MXPA97002797A - Agentes de enlace a c - Google Patents
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Abstract
Se describen los agentes de enlace para CD23,útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o alérgic
Description
AGENTES DE ENLACE A CD23
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a los agentes de enlace particular-es, lo-s cual-es pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoirmratres o aléxg"icas . CD23 (FCeRll) es una molécula del tipo II de la familia de la C—lectina, la -cu-al incluye también el receptor autodirigido de linfocitos (MEL-14) y la molécula 1 de adhesión endo1-eti-a1 -de leucocitos {ELAM-1) . Este es un receptor de baja afinidad para IgE. En los humanos una variedad de tipos de células hematopoyéticas expresan CD23 sobre su superficie, incluyendo ras rréltilas dendríiricas -olitrul es, células B, células T y macrófagos. Las células CD23 son tambi-én -encontradas en f rma soluble -en fluidos biológicos. Las moléculas solubles de CD23 (sCD23) son formadas -mediante es-cprsi m -proteo±?lrrca t±e receptores transmembranales . CD23 tiene actividades pleiotrópicas incluyendo la mediación de la adhesión celular, la regulación de IgE y la liberación de histamipa, el xescra e de las "células B de la apoptosis, y la regulación del crecimiento de células
REF: 24971 mieloides. Estas actividades funcionales son mediadas a través del enlace a ligandos específicos de CD23 asociados a células, o de sCD23, actuando el último de una manera similar a la citocina (Conrad, D. H., -Annu Rev I munol 8, 623-645 1990); Delespesse, G., y colaboradores, Adv immunol 4-9, 149-191 {1-991); Bonnefoy, J. Y., y colaboradores., Curr Opin Immunol 5, 944-947 (1993* ) . La expresión incrementada de CD23 ha sido observada en un número de enfermedades ±trf1amatorias . CD23 ha sido identificado en biopsias sinoviales provenientes de paciente con sinovitis crónica, y sCD23 puede ser medido a concentraciones que exceden el intervalo normal -en el srexo y el fluido sinovlal de pacientes con artritis reumatoide (Bansal, A. S., Oliver, -W . , Mar-sh, .N., -Pumph-r-ey, -R. S., and -Wil-son, P. B., Im unology 79, 285-289 (1993); Hellen, E. A. Ro lands, D. C, Hansel, T. T., Kitas, G. £>. , and Crocker, J., J. Clin Pathol 44, 293-296 (1991); Cho arat, P., ^B ioloay, J., -Banch-er-eau, J., & Mios-sec, P., Arthritis Rheum 86, 234-242 (1993); Bansal, A., et al., Clin Exp Imamo1 -89, 452-4"5r5 (1992); Re-zorrzew, R., & Newkirk, M. M., Clin Immunol Immunopathol 71, 156-163 (1994) . Además, los ivel s de sCB23 -sérico en pacientes con artritis reumatoide están relacionados al estado de la enfermedad y se correlacionan con el factor reumatoide sérico -(-Bansal, A. S., y colaboradores., Clin Exp Rheumatol 12, 281-285 (1994)). Las citocinas proirrflamatorias parecen ser particularmente importantes en la artritis reumatoide, y ha sido postulado un papel central para TNF—« e IL— lß en la destrucción de las coyunturas artríticas (Brennan, F. M., Charrtry, D., ackson, A., aini, "R. , & Feldman, M., Lancet 2,244-247 (1989); Brennan, F. M., -Mai i, & . -M . , & Feld an M., -Br J Rheumatol 31,293-298 (1992) ) . Se ha postulado también que las interacciones CD23-CD21 pueden j rgar un papel en el control de la producción de IgE (Flores Romo L. y colaboradores, Science 261 103-8-19-41 (1993} Anbry y colaboradores, Nature 358, 505-507 (1992)). CDllb y GDIle son -moléculas de adhesión Tqxte participan en muchas interacciones célula-célula y célula-matriz. -CDl b/CDl-8 - CDllc/CDl-8 tuna asociación de CDllb y CD18 y CDllc y CD18, respectrvament j ian sido reportada-s como capaces de enlazarse a varios ligandos, incluyendo CD54, fibpnógeno, Tactor X, LPS, Con A -y Tinroían -(Springer, T. A, Nature 346, 425-434 (1990)). El papel de estas moléculas de enlace rto es sim ^embargo om letament comprendido. CDllb/CDi-8 y CDlIc/CD18 son -también conocidos como MAC-1 y pl50, 95 respectivamente.
