MXPA97007028A - Celulas sertoli como celulas de induccion de neurorecuperacion para trastornos neurodegenerativos - Google Patents

Abstract

Unmétodo para generar in situ la producción de factor trófico trasplantando células Sertoli a un tejido con la necesidad de factores tróficos de un mamífero, las células creando factores tróficos in situ.

Description

CÉLULAS SERTOLl COMO CÉLULAS DE INDUCCIÓN DE - NEURORECUPERACION PARA TRASTORNOS NEURODEGENERATIVOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente se refiere al transplante de células y específicamente a un método para transplantar células, el cual después del trasplante al sistema nervioso central, (CNS) reduce los déficits de comportamiento y funcionales asociados con trastornos neurológicos y neurodegenerativos. En el tratamiento de la enfermedad, por lo general es útil tratar el tejido localmente, en lugar de sistémicamente, con factores tróficos, particularmente áreas de daño del tejido como, por ejemplo, en la curación de heridas . Como ejemplo adicional, el transplante de tejido neural al sistema nervioso central de mamífero (CNS) se ha convertido en un tratamiento alternativo para trastornos neurológicos y neurodegenerativos, incluyendo epilepsia, ataque, enfermedad de Huntington, daño de la cabeza, daño espinal, dolor, enfermedad de Parkinson, deficiencias de rr.ieiina, trastornos neuromusculares, doler neurológico, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y trastornos afectivos del cerebro. Los datoe preclínicos y clínicos indican que las células transplantadas (injertos) utilizadas en protocolos de transplante de célula para estos tipos de enfermedades neurodegenerativas sobreviven y se integran con el tejido huésped, y proporcionan recuperación funcional. (Sanberg et al., 1994). La fuente principal de estos injertos ha sido el feto. Por ejemplo, se ha demostrado que el tejido mesencefálico ventral fetal es una fuente de injerto viable en la enfermedad de Parkinson (Lindvall et al., 1990; Bjorklund, 1992). Asimismo, se ha utilizado tejido estriatal fetal exitosamente como material de injerto en la enfermedad de Huntington (Isacson et al., 1986; Sanberg et al., 1994). Los animales neurológicamente con mal funcionamiento han sido transplantados con células no fetales y células no neuronales/tej ido. Por ejemplo, las células de cromafina de donadores adultos han sido utilizadas en el tratamiento de enfermedad de Parkinson. La principal ventaja de este tipo de protocolo de trasplante es que la fuente de injerto no es una fuente fetal y, de esta manera, evita los problemas ético y logísticos asociados con la adquisición de tejido fetal. Utilizando el protocolo de células de cromafina, se observa la normalización del comportamiento. Sin embargo, la recuperación funcional de este comportamiento es temporal y los animales regresan a su estado pre-trasplante (Bjorklund y Stenevi, 1985; Lindvall et al., 1987) . La inhabilidad de este tipo de protocolo de tratamiento para mantener la actividad de comportamiento normal en animales en el modelo de enfermedad de Parkinson, hace que la aplicación clínica de este protocolo así como otras terapias de tratamiento, sea prematura. La administración de factores de crecimiento como medios para tratar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas ha sido contemplada en la técnica. Sin embargo, el suministro de estos agentes al cerebro está lleno de dificultades enormes que tienen que ser exitosamente superadas. Generalmente, estos agentes no pueden ser administrados sistemáticamente y la infusión al cerebro es una solución no práctica e imperfecta. El diseño de ingeniería de células para suministrar factores específicos, tróficos individuales cuando se implantan en el cerebro, ha sido sugerido, pero la transfección estable y la sobrevivencia de células cuando se implantan en el cerebro continúa siendo problemática. Además, se ha reconocido enormemente que múltiples factores tróficos que actúan en concierto probablemente son necesarios para el tratamiento exitoso de condiciones neurológicas y neurogenerativas . El mantenimiento a largo plazo de la recuperación funcional se ha observado en un modelo de animal diabético utilizando un protocolo de tratamiento de transplante novedoso que utiliza células de isleta aisladas y células Sertoli. Es evidente que la eficacia del tratamiento se debe a la presencia de células Sertoli, en parte, debido a su factor de secreción inmunosupresor