MXPA99007058A - Antigenos e inmunoanalisis para diagnosticar la enfermedad de chagas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la transfusión de sangre contaminada se ha convertido en la ruta principal de transmisión de la enfermedad de Chagas. Los actuales ensayos de exploración son insensibles y producen resultados contradictorios, mientras que no existen análisis confirmatorios. El presente invento se refiere a antígenos y a su uso para el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas. Más específicamente, el presente invento concierne a análisis que son capaces de detectar de manera fiable y exacta la presencia de anticuerpos para diversos antígenos específicos de Trypanosoma cruzi de una manera muy sensible y específica.

Description

ANTIGENOS E IN UNOANAL1SIS PARA DIAGNOSTICAR LA ENFERMEDAD DE CHAGAS CAMPO DE LA INVENCIÓN El presente invento se refiere en términos generales a conjuntos de por lo menos 6 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se derivan de proteínas de Trypanosoma cruzi, las cuales se utilizan para diagnosticar la enfermedad de Chagas de una manera muy sensible y específica. Más específicamente, el presente invento se refiere a péptidos que se derivan de los antígenos de T. cruzi SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39 y MAP, que se utilizan en un inmunoanálisis confirmatorio y concierne a estuches de ensayo que comprenden estos últimos péptidos.

ANTECEDENTES DEL INVENTO La enfermedad de Chagas es endémica a lo largo de toda Latinoamérica y es una causa principal de la morbididad y mortalidad en estos países afectados. Aproximadamente 16-18 millones de personas están infectadas, y aproximadamente 50.000 pacientes mueren cada año de esta condición (Carvalho y colaboradores, 1993). Su agente etiológico, el parásito protozoo Trypanosoma cruzi, es transmitido de modo natural por diversas especies de chinches del género Triatoma. La transmisión de la enfermedad se produce cuando las formas infecciosas del parásito son REF . : 30995 depositadas durante la ingestión de sangre por los insectos, junto con los excrementos de éstos. En el Brasil, unos programas satisfactorios de represión de los vectores han suprimido casi completamente la transmisión producida por naturaleza, con la excepción de las regiones interiores del país. Como resultado de ello, la transfusión de sangre procedente de donantes infectados - con frecuencia inmigrantes en ciudades grandes - se ha convertido en la ruta principal para contraer el parásito (Almeida y colaboradores, 1990). Recientes estudios estiman que el número anual de los casos de enfermedad de Chagas adquirida por transfusión en el Brasil es de 20.000 entre un total de 5 a 6 millones de transfusiones de sangre (Zingales y colaboradores, 1990). Consiguientemente, es crucial un programa eficaz de exploración de donante para eliminar la sangre contaminada, al mismo tiempo que no afecte negativamente al suministro de sangre en el país. En los bancos de sangre del Brasil, es obligatoria la exploración en cuanto a anticuerpos dirigidos contra T. cruzi. Los análisis de exploración incluyen los análisis por inmunofluorescencia indirecta (IFA), por hemoaglutinación indirecta (IHA) y de inmunosorbente enlazado a una enzima (ELISA). Se recomienda actualmente la utilización de por lo menos dos análisis basados o bien en metodologías diferentes o en preparaciones diferentes de antígenos, pero se observan con frecuencia resultados contradictorios. Unos pocos laboratorios especializados han desarrollado técnicas de Western Blot (Peralta y colaboradores, 1994) en un intento de resolver los resultados discrepantes, pero ni uno sólo de los ensayos es lo suficientemente sensible para prevenir la transmisión por transfusión de la enfermedad de Chagas. La mayor parte de los ensayos que están disponibles actualmente a escala comercial emplean extractos crudos de parásitos o fracciones subcelulares de éstos como preparaciones de antígenos. Sin embargo, se ha demostrado que los extractos de parásitos reaccionan de modo cruzado con sueros procedentes de pacientes que albergan otras enfermedades tales como la leishmaniasis, una infección por Trypanosoma rangeli, sífilis o fiebre reumática. En los últimos años, diversos investigadores han informado sobre la clonación y caracterización de antígenos inmunorreactivos específicos para T. cruzi (Borges-Pereira, 1997). Varios estudios han evaluado el potencial para diagnóstico de estos antígenos recombinantes o bien en la forma de proteínas de fusión o como péptidos sintéticos (Almeida y colaboradores, 1990; Peralta y colaboradores, 1994). Aunque se observó un aumento en la sensibilidad y en la especificidad de estos análisis, todavía se producía una reactividad cruzada con anticuerpos específicos para Leishmania. El presente invento se refiere a conjuntos de por lo menos 6 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se derivan de antígenos de Trypanosoma cruzi que se utilizan para diagnosticar la enfermedad de Chagas de una manera muy sensible y específica y que no reaccionan de modo cruzado con anticuerpos específicos para Leishmania. Se describe en la presente memoria desxcriptiva el uso de un nuevo análisis de parámetros múltiples, que combina antígenos relevantes e inmunodominantes que se derivan de proteínas de T. cruzi con un ensayo para diagnóstico de la enfermedad de Chagas.