Estos son miembros de la f-amilia de la integrina 62
(algunas veces conocida como Leu-CAM, por ejemplo las moléculas de adhesión a células lencocitarlas) . Esta familia también incluye LFA-1 entre sus miembros
(también conocido co o CDlla/CD18). La patente Europea EP 0205405 describe los
Mabs para receptore-s celulares linrocrttcos para SgE (FCeR) de reacción cruzada con el factor de enlace a la inmunoglobulina E "humana (IgE-BF), y derivados del mismo . El documento WO 93/04173 describe un polipéptido que es capa-z -de enla-zarse a xmo de FCEL (receptor de IgE de baja afinidad, FCeRII) o FCEH
(factor de alta afinidad, E-€-eRI) pero -el cual es substancialmente incapaz de enlazarse al otro FCEL o a
FCEH. El tratamiento de tin desorden alérgico -es alegado como un polipéptido específico de FCEL o FCEH (con la condición de ^u el polipéptido e-speeífico de
FCEH sea incapaz de reticularse a FCEH e inducir la liberación de histamina) . La patente 'Europea EP 0269728 describe los
Mabs para el receptor IgE de linfocit-os hi± no-s .
La patente Europea EP 0259585 describe los Mabs que reconocen un receptor de superficie para IgE (FCeR) sobre los linfocitos B humanos. El documento s93/021G8 describe los anticuerpos pri atizados para uso terapéutico. Los presentes inventor s han descubie to sorprendentemente que los agentes de enlace a CD23 pueden s-et de utilidad en el ^tratamiento o -prcrfiia-x s de diversas enfermedades y en particular en el tratamiento o -ptsfila-?is de la artritis . An e de la presente invención, no habían sido presentados los datos que pudieran apoyar iral utilidad, a pesar de la publicación de un gran número de documentos en los cuales CD23 ha sido discutido. De acuerdo a la presente invención, se proporcionan a-gentes de enlace a CD23 para -el uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades inflama orias, au ?inmurres o alérgicas. El agente de enlace puede funcionar mediante el -blotpaeo de la interacción entre GD23 ~y n ligando, el cual se enlaza a éste. Los ensayos in vi tro, por ejemplo ensayos -radioinmun s , pueden ser utili-z do-s para estudiar tal efecto de bloqueo. El agente de enlace puede estar -en la forma aislada o como parte de una composición farmacéutica.
Se desea -que éste e-s é en la forma -estéril. H-ablando en general un agente de enlace que es específico para CD23 es útil en el -tratamiento pro-filaxis descritos . Los presentes inventores han demostrado que los a-g-en es de -enlace dentro del alcance de la presente invención, trabajan in vi vo en el tratamiento o profilaxis de enfermedades inf1amatorias o autoinmunes . Esta demostración es de gran significancia, dado el lieeno de que mucha-s óe cestas enfermedades son difíciles o imposibles de tratar de manera efectiva, a pesar de la -prolongada investigación -en -su naturaleza y causas. Este es particularmente el caso al respecto de la artritis, la cual -frecuentemente afecta a gente de edad media y puede provocarles abandonar el trabajo prematuramente. Un tratamiento e-fecirivo de la artritis ha sido una meta muy buscada de muchos grupos de investigación. I Los agentes de enlace preferidos incluyen anticuerpos, f agmentos de les mismos o construcciones artificiales que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos, o construcciones artificiaie-s d±seiiadas para imitar el enlace de los anticuerpos o fragmentos de los irtismos. Tales agentes de enlace ~se discuten por Dougall y colaboradores en Tibtech 12,372-379 (1994) . Estos incluyen los anticuerpos completos, fragmentos F{ ')2 fra-gmentos íab, fragmentos Fv, fragmentos ScFv, otros fragmentos, péptidos CDR y agentes -miméticos. Estos -pueden ser obtenidos/preparados por aquellos expertos en la técnica. -for ej-emplo, la di-gestión enzimática pud ser utilizada para obtener fragmentos F(ab')2 y Fab (al sujetar una -molécula de I-gG a la -esci-sión por pepsina o papaína, respectivamente) . Se debe considerar que las referencias a "anticuerpos" en la siguiente descripción incluyen todas las posibilidades menciónadas anteriormenrte . Pueden ser utilizados anticuerpos recombinantes . Los anticuerpos pueden ser humanizados; o quimerizados. Una preparación típica de un anticuerpo humaniz >ado en el cual los "CTJRs son derivados de una especie diferente de la estructura de los dominios variables del anticuerpo-, se describe - n la Patente Europea EP-A-0239400. Los CDRs pueden ser derivados de un anticuerpo msnoclonal de rata o-tie ratón. La
I estructura de los dominios variables, y los dominios constantes-, del anticuerpo alterado -pueden -ser derivados de un anticuerpo humano . Tal anticuerpo humanizado provoca una respuesta inmune despreciable cuando se administra a un -huma o , en comparación a la respuesta inmune provocada por un humano contra un anticuerpo de -rata o d ratón. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo -quimérico, -por ejemplo del tipo descrito en el documento WO 86/01533. Un anticuerpo quimérico de acuerdo a WO 86/015-33 comprende una región de enlace al antí-geno y una región no inmunoglobulina . La región de enlace al antígens es un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo o dominio variable de la cadena pesada típicamente, el anticuerpo quimérico comprende dominios variables de cadena ligera y pesada. La región no inmunoglobulina está fusionada en -su extremo C a la región de enlace al antígeno. La región no inmunoglobulina -es típicamente una pr t ína no inmunoglobulina, y puede ser una región enzimática, una región derivada de una -pxste±pa que -tiene especificidad de enlace conocida, proveniente de una toxina proteica o po -supuesto de cualquier -pro-teína expresada por un gen. Las dos regiones del anticuerpo quimérico pueden -ser conectadas -vía una ^secuencia ligadora escindible.
El anticuerpo puede ser una IgG humana, tales co o igGl, IgG2, IgG3, I-gG" IgM; IgA? IgE o IgD que poseen regiones variables de rata o de ratón (quiméricas) o -CDR-s (numani zados) . Las técnicas de primatización pueden también ser utilizadas, tales como aquellas descritas en WO93/02108. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, donde se describen -en la presente -agentes de enlace específicos, pueden también ser utilizados los derivados de tales agentes . El término "derivados" incluye las variantes de los agentes descritos, teniendo una o más substxtucisnes, supresiones o inserciones de aminoácidos, con relación a dicho-s agentes, al tiempo que -tienen la actividad de enlace descrita. Preferentemente, estos derivados tienen identidad substancial de la secuencia de aminoácidos con los agentes de enlace especificados. El grado de identidad de la secuencia de aminoácidos puede ser calculado usando un programa tal como "ajuste óptimo-"' ("tres-fit"} t-Smirth and -Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) para encontrar el - or segmento de ~ similitud entre cualesquiera dos secuencias. El alineamiento está basado en la -maximización de la calificación lograda utilizando una -ptatri-z de simii-itud de aminoácido-s , tal como aquella descrita por Sch arz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence y Structure, Dayhof, M. O. Ed pp 353-358. Preferentemente, el grado de identidad secuencial es al menos del 50 %, más pr erentemente éste es al menos de 75 %. Son más preferidas las identidades secuenciales de al -menos 90 % o de al menos 95 %. No obstante, podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica -que no son necesariamente requeridos altos grados de identidad secuenc al, -ya que diversos airrinoácidos pueden frecuentemente ser substituidos por otros aminoácidos, los cuale-s -tengan propiedades similares, sin alterar substancialmente o afectar adversamente ciertas