MXPA98005522A - Hadrurina:un peptido antibiotico - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un péptido denominado Hadrurina, con actividad antibiótico, conteniendo 41 aminoácidos y peso molecular 4,435 que fue aislado y caracterizado a partir del veneno soluble del alacrán Mexicano~Hadrurus aztecus y también fue sintetizado exitosamente. Se provee la estructura primaria completa, tal como se aprecia en la figura 3. La Hadrurina, tanto nativa como sintética, inhibe el crecimiento de cultivos bacterianos. La homología parcial de Hadrurina con las Brevininas tipo 2 de piel de la rana Brevipoda porsa y con la Gaegurina 4 de Rana rugosa en su porción amino-terminal, y con la cecropina P1 de mamífero (puerco) en su región carboxilo-terminal le hace un híbrido natural entre estos dos tipos de péptidos. Por estas razones se concluye que Hadrurina constituye un nuevo tipo estructural de agente antimicrobiano. La invención también incluye las composiciones farmacéuticas para la aplicación del nuevo péptido y la secuencia de ADN que codifica para el mismo.
Description
HADRURINA: UN PÉPTIDO ANTIBIÓTICO.
DESCRIPCIÓN '1 5 CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un péptido con actividad aniibiótica, particularmente contra un cierto grupo de microorganismos. Dicho pépíido fue asilado y purificado a partir del veneno del alacrán Hadrur?s azecus pero 10 también puede ser obtenido por otros medios. La invención también se refiere a la secuencia de ADN que codifica para el péptido y la composición farmacéutica que comprende el uso de tal péptido.
ANTECEDENTES
El creciente aumento de la resistencia a antibióticos por parte de muchos organismos patógenos ha motivado la búsqueda de nuevos compuestos naturales capaces de inhibir o inducir toxicidad a dichos organismos ( Cohén,
1992). Actualmente, la batería de antibióticos disponibles se restringe de manera importante a productos colaterales de hongos, como la penicilina y otros similares obtenidos de organismos unicelulares. E! surgimiento de antibióticos de origen peptídico puede ser la clave para solucionar este problema, pues han evolucionado por millones de años y constituyen uno de los mecanismos más
eficientes utilizados por artrópodos, desprovistos de anticuefos, para contender con el ataque de microorganismos.
Actualmente se conoce una gran variedad de antibióticos peptídicos, obtenidos de diferentes fuentes como artrópodos, mamíferos y plantas (Nicolás y Mor,
1995; Boman, 1995; Cociancih y col. 1993; Maloy y Kari, 1995; Broekaert y col., 1995; Hristova y col. 1996; Harder y col., 1997).
Este asunto fue el objeto de un simposium durante el reciente 5a Congreso de Química de América del Norte (Cancún, México, noviembre de 1997), bajo el título de "Péptidos y péptido-miméticos" en donde se vio que las tendencias actuales en la búsqueda de nuevos antibióticos de origen peptídico son hacia el diseño de nuevos péptidos cíclicos antibióticos por modificaciones o sustituciones de aminoácidos en su estructura (Hodges y Kondejewski, 1997) y según estos autores, se puede orientar la acción de forma preferencial para matar o inhibir crecimiento de bacterias y al mismo tiempo disminuir la acción lítica celular a tejidos de organismos superiores, mediante el cambio del perfil hidrofóbico de los péptidos.
a. Péptidos antibióticos
Los péptidos antibióticos son posiblemente las moléculas más primitivas desarrolladas como barreras primarias de defensa, y se han encontrado muchas familias de ellos tanto en plantas como animales superiores (Boman, 1995), aunque fueron aislados inicialmente en invertebrados (Steiner, 1981). Debido a su reducido tamaño (la mayoría con masa molecular entre 2,000 y 5,000), se producen por el organismo con un gasto mínimo de energía y biomasa (Levashina et al., 1995).
Una característica común de todos estos péptidos es su naturaleza básica debido a la presencia de múltiples residuos de lisina y arginina, y su carácter antipático. Se han propuesto dos mecanismos probables de actividad para la mayoría de ellos:
1) Formación de poro.- Sugiere la formación de poros transmembrenales por la agregación de dímeros o multímeros para formar una estructura de canal bajo la influencia de una fuerza electromotriz, por lo que se requiere una célula metabólicamente activa. Si el canal no se repara, la célula muere debido a la depolarización de la membrana, decaimiento del ATP cfíoplasmático y pérdida de iones (White y col, 1995).
2) Formación de tapiz.- Sugiere la formación de una capa de monómeros paralela a la superficie de la membrana capaz de perturbar la membrana fosfolipídica y consecuentemente desintegrar la membrana (Gazií y col., 1996).
