estas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de co-acumulación, o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistema de distribución de fármaco, coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas (o microemulsiones). Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol. A. Ed. (1980) . Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófogos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que salen en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsula. Los ejemplos de matriz de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato), o poli (alcohol vinilico)), polilactidos (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y g etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láct ico-ácido glicólico degradables tal como Lupron DepotMR (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D ( - ) -3-hidroxibut irico . En tanto que los polímeros tal como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permite la liberación de moléculas durante más de 100 dias, ciertos hidrogeles liberan proteínas con periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desneutralizarse o agregarse como resultado a la exposición a la humedad a 37°C, dando por resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad . Las estrategias de relación se pueden contemplar para la esterilización dependiendo del microorganismo comprendido. Por ejemplo, si el mecanismo de acumulación se descubre que es una formación de enlace S-S intramolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, puede lograr la estabilización al modificar los residuos de sulfidrilo, liofilizando de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz poliméricas, específicas.

D. Usos no Terapéuticos para el Anticuerpo Los anticuerpos de la invención se pueden usar como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan- en una fase sólida tal como resina Saphadex o papel filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteina de CDlla (un fragmento de la misma) que se va a purificar, y posteriormente el soporte se lava con un solvente adecuado que removerá substancialmente todo el material en la muestra excepto la proteina de CDlla, que se une al anticuerpo movilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteína de CDlla del anticuerpo. Los anticuerpos CDlla también pueden ser útiles en los ensayos de diagnóstico para la proteína de CDlla, por ejemplo, la detección de suspensión en células específicas, tejidos, o suero. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará típicamente con una porción detectable. Numerosas marcas están disponibles que se pueden agrupar en general en las siguientes categorías : (a) Radioisótopos, tal como 35S, 1 C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed . Wiley-interscience , New York, New York, Pubs. (1991) por ejemplo y se puede medir la radioactividad usando un conteo de escintilación. (b) Marcas fluorescentes que son quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina y rojo Texas están disponibles. Las arcas fluorescentes se pueden conjugar al anticuerpo usando las técnicas descritas en current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo, se puede cuantificar la fluorescencia usando un fluorímetro. (c) Varias marcas de substrato de enzima están disponibles y la Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunos de estos. La enzima cataliza en general una alteración química del substrato cromogénico que se puede medir usando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, que se puede medir espectrofotomét ricamente . De manera alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminescencia del substrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El substrato quimioluminescente llega a estar electrónicamente excitado por una reacción química y luego puede emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminómetro , por ejemplo) donando energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasas de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinodionas , malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidas , glucoamilasa , lisozima, sacárido-oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa) oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina-oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar las enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparación of Enzyme-Antibody Connugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Los ejemplos de las combinaciones enzima-substrato incluyen por ejemplo: (i) peroxidasa de rábano (HRPO) con hidrógeno-peroxidasa como un substrato, en donde la hidrógeno-peroxidasa oxida un precursor de tinta (por ejemplo, ortofenilen-diamina (OPD) ó clorhidrato de 3 , 30-5 , 5 ' -tet ramet ilbencidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil-fosfato como substrato cromogéico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o el substrato fluorogénico 4-metilumbeliferi1-ß-D-galactosidasa . Otras numerosas combinaciones de enzima-substrato están disponibles por aquellos expertos en la técnica. Para una revisión general de estas, ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, la marca se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en la técnica estará consciente de las varias técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres categorías amplias de marcas mencionadas anteriormente se pueden conjugar con arginina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y de esta manera, la marca se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. De manera alternativa, para lograr la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los tipos diferentes de marcas mencionadas anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno) por ejemplo, anticuerpo-anti-digoxina) . De esta manera, la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo se puede lograr . En otra modalidad de la invención, el anticuerpo anti-CDlla no necesita estar marcado, y la presencia de un miembro se puede detectar usando un anticuerpo marcado que se una al anticuerpo de CDlla. Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos de intercalación directa o indirecta, y ensayos de inmunoprecipitación . Zola, Monoclonal antibodies; A Manual of Techniques, pp . 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Los ensayos de unión competitiva dependen de la capacidad de una norma marcada para competir con el analito de la muestra de prueba para la unión con una cantidad limitada del anticuerpo. La cantidad de la proteína de CDlla en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de la norma que llega a estar unida a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de la norma que llega a estar unida, los anticuerpos se insolubilizan en general antes o después de la competición, de modo que la norma y el analito que se unen a los anticuerpos se pueden separar de manera conveniente de la norma y el analito que permanecen no unidos. Los ensayos de intercalación comprenden el uso de dos anticuerpos, cada un capaz de unirse a una diferente porción inmunogénica, o epítope, de la proteína que se va a detectar. En un ensayo de intercalación, el analito de la muestra de prueba se une por un primer anticuerpo que se moviliza en un soporte sólido, y posteriormente un segundo anticuerpo se une al analito, formando de este modo un complejo de 3 partes insoluble. Ver por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,376,110. El segundo anticuerpo se puede marcar por sí mismo con una porción detectable (ensayos de intercalación directa) ose pueden medir usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con una porción detectable (ensayo de intercalación indirecto). Por ejemplo, el tipo del ensayo de intercalación es un ensayo ELISA, el caso en el cual la porción detectable es una encima. Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede estar fresca o congelada o puede estar incrustada en parafina y fijada con un conservador tal como formalina, por ejemplo. Los anticuerpos también se pueden usar para los ensayos de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo de marca con radionúclido (tal como ?uln, "Te, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S), de modo que el tumor se puede localizar usando inmunoescintiografía .

E. Equipos de diagnóstico Como una materia de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un equipo, es decir, una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instructivos para realizar el ensayo de diagnóstico. Donde se marca el anticuerpo con una encima, el equipo incluirá substratos y co-factores requeridos por la encima (por ejemplo, un precursor de substrato que proporciona el cromóforo detectable o fluoroforo) . Además, se pueden incluir otros aditivos tal como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloque o amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. De manera particular, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes que en la disolución proporcionarán una solución reactiva que tiene la concentración apropiada.

F. Usos Terapéuticos para el Anticuerpo Se contempla que el anticuerpo anti-CDlla de la presente invención se puede usar para tratar los varios desórdenes mediados por LFA-1 como se describe en la presente.