propiedades de -una proteina. Estos -son algunas veces denominados como cambios de aminoácidos "conservadores". De este modo, los aminoácidos glicina, leucina o isoleucina pueden frecuentemente ser sus i-tuidos uno por el otro aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas) . Otros aminoácidos -que pueden frecuentemente ser substituidos por otro más incluyen: fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas-) ; lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas) ; espártate y -giuta ato (a noácidos -que tienen cadenas laterales acidas); asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida) y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre) . De este Ttrodo el término "derivado" puede también incluir una variante de una -secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de tales cambios "conservadores" con relación a dicha secuencia. La presente invención también incluye los fragmentos de tos a-gentes de enlace o de la presente invención o de los derivados de los mismos, los cuales todavía tienen la actividad de enlace descrita. Los fragmentos preferidos son al menos de 10 aminoácidos de longitud, pero éstos pueden ser más largos (por ejemplo hasta de 50 o hasta de 100 aminoácidos de longitud) . Se cree que los agentes de enlace de la presente invención -son útiles en el tratamiento o profilaxis de varias enfermedades humanas incluyendo artritis, lupus eritematoso, -i-roiditis de HasInmoto, esclerosis múltiple, diabetes, uveitis, dermatitis, psoriasis, urticaria, síndrome nefrótico, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Cro n, síndrome de Sjogren, alergias, asma, rinitis, eczema, GVH, COPD, insulitis, bronquitis -particularmente bronquitis crónica) o diabetes (particularmente diabetes del tipo 1). Estos pueden también ser útiles en el estudio de las integraciones entre CD23 y diversos ligandos, por ejemplo, entre CD23 y CD21, entre CD23 y CDllb, entre -CD23 y CDllc, entre CD23 -y una proteína de células endoteliales de 70 a 85 KDa (la cual puede ser una pro-teína de células endotellales de 76, -8-0 u 85 KDa) o entre CD23 y una proteína endotelial de 115 KDa (la cual se cree que está relacionada a la proteína endotelial de 70 a 85 KDa) . Se cree que ocurren -in vivo una o más de las -in eracciones anteriores. Los anticuerpos u otros agentes de enlace que son capaces de bloquear estas interacciones -son particularmente preferidos, ya que se cree que éstos pueden -ser especialmente adecuados para reducir o aliviar los efectos inflamatorios mediados por la citocina. Estos pueden también -ser útiles contra malignidades de células B, tales como leucemia linf cítica crónica, y leucemia de células pilosas.
Los agentes de enlace de la presente invención son particularmente aplicables para el uso en el tratamiento o profilaxis de artritis reumatoide .
Sin desear comprometerse por la teoría, se dan las siguientes explicaciones posibles: En el sinovio inflamado por artritis reumatoide, los macrófa-gos expresan CD23 y las integrinas ß2/ CDllb y CDllc, permitiendo que tengan lugar en este tejido las posibles interacciones homotípicas. Además, la difusión de moléculas CD23 solubles a través del -sinovio y su - enlace a lo-s ligandos de integrina, es también posible. Por lo tanto, .las interacciones CD23—CDlib/CDilc -que involucran una vuelta de activación positiva, podrían existir ±n - vivo. Si -se pre-sentan -en pacientes con artritis reumatoide, esto puede explicar algunos de los mecanismos pate-génieos de la -exacerbación y cronicidad de la enfermedad, y podrían apoyar la hipótesis de oue una ve-z localizados -en - las coyunturas, los macrófagos por sí mismos pueden mantener y -exa-eerbar la Inflamación vía una ruta que involucra las moléculas de CD23, las integrinas ß2, CDllb y CDllc, asi como las citocinas' proinflamatorias TNF-a, Il-lß e 11-6.
