MXPA98001104A - Composicion terapeutica para infeccion por coxsackievirus b - Google Patents

Abstract

El objetivo de la presente invención es proveer una composición terapéutica para infección por coxsackievirus contra la cual no existen medios terapéuticos efectivos;este objetivo se logra mediante una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B que comprende interferón gamma como ingrediente activo.

Description

COMPOSICIÓN TERAPÉUTICA PARA INFECCIÓN POR COXSACKIEVIRUS B CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una composición terapéutica para enfermedades provocadas mediante infección por el coxsackievi rus B que comprende interferón gamma (t-IFN) como un ingrediente activo.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Los interferones (IFNs) actualmente se clasifican en tres grupos, principalmente alfa, beta y gamma. Entre ellos, el interferón gamma (t-IFN) es un IFN producido mediante la estimulación de linfocitos T sensibilizados mediante enlace antígeno o mediante estimulación de linfocitos T no sensibilizados por medio de un mitógeno o similares y también se llama interferón inmune. Dicho t-IFN está compuesto por 146 residuos de aminoácido. Es inestable al calor (56°C) y ácidos (pH 2) y, con electrofóresis con gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), se separa en dos fracciones, una con un peso molecular de 25,000 y la otra con un peso molecular de 20,000. Su secuencia de aminoácido y la secuencia de base correspondiente se diferencia distintivamente de los interferones del grupo alfa o beta. En 1981, Gray y otros, lograron introducir el gen t-IFN humano en Escherichia coli y en provocar la expresión de dicho gen en dicho hospedero y determinaron la estructura del gen y la secuencia de aminoácido completa de la proteína, revelando que tiene un peso molecular de 17,000 y que el grupo gamma comprende sólo una especia [Gray, P. W. y otros, Nature, 295, 503 (1982)]. Los interferones se descubrieron primero como substancias antivirales elaboradas mediante células en respuesta a la estimulación mediante virus etc. [Nagano, Y. & Kojima, Y., C. R. Soc. Biol., 148, 17000 (1954); Isaacs, A. & Linder ann, J., Proc. Roy. Soc. B. , 147, 258 (1984)]. Desde entonces, ha revelado que tienen actividad antitumoral [Ida, N., "Interferon no Kagaku (Science of Interferons)" , 11, Kidansha (1985), p. 44] al igual que varias actividades in unoactivadoras e inmunopotenciadoras tal como actividad potenciadora como asesino de células T, actividad potenciadora como asesino natural y actividad potenciadora de actividad ADCC. Los virus contra los cuales los IFNs, en particular t-IFN, muestran actividad antiviral incluyen según se informa virus de herpes simplex [Martin, J.B. y otros, J. Infect. Dis., 166. 1401-1403 (1992)], virus de hepatitis B [Mora, C. V., y otros, J. Interferon Resc, 6, Suppl. 1, 133 (1986)], etc. Sin embargo, hasta ahora no hay disponible información importante sobre el coxsackievi rus B. En la actualidad, en el campo de la medicina clínica, se usan los IFNs en el tratamiento de carcinoma de células renales, melanoma maligno, hepatitis crónica tipo C, hepatitis crónica tipo B, leucemia mielocítica crónica, mieloma múltiple, leucemia de células capilares, reumatismo, etc. El t-IFN se usa particularmente en el tratamiento de carcinoma de células renales y el melanoma maligno entre las enfermedades antes mencionadas. Además, también se ha realizado un intento por usar el r-IFN contra los fungoideos de micosisis. Los tres grupos anteriormente mencionados de IFN difieren en la actividad biológica. Todos los IFNs le dan potencia a la expresión de antígeno de clase I MHC. Por otro lado, la potencialización de la expresión de antígeno de clase I MHC no se encuentra en los grupos alfa y beta, sino que sólo se observa con el grupo gamma. Con respecto a otras actividades biológicas en las que se involucra el sistema inmunológico, el grupo gamma difiere en varios aspectos de los grupos alfa y beta; por ejemplo, el grupo gamma muestra una actividad más fuerte que la de los grupos alfa y beta. Por otro lado, coxsackievi rus pertenece a un grupo del género Ente rovi rus de la familia Picornavidae. Es un virus no cubierto (icosahedron regular) esférico con un diámetro de alrededor de 25 a 30 nm. Desde el punto de vista de la antigenicidad, se clasifica en dos tipos (A y B) y cada uno incluye además un número de serotipos. Como ejemplos típicos, se pueden mencionar coxsackievi rus Al a 24 y coxsackievi rus Bl a 6, los cuales son causantes de gastroenteritis viral. El virus tipo A también es causante de herpangina humana y enfermedad hand-foot-and-mouth, mientras que el virus tipo B es una fuente de infección de nefritis glomérulo proliferante y también es causante de pleurodinia epidémica. Además, ambos tipos son causantes de meningitis aséptica, miocarditis, pericarditis y diabetes melitos juvenil aguda. En particular, en la diabetes melitos juvenil aguda, se dice que una cierta variante de coxsackievi rus B4 destruye directamente las islas de Langerhans pancreáticas e induce diabetes melitos independientemente de las respuestas autoinmunes. En el campo del diagnóstico, se ha intentado un método para establecer infección viral de muestras de biopsia miocárdica de pacientes con miocarditis crónica usando el ADNc de coxsackievi rus. En el tratamiento de la miocarditis antes mencionada, además del descanso y alimentación, en casos leves se administran agentes antiinflamatorios, por ejemplo aspirina, y diuréticos. Además, considerando la miocarditis como un caso de anormalidad inmunológica, se ha sugerido que se administren agentes esteroidales o inmunosupresores tales como ciclosporina. Sin embargo, se ha informado que tales agentes experimental ente pueden provocar agravación. De esta manera, deben administrarse sólo en casos severos cuando no son efectivos otros medios terapéuticos y con cuidado. Mientras tanto, hay varios informes con respecto a la relación entre la miocarditis viral y los IFNs. Lutton y otros, informan que, en un modelo de ratón con miocarditis viral, el IFN beta murina (ß-IFN) si previene la infección viral en grupo s en los que la administración de ß-IFN se comenzó 24 horas antes o inmediatamente después de la inoculación con coxsackievi rus B3. Sin embargo, la administración comenzó 3 días después de la inoculación, dicha administración fue muy dañina [Lutton, C. W. & Gauntt, C. J., J. Interferon Res., 5, 137-146 (1985)]. Además, Matsumori y otros investigaron si el oc-IFN humano recombinante A/D administrado subcutáneamente o ratones infectados con coxsackievi rus B3 en una dosis de 10* U/g de ratón en el día anterior a la inoculación del virus e inmediatamente después de la inoculación podría evitar la réplica viral en el corazón del ratón infectado con el virus y mejorar el panorama histopatológico del corazón. Ellos confirmaron la inhibición de réplica viral y, con respecto a la mejoría del panorama histopatológico cardiaco, informaron que dicho IFN fue efectivo en la inhibición de infiltración de células inflamatorias al igual que de necrosis ce células miocárdicas [Matsumori, A., y otros Am. Heart J., 115, 1229-1232 (1988)]. Además, Ikada y otros, informan que, en una prueba in vitro en la cual se usan en combinación rivabirina y a-IFN humano recombinante A/D, el a-IFN humano recombinante A/D, incluso sólo, mostró actividad antiviral en contra del virus coxsackievi rus B3, el valor EDso siendo 42.1 IU/ml [Okada, U., y otros, J. Lab. Clin. Med., 120, 569-573 (1992)]. Por otro lado, Seko y otros administraron t-IFN a ratones infectados con coxsackievi rus B3 e investigaron la expresión del antígeno MHC en células miocárdicas mediante inmunofluorescencia y análisis de tinte northern. Informando que se observaron la expresión de antígeno de clase I MHC y expresión de antígeno de clase II MHC de nivel inferior, sugieren que la expresión de antígeno de clase I MHC induce la interacción entre las células miocárdica y los linfocitos T y en particular que los linfocitos T citotóxicos desempeñan un papel parcial en la lesión cardiaca inducida por infección viral [Seko, Y., Circulation Res., 67 (2), 360-367 (1990)]. Además, Seko y otros administraron t-IFN a ratones infectados con coxsackievi rus B3 como se describió en la referencia anteriormente citada y confirmaron la expresión de antígeno ICAM-1 en las células miocárdicas en un modelo de miocarditis aguda. De acuerdo con su informe, el tratamiento de anticuerpo anti-ICAM-1 inhibió la miocarditis inducida por coxsackievi rus B3 [Seko, Y., y otros, J. Clin. Invest., 91, 1327-1336 (19993)]. Smith y otros informan que la administración de anticuerpo anti-t-IFN a ratones A/J en los cuales se ha inducido miocarditis mediante la inmunización con miosina resultó en aumentos estadísticamente importantes en la severidad de la miocarditis en comparación con la inmunoglobulina G de rata y los grupos de control [Smith, S. C. & Alien, P. M. , Circulation Research, 70 (4), 856-863 (1992)]. Además. Kipshidze y otros detectaron anticuerpos para coxsackievi rus B y el virus de la influenza en pacientes con miocarditis viral finalmente muriendo. Informaron actividad a-disminuida y, en particular actividad t-IFN [Kipshidze, N. N., y otros, Ter. Arkh, . 60 (11), 43-46 (1988)]. Además, Durand y otros describen la relación entre el nivel de t-IFN producido por monocitos en pacientes con miocarditis inducida por infección con coxsackievi rus B4 o rabdomiolisis y los descubrimientos clínicos [Durand, J. M. & Soubeyrand, J., Rev. Med. Interne, 14/10, 1128 (1993)].