El espectro de actividad antibiótica de estas moléculas es muy amplio (bacterias, protozoarios, hongos, y en ocasiones células eucariontes); trabajan a altas concentraciones (1-50 µM) en sitios locales, por lo que sus concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) son altas en comparación con otros antibióticos (Maloy y Kari, 1995). Además de su actividad aniibiótica, ciertos p?ptidos también se han relacionado con la estimulación del crecimiento celular, cicatrización y estimación de la quimiotaxis de mo.nccríos (Hoffman y Hetru, 1992; Lehrer y col., 1993).
Los péptidos antibióticos pueden dividirse en cuatro grupos: 12 Alfa-helicoidales, con o sin doblez. 2- Hoja beta-antiparalela, con 2 o más puentes disuífuro. 3- Estructuras helicoidales presentando doblez, estabilizadas por un puente de disulfuro. 42 Estructuras con un alto contenido de ciertos aminoácidos como proíina/arginina, glicina o triptofano (Boman, 1995).
Algunas patentes norteamericanas protegen la combinación sinérg?ca de ciertos antibióticos de origen péptídico con antibióticos tradicionales (5610139) para uso
uso en tratamiento de infecciones, o con sustancias antisépticas (5656591) para uso como antiséptico.
La patente norteamericana 5,714,467 protege una familia de péptidos antibióticos híbridos que incluyen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de péptidos con actividad antiblótica tales como cecropinas, magaininas y melitina, donde dichos péptidos tienen una mejor actividad biológica que los péptidos nativos que les dan origen, ya sea porque presentan una menor actividad lítica o porque presentan una mayor actividad antibiótica. Sin embargo, a diferencia de la presente invención, se trata de péptidos sintéticos.
Finalmente, la revisión de Nicolás y Mor (1995) menciona el caso de la inhibición del desarrollo de lesiones cutáneas causadas por Trepopema pallidum en un modelo de conejo, a los cuales se inyectó intradérmicamente soluciones de defensinas. Estos autores también mencionan el uso de las dermaseptinas como indicado en la cura de leishmaniasis murina, Las magaininas fueron reportadas como eficientes en el tratamiento de tumores de ascitis peritoneal murino (Baker y col., 1993). De hecho, las magaininas son actualmente utilizadas en la clínica, para uso tópico como antiséptico (Maloy y Kari, 1995).
b. Alacranes y sus péptidos antibióticos
Dentro del phylum Arthropoda, los alacranes son las especies terrestres más antiguas que se conocen. Su veneno contiene componentes neurotóxicos que afectan canales ¡ónicos de Na+, K+, Ca2+ y CI" (Catterall, 1979, Possani y col., 1982, Valdivia y col., 1992, Debin y col., 1993). La mayoría de estas toxinas muestran un motivo estructural común con las defensinas de insecto consistente en una hoja beta-plegada antiparalela ligada a una alfa-hélice antipática y a un
fragmento amino-terminal por tres puentes de disulfuro (Bontems y col., 1991), pero a diferencia de éstas, no presentan una actividad antibiótica sino más bien una actividad tóxica a diferentes grupos de animales.
Los alacranes son particularmente resistentes a las agresiones bacterianas, por lo que representan una potencial fuente de sustancias antibióticas responsables de ello. Sin embargo, hasta el momento sólo se han aislado este tipo de compuestos de la hemolinfa de dos especies de alacranes. En Leiurus quinquestríatus, se encontró una defensina (Cociancich y col., 1993), y en Androctonus australis se aisló también una defensina y un péptido semejante a taquiplesina (Ehrer-Sabatier y col., 1996). Sin embargo, hasta ahora no existen reportes en la literatura sobre la presencia de péptldos bactericidas en el veneno de alacranes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se puede constatar en el estado del arte, existe el problema médico de que los antibióticos tradicionales presentan el inconveniente de que muchos microorganismos han desarrollado resistencia al embate de los mismos. Una alternativa general para enfrentar este problema es el uso de nuevos tipos de sustancias antibióticas, particularmente de péptidos antibióticos, que según se aprecia existen de muy variados orígenes, desde invertebrados hasta mamíferos, teniendo cada uno diferentes espectros de acción, atacando diversos patógenos incluyendo bacterias, hongos y protozoarios.
Dentro de esta tendencia y dado que hasta ahora no existen reportes en la literatura sobre la presencia de péptidos bactericidas en el veneno de alacranes, en la presente invención se analiza esta posibilidad utilizando el veneno de un alacrán excavador: Hadrurus aztecus, que está constantemente expuesto a bacterias y hongos del suelo. La idea del trabajo surge de la utilización de un
auto-rociado de veneno por parte de algunas especies de alacranes para limpieza de su exosqueleto. Los inventores aportan como propuesta al problema mencionado, el uso de la Hadrurina, un péptido aislado y purificado que presenta una secuencia aminoácida SEQ ID NO: 1.