METAS DEL INVENTO Resulta manifiesto a partir de lo que antecede que ningún ensayo es lo suficientemente sensible para prevenir la transmisión por transfusión de la enfermedad de Chagas, que se ha convertido en la ruta principal de transmisión para esta infección. Los actuales ensayos de exploración son insensibles, inespecífiros y proporcionan resultados contradictorios, mientras que no existen análisis confirmatorios convenientes. El presente invento, por lo tanto, tiene como meta proporcionar conjuntos de antígenos recombinantes y/o sintéticos y su uso para el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas. Más específicamente, el presente invento tiene como meta proporcionar análisis que sean capaces de detectar de manera fiable y exacta la presencia de anticuerpos para diversos antígenos específicos de Trypanosoma cruzi de una manera muy sensible y específica. A este respecto, el presente invento tiene como meta proporcionar conjuntos de por lo menos 6 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se derivan de los antígenos de T. cruzi SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39 y MAP, para utilizarlos en un inmunoanálisis confirmatorio, y pretende proporcionar estuches de ensayo que comprendan estos últimos péptidos. Además, también es una meta del presente invento proporcionar conjuntos de antígenos de T cruzi que se puedan utilizar en una composición de vacuna para inmunizar a un individuo con el fin de prevenir la enfermedad de Chagas después de una exposición a T. cruzi.

BREVE DESCRIPCIÓN DE TABLAS Y DIBUJOS La Tabla 1 muestra una comparación de los resultados obtenidos de analizar 1062 sueros mediante el análisis INNO-LIA Chagas Ab, con los resultados obtenidos de analizar el mismo conjunto de sueros con cuatro diferentes análisis de exploración: un ELISA de la propia casa y tres inmunoanálisis enzimáticos comerciales (véase la sección de los Ejemplos). La Tabla 2 muestra típicos cuadros de reactividad de 57 muestras de suero (los números de serie 1 a 57 y el correspondiente suero se dan en las columnas de identificación) en el INNO-LIA Chagas. Los péptidos utilizados en el INNO-LIA Chagas se indican por las letras A hasta G (A = SEQ ID N° 1 ; B = SEQ ID 2; C = SEQ ID 3; D = SEQ ID 4; E = SEQ ID 5; F = SEQ ID 6; G = SEQ ID 7). Las calificaciones se dan para cada línea de antígeno fluctuando entre 0 y 4 (véanse las columnas 4 a 10 y véase también la sección de Ejemplos). La interpretación final es comparada con el número de resultados positivos (de 0 a 4, columna de exploración) obtenidos analizando los mismos sueros con cuatro diferentes análisis de exploración, como antes se indica.

La Tabla 3 muestra la secuencia de aminoácidos (en código de una sola letra) de los siete péptidos utilizados en el INNO-LIA Chagas y sus correspondientes números de SEQ ID. La Figura 1 ilustra resultados representativos de INNO-LIA Chagas Ab obtenidos en 26 muestras de sueros (la identificación ID del suero se indica en la columna 1) y sus respectivas interpretaciones (véase la sección de Ejemplos). Los péptidos (antígenos) utilizados en el INNO-LIA Chagas se indican por las letras A hasta G (A = SEQ ID N° 1 ; B = SEQ ID 2; C = SEQ ID 3; D = SEQ ID 4; E = SEQ ID 5; F = SEQ ID 6; G = SEQ ID 7). N = resultado negativo, ¡nd = indeterminado; + = resultado positivo. La Figura 2 describe el algoritmo que se estableció basándose en la reactividad en los cuatro análisis de exploración ELISA y el cuadro de reactividad en el I N NO-LIA Chagas Ab (véase la sección de Ejemplos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO El invento que aquí se describe se basa en trabajos publicados con anterioridad y en solicitudes de patentes pendientes. Por vía de ejemplo, tales trabajos consisten en revistas científicas, patentes o solicitudes de patente pendientes. Todas estas publicaciones y solicitudes, citadas en lo que antecede o a continuación, se incorporan a la presente por su referencia.

El presente invento concierne a una composición que comprende por lo menos 6 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se unen a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y no se unen a anticuerpos específicos para Leishmania. La expresión "por lo menos 6" indica que ei presente invento concierne a una composición que comprende 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o más péptidos que se unen a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y no se unen a anticuerpos específicos para Leishmania. Deberá quedar en claro que cae dentro del alcance del presente invento cualquier combinación de por lo memos 6 péptidos que son definidos funcionalmente por su unión a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y su "falta de unión" a anticuerpos específicos para Leishmania. Como un ejemplo de esta última combinación, que no se pretende que limite el alcance del presente invento, el presente invento se refiere específicamente a una composición que comprende 7 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se unen a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y no se unen a anticuerpos específicos para Leishmania y que se derivan de los antígenos de T. cruzi escogidos entre el grupo que consta de las bien caracterizadas proteínas SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39 y MAP (véase la Tabla 3 y véase también más adelante). En otras palabras, deberá resultar evidente que esta última composición es una realización preferida del presente invento, pero que constituye también una parte del presente invento cualquier otra composición afín que comprenda por lo menos 6 péptidos que se derivan de estas últimas proteínas y/o de proteínas tales como Agí y Ag2 (descritas en el documento WO91/15584 de Goldenberg y colaboradores), Tcl OO (descrita en el documento WO96/05312 de Paranhos Baccala y colaboradores), Gp90, Gp60/50 y LPPG (descrita en el documento WO94/01776 de Winkler y colaboradores), TCR27 (descrita en el documento WO95/25797 de Kirchoff y Otsu), TcE y PEP2 (descrita en los documentos WO96/29605 y WO97/18475 de Reed y Reed y colaboradores, respectivamente), Ag 13 y Ag 30 (descrita en un artículo de Pastini y colaboradores, 1994) o cualquier otra proteína conocida en el sector técnico que se una a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y no se una a anticuerpos específicos para Leishmania. La expresión "péptidos recombinantes y/o sintéticos" se refiere a péptidos (es decir, polímeros que tienen generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos - excepto el péptido recombinante Tc24 que contiene 21 1 aminoácidos (véase la Tabla 3)-), generados utilizando cualesquiera de las técnicas bien conocidas por los que poseen experiencia ordinaria en el sector técnico, tales como técnicas de ADN recombinante, tal como han sido descritas por Maniatis y colaboradores (1982) y en el documento WO96/29605 de Reed así como síntesis químicas clásicas como