MXPA98008732A - Aislamiento, determinacion estructural, sintesis, actividad biologica y aplicacion como agente de control de la feromona marcadora de hospedero y sus derivados de las moscas de la fruta del genero anastrepha (diptera:tephritidae) - Google Patents
Aislamiento, determinacion estructural, sintesis, actividad biologica y aplicacion como agente de control de la feromona marcadora de hospedero y sus derivados de las moscas de la fruta del genero anastrepha (diptera:tephritidae)Info
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Abstract
Elácido 2-(2,14-Dimetil-pentadecanoilamino)-pentanedióico (I) y compuestos de la fórmula (II), en la que los sustituyentes tienen el significado descrito en la especificación. Son utilizados como disuasivos de oviposición en contra de las siguientes moscas de la fruta (Diptera:Tephritidae) de importancia económica;Anastrepha fraterculus (Mosca Sudamericana de la fruta), A. grandis, A. ludens (Mosca Mexicana de la fruta), A. obligua (Mosca del mango), A. serpentina (Mosca de los zapotes), A. striata (Mosca de la guayaba), y A. suspensa (Mosca Caribeña de la fruta). Las sustancias antes mencionadas, si son formuladas adecuadamente, pueden ser usadas para reducir el daño que estos insectos ocasionan a la fruta cultivada en huertos comerciales y semi-comerciales, en huertos de traspatio y enárboles aislados en jardines residenciales.
Description
derivados de las moscas de la fruta del género Anas recha (Dipcera: Tephritidae) . ANTECEDENTES DEL INVENTO
1. Dominio del invento Este invento está relacionado con fero onas marcadoras de hospedero (FMH; "host marking pheromones" o HMPs, en inglés), también conocidas como feromonas disuasivas de oviposición (FDO; "oviposition deterring pheromones" o ODPs, en inglés) en insectos. En particular se refiere a las feromonas marcadoras de hospedero en moscas de la fruta del género Anastrepha.
2. Descripción del astado del arta previa Las moscas de la fruta (Diptera: Tephritidae) están consideradas entre las plagas de mayor importancia comercial en todo el mundo (Aluja y iedo 1993; McPheron y Steck 1996) . Las especies plaga más notorias pertenecen a los géneros Anastcepha,, Bactrocera. Ceratitis. Rhasoletis. y Toxotrvpana (Aluja, 1993) . Entre las 184 especies de Anastrepha reportadas hasta la fecha (Aluja 1994) , siete- resaltan por el daño que causan a frutas cultivadas comercialmente: . fraterculus. A.. qra,ndi.s, , A- ludens . A., obliaua. ., serpentina. ., striata y A., suspensa. La distribución y los frutos atacados por éstas se presentan en la TABLA 1 (a partir de Hernández-Ortíz y Aluja 1993) .
TABLA 1. Distribución y hospederos más comunes de las siete especies de Anastrepha de importancia comercial.
Especies de frutos Especies de Anastrepha Distribución atacados cultivados comercialmente A- fraterculus. México a Argentina Guayab , Naran a A- qrai s Sudamérica Cucurbitáceas - comerciales A. ludens Sur de EUA a Costa Rica Naranja, Mango, Toronja A- obli?rua. México a Argentina Mango, Ciruela tropical A- serp ntina México a Argentina Mamey, Chico Zapote A- stri ta México a Argentina Guayaba ., suspensa Florida e Islas del Toronja, Guayaba Caribe e indirecto (severas restricciones cuarentenarias que limitan el comercio internacional).- Los niveles de infestación (i.e., porcentaje de fruta infestada [= pérdida] ) en un árbol pueden variar entre 0 y 90% dependiendo de la región de 5 cultivo, la especie de fruta o cul ti var, tamaño de la población de moscas, ^k intensidad de manejo en el huerto, y grado de capitalización del dueño del huerto. Históricamente, el control de estas plagas se ha intentado a través de fumigantes, cebos tóxicos (un cebo alimenticio mezclado con un insecticida) y en ocasiones mediante el uso de la técnica del insecto estéril (TIE; "sterile
insect technique" o SIT, en inglés) (Steiner 1955; Aluja 1994) . A pesar de su alta eficacia, el uso a gran escala de cebos tóxicos ya no es aceptable debido a su impacto negativo en la entomofauna benéfica nativa (Asquith y Messing 1992;
Holmer y Dahlsten 1993). _ En años recientes, se han estado explorando una variedad de alternativas como son el uso de ácido giberélico para incrementar la
resistencia innata de los cítricos al ataque de las moscas (Greany 1989), de
^ reguladores de crecimiento en insectos como la ciromazina (Martínez y Moreno et mW al. 1991), de patógenos como Bacillus thurinsiens is Berliner (Martínez et al.
1997) y de pigmentos fotoactivados como por ejemplo SureDye" (PhotoDye International, Inc., Boca Ratón, USA) . A pesar de ser prometedoras como
alternativas viables a los cebos tóxicos, algunos de estos métodos podrían aún ser inaceptables debido a sus efectos perjudiciales en insectos benéficos (Aluja 1996) . Lo artterior debido a que el agente letal debe ser ingerido por un insecto adulto, y la única manera práctica de lograrlo es mezclándolo con un cebo alimenticio. Como en el caso de cebos alimenticios mezclados con 25 insecticida, los cebos utilizados en combinación con pigmentos fotoactivados o los reguladores de crecimiento en insectos, no son específicos. Esto quiere decir, que atraen a un gran número de insectos benéficos (como es el caso de muchas especies del orden Díptera), que también son eliminados.
El uso de FMH sintéticas es una alternativa altamente selectiva al uso de insecticidas que Jjfe sido probada recientemente en moscas de la fruta del género Rhasolßt is . y que no requiere de un cebo para ser efectiva. Las moscas depositan FMH después de cada evento de oviposición y de esta manera inhiben la oviposición de coespecificos en el mismo fruto, dada una concentración
suficientemente alta (Katsoyannos y Boller 1980) . Basados en este conocimiento y en el trabajo químico de Hurter et al. (1987a; 1987b) y Ernst y agner (1989), se pudo poner a prueba con éxito la FMH de Rhagoletis cerasi como un agente (Aluja y Boller 1992) . La aplicación de FMH sintéticas en toda la copa del árbol redujo el-*nivel de infestación en un factor de 10, comparado con un árbol no tratado (0.226 vs . 0.021 pupas/fruta en árboles no tratados y tratados,
respectivamente) . Se logró también una reducción significativa en la
^^ infestación de fruta tratando solo la mitad (superior o inferior) de la copa
(Aluja y Boller 1992) . Es relevante el hecho de que la conducta de mareaje de hospedero se ha reportado en varias especies de Anastrepha: A. suspensa (Prokopy et al. 1977), A. fraterculus (Prokopy et al. 1982), A. sororcula y A. oblisua
(Simoes et al., 1978), A. oseudoaarallela (Polloni y Da Silva 1936), A. striata
(Aluja et al. 1993), A., bistriaata (Gomes-Da Silva 1991), A., randis (Selivon
1991) y A. ludens (Papaj y Aluja 1993). Al igual que Hurter y colaboradores trabajando con - cerasi (Hurter et al. 1987b), Santiago y colaboradores (1990;
1991) , trabajando con A. ludens y A. serpentina, demostraron que las heces de
estas dos especies contenían la feromona marcadora de hospedero. Al realizar un corrimiento en cromatografía de capa fina de extractos de heces de A. ludens .
^^ estos autores encontraron, en bioensayos de laboratorio, que una de las bandas presentó efecto disuasivo de la oviposición en las «hembras de esta especie
(Santiago et al. 1991) . También demostraron, que extractos crudos de las heces
de A. ludens aplicados a ramas de mango en el campo, redujeron el nivel de infestación en la misma especie. En general, aplicadas en frutos a una concentración suficientemente alta, las feromonas marcadoras de hospedero (FMH) reducen la oviposición de las hembras de moscas de la fruta (Averill y Prokopy 1989) . 25 Aún existe la necesidad en el arte de una alternativa altamente selectiva
^P (i.e., dirigida solo a moscas del género Anastrepha) y ambientalmente segura, al uso de métodos de control de Anas repha que no dependa del uso de cebos alimenticios para que la sustancia tóxica o el agente letal sean efectivos. El
presente invento describe varias sustancias que reducen el daño ocasionado a frutos de valor comercial por moscas del género Anastrepha y que no requieren de cebos alimenticios para ser aplicadas o para ser efectivas.
De acuerdo al presente invento , se ha encontrado que el ácido 2 - ( 2 ' , 14 ' Dimetil -pentadecanoilamino ) -pentanedióico , de la fórmula ( I ) ,
aislado de las heces de Anastrepha ludens . funciona como disuasivo de oviposición en las moscas de la fruta (Díptera: Tephritidae) del género Anas treoha . tanto en aquellas de importancia comercial como en las que no la tienen. Esto es significativo, ya que las sustancias antes mencionadas pueden ser usadas para reducir el daño que estos insectos ocasionan a la fruta cultivada en huertos comerciales y semi comerciales, en huertos de traspatio y en árboles aislados en jardines residenciales.