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A pesar de la existencia de informes acerca de la relación entre miocarditis por coxsackievi rus B y t-IFN, como se mencionó anteriormente, no hay informes sobre un efecto antiviral producido por la administración de t-IFN a pacientes con infección por coxsackievi rus B o sobre alivio o remisión de varios síntomas de infección viral como se logra mediante la administración de t-IFN. De esta manera, continua sin saberse si la administración de t-IFN es efectiva contra la miocarditis provocada por infección con coxsackievi rus B, en particular infección por coxsackievi rus B3. Por consiguiente, la presente invención tiene por objeto proveer una composición terapéutica para infecciones por coxsackievi rus B, particularmente la miocarditis y pericarditis asociadas con dicho virus, cuya composición comprende t-IFN como un ingrediente activo.

Los inventores de la presente hicieron investigaciones intensivas para lograr el objeto anterior y encontraron que cuando se administra t-IFN recombinante en contra de las enfermedades infecciosas anteriormente mencionadas, se pueden obtener índices de supervivencia significativamente mayores en comparación con los controles de infectados, con efectos inhibidores en el desarrollo de lesiones miocárdicas e importante disminución en el conteo de virus endocárdicos. Con base en estos descubrimientos, ahora han completado la presente invención. De esta manera, la presente invención provee una composición terapéutica para enfermedades provocadas por coxsackievirus B que comprende t-IFN como un ingrediente activo, además una composición terapéutica para enfermedades provocadas por coxsackievirus B en las que la infección por coxsackievirus B ocurre en el miocardio y/o pericardio cuya composición comprende t-IFN como un ingrediente activo, y además una composición terapéutica para enfermedades provocadas por coxsackievirus B en las que la infección por coxsackievirus B es infección por coxsackievirus B3 cuya composición comprende t-IFN como ingrediente activo. El t-IFN que se va a usar como un ingrediente activo en la composición terapéutica de la presente invención para enfermedades provocadas por infección con coxsackievirus B puede ser ya sea t-IFN natural o uno manejado mediante ingeniería genética (recombinante) a condición que tenga actividad t-IFN. Por lo general, el t-IFN natural se produce mediante un método que comprende recoger leucocitos humanos o cultivar células humanas comunes y después inducir las células a producir t-IFN usando PHA, ConA o similares como inductores [Nathan, I. y otros, Nature, 292, 842 (1982); Matuyama, M., y otros, J. Immunol., 129, 501 (1982)]. Para llevar a cabo el método antes mencionado, en muchos casos es difícil obtener células en grandes cantidades desde los puntos de vista técnico y de costo. Para crecimiento de celular de bajo costo, se ha desarrollado el método denominado de hámster (véase la publicación de la patente japonesa 63-1296 y la publicación de la patente japonesa 56-54158). De conformidad con dicho método, la multiplicación de las células T es provocada transplantando subcutáneamente células T de línea establecida a la espalda de hámsteres jóvenes dando por adelantado un in unosupresor. Después del crecimiento de la masa tumoral en la espalda del hámster alcance cierto tamaño, la masa tumoral se corta y desmenuza, se prepara una suspensión celular dispersando las células, las células T así preparadas se inducen a producir t-IFN usando PHA. El t-IFN obtenido mediante dicho método tiene la misma cadena de carbohidrato que la del tipo natural. Además, para producir t-IFN de manera estable y a un bajo costo, también se conoce un método que comprende cultivar un microorganismo con un gen t-IFN humano preparado por medio de la tecnología de ADN recombinante e introducido a dicho microorganismo [Gray, P., y otros, Nature, 295. 501 (1982)3.