Inicialmente este péptido fue obtenido por aislamiento y purificación a partir del veneno del alacrán Hadrurus aztecus, que puede ser colectado en el estado de Guerrero, por lo que se ha resuelto llamarlo Hadrurina.
El veneno crudo del alacrán es obtenido por estimulación eléctrica del telson o cualquier otro método conocido en el estado del arte. El veneno es recuperado en agua bidestilada y centrifugado a 4°C. El sobrenadante es liofilizado y conservado a -20°C, hasta su uso.
La purificación de los componentes solubles del veneno se puede llevar a cabo en varias etapas, primero una filtración en gel; para ello el veneno liofilizado debe ser disuelto en algún amortiguador, y ser aplicado directamente a la columna. De las fracciones obtenidas de esta separación, se continua con la purificación de aquella(s) fracción(es) muestre(n) una actividad antibiótica contra alguna bacteria preseleccionada, purificándola por alguno de los métodos cromatográficos conocidos en el estado del arte como la cromatografía líquida de alta resolución (CLAP), precipitación, o cualquier otro tipo de método conocido en estado del arte. De las fracciones obtenidas, se pueden continuar subsecuentes etapas de purificación de aquella(s) que presente(n) actividad antibiótica contra la bacteria preseleccionada, por los diferentes métodos indicados, tantas etapas como sea necesario hasta obtener un compuesto único y puro.
Para la caracterización química del péptido se determina su composición química la cual se lleva a cabo mediante una análisis de aminoácidos en un analizador
automático como es el caso del Beckman 6300E, después de hidrolizar por 20 horas a 110 °C en tubos sellados al vacío con 6 N de HCl y 0.05% de fenol. Con ello se estimó el peso molecular mínimo, que se confirmó por espectrometría de masas.
El péptido purificado se secuencia en un secuenciador automático como el ProSequencer modelo 6600 de MilliGen/Biosearch (división de Millipore) en membranas de unión covalente Sequelon-AAR siguiendo los protocolos descritos por la compañía. Se usa péptido nativo para secuencia directa, así como los péptidos aislados por CLAP provenientes del rompimiento con la endopeptidasa Asp-N (Boehringer Manheim), como se muestra en la figura 1. Las digestiones se hacen con 100 µg de péptido cada vez disolviéndolo en amortiguador de fosfatos 50 mM pH 8.0, e incubándolo durante 4 horas a 37 °C usando una relación 1 :100 (enzima:péptido). La Hadrurina resulta tener la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Sin embargo, resulta obvio para cualquier experto en el estado del arte que se puede realizar alguna sustitución, adición o eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia con la idea de incrementar el carácter básico, forzar o interrumpir algún plegamiento o para algún otro fin, con lo que dicha modificación o mutación cae dentro del alcance de la presente invención.
La cuantificación del contenido de proteína durante los procedimientos cromatográficos se calcula asumiendo que una unidad de absorbancia a 280 nm equivale a 1 mg/ml de proteína. La concentración verdadera de péptido para la curva dosis-respuesta en bacterias, se determinó con base en el análisis de aminoácidos. La Hadrurina corresponde a un 0.01% del veneno total.
De esta forma la Hadrurina resulta tener un peso molecular de 4,435.3, un punto isoeléctrico calculado de 11.08 y carece de residuos de cisteína en su secuencia aminoácida, lo cual facilita el adecuado plegamiento del péptido cuando es sintetizado. También resulta obvio para cualquier experto en el estado
del arte que alguna modificación a la secuencia aminoácida de la Hadrurina, repercutirá directamente en los valores de peso molecular y punto isoeléctrico, sin que por ello el péptido modificado quede fuera del alcance de la presente invención.
Las búsquedas en bancos de datos conteniendo secuencias aminoácidas de proteínas mostraron una pobre similitud con los péptidos antibióticos Brevinina 2e y Gaegurina 4 de piel de rana y Cecropina P1 de cerdo (Fig. 2). El alineamiento de las secuencias de aminoácidos se realizó con el programa Pileup de GCG y las comparaciones con el programa Fasta de GCG. Los alimentos de la Fig. 2 se prepararon introduciendo espacios blancos en algunas posiciones (puntos) para aumentar la similitud de la secuencia.
Al comparar la Hadrurina con la Gaegurina 4 (Fig. 2a), de las 41 posiciones generadas solamente 12 son identificadas, lo que arroja una identidad de 29% entre estas secuencias completas; cuando comparamos Hadrurina con la
Brevinina (Fig. 2b), se identifican 9 de los 41 aminoácidos generados, obteniéndose una identidad de 22%, mientras que la comparación de la secuencia completa de Hadrurina con la Cecropina P1 (Fig. 2c) muestra una identidad de apenas 14%. Estos valores de identidad demuestran una gran diferencia entre Hadrurina y los péptidos conocidos. De este modo Hadrurina es un péptido que presenta homologías con dos péptidos antibióticos de naturalezas distintas lo que le da la característica de ser un péptido natural híbrido de otros péptidos, característica nunca antes reportada y por lo tanto muy novedosa y que se diferencia de los trabajos reportados en la patente norteamericana 5,714,467 en que los péptidos que ésta protege son péptidos híbridos pero sintéticos y no naturales como lo es la Hadrurina.