El anticuerpo anti-CDlla se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y se desea para el tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional, (incluyendo percusión o contacto de otra manera del injerto con el anticuerpo antes del transplante). Las infusiones parentales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CDlla se administra de manera adecuada por infusión de impulso, particularmente con dosis declinante del anticuerpo. De manera preferente, la dosis se da por inyecciones, en forma más preferente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se trate, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, previo a la terapia, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del facultativo que atiende. El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente en una vez o varias series de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se inspecciona fácilmente por técnicas convencionales y ensayos convencionales. Se describe en la WO94/04188 un régimen de dosis de ejemplo. La composición de anticuerpos se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores para la consideración en este contexto incluyen el desorden particular que se trate, el mamífero particular que se trate, la condición clínica del paciente individual, la causa del desorden, el sitio de distribución del agente, el método de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos para los practicantes médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo que se va a administrar se gobernará por estas consideraciones, y es la cantidad minima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar el desorden mediado por LFA-1, que incluye el tratamiento de artritis reumatoide, reducción de las respuestas inflamatorias, inducción de tolerancia de inmunoestimulantes , prevención de una respuestas inmunitaria que daría por resultado el rechazo de un injerto en un huésped o viceversa, o la prolongación de la supervivencia de un injerto transplantado. Esta cantidad preferentemente está por debajo de la cantidad que es tóxica al huésped o vuelva al huésped significantemente más susceptible a la infecciones. El anticuerpo no necesita ser, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes usados corrientemente para prevenir o tratar el desorden den cuestión. Por ejemplo, en la artritis reumatoide, el anticuerpo se puede dar en unión con un glucocorticosteroide . Además, la terapia del péptido receptor de células T es adecuadamente una terapia auxiliar para prevenir signos clínicos de la encefalomielitis autoinmunitaria. Para trasplantes, el anticuerpo se puede administrar concurrentemente con, o separado de un agente inmunosupresor como se define anteriormente, por ejemplo ciclosporina A, para modular el efecto inmunosupresor. De manera alternativa, o además, los antagonistas u otros antagonistas de LFA-1 se pueden administrar al mamífero que sufre de un desorden mediado por LFA-1. La cantidad efectiva de otros agentes dependerá de la cantidad del anticuerpo anti-CDlla presente en la formulación, el tipo de desorden o tratamiento, u otros factores discutidos anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosis y con las rutas de administración como se usa anteriormente en la presente o desde aproximadamente 1 hasta 99 % de las dosis empleadas hasta la fecha.

Artículos de manufactura En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene los materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una marca.

Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de ensaye. Los recipientes pueden formar a partir de una variedad de materiales tal como vidrio plástico. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CDlla. La marca o etiqueta en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se usa para dar la condición de elección, el artículo de manufactura puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y desde del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y hojas de empaque con instrucciones para el uso.

EJEMPLO Producción de anticuerpos anti-CDlla humanizados Este ejemplo describe la eficacia biológica in vitro y la humanización de un anticuerpo monoclonal anti-CDlla humano, murino, el MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983)). Los estudios previos en el MHM24 murino han mostrado que, diferente de otros anticuerpos anti-CDlla puede inhibir la función de las células T (Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985); Dougherty et al., Eur. J. Immunol. 17:943-947 (1987)). Tanto los MAb murinos como humanizados previenen efectivamente la adición de las células T humanas a los queratinocitos humanos y la proliferación de las células T en respuesta a los leucocitos no autólogos en la respuesta de linfocitos mezclados (MLR) , un modelo para la sensibilidad a los antígenos clase II de MHC (McCabe et al., Cellular Immunol. 150:364-375 (1993)). Sin embargo, tanto los MAb murinos ((Reimann et al., Cytometry, 17:102-108 (1994)) y los humanizados no reaccionan en forma cruzada con el CDlla de primate, no de humano diferente del CDlla de chimpancé. A fin de tener un MAb humanizado disponible para los estudios preclinicos en el rhesus, el MAb humanizado se pre-manejo genéticamente para unirse al CDlla de rhesus al cambiar cuatro residuos en una de las regiones de determinación de complementariedad, la CDR-H2, en el dominio pesado, variable. La clonación y modelo molecular del I-dominio de CDlla de rhesus sugirió que un cambio de un residuo de lisina en el I-domini?' de CDlla humano a ácido glutámico en el I-dominio de CDlla de rhesus en la razón que los MAb murinos y humanizados no se unan al CDlla.

Materiales y métodos (a) Construcción de F(ab')s humanizado El MAb anti-CDlla humano, murino, el MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985)), se clonó y se secuenció. A fin de tener un plásmido útil para la mutagénesis así como para la expresión de F(ab)en E. coli, se .construyó el fagémido pEMXl .

Basándose en el fagémido pb0720, un derivado de pB0475 (Cunningham et al., Science 243:1330-1336 (1989)), el pEMXl contiene un fragmento de ADN que codifica para cadena ligera del k-subgrupo I, humanizada y una cadena pesada del subgrupo III humanizada (VH-CH1) y un rpomotor de fosfatasa alcalina y la secuencia de Shine-Dalgarno, ambos derivados de otro plásmido basado en pUC119 descrito previamente, el pAK2 (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992). También se introdujo un sitio único de restricción de Spel entre el ADN que codifica para las cadenas ligeras y pesadas de F(ab) . Para construir la primera variante de F(ab) de MHM24 humanizado, F(ab)-1, se realizó la mutagénesis dirigida a la secuencia (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) en una plantilla que contiene desoxiuridina de pEMXl; los seis CDR se cambiaron a la secuencia de MHM24. Se construyeron otras variantes de F(ab) a partir de una plantilla de F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) para la incorporación del ADN de doble hebra o de hebra individual. Para cada variante se secuenciaron completamente tanto las cadenas ligeras como pesadas usando el método de didesoxinucleotido (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Se transformaron los plásmidos en la cepa 16C9 de E. coli, un derivado de MM294, colocado en placas LB que contienen 5 µg/ml de carbenicilina, y una colonia individual se seleccionó para la expresión proteica. La colonia individual se cultivó en 5 ml de LB-100 µg/ml de carbenicilina durante 5-8 horas a 37°C. Se adicionó el cultivo de 5 ml a 500 ml de AP5-100 µg/ml de carbenicilina y se dejo cultivar durante 16 horas en un matraz agitado con desviadores 4 L a 37°C. El medio APS consiste de: 1.5 g de glucosa, 11.0 de Hycasa SF, 0.6 g de extracto de levadura (certificado), 0.19 g MgS04 (anhidro), 1.07 g de NH4C1, 3.73 g de KCl, 1.2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7.4 a un 1 L de agua y luego se filtró estéril a través de un filtro Sealkeen de 0.1 µm. Las células se recolectaron por centrifugación en una botella de centrifuga 1 L (Nalgene) A 3000 x g y el sobrenadante se removió.