Sin embargo, el t-IFN obtenido mediante dicho método no tiene cadena de carbohidrato. Mejor conocido, como un método para producir un polipéptido que tiene actividad de t-IFN humano, es el método descrito en la publicación de la patente japonesa 07-45516 y en la publicación de la patente japonesa 07-45515, se describe un método para producir un t-IFN humano novedoso. Los IFNs obtenidos mediante estos métodos pueden usarse como ingrediente activo de la composición de conformidad con la presente invención. El producido por medio del método del hámster es particularmente preferido para llevar a cabo la presente invención. En el uso clínico de la composición terapéutica de la presente invención para infección con coxsackievirus B, la cantidad diaria efectiva para cada adulto se puede seleccionar dentro de una escala amplia. Generalmente, cuando el t-IFN humano se usa como un ingrediente activo, por conveniencia dicha cantidad se selecciona dentro de la escala aproximada de 100,000 a 2,000,000 unidades internacionales por cuerpo por día. La composición terapéutica de la presente invención para la infección por coxsackievirus B que comprende t-IFN humano como ingrediente activo se puede usar en combinación con otra composición terapéutica para la infección por coxsackievirus B o también puede contener el compuesto de ingrediente activo de dicha otra composición. Como ejemplos, de tales compuestos de ingrediente activo, se pueden mencionar aquellos que se usan para miocarditis por coxsackievirus B, tales como aspirina, esteroides, ciclosporina e inmunosupresores similares, entre otros. Dicho uso combinado se espera que produzca efectos sinergísticos, que hacen posible reducir las cantidades de ambos fármacos para combinarse y reducir los efectos colaterales de los fármacos. De manera similar, la composición terapéutica de la presente invención puede contener un a-IFN o un ß-IFN o ambos. También es posible usar la composición terapéutica de la presente invención junto con una preparación terapéutica que contiene dicho otro t-IFN. Dicho uso combinado hace posible reducir la dosis de uno o ambos IFNs y reducir los efectos colaterales. Para los otros IFNs adecuados para el uso combinado anteriormente mencionado, por ejemplo IFN natural humano tipo-a e IFN natural humano tipo -ß, se han establecido métodos de producción a gran escala. De esta manera, conocido como un método para producir IFN natural humano tipo -IFN en una gran escala es el método que comprende usar, entre líneas celulares de leucemia aguda humana, células capaces de producir a-IFN de alta potencia mediante inducción viral (véase por ejemplo, la patente japonesa Kokai Tokkyo Kiho 55-47629; la patente japonesa Kokai Tokkyo Koho 55-62024). Con respecto a la producción de ß-IFN humano usando la tecnología de ADN recombinante, se pueden mencionar los métodos descritos en la solicitud de patente europea 81-28033, la solicitud de patente europea 81-321134, la solicitud de patente europea 81-837397, entre otras. Los demás agentes terapéuticos antes mencionados y/o otras preparaciones de IFN no necesitan administrarse siempre simultáneamente con la composición terapéutica de la presente invención pero se pueden administrar separadamente dentro del periodo en el que se puede esperar el efecto de la composición terapéutica de la presente invención. En el caso antes mencionado de administración combinada de IFNs, t-IFN, por ejemplo t-IFN humano, como el ingrediente activo de la composición terapéutica de la presente invención es conveniente administrarse en dosis de alrededor de 100,000 a 2,000,000 unidades internacionales por cuerpo, mientras que por conveniencia se usan a- y/o ß-IFN en combinación con t-IFN en una dosis diaria general de alrededor de 100,000 a 5,000,000 unidades internacionales por cuerpo. Cuando se usan a- y/o ß-IFN y t-IFN en combinación, la relación de dosis preferiblemente se selecciona entro de la escala de 1:1 a 10,000:1, preferiblemente 1:1 s 1,000:1, de mayor preferencia 5:1 a 100:1 (unidades). Se puede usar la composición terapéutica de la presente invención para infección por coxsackievirus B en varias formas de dosis que son convencionales en el campo de la técnica, de acuerdo con el propósito de su uso. En particular, en la práctica de la presente invención también es posible aumentar la estabilidad del ingrediente activo t-IFN usando albúmina de suero humano y/o un carbohidrato y un agente tensioactivo para producir las dosis. El carbohidrato mencionado anteriormente no se limita a ninguna especie en particular, pero su uso puede estar hecho de monosacáridos tales como glucosa, mañosa, galactosa y fructuosa, alcoholes de azúcar tales como manitol, inositol y xilitol, disacáridos tales como sacarosa, maltosa y lactosa, polisacáridos tales como dextrano e hidroxipropilal idón, etcétera. Estos pueden usarse ya sea de manera individual o en combinación como mezcla de dos o más. Particularmente preferidos entre ellos son la sacarosa, maltosa, manitol, inositol, dextrano y similares. El agente tensioactivo no se limita a ninguna especie en particular, ninguna. Generalmente se pueden usar agentes tensioactivos iónicos y no iónicos. Entre ellos, se prefieren tales agentes tensioactivos como esteres de polioxietilenglicolsorbitan de alquilo, éteres de polioxietilen de alquilo, esteres de sorbitan monoacílico, glicéridos de ácido graso y similares. El carbohidrato mencionado anteriormente se agrega adecuadamente en un nivel de adición de alrededor de 0.1 mg o más, de preferencia de alrededor de 1 a 100 mg, por microgramo (µg) del t-IFN mismo o un derivado de éste tal como se mencionó con anterioridad (en lo sucesivo referido colectivamente como "substancia activa de t-IFN") y el agente tensioactivo se agrega adecuadamente a un nivel de alrededor de 0.0001 mg o más, de preferencia de alrededor de 0.001 a 0.1 mg, por microgramo de la substancia activa d t-IFN. La albúmina de suero humano se agrega adecuadamente en un nivel aproximado de 0.001 mg o más, de preferencia de alrededor de 0.01 a 10 mg, por microgramo de la substancia activa de t-IFN. La composición terapéutica de la presente invención para infección por coxsackievirus B puede ser del mismo tipo que las composiciones farmacéuticas convencionales de este tipo. De esta manera, una o más de las demás ingredientes farmacológicamente activos o ingredientes comunes en la producción de preparaciones farmacéuticas pueden agregarse si se desea. Particularmente, además de aumentar la estabilidad de la substancia activa de t-IFN, se prefieren los agentes reductores que contienen azufre como los demás ingredientes que se pueden incorporar en la composición terapéutica de la presente invención par infección por coxsackievirus B. Los ejemplos preferidos y específicos de dichos agentes reductores que contienen azufre son dichos agentes reductores relativamente suaves como cisteína, N-acetilhomocisteína, ácido tiótico, ácido tioláctico, sales de estos, tiosulfato de sodio, ácido tiláctido, ditiotreitol, glutationa y similares. Estos pueden usarse solos o en combinación (dos o más). El nivel de adición de estos no está particularmente limitado, pero es adecuado de alrededor de 0.001 mg o más, de preferencia de alrededor de .01 a 10 mg (cuando se usan en combinación dos o más, la cantidad total), por microgramo de la substancia activos de t-IFN. También es apropiado que la composición terapéutica de la presente invención para la infección por coxsackievirus B de una forma de preparación isotónica estable isotinizando con un regulador de pH. Como ejemplos típicos del regulador de pH se que se pueden usar para este propósito, se pueden mencionar varias soluciones reguladoras de pH que tienen un pH de alrededor de 4 a 8, de preferencia de alrededor de 5 a 6, tales como citrato de sodio de ácido cítrico, fosfato de sodio de ácido cítrico y reguladores de pH de borato de sodio de ácido cítrico. La composición terapéutica de la presente invención para infección por coxsackievirus B por lo general se prepara en la forma de una preparación farmacéutica, por ejemplo mezclando una cantidad farmacológicamente efectiva de la substancia activa de t-IFN, junto con uno o más ingredientes específicos como los antes mencionados, con un vehículo apropiado para la producción de la preparación farmacéutica. Se pueden usar como vehículos farmacéuticos los excipientes o diluyentes que por lo general se usan en la producción de preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la forma de uso, incluso rellenos, extendedores, aglutinantes, agentes humectantes, desintegradores, etc. La forma de la preparación farmacéutica no se limita en particular a ninguna a condición de que contenga eficientemente el ingrediente activo. Dicha forma así incluye formas sólidas tales como tabletas, polvos, granulos y pildoras, al igual que formas de inyección tales como soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas pueden estar en la forma de productos secos que se pueden convertir en formas líquidas antes de usarse agregando un vehículo apropiado. Las preparaciones farmacéuticas apropiadas mencionadas con anterioridad pueden producirse mediante los métodos convencionales. Las preparaciones farmacéuticas así obtenidas se administran mediante una vía apropiada de acuerdo don la forma de las mismas. Por ejemplo, de esta manera cuando es una inyectable, se puede administrar de manera intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o intraperitoneal. Cuando es una preparación de forma sólida, se puede administrar de manera oral, rectal o a través del intestino. Cuando está en forma de una solución, suspensión o polvo, se puede usar como un inhalante o también una preparación nasal. Dicha administración puede conducirse una vez al día o divididamente en 3 a 4 veces al día. La administración de la composición terapéutica de la presente invención para la infección por coxsackievirus B, que comprende t-IFN como un ingrediente activo produce un efecto inhibidor en el desarrollo de lesiones miocárdicas y provoca una disminución importante en el conteo de virus endocárdico en la infección por coxsackievirus B, en particular en la miocarditis provocada por dicha infección viral, dando un índice de supervivencia significativamente más alto en comparación con los controles de infectados. De esta manera, dicha composición es útil como una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra gráficamente el efecto inhibidor en la pérdida de peso corporal como se produjo en ratones infectados con coxsackievirus B3 mediante la administración de t-IFN. La figura 2 muestra gráficamente el cambio en el índice de supervivencia y el efecto que prolonga el periodo de vida en ratones infectados con el coxsackievirus B3 mediante administración intratraqueal de t-IFN. La figura 3 muestra gráficamente el efecto inhibidor en la réplica viral endocárdica como se produjo en ratones infectados con coxsackievirus B3 mediante administración intratraqueal de t-IFN. La figura 4 muestra gráficamente la comparación del efecto inhibidor en la réplica viral endocárdica como se produjo en ratones infectados con coxsackievirus B3 mediante administración intratraqueal de t-IFN o un a/ß-IFN.