El presente invento tiene que ver con un método para el aislamiento de la feromona marcadora de hospedero ( feromona disuasiva de oviposición) de Anastrepha ludens . que es aplicable a todas las especies del género Anastrepha. El invento también se relaciona a un método de síntesis de disuasivos de oviposición que poseen la fórmula general (II) .
Donde Ri es H, C-_-C4 alquil, C3-C6 cicloalquil, C3- ó C4 alquenil, C3- ó C4 alquinil. 5 R2 y R3 , independientes uno de otro, son H ó C1-C4 alquil, C3-C6 ^^ cicloalquil, C3- ó C4 alquenil, C3- ó C4 alquinil, bencil ó bencil que es ^^ sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil.
R4 es H ó C1-C4 alquil, C3-C6 cicloalquil, C3- ó C4 alquenil, C3- ó C4 alquinil, C1-C4 alquil carbonil, bencil ó bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil.
Donde a se refiere a estereoisómeros (R) ó (S) (ó sus mezclas) , con la premisa 15 que Rl no es = H.
^^ Donde n = un intervalo entre 0 y 15.
Donde * se refiere a la estereoquímica (L) ó (D) del aminoácido (ó sus mezclas ) .
Los grupos alquil , alquenil y alquinil en las definiciones antes mencionadas puedervTser cadenas rectas ó ramificadas . Los grupos alquil son por ej emplo : metil , etil , n-propil , isopropil , n-butil , sec-butil , iso-butil , y tert-butil . 25 Ej emplos de alquenilos son: vinilo , alilo , metalilo , 1-metil-vinil , but-2- en-l-il .
ejemplo: ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, y ciclohexil .
Alquil carbonil son por ejemplo, acetil, propionil y pivaloil.
La invención también incluye a las sales acidas mono- ó di-carboxílicas que el compuesto de la fórmula (II) puede formar con bases. Estas sales son: sales metálicas alcalinas (de sodio y potasio); sales metálicas alcalinoterreas , (de calcio y magnesio) ; sales de amonio (no sustituidas y mono ó polisustituidas , tales como: sales de trietilamonio y de metilamonio) ; ó sales con otras bases.
Los agentes formadores de sales, preferentemente metales alcalinos e hidróxidos de metales alcalinoterreos por ejemplo, hidróxidos de litio, sodio, potasio, magnesio o calcio y en particular aquellos de sodio y potasio.
Ejemplos de aminas que son adecuadas para la formación de sales de amonio incluyen al amonio, y las C1-C8 alquil-aminas primarias, secundarias" y terciarias. Por ejemplo, metilamina, etilamina, n-propilamina, dietilamina y trietilamina, preferentemente trietilamina.
La posible presencia de al menos un carbón asimétrico en los compuestos de la fórmula (II) significa que los compuestos pueden presentarse como isómeros idividuales, ópticamente activos y en forma de mezclas racémicas. En el presente invento, se debe entender que los compuestos activos de la fórmula (II) comprenden a los antípodas ópticamente puros y a los racematos ó dias eroisómeros .
Si un enlace alifático doble C=C se encuentra presente, puede existir isomería geométrica. El presente invento también comprende a estos isómeros.
Los compuestos preferidos de la fórmula (II) tienen la fórmula (lia) .
en los que Rl , R2,_ R3 , n, y * son como se definen bajo la fórmula (II) .
En particular, los compuestos preferidos de la fórmula (l a) en que Rl es metil, y n es un intervalo entre 5 y 10.
Los compuestos que son especialmente preferidos son aquellos de la fórmula (IlaJ en los que R2 y R3 , independientemente uno de otro, son H ó metil.
Los compuestos con preferencia especial poseen esteroquímica a (R) ó (S) ó son una mezcla de isómeros - (R)/(S).
Los compuestos de particular importancia tienen estereoquímica (L) en *.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Producción del material en crudo f faromona, natural )
El material en crudo se extrajo de heces de las moscas A_. ludens . A,, oblisua y A,, serpentina criadas en laboratorio. Las heces se obtuvieron de la siguiente manera: En una jaula de vidrio de 30 X 30 X 30 cm, se colocaron 300 ml de pupas de moscas de la fruta (equivalente a ca. 11, 000 moscas adultas) . Se colocaron dos pedazos de vidrio de 13 X 25 x 0.3 cm dentro de la caja para incrementar la superficie expuesta a las moscas. En cada jaula se colocó alimento (sacarosa y mantuvieron en las jaulas durante 30 días. Pos eriormente se removieron todas las moscas vivas y muertas así como los huevos secos, alas y patas rotas. Hecho esto, se rasparon de las paredes los "desechos" restantes (que contenían mayormente heces de mosca) utilizando una espátula de metal. El rendimiento de cada jaula fue de ca. 10 g de heces. Las heces de mosca se conservaron en cajas de Petri de plástico a -15°C hasta el momento de ser utilizadas.
Para obtener extractos de feromona crudos para purificación y experimentación, se mezclaron lotes de 400 g de heces de Anastrepha con 1,000 ml de metanol y se sonicaron manualmente durante 15 minutos. Después de esto, el líquido fue centrifugado a 12,000 RPM durante 20 minutos. El sobrenadante fue concentrado en un evaporador rotatorio (rotavapor) para obtener la solución primaria para uso posterior.
EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL DE LA FEROMONA
DE MARCAJE DE HOSPEDERO (FMH) DE Anaatrepha ludens
Procedimiento de extracción v purificación de la feromona disuasiva de 'oviposición ó feromona de marca-je de hospedero
Extracción.
Se suspendieron 167 g de heces de la mosca Anastrepha ludens en 5 1 de etanol, agitándose durante 17 horas a temperatura ambiente. El material sólido fue eliminado por filtración, enjuagado con 1 1 de etanol. Este proceso de extracción se repitió con 2 1 de etanol que contenían 3.5 ml de ácido trifluoro acético. Los extractos de etanol combinados se concentraron en un evaporador rotatorio a 50°O--y 20 mbar hasta casi desecarlos. Después de 6 horas de liofilización, el residuo (33.8 g) se disolvió en 300, ml de metanol a 50°C y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, el precipitado graso (10.5 g) fue eliminado por filtración y enjuagado con metanol. Posteriormente, la solución se dejó evaporar hasta que se secara, resultando 23.3 g de un residuo amarillo miel el cual, fue utilizado en cuatro lotes para Cromatografía Líquida de Alta Presión (CLAP) .
Col umna. 1 : 50.x 250 mm, Lichrospher RP-18, 7 µm (Merck). Tasa de flujo: 0-60 min.: 75 ml/min., 60-90 min.: 100 ml/min. Fase móvil: 0-60 min., gradiente lineal de 100 % agua a 100 % metanol, 60-90 min.: 100 % metanol. Las fracciones se separaron de acuerdo con el tamaño de los picos del cromatograma. Detección ultravioleta: 220 nm. La actividad electrofisiológica se eluyó entre 47 y 60 minutos, conteniendo 2.43 g de materia seca.
Col umna 2 : 50 x 250 mm, Kromasil KR100-C18, spher. 7 µm (Eka Nobel) . Tasa de flujo 0-45 min.: 70 ml/min., 45-90 min.: 100 ml/min. Fase móvil: 0-45 min.: gradiente lineal de acetonitrilo al 50 % en agua a acetonitrilo al 100 %. Las fracciones se separaron de acuerdo con el tamaño de los picos del cromatograma. Detección ultravioleta: 200 nm. Se detectaron dos regiones electrofisiológicamente activas: (1) 12-18 min. que contenía 63 mg de materia seca, y (2) 36-42 min., que contenía 28 mg de materia seca.
Para investigaciones posteriores, solamente se purificó material de la región 1;.
Las fases móviles consistieron en las siguientes soluciones: A: 100 % de agua con 0.1 % de ácido fórmico. B: 100 % de acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico. Detection: UV a 195 nm. Las columnas CLAP fueron provistas por: Macherey-Nagel .
Col umna 3 : 10 x 250 mm, 10 µ Nucleosil CN 100. Tasa de flujo: 4 ml/min-Inyección: 6.3 mg en 1.0 ml de agua (10 repeticiones). Fase móvil: 0-2 min. 80% de A y 20% de B; 2-25 min., gradiente lineal de 80% de A y 20% de B a 60% de A y 40% de B; 25-35 min. 60% de A y 40% de B; 35-40 min., gradiente lineal de 60% de A y 40% de B a 100% de B. Volumen de las fracciones: 4 ml . Actividad electrofisiológica en la fracción 23-27, evaporada (Rotavap) , disuelta en 1 ml de 50% de A y 50% * e B.
Col umna 4 : 10 x 250 mm, 7 µm Fenil Nucleosil 100. Tasa de flujo: 4 ml/min. Inyección 200 µl (5 repeticiones). Fase móvil: 0-60 min. 68% de A y 32% de B. Volumen de la fracción: 4 ml . Actividad electrofisiológica en la fracción 36-42, evaporada y disuelta en 5 ml de 50% de A y 50% de B.
Inyección 1 ml (5 repeticiones) . Fase móvil: 0-60 min. 65 % de A y 35 % de B. Volumen de las _ fracciones : 4 ml . Actividad electrofisiológica en la fracción 34-40, evaporada y disuelta en 1.0 ml de 50% de A y 50% de B.