Después del congelamiento durante 1 hora, la pelotilla se dispersó en 25 mm de MES 10 mM frio-EDTA mM, pH 5.0 (amortiguador A). Se adicionaron 250 µl de PMSF 0.1 M (Sigma) para inhibir la proteólisis y se adicionaron 3.5 ml de lisozima blanca de huevo de gallina de 10 mg/ml concentrada (Sigma) para ayudar a la lisis de la pared celular bacteriana. Después de la agitación suave en hielo durante 1 hora, la muestra se centrifugó a 40,000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se llevo a 50 ml con amortiguador A se cargo en una columna de DEAE de 2 ml equilibrada con amortiguador A. Luego se aplicó flujo de paso a una columna de proteína G-seforosa CL-4b (Pharmacia) (volumen de lecho 0.5 ml ) puesta en equilibrio con amortiguador A. La columna se lavó con 10 ml de amortiguador A y se diluyó con 3 ml de glicina 0.3 M, pH 3.0, en 1.25 ml de Tris 1 M, pH 8.0. El F(ab) luego se intercambió con amortiguador en PBS usando un Centricon-30 (Amicon) y se concentró a un volumen final de 0.5 ml . SE corrieron los geles de SDS-PAGE de todos los F(ab) para determinar la pureza y el peso molecular de cada variante se verificó por espectrometría de masas con electrorociada . (b) Construcción de IgG quimérico humanizado Para la generación de variantes humanas de IgGl del MHM24 quimérico (chlgGl) y humanizado (HuIgGl), se subclonaron los dominios de variables de cadena ligera y variables de cadena pesada (F(ab)-8, Tabla II) humanizados o murinos, apropiados o en vectores pRK, descritos previamente, separados (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech. 2:3 (1990)). Las variantes de exploración de alanina se construyeron por mutagénesis dirigida a la secuencia (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) de los plásmidos de cadena ligera y pesada de HuIgGl. La secuencia de ADN de cada variante se verificó con secuenciación de didesoxinucleotidos . Los plásmidos de cadena pesada y ligera se co-transfectaron en una línea de célula de riñon embriónico, humano, transformado con adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), usando un procedimiento de alta eficiencia (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); Gorman et al., Science, 221:551 (1983)). Se cambió el medio a libre de suero y se recolectó diariamente durante 5 días. Se purificaron los anticuerpos de los sobrenadantes mezclados usando proteína A-Sefarosa CL-4B (Pharmacia). El anticuerpo eluido se intercambio con amortiguador en PBS usando un Centricon-30 (Amicon) , se concentró a 0.5 ml, se filtró estéril usando un Millex-GV (Millipore) y se almacenó a 4°C. La concentración del anticuerpo se determinó usando ELIDA de unión a Ig total. La concentración de la IgGl anti-pl85HER, humanizada, de referencia (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) se determinó por análisis de composición de aminoácidos. Cada pozo de una placa de 96 pozos se revistió con 1 µg/ml de la IgG F(ab')2 anti-humano de cabra (Cappel Laboratories, Westchester, PA) durante 24 horas a 4°C. Se diluyeron los anticuerpos purificados y se adicionaron en duplicado a las placas revestidas. Después de la incubación a 1.5 h, las placas se lavaron con PBS-Tween 20 al 0.002 % y se adicionaron 0.1 ml de una dilución 1:2000 de la IgG F(ab')2 anti-humano de oveja conjugada con peroxidasa de rábano (Cappel). Después de 1.5 horas de incubación, las placas se lavaron y se adicionaron 0.1 ml de diclorhidrato de o-fenilendiamina de 0.2 mg/ml -peróxido de hidrógeno al 0.01 %-PBS. Después de 10 minutos, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 M y se leyó el O.D. a 490 nm. (c) Clonación del I-dominio de CDlla de rhesus .

La secuencia de ADN del I-dominio de rhesus se obtuvo usando RT-PCR y cebadores derivados de la secuencia de ADN de CDlla, humano producido de manera breve, se aisló el ARNn de aproximadamente 107 leucocitos de rhesus usando el equipo de purificación de ARNm Fast Track (Invitrogen) . 10 µg de ARNm se transcribieron invertidos usando transcriptasa invertida de MuLV. Luego se amplificó el ADNc de la primera hebra por 40 ciclos de PCR usando los cebadores: 5 ' CACTTTGGATACCGCGTCCTGCAGGT-3 ' (hacia delante) (SEQ ID NO:21) y 'CATCCTGCAGGTCTGCCTTCAGGTCA-3' (invertido) (SEQ ID NO:22) . Se purificó una banda individual del tamaño pronosticado a partir de la reacción de PCR usando electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR se digirió con la encima de restricción Sse8387l (Takara) y se ligó a un plásmido que contiene CDlla humano digerido con la misma encima de restricción. Hubo dos sitios Sse8387I en la secuencia de CDlla humano, uno en cualquier lado del I-dominio. El plásmido resultante codificó para una quimera que consiste de CDlla humano con un I-dominio de rhesus sustituido para el I-dominio, humano. El análisis de la secuencia de ADN reveló cinco diferencias de aminoácidos entre el humano y el rhesus. Una diferencia estaba en la región N-terminal al I-dominio (Thr59Ser) y las otras cuatro diferencias estaban en el I-dominio mismo; Vall33Ile, Argl89Gln, Lysl97Glu, y Val308Ala (Figura 2) . (d) Análisis FACScan de F(ab) e IgG que se une a células Jurkat Se incubaron alícuotas de 10d células T Jurkat con diluciones en serie de anticuerpos humanizados y de control en PBS-BSA al 0.1 %-azida sódica 10 mM durante 45 minutos a 4°C. Las células se lavaron y luego se encubaron en F(ab')2 anti-humano, de cabra, conjugado con fluorescina (Organon Teknika, Westchester, PA) durante 45 minutos a 4°C. Se lavaron las células y se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Se adquirieron 8 x 103 células por modo de lista y se regularon por dispersión de luz hacia delante contra dispersión de luz lateral, excluyendo de este modo las células muertas y desechos. (e) Unión de saturación para determinar la kas aparente Se prepararon anticuerpos radiomarcados usando yodo-Gen (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se adicionaron 50 µg del anticuerpo y 1 mCi125I(Du Pont, Wilmington, DE) a cada tubo y se incubaron durante 5 minutos a 25°C. Se purificaron las proteínas radiomarcadas de 125I restante usando columnas PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) puestas en equilibrio en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene gelatina al 0.2 %. Se purificaron las células mononucleares a partir de la sangre periférica humana heparinizada recolectada de dos donadores usando el Medio de Separación de Linfocitos (LSM, Organon Teknika, Durham, NC) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La sangre se centrifugó a 400 x g durante 40 minutos a 25°C sin rotura. Las células en la interfaz de LSM y el plasma se recolectaron y luego se redispersaron en HBSS-gelatina al 0.2 %. Se purificaron los leucocitos a partir de la sangre periférica de mono rhesus, heparinizada, recolectada a partir de dos individuos por sedimentación de dextrano. se diluyó la sangre con un volumen igual de Dextrano T500 al 3 % (Pharmacia) en PBS y se dejó sedimentar sin disturbio a 25°C durante 30 minutos. Después de la sedimentación, se recolectaron las células que permanecen en al suspensión y se sedimentaron por centrifugación a 400 x g durante 5 minutos. Se removieron los eritrocitos residuales por dos ciclos de lisis hipotónica usando agua destilada y HBSS 2X. Después de la lisis de los eritrocitos, se lavaron las células en PBS y luego se redispersaron en HBSS-gelatina al 0.2 %. Se determinaron las afinidades de los anticuerpos por la unión de saturación usando ya sea células mononucleares de sangre periférica (MHM24 murina y HuIgGl) . o leucocitos de rhesus (MHM23, RhlgGl) . En cada ensayo, se diluyó en serie un anticuerpo radiomarcado en HBSS-gelatina al 0.2 % en cuadruplicado. Se determinó la unión no específica por la adición de la concentración final de 500 nM de anticuerpo no marcado homólogo en duplicado a través de la dilución en serie. Los linfocitos humanos o los leucocitos de rhesus se adicionaron a las placas en un volumen de 170 µl por pozo. Las placas se incubaron durante 2 hr a temperatura ambiente en un agitador de placa orbital. Después de la incubación, se recolectaron las células usando un recolectador de células SKATRONMR (Lier, Norway) y se lavaron 10 veces con PBS que contiene gelatina al 0.25 % y ázida sódica al 0.1 %. Luego se contaron las muestras durante un minuto en un contador gamma LBK Wallac GammaMaster (Gaitherburg, MD) . Los datos se transformaron de las cuentas por minuto a nonamolaridad y luego se realizaron gráficas de cuatro parámetros de ajuste a la curva de saturación (unión contra total) para determinar los valores de Kd (app) . (f) Ensayo de adición de monocapa de queratinocitos .