Un mecanismo ai-ternativo de acción de la terapia anti-CD23, podría involucrar el bloqueo de una respuesta inmune de IqE . En el trabajo publicado previamente, se ha mostrado que el t atamiento in vivo de ratas con anticuerpos anti-CD23, dio como resultado la inhibición especifica de antíqeno de la producción de IgE, probablemente mediante el bloque de las interacciones CD23-CD21, -necesaria-s para la diferenciación completa de las células B sometidas a IgE (Flores Romo y colaboradores , Science 2-61, 1038-1041 (1993) ) . La presente invención también incluye los agentes de enlace a CD23, los cuales -bloquean -tal respuesta. Estructuralmente, la proteína CD21 está compuesta de un dominio extracelular de 1-5 tMoore y colaboradores "Clonación molecular del ADNc que codifica para el receptor C3d del -virus de Spst in Barr (receptor del complemento, tipo 2) de linfocitos B humanos" Prsc Nsrtl Acad Sci USA 84: 91- U ^7)) o 16 (Weis y colaboradores "Estructura del receptor de linfocitos B humanos para C3d y el virus de Epstein Barr, y relación a otros miembros de la familia de proteínas de enlace a C3/C4", J Exp tfed 1€7- 1047 (1988)) unidades repetitivas de 60 a 75 aminoácidos, llamadas repeticiones consensúales cortas {SCR-s) , seguido por un dominio transmembranal (24 aminoácidos) y una región intracirtoplásmica de 34 aminoácidos. Utilizando los mutantes CD21 que poseen supresiones de SCRs extracito?lá-smica-s (Carel y colaboradores "Requerimientos estructurales para el receptor de C3d, g/Virus de Epstein Barr (CR2/CD21), enlace al ligando, internal zación e infección viral" J. Biol Chem 265: 12293 -(1-990)), los presentes inventores han encontrado recientemente que CD23 se enlaza a los SCRs 5-8 y 1-2 sobre CD21. El enlace de CD23 a los SCR-s 5--8 es una interacción similar a la lectina, que involucra carbohidratos sobre Asn 295 y 370. En contraste, CD23 que se enlaza a los SCRs 1-2 es una interacción proteína-prsteina (Aubry y colaboradores "CD23 interactúa con un nuevo dominio extracitoplásmico funcional que involucra oligo acáridos ligados por nitrógeno, sobre CD21", J. Immunol 152: 5806 (1994)). Los presentes inventores nan probado ahora el efecto de los otros ligandos de CD21 (EVC, C3d, g e IFN-a) sobre el -enlace de CD23 a CD21 y sobre la re-gulación de la producción de Ig en presencia de IL-4. Únicamente las par ículas de E-BV y un péptido derivado de EBV fueron capaces de inhibir el enlace de CD23 a CD21. Además, el péptido -EBV disminuyó -selectivamente la producción de IgE y de IgG4, e incrementó la producción de IgM. Estos datos indican que el enlace de CD23 al sitio de enlace de EBV sobre CD21, regula sel ctivamente la producción de ig humana en presencia de IL-4. Nuevamente, sin comprometerse con alguna teoría, -s cree que la presente invención permite que sean logrados tratamientos efectivos mediante la supre-sión de la síntesis de novo de las ci-tacinas proinflamatorias . Esto contrasta con los usos previos de los anticuerpos, simplemente para neutrali-zar directamente las moléculas de citocina presentes en los tejidos inflamados. Se debe de notar que existen publicaciones especulativas en la -técnica -que enlistan grandes números de anticuerpos, así como grandes números de posibles enf rmedades en las -que se dice -que los anticuerpos son útiles en el tratamiento, pero que no proporcionan ninguna-evidencia o datos sólidos para la mayoría de las combinaciones posibles. Una publicación tai es -el documento WO93/021 S el -cual está principalmente dirigido a la producción de anticuerpos qul éricos par ticulares.
La presente invención es claramente distinguida de tales publicaciones por la provisión de agentes de enlace a moléculas particulares, las cuales se indica claramente que son de utilidad en el tratamiento o profilaxis de ciertas enfermedades, en vista de los datos y explicaciones proporcionados -en la presente. Los agentes de enlace de esta invención son también de -uso particular en el tratamiento o profilaxis de enfermedades alérgicas, incluyendo las enfermedades -mediadas por no-IoE. Estos -pueden ser utilizados en el tratamiento y profilaxis de colitis ulcerativa. Estos -también pueden ser utilizadas en el tratamiento de profilaxis de la enfermedad de Crohn. Los a-gentes de enlace de la presen-te invención pueden ser utilizados solos o en combinación con agentes inmunosupresores tales como esferoides, ciclosporina, o anticuerpos tales como un anticuerpo anti-lipfocrtos, o -más p efe ent mente con un agente inductor de la tolerancia, anti-autoinmune o antiinflamato io iral como el agente inhibidor de células CD4+T, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD4 (preferentemen e un -anticuerpo óloqueador -o de no disminución), un anticuerpo anti-CD8, un antagonista de TNF, por ej mplo apti-TNF o un -inhirrirdor de TNF, por ejemplo, el receptor de TNF soluble, o a-gent s tales como NSAIDs. El agente de enlace será usualmente suministrado co o parte de una composición estéril, farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma apropiada, dependiendo del método deseado de administración de ésta a un paciente. La misma se puede -proporcionar en forma de dosis unitaria y se puede proporcionar como parte de -un -equipo. Tal equipo podría normalmente incluir (aunque no necesariamente) las instrucciones para el uso. Las administraciones del agente de enlace se dan en -general parenteraI ente, por ejem lo intravenosamente o subcutáneamente. Los agentes de enlace se dan en qeneral mediante inyección o mediante infusión. Para este propósito un agente de enlace que se formula en una -composición -farmacéutica -que contiene un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede utilizar cualquier portador o diluyente apropiado, por ejemplo solución salina isotónica. Pueden -ser agregados estabilizadores -tales como un quelante de metales para evitar la escisión inducida por el cobre. Un quelante- apropiado podría ser EDTA, DTPA o citrato de sodio.