La estructura secundaria predicha para Hadrurina, aplicándose el algoritmo de Chou-Fasman (1978), sugiere la presencia de una estructura
preponderantemente tipo alfa-hélice (datos no mostrados). Se usó un diagrama de Schiffer-Edmundson (véase Colé, 1997) para predecir las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas dentro de la estructura secundaria de la Hadrurina. La Fig. 3 muestra una conformación antipática alfa-helicoidal en la que los residuos hidrofóbicos e hidrofílicos se encuentran en lados opuestos de la región que comprende los 11 primeros residuos del extremo amino terminal y del residuo 18 en adelante.
Con el objeto de demostrar que la actividad biológica de la Hadrurina no era debida a la presencia de algún posible contaminante en la muestra, purificada a partir del veneno del alacrán, y que es factible obtener la Hadrurina por métodos distintos al aislamiento y purificación a partir del veneno, se procede a sintetizar la molécula completa de Hadrurina por un método químico, como por ejemplo el descrito por los inventores en la patente norteamericana No. 4,929,718, haciendo una síntesis de novo de la molécula de Hadrurina. Sin embargo es obvio para cualquier experto en el estado del arte que el péptido de la presente invención puede también ser obtenido por otros métodos estándares conocidos como los métodos de ADN recombinante.
La Hadrurina, tanto la obtenida por aislamiento del veneno del alacrán como la sintética, fue probada en su actividad antibiótica contra diferentes microorganismos, seleccionados tratando de representar diferentes tipos de patógenos, algunos de ellos conocidos por su virulencia, y algunas de las cepas conocidas por su alta resistencia a los antibióticos clásicos, mediante la medición del crecimiento celular en cultivos líquidos incubados con diferentes concentraciones del péptido. Los microorganismos seleccionados fueron Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus feacalls, Enterococcus cloacae, Klebsiella pneumoniae, Salmonella thypi, Serratia marcencens y Sacharomic?s cerevisiae. En todos los casos la Hadrurina demostró tener actividad antibiótica.
El hallazgo de la Hadrurina en el veneno del alacrán Hadrurus aztecus, su aislamiento, síntesis y demostración de su actividad antibiótica es un nueva invención, distinta de lo encontrado en la hemolinfa de los alacranes Norte-Africanos mencionados en la literatura, los cuales contienen defensinas y taquiplesinas y de otros péptidos encontrados en los venenos de diferentes alcacranes, los cuales no muestran una actividad antibiótica, sino más bien tóxica.
Otro aspecto que contempla la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el péptido Hadrurina de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser elaborada conforme a la vía de administración que se desea emplear, lo cuai incluye composiciones sólidas (como tabletas, cápsula, pildoras, óvulos, polvos y granulados con o sin capa entérica) para administración oral o vaginal; composiciones líquidas para administración oral, oftálmica o para inhalaciones y aplicaciones en vías respiratorias, tales como soluciones, suspensiones, jarabes o elixires; preparaciones para administración parental como soluciones estériles, suspensiones o emulsiones. Las composiciones también pueden ser preparadas como sólidos estériles para ser disueltos antes de su uso en algún medio inyectable estéril, tal como agua y solución fisiológica salina. Preferentemente, dado que también se encontró una actividad hemolítica en la Hadrurina, se pueden utilizar composiciones para uso tópico tales como emulsiones, suspensiones, cremas, lociones, espumas o geles, los cuales pueden contener emolientes, agentes suspensores, quelantes, solidificantes y amortiguadores, así como cualquier otro componente típicamente utilizado en las composiciones tópicas de otros péptidos antibióticos.
Una composición preparada como se indica en la presente invención al ser administrada en cantidades terapéuticamente efectivas, a un mamífero afectado por una infección bacteriana debe causar una inhibición considerable al crecimiento de la bacteria causante de la infección, dando lugar a una mejoría en el mamífero tratado.
Preferentemente la composición farmacéutica de la presente invención deberá causar una inhibición al crecimiento de la bacteria causante de la infección, cuando se trate de alguno de los siguientes microorganismos: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus feacalis, Enterococcus cloacae, - Klebsiella pneumoniae, Salmonella thypi, Serratia marcencens y levaduras como Sacharomices cerevisiae.