MEJORES MANERAS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos de referencia y ejemplos de trabajo son más ilustrativos de la presente invención.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 PREPARACIÓN DE t-IFN Se preparó t-IFN de conformidad con la publicación de la patente japonesa 63-1296 de la siguiente mane ra . (1) Multiplicación Celular Se cultivaron células BALL-1 en un medio RPMI-1640 (pH 7.2) que contiene FCS al 20% (suero fetal de becerro) a 37°C. Se lavó las células obtenidas con un medio RPMI-1640 libre de suero (pH 7.2) y después se suspendió en el mismo medio a una concentración de alrededor de 1 x 106 células/ml. Las células BALL-1 preparadas como anteriormente se usaron para inocular subcutáneamente hámsteres vecinos dando antisuero de conejo antes para suprimir respuestas inmunes. Los animales se alimentaron igual de manera normal durante alrededor de 3 semanas. Después, se extirpó y trituró la masa de células BALL-1 tumorales que creció subcutáneamente y se suspendió en una solución salina fisiológica que contiene tripsina para dispersar las células.

Se lavó las células obtenidas con un medio RPMI-1640 libre de suero y se suspendió en el mismo medio que contiene FCS al 10% en una concentración de alrededor de 1 x 106 células/ml para presentación al paso subsecuente de producción de t-IFN. (2) Producción de t-IFN Se agregó 100 mg de lipopolisacárido (LPS), como un inductor, a las células BALL-1 obtenidas como se mencionó anteriormente. Después, la producción inducida de t-IFN se provocó cultivando a 37°C durante tres días. Después del cultivó, las células se removieron mediante centrifugación y el filtrado se concentro por medio de ultrafiltración. El concentrado se purificó usando una columna de anticuerpo monoclonal. La muestra obtenida tuvo una actividad específica de 7.35 x 106 IU/mg de proteína.