han sido descritas por Houben-Weyl (1974), Atherton y Shepard (1989), y en el documento WO96/29605 de Reed. La expresión "que se unen a anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi y no se unen a anticuerpos específicos para Leishmania" se refieren a combinaciones de por lo menos 6 péptidos como antes se definen, que detectan de manera fiable, exacta y específica la presencia de anticuerpos para diversos antígenos de la especie Trypanosoma cruzi en una muestra biológica y no reaccionan de modo cruzado con anticuerpos para antígenos de las especies que pertenecen al género Leishmania - especialmente para especies de Leishmania que provocan la leishmaniasis visceral o tegumentaria - posiblemente presentes en la misma muestra biológica. La expresión "reacciona de modo cruzado" que aquí se utiliza, se refiere a la reacción (es decir, a la unión) de un antígeno (es decir, un péptido derivado de una proteína de 7". cruzi) con anticuerpos desarrollados contra otro antígeno (es decir, un antígeno de especies de Leishmania). Además, deberá resultar manifiesto que la composición del presente invento preferiblemente no reacciona de modo cruzado con antígenos de otras especies pertenecientes al género Trypanosoma tales como T. rangeli o con antígenos de especies pertenecientes a los géneros Plasmodium, Treponema y/o Mycobacterium. Como ya se ha mencionado anteriormente, el presente invento se refiere específicamente a una composición como antes se define, en la que dichos péptidos se derivan de los antígenos de T cruzi escogidos entre el grupo que consta de las proteínas SAPA (descrito en las citas de Pollevick y colaboradores, 1991 , y de Vergara y colaboradores, 1992), CRA y FRA (descritos en la cita de Lafaille y colaboradores, 1989), TcD (descrito en las citas de Burns y colaboradores, 1992, y de Peralta y colaboradores 1994), Tc24 (descrito en la cita de Guevara y colaboradores, 1997 y el documento de patente francesa FR 2692900 de Taibi y colaboradores), Ag39 (Hoft y colaboradores, 1989) y MAP (Kerner y colaboradores, 1991). Además, el presente invento concierne a una composición como antes se define, en la que dichos péptidos tienen secuencias de aminoácidos dadas por SEQ ID N° 1 a 7 (véase la Tabla 3) o cualquier variante de éstas. Tal como se utiliza en el presente contexto, el término "variante" se refiere a un péptido que difiere de los péptidos citados que tienen la SEQ ID N° 1 , 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 solamente en sustituciones o modificaciones conservativas de manera tal que retiene las propiedades de unión de los citados péptidos. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera tal que un experto en el sector técnico de la química de los péptidos podría esperar que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del péptido queden sustancialmente inalteradas. Las variantes pueden también, o alternativamente, contener otras modificaciones conservativas, inclusive la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre las propiedades de unión, la estructura secundaria o la naturaleza hidropática del péptido. Por ejemplo, el péptido puede ser conjugado a un engarzador o a otra secuencia para obtener facilidad de síntesis o para incrementar la unión del péptido a un soporte sólido. También se incluyen dentro de la definición las modificaciones posteriores a la traducción de los péptidos representados por SEQ ID 1 hasta 7 tales como glicosilación, acetilación, fosforilación, modificaciones con ácidos grasos y similares, péptidos que contienen enlaces de disulfuro entre residuos de cisteína, péptidos biotinilados así como otras modificaciones conocidas en el sector técnico. El presente invento se refiere además a un método para detectar la presencia de un anticuerpo de T cruzi en una muestra biológica, que comprende: - poner en contacto dicha muestra biológica con los péptidos de la composición que antes se define, - detectar en una muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen a los péptidos de la composición que antes se define. La expresión "un método para detectar" se refiere a cualquier inmunoanálisis conocido en el sector técnico tal como los análisis que utilizan biotina y avidina o estreptavidina (tales como los LIA's), los ELISA's y análisis por inmunoprecipitación y aglutinación. Una descripción detallada de estos análisis está dada en el documento WO96/13590 de Maertens y Stuyver, Zrein y colaboradores (1998) y el documento WO96/29605 de Reed, que se incorporan a la presente por su referencia. La expresión "muestra biológica" se refiere a un fluido obtenido a partir de un organismo, tal como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, mucosidades y similares. Más específicamente, esta última expresión se refiere a una muestra de suero humano. La expresión "anticuerpo de 7". cruzV se refiere a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal que se une a una proteína de T. cruzi. Más específicamente, esta última expresión se refiere a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal que se una a las proteínas de T. cruzi SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39, MAP, Agí , Ag2, TdOO, Gp90, Gp60/50, LPPG, TCR27, TcE, PEP2, Ag 13 ó Ag 30 (véase antes). Esta expresión no es limititativa en lo concerniente a la especie o fuente del anticuerpo, ni se pretende que sea limitada por la manera en la que éste se produce. Además, la expresión "anticuerpo" se refiere también a anticuerpos humanizados como se describen en la patente de los EE.UU. n° 4.946.778 y a fragmentos de anticuerpos que retienen la función de unión a antígenos y la especificidad del anticuerpo progenitor. Además, el presente invento se refiere a un método como antes se define, en el que la operación de detectar comprende: - retirar la muestra no unida, - añadir un reactivo de detección, y - determinar el nivel de anticuerpos que reaccionan con relación a un valor de corte predeterminado. La expresión "reactivo de detección" se refiere a cualquier compuesto que se une al complejo de péptido y anticuerpo de 7". cruzi formado después de poner en contacto dicha muestra biológica con los péptidos de la composición como antes se definen, y que se puede detectar por uno cualquiera de una diversidad de medios conocidos por los expertos en el sector técnico. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (tal como por ejemplo la Proteína A, la Proteína G, una inmunoglobulina, una lectina o un antígeno libre) conjugado a un grupo reportero que incluye enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, colorantes, grupos radiactivos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del agente de unión al grupo reportero se puede conseguir utilizando métodos clásicos conocidos por los expertos en el sector técnico. La expresión "determinar el nivel de anticuerpos que reaccionan con relación a un valor de corte predeterminado" se refiere a la determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos de 7". cruzi en la muestra por detección de la señal obtenida a partir del grupo reportero (los métodos para detectar esta última señal se describen con detalle en el documento WO 96/29606 de Reed) que es comparada con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. Este valor de corte es con frecuencia la señal media promedia obtenida cuando los péptidos son incubados con muestras procedentes de un paciente sin infectar (véase también la sección de Ejemplos). Además, el presente invento se refiere a un método como antes se define, en el que dichos péptidos de la composición que antes se define están unidos a un soporte sólido. Ejemplos de dichos soportes sólidos son nylon, nitrocelulosa, látex, dextrano, oro y/o un material plástico. Además, el presente invento se refiere también a un método como antes se define, en el que dichos péptidos de la composición que antes se define están unidos a un soporte sólido de una manera lineal. Más específicamente, este último método se refiere a un inmunoanálisis como se describe con detalle por Zrein y colaboradores (1998). Desde luego, existen otros numerosos protocolos de métodos y análisis que son apropiados para utilizarse con los péptidos del presente invento. Se pretende que las descripciones anteriores sean solamente ejemplificadoras. El presente invento se refiere también a un estuche de diagnóstico para detectar una infección por T cruzi en una muestra biológica, que comprende una composición como antes se define. Además, el presente invento se refiere a este último estuche de diagnóstico, el cual además de una composición como antes se define, comprende también un reactivo de detección como antes se define. La expresión "estuche de diagnóstico" se refiere en general a cualquier estuche de diagnóstico que es conocido en el sector técnico. Más específicamente, esta última expresión se refiere a un estuche de diagnóstico como se describe en la cita de Zrein y colaboradores (1998). Una realización final del presente invento es el uso de los péptidos que antes se definen en una composición de vacuna. La expresión "una composición de vacuna" se refiere a una composición inmunogénica, capaz de producir una protección contra infección por T. cruzi, ya sea parcial o completa. Los péptidos del presente invento se pueden utilizar como tales, en una forma biotinilada (como se explica en el documento WO 93/18054) y/o convertida en complejo con Neutralite Avidin de acuerdo con la hoja de instrucciones del fabricante (Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Deberá señalarse también que "una composición de vacuna" comprende, además de una sustancia activa (es decir, los péptidos del presente invento), un excipiente apropiado, diluyente, vehículo y/o adyuvante, los cuales, por sí mismos, no inducen la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición ni producen una protección. Los vehículos apropiados son típicamente grandes macromoléculas metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), polímeros de aminoácidos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Tales vehículos son bien conocidos por los expertos en el sector técnico. Los adyuvantes preferidos para intensificar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, aluminio en combinación con el monofosforil-lípido A desacilado en 3-0 como se describe en el documento WO 93/19780, fosfato de aluminio como se describe en el documento WO 93/24148, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina como se describe en la patente de los EE.UU. n- 4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina2(1 '2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina y RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) que contiene monofosforil-lípido A, endotoxina desintoxicada, trehalosa-6,6-dimicolato, y un esqueleto de paredes celulares (MPL + TDM + CWS) en una emulsión al 2% de escualeno y Tween 80. Se pueden utilizar también cualesquiera de los tres componentes MPL, TDM ó CWS a solas o combina-do a razón de 2 x 2. Adicionalmente, se pueden utilizar adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), MF 57 (Chiron) o SAF-1 (Syntex).

Además, se pueden utilizar el Adyuvante de Freund Completo (CFA) y el Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) para aplicaciones no humanas y para finalidades de investigación. "Una composición de vacuna" contendrá además excipientes y diluyentes que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH, conservantes y similares. Típicamente, una composición de vacuna se prepara como un inyectable, ya sea como una solución o suspensión líquida. Se pueden preparar asimismo formas sólidas, apropiadas para disolución en, o suspensión dentro de, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación puede ser también emulsionada o encapsulada en liposomas para intensificar el efecto adyuvante. Los polipéptidos se pueden incorporar también en Complejos Estimulantes de Inmunidad juntamente con saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS). Las composiciones de vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los péptidos del presente invento, así como cualesquiera otros de los componentes antes mencionados. La expresión "cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una única dosis o como parte de una serie de ellas, es eficaz para prevención o tratamiento. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y de la condición física del individuo que se haya de tratar, del grupo taxonómico del individuo que se haya de tratar (p. ej. un primate no humano, un primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para establecer una respuesta inmune eficaz, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la contribución del médico que realiza el tratamiento, la cepa del parásito infectante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga dentro de un margen relativamente amplio, que se puede determinar mediante pruebas rutinarias. Usualmente, la cantidad variará entre 0,01 y 1000 µg/dosis, más particularmente entre 0,1 y 100 µg/dosis. Las composiciones de vacuna se pueden administrar convencionalmente por vía parenteral, típicamente por inyección, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales apropiadas para otros métodos de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de una única dosis o un esquema de dosis múltiples. La vacuna se puede administrar en conjunción con otros agentes inmunorreguladores. Deberá hacerse observar que una vacuna puede también ser útil para el tratamiento de un individuo, en cuyo caso se la denomina una "vacuna terapéutica". El presente invento se ilustrará ahora haciendo referencia a los siguientes ejemplos que exponen realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, deberá señalarse que estas realizaciones son ilustrativas y no pueden ser consideradas como restrictoras del invento de ninguna de las maneras.