Desde luego el régimen pozológico empleado puede requerir modificar las concentraciones empleadas respecto a las que se reportan en la presente invención de acuerdo al tipo de composición, la vía de administración empleada, las características del mamífero al cual se le administrará tales como la especie, sexo, peso, edad, gravidez, dieta, la combinación con otros fármacos y la sensibilidad, así como del microorganismo que se desee atacar y algunos síntomas del padecimiento provocado.
Es obvio para cualquier experto en el estado del arte que la Hadrurina, el péptido de la presente invención, tiene un potencial uso farmacéutico o veterinario como antibiótico, sin embargo son posibles posteriores hallazgos respecto a otros nuevos usos o aplicaciones que pueda tener, sobre todo atendiendo a que su origen está en un veneno de alacrán a diferencia de la gran mayoría de otros péptidos encontrados en el estado del arte, cuyo origen son las respuestas humorales inmunes de insectos y otros animales.
Otro aspecto de la presente invención lo constituye la secuencia de ADN SEQ ID NO: 2, codificante para la Hadrurina, la cual puede ser obtenida por técnicas de PCR mediante el empleo de los oligonucleótidos adecuados, o bien ser sintetizada mediante algún equipo sistematizado, siguiendo como patrón de referencia la secuencia SEQ ID NO: 2, o ser obtenida por algún otro método conocido en el estado del arte, la cual ha sido determinada acomodando en el orden correcto los posibles codones codificantes para cada uno de los aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO: 1 ; en los casos donde hay más de un posible codón, se hace la anotación correspondiente a todas las opciones, de tal forma que al sintetizar el fragmento de ADN se pueda considerar las preferencias en el uso de codones para el huésped en el que se habrá de expresar la síntesis del péptido. Dicha secuencia de ADN codifica pues para la secuencia aminoácida SEQ ID NO: 1.
Resulta obvio para cualquier experto en el estado del arte que pueden generarse mutaciones puntuales conservativas (sustitución de uno o más pares de bases)en la SEQ ID NO: 2 que den lugar a la misma secuencia aminoácida SEQ ID NO: 1 y que por tanto dichas mutaciones conservativas quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. También es obvio para un experto en el estado del arte que como lo reportan Hodges y Kondejewski (1997) se puede orientar la acción de forma preferencial para matar o inhibir crecimiento de bacterias y ai mismo tiempo disminuir la acción lítica celular a tejidos de organismos superiores, mediante el cambio del perfil hidrofóbico de las moléculas, mediante mutaciones sitio-específicas (inserciones, sustituciones y/o deleciones de uno o más pares de bases) de tal forma que las variaciones en la secuencia aminoácida modifiquen la polaridad de la molécula dando lugar a la obtención de una nueva generación de antibióticos que presenten mayor actividad antibiótica y menor actividad hemolítica, respecto al péptido nativo, y cuyas secuencias aminoácidas sean derivadas y muy similares a la secuencia SEQ ID NO: 1 , quedando, por tanto, dentro del alcance de la presente invención.
Asimismo, como no existen receptores específicos para estos antibióticos (cecropinas, defensinas, etc.), véase Wade y col., 1990) en los microorganismos, se pueden sintetizar péptidos con aminoácidos de estereoisomería D-, en lugar de L-, y de esta forma impedir la destrucción de Hadrurina por acción de posibles proteasas bacterianas endógenas, y así aumentar la vida media del péptido en al organismo al que se haya aplicado (Saberwal y Nagaraj, 1994).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Secuencia de aminoácidos de la Hadrurina. La secuencia directa de Hadrurina permitió determinar la secuencia inequívoca de los primeros 30 residuos (glicina 1 hasta valina 30), marcado con la letra d. Uno de los péptidos puros, obtenidos por CLAP, después de la digestión enzimática, resolvió la posición de los aminoácidos desde el ácido aspártico 21 a la alanína 41 , como indica la figura marcado con AspN, mostrando una extensa región de sobre-cruzamiento.
Fig. 2. Comparación de la Hadrurina con otros péptidos antibióticos. Se indican los residuos idénticos con asterisco (') y los similares con guión (-) entre las secuencias. Se introdujeron blancos (.) para maximizar la similitud entre las secuencias. Se añadieron tildes (~) en lugares vacíos de la secuencia para fines estéticos.
a.- Análisis de la Hadrurina, en comparación con el de la Gaegurina 4. b.- Análisis de la Hadrurina, en comparación con el de la Brevinina 2e. c- Análisis de la Hadrurina, en comparación con la Cecropina P1.
Fig. 3. Diagrama de Schiffer-Edmundson mostrando la probable conformación alfa-helicoidal antipática de la Hadrurina. Los cuadros indican aminoácidos hidrofóbicos. Se muestra el número de residuo a partir del extremo amino-terminal.
Fig. 4. Separación por filtración molecular del veneno de Hadrurus azíecus.
Fig. 5. Separación por CLAP de la fracción III. El componente marcado con asterisco presentó eíec o ar? b ó:ico en contra de Escherichia coli. El inserto en esta figura corresponde a ia comprobación de su pureza por CLAP.