Se removieron los queratinocitos epidérmicos, normales, humanos (Clonetics, San Diego, CA) de los matraces de cultivo con tripsina-EDTA, se centrifugaron, y se redispersaron en el medio de ensayo de linfocitos (RPMI 1640 (GIBCO) - suero de becerro fetal al 10 %-penicilina/estreptomicina al 1 %) a una concentración de 5 x 105 células viables/ml. Luego se cultivaron durante la noche alícuotas de 0.1 ml/pozo en placas de 96 pozos de fondo plano; se estimularon los pozos apropiados por la adición de interferon-gamma (Genentech, South San Francisco, CA) a 100 unidades/pozo. Se marcaron las células E6-1 de Jurkat (ATCC, Rockville, MD) o los linfocitos purificados de rhesus (ver métodos de MLR) con 20 µg/ml de Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a 37°C durante 45 minutos. Después de lavar tres veces con un medio de ensayo de linfocitos, se redispersaron las células de linfocitos de rhesus o Jurkat a 1 x 106 células/ml y se incubaron con el anticuerpo diluido en serie a 4°C durante 30 minutos. Después de la remoción del medio de la monocapa de queratinocitos, se adicionaron 0.1 ml/pozo de células marcadas y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavaron cinco veces con 0.2 ml/pozo/lavado del medio de linfocitos a 37°C para remover las células no unidas. Se midió la fluorescencia usando un Citoflúor 2300 (Millipore, Bedford, MA) . Un CDlla quimérico, de rhesus-humano (Rh/HuCDlla) que comprende CDlla humano con I-dominio de rhesus se construyó con mutagénesis dirigida a la secuencia (Kunken, Proc, Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) en un plásmido de plantilla que contiene desoxiuridina que codifica para CDlla humano. Se alteraron cuatro residuos: Vall33Ile, Argl89Gln, Lysl97Glu, y Val308Ala (Figura 2). Se co-transfectaron los plásmidos que codifican para Rh/HuCDlla y CDllb humano (EP 364,390) en una linea de células de riñon embriónico, humano, transformados con adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), usando un procediminto de alta eficiencia (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); Gorman et al., Science, 221:551 (1983)). Las células 293 transfectadas con Rh/HuCDlla se marcaron con 20 µg/ml de Calceina AM a 37°C durante 45 minutos . Después de lavar tres veces con el medio de suero de linfocitos, las células 293 transfectadas con Rh/HuCDlla se redispersaron a 1 x 106 células/ml y se incubaron con un anticuerpo diluido en serie a 4°C durante 30 minutos. Después de la remoción del medio de la monocapa de queratinocitos, se adicionaron 0.1 ml/pozo de las células 293 marcadas y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavaron 5 veces con 0.2 ml/pozo/lavado del medio de linfocitos a 37°C para remover las células no unidas. Se midió la fluorescencia usando un Citoflúor 2300. (g) Ensayo de adhesión de ICAM.

Se revistieron las placas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con 0.1 ml/pozo de 1 µg/ml de IgG Fe anti-humano de cabra (Caltag) durante 1 hora a 37°C. Después de lavar las placas tres veces con PBS, , las placas se bloquearon con BSA al 1 %-PBS durante 1 hora a 25°C. Luego, las placas se lavaron tres veces con PBS y 0.1 ml/pozo de 50 ng/ml de ICAM-IgG humano, recombinante se adiciono y se incubó durante la noche . El ICAM-IgG consistió de los cinco dominios extracelulares de la ICAM humana fusionada en una IgG Fe humana. Un plásmido para la expresión de una ICAM-a humana (Simmons et al. Cell 331:624-627 (1988) y Staunton et al. Cell 52:925-933 (1988)) inmunoadhesina llamada pRK.5dICAMGaIg se construyó. Contienen los cinco dominios similares a Ig de ICAM-1, un sitio de escisión de seis aminoácidos reconocido por una variante de H64A de subtilisina BPN', Genenasa I (Cárter et al. Proteins: Structure, Funtion and Genetics 6:240-248 (1989)), y y la región Fe de IgGl humana (Ellison et al. Nucleic Acids Research 10:4071-4079 (1982)) en el vector pRK5 (Eaton et al. Biochemistry 25:8343-8347 (1986)). Las células 293 de riñon embriónico, humanas (raham et al. J. Gen. Virol. 36:59 (1977)) se transfectaron establemente con pRK.5dICAMIg y el plásmido RSV-neo (Gorman et al. Science 221:551:553 (1983)) para genera una línea celular que expresa la ICAM-Ig de cinco dominios (5dICAMIg) . Se seleccionó un clon que expresó 20 µg/ml de 5dICAMIg segregado por el ensayo inmunosolvente en enlazado a encimas (ELISA) usando los anticuerpos IgG Fe humano (Caltag, Burlingame, CA) e ICAM-1 (BBIG-I1; R & D Systems, Minneapolis, MN) . El sobrenadante del cultivo celular de esta linea celular se cargo en una columna de proteina A (ProsepA, Bioprocessing, Ltd, Durham, Inglaterra) puesto en equilibrio en amortiguador Hepes 0.01 M (pH 7.0), NaCl 0.15 M (HBS) y la columna se lavo con HBS seguido por amostiguados HEPES 0.01 M (pHY 7.0), NaCl 0.5 M, TMAC 0.5 M (cloruro de tatra-metil-amonio) para remover el material no unido de manera específica. El amortiguador de TMAC se lavó completamente de la columna con HBS y el 5dICAMIg eluido con amortiguador Hepes 0.01 M (ph 7.0), MgCl2 3.5 M y glicerol al 10 % (p/v) . La mezcla de proteina A se dializó de manera extensiva contra HBS y se concentró. Se marcaron los linfocitos purificados de rhesus (ver métodos de MLR) con 20 µg/ml de Calceina AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a 37°C durante 45 minutos. Después de lavar tres veces con el medio de ensayo de linfocitos, se redispersaron las células de linfocitos de rhesus a 1 x 106 células/ml y se incubaron con el anticuerpo diluido en serie a 4°C durante 30 minutos. Después de la remoción del medio de las placas revestidas con ICAM-IgG, se adicionaron 0.1 ml/pozo de células marcadas y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavaron cinco veces con 0.2 ml/pozo/lavado de el medio de linfocitos a 37°C para remover las células no unidas. Se midió la fluorescencia usando un Citoflúor 2300 (Millipore, Bedford, MA) . (h) Respuesta de linfocitos mezclados unidireccional (MLR) Tanto para la MLR humana y de rhesus, los linfocitos de la sangre periférica de dos donadores no relacionados se aislaron de la sangre heparinizada, completa usando el medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC) . Los linfocitos se redispersaron a una concentración de 3 x 106 células/ml en RPMI 1640 (GIBCO) -suero AB humano al 10 %-glutamina al 1 %-penicilina/estreptomicina al 1 %-aminoácidos no esenciales al 1%-piruvato al 1 %-5 x 10~5 M 2-ß-mercaptoetanol-50 µg/ml de gentamicina-5 µg/ml de polimixina B. Las células estimuladoras se hicieron insensibles por radiación con 3000 rads en un radiador de cesio. Las células respondedoras a una concentración de 1.5 x 105 células por pozo se co-cultivaron con un número igual de células estimuladoras en placas de fondo plano, de 96 pozos.