conocido. (Selawry y Cameron, 1993; Cameron et al., 1990). Las células Sertoli también se sabe que secretan un número de factores importantes de crecimiento tróficos. Por consiguiente, podría ser deseable utilizar células Sertoli sólo como una fuente para enfermedades, en donde es útil el crecimiento y el soporte de factor trófico del tejido dañado. Los ejemplos incluyen, curación de heridas y trastornos neurológicos incluyendo trastornos neurodegenerativos. Las células Sertoli pueden ser utilizadas para funcionar como una fábrica in si tu para factores tróficos para activar así la curación de heridas y reducir los déficits funcionales y de comportamiento asociados con trastornos neurológicos y neurodegenerativos. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para generar in si tu la producción del factor trófico mediante el transplante de células Sertoli a un mamífero, las células secretando factores tróficos in si tu . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Ctra= ventajas de la presente invención serán fácilmente apreciadas como la misma se vuelve mejor entendida haciendo referencia a la descripción detallada siguiente, considerando los dibujos anexos en donde: la Figura 1 es una gráfica que muestra los resultados del comportamiento rotacional inducido por apomorfina, animales de ambos grupos exhibieron rotaciones > 7 por minuto o, por lo menos, un total de 210 rotaciones por 30 minutos (contralateral a la lesión) cuando se trató con apomorfina de pre-trasplante, durante periodos de posttrasplante, los animales que recibieron los medios solos continuaron exhibiendo rotaciones significativas, en contraste, los animales que recibieron células Sertoli tuvieron reducciones marcadas, (más del 60%) en su comportamiento rotacional a través de los periodos post-trasplante; la Figura 2 es una gráfica que muestra el comportamiento oscilante desviado, animales de ambos grupos exhibieron > 80% con actividad oscilante desviada (contralateral a la lesión) según se reveló a través de la prueba de oscilación de cuerpo elevado, en periodos de posttrasplante, los animales que recibieron solo el medio continuaron exhibiendo actividad oscilante desviada significativa, en contraste, los animales que recibieren las células Sertoli no exhibieron ningún comportamiento oscilante de desviado a través de los periodos de post-trasplante : las Figuras 3A-C son micrografías de luz ilustrando células del mesencefalo ventral de ratas fetales (VM) aislado y cultivado durante siete días en un medio de control (CM) o medio preacondicionado de células Sertoli (SCM) y se fotografiaron con óptica de contraste de interferencia, decampo oscuro, en donde (A) representa células VM incubadas en CM que no muestran ninguna evidencia de estimulación o diferenciación, (B) representa células VM incubadas en SCM apareciendo altamente estimuladas, y (C) a una amplificación mayor, representa células VM incubadas en SCM exhibiendo crecimiento excesivo de neurita como resultado de los factores tróficos que secretan Sertoli; las Figuras 4A-B son micrografías de electrón ilustrando (A) el estriato del cerebro mostrando el tracto de penetración (flechas) y el sitio de transplante de células Sertoli, y (B) muestra el área en una caja en (A) en una amplificación superior, con resolución superior, las células Sertoli (flechas) son fácilmente identificadas, debido a las inclusiones del lecho de látex de lµ, las cuales fueron cargadas en las células antes del trasplante; y las Figuras 5A-B son son dos micrografías de luz ilustrando células Sertoli injertadas in si tu marcadas con una etiqueta fluorescente (Dil) antes de su trasplante al estriato del cerebro, en donde (A) representa célulae Sertcli fluorescentes, viables en un huésped rata que no recibió terapia de inmunosupresión con ciclosporina A (CsA) , y (B) muestra células Sertoli fluorescentes, viables en ei huésped rata que recibió la terapia de inmunosupresión de ciclosporina A. Generalmente, la presente invención provee un método para promover la reparación, protección y soporte del mal funcionamiento de tejido a través de mecanismos que incluyen la producción in si tu del crecimiento derivado de células Sertoli y factores de regulación referidas generalmente como factores tróficos. Además el método de la presente proporciona un método para generar in si tu la producción del factor trófico. Esto se logra trasplantando células Sertoli aisladas en un mamífero, las células