Fig. 6. Comprobación por CLAP de la identidad de ¡a Hacr-rin sintética con la nativa. a.- Separación de 20 µg de Hadrurina nativa, b.- Ap,;ca:>'5-? de Hadrurina sintética (aprox. 50 µg). c- Coinyección de una mezcla ecu 'alenie (10 µg de cada una) de Hadrurina nativa y Hadrurina sintética.
Fig. 7.- Actividad antibiótica de la Hadrurina. Como control positivo se usó BSA 0.2% con 0.01 -= de ác'co acético, y como control negativo formaldehído al 0.4%, para caca tipo de microorganismo ensayado, donde a es Salmonella thypi, b es K.'ezs el'a ce inoniae 9, c es Enterococcus cloacae 129, d es Pseudomonas aer?ghosa PG201 , e es Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, f es Enisrococcjs feacalis 51 , g es Escherichia coli 109, h es Serratia marscenseps e i es Saccharomyces cerevisiae.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son dados a modo de ¡lustrar algunos de los modos para obtener o utilizar la presente invención. Es posible llevar a cabo muchas variaciones de los mismos sin salirse del alcance de la presente invención y por lo tanto de ninguna manera deberá considerarse que la limitan de alguna forma.
Ejemplo 1. Aislamiento y purificación de ia Hadrurina a partir del veneno del alacrán Hadrurus aztecus
El veneno crudo de Hadrurus aztecus se obtuvo por estimulación eléctrica del telson de los alacranes colectados en Iguala, estado de Guerrero. El veneno se recuperó en agua bidestilada y se centrifugó en una ultracentrífuga Beckman OptimaTL por 15 minutos, a 4°C y 15000 x g de aceleración. El sobrenadante se liofilizó y conservó a -20°C, hasta su uso.
La purificación de los componentes solubles del veneno se llevó a cabo primeramente 'por filtración en gel en una columna de Sephadex G-50 (grado superfino), Pharmacia Fine Chemicals). El veneno liofilizado se disolvió en amortiguador de acetato de amonio 20 mM, pH 4.7, y se aplicó directamente a la columna, obteniéndose el perfil mostrado en la figura 4. En esta separación se obtuvieron siete fracciones, numeradas del I al Vil en la Fig. 4, colectándose tubos de 1.5 mi y agrupándose de acuerdo a la absorbancia leída a 280 nm. La recuperación total fue del 81%, del cual aproximadamente el 25% corresponde a la fracción I, el 17% a la fracción II, el 29% a la fracción III y el 27% restante a las demás fracciones menores. De éstas, la única capaz de inhibir el crecimiento de E. Coli (seleccionada como cepa control por su alta sensibilidad a un gran número de antibióticos), a las concentraciones utilizadas (alrededor de 5 µg por ensayo) fue la fracción III. Los tubos correspondientes a esta fracción se mezclaron y liofilizaron.
Soluciones posteriores del material de la fracción III, en cantidades de alrededor de 2 miligramos (mg) por aplicación, fueron purificadas por cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) utilizando una columna (Vydac) C18 semi-preparativa, en un aparato Waters 600E equipado con un detector de UV, modelo Waters-486, con un gradiente lineal de 0 a 60% de acetonitrilo, en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA), durante 60 minutos, resultando el perfil cromatográfico de la figura 5. Más de veinte sub-fracciones fueron obtenidas como se puede observar en la Fig. 5, en donde el componente marcado con asterisco (el último que eluye, a los 50 minutos) mostraba actividad antibiótica (contra la cepa de E. coli). Esta sub-fracción fue finalmente aplicada a una columna analítica de CLAP resultando un componente puro (véase inserto Fig. 5). De acuerdo a los cálculos de recuperación cromaíográfica, este péptido corresponde al 0.01% del veneno total. Este material sometido a análisis de espectrometría de masa demostró estar homogéneo y con un peso molecular de 4,435.3.
Ejemplo 2. Síntesis química de Hadrurina.
Con el fin de ¡lustrar la posibilidad de obtener la Hadrurina por otros medios distintos al aislamiento de la misma a partir del veneno del alacrán, se llevó a cabo una síntesis química de este péptido y se demostró su identidad con el péptido nativo.
Se utilizó el método de fase sólida (Merrifield, 1963), mediante el uso de BOC-aminoácidos. La eficiencia de la incorporación de cada aminoácido se determinó por reacción de ninhidrina. Al final de la síntesis el pépíido se liberó de la resina por rompimiento con ácido fluorhídrico. El péptido se purificó primeramente pasando por una columna de Sephadex G-10, para eliminar contaminantes de bajo peso molecular y después por CLAP, usando una columna semipreparativa
C , fase reversa, con un gradiente lineal de acetonitrilo de 30-60% en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético en 60 minutos. Posteriormente se recromatografió en una segunda columna, analítica C18 de fase reversa (Vydac), con el mismo gradiente.