EJEMPLO 1 Efecto de t-IFN en el modelo de miocarditis por coxsackievirus B (1) Construcción del modelo de miocarditis viral Se subcultivó en Hela (3 pasajes) y en ratones C3H/He (12 pasajes) en el laboratorio de Otsuka Pharmaceutical Co. usando un medio MEM de Eagle suplementado con suero fetal de becerro al 10% (en lo sucesivo referido como E-MEM al 10%), la cepa Nancy de coxsackievirus B3 (ATCC VR-30, SM/2+, MkK/14, cepa de generación subcultivada LLC-M2/3, obtenidas a partir el American Type Culture Collection: ATCC). El corazón de cada ratón sintomático se extirpó y trato en E-MEM al 10% para dar emulsión 10%. La emulsión se centrifugó y el sobrenadante se almacenó en un recipiente a temperatura ultrabaja a -80°C (cepa de abastecimiento, sobrenadante de emulsión de corazón de ratón infectado 10%) . La cepa de abastecimiento anterior se diluyó a 1.0 x 106pfu/ml. Se inoculó intraperiotonealmente ratones C3H/He sic machos de tres semanas de edad con la anterior dilución que contiene el virus en un tamaño de in culo d 0.1 ml . Los ratones para experimento antes mencionados se adquirieron de la firma SLC. Los ratones adquiridos se pesaron al día siguiente de su llegada y se agruparon por peso en 7 grupos cada comprendiendo 20 animales usando el programa de agrupamiento TRIM (sistema de procesamiento de datos edición compilador) y de está manera se agruparon en no infectados, control de infectados y grupos a los que se les dio INF para el experimento subsecuente. (2) preparación de t-IFN de murino. El t-IFN de murino usado fue t-IFN de murino recombinante (en adelante llamado m-tlFN) obtenido de Hayashibara Biochemical Laboratories, Okaya a Prefecture (número de lote: 004003). La actividad biológica de dicho m-tlFN era de 6.52 x 10* IU/ml (6.25 x 105 IU/mg de proteína). La actividad biológica de un m-tIFN ya conocido era de 7.5 x 105 IU/ g de proteína [Yoshida , T. et al., katei Igaku (Family Medicine), 8, Suppl. 2, 19-22 (1992)]. (3) Preparación de a/ß-IFN de murino. El a/ß-IFN de murino usado fue a/ß-IFN de murino natural (en adelante llamado m-a/&IFN) obtenido de Hayashibara Biochemical Laboratories, Okayama Prefecture (número de lote: 005). La actividad biológica de dicho m-a/ßlFN determinada en base a CPE usando la combinación de células L929 y VSV fue 6.95 x 107 iu/ml (3.56 x 10? IU/mg de proteína). (4) Administración de cada IFN a ratones infectados con virus. La concentración de m-tlFN se ajustó a 5 x 10* IU/ l usando solución salina fisiológica. Esto se diluyó más a 5 x 103 ó 5 x 10¿ IU/ml usando solución salina fisiológica-albú ina de ratón al 0.01%. La concentración de m-a/BIFN se ajustó a 5 x 103, 5 10A ó 5 x 105 IU/ml usando solución salina fisiológica-albúmina de ratón al 0.01%. Después de la inoculación con el virus al igual que en (1), los ratones fueron anestesiados con 0.1 ml/ratón de una dilución doble de Ketalar 50 (Sankyo-Zoki Kabushiki Kaisha) en solución salina inyectada en el músculo femoral de limbo oculto de cada ratón, y usando una micro jeringa (Microliter #710, Hamilton), se administraron 20 µl cada una de soluciones de m-tlFN) y m-a/ßIFN de las concentraciones anteriormente mencionadas respectivamente a la tráquea por medio de la laringe usando Mimi-Pick 33 (Pyro Electric Company) iluminación durante 4 días consecutivos después de la inoculación. Para evaluar el efecto prolongador de vida, los tiempos de supervivencia en los días fueron registrados hasta el día 21 después de la inoculación, los índices de supervivencia se probaron mediante el método de Kaplan-Meir y la homogeneidad de las curvas de la supervivencia se probó mediante la prueba de Wilcoxon generalizada. Sin embargo, para ajustar la multiplicidad se hizo la corrección de Bonferroni. Para la evaluación de dependencia a la dosis, se llevó a cabo la prueba de tendencia Cochran-Armitage (prueba C-A) usando los números de animales sobrevivientes y de animales muertos en el día 21 después de la inoculación. La evaluación del efecto antiviral, se extirpó el corazón 7 días después de la inoculación, se emulsificó en E:MEM al 10% y se cultivó en mono capas. Por medio de la prueba de placa usando células FL, se calculó la población de virus endocardíaco. La dosis efectiva se calculó mediante un análisis de variación de una forma (Anova) seguido por la prueba de Dunnett de dos residuos. Se evalúo el efecto mejorador del cuadro patológico como sigue. El corazón se extripó 7 días después de la inoculación y los especímenes patológicos del corazón fueron preparados. Las puntuaciones de lesión se determinaron como sigue. De acuerdo con el porcentaje de la lesión en base al área total de la sección del corazón (ventricular), el caso en el cual el porcentaje de la lesión fue menor del 25% fue calificado como +1; 25-50% como +2; 50-75% como +3; y más del 75% como +4. el índice de patología cardíaca se obtuvo dividiendo la puntuación total entre el número de especímenes examinados. Para una evaluación adicional de dependencia a la dosis, se graduaron las puntuaciones de lesión en <+3 y +4 o 1+2 y >+3, y se llevó a cabo la prueba C-A. Se calculó la dosis efectiva mediante la prueba de Mann-Whitney U. La evaluación se hizo después de la corrección de Bonferroni para multiplicidad. En todas las pruebas, se usó el nivel de 5% de significancia. A continuación se muestran los resultados obtenidos anteriormente, junto con los resultados obtenidos para el grupo al que se le administró albúmina de ratón al 0.01% sola (grupo de control infectado). a) Cambio del peso corporal del ratón. Los resultados se muestran en la figura 1 (ordinario: peso corporal medio (g); abscisa: número de días después de la inoculación). En la figura, las líneas en zigzag