Diluciones en serie de dos veces del anticuerpo se hicieron a los cultivos para dar un volumen total de 200 µl/pozo. Los cultivos se incubaron a 37°C en C02 a 5 % durante 5 dias y luego se les trató con impulsos con 1 µCi/pozo de [3H]timidina durante 16 horas. Se midió la incorporación de [3H]timidina con un contador de escintilación Beckman. Se hicieron los ensayos en triplicado. Un MAb anti-pl85HER2 humanizado (Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) se usó como el control de isotipo para HuIgGl y RhlgGl. Un MAb anti-tpa de hámster, murino (Genentech) se usó como el control de isotipo (IgGl murina) para el MAb MHM23. El MAb 25.3 se compro de Immunotech, Inc (Westbrook, ME) . (i) Modelos gráficos por computadora del MHM24 murino y humanizado.

Se usaron las secuencias de los dominios VL y VH (Figuras ÍA y B) para construir un modelo gráfico por computadora de los dominios murinos VL-VH de MHM24. Este modelo se usó para determinar que residuos de armazón se deben incorporar en el anticuerpo humanizado. También se construyó un modelo de F(ab)-8 para verificar la selección correcta de los residuos murinos de armazón. Se realizó la construcción de los modelos como se describe previamente (Cárter et al Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Eigenbrot et al., J. Mol. Biol 229: 969 (1993) ) .

Resultados (a) Humanización La secuencia de consenso para el subgrupo III de la cadena pesada, humano y el subgrupo K de cadena ligera se usaron como el armazón para la humanización (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) (Figs. la y B) . Esta armazón se ha usado exitosamente en la humanización de otros anticuerpos murinos (Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). Todas las variantes humanizadas se elaboraron inicialmente y se detectaron para la unión como F(ab)a expresado en E. coli. Los rendimientos típicos de matraces agitados de 500 ml fueron 0.2-0.5 mg de F(ab) . La espectrometría de masas verificó la masa de cada F(ab) para estar dentro de 5 unidades de masa . El CDR-H1 incluyó residuos H28-H35, que incluye todos los residuos expuestos a partir tanto de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y Chothia et al Nature 342:877-883 (1989). Las otras asas hipervariables se definieron de acuerdo con Chothia et al (1989). Los números del residuo de cadena ligera se prefijan con L; los números de residuo de cadena pesada se prefijan con H.

Tabla II Unión de variantes de MHM24 humanizadas a CDlla humano en células Jurkat a Residuos murinos en heridas; los números de residuo están de acuerdo a Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . b Promedio y desviación estándar son el promedio de las relaciones calculadas para cada uno de los ensayos FACScan independientes; la EC50 para F(ab)-2 fue de 771 ± 320 ng/ml. c HuIgGl es los dominios VL y VH de F(ab)-8 fusionados a cadenas ligeras y pesadas, constantes, humanas . d chlgGl es IgG quimérica con dominios VL y VH murinos fusionados a las cadenas ligeras y pesadas, constantes, humanas.

En la variante F(ab)-1, los residuos de CDR se transfirieron desde el anticuerpo murino al armazón humana. Además, el residuo H71 se cambió desde la Arg humana a Val murina puesto que ese residuo se ha mostrado previamente que afecta as conformaciones de CDR-H1 y CDR-H2 (Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Tramontano J. Mol. Biol. 215:175 (1990)). Este F(ab) no mostró unión detectable. En F(ab)-2, el CDR-H2 se extendió para incluir la definición basada en la secuencia (es decir, que incluye los residuos H60-H65) . La EC50 para F(ab)-2 que se une al CDlla humano fue de 771 ± 320 ng/ml, que fue 148 veces más débil que la EC50 de la IgGl quimérica (5.2 ± 3.0 ng/ml) . En las humanizaciones previas, se ha encontrado que los residuos en una asa de armazón (FR-3) adyacente a CDR-H1 y CDR-H2 puede efectuar la unión (Eigenbrot., Proteins 18:49-62 (1994)). En F(ab)-5 tres residuos en esta asa se cambiaron a su contraparte murina y esta murina mostró una mejora de 23 veces en la unión (tabla II) . La alteración en los residuos humanos en las posiciones L53 y L55 a murino (es decir SerL53Thr y Glu55Gln) mejoró adicionalmente la unión por otras 4 veces (F(ab)-6, Tabla II); este CDR-L2 efectivamente convertido de la definición basada en la estructura (residuos L50-L52) a la definición basada en la secuencia (residuos L50-L56) . La alteración subsecuente de PheH27 a Tyr murino en CDR-H1 dio por resultado una mejora adicional de tres veces (F(ab)-7; Tabla II) . Finalmente, basándose en los modelos del MHM24 murino y humanizado, dos de los tres murinos (H75 y H76) en FR-3 se cambiaron de regreso al humano y se encontró que estos residuos no tienen efecto en la unión (comparar F(ab)-7 y F(ab)-8, Tabla II). La EC50 promedio para F(ab)-8 fue ligeramente mejor que aquella de la IgGl quimérica (Tabla II). No todos los cambios del humano a murino dieron por resultado unión mejorada. El PheH67 se cambió Ala murino puesto que esta posición no se ha encontrado previamente que afecta la unión (Presta et al., J.

Immunol. 151:2623-2632 (1993)), pero no fue evidente el efecto (F(ab)-3, Tabla II). El cambio de ValH71 de regreso a Arg humano afecto una reducción de tres veces la unión (F(ab)-4, Tabla II), soportando la inclusión de ValH71 en F(ab)-1. Los dominios de VL y VH de F(ab)-8 se transfirieron a los dominios constantes de IgG humano. El anticuerpo intacto de longitud completa, HuIgGl, mostró una EC50 equivalente a F(ab)-8 y mejoró en comparación a la IgGl quimérica de longitud completa (tabla II) . Cuando los datos para todos los ensayos de HuIgGl se consideran, incluyendo su uso como una norma para los ensayos de exploración de alanina y de MLR (ver posteriormente), la EC50 para HuIgGl contra el CDlla humano fue 0.042 ± 0.072 nM (N = 15) . El análisis de unión de saturación también se realizó para determinar las constantes de disociación aparentes, Kd (app) : 0.15±0.002 nM para MHM24 murino y 0.15 ± 0.04 nM para HuIgGl (Tabla III).

Tabla III Kd aparente por unión de saturación a linfocitos humanos y leucocitos de rhesus a Ensayos para el donador 3 de rhesus se realizaron usando dos lotes de RhlgGl; los ensayos se realizaron en la presencia de 1 mg/ml de IgGl humana para bloquear la interacción del receptor de Fe. (b) Exploración de alanina de residuos de CDR Para determinar que residuos de CDR estaban comprendidos en la unión de CDlla humano se realizó una exploración de alanina (Cunningham et al., Science 244:1081 (1989) en los residuos de CDR de HuIgGl. Cada variante se probó para la unión a CDlla en células Jurkat. En la cadena ligera solo CDR-L3 contribuye a la unión. El HisL91 tiene un efecto mayor (Tabla IV) y es probablemente conformacional puesto que esta carga lateral se debe ocultar parcialmente. Los residuos AsnL92 y TyrL94 tiene un efecto más modesto, reduciendo la unión por 3 veces y 12 veces, respectivamente. Sin embargo, se señala que cambiando simultáneamente estos dos residuos a alanina (como GluL93Ala) tiene un efecto no aditivo en la unión (variante L3; Tabla IV) .