Con el objeto de caracterizar en mayor medida este péptido y obtener un mayor espectro de actividad se sintetizó y purificó a homogeneidad 200 mg de la Hadrurina, obteniéndose un rendimiento final del 7% de péptido puro. La identidad del péptido sintético fue confirmada por secuencia del extremo amino terminal y por CLAP (Fig. 6). En este figura la letra a corresponde a una muestra de la Hadrurina nativa, tal como es obtenida por purificación del veneno, la letra b es el producto sintético purificado por CLAP y la letra c una mezcla de 50% de Hadrurina nativa y 50% de Hadrurina sintética. El tiempo de elución de ambos péptidos coincide (Fig. 6), la secuencia de aminoácidos de la sintética es idéntica a la nativa y el análisis de aminoácidos resultó muy parecido a la nativa, por lo que concluimos que la síntesis de Hadrurina fue exitosa.
Ejemplo 3. Síntesis por métodos recombinantes
Una vez teniendo un fragmento de ADN ya sea sintético (con algún equipo automatizado) o del ADNc aislado de células del íelson del alacrán por técnicas de PCR mediante el uso de los oligonucleótidos adecuados, el cual corresponda a la SEQ ID NO: 2 o alguna mutación conservativa del mismo, es posible insertar dicho fragmento en una posición adecuada en un vector que contenga al menos un promotor y un sitio de terminación adecuados para el huésped que se desea emplear. Con este vector recombinante, transformar células ya sean procariontes (bacterias) o eucariontes (hongos, levaduras, líneas celulares animales, células vegetales, etc.) y cultivar dichas células en los medios de crecimiento adecuados, que les permitan reproducirse y expresar el péptido Hadrurina o una mutación conservativa del mismo. Posteriormente, mediante alguna de las
técnicas conocidas en el estado del arte, aislar y purificar hasta el grado necesario el péptido.
Ejemplo 4. Ensayos de inhibición de crecimiento bacteriano en fase líquida • 5 Con el fin de mostrar el potencial de la actividad antibiótica de la Hadrurina se realizaron pruebas de inhibición del crecimiento de diferentes bacterias.
Los ensayos se realizaron incubando 5 microlitros (µl) de cada muestra, a ser 10 ensayada, resuspendida en 0.01% de ácido acético y 0.2% de albúmina sérica bovina (BSA) a diferentes concentraciones en microplacas de ensayo de 96 pozos con 45 µl de un cultivo conteniendo aproximadamente 1x105 bacterias por mililitro (mi). El crecimiento microbiano se monitoreó por medida de densidad óptica a 492 nm, en un lector BioRad EIA modelo 2550, después de incubar por 15 18 horas a 37°C. Como control positivo se usó BSA 0.2% con 0.1% de ácido acético, y como control negativo formaldehído al 0.4%. Las cepas usadas fueron obtenidas de la colección del Instituto Nacional de Salud Pública, México.
En la Fig. 7 se muestran los resultados de la aplicación de Hadrurina a cultivos 0 de microorganismos. La actividad antibiótica de la Hadrurina se probó en una serie de microorganismos, observándose una mayor sensibilidad en Escherichia coli 109, Enterococcus feacalis 51 y Serratia marscencens (ATCC) 13880 mientras que las dos cepas de Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus cloacaes 129 presentan una sensibilidad intermedia (los números después de la 5 especie corresponden a la numeración de cepa registrada por el Instituto
Nacional de Salud Pública o por la American Type Culture Collection ATCC). Los cultivos de Salmonella thypi y Klebsiella pneumoniae 9 presentaron una menor sensibilidad a la adición de Hadrurina, si bien se observa una inhibición a más altas concentraciones del antibiótico. Mientras que en el caso de Sacharomices 0 cerevisiae, se observa una inhibición importante del crecimiento.
En la tabla 1 se muestran las concentraciones mínimas inhibitorias MIC para cada uno de los cultivos ensayados. La Hadrurina sintética se ensayó en cultivos de Escherichia coli, Enterococcus feacalis 51 y Pseudomonas aeruginosa dando esencialmente el mismo resultado que el péptido nativo, lo que indica que la Hadrurina sintética debe tener el mismo plegamiento y actividad que la nativa.
TABLA 1. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de la Hadrurina en los diferentes microorganismos y células ensayados.