Co l umna 6 : 4 x 250 mm, 7 µ Nucleosil OH (Diol) 100. Tasa de flujo: 1.0 ml/min. Inyección: 200 ul (5 repeticiones). Fase móvil: 0-70 min., 65 % de A y 35 % de B. Volumen de la fracción: 1.0 ml . Actividad electrofisiológica en la fracción 9-11, evaporada y disuelta en 1.0 ml de 50% de A y 50% de B.
Col umna 7 : 4 x 250 mm, 5 µm Nucleosil C-18 AB 100. Tasa de flujo: 1.0 ml/min. Inyección: 250 µl (4 repeticiones). Fase móvil: 0-70 min. 65% de A y 35% de B. Volumen de la fracción: 1.0 ml. Actividad electrofisiológica en las fracciones 49-52 y evaporadas hasta secarlas, para el análisis estructural.
Determinación estructural da la feromona disuasiva de oviposición (marcadora de hospedero)
Espectroscopia de masas
La espectroscopia de masas FAB (Fast Atom Bombardment-MS en inglés) da fuertes iones moleculares a m/z 400 (MH+) y 422 (M Na+), esto corresponde a un peso molecular para la feromona de 399. La masa exacta se ha determinado por medio de espectroscopia de masas de alta resolución en 422.2864 para M+Na y la fórmula molecular pudo deducirse en C22H ;j_N05 para la feromona con una diferencia de 1-8 urna entre la masa calculada y la observada.
La feromona se ha esterificado con diazometano dando un ion molecular a m/z 428 (MH+, APCI-MS) . La diferencia de 28 unidades de masa indica la presencia de dos^ grupos carboxil metilados. Se observan fragmentaciones características para el ion molecular en el modo MS-MS. Todos los fragmentos registrados se pueden asignar a fracturas específicas (intensidades relativas en % del pico basal). 428(77), 396(31), 368(8), 336(1), 253(6), 225(5), 183(2), 176(100), 169(6), 158(45), 155(4), 144(42), 141(4), 127(6), 116(19), 113(4), 99(4), 98(17), 85(3), 71(4), 57(4), 43(1).
Corrimientos químicos de la feromona natural aislada en ppm, 500 MHz, en CDCl-
Las señales de RMN en solventes metanólicos son marcadamente más agudas. Los corrimientos químicos de la feromona natural en CDCI3/CD3OD 1:1 son:
1H-NMR: 7.60 (s, 1 NH) , 4.36 (dd, 1H) , 2.32 (m, 2H) , 2.27 (m, 1H) , 2.11 (m, 1H) , 1.88(m, 1H) , 1.52 (m, 1H) , 1.42 (m, 1H) , 1.29 ( , 1H) , 1.18 (br., 18H) ,
1.07 (q, 2H) , 1.03 (d, 3H) , 0.77 (d, 6H) .
13C-NMR(CDCl3 = 77".0 ppm) : 177.99, 175.04, 173.5, 51.18, 40.45, 38.49, 33.56, 29.76, 29.29, 29.05, 29.00 (4x) , 28.89, 27.34, 26.84, 26.76, 26.32, 21.71 (2x) , 16.67.
Las conectividades carbónicas y protónicas están basadas en experimentos de RMN bidimensionales extendidos (COSY, HCCORR, HMBC, ROESY) .
La feromona natural hidrolizada en ácido se ha derivado al ácido glutámico N-trifluoroacetil isopropiléster . En la columna GC quiral (Chirasil-L-Val) , el isómero L tuvo un tiempo de retención de 25.6 minutos, el isómero D, de 24.2 minutos, con base en los compuestos sintéticos. Programa de temperaturas: 7?°C (3 min. isocrático, 2°C/min. a 190°C) . Sorprendentemente, la muestra de producto natural purificado cromatográficamente consistió de un 21 % de ácido D-glutámico y un 79 % de ácido L-glutámico, lo cual se ha confirmado por coinyección de la muestra natural y sintética.
Determinación de suiralidad de la fracción de ácido graso c—metil
Los cuatro estereoisómeros posibles se pueden describir como R-L, S-L, R-D, S-D, de los cuales R y S describen la quiralidad del ácido graso a-metil, mientras que L y D indican la quiralidad del ácido glutámico.
La síntesis total de todos los isómeros posibles se ha logrado por medio de rutas estereoselectivas análogas a los procedimientos en la literatura. Los dos pares diasteroméricos de enantiómeros se pueden distinguir bajo condiciones específicas de% CLAP (Nucleosil-100-7um-Fenil, 10 x 250 mm, 4 ml/min, 40 % de acetonitrilo/ 60 % de agua, ácido fórmico al 0.1 %, 195 nm detección ultravioleta) . El tiempo de retención para R-L y S-D fue 46 minutos en tanto que R-D v S-L fue de 48 minutos. La feromona natural eluyó después de 46 minutos. Dado que la configuración del aminoácido del producto natural se determinó como L, la quiralidad del grupo a-metil de la parte del ácido isopalmítico fue asignada sin ambigüedad a R. Esto se ha confirmado mediante la coinyección de la feromona natural y del compuesto sintetizado.
natural de Anas renha. ludens indicando la numeración de carbonos.
Donde la estereoquímica en'C-2 es 79:21 (L) : (D)
I. SÍNTESIS DE OS COMPUESTOS DE A FÓRMULA (II)
De acuerdo al invento, el proceso de preparación de los compuestos de la fórmula (II) se realiza análogamente a los procedimientos reportados en la literatura y que incluye
a) reacción de un compuesto de la fórmula (III)
un grupo activado ácido, por ejemplo halógeno, en un solvente orgánico inerte en la presencia de ."una base, con un compuesto de la fórmula (IV)
en el que R4 y * son como se define en la fórmula (II) , y donde R5 representa a grupos protectores desprendibles , para dar los compuestos de la fórmula (V)
en el que los grupos protectores R5 de esos compuestos son separados y flfc remplazados por H, ó
b) reacción de un compuesto de la fórmula (III)
donde Rl, R2 , R3 , n y a son como se define en la fórmula (II), y X es un grupo activador ácido, por ejemplo halógeno, en un solvente orgánico inerte en presencia de una base y un agente solubilizador, por ejemplo cloruro de litio, con un compuesto de la fórmula (VI)
en que R4 y * se definen como se ha hecho previamente.
Compuestos de fórmula (VI) son derivados de ácido glutámico y se encuentran ampliamente disponibles. Compuestos de la fórmula (IV) conteniendo gruos protectores R5 que son grupos protectores típicos usados en química de péptidos. Ejemplos de ellos son C1-C4 alquil; bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil; C3- ó C4 alquenil.
Los grupos «-alquil, alquenil y alquinil en las definiciones antes mencionadas, pueden ser cadenas rectas o ramificadas. Los grupos alquil son por ejemplo, metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, sec-butil, iso-butil, y tert-butil. Como un ejemplo de grupos al uenil protectores, se prefiere alilo.
Especialmente preferidos son los compuestos donde R5 es bencil.
conocidos (para ejemplos ver Greene, 1981) . Por ejemplo, en un compuesto de la fórmula (V) dónde R5 es bencil, la desprotección puede obtenerse por hidrogenación catalítica estandard, ó por hidrogenación por transferencia catalítica de hidrógeno como se describe en la literatura (Means et al , 1979).
Los grupos activadores usados para la unión del compuesto (III) con los compuestos (IV) y (VI) son por ejemplo, halógeno ó esteres activados muy conocidos en la síntesis de peptidos (ver ejemplo en Geiger (1985)) . Los métodos preferidos para la activación de el ácido (Compuesto III, X=OH) son la formación de el ácido clorhídrico, usando por ejemplo cloruro de tionilo con una cantidad catalítica de dimetilformamida, ó formación de los esteres activados usando, por ejemplo, N-etil-N' -( 3 -dimetilaminopropil ) -carbodimida (EDC) ó diciclohexilcarbodiimida. La reacción del compuesto (III) con el compuesto (IV) se lleva a cabo en un solvente orgánico inerte, por ejemplo un solvente hidrocarburo clorinado como el diclorometano, ó un solvente hidrocarburo aromático, como el tolueno, en presencia de una base, por ejemplo una alquil-amina como la trietilamina ó una amina aromática, por ejemplo 4"-dimetilaminopiridina (DMAP), ó una combinación de bases. La reacción puede llevarse a cabo a temperaturas entre O y 120°C.
La reacción de los compuestos de la fórmula (VI) con compuestos de la fórmula (III) se lleva a cabo en presencia de una agente solubilizador como el LiY, donde Y es un halógeno, por ejemplo cloro, en un solvente éter inerte, como el tetrahidrofurano, a temperaturas entre 0 y 120°C. El uso de agentes solubilizadores en la química de péptidos es muy conocido en la literatura (e.g., Seebach et al , (1995)).