Tabla IV Exploración de alanina de residuos de CDR MHM24 humanizado * CDRS and FR-3 son como se definen en Kabat et al ( 1 1 ) Slipra. b EC50 HllIgGl para CDlla humano « 0.042 n (S X>." 0.072; N - 15). C EC50 HuIgGl para CDl la de rhesus " 45.6 nM (SX>.- 40.4; N m 16); todos los valores para CDlla de ihesus son para el ensayo de umón individual a menos que se señale de otra manera; nb denota unión de la vanante que es 10 veces más débil que HulgGl *» de IgGl como el anticuerpo huMHM24 En la cadena pesada, el CDR-H2 y el CDR-H3 son los contribuyentes prominentes a la unión. El residuo de CDR-Hl TrpH33Ala tiene un mayor defecto pero esto es más probablemente debido a un cambio conformacional como TrpH33 que se debe ocultar parcialmente. El residuo individual más importante que contribuye a la unión es AspH54 en CDR-H2; cambiando este residuo alanina afectó en una reducción de 147 veces en la unión (Tabla IV) . Otros residuos en CDR-H2 comprendidos en la unión incluyen (GluH56, GlnH61 y LysH64 (Tabla IV) . En CDR-H3, el TyrH97Ala redujo la unión por 11 veces y el TyrHIOOcAla por 8 veces. Como en CDR-L3 la alteración simultánea de varios residuos de CDR-H3 alanina afectó una reducción grande, no aditiva en la unión (comparar, variante H3 contra TyrH97Ala y TyrH99Ala, Tabla IV) . Además, el residuo de FR-3 incluido en la humanización, LysH73, también mostró una reducción de 5 veces en la unión cuando se cambió a alanina o arginina (Tabla IV) . (c) Re-manejo de HuIgGl para la unión a CDlla de rhesus.

Tanto el MHMm24 murino como la HuIgGl mostraron una reducción de aproximadamente 1000 en la unión al CDlla de rhesus; el HuIgGl tuvo una EC50 contra el CDlla de rhesus de 45.6 ± 40.4 nM (N = 16) en comparación a una EC50 de 0.042 ± 0.072 nM contra CDlla humano. Puesto que un modelo primate es importante para la evaluación de la biología; toxicidad y eficacia de MHM24 se vio ventajosa la mejora de la unión de HuIgGl al CDlla de rhesus. De manera inicial, los residuos de la región hipervariable de MAb que fueron importantes en la unión al CDlla humano y cDlla de rhesus se determinaron, de modo que aquellos importantes para el rhesus pero no para el humano se pueden alterar. Por consiguiente, las variantes de exploración de alanina también se valoraron contra CDlla de rhesus en los linfocitos de la sangre periférica. El hallazgo más importante fue que una de las variantes de mutación de múltiple alanina la variante H2, se unió 18 veces mejor al CDlla de rhesus que la HuIgGl (Tabla IV) . Sin embargo, las mutaciones individuales en los 3 residuos incluidos en la variante H2 mostraron una mejora mínima en la unión: HisH52Ala, 0.7 veces mejor, SerH53Ala, 0.7 veces mejor, y SerH55Ala, 1.3 veces peor (Tabla IV). Una serie de mutaciones dobles en estos 3 residuos mostraron que la combinación HisH52Ala-SerH53Ala fue lo mejor, proporcionando la mejora de 77 veces en la unión en comparación a HuIgGl (comparar variantes H2A1, H2A2 y H2A3, Tabla IV) . Además, las variantes AspH54Ala y GluH56Ala también efectuaron una mejora de 3 veces sobre HuIgGl (Tabla Iv) , aunque la AspH54 es el residuo de unión más importante en HuIgGl con respecto a CDlla humano. En un intento para encontrar una sustitución individual en la posición H54 que mejoraría la unión a CDlla de rhesus, pero no reduce la unión a CDlla de humano, se sustituyó la posición H52 con una variedad de aminoácidos. Todas las sustituciones redujeron la unión por más de un orden de magnitud mientras que la sustitución de AspH54Asn mejoró la unión de rhesus por 10 veces (Tabla V) .

Tabla V Substitución de aminoácidos en AspH54 a EC50 HuIgGl para CDlla humano = 0.042 nM (S.D. 0.072; N = 15); EC50 HuIgGl para DClla de rhesus 45.6 nM (S.D. = 40.4; N = 16). b Valores son del promedio de dos ensayos. c Valores para un ensayo individual.

Puesto que se señalaron los efectos no aditivos para los cambios en las posiciones H52-H53, estos se combinaron con una variedad de cambios de las posiciones .H65 y H55 (Tabla VI) . Para todas las variantes, H52 y H53 fueron alanina. En una serie, la posición H54 fue Asn y la posición H56 fue Glu (original) , Ala, Asn o Gln. Ninguna de estas variantes mejoró la unión de CDlla de rhesus sobre la variante H2A1 (Tabla VI) . En otra serie, la posición H54 fue Ala y la posición H56 fue Glu (original), Ala, Ser, o Asn y nuevamente fueron peores que la variante H2A1. En la tercera serie la posición H54 fue Ser y la posición H56 fue Glu (original), Ala, Ser, O Asn. Dos de estas variantes se exhibieron unión mejorada a DClla de rhesus en comparación a la variante H2A1 (H2C11 y H2C12, Tabla VI) . La EC50 de CDlla de rhesus para estas dos variantes puede ser 0.11 ± 0.11 nM (N 0 ) para H2C11 y 0.19 + 0.08 nM (N 0 7) para H2C12. Estos valores son dos a cinco veces más débiles que la EC50 para HuIgGl para CDlla (0.042 nM) pero son una mejora de 240 a 415 veces sobre la EC50 de HuIgGl para CDlla de rhesus (45.6 nM) . La H2C12 se referirá posteriormente como RhlgGl. Los valores de Kd aparentes de los experimentos de unión por saturación mostraron que RhlgGl se une a CDlla de rhesus así como MHM23 se une a CD18 murino (Tabla III) .

Tabla VI Unión de variantes de CDR-H2 a CDlla humano y de Rhesus Var.ECS€ HuIgGl EC50* Variante CDlla CDlla de rhesus Secuencia IgGl Humano Pro S.D. H2C2 A 2.6 >100 H2C3 A A A N >100 >100 CD -H2 M I H P S D S E T R Y 1.0 1.00 H2A1 A A 10.8 0.013 0.012(N-10) H2C1 A A N >100 0.56 0.01 H2C4 A A N A >100 0.38 0.06 H2C5 A A N N 46 o.p 0.02 H2C6 A A N Q >I00 0.21 0.01 mes A A A 12.7 038 H2C7 A A A A 2.4 1.03 0.05 H2CI0 A A A S 14.2 0.22 0.03 1 H2C9 A A A N 343 022 0.04 H2CI3 A A S 0.10 0.06 H2C14 A A S A 0.021 0.013 H2C12 A A 5 S 0.004 0.001 (N**7) H2C11 A A S N 24.9 0.002 0.001( N-9) a EC50 HuIgGl para CDlla humano = 0.042 nM (S.D. = 0.072; N = 15); EC50 HuIgGl para CD11 de rhesus = 45.6 nM (S.D. = 40.4; N = 16); todos los valores para CDlla de rhesus son el promedio de dos ensayos de unión independientes excepto donde se señala.