corresponden respectivamente a los siguientes grupos dosificados. En las figuras que aparecen después también, los grupos dosificados respectivos se indican por los mismos símbolos que los usados aquí . (1) - grupo de control infectado al que se le administró albúmina de ratón al 0.01% sola (n = 14) (2) - grupo dosificado con 100 IU m-a/ßlFN (n = 7) (3) - grupo dosificado con 1,000 IU m-a/ßlFN (n = 9) (4) - grupo dosificado con 10,000 IU m-a/ßlFN (n = 9) (5) - grupo dosificado con 100 IU m-a/ßlFN (n = 16) (6) - grupo dosificado con 1,000 IU m-cc/ßlFN (n = 15) (7) - grupo dosificado con 10,000 IU m-a/ßlFN (n = 12). Como se ve en la figura 1, se observó la dependencia a la dosis en los grupos a los que se le administró -tlFN intratraquealmente (linealidad: p = 0.005, desviación de la línea: p = 0.2418. Además, en el grupo 10,000 IU/ ratones (gráfica (7)) solo, la pérdida de peso corporal se inhibió significativamente en el nivel del 1%, presumiblemente debido a la administración de m-tlFN. b) índice de supervivencia y efecto prolongador de vida. Para los mismos grupos que los probados anteriormente en a), se muestran los resultados del análisis de índice de supervivencia en la figura 2 (ordinario: índice de supervivencia por ciento; abscisa: número de días después de la inoculación) usando las mismas leyendas que las usadas en la figura 1. Como se observa en la figura 2, los grupos que muestran un valor de índice de supervivencia más alto que el obtenido en el grupo de control infectado (gráfica (1)), 28.6% entre los grupos a los que se les administró intratraquealmente m-tlFN fueron como sigue: grupo de 100 IU m-rIFN (gráfica (5), 50%), grupo de 1,000 IU m-tlFN (gráfica (6), 80%) y grupo de 10,000 IU m-tlFN (gráfica (7), 100%). Más aún, la dependencia a la dosis se observó en los grupos m-tlFN en el nivel del 1% de significancia p = 0.0006). Se observó un efecto prolongador de vida en el grupo 1,000 IU y en el grupo 10,000 IU en el nivel del 1% de significancia (**: p = 0.0093 y p = 0.0012, respectivamente). La diferencia en el índice de supervivencia entre el grupo de 1,000 IU m-tlFN (gráfica (6)) y el grupo de 1,000 IU m-a/ßlFN (gráfica (3)) fue significativa en el nivel del 1% (**: p = 0.0024) y la diferencia entre el grupo de 1,000 IU m-tlFN (gráfica (6)) y el grupo de 10,000 IU m-cc/ßlFN (gráfica (4)) fue significativa en el nivel del 5% (*: p = 0.0225). La diferencia entre el grupo de 10,000 IU m-tlFN (gráfica (7)) y el grupo de 10,000 IU -ot/ßlFN (gráfica (4)) fue significativa en el nivel del 1% (**: p = 0.0015). De esta manera, cada comparación reveló el efecto prolongador de vida en cada grupo m-tlFN. Los resultados anteriores indican claramente que los grupos m-tlFN muestran un efecto significativo de prolongación de vida en comparación con los grupos m-a/ßlFN. c) Efecto inhibidor de replicación viral endocardíaca Los resultados de las pruebas para el efecto inhibidor de replicación viral endocardíaca se muestran en la figura 3 y en la figura 4 (ordinario: titulación de virus endocardíaco; abscisa: cada grupo dosificado). Como es claro a partir de los resultados mostrados en la figura 3, la replicación viral endocardíaca fue inhibida significativamente en el grupo al que se le administró intratraquealmente 10,000 IU/ratón de m-tlFN (gráfica /!) ) (3.6 ± 0.2 logio pfu/mg) en comparación con el grupo de control infectado (gráfica (1)) (4.9 ± 0.2 logio pfu/mg) al nivel del 1%. Más aún, el grupo de 10,000 IU/ratón de m-tlFN (gráfica (7)), cuando se comparó con los grupos m-a/ßlFN (gráficas (2), (3) y (4) mostrados en la figura 4), inhibió la replicación viral endocardíaca significativamente en el nivel del 1%. d) Efecto mejorador del cuadro patológico cardíaco. 1.- Lesión de la pared ventricular. En los grupos m-tlFN se notó una dependencia de dosis significativa en el nivel del 1% (p = 0.0006). Más aún, la lesión de la pared ventricular fue inhibida significativamente en el grupo 10,000 IU/ratón de m-tlFN (puntuación de lesión: +3.3 ± 0.8) en el nivel del 5% (p = 0.0161) en comparación con los ventrículos de ratón en el grupo de control infectado (puntuación de lesión: 3.9 ± 0.3). 2.- Necrosis de células miocardíacas. En los grupos m-tlFN se notó una dependencia de dosis significativa en el nivel del 1% (p = 0.0016). Más aún, la necrosis de las células ventriculares fue inhibida significativamente en el grupo al que se le administró intratraquealmente 10,000 IU/ratón de m-tlFN ((puntuación de lesión: +2.4 ± 0.7) en el nivel del 5% (p = 0.0170) en comparación con los ventrículos de ratón en el grupo de control infectado (puntuación de lesión: 2.9 ± 0.3). 3.- Infiltración de células inflamatorias No se observó una diferencia significativa entre los grupos a los que se les administró m-tlFN intratraquealmente y el grupo de control infectado. 4.- Formación de focos de calcificación En los grupos a los que se les administró -xIFN intratraquealmente, se observó una dependencia de dosis significativa en el nivel del 5% (p = 0.0164). Más aún, la formación de foco de calcificación sobre la pared ventricular fue inhibida significativamente en todos los grupos a los que se les administró m-tlFN intratraquealmente (100 IU/grupo de ratón, puntuación de lesión: +2.0 ± 0.4; 1,000 IU/grupo de ratón, puntuación de lesión: +2.1 ± 0.5; 10,000 IU/grupo de ratón, puntuación de lesión: +1.9 ± 0.6) en el nivel del 1% (p = 0.0001, p = 0.0004 y p = 0.0002, respectivamente) en comparación con los ventrículos de ratón en el grupo de control infectado (puntuación de lesión +2.9 ± 0.3). 5.- Fibrosis de la pared ventriculada Ninguno de los grupos inclusivos del grupo de control infectado mostró fibrosis de la pared ventricular.