Los compuestos de la fórmula (III) conteniendo un grupo a-metilo pueden ser preparados de forma racémica de acuerdo a los métodos descritos en la literatura (para -ejemplos ver Hoefle et a.1: , US 4,716,175 A (1987)). Los compuestos de fórmula (V) se forman subsecuentemente como mezclas de diastereoisómeros y pueden ser separados por ejemplo por métodos de CLAP.
Alternativamente, los compuestos de fórmula (III) (donde Rl no es H) pueden ser preparados de una manera estereoespecífica adhiriendo un grupo que contenga por lo menos un centro quiral (un auxiliar quiral) a un compuesto de (VII) , que puede entonces reaccionar con un compuesto Rl-Y, donde Rl es como se definió previamente, con la premisa de que no sea H, y y es halógeno, para obtener el compuesto de fórmula (VIII), y luego separándolos del auxilar quiral, para dar compuestos de la fórmula (III). Subsecuentemente la activación y reacción de estos compuestos con compuestos de la fórmula (IV) ó (VT) permiten la obtención de compuestos de la fórmula (II) ó (V), donde Rl no es H, en forma no-racémica, como se ilustra en el esquema I.
Esquema I
1. Activación 2. Compuesto IV o VI
Compuestos de fórmula II o V
(Ager et al . , (1995)). Los auxiliares quirales son por ejemplo, 2-(R)- ó 2-(S)-Bornane-10,2-sul-tams,
2-(S)-Bornane-10,2-Sultam 2-(R)-Bornane-10,2-Sultam
que pueden unirse a los compuestos de la fórmula (III) , donde X es un grupo activador por ejemplo cloro, donde R2 , R3 y n son como se define en fórmula (II) , y Rl es H, para dar los compuestos de la fórmula (Vlla) y (Vllb) .
Vlla Vllb
Los compuestos de la fórmula (Vlla) pueden ser deprotonados con una base fuerte, por ejemplo n-butil litio, en un solvente inerte, tal como el tetrahidrofurano, y un co-solvente dipolar aproteónico (aprotic en inglés) , tal como la 1, 3-dimetil-tetrahidro-2- (1H) -pirimidona (DMPU) , y subsecuentemente reaccionar con un agente alquilador Rl-Y, donde Rl se ha definido previamente, con la premisa de que no es H, y Y es un halógeno, por ejemplo iodo, para dar un compuesto (Villa), preferencialmente de la configuración Rl-a ilustrada para (vina) .
Vlla Villa
Análogamente, los compuestos de la fórmula (Vllb) pueden reaccionar con compuestos Rl-Y para dar compuestos de tipo (VlIIb) , donde la configuración Rl-a esta predominantemente como se muestra en (VlIIb) .
Vllb Vlllb
Alquilaciones selectivas de este tipo son predecibles y bien documentadas en la literatura (Oppolzer et al . , (1989)).
Los auxiliares quirales pueden separarse de los compuestos de la fórmula (VIII) por ejemplo, por hidrólisis por una base, por ejemplo hidróxido de litio, en un solvente inerte, tal como tetrahidrofurano, y un solvente proteónico (protic en inglésj^corao el agua, en la presencia de un peróxido inorgánico, tal como el peróxido de hidrógeno, de manera análoga a los procedimientos en la literatura (Evans et al . , 1987). Después de la activación, los compuestos de fórmula (III) , donde X es un grupo activador, por ejemplo cloro, pueden usarse para prepar compuestos de la fórmula (II) con estereoquímica a definida, basándose en las discusiones mecanísticas de Opollzer eC al . (1989).
fórmula (II) pueden prepararse de acuerdo a este proceso con estereoquímica definida ,en las aposiciones a y * por selección juiciosa del auxiliar quiral, y los isómeros L- ó D de los compuestos de las fórmulas (IV) ó (VI) .
Los siguientes ejemplos (1-36) ilustran la síntesis estereoespecífica del invento sin limitaciones:
Compuestos de las órmulas Vlla y Vllb
Vil a Vil b
Ej emplo 1 : (Compues to Vllbl, R7 = Me , R, = Me , n=5 )
Se disolvió una solución de 750 mg del ácido 14-methyl-pentadecanoico (preparado como lo describe C. Djerassi et al . (J. Org. Chem., 51: 2751, 1986) en cloruro de tionilo (lOml) a temperatura ambiente y se trató con una o dos gotas de dimetil formamida. La solución se agitó a temperatura ambiente hasta que cesó la evolución gaseosa (ca. l.hr.). El exceso de cloruro de tionilo fue removido in vacuo y luego el residuo fue disuelto en tolueno anhidro (lOml) . A continuación esta solución fue añadida a una suspensión de 2- (R) -Bornane-10 , 2-sal de sultam de»- sodio (que se preparó tratando 2- (R) -Bornane-10, 2-sultam (692mg) disuelto en tolueno anhidro (40 ml) con hidruro de sodio (200 mg de 80% de hidruro de sodio en aceite mineral a temperatura ambiente) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que el análisis TLC (5:1 hexano: acetato de etilo), mostró que la reacción se había completado (ca. 1 hr.). A continuación la mezcla de reacción fue diluida con acetato de etilo y HCl al secada en Na2S04 y . concentrada in vacuo . Los compuestos crudos fueron purificados por -medio de cromatografía flash para resultar en los compuestos (Vllbl) (1.208 g) en forma de aceites pálidos.
Datos seleccionados de XH RMN (en CDCl- en ppm) : 0.854, 6H, d, (J = 5.7 Hz) ;
0.963, 3H, s; 1.114, 2H, m; 1.51, 3H, s; 1.240, br s ; 2.69, 2H, m; 3.38-3.51, 2H, cuarteta AB (J = 22.3Hz y 14.1 Hz); 3.36, 1H, t, (J = 6.1 Hz).
Los siguientes compuestos se prepararon de manera análoga:
Ejemplo 2; (Compuesto VIIb2, R2 = Me, R3 = H, n=5) : Datos seleccionados de H RMN (en CDCI3 en ppm): 0.873, 3H, t, (J = 6.4 Hz) ; 0.963, 3H, s; 1.150, 3H, s;
1.240, br s; 2.69, 2H, m; 3.38-3.51, 2H, cuarteta AB (J = 22 Hz y 14.3 Hz) ; 3.37, 1H, t, (J = 6.0 Hz) .
Ejemplo 3; (Compuesto v lal, R = Me, R3 = Me, n=5) : Enantiómero del ejemplo
1, RMN idéntica.
Ejemplo 4; (Compuesto VIIa2, R = Me, R2 = H, n=5): Enantiómero del ejemplo
2, RMN idéntica.
Compuestos Villa v VlIIb
Villa Vlllb
Ejemplo 5: (Compuesto VlIIbl, Ri = R = R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , n=5): ZL (THF) (15ml) y luego se trató por goteo durante 10 minutos con una solución de n-butil litio (-1.6 M en hexano, 1.6ml). Esta solución se agitó a -78°C y luego se trató con DMPU (3.83ml) durante 15 minutos. Posteriormente, se continuó agitando la solución a -78°C durante 1 hora y luego se trató con ioduro de metilo (5eq.) a la misma temperatura. Toda la reacción se monitoreó por medio de TLC (9:1 hexano: acetato de etilo) hasta que se completó (ca 4-6 hr) . A continuación, la mezcla de reacción se trató a -78°C con HCl al 10% y acetato de etilo y luego se dejó calentar a temperatura ambiente. Se decantó la fase orgánica, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo, y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, y luego con NaHCO., acuoso al 10%. El secado en Na2S04 y la concentración in vacuo resultaron en los productos crudos en forma de aceites. El análisis 1H-RMN de los productos crudos (RMN integración de tripletas a 3.893 ppm (J = 6.3 Hz , isómero mayor) y 3.667 ppm (J = 6.3 Hz, (isómero menor)) mostraron una diasteroselectividad de la alquilación de ca. 9:11. Los diastereoisómeros se pudieron separar por medio de cromatografía y/o recristalización. La obtención del compuesto principal VlIIbl (Rl = R2 = R3 = Me, a = (R) Estereoquímica, n=5) fue de 782mg (cristales blancos).
tpf: 39.4-39.5°C.
(Compuesto V IIbl) Datos seleccionados de -^H-NMR (CDCI3 en ppm): 0.854, 6H, d, (J = 6.6Hz); 0.963, 3H, s; 1.114, 2H, ; 1.51, 3H, s; 1.19, 3H, d, (J = 6.9 Hz) ; 1.235, br s; 3.04, 1H, m; 3.39-3.52, 2H, cuarteta AB (J = 24 Hz y 12 Hz) ; 3.893, 1H, t, (J = 6.3 Hz) .
13C-NMR (n CDCI3): 18.895; 19.734; 20.681; 22.534,, 26.318; 27.171; 27.293;
27.831; 29.539; 29.488; 29.538; 29.567; 29.602; 29.818; 32.567; 32.686; 38.352; 38.947; 40.246; 44.513; 47.611; 48.135; 53.091; 64.996; 176.455.
Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga:
Ejemplo 6: (Compuesto VIIIb2, Rl = Me, R = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , n=5): Diastereoselectividad >98:2 de tripletas a 3.893 (isómero mayor) y 3.730 ppm (isómero menor): Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (-20°C pentano, tpf: 39.5-40.6°C) .