EJEMPLOS Evaluación de un inmunoanálisis de una línea de antígeno recombinante y de péptido para la enfermedad de Chagas: el análisis de anticuerpos (Ab) INNO-LIA Chagas. a. Materiales y métodos Estudio de población Los 1062 sueros empleados en este estudio retrospectivo se obtuvieron a partir de pacientes y residentes sanos en cuatro regiones brasileñas endémicas para la enfermedad de Chagas: 261 sueros procedían del estado de Minas Gerais (del municipio Virgem da Lapa) en el que son frecuentes las formas cardíacas y digestivas de la enfermedad; 465 y 253 sueros se obtuvieron de las regiones interiores de Paraíba y Piauí, respectivamente, en donde es corriente la forma indeterminada de la enfermedad; y 83 sueros procedían de la región del Amazonas (municipio de Barcellos) en donde está emergiendo la enfermedad de Chágas. La mayor parte de las muestras de sangre se originaron de pacientes que habían estado participando en estudios de seguimiento a largo plazo durante 2-20 años. El análisis serológico se realizó utilizando varios métodos inmunológicos (véase seguidamente). Además, la presencia del parásito podría ser demostrada en algunos pacientes por xenodiagnóstico y/o PCR.

Los sueros procedentes de pacientes con leishmaniasis visceral (n=20) se obtuvieron en Natal, Estado de Rio Grande do Norte, Brasil. El diagnóstico serológico se realizó utilizando un ELISA de motas, y los parásitos fueron aislados de un material obtenido por punción de médula ósea. Los sueros procedentes de pacientes con leishmaniasis tegumentaria (n=20) se originaron en Macaé, Estado de Rio de Janeiro, Brasil. Los pacientes fueron diagnosticados mediante examen histopatológico de biopsias, y los parásitos fueron aislados por cultivo del material obtenido a partir de las lesiones. Caracterización serológica Todos los sueros fueron caracterizados serológicamente por cuatro diferentes análisis de exploración: un ELISA de la propia casa y tres comerciales, como se describen más adelante y en la cita de Oelemann y colaboradores (1998). Estos cuatro análisis se utilizaron para establecer un algoritmo de interpretación para la evaluación del INNO-LIA Chagas Ab. Para el ELISA de la propia casa, se utilizó como antígeno la fracción citosólica de epimastigotos de la cepa Y de T cruzi, y los sueros fueron ensayados en una dilución de 1/200. Después de incubación con un conjugado de IgG anti-humana y peroxidasa, los complejos inmunes fueron desarrollados con TMB/H2O2 (Sigma, St. Louis, MO) y se leyeron las absorbancias a 450 nm. Los valores de corte fueron determinados empíricamente dividiendo por tres la diferencia de las absorbancias promedias de dos testigos positivos y tres testigos negativos ([positivo medio- negativo medio]/3). Los inmunoanálisis enzimáticos comerciales incluyeron el ElA de anticuerpos de Abbott Chagas (Abbott Laboratorios do Brasil, Sao Paulo, Brasil), el BIOELISACRUZI® (Biolab-Mérieux, Rio de Janeiro, Brasil) y el BIOZIMA Chagas (Polychaco S.A.I.C., Buenos Aires, Argentina). Todos los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por los fabricantes. Todos estos sueros habían sido ensayados también en una dilución final de 1/40 o bien con un ensayo IFA comercial o de la propia casa, de acuerdo con Camargo (1966) utilizando epimastigotes de la cepa Y de T. cruzi como antígeno e IgG de cabra anti-humana, conjugada con FITC (Cappel Biomedical Inc., Malven, PA). Además, algunos sueros fueron caracterizados por un Western Blot de la propia casa, tal como se ha descrito anteriormente (Peralta y colaboradores, 1994). Dicho brevemente, la fracción citosólica de epimastigotos de T. cruzi (cepa Y) se sometió a un SDS-PAGE en geles de acrilamida al 10% y subsiguientemente se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Luego, se añadieron a las membranas muestras de suero diluidas (a 1/100), y los complejos inmunes formados fueron revelados utilizando un conjugado de IgG anti-humana y peroxidasa, seguido por una reacción colorimétrica. Los sueros fueron considerados positivos cuando reaccionaron con al menos 3 bandas entre un grupo de siete de ellas (de 14-, 19-, 27-, 30-, 34-, 37- y 75 kDa). El análisis de INNO-LIA Chagas Ab El análisis de INNO-LIA Chagas Ab consta de siete antígenos recombinantes y sintéticos de T. cruzi revestidos como líneas discretas sobre una membrana de nylon con un respaldo de material plástico. Además, las tiras contienen líneas testigos para sueros con reactividad fuerte, moderada y débil (de corte), y un testigo de fondo con estreptavidina. Los antígenos se derivaron de las secuencias de los siguientes antígenos recombinantes descritos en la bibliografía: Ag 39 (Hoft y colaboradores, 1989), TcD (Burns y colaboradores, 1992), Tc24 (FR 2692900 de Taibi y colaboradores), SAPA (Pollevick y colaboradores, 1991), MAP (Kerner y colaboradores, 1991), CRA (Lafaille y colaboradores, 1989) y FRA (Lafaille y colaboradores, 1989). Las tiras fueron incubadas con los sueros en una dilución de 1/100 durante 18 horas a 25°C y, después de haber lavado, los complejos inmunes fueron detectados por incubación con un conjugado de IgG anti-humana y subsiguiente desarrollo del color. Los resultados fueron determinados comparando visualmente las intensidades de las líneas de antígenos con las de los