Los resultados anteriores son evidencia definitiva del efecto prolongador de vida, del efecto mejorador de patología cardíaca y del efecto inhibidor de replicación de virus endocardíaco del t-IFN administrado intratraquealmente en el modelo de ratón con miocarditis B subaguda por virus Coxsackie. Particularmente, el índice de supervivencia, el efecto prolongador de vida, y el efecto inhibidor de replicación de virus endocardíaco fueron inesperada y significativamente superiores incluso cuando se compararon con a-/ß-IFN.

EJEMPLO 2 Efecto del uso combinado de t-IFN en el modelo de miocarditis B por virus Coxsackie (1) Construcción de un modelo de miocarditis viral. Se construyó un modelo de miocarditis viral de la misma manera que en el ejemplo l inoculando intraperitonealmente en ratones C3H/He sic de tres semanas con una dilución viral derivada a partir de una cepa obtenida subcultivando la cepa Nancy del virus Coxsackie B3 en Hela (3 generaciones) y ratones CH3/He (12 generaciones). 2.- Preparación de fármacos de prueba Se preparó una muestra de t-IFN de murino diluyendo m-tlFN (Hayashibara Biochemical Laboratories, Okayama Prefecture; número de lote: 004003; actividad: 4.74 x 105 IU/ml) a 1 x 105 IU/ml usando solución salina fisiológica y ajustando a 1 x 102 IU/ml usando albúmina de ratón al 0.01%-sólución salina fisiológica (0.01% mAlb). Las muestras de a- y ß-IFN de murino se prepararon diluyendo m-a/ßlFN (Hayashibara Biochemical Laboratories, Okayama Prefecture; número de lote: 005; actividad; 4.96 x 107 IU/ml) a 1 x 103 y i ?o* IU/ml usando 0.1% mAlb). 3.- Administración de cada IFN a ratones infectados con vi rus Los ratones modelo producidos en (1) fueron dosificados intramuscularmente con las soluciones de fármaco respectivas preparadas en (2) ya sea en forma sencilla o en combinación, o con la preparación de control mencionada posteriormente durante 4 días consecutivos después de la inoculación del virus. Grupo 1 - grupo de control infectado (se le administró 0.01% mAlb) Grupo 2 - grupo administrado con m-tlFN (10 IU/ratón) solo Grupo 3 - grupo administrado con m-a/ßlFN (1,000 IU/ratón) solo Grupo 3' - grupo administrado con m-a/BIFN (100 IU/ratón) solo Grupo 4 - grupo administrado combinadamente con m-tlFN y m-a/ßlFN (1,000 IU/ratón) Grupo 4' - grupo administrado combinadamente con m-tlFN y m-a/ßlFN (100 IU/ratón) 4.- Investigación de los efectos El aumento en el índice de supervivencia, los efectos inhibidores de la replicación viral endocardíaca y los efectos mejoradores del cuadro cardíaco obtenidos en la prueba se determinaron y se analizaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Los conteos virales endocardíacos se determinaron como sigue. Siete días después de la inoculación se extirpó el corazón asépticamente, se lavó con una solución salina fisiológica y se procesó en una emulsión al 10% (E-MEM al 10% 0.1 ml/corazón) usando Polytron (Kinematica AG, modelo K). El sobrenadante derivado de la emulsión (3000 rpm, 4ßC, durante 10 minutos) se diluyó en serie (10 niveles) con E-MEM al 10%. Las células de monocapa FL se inocularon con 0.1 ml de cada dilución y se sometieron a la prueba de placa. Después de la incubación a 37°C durante 4 días en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5%, se descartó el medio estratificado, se distribuyó una solución de formalina al 10% de pH regulado complementada con violeta de cristal al 0.05% en porciones de 1 ml y se llevaron a cabo la fijación y la tinción durante la noche a temperatura ambiente. Al siguiente día se descartó la solución de tinción, la placa se lavó con solución salina fisiológica y se secó, y después se contaron las placas. El control de virus (pfu/mg, límite de detección < 1 pfu/mg corazón) se calculó multiplicando el número de placas por el factor de dilución. Para análisis estadístico, se llevó a cabo el análisis unidireccional de variancia y después se realizó la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Se utilizó el nivel de significancia de 5% en la evaluación. Se utilizaron secciones patológicas de cada corazón extirpado 10 días después de la inoculación con el virus como muestras para la evaluación patológica del corazón. Además, de acuerdo con el reporte de Connell y otros [Connel, E.V. y otros, 1985, en The Biology of Interferon System; pp. 419-422 y Aapro, M.S. y otros, 1983, Cáncer Chemother. Pharmacol., 10, 161-166] utilizando el virus de la encefalomiocarditis y otros modelos de infección por virus, se examinó el efecto del uso combinado de m-tlFN y m-a/ßlFN determinando la muerte o sobrevivencia de cada ratón 21 días después de la inoculación, y juzgando si dicho efecto correspondía a sinergismo, aditividad o antagonismo (véase cuadro 1 a continuación). CUADRO I Sinergismo FMa + b < FMa x FMb Aditividad FMa + b = FMa x FMb Antagonismo FMa + b > FMa x FMb FM: Mortalidad; a, b: cada mlFN; a+b: uso combinado (6) Resul tados Los resul tados obtenidos se muest ran a continuación , punto po r punto . a) índice de sobrevivencia y efecto del uso combinado Como se muestra a continuación en el cuadro 2, se observó cierto incremento en el índice de sobrevivencia en el grupo de tratamiento con combinación (dos agentes) (grupo 4), comparativamente con cada grupo de tratamiento con agente individual de IFN (grupo 2 o grupo 3). Se sugirió que este efecto derivado de la combinación era un sinergismo.