- en 3 en ppm : . , , , = . z ; 0.951, 3H, s; 1.139, s ,- 1. 195, 3H, d, (J = 6.6 Hz ) ; 3.041, 1H, m; 3.400-3.521, 2H, cuarteta AB (J = 22.5 Hz y 13.8 Hz) ; 3.893, 1H, t, (J = 6.2 Hz) .
Ejemplo 7: (Compuesto VlIIal, Rl = R = R3 = Me, a = Estereoquímica (S), n = 5) : Dias ereoselectividad >98:2 (no se detectó el isómero menor) . Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (pentano -20°C, tpf: 40.1-40.8°C) .
H-NMR: Como en el ejemplo 5 (enantiómeros)
Ejemplo 8: (Compuesto VIIIa2, Rl = Me, R2 = H, R3 3 Me, a = Estereoquímica (S) , n=5) : Diastereoselectividad 97:3 (integración de tripletas a 3.893 (isómero mayor) y 3.667 ppm (isómero menor)) . Purificación por medio de cromatografía flash y recristalización (-20°C, pentano, tpf: 39.5-39.6°C) .
1H-NMR: Como en el ejemplo 6 (enantiómeros) .
Compuesto III
lll
Ejemplo 9: (Compuesto lili, X = OH, Rl = R = R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , n=5) :
Se enfrió a 0°C una solución de (VlIIbl) (750 mg.) en THF: H20 4:1 (20 mi /mmol) y luego se trató con LiOH.H20 (8 eq.) y H202 acuoso al 30% (714 mg) . La suspensión se agitó a 0°C durante 1 hora y luego se dejó calentar a temperatura ambiente, agitándose a esta temperatura hasta que se completó la reacción mezcla de la reacción se trató con NaHSO acuoso al 10%, se acidificó con HCl acuoso al 10%, y se extrajo con acetato de etilo. La fase de acetato de etilo se lavó con H2Ó, se secó en Na2S04 y se concentró in vacuo . El residuo del producto crudo se trituró en pentano, los cristales blancos de 2- (R) -bornane-10, 2-sultam fueron filtrados en la bomba, y el filtrado fue concentrado in vacuo resultando en el ácido (lili) el cual se pudo utilizar en el siguiente paso sin más purificación. Las muestras analíticas se pudieron obtener del pentano por medio de recristalización a -20°C.
(Compuesto lili, X = OH, Rl = R = R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , n=5) :
tpf: 25.7-26.4°C.
1H-NMR (CDCI3 en ppm): 0.856, 6H, d, (J = ß.9Hz); 1.114, 2H, ra; 1.172, 3H, d, (J = 7.2Hz); 1.249, br s ; 1.42, 1H, m; 1.51, 1H, m; 1.66, 1H, m; 2.45, IH, m.
Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga:
Ejemplo 10: (Compuesto III2, X = OH, Rl = Me, R2 = H, R3 = Me, - a =
Estereoquímica (R) , n=5) :
tpf: 39.0-40.6°C.
XH-NMR (CDCI3 en ppm): 0.875, 3H, t, (J - 7.2Hz); 1.171, 3H, d, (J = 6.9Hz);
1.249, br s; 1.42, 1H, m; 1.66, 1H, m; 2.45, 1H, m.
Ejemplo 11: (Compuesto III3, X = OH, Rl = R = R3 = Me, a = Estereoquímica (S) , n=5) :
tpf: 25.4-26.5°C. ^
-'-H-NMR : Como en el ej emplo 9 (enantiómeros ) .
Ej emplo 12 : ( Compues to III4 , X = OH , Rl = Me , R = H, R3 = Me , a
Es tereoquímica ( S ) , n=5 ) : : . - . .
H-NMR: Como en el ejemplo 10 (enantiómeros)
Compuesto V •
* Ejemplo 13: (Compuesto VI, R]_ = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 Bencil, a Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=5) :
Una muestra del ácido (lili) (6.77 g) en cloruro de metileno (300ml) se trató secuencialmente a temperatura ambiente con 13.86 g de (L) -H-Glu (OBn-OBn) -para- 15 tolueno-sulfonato , trietilamina (5.6 g) y enfriada a 0°C . Esta solución se trató luego con N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodimida (5.3 g) y se dejó calentar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura hasta que el análisis TLC (5:1 hexano: acetato de etilo) mostró que se había completado la reacción (4-6 hr.). La mezcla de reacción se diluyó con
• cloruro de metileno y luego se lavó sucesivamente con HCl acuoso al 10%, H-O, y
NaHCO, acuoso saturado. El secado en N 2S04 y la concentración in vacuo resultaron en los productos crudos, los cuales fueron purificados por medio de cromatografía flash (8:1 hexano: acetato de etilo) para dar 9.1 g del compuesto del título como ci?stales blancos. 25 (Compuesto VI, R]_ = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 H, R5 = Bencil, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=5) :
tpf: 74.2-76.4°C. 30 . 1.145, 2H, m; 1.238," br s ; 1.26-1.68, 3H, m; 2.02, 1H, ; 2.12-2.52, 4H, m; 4.68,' 1H, m; 5.1Í, 2H, s ; 5.18, 2H, s ; 6.14, 1H, br d, (J = 7.6Hz); 7.38, 10H, br s .
13C-NMR (CDCI3 en ppm): 17.955; 22.53; 27.99; 27.328; 27.837; 29.487; 29.530 29.588; 29.608; 29.824; 30.146; 34.115; 38.946; 41.299; 51.425; 66.465; 67.240 128.15; 128.287; 128.316; 128.502; 128.581; 128.638; 135.255; 135.855; 172.955 172.855; 177.855.
Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga:
Ejemplo 14; (Compuesto V2, R]_ = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a= Estereoquímica (R) , * = Es ereoquímica (D) , n=5) :
tpf: 64.6-64.7°C.
^-H-NMR (CDCI3 en ppm): 0.861, 6H, d, (J = 6.6Hz); 1.122, 3H, d, (J = 6.9Hz)-7
1.105, 2H, m; 1.241, br s ; 1.26-1.68, 3H, m; 2.02, 1H, m; 2.12-2.52, 4H, m; 4.68, 1H, m; 5.097, 2H, s; 5.160, 2H, s; 6.18, 1H, br d, (J = 7.6Hz); 7.38, 10H, br s .
13C-NMR (CDC13 en ppm) : 17.566; 22.544; 27.069; 27.227; 27.306; 27.851; 29.393
29.508; 29.522; 29.551; 29.579; 29.602; 29.838; 30.168; 34.062; 38.960; 41.262 51.418; 56.493; 67.232; 128.272; 128.287; 128.351; 128.469; 128.609; 128.652 135.222; 135.702; 171.935; 172.846; 176.805.
Ejemplo 15; (Compuesto V3, Ri = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a= Estereoquímica (S) , * = Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 64.5-64.9°C..T
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 14 (enantiómeros) .
Ejemplo 16; (Compuesto V4, Ri = Me, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a= Estereoquímica (S) , * = Estereoquímica (D) , n=5) :
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 13 (enantiómeros) .
Ejemplo 17; (Compuesto V5, R]_ = Me, R2 = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a ^ Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 79.2-79.8°C.
-H-N R (CDCI3 en ppm): 0.809, 3H, t, (J = 6.9 Hz); 1.0385, 3H, d, (J = 6.9 Hz) ;
1.166 br s; 1.28, 1H, m; 1.54, 1H m; 1.966, 1H, m; 2.093-2.449, 4H, m; 4.603, 1H, m; 5.026, 2H, s; 5.088, 2H, s; 6.078, 1H, br d, (J = 7.2 Hz); 7.38, 10H, br s .
13C-NMR (en ppm en CD3OD: CDCl-j, 9:1): 14.417; 18.326; 23.647; 27.319; 28.581; 30.403; 30.539; 30.632; 30.697; 30.712; 30.726; 31.185; 32.992; 35.194; 41.706; 52.757; 67.409; 67.897; 137.06; 137.112; 173.042; 174.046; 180.013.
Ejemplo 18; (Compuesto V6, Ri = Me, R = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a = 20 Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (D) , n=5):
tpf: 64.5-65.1?C.
^-H-NMR (CDCI3 en ppm): 0.809, 3H, t, (J = 6.9 Hz) ; 1.0384, 3H, d, (J = 6.9 Hz); 25 1.167 br «5; 1.28, 1H, m; 1.54, 1H m; 1.966, 1H, m; 2.093-2.449, 4H, m; 4.603, 1H, m; 5.026, 2H, s; 5.09, 2H, s ; 6.078, 1H, br d,' (J = 7.2 Hz); 7.38, 10H, br • s.
13 C-NMR (in CD3OD: CHCI3 9:1 en ppm): Idéntico al ejemplo 18 con excepción de
los siguientes picos: 28.388; 35.015; 52.872; 173.035; 174.117; 180.070.
Ejemplo 19; (Compuesto V7, Ri = Me, R = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, a Estereoquímica (S) , * = Estereoquímica (L) , n=5) :
tpf: 62.2-62.7°C.
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 18 (enantiómeros) .
Estereoquímica (?), * = Estereoquímica (D) , n=5):
tpf: 78.3-79.4°C.