testigos. Las intensidades fueron calificadas de la siguiente manera: O(-), ausente o menos intensa que la línea de corte; 0,5 (±), intensidad mayor o igual que la de la línea de corte pero menor que la de la línea testigo 1 +; 1 (+), intensidad igual que la de la línea testigo 1 +; 2(++), intensidad intermedia entre la de la línea testigo 1 + y la de la línea testigo 3+; (3+++), intensidad igual a la de la línea testigo 3+; 4(++++), intensidad mayor que la de la línea testigo 3+. Los resultados del INNO-LIA se pueden expresar de este modo como un valor numérico, es decir, la suma de intensidades de las diferentes bandas de antígenos. La figura 1 muestra resultados representativos del INNO-LIA y sus interpretaciones respectivas. Basándose en la reactividad en los cuatro análisis de exploración por ELISA y del cuadro de reactividad con los antígenos múltiples utilizados en el INNO-LIA Chagas Ab, se estableció un algoritmo (Figura 2). Estas muestras en estudio para las que los cuatro análisis de exploración empleados, o bien eran todos ellos positivos (considerados por lo tanto como muestras verdaderamente positivas; n=500) o todos ellos negativos (considerados como muestras verdaderamente negativas; n=460) se seleccionaron para definir un algoritmo de interpretación por INNO-LIA. El algoritmo ilustrado en la Figura 2 fue optimizado en cuanto a sensibilidad y especificidad basándose en este subconjunto de muestras. Las restantes muestras (n=102) con resultados ELISA contradictorios se clasificaron luego, utilizando el algoritmo establecido, como siendo negativas en INNO-LIA, positivas en INNO-LIA o indeterminadas en INNO-LIA. Métodos estadísticos El sistema lógico (software) GraphPad StatMate™ (versión 1 ,01 , San Diego, CA) se utilizó para el cálculo de los intervalos de confianza (Cl) de 95% para las proporciones. b. Resultados y discusión Evaluación del ensayo del INNO-LIA Chagas Ab utilizando sueros chagásicos Con el fin de evaluar el comportamiento del análisis del INNO-LIA Chagas Ab, los autores del invento hemos analizado 1062 sueros y hemos comparado los resultados con los obtenidos en cuatro diferentes análisis de exploración, un ELISA de la propia casa y tres inmunoanálisis enzimáticos comerciales. Los resultados están recopilados en la Tabla 1. De acuerdo con el algoritmo establecido en este estudio (Figura 2), una muestra fue considerada negativa si, o bien no aparecía ninguna banda o aparecía una única banda, o si aparecían dos o más bandas con una calificación total de menos que o igual a 1 ; una muestra fue considerada positiva cuando aparecían al menos dos bandas con la suma de intensidades mayor que 2,5; si aparecían dos o más bandas con una suma de intensidades mayor que 1 pero menor o igual que 2,5, la muestra fue considerada indeterminada cuando la línea de antígeno E dio una calificación de 0, y positiva cuando la calificación del antígeno E era mayor que 0. Una muestra no podría ser interpretada cuando la línea testigo con estreptavidina manifestase una calificación mayor o igual que 1. Un total de 460 sueros (43,3%) fueron negativos en los cuatro análisis de exploración. De éstos, 458 (99,6%) fueron también negativos en el INNO-LIA. Un suero dio un resultado indeterminado, mientras que otro suero era positivo en el INNO-LIA. Cincuenta y cuatro sueros (5,1 %) fueron clasificados como "probablemente negativos", puesto que fueron encontrados, o bien como negativos en dos de los análisis de exploración y dudosos en los restantes análisis, o positivos en un ensayo pero negativos en los tres ensayos restantes. De los sueros probablemente negativos, el INNO-LIA fue capaz de confirmar a 41 sueros (75,9%) como negativos, y a 1 1 sueros (20,4%) como positivos en el INNO-LIA. Dos sueros (3,7%) fueron indeterminados en el INNO-LIA. Treinta y ocho sueros (3,6%) fueron clasificados por los ensayos de exploración como "probablemente positivos" (es decir, o bien positivos en dos ensayos y dudosos en otros dos ensayos, o positivos en tres ensayos y negativos en uno de ellos). De éstos, el INNO-LIA confirmó a 32 sueros (84,2%) como positivos, a 2 (5,3%) como indeterminados en el INNO-LIA y a 4 sueros (10,5%) como negativos en el INNO-LIA. De los 500 sueros (47,1%) que fueron positivos en los cuatro análisis de exploración, 499 sueros (99,8%) fueron también positivos en el INNO-LIA, y 1 suero fue negativo en el INNO-LIA. No obstante, basándose en los resultados obtenidos en los cuatro análisis de exploración, 10 sueros (0,9%) fueron considerados como controvertidos (es decir, dos ensayos fueron positivos y los otros ensayos negativos). De estos sueros, 4 fueron negativos en el INNO-LIA, 1 fue indeterminado en el INNO-LIA y 5 fueron positivos en el INNO-LIA. La Tabla 2 muestra típicos cuadros de reactividad de 57 muestras de sueros (los números de serie 1 a 57 y el correspondiente suero se dan en las columnas de identificación) en el INNO-LIA Chagas. Los péptidos utilizados en el INNO-LIA Chagas se indican por las letras A hasta G (A = SEQ ID N° 1 ; B = SEQ ID 2; C = SEQ ID 3; D = SEQ ID 4; E = SEQ ID 5; F = SEQ ID 6; G = SEQ ID 7). Las calificaciones se dan para cada línea de antígeno fluctuando entre 0 y 4 (véanse las columnas 4 a 10 y véase también la sección de Ejemplos). La interpretación