secretando factores tróficos in si tu . Un beneficio significativo de utilizar células Sertoli como una fábrica in si tu para producir factores tróficos es que las células Sertoli han sido mostradas que presentan un efecto inmunosupresor efectivo. Por consiguiente, la terapia auxiliar concomitante para producir inmunosupresión no es requerida. En otras palabras, las células Sertoli pueden ser utilizadas como una fuente de factor trófico mientras que también proporcionan un efecto inmunosupresor local autoinducido. Los factores trópicos secretados por las células Sertoli incluyen factores de crecimiento y reguladores derivados de células Sertoli, tales como factores de crecimiento de tipo insulina I y II, factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento de transformación a y ß, e interleucina la (Griswold, 1992) . Para lista más extensa de factores de secreción de células Sertoli se hace referencia a la Tabla 1. Tales factores se ha mostrado que tienen un efecto curativo en los déficits de comportamiento y funcionales asociados con las enfermedades neurodegenerativas. Estos factores son factores trópicos bien conocidos que soportan el metabolismo y función de célula normal y tejido. (Griswold, 1992). La presente invención utilizó el fenómeno de que las células Sertoli pueden producir un microambiente de fluido de soporte de crecimiento, enriquecido, trófico, en el sitio del mal funcionamiento celular o daño celular/tejido. El daño celular/tejido puede incluir, pero no se limita a, daño por radiación, quemaduras y heridas. En contraste al protocolo de trasplante de células Sertoli/célula de isleta utilizado en el modelo diabético, el método de la presente invención utiliza solamente un tipo de célula, es decir, célula Sertoli, reduciendo así significativamente los problemas logísticos y de procedimiento inherentes al intentar trasplantar dos tipos de célula diferentes en un sitio huésped. Aunque se utilizaron células Sertoii de rata en los siguientes ejemplos, se pueden utilizar células Sertoli de cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, se pueden utilizar células Sertoli de humano para el trasplante en seres humanos. Además, en una modalidad preferida de la presente invención, se pueden trasplantar células Sertoli de porcino en un mamífero, tal como un ser humano. Además, se contemplan los usos veterinarios de la presente invención y las células Sertoli alogénicas pueden ser seleccionadas para el trasplante al huésped mamífero deseado. Como se demuestra en la sección experimental más adelante, la presente invención puede ser utilizada como un tratamiento para aliviar los déficit de comportamiento y funcionales asociados con las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Huntington y ia enfermedad de Parkinson. Esto se puede lograr sin los efectos laterales concomitantes de la terapia auxiliar inmunosupresora previamente utilizada, tal como el uso crónico de ciclosporina A. La célula Sertoii, para proporcionar tanto la secreción como los factores trópicos y el efecto inmunosupresor.. Como se muestra en los ejemplos más adelante, el trasplante de células Sertoli antes de la inducción o fcrtr.ación de una lesión cerebral, puede propcrcicr.ar un efecto neuroprotector. Por ejemplo, como se demuestra más adelante, la implantación de células Sertoli antes de la inducción de una enfermedad del tipo Huntingtcn prcpcrcionó efectos tanto neuroprotectores como profilácticos en la lesión subsecuente del cerebro. Por lo tanto, la implantación de células Sertoli en forma temprana siguiendo el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa puede proveer un tratamiento útil, prevención o reducción de la enfermedad. Además, las células Sertoli pueden ser trasplantadas en otros tipos de traumas del CNS tales como daño de la cabeza para tratar, evitar y/o profilácticamente reducir los efectos del daño en el CNS. Los siguientes ejemplos demuestran la capacidad de la presente invención para reducir los déficits de comportamiento asociados con trastornos neurodegenerativos. Ejemplo 1: TRASPLANTE DE CÉLULAS SERTOLl Protocolo Específico: El protocolo generalmente implica dos pasos básicos, (1) aislamiento de células Sertoli y (2) trasplante de célula, ambos de los cuales brevemente se describen en lo siguiente (para mayores detalles con respecto al aislamiento de células, véase Selawry y Cameron (1993) y para detalles con respecto al trasplante de célula, véase Pakzaban et