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 17 (enantiómeros) .
Ejemplo 21; (Compuesto V9, R]_ = H, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, * = Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 62.2-62.7°C.
1H-NMR (CDC13 en ppm): 0.867, 6H, d, (J = 6.6 Hz) ; 1.145, 2H, m; 1.243, br s; 1.44-1.66, 3H, m; 2.603, 1H, m; 2.160, 2H, t, (J = 7.9 Hz): 2.160-2.51, 2H, m; 4.68, 1H, m; 5.11, 2H, s: 5.18, 2H, s: 6.17, 1H, br d, (J = 7.2 Hz); 7.38, 10H, br s .
13C-NMR (en CDCI3 en ppm): 22.48; 22.509; 25.371; 27.085; 27.264; 27.809
29.100; 29.186; 29.322; 29.473; 29.509; 29.538; 29.573; 29.796; 30.119; 36.315 38.918; 51.469; 66.416; 67.190; 128.216; 128.223; 128.230; 128.252; 128.295 128.467; 128.539; 128.560; 128.567; 135.173; 135.682; 171.929; 172.732; 173.241.
Ejemplo 22; (Compuesto VIO, R = H, R2 = Me, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, * = Estereoquímica (D) , n=5) :
tpf: 62.3-63.4°C.
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 21 (enantiómeros) .
Ejemplo 23; (Compuesto Vil, Ri = H, R2 = H, R3 = Me, R4 = H, R5 = Bencil, Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 45.5-46.0°C.
^-H-NMR (CDCI3 en ppm): 0.867, 3H, t, (J = 5.9 Hz) ; 1.243, br s; 1.48-1.66, 2H, m; 2.603, 1H, m; 2.160, 2H, t, (J = 7.9 Hz) : 2.160-2.51, 2H, m; 4.68, 1H, m; 5.11, 2H, s; 5.18, 2H, s; 6.17, 1H, br d, (J = 7.4 Hz); 7.38, 10H, br s.
Estereoquímica (D) :
tpf: 47.0-48.10°C.
Datos espectrales idénticos a los del ejemplo 23 (enantiómeros ) .
Compuesto lia
Ejemplo 25; (Compuesto Ilal, B.? = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = (R) 15 Estereoquímica, * = Estereoquímica (L) , n=5):
Una solución de (VI) (6.45) en MeOH:acetato de etilo (1:1, 500ml) se agitó a temperatura ambiente y se trató con 10% Pd sobre carbón (150mg) en atmósfera de hidrógeno. Después de 24 hr la reacción se completó. La suspensión fue
filtrada sobre Hyflo Super Cel®, la cual se lavó con acetato de etilo y
^uW concentrado in vacuo, para dar el producto crudo que se trituró con hexano.
Esto produjo el compuesto del título (VI) (3.44g) como polvo blanco que fue analizado por RMN y CLAP (condiciones CLAP: Col.: Fenil RP Nucleosil 10 x 250 mm: Eluyente: 60 % H20 : 40 % CH3C con 0.1 % ácido fórmico: Flujo: 4 ml/min.:
Detección: Diodo, A95 nm. ) .
(Compuesto Ilal, Ri = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 84-85°C.
H-NMR (CD3OD en ppm) : 0.880, 6H, d, (J = 6.6Hz) ; 1.108, 3H, d, (J = 6.6Hz) ; 1.91, 2H, m; 1.286, br s; 1.32, 1H, m; 1.54, 1H, m; 1.61, 1H, m; 1.953, 1H, m; 2.180, 1H, m; 2.394, 2H, t, (J = 7.5Hz) ; 2.31-2.42, 1H, m; 4.413, 1H, m; 8.13, 1H, br d, (J = 7.4Hz) .
13C-NMR (CD3OD en ppm) : 18.170; 23.001; 28.503; 28.608; 29.110; 30.639; 30.696; 30.736; 30.785; 31.012; 35.389; 40.228; 42.000; 53.800; 177.300 (br 2C) ; 179.7.
CLAP: Tiempo de retención (Tiempo de Ret.): 46.0 min
Los siguientes compuestos fueron preparados de manera análoga:
Ejemplo 26 (Compuesto IIa2, R = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (S) , * = Estereoquímica (L) , n=5):
^•H-NMR (CD30D en ppm): 0.880, 6H, d, (J = 6.6Hz); 1.108, 3H, d, (J = 6.6 Hz) ; 1.91, 2H, m; 1.286, br s; 1.32, 1H, m; 1.54, 1H, m; 1.61, 1H, m; 1.953, 1H, m,-2.180, 1H, ; 2.394, 2H, t, (J = 7.5 Hz) ; 2.31-2.42, 1H, m; 4.413, 1H, m; 8.13, 1H, br d, (J = 7.4Hz) .
13C-NMR (CD3OD en ppm) : 18.364; 23.008; 27.823; 28.422; 28.503; 30.639; 30.704; 30.744; 30.793; 31.011; 35.270; 40.228; 41.838; 52.940; 175.306; 176.68; 180.09.
CLAP: Tiempo de Ret.: 48.0 min.
Ejemplo 27; (Compuesto IIa3, Ri = Me, R2 = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (S) , * = Estereoquímica (D) , n=5) :
RMN idéntica a la del ejemplo 25 enantiómeros.
CLAP: Tiempo de R"t.: 46.0 min.
Ejemplo 28; (Compuesto IIa4, Rx = Me, R = Me, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (D) , n=5) :
RMN idéntica a la del ejemplo 26 (enantiómeros) .
Ejemplo 29; (Compuesto IIa5, Ri Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=5):
tpf: 94-95°C.
1H-NMR (CD30D en ppm) : 0.897, 3H, t, (J = 7.2 Hz) ; 1.103 3H, d, (J = 6.6 Hz);
1.286, br s; 1.32, 1H, m; 1.61, 1H, m; 1.953, 1H, m; 2.180, 1H, m; 2.394, 2H, t, (J = 7.5 Hz); 2.31-2.42, 'lH, m; 4.413, 1H, m; 8.13, 1H, br d, (J = 7.4 Hz) .
13C-NMR (CD30D en ppm) : 14.435; 18.212; 23.670; 28.037; 28.597; 30.447; 30.648;
.705; 30.734; 30.748; 30.777; 31.445; 33.036; 41.893; 52.786; 176.870 (far 2C) ; 179.775.
CLAP: Tiempo de Ret.: 36.8 min.
Ejemplo 30; (Compuesto IIa6, Ri = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (D) , n=5) :
XH-NMR (CD3OD en ppm): 0.897,3H, t, (J = 7.2 Hz) ; 1.103 3H, d, (J = 6.6 Hz) ;
1.286, br s; 1.32, 1H, m; 1.61, 1H, m; 1.953, 1H, m; 2.180, 1H, m; 2.394, 2H, t, (J = 7.5 Hz); 2.31-2.42, 1H, m; 4.413, 1H, m; 8.13, 1H, br d, (J = 7.4 Hz) .
13C-NMR (CD3OD en ppm) : 14.435; 18.319; 23.670; 28.037; 28.417; 30.447; 30.648;
.705; 30.734; 30.748; 30.777; 31.955; 33.036; 41.893; 52.044; 176.870 (br 2C) ; 179.775.
CLAP: Tiempo de Ret.: 38.5 min.
Ejemplo 31: (Compuesto IIa7, Rl = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (S), * = Estereoquímica (D) , n=5) :
RMN idéntica a la del ejemplo 29 (enantiómeros)
CLAP: Tiempo de Ret.: 36.8 min.
( S ) , * = Estereoquímica ( L) , n=5 ) : '
RMN idéntica a la del ej emplo 30 (enantiómeros) .
CLAP: Tiempo de Ret.: 38.2 min.
Ejemplo 33; (Compuesto IIa9, Ri = H, R2 = R3 = Me, * = Estereoquímica (L) , n=5): 1 0 1H-NMR (CD3OD en ppm): 0.885, 6H, d, (J = 6.6 Hz) ; 1.' 189, 2H, m; 1.286, br s; 1.521, 1H, m; 1.61, 1H, m; 1.93, 1H, m; 2.160, 1H, m; 2.240, 2H, t, (J = 7.7 Hz) ; 2.39, 2H, t, (J = 7.7 Hz); 4.42, 1H, m; 8.13, 1H, br d, (J = 7.4 Hz) .
Ejemplo 34; (Compuesto IlalO, Rl = H, R2 = R3 = Me, * = Estereoquímica (L) , n=5) :
RMN idéntica a la del ejemplo 33 (enantiómeros) .
2 0 Ejemplo 35 ; (Compuesto Hall, Ri = R2 = H, R3 = Me, * = Estereoquímica ( L) , n=5 ) :
XH-NMR (CD3OD en ppm): 0.899, 3H, t, (J = 6.4 Hz) ; 1.282, br s; 1.61, 2H, m; 1.94, 1H, m; 2.18, 1H, m; 2.240, 2H, t, (J = 7.7 Hz); 2.39, 2H, t, (J = 7.7 Hz) ;
4.42, 1H, m; 8.12, 1H, br d, (J = 7.4 Hz) .