final es comparada con el número de resultados positivos (de 0 a 4, columna de exploración) obtenidos analizando los mismos sueros con cuatro diferentes análisis de exploración, como antes se indica. Estos datos demuestran con claridad que los resultados obtenidos con el análisis INNO-LIA Chagas ayudan a establecer una confirmación y dan información adicional acerca de los resultados obtenidos después de haber usado subsiguientemente 4 diferentes inmunoanálisis. De los 1062 sueros ensayados, 6 (0,6%) fueron indeterminados en el INNO-LIA. Un suero (PB 140) fue negativo en todos los análisis suplementarios. Los restantes 5 sueros reaccionaron de modo positivo o dudoso en por lo memos uno de los análisis suplementarios. Ninguna de estas muestras fue ensayada utilizando una reacción PCR. Finalmente, 1 muestras fue positiva en el INNO-LIA/negativa en el ELISA (negativa en todos los análisis suplementarios) y 1 muestra fue negativa en el INNO-LIA/positiva en el ELISA (positiva en 2 análisis suplementarios). Ninguna de estas muestras fue ensayada por PCR. Cuando se considera el comportamiento del INNO-LIA para sueros positivos en los cuatro análisis de exploración, el ensayo mostró una sensibilidad de 99,8% (verdaderamente positivas/verdaderamente positivas + falsamente negativas; 499/499+1 ; 95% de Cl: 98,89-99,99) y una especificidad de 99,8% (verdaderamente negativas/verdaderamente negativas + falsamente positivas; 458/458+1 ; 95% de Cl: 98,79-99,99), si se excluyen los resultados indeterminados en el INNO-LIA. Finalmente, de los 20 sueros obtenidos de pacientes con leishmaniasis visceral, y de los 20 sueros procedentes de pacientes con leishmaniasis tegumentaria, ninguno de los sueros fue reactivo en el análisis de INNO-LIA Chagas Ab. Por contraste, todos los sueros con leishmaniasis visceral y 2 sueros (10%) con leishmaniasis tegumentaria dieron una reacción positiva cuando se ensayaron en un IFA con epimastigotos de T. cruzi y 3 sueros con leishmaniasis visceral y 1 suero con leishmaniasis tegumentaria fueron o bien indeterminados o positivos en el ElA de anticuerpos Abbott Chagas. Tomado conjuntamente, el presente ejemplo ilustra la evaluación de un nuevo análisis diseñado para la detección de anticuerpos de IgG contra T cruzi en sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas, que está destinado a ser utilizado preferentemente para la confirmación de los resultados obtenidos por otros análisis serológicos en el diagnóstico rutinario y en la exploración de bancos de sangre. El algoritmo de interpretación fue establecido basándose en el subconjunto de muestras o bien positivas o negativas en cuatro diferentes análisis de exploración. Utilizando paneles de sueros obtenidos en cuatro regiones endémicas diferentes del Brasil, el INNO-LIA Chagas Ab mostró una sensibilidad de 99,8% (95% de Cl: 98,89-99,99) y una especificidad de 99,8% (95% de Cl: 98,79-99,99) para sueros con resultados casados en 4 diferentes análisis de exploración por ELISA. Las muestras adicionales están siendo analizadas por un laboratorio independiente como un conjunto de validación de sueros. Una característica importante del INNO-LIA Chagas Ab es la utilización de siete diferentes antígenos peptídicos recombinantes y sintéticos que están revestidos como líneas separadas sobre una membrana reforzada. Como tal, el análisis puede comprobar simultáneamente los sueros en cuanto a la presencia de un amplio espectro de anticuerpos específicos para T cruzi que se pueden unir a sus respectivos antígenos sin impedimento estérico. Se ha sabido que dicha interferencia se produce cuando una mezcla de antígenos es utilizada para sensibilizar micropocillos, puesto que las diferentes moléculas están apretadamente empaquetadas en conjunto dentro de un espacio físico limitado, dando como resultado una pérdida de sensibilidad de los análisis. Pastini y colaboradores (1994) informaron recientemente sobre el desarrollo del análisis Dia Kit™ Bio-Chagas (Gador S.A., Buenos Aires, Argentina). Este ensayo emplea 5 antígenos de T. cruzi recombinantes expresados como proteínas de fusión de glutationa S y transferasa. Una mezcla de los antígenos es aplicada como revestimiento como una única línea sobre una membrana de nitrocelulosa reforzada, conjuntamente con una segunda línea testigo con IgG humana para vigilar el conjugado y las subsiguientes operaciones de desarrollo del color. Los autores encontraron una sensibilidad de 99,6% y una especificidad de 99,1 % al comprobar 300 sueros positivos y 350 sueros negativos (resultados casados de I HA, IFA y ELISA). No obstante, el estuche dio un resultado positivo para 4 de entre 16 sueros obtenidos de pacientes con leishmaniasis visceral. En nuestro estudio, el INNO-LIA Chagas Ab no mostró ninguna reactividad en 20 sueros procedentes de pacientes con leishmaniasis visceral y en 20 sueros procedentes de pacientes con leishmaniasis tegumentaria. Éste indica que el INNO-LIA no proporcionará resultados falsamente positivos causados por anticuerpos específicos para Leishmania reactivos de modo cruzado. El análisis de los datos obtenidos en el presente estudio puso de manifiesto que todos los sueros con resultados, o bien indeterminados en el INNO-LIA o resultados, en el INNO-LIA que estaban en conflicto