al. ;i5 3) arios incorporados para referencia. (ÍA) Aislamiento de células Sertoi El procedimiento de aislamiento sigue un rétodc bien definido por Selawry y Cameron, (1993) y se utiliza por rutina. El medio de cultivo de célula es utilizado en ios pasos de aislamiento y en donde las células se incubaron fue DMEM: Hams F12 suplementado con retinol, ITS y sulfato de gentamicina (Cameron y Muffly, 1991) . Quirúrgicamente se recogieron testes de ratas Sprague-Dawley macho de 16 días de edad. Las testes se descapsularon y se prepararon para digestión enzimática para separar otros tipos de célula testiculares de las células Sertoli. El procedimiento enzimático utilizó colagenasa (0.1%), hialuronidasa (0.1%), y tripsina (0.25%), el cual es un procedimiento típico utilizado en muchos protocolos de aislamiento de célula. Después de la digestión enzimática secuencial, el aislado de células Sertoli se lavó con el medio de cultivo, se transfirió a vasos de cultivo estériles y se colocó en un incubador de cultivo de tejido humedecido, 5% de CO2 - 95% de aire. Después de 48 horas de pre-incubación en un incubadora 39°C, las células Sertoli se lavaron para remover cualquier desperdicio contaminante. La fracción enriquecida con células Sertoli resultantes se volvió a suspender en 0.25 ml del medio DMEM/F12 y se incubó a 37°C durante por lo menos 24 horas. Las células Sertoli después ee liberaren del piso de recipiente con tripsina, se transfirieren a un tubo de prueba cónico estéril, y se lavaron repetida-ente mediante centrifugación y se trataron con inhibidor de tripsina para cesar la acción enzimática de la tripsina. Durante el día del trasplante, la fracción enriquecida con células Sertoli se volvió a suspender y se succionó utilizando una jeringa Hamilton con un aguja espinal con un calibre de 20. (IB) Aislamiento y Pretratamiento de Células Sertoli Alternativamente, como se describió antes (Cameron et al. 1987a; Cameron et al. 1987b) los testes de rata descapsulados se sometieron a tratamiento enzimático secuencial a 37°C utilizando 0.25% de tripsina (Sigma) y 0.1% de colagenasa (Sigma, tipo V) . (Cameron et al. 1987a; Cameron et al. 1987b) . El agregado de células Sertoli resultante se distribuyo igualmente en un volumen de 20 ml de medio de incubación en matraces de cultivo de tejido de 75 cm2 (Costar) . Los agregados de Sertoli en placas se incubaron a 39°C en 5% de C02 - 95% de aire durante 48 horas, después de los cual las célula se sometieron a tratamiento hipotónico con regulador de pH de 0.5 mM Tris-Hcl estéril durante un rr.inuto (Galdieri et al. 1981) para acelerar ia remoción de células de germen de contaminación. Después de dos lavados con el medio de incubación, los matraces se llenaron con 20 ml del medio de incubación y se regresaron ai incubador inyectado con C02 a 37C en 5% de CO- - ??% ie aire. Los monocultivos enriquecidos con células Serteii pretratados resultantes contuvieron más de 95% de células Sertoli. La densidad en la placa (< 2.1 X 1C€ células =ertelt/ c-.2) no dio como resultado ninguna monocapa confluente de células. (2) Trasplante de Células El protocolo de trasplante sigue el procedimiento previamente descrito (Pakzaban et al., 1993). Se realizó la cirugía de animal bajo condiciones estériles. Todos los animales se anestesiaron inicialmente con 0.60 ml/kg de pentobarbital de sodio y después se colocaron en un instrumento esterotáxico Koph. Se realizaron trasplantes estriatales unilaterales utilizando un fijación de coordenadas a: anteroposterior = +1.2, mediolateral = +/-2.8, dorsoventral = 6.0, 5.9 y 5.8 (basado en el atlas de Paxinos y atson, 1984) . El estriato ipsilateral a la nigra sustancia lesionada se trasplantó con células Sertoli. Cada estriato recibió un volumen total de 3 µl de suspensión de células Sertoli. Un microlitro de la suspensión de células Sertoli se hizo penetrar un durante un rr. nuto en el sitio dorsoventral. Los controles solamente recibieron el medio. Otros cinco minutos se dejaron después ?e llegar al último sitio dorsoventral antes de retraer la aguja. Después de cirugía, los animales fueron colocados en almohadillas de calentamiento para recuperación. Los animales recibieron un curso corto de inmunosupreeió utilizandc ciele=porina-A (20 mg/kg/d, i.p.) inmediatamente después de la cirugía y al día siguiente del trasplante. Sin embargo Los estudios subsecuentes demostraron que este curso corto de ciclosporina-A no es necesario (Figura 5A-B) .