^ Ejemplo 36; (Compuesto IIal2, R = R = H, R3 = Me, * = Estereoquímica (D) , n=5) :
RMN idéntica a la del ejemplo 35 (enantiómeros) .
A continuación se ilustra la síntesis no estereoespecífica del invento (ejemplo 37) y la separación resultante de la mezcla en los diasteroisómeros (ejemplos 38 y 39) 35 Ejemplo 37; (Compuesto IIal3, Ri = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R/S) , * = Estereoquímica (L) , n=6) : con LiCl anhidro (600mg) y luego, 2 g de cloruro racémico 2-metilhexadecanoil (preparado d _ acuerdo con Hoefle et al., 1987), disuelto en 40ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente. Después de agitar por 6 hr, el so lvente se removió in vacuo y la goma restante fue triturada con hexano
(4x200ml) , para dar el compuesto (Ilal3) (1.2 g) en forma de polvo blanco.
(Compuesto IIal3, Ri = Me, R2 = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R/S) , * = Estereoquímica (L) , n=6) : 10 tpf: 133.0-135.0°C.
CLAP: Tiempo de Ret.: 52.6 (R) y 55.6 (S) min. (1:1 Ratio).
Las contrapartes diastereoméricas resueltas están conectadas con "y" .
^fe 1H-NMR (en CD3OD [3 = 3.30 ppm], 50 mg/ml, 300 MHz, temp. ambiente): 4.44 y 4.42 (cada dd, J = 8.4, 4.8, 1H) , 2.40 (m, 3H) , 2.17 (br. m, 1H) , 1.94(br. m, 1H) , 1.60 (m, 1H) , 1.29 (br., 25H) , 1.10 (d, J = 6.9, 3H) , 0.89 (t, 20 J = 6.6, 3H) .
13C-NMR (en CD3PD [d = 49.0 ppm], 50 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente): 180.11 y 180.05, 176.59 y 176.51, 175.24 y 175.17, 52.82 y 52.78, 41.86 y 41.83, 35.39 y 35.28, 33.04, 31.26 y 31.23, 30.74 (5C) , 30.69 (2C) , 30.63, 30.43, 28.60
y 28.41, 27.75 y 27.71, 23.67, 18.34 y 18.22, 14.38.
Los diastereómeros en el caso de los ejemplos 38 y 39, fueron separados por medio de CLAP (250/10 Nucleosil 100-7 C6H5; Acetonitrilo: agua + 0.1% ácido fórmico = 40:60) . 30 Ejemplo 38; (Compuesto IIal4, R]_ = Me, R = H, R3 = Me, a = Estereoquímica (R) , * = Estereoquímica (L) , n=6) :
tpf: 99.0-100.0°C. 35 CLAP: Tiempo de Ret.: 52.6 min.
4.39 (dd, J = 8.4, 4.8, 1H) , 2.38 (m, 3H) , 2.15 (m, 1H) , 1.94 (m, 1H) , 1.59 (m,
1H) , 1.28 (br.,- 25H) , 1.10 (d, J = 6.9, 3H) , 0.89 (t, J = 6.6, 3H) .
13C-NMR (en CD3OD [3 = 49,0 ppm], 16 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente): 179.81, 176.95, 176.10, 53.51, 41.98, 35.36, 33.04, 31.54, 30.75 (2C) , 30.73 (3C) , 30.69 (2C) , 30.63, 30.42, 28.60, 28.22, 23.67, 18.18, 14.36.
Ejemplo 39; (Compuesto Hal5, Ri = Me, R = H, R3 = Me, a Es ereoquímica (S) , * = Estereoquímica (L) , n=6) :
tpf: 131.0-133.0°C.
CLAP: Tiempo de Ret. 55.6 min.
^-H-NMR (en CD3OD [3 = 3.30 ppm], 15 mg/ml, 300 MHz, temp. ambiente): 4.38 (dd, J = 8.4, 4.8, 1H) , 2.37 (m, 3H) , 2.15 (m, 1H) , 1.95 (m, 1H) , 1.60 (m,
1H) , 1.28 (br., m, 25H) , 1.10 (d, J = 6.9, 3H) , 0.89 (t, J = 6.6, 3H) .
13C-NMR (en CD3OD [9 = 49.0 ppm], 15 mg/ml, 75 MHz, temp. ambiente): 179.89, 177.05, 175.99, 53.51, 41.97, 35.36, 33.04, 31.54, 30.74 (7C) , 30.63, 30.43, 28.44, 28.25, 23.68, 18.35, 14.36.
tpf: 131.0-133.0°C.
CLAP: Tiempo de Ret. 55.6 min.
ACTIVIDAD BIOLÓGICA D? EXTRACTOS DE FMH, LA FMH NATURAL Y SUS DERIVADOS _
Los experimentos y estudios llevados a cabo arrojaron claras evidencias de que hay un reconocimiento cruzado (i. e., interespecífico) de FMH entre siete especies de Anastrepha (bezzii . leptozona. ludens . oblisua. serpentina, striata. suspensa ) y una especie de un género cercano de importancia económica (Toxotrvpana curvicauda) . Para los fines de esta patente, es importante el este documento (ver TABLA 2). Nuestros resultados indican que A., oblig-na también responde a un compuesto sintético derivado de la feromona de A. ludena (descrito como ejemplo No. 29) . Todos estos hechos proporcionan evidencias claras de que la estructura química general de la FMH de todas las especies de Anastrepha debe ser homologa, y de que una fórmula general será suficiente para disuadir la oviposición en todas las especies de Anastreoha.
1 o Métodos utilizados
Bioensavoa elßctrofisioló isoa .
Las pruebas se llevaron a cabo en el laboratorio de electrofisiología de la
Swiss Federal Research Station en Wádenswil, Suiza. Los procedimientos y técnicas usados fueron desarrollados por Stádler y colaboradores para estudios
MM con Rhasoletis cerasi (Stádler et al., 1987). Ninguna modificación fue hecha a esta técnica. Básicamente, el estímulo (biológico) de la FMH en las moscas experimentales se puso a prueba con quimioreceptores localizados en sedas
específicas de los tarsos de las moscas.
Bioensavos de laboratorio.
Los bioensayos de laboratorio se llevaron a cabo en la sede del Programa
MoscaMed, Metapa de Domínguez, México. Seguimos una versión ligeramente
^? modificada de los bíoensayos descritos por Boller y Aluja (1992). En lugar de utilizar fruta fresca como substrato de oviposición, se utilizaron esferas de agar verdes de 2.5 cm de diámetro envueltas en Parafilm®. Se colocaron 30 de
dichas esferas en tubos de cristal (12 mm diámetro x 60 mm altura) (una esfera por tubo) . Los tubos se insertaron en orificios previamente hechos en un tablero de madera de 27 X 27 X 2 cm. El arreglo final de las esferas de agar fue hexagonal y la distancia entre las esferas fue de ca. 1.5 cm (ver Boller y Aluja 1992, para mayores detalles) . El tablero se transfirió a una jaula de 35 plexiglás de 40 X 30 X 30 cm, en cuyas paredes se habían colocado hojas de mango (para dar a las moscas suficientes sitios de reposo) . La tarde anterior a realizar la prueba, se liberaron en la jaula (que contenía agua y alimento) 16 limpias. A la mañana siguiente, ca. una hora antes de la prueba, se retiró el tablero de madera con las esferas de agar.
El bioensayo consistió en introducir una arena fresca de preparación reciente (tablero de madera con esferas de agar) en una jaula con moscas (mantenidas como se describió) a las que se les dejó oviponer durante una hora en las esferas, de las cuales unas estaban tratadas con FMH y otras estaban solamente tratadas con el solvente (MeOH) .
De las 30 esferas expuestas a las moscas, 15 no estaban tratadas (controles) y 15 estaban tratadas, por lo que la distribución de los tratamientos fue sistemática.
Durante el período experimental de 60 • minutos, las moscas fueron monitoreadas continuamente y se registraron sus aterrizajes, intentos de oviposición y oviposiciones exitosas en esferas tratadas y no tratadas. Cada vez que una esfera control ó una esfera tratada era ovipositada y marcada, se reemplazaba inmediatamente con una esfera idéntica con el mismo tratamiento.
Con esta información sobre oviposiciones exitosas se calculó un coeficiente de discriminación basado en la siguiente fórmula (Boller y Hurter 1985) :
CD = X 100 A + B
en donde A = oviposiciones en esferas no tratadas (control) B = oviposiciones en esferas tratadas con FMH.
CD puede variar entre -100 y +100. Un CD de -100 indicaría que todos los huevos fueron puestos en sustrato de oviposición tratado. De no haber diferencia entre la sustancia probada y el control resultaría un CD de 0 y, por lo tanto, no se habría logrado ningún efecto disuasivo. Un CD de +100 indicaría que ningún huevo fue puesto en los sustratos de oviposición tratados y por lo tanto, se obtuvo un efecto disuasivo absoluto.