con la clasificación de análisis de exploración, se originaron en Paraíba y el Amazonas (Tabla 2, números 24, 29, 49, 54). Se sabe que estas regiones son problemáticas en cuanto a la serología de la enfermedad de Chagas, puesto que los pacientes procedentes de estas zonas presentan bajos títulos serológicos frente a T. cruzi y en su mayor parte son asintómaticos. Los estudios por xenodiagnóstico y PCR llevados a cabo en Paraíba demostraron que la parasitemia en pacientes crónicos es extremadamente baja, proporcionando por lo tanto una explicación aceptable para el bajo título de anticuerpos. Además, se sabe que la región del Amazonas es conjuntamente endémica para T. rangeli lo cual puede conducir a resultados falsamente positivos en análisis de exploración en cuanto a anticuerpos para T. cruzi (Salles y colaboradores, 1996). Solamente 1 suero dio una reacción que posiblemente era falsamente negativa en el INNO-LIA, y 1 muestra dio un resultado que posiblemente era falsamente positivo (véase la Tabla 1). El suero que posiblemente era falsamente positivo fue negativo en los cuatro análisis de exploración. Sin embargo, el resultado negativo por análisis de exploración podría ser debido a una carencia de sensibilidad. Típicamente, dentro de la disposición de exploración de bancos de sangre, dicha muestra no sería sometida a confirmación. El suero que posiblemente era falsamente negativo fue positivo en los cuatro análisis de exploración y en los IFA y WB. Si se utilizaron los INNO-LIA como un ensayo confirmatorio, este suero no podría ser considerado como positivo para anticuerpos de Chagas. No obstante, puesto que la muestra fue obtenida en la región del Amazonas, la posibilidad de infecciones por T. rangeli y/o por Leishmania no puede ser desechada por completo. Los anticuerpos contra estos parásitos podrían dar resultados falsamente positivos en los cuatro análisis de exploración así como en los WB e IFA, toda vez que todos estos ensayos emplean o bien preparaciones crudas o fracionadas de antígenos de parásitos. Desafortunadamente, el estado de PCR de estas muestras era descono-cido, por lo que no se podría establecer ninguna conclusión más definida concerniente a estas muestras.

En conclusión, los resultados presentados en este estudio demuestran que el INNO-LIA es un análisis confirmatorio fiable en el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas con el potencial de discriminar resultados falsamente positivos causados por infección o bien con T. rangeli o con Leishmania.

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TABLA 1 Resultados de cuatro diferentes ensayos de exploración** INNO-LIA Nega- ProbaContro- Proba- Positivo Total Chagas tivo blemenvertido blemente te negapositivo tivo Positivo 11 32 499 548 Indeterminado Negativo 458 41 508 Total 460 54 10 38 500 1062 * Probablemente negativo: negativo por dos diferentes ensayos y dudoso por los restantes ensayos o negativo por tres ensayos y positivo por un ensayo; Probablemente positivo: positivo por dos diferentes ensayos y dudoso por los restantes ensayos o positivo por tres ensayos y negativo por un ensayo; Controvertido: positivo por dos ensayos y negativo por otros dos ensayos.

TABLA 2 TABLA 3 O

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición, caracterizada porque comprende por lo menos 6 péptidos recombinantes y/o sintéticos que se unen a anticuerpos específicos para
2. Trypanosoma cruzi y no se unen a anticuerpos específicos para Leishmania. 2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque los péptidos se derivan de los antígenos de T. cruzi escogidos entre el grupo que consta de las proteínas SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39 y MAP.
3. 3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque los péptidos tienen secuencias de aminoácidos dadas por SEQ ID N° 1 a 7 o cualquier variante de éstas.
4. 4. Un método para detectar la presencia de un anticuerpo de T. cruzi en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: - poner en contacto dicha muestra biológica con los péptidos de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y - detectar en una muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen a los péptidos de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la operación de detectar comprende: - retirar la muestra no unida, - añadir un reactivo de detección, y - determinar el nivel de anticuerpos que reaccionan con relación a un valor de corte predeterminado.
6. 6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, caracterizado porque los péptidos de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 están unidos a un soporte sólido.
7. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el soporte sólido comprende nylon, nitrocelulosa, látex, dextrano, oro y/o un material plástico.
8. 8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque los péptidos de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 están unidos a un soporte sólido de una manera lineal.
9. 9. Un estuche de diagnóstico para detectar una infección por T. cruzi en una muestra biológica, caracterizado porque comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. 10. Un estuche de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además un reactivo de detección.