Las células Sertoli se trasplantaron en modelos de animal de varios trastornos neurodegenerativos a través de coordenadas esterotáxicas definidas para el trastorno específico, como se ilustra en el ejemplo de la enfermedad de Parkinson, y después se analizaron sistemáticamente para la recuperación funcional a través de técnicas específicas a aquel modelo animal. El estudio de la presente utilizó ratas Sprague-Dawley macho, de ocho semanas de edad con hemiparkinsonismo inducido con 6-OHDA (n=12) . A las tres semanas de post-lesión, los animales fueron sometidos a pruebas de comportamiento que incluyeron el comportamiento rotacional inducido por apomorfina y el comportamiento oscilante. Los datos de línea de base mostraron un comportamiento rotacional inducido por apomorfina significativo (contrahacer al lado lesionado del CNS) en todos los animales (por lo menos 200 giros durante 30 minutos) . Utilizando ia prueba oscilante de cuerpo elevado (EBST) , también se observó una actividad oscilante desviada a la derecha significativa (más de 70%) . En la tres semanas de post -lesión, un grupo de animales (n=6) recibió célula Sertoli y un grupo de animales (n=6) se sometió al mismo procedimiento quirúrgico, pero solamente recibió el medio (DMEM sin suero) como controles.

Todos los animales recibieron cicieeperina ;200 mg/kg) durantes los dos primeros días después del trasplante. Al mes, al mes y medio y a los dos meses después del trasplante, los animales otra vez fueron introducidos en las mismas pruebas de comportamiento. Los animales que recibieron células Sertoli exhibieron reducciones significativas en rotaciones (media de 50 vueltas durante 30 "minutos) mientras que los animales que recibieron solo el medio estuvieron en un nivel rotacional de Pre-trasplante (Figura 1) . La normalización del comportamiento de rotación persistió a través de un periodo de 2 meses de prueba. La actividad oscilante desviada a la derecha previamente exhibida por las células Sertoli en animales trasplantados también se redujo significativamente en sesiones de prueba después del trasplante (Figura 2) . Los animales que recibieron el medio no mostraron ninguna reducción significativa en sus respuestas oscilantes desviadas a la derecha. En la autopsia, se removieron les cerebros de los animales y se fijaron para el seccionamiento de vibratoma en 40-80 µm. Después de la tinsión, se presentó una reducción marcada de células glialee activadas en el sitio de penetración (es decir, sitio de lesión'. en ratas trasplantadas con células Sertoli cuando se compararon con el sitio de penetración en los animales lesionados no trasplantados con células Sertoli.

EJEMPLO 2: CRECIMIENTO DE CÉLULAS NEURALES Incubación del medio y medio preacondicionado de células Sertoli El medio de incubación utilizado para el cultivo de células Sertoli y co-cultivo fue el Medio Esencial Mínimo de Dulbecco: Medio Nutriente :Hams F12 ( hittaker Bioproducts) mezclado con 1:1 y suplementado con 3 mg/ml de L-glutamina (Sigma, grado III), 0.01 cc/ml de insulina-transferrina-selenio (ITS Collaborative Research, Inc.), 50 ng/ml de retinol (Sigma), 19 µl/ml de ácido láctico (Sigma) y 0.01 cc/ml de sulfato de gentamicina (Gibco) . Después del periodo de incubación de las primeras 48 horas de células Sertoli aisladas, se recogió el medio y se centrifugo a 500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió e inmediatamente se congeló en tubos de ensayo estériles. Este medio se identificó como el medio preacondicionado de Sertoli (SCM; . Aislamiento e incubación de células de cerebro fetal Se recogieron células de cerebro fetal (FBC) del mesencefalon ventral de ratas fetales (15-17 días de gestación) . El tejido de cerebro fetal se suspendió en el medio e inicialmente se dispersó haciéndolo pasar a través de una serie de agu:ae hipodérmicas dimensionadas secuencialmente en reducción (calibre 18-26). La suspensión resultante se trató con 0.1% de tripsina durante 5 minutos y seguido por 0.1% de inhibidor de tripsina durante dos minutos. El FBC se suspendió y se lavo tres veces, se volvió a suspender en el medio de incubación y se colocó en recipientes de cultivo revestidos con poli-L-lisina. Las células del mesencefalon ventral de las ratas fetales (VM) se aislaron y se cultivaron durante 7 días en un medio de control (CM) o medio preacondicionado de células Sertoli (SCM) como se muestra en la Figura 3A. Las células VM incubadas en CM no mostraron ninguna evidencia de estimulación celular o diferenciación. Haciendo referencia a la Figura 3B, las células VM incubadas en SCM fueron altamente estimuladas. La Figura 3C ilustra que a una aplicación mayor, la células VM incubadas en SCM muestran un crecimiento de neurita como una respuesta a los factores tróficos secretados por la célula Sertoli. EJEMPLO 3: IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS SERTOLl Incorporación de perlas látex: Las células Sertoli se aislaron y se prepararon para incubación como se describió. Antes del trasplante (aproximadamente 12 horas' se agregaron perlas de látex de 1 µm (lOµl/ml medio; Peleo, Tustin, CA) al medio de incubación. La célula Sercoli rápidamente fagocitaron las perlas. Inmediatamente antes del trasplante, las células Sertoli en perla se lavaron (3 veces) y se volvieron a suspender en 1 ml del medio de incubación. Haciendo referencia a la Figura 4A, las células Sertoli fueron trasplantadas en el estriato del cerebro, en donde el tracto de penetración (flechas) y el sitio de trasplante de células Sertoli se muestran. A una amplificación mayor como se muestra en la Figura 4B, las células Sertoli (flechas) fueron fácilmente identificadas debido a la inclusión de 1 µ perlas de látex las cuales fueron cargadas en la células Sertoli antes del trasplante.