La pruebas de campo se efectuaron en tres localidades del estado de Veracruz, México. Se llevaron a cabo pruebas en condiciones naturales en huertos de ciruela tropical (Soondia.q purpurea) , guayaba (Psidium suaiava) y toronja (Ci rus paradis i ) . Estas pruebas consistieron en aplicar los extractos naturales de la feromona de A. ludens (extracto 100 mg/ml MeOH diluido en agua hasta 10 mg/ml) a los frutales visitados por las moscas provenientes de poblaciones locales de tamaño intermedio, utilizando un bomba de mochila. Con
el mismo método, también se aplicó la sustancia descrita como ejemplo 29 en la TABLA 3 (derivado sintético de la FMH de A,, ludens ; 100 ppm) a ramas aisladas de árboles de S. purpurea que presentaban frutos y que eran visitadas por hembras de A. oblicua.
Resultados
^? Actividad de loa extractos crudos de FMH.
Los extractos en metanol provocaron fuertes respuestas electrofisiológicas y
conductuales en bioensayos tanto de laboratorio como de campo . Los resultados se resumen en la TABLA 2, y muestran claramente que las FMH producidas por seis diferentes especies de Anastrepha son percibidas por A,, ludens y A., oblisua. y apoyan nuestros resultados en otros bioensayos de laboratorio que incluyen 3 especies de prueba y sus FMH. En el caso de _. curvicauda. se demostró en
pruebas electrofisiológicas y en bioensayos de laboratorio, que su feromona de mareaje (contenida en extractos de heces), es reconocida por A,, ludens y A. ^m oblisua (TABLA 2) .
Actividad de FMH natural de A. ludßna y sus derivado.
Tanto la FMH natural sintética como varios de sus derivados provocaron fuertes respuestas electrofisiológicas y conductuales en el laboratorio (TABLA 3) . El compuesto sintético descrito como ejemplo 29 también resultó ser efectivo
reduciendo significativamente la oviposición de A., obliqua en condiciones de campo (TABLA 3, última columna).
por A. bezz i (AB) , ., leptozona (ALZ) A. 1 udens (AL) , A. oblisua (AO) , A.. serpentina (AS) , A. suspensa (ASU) , A. striata (AST) , Toxotrvpana curvicauda (TC) y probados con hembras de A. ludens . A. ohliaua y ,, serpentina. C (= KCl) se refiere a la sustancia control utilizada.
-'-Concentración del extracto f eromonal : 100 mg/ml MeOH
Actividad de la feromona (FMH) natural v sus derivados.
Los resultados se resumen en la TABLA 3. Los datos muestran actividad biológica en compuestos descritos en este documento como ejemplos 25, 29, 37, 38, 39, respectivamente. --
33 ejemplos 25, 29, 37, 38, 39, respectivamente. La electrofisiología y las pruebas conductuales de laboratorio se realizaron con hembras de A. ludens . La prueba de campo se realizó con A. oblisua .
Compuesto de Isómero Actividad biolósica prueba Electro- Pruebas de Prueba de fisiología conducta campo
Ejemplo No. 1 ppm laboratorio 100 ppm Rl R2 R3 * n a 100 ppm Eficacia % Picos/msec DC (Abbott)
(25) FMH Me Me Me L 5 R 76 82.3 11 al natural (28) . FMH Me Me Me D 5 R 50 23.2 natural (26) Me Me Me SL 5 S 16 -^—
IIa2 (27) Me Me Me D 5 S 6 IIa3 - (29) Me H Me L 5 R 78 84.8 64.37
IIa5 (30) Me H Me D 5 R 23 IIa6 (33) H Me Me L 5 - 25 23.7 IIa9 (35) H H Me L 5 - 12 8.3 Ilal 1 (38) Me H Me L 6 R — 84.3 Ilal 4 (39) Me .. H Me L 6 S — 61.7 II al 5 (37) Me H Me L 6 R/S - 78.4 1 al - 3 Los valores con actividad biológica importante se presentan en negrillas.
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Claims (11)
1. El compuesto^ llamado ácido 2- (2', 14 ' -Dimetil-pentadecanoilamino) pentanedioico de la fórmula (I) en la forma de sus isómeros ópticos o las mezclas de los mismos, así como " metales alcalinos, metales alcalinotérreos y las sales acidas de amonio mono- ó dicarboxílicas, que generen actividad disuasiva de oviposición en moscas de la fruta del género Anastrepha. ' -
2. Los derivados biológicamente activos de la feromona de mareaje de hospedero natural que exhiban actividad disuasiva de oviposición en moscas de la fruta del género Anastrepha, caracterizados por la fórmula general (II) : alquinil; R2 y R3 independientemente una de otra son H ó C1-C4 alquil, C3-C6 cicloalquil, C3 - ó C4 alquenil, C3- ó C4 alquinil, bencil ó bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno, C1-C4 alquil ; 5 ^^ R4 es H ó C1-C4 alquil , C3 -C6 cicloalquil , C3 - ó C4 alquenil , C3- ó C4 alquinil , ^^ C1-C4 alquil carbonil , bencil ó bencil que es sustituido de una a tres veces en el anillo fenil por halógeno , C1-C4 alquil , 1 0 d onde oc se ref iere a los estereoisómeros (R) ó (S ) ( ó sus mezclas ) , con la premisa que Rl no es = H. donde n - un intervalo entre 0 y 15 1 5 donde * se refiere a la estereoquímica (L) ó (D) del aminoácido (ó sus mezclas ) .
?) 3 . Un compuesto de fórmula ( II), caracterizado p r ué Rl es Mstil, R2 es H, R3 es Ms, R4 es H, y n es 5, de acuerdo a la reivindicad en 2. 2 0
4 . Un compuesto de fórmula II,. caracterizado porque Rl es Mstil, R2 es H, R3 es Me, R4 es H y n es 6, de acuerdo a la reivinii cpción 2.
5 . Los metales alcalinos , alcalinotérreos y las sales acidas de amonio mono- ó dicarboxí 1 icas de la fórmula ( II) de la reivindicación 2 . 2 5
6. Compuestos de la fórmula general ( II) en la que el ácido glutámico es reemplazado por ácido aspártico .
7. Un proceso para preparar compuestos de la fórmula general (II ) como se 3 0 reclama en la reivindicación 2 que es aplicable a todas las feromonas de mareaje de hospedero (feromona disuasiva de oviposición) de las moscas de la fruta de los géneros Anas.t epha. y Toxotrypana,. este preceso está caracterizado DOTOUS consista en hacer reaccicnar los derivados acil activados de la fórmala (m) . con un compuesto de la fórmula (VI) donde Rl , R2 , R3 , R4 , n, a and * tienen los significados descritos en 1 reivindicación 2 , en un solvente inerte en presencia de una base y un agente solubilizador .
8. Un proceso para preparar los compuesto de la fórmula general ( II ) como se reclama en la reivindicación 2 que es aplicable a todas las feromonas de mareaje de hospedero ( feromona disuasiva de oviposición) de las moscas de la fruta de los géneros Anastrepha y Toxotry ana, este proceso está caracterizado porque consiste en hacer reaccLcnar los derivados acLL activados de la fórpula (HE) . donde Rl , R2 , R3 , R4 , n, y * tienen el significado descrito en la reivindicación 2, en un solvente inerte en presencia de una base para dar el compuesto (V) donde R5 son grupos protectores que pueden ser remplazados por hidrógeno.
9. Productos que actúan cerno disuasivos de oviposición en especies de Anastrepha, caracterizados porque centengan además de solver?ss biolóqicos neutros y/o otras sustancias vehículo, ingredientes biológicamente activos de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2 y/o sus mezclas.
10. Productos d sacuerdo a la reivindicación 8 caracterizados por contener el ingrediente activo o una mezcla de ingredientes activos de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2 en cantidades entre 0.1 y 99% (peso) del producto final.
11. Productos de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizados por un solvente que puede ser alcohol C1-C4, agua o una mezcla de ellos. especies de Anas reo a, caracterizado por la aplicación de la cantidad adecuada de ingrediente (s) activos referidos en las reivindicaciones 1 y 2, a la superficie del cultivo que se desee protejer. Re sumen El ácido 2- (2 , 14-Dimetil-pentadecanoilamino) -pentanedióico (I) y compuestos de la fórmula (II) , Mexicana de la fruta) , &. obliaua (Mosca del mango) , ., serpentin {Mosca de los zapotes) , &. striata (Mosca de la guayaba) , y A. suspensa 3 5 (Mosca Caribeña de la fruta) . Las sustancias antes mencionadas , si son formuladas ^H adecuadamente, pueden ser usadas para reducir el daño que estos insectos ocasionan a la fruta cultivada en huertos comerciales y semi-comerciales , en huertos de traspatio y en árboles ' . aislados en jardines residenciales.
Priority Applications (5)
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|---|---|---|---|
| CR6121A CR6121A (es) | 1998-10-21 | 1999-10-19 | Aislamiento, determinacion estructural, sintesis, actividad biologica y aplicacion como agente de control de la feromona marcadora de hospedero y sus derivados de las moscas de la fruta del genero anastrepha (diptera: tephritidae) |
| CO99066147A CO5210974A1 (es) | 1998-10-21 | 1999-10-20 | Proceso para preparar acido 2-(2´14´-dimetil-pentadecanoilamino)-pentanedioico y sus derivados biologicamente activos |
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Publications (1)
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