Para la interacción HuIgGl CDlla humano, el AspH54 fue el residuo más importante (Tabla IV) ; cambiando este residuo a otros aminoácidos se redujo significantemente la unión con la última reducción que ocurre para los cambios a Glu, Asn y Gln. Sin embargo, para interacción HuIgGl CDlla de rhesus, el AspH54 fue nocivo puesto que cambiando este residuo a Ala o Asn se mejoro la unión (Tabla V) . A fin de entender esta diferencia entre la unión al CDlla humano de rhesus este último se clonó a partir de la biblioteca PBL de rhesus. La Figura 2 muestra que el I-dominio de CDlla de rhesus difiere del I-dominio de CDlla humano en solo cuatro posiciones: 133, 189, 197, 308. Previamente, el epítope de CDlla humano de MHM24 se correlacionó a los residuos 197-203 (Champe et al, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)) que incluye el Lys 197 humano a Glu 197 de rhesus cambio en rhesus. (d) Ensayos de adhesión de células de queratinocitos Se compararon el MHM24 murino, IgGl quimérica y HuIgGl para su capacidad para prevenir la adhesión de células Jurkat (células T que expresan LFA-1) a queratinocitos epidérmicos humanos normales que expresan ICAM-1. Los tres anticuerpos se desempeñan de manera similar (Figura 3) con valores IC50 similares (Tabla VII) .

Tabla VII Bloqueo de la Adhesión celular por variantes de MHM24 a HuK = queratinocitoepidérmico humano, normal. b RhLy = linfocito de rhesus. c HuICAM = ICAM humano, recombinante. d Rh/HuCDlla = CDlla humano con I-dominio de rhesus transfectado en células 293 humanas Ni el MHM24 murino ni el humanizado bloquearon los linfocitos de rhesus o cinomólogos de la adherencia a los queratinocitos humanos . Cuando se comparo el RhlgGl al anticuerpo MHM23 anti-CD18 humano, murino (Hildreth et al, Eur J. Immunol, 13:202-208 (19983); Hildreth et al. J. Immunol. 134:3272-3280 (1985)) en el bloqueo de la adherencia de los linfocitos de rhesus a los queratinocitos humanos, el RhlgGl fue 74 veces menos eficaz que el MHM23 (Figura 4A, Tabla VII) . Sin embargo, cuando la ICAM-1, se revistió en placas (en lugar de queratinocitos humanos) la RhlgGl fue solo cuatro veces menos eficaz que el MHM23 (Figura 4B, Tabla VII) . Un CDlla quimérico comprendido de CDlla humano en el cual el I-dominio se muto a rhesus (Vall33Ile, Argl89Gln, Lysl97Glu, Val308Ala) se transfectó en las células 293 de riñon embriónico, humano. Nuevamente, RhlgGl fue solo 4 veces por debajo de MHM23 en el bloqueo de estas células Rh/HuCDlla-293 de que se adhieran a los queratinocitos humanos (Figura 4C, Tabla VII) . Los anticuerpos de isotipo de control para RhlgGl (anticuerpo anti-pl85HER2 humanizado; Cárter et al. Proc. Nati. Sci USA 89:4285 (1992)) y MHM23 (MAb 354 murino, un tPA anti-hámster de IgG murina) no bloqueo la unión de los linfocitos de rhesus a los queratinocitos humanos o ICAM-1 recombinante (Figuras 4A, 4B) o Rh/HuCDlla a los queratinocitos humanos (Figura 4C) . Esto implica que el desempeño reducido de RhlgGl en comparación al MHM23 murino en el ensayo de queratinocitos humanos: linfocitos de rhesus no fue debido a ninguna interacción inesperada del Fe humano de HuIgGl (en comparación a Fe murino de MHM23) con los linfocitos de rhesus, que pueden reducir la concentración de RhlgGl disponible para la unión a CDlla de rhesus. Los datos de la ICAM-1 humana, recombinante muestran que RhlgGl se une a los linfocitos de rhesus y previene la adherencia entre casi como MHM23 murino (Figura 4B, Tabla VII) . Los datos de Rh/HuCDlla 293 (Figura 4C, Tabla VII) muestran que RhlgGl no se une a los objetivos en los queratinocitos humanos (en comparación a HUIgGl), que podria reducir la concentración de RhlgGl disponible para la unión a CDlla de rhesus. Además, la Kd(app) de RhlgGl a los leucocitos de rhesus fue similar con (donador 3 de rhesus) o sin (donador 1 de rhesus) adición de 1 mg/ml de IgGl humano (Tabla III); Esto muestra que la unión de RhlgGl es especifica a CDlla de rhesus. (e) Ensayos de respuesta linfocitos mezclados En la MRL, el HuIgGl exhibió un valor IC50 2 veces más débil que el MHM24 murino (Tabla VIII, Figura 5) .

Tabla VIII Resultados del ensayo de respuesta de linfocitos mezclados a murMHM24, HulgGl y mAb 25.3 probado en MLR humano; RhlgGl y MHM23 probado en MLR de rhesus Tanto los MAb murinos como humanizados viajaron de 10 a 20 veces mejor que el MAb 25.3, que se ha probado previamente in vivo (Fisher et al. Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al, Transplant Intl. 4:3-7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994). La variante de unión a rhesus RhlgGl exhibió un valor IC50 ligeramente mejor que el MHM23 murino (Tabla VIII). Diferentes donadores de sangre de respondedor : estimulador se usaron en ensayos independientes y los resultados no variaron de manera significante. La kd de RhlgGl para CDlla de rhesus es aproximadamente 26 veces menor de la Kd de HulgGl para el CDlla humano (Tabla III) y esto se refleja en los valores IC50 derivados de los ensayos de MLR (Tabla VIII) .