EJEMPLO 4: EFECTOS DE CICLOSPORINA A (CSA) EN LA SOBREVIVENCIA DE CÉLULAS SERTOLl TRASPLANTADAS Etiquetación de célula fluorescente: Inmediatamente antes del trasplante (aproximadamente dos horas) , se trataron monocultivos de células Sertoli con colorante fluorescente CM-Dil para el rastreo de células (100 µl de abastecimiento/ml de medio; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) durante 7 minutos a 37°y después se colocaron a 4°C durante 15 minutos adicionales. Las células Sertoli "etiquetadas" fluorescentes se lavaron (3X) y se volvieron a suspender en 1 ml del medio de incubación. Se examino el efecto de ciclosporina A en la sobrevivencia de células Sertoli injertadas. Las células Sertoli injertadas fueron etiquetadas con una etiqueta fluorescente (Dil) antes del trasplante en el estriato del cerebro. El tejido se recogió un mes después del trasplante. Haciendo referencia a la Figura 5A, se ven células Sertoli fluorescentes viables en un huésped rata que no recibió terapia de inmunosupresión con ciclosporina A. Haciendo referencia a la Figura 5B, se muestran células Sertoli fluorescentes viables en un huésped rata que recibió la terapia de inmunosupresión de ciclosporina A. Este ejemplo demuestra que la ciclosporina A no es necesaria para la sobrevivencia de células Sertoli trasplantadas en el cerebro. EJEMPLO 5: EFECTOS PROFILÁCTICOS DE CÉLULAS SERTOLl El trasplante de células Sertoli es neuroprotector cuando se implantan antes de la inducción de células de lesiones en el cerebro. Este efecto profiláctico de células Sertoli fue demostrado en un modelo de animal para la enfermedad de Huntington (HD) . Este modelo se produjo a través de administración sistémica del inhibidor mitocondrial, ácido 3-nitroproprónico (3NP) . Se ha demostrado mediante Sanberg y sus colegas (Kotouz et al. 1994; Borlongan et al. 1995) y otros que la inyección de 3NP ocasiona lesiones específicas dentro del estriato, las cuales se asemejan a la patología vista en la enfermedad de Huntington. En el experimento de la presente, 8 ratas fueron trasplantadas con células Sertoli de rata (como se describió previamente) unitariamente en un estriato de ratas normales.

Por lo tanto, un lado del cerebro tuvo células Sertoli y el otro lado no tuvo. Un mes después, los animales fueron inyectados con 3NP como se describe anteriormente (Koutouzis et al., 1994; Borlongan et al. 1995) para inducir HD. Las ratas normales fueron inyectadas con 3 NP demuestran el daño bilateral del estriato del cerebro y tienen déficits de comportamiento los cuales son iguales en ambos lados del cuerpo (Koutouzis et al., 1994; Borlongan et al. 1995). Un mes después de la administración de 3NP, los animales demostraron déficits de comportamiento unilaterales, esto se observó a través de la demostración de rotaciones inducidas por apomorfina después de la lesión en animales trasplantados con Sertoli, pero no en los controles (número de rotaciones; controles = 0.25±.6; Sertoli transplantada = 197+31.9, p <.0001). Este comportamiento rotacional asimétrico es indicativo de una lesión en el lado del cerebro que no fue trasplantado con células Sertoli. Por lo tanto, los implantes de células Sertoli, mecanismo tróficos vis a vis, tienen efectos neuroprotectores y profilácticos en lesiones subsecuentes del cerebro. Esto proporciona la evidencia de que el trasplante de Sertoli también puede ser útil para tratar para tratar enfermedades neurodegenerativas en forma temprana, antes de que se presente el daño significativo.