Para verificar el posible efecto lítico de la Hadrurina se utilizaron eritrocitos humanos frescos lavándolos tres veces con amortiguador salino de fosfatos (PBS), a pH 7.4, y centrifugando cada vez por 15 minutos a 900 x g. Se hizo una suspensión al 0.5% con PBS. Se incubaron 195 µl de esta suspensión en microplacas de ensayo de 96 pozos con 5 µl de péptido a diferentes concentraciones. Se utilizó como control positivo (100% de lisis) una solución al 1% del detergente Tritón X-100. Después de incubar por 1 hora a 37 °C se
centrifugó la muestra a 900 x g por 2 minutos y se leyó la absorbancia de 100 µl del sobrenadante a 541 nm en un espectrofotómetro Beckman DU-50. Encontrándose que Hadrurina a concentraciones en torno de 10 micromolar ya puede causar 20% de lisis a glóbulos rojos humanos. '5
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LISTADO DE SECUENCIAS
No. DE SECUENCIAS: 2 INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : l.- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS A) LONGITUD 41 aminoácidos B) TIPO aminoácidos D) TOPOLOGÍA lineal II.- TIPO DE MOLÉCULA péptldo III.- HIPOTÉTICA no IV.- ANTI-SENTIDO no V.- TIPO DE FRAGMENTO fragmento completo
VI.- FUENTE ORIGINAL (A) ORGANISMO Hadrurus aztecus (D) ESTADO DE DESARROLLO adulto
IX.- CARACTERÍSTICAS péptido maduro
(A) NOMBRE/CLAVE Hadrurina (B) LOCALIZACION de 1 a 41 aminoácidos (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN experimentalmente (D) OTRA INFORMACIÓN actividad antibiótica
Gly lie Leu Asp Thr lie Lys Ser lie Ala Ser Lys Val Trp Asn Ser 1 5 10 15
Lys Thr Val Gln Asp Leu Lys Arg Lys Gly lie Asn. Trp Val Ala Asn
25 30 Lys Leu Gly Val Ser Pro Gln Ala Ala 35 40
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS A) LONGITUD 123 pares de bases B) TIPO nucleótidos C) TIPO DE CADENA doble D) TOPOLOGÍA lineal II.- TIPO DE MOLÉCULA ADN III.- HIPOTÉTICA sí
IV.- ANTI-SENTIDO no
VI.- FUENTE ORIGINAL •-5 (A) ORGANISMO Hadrurus aztecus
(D) ESTADO DE DESARROLLO adulto
IX.- CARACTERÍSTICAS secuencia codificadora
(B) LOCALIZACION de 1 a 123 pares de bases
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN experimental 15 (D) OTRA INFORMACIÓN codifica para la Hadrurina, péptido con actividad antibiótica
GGN ATH YTN GAY ACN ATH AAR WSN ATH GCN WSN AAR GTN TGG AAY WS 48 Gly lie Leu Asp Thr lie Lys Ser lie Ala Ser Lys Val Trp Asn Ser 1 5 10 15 AAR ACN GTN CAR GAY YTN AAR MGN AAR GGN ATH AAY TGG GTN GCN AAY 96 Lys Thr Val Gln Asp Leu Lys Arg Lys Gly lie Asn Trp val Ala Asn 25 20 25 30 AAR YTN GGN GTN WSN CCN CAR GCN GCN 123
Lys Leu Gly Val Ser Pro Gln Ala Ala 35 40
Claims (10)
1. Un péptido aislado y purificado caracterizado por presentar una secuencia aminoácida SEQ ID NO: 1, o cualquier modificación o mutación funcionalmente equivalente de la misma.
2. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por: a) presentar un peso molecular de 4,435 Daltones por espectrometría de masas ; b) presentar un punto isoeléctrico calculado de 11.08, y c) no presentar en su secuencia aminoácida residuos de cisteína
3. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizador por ser : a) obtenido por aislamiento y purificación a partir del veneno del alacrán Hadrurus aztecus ; b) producido por síntesis química, o bien c) producido mediante métodos de DNA recombinante.
4. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por presentar una actividad antibiótica.
5. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado por inhibir el crecimiento de microorganismos preferentemente seleccionados del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus feacalis, Enterococcus cloacae, Klebsiella pneumoniae Salmonella thypi, Serratia marcencens y Sacharomices cerevisiae.
6. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido de conformidad con la reivindicación 4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, caracterizada porque administrada en una cantidad terapéuticamente efectiva a un mamífero afectado por una infección por microorganismos, inhibe el crecimiento de los microorganismos que provocan la infección.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, caracterizada porque los microorganismos cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus feacalis, Enterococcus cloacae, Klebsiella pneumoniae, Salmonella thypi, Serratia arcencens y Sacharomices cerevisiae
9. Un péptido antibiótico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 para su uso mediante la composición farmacéutica de las reivindicaciones 7 u 8 en el tratamiento de infecciones.
10. Un segmento de ADN que codifica para el péptido de la reivindicación 1, caracterizado por presentar una secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2 o una mutación funcionalmente equivalente.
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA98005522A true MXPA98005522A (es) | 2000-01-01 |
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