CUADRO 2 Efecto del uso Mortalidad (FM) FMa x FMb combinado Grupo 2 (a) 19/20 (0.95) - - Grupo 3 (b) 18/20 (0.90) - - Grupo 4 (a+b) 15/20 (0.75) 0.86 Sinergístico b) Efecto inhibidor de la replicación viral endocárdica Los resultados se muestran en la figura 5. En el grupo con uso combinado (dos agentes) (grupo 4, n = 19), el conteo de virus endocárdico fue de 4.80 ± 0.2 logio pfu/mg. Comparativamente con el valor (5.1 ± 0.3 logio pfu/mg) obtenido en el grupo control infectado (grupo 1, n = 20), se determinó que este valor indica un efecto inhibidor significativo de la replicación viral endocárdica (p<0.01). También en el grupo de tratamiento con agente individual de m-a/ßlFN (grupo 3, n = 19), se observó substancialmente el mismo efecto. c) Examen histopatológico c-1) Infiltración de células inflamatorias Los resultados se muestran en el cuadro 3. Cada una de las pruebas descritas a continuación se llevó a cabo en 5 grupos, proveyéndose adicionalmente un grupo no infectado y un grupo no tratado. CUADRO 3 Grupo 5 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 n 10 19 19 20 18 Puntuación 0 10 0 0 0 0 +1 0 0 1 0 5 +2 0 8 15 6 8 +3 0 11 3 14 5 +4 0 0 0 0 0 Total 0 49 40 54 36 índice 0 2.6 2.1 2.7 2.0 Prueba* - - 0.0066 NS 0.0183 Prueba* = Prueba U de Mann-Whitney (sin embargo, siempre que se haga la corrección de Bonferroni para ajustar para multiplicidad). Las puntuaciones para las lesiones se obtuvieron como sigue. De acuerdo con el porcentaje de la lesión con base en el área total de la sección del corazón (sección ventricular), el caso en el que el porcentaje de la lesión fue menor de 25% se clasificó como +1; 25 a 50% como +2; 50 a 75% como +3; y 75 a 100% como +4. Es evidente a partir del cuadro 3 que comparativamente con el grupo control infectado (grupo 1), el grupo de tratamiento con dos agentes (grupo 4) mostró una inhibición significativa de infiltración de células inflamatorias en el nivel de 5% (p = 0.0183). Además, comparativamente con el grupo de tratamiento con agente individual de m-a/ßlFN (grupo 3), el efecto inhibidor obtenido en el grupo 4 fue significativo en el nivel de 1% (p = 0.0035). Sin embargo, el efecto obtenido en el grupo 4 fue ligero y no significativo, comparativamente con el grupo de tratamiento con agente individual de m-tlFN (grupo 2). c-2) Infiltración de células inflamatorias En lugar del grupo 3 (grupo de tratamiento con agente individual de m-a/ßlFN, 1,000 Ul/ratón), se estableció como grupo 3' un grupo que recibe 100 Ul de m-a/ßlFN/ ratón (n = 19). Después, la prueba anterior se repitió y se investigó y analizó estadísticamente la necrosis de las células del músculo cardíaco. Los resultados se muestran en el cuadro 4. CUADRO 4 Grupo Grupo rupo Grupo Grupo 5 1 2 3' 4' n= 10 19 18 19 17 Puntuación 0 10 0 0 0 0 +1 0 1 0 1 5 +2 0 6 9 7 11 +3 0 12 9 11 1 +4 0 0 0 0 0 Total 0 49 45 48 30 índice 0 2.6 2.5 2.5 1.8 Prueba* - - NS NS 0.0015 También es evidente a partir del Cuadro 4 que comparativamente con el grupo control infectado (Grupo 1), el grupo de tratamiento con dos agentes (Grupo 4') mostró una inhibición significativa de infiltración de células inflamatorias en el nivel de 1% (p=0.0015). Además, comparativamente con cualquier grupo de tratamiento con agente individual de mlFN (Grupo 2 y Grupo 3'), el Grupo 4' mostró una inhibición significativa de infiltración de células inflamatorias en el nivel de 1% (p=0.0045 y p=0.0045). c-3) Necrosis de células del músculo cardíaco Los resultados de la observación y el análisis de la necrosis de las células del músculo cardíaco en la prueba anterior utilizando el grupo 3' se presentan en el cuadro 5. CUADRO 5 Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo 5 1 2 3' 4' 10 19 18 19 17 Puntuación 0 10 0 0 0 0 +1 0 0 1 1 4 +2 0 4 2 2 10 +3 0 15 15 16 3 +4 0 0 0 0 0 Total 0 53 50 53 33 índice 0 2.8 2.8 2.8 1.9 Prueba* - - NS NS 0.0006 Es evidente a partir del cuadro 5 que comparativamente con el grupo control infectado (Grupo 1), el grupo de tratamiento con dos agentes (Grupo 4') mostró una inhibición significativa de necrosis de células miocárdicas en el nivel de 1% (p=0.0006). Además, comparativamente, con cualquier grupo de tratamiento con agente individual de mlFN (Grupo 2 y Grupo 3'), el grupo 4' mostró una inhibición significativa de células del músculo cardíaco en el nivel de 1% (p=0.0015 y p=0.0010). Los resultados anteriores sugieren que el efecto de incremento del índice de sobrevivencia del tratamiento de combinación con 1,000 Ul de m-a/ßlFN/ratón y 10 Ul de m-tlFN/ratón deriva el efecto antiviral provisto por 1,000 Ul de m-a/ßIFN/ ratón y el efecto inhibidor de 10 Ul de m-tlFN/ratón sobre la infiltración de células inflamatorias. Además, el efecto del tratamiento de combinación con 100 Ul de m-a/ßlFN/ ratón y 10 Ul de m-rIFN/ratón, es decir, el efecto inhibidor sobre la necrosis de las células del músculo cardíaco y la infiltración de células inflamatorias, es un efecto sinergístico de los dos fármacos. Los siguientes son ejemplos de preparación de la composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de la invención. En estos ejemplos, se utilizaron los siguientes agentes. 1) Solución patrón de IFN-t (Fabricada por Hayashibara Biochemical Laboratories): Una solución patrón en donde IFN derivado de células HBL-38 humanas (actividad específica de 10000000 Ul/mg) se disuelve en una cantidad de 1000000 Ul/ml en un regulador de pH de fosfato (pH 7.2) conteniendo 0.1% en peso/volumen de albúmina de suero humano como estabilizador. 2) Solución patrón de IFN-a (Fabricada por Hayashibara Biochemical Laboratories): Una solución patrón en donde IFN derivado de células BALL-1 humanas (actividad específica de 50000000 Ul/mg) se disuelve en una cantidad de 5000000 Ul/ml en un regulador de pH de fosfato (pH 6) conteniendo 0.1% en peso/volumen de albúmina de suero humano como estabilizador. 3) Esteres de ácido graso de sacarosa: Ester de ácido láurico de sacarosa, éster de ácido palmítico de sacarosa, éster de ácido esteárico de sacarosa y éster de ácido oleico de sacarosa (todos fabricados por Mitsubishi Chemical Food Co.).

EJEMPLO DE PREPARACIÓN 1 Se disolvió una cantidad de 50 mg de éster de ácido láurico de sacarosa en un 1 ml de solución patrón de IFN-t, y se añadió D-manitol a la misma. La mezcla se ajustó a relación osmótica de 2 y se liofilizó para producir una preparación inhalante de conformidad con la presente invención. Esta preparación se administra disuelta en 10 ml de agua antes de su uso.

EJEMPLO DE PREPARACIÓN 2 Se añadió una cantidad de 50 mg de éster de ácido láurico de sacarosa a solución de IFNs que contiene 1 ml de solución patrón de IFN-t y 2 ml de solución patrón de INF-a, seguido por isotonización con D-manitol, y la mezcla resultante se liofilizó para producir una preparación inhalante de la presente invención. Esta preparación se administra disuelta en 10 ml de agua antes de su uso.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B que comprende interferón gamma como ingrediente activo.

2.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el interferón gamma se selecciona de entre interferón gamma natural, interferón gamma tratado mediante ingeniería genética y un derivado de interferón gamma que tiene actividad de interferón gamma.

3.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B ocurre en el miocardio y/o pericardio.

4.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B ocurre en el miocardio y/o pericardio.

5.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B es infección por coxsackievirus B3.

6.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B que comprende interferón gamma e interferón alfa como ingredientes activos..

7.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el interferón gamma se selecciona de entre interferón gamma natural, interferón gamma tratado mediante ingeniería genética y un derivado de interferón gamma que tiene actividad de interferón gamma.

8.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B ocurre en el miocardio y/o pericardio.

9.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B ocurre en el miocardio y/o pericardio.

10.- Una composición terapéutica para infección por coxsackievirus B de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque la infección por coxsackievirus B es infección por coxsackievirus B3.