Estos resultados, to ados conjuntamente, muestran que las células Sertoli reducen los déficits de comportamiento y funcionales de los modelos animal de enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. El mecanismo implicado probablemente es la secreción de los factores de crecimiento derivados de células Sertoli, como se demuestra a través del brote de tejido neural como se muestra en el Ejemplo 2, y factores de regulación que promueven la reparación y el soporte prolongado del tejido nervioso relevante. Además, las células Sertoli pueden proteger y promover la reparación del tejido nervioso en el cerebro inhibiendo la activación de células gliales en el sitio de la lesión. Estos resultados también demuestran la viabilidad in situ de células Sertoli trasplantadas. A través de esta solicitud, se presentan varias publicaciones en cita o número. Todas las citas para la publicación se enlistan a continuación. La descripción de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan a la presente para referencia en esta solicitud con el fin de describir rr.áe completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. La invención ha sido descrita en una forma ilustrativa, y se debe entender que la terminología utilizada pretende ser de la naturaleza de la descripción en lugar de limitación.

Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto se debe entender que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención pueda ser practicada de una forma distinta a la específicamente descrita. TABLA 1 I. Crecimiento Derivado de Células Sertoli y Factores de Regulación (Lista Parcial) Categoría y Proteína Función Hormonas/factores de crecimiento Inhibición de sustancia para inhibe el ducto de inhibir Muleriana muleriana que inhibe Factor de crecimiento del la liberación de FCH tipo insulina (Somatomedinas A y C, IGF) Factor de crecimiento Prodinorfina Interleucina-IÁ mitogeno Factor de crecimiento de trans- Factores de crecimiento formación Á y ß Factor de crecimiento de Factor de crecimiento fibroblasto básico Factor del tipo LHRH Estereoidogénesis de (no purificado o incompletamente célula Leydig caracterizado Factor de crecimiento secretado Factor de crecimiento de Sertoli Factor de crecimiento seminífero Actividad de estimulación de célula Leydig Testinas Proteínas CMB Proteínas de unión de vitamina Transporte de vitamina Transporte y bioprotección Trasferina Transporte de fierro Ceruloplasma Transporte de cobre Saposina se une a glicosfino- lípidos SGP-2 (Clusterina) Transporte de lípido Proteína de unión de andrógeno Transporte de T y DHT SPARC proteína de unión de calcio Proteína de unión IGF Transporte de IGF Proteína de unión de riboflavina Transporte de riboflavina Proteasas e inhibidores de proteasa Activador de plasminógeno proteasa Proteína 2 cíclica inhibidor de proteasa cistatina inhibidor de proteasa Á2-macroglobulina inhibidor de proteasa colagenasa de tipo IV proteasa etaloproteinasas proteasa Membrana de base colágeno IV laminina Proteoglicanos REFERENCIAS C?TADAS Bjorklund and Stenevi, "Intracerebral neural grafting: a historical perspective" in Bjorklund, A. and U. Stenevi, eds. Neural qrafting in the mammaljan CNS, Amsterdam: Elsevier, 3-11 (1985) . Bjorklund, "Dopaminergic transplants in experimental Parkinsonism: Cellular mechanisms of graft-induced functional recovery" Current Biolocry, 2:683-689 (1992) . Borlongan et al. "PR: Systemic 3-nitropropionic acid: Behavioral déficits and striatal damage in rats", Brain Research Bulletin, 36:549-556 (1995). Cameron et al., "Successful islet/abdominal testis transplantation does not require Leydig cells" Transplantation, 50:549-556 (1995). Cameron and Muffly, "Hormonal regulation of spermated binding to Sertoli cells in vitro" J.Cell Sci. , 100:523-533 (1991) . Griswold, "Protein secretion by Sertoli cells: general considerations" in Russel, L.D. and M.D. Griswold, eds. The Sertoli Cell, Cache River Press, Clearwater, FL. , 195-200 (1992) . Isacson et al., "Graft- induced behavioral recovery in an animal model of Huntingtonts disease" Proc. Nati. Acad. Sci. , 83:2728-2732 (1986). Koutouzis et al., "PR: Systemic 3-nitropropionic acid: Long term effects on locomotor behavior" Brain Research. 646:242-246 (1994). Lindvall et al., "Transplantation in Parkinson's disease: two cases of adrenal medullary grafts to the putamen" Ann. Neurol. , 22:457-468 (1987). Lindvall et al., "Grafts of fetal dopamine neurons survive and improve motor function in Parkinson's disease" Science, 247:574-577 (1990). Pakzaban et al., "Increased proportion of Ache-rich zones and improved morphological integration in host striatum of fetal grafts derived from the lateral but not the medial ganglionic eminence" Exp. Brain Res . , 97:13-22 (1993). Sanberg et al., "Cell transplantation for Huntington's disease" R.G. Landes Co., Boca Ratón, FL, pp. 19-21 (1994) . Selawry and Cameron, "Sertoli cell-enriched fraction in successful islet cell transplantation" Cell Transplant .. 2:123-129 (1993).