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Genentech, Inc. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos Anti-CDlla, Humanizados (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 24 (iv) : DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Genentech, Inc. (B) CALLE: 1 DNA Way (C) CIUDAD: South San Francisco (D) ESTADO: California (E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible, 3.5 pulgadas, 1.44 Mb. (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: WinPatin (Genentech) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD CORRIENTE: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO (A) NOMBRE: Lee, Wendy M. (B) NUMERO DE REGISTRO: 40,378 (C) NUMERO DE ORDEN/REFERENCIA: P1014PCT (ix) INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: 650-225-1994 (B) TELEFAX: 650-952-9881 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 1 : Asp Val Gln Zle Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Thr Zle Ser Zle Asn Cys Arg Ala Ser Lys Thr Zle Ser 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lyß 35 40 45 Leu Leu lie Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly lie Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Zle 65 70 75 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp he Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 108 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 2: Asp Zle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 ?o 15 Gly Asp Arg val Thr Zle Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr lie Ser 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Zle Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Zle Lys Arg 108 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 3: Asp ?le Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Zle Thr Cys Arg Ala Ser ßln Ser Zle Ser 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Zle Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Zle 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Zle Lys Arg 108 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 4: Glu Val Gln Leu ßln Gln Pro ßly Ala Glu Leu Met Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Gly His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Xle Gly Met Zle His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lyß Ser 65 70 75 Ser Ser Ser Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Zle Tyr Phe Tyr Gly Thr 95 100 105 Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 110 115 120 Ser 121 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 5: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 , 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Gly His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Met lie His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Zle Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Zle Tyr Phe Tyr Gly Thr 95 100 105 Thr Tyr Phe Asp Tyr *Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser 121 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No : 6 : Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu 'Trp Val Ser Val Zle Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Zle Ser Arg Asp Aßn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 B5 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 95 100 105 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 113 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 184 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 7 Lys Gly Asn Val Asp Leu Val Phe Leu Phe Asp Gly Ser Met Ser 1 5 10 15 Leu Gln Pro Asp ßlu Phe Gln Lys Zle Leu Asp Phe Met Lys Asp 20 25 30 Val Met Lys Lys Leu Ser Asn Thr Ser Tyr Gln Phe Ala Ala Val 35 40 45 ßln Phe Ser Thr Ser Tyr Lys Thr Glu Phe Asp Phe Ser Asp Tyr 50 55 60 Val Lys Arg Lys Asp Pro Asp Ala Leu Leu Lys His Val Lys His . 65 70 75 Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Zle Asn Tyr Val Ala 80 85 90 Thr Glu Val Phe Arg Glu Glu Leu Gly Ala Arg Pro Asp Ala Thr 95 100 105 Lys Val Leu Zle Zle Zle Thr Asp Gly Glu Ala Thr Asp Ser Gly 110 115 120 Asn Zle Asp Ala Ala Lys Asp Zle Zle Arg Tyr Zle Zle Gly Zle 125 130 135 Gly Lys His Phe Gln Thr Lyß Glu Ser Gln Glu Thr Leu His Lys 140 145 150 Phe Ala Ser Lys Pro Ala Ser Glu Phe Val Lys Zle Leu Aßp Thr 155 160 165 Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Phe Thr Glu Leu Gln Lys Lys Xle 170 175 180 Tyr Val lie Glu 184 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 184 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 8; Lys Gly Asn Val Asp Leu Zle Phe Leu Phe Asp Gly Ser Met Ser 1 5 10 15 Leu Gln Pro Asp Glu Phe ßln Lys Zle Leu Asp Phe Met Lys Asp 20 25 30 Val Met Lys Lys Leu Ser Asn Thr Ser Tyr ßln Phe Ala Ala Val 35 40 45 ßln Phe Ser Thr Ser Tyr Lys Thr ßlu Phe Asp Phe Ser isp Tyr 50 55 60 Val Lyß ßln Lyß Aßp Pro Aßp Ala Leu Leu ßlu Hiß Val Lys His 65 70 75 Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Zle Asn Tyr Val Ala 80 85 90 Thr ßlu Val Phe Arg ßlu ßlu Leu ßly Ala Arg Pro Asp Ala Thr 95 100 105 Lyß Val Leu Zle Zle Zle Thr Asp ßly Glu Ala Thr Asp Ser ßly 110 115 120 Asn Zle Asp Ala Ala Lys Asp Zle Zle Arg Tyr Zle Zle ßly Zle 125 130 135 ßly Lys His Phe ßln Thr Lys ßlu Ser Gln Glu Thr Leu His Lys 140 145 150 Phe Ala Ser Lyß Pro Ala Ser Glu Phe Val Lyß Zle Leu Aßp Thr 155 160 165 Phe ßlu Lys Leu Lys Asp Leu Phe Thr ßlu Leu Gln Lys Lys Zle 170 175 180 Tyr Ala lie ßlu 184 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 9 Lys Hiß Val Lys His Met Leu i 5 7 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 10: Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Trp Met Asn. 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 11: Mßt IXe Hiß Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe ! 5 10 15 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 12: Gly lie Tyr Phe Tyr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 . 5 10 12 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 13: Arg Ala Ser Lys Thr Zle Ser Lys Tyr Leu Ala i 5 10 ll 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 14 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 7 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 15: Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 9 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 16: Pro Lys Asn Ser Ser Met Zle Ser Asn Thr Pro 1 5 10 11 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 17 is Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5 7 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 18 iß ßln Aßn Leu Ser Aßp ßly Lyß 1 5 8 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 19: His Gln Asn Zle Ser Asp Gly Lys 1- 5 8 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No:20: Val Zle Ser Sei His Leu Gly Gln 1 5 8 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 21: CACTTTGGAT ACCGCGTCCT GCAGGT 26 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 22: CATCCTGCAG GTCTGCCTTC AGGTCA 26 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos ( D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ . ID No : 23 ; Met Zle Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 1 5 10 15 Lys Asp ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ. ID No: 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Gly His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lyß Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Met Zle Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Arg Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Zle Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Zle Tyr Phe Tyr Gly Thr 95 100 105 Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser 121 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CDlla, humanizado caracterizado porque se une específicamente al I-dominio de CDlla humano

2. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une al epítope MHM24 en CDlla.

3. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque tiene un residuo 66L de armazón de cadena ligera de consenso de kappa I humano.

4. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene todos los residuos de armazón de cadena ligera de consenso de kappa I humano.

5. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene el residuo 93H de armazón de cadena pesada de consenso de subgrupo III, VH humano.

6. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque contiene un dominio variable que tiene un CDR no humano incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano de consenso III subgrupo VH, y comprende adicionalmente un aminoácido de sustitución a un sitio seleccionado a partir del grupo que consiste de 27H, 28H, 30H, 49H y 73H.

7. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO:ll) y/o CDR3 (SEQ ID NO:12) de anticuerpo MHM24 (F(ab)-8, humanizado.

8. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

9. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID N0:14) y/o CDR3 (SEQ ID N0:15) de F(ab)-8 de MHM24 humanizado .

10. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con la reivindicación 1 o 2 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2:

11. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2.

12. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es de tamaño normal o un fragmento de anticuerpo .

13. El anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene al menos una de las siguientes propiedades: (a) se une a CDlla humano con un valor Kd de no más de aproximadamente lxlO-8 M, (b) tiene un valor IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM para prevenir la adhesión de células Jurkat a queratinocitos epidérmicos humanos, normales que expresan ICAM-1, o (c) tiene un valor de no más de aproximadamente 1 nM en un ensayo de respuesta de linfocitos mezclados.

14. Un anticuerpo marcado, caracterizado porque comprende el anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores unido a una marca detectable .

15. Un anticuerpo inmovilizado, caracterizado porque comprende el anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores unido a una fase sólida .

16. Un conjugado, caracterizado porque comprende el anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores unido a un agente citotóxico.

17. Un método para determinar la presencia de la proteína de CDlla, caracterizado porque comprende exponer una muestra sospechosa de que contiene la proteína de CDlla a un anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y determinar la unión del anticuerpo a la muestra.

18. Un equipo, caracterizado porque comprende el anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores e instrucciones para la utilización del anticuerpo anti-CDlla, humanizado para detectar la proteina de CDlla.

19. Un ácido nucleico, aislado que codifica para el anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

20. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19.

21. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 20.

22. Un proceso para producir un anticuerpo anti-CDlla, humanizado caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 21, de modo que el ácido nucleico se exprese; y recobrar el anticuerpo anti-CDlla, humanizado a partir del cultivo de la célula huésped .

23. El uso de un anticuerpo anti-CDlla, humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para preparar un medicamento para el tratamiento de un desorden mediado LFA-1 en un paciente con necesidad el mismo.