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Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para generar in situ factores tróficos transplantando célula Sertoli a un tejido con la necesidad de factores tróficos de un mamífero, las células creando factores tróficos in situ.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido con la necesidad de factores tróficos es el sistema nervioso central de un mamífero .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el mamífero padece de un trastorno neurológico que incluye un trastorno de degeneración neural, el método además incluye el paso de reducir los déficits de comportamiento funcionales causados por el trastorno a través de la acción de los factores tróficos secretados.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células Sertoli son células Sertoli de porcino.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el paso de trasplante está definido además come una protección del sistema nervioso central de trastornos degenerativos.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el paso de trasplante además está definido como una reparación del tejido del sistema nervioso central dañado.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el trastorno neurológico o trastorno de degeneración neural incluye epilepsia, ataque, enfermedad de Huntington, daño de la cabeza, daño espinal, dolor, enfermedad de Parkinson, deficiencias de mielina, trastornos neuromusculares, dolor neurológico, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y trastornos afectivos del cerebro.
8. 8. Un método para generar una producción de factor trófico in si tu a través del trasplante de células de Sertoli de porcino en el sistema nervioso central de un sujeto, las células que secretan factores tróficos in si tu, para el tratamiento de factores neurológicos que incluyen epilepsia, ataque, enfermedad de Huntington, daño de la cabeza, daño espinal, dolor, enfermedad de Parkinson, deficiencias de mielina, trastornos neuromusculares, dolor neurológico, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y trastornos afectivos del cerebro.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el sujeto es un ser humano.
10. 10. Un método para generar in situ una producción de factor trófico trasplantando células Sertoli a un área de daño del tejido de un sujeto, las células Sertoli secretando factores tróficos in situ.
11. 11. El uso de las células Sertoli para generar factores tróficos in situ trasplantando células Sertoli a un tejido con la necesidad de factores tróficos de un mamífero, las células creando factores tróficos in situ.
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en el que el tejido con necesidad de factores tróficos es el sistema nervioso central de un mamífero.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en el que el mamífero padece de un trastorno neurológico que incluye un trastorno de degeneración neural, el uso reduce los déficits de comportamiento y funcionales causados por el trastorno por la acción de los factores tróficos secretados.
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en el que las células Sertoli son células Sertoli de porcino.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en el que el trasplante se define además como protector del sistema nervioso central para trastornos degenerativos.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en el que el trasplante se define adicionalmente como la reparación del tejido del sistema nervioso central dañado.
17. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en el que el trastorno neurológico o trastorno de degeneración neural incluye epilepsia, ataque, enfermedad de Huntington, daño de la cabeza, daño espinal, dolor, enfermedad de Parkinson, deficiencias de mielina, trastornos neuromusculares, dolor neurológico, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y trastornos afectivos del cerebro.
18. 18. Las células Sertoli, caracterizadas porque son útiles para generar una producción de factor trófico in situ a través del trasplante de células de Sertoli de porcino en el sistema nervioso central de un sujeto, las células que secretan factores tróficos in si tu, para el tratamiento de factores neurológicos que incluyen epilepsia, ataque, enfermedad de Huntington, daño de la cabeza, daño espinal, dolor, enfermedad de Parkinson, deficiencias de mielina, trastornos neuromusculares, dolor neurológico, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y trastornos afectivos del cerebro.
19. 19. Las células Sertoli, caracterizadas porque son útiles para generar la producción de factor trófico in situ de conformidad con la reivindicación 18, en donde el sujeto es un ser humano.
20. 20. Las células Sertoli, caracterizadas porque son útiles para generar in situ una producción de factor trófico trasplantando células Sertoli a un área del daño del tejido de un sujeto, las células Sertoli secretando factores tróficos in situ.