Estas se pueden administrar oral o nasalmente por medio de un -rocío, especialmente para tratamiento de desórdenes respiratorios. Estas se pueden -formular como crema-s o ungüentos, especialmente para el uso en el tratamiento de desórdenes de la piel. Estas se pueden formular como gotas, o similares, para ra administración al ojo, para el -uso en el tratamiento de desórdenes tales como conjuntivitis vernal. Para soluciones inyectables, los excipientes que pueden ser utilizados incluyen, por ejemplo, a-gua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las compo iciones farmacéuticas pueden contener agentes conservadores, agentes solubilizadores, agentes esta-bilizadores, agente-s humectantes, emulsificantes, endulzantes, colorantes, odori zantes, -sales, amo t guadores, a-gentes de recubrimiento o antioxidantes. Estos pueden también contener otros a-gentes^ -ter péu icamente activos. Las dosis apropiadas de las sustancias de la presente invención variarán, dependiendo de los factores tales como la enfermedad o el desorden a ser tratado, de ta—uta de administración y de la edad y peso del individuo a ser tratado. Sin estar limitado por cualquier dosis particular, se cree que por ejemplo para la administración parenteral, una dosis diaria desde 0.01 -hasta 50 mq/kq de un agente de enlace de la presente invención (usualmente presente como parte de una composición farmacéutica como -se indicó anteriormente) puede ser apropiada para el tratamiento de un adulto típico. De manera -más apropiada la dosis puede ser de 0.05 a 10 mg/kg, tal como 0.1 a 2 mq/kg. Esta dosis puede ser repetida tan frecuentemente como -sea apropiado . Tipieamen e, la administración puede ser de una a 7 veces a la semana. Si se desarrollan efectos colaterales puede -ser reducida la cantidad y/o frecuencia de la dosis. Una dosis unitaria tipica para la incorporación en una composición farmacéutica podría de este modo -ser al menos de i - g del agente de enlace, adecuadamente de 1 a 1000 mg. La presente invención incluye dentro de -su alcance un ensayo para la determinación de si el agente particular -que -se -enla-za a CD23 puede ser útil o no en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, autoinmune o alérgica, que comprende-: la determina-ción de si el agente es capaz de bloquear o no la interacción entre CD23 y CDllb, o la interacción entre CD23 y CDllc, o la uLeracción entre CD23 -y CD21, o la interacción entre CD23 y una proteína de 70 a 85 KDa (tal como una de 76 KDa, 85 KDa u 80 KDa) o una proteína de 115 KDa, expresada sobre las células endoteliales. Este ensayo puede ser utilizado para seleccionar compuestos o -"moléculas mediante el uso de líneas celulares que expresan las moléculas apropiadas. Preferentemente, CDllb se utiliza en estos ensayos como CDllb/CD18, y CDllc se utiliza como CDllc/CD18. CDilb/CD18 y CDllc/CD18 pueden ser coexpresados sobre la superficie celular. Puede ser utili-zada cualquier -técnica de ensayo apropiada, por ejemplo los ensayos de proteína-no prsteína (por ej mplo el ensayo de ra interacción de las proteínas con productos químicos o azúcares) , ensayos de p u rna-ptste±na o ensayos de proteína-célula . La pres nte invención será ahora descrita a manera de ejemplo únicamente con referenoia a ios dibujos anexos; en donde
La Figura 1 ilustra el efecto del tratamiento preventivo -contra la artritis sobre ratones, utilizando un anticuerpo anti-CD23;
La Figura 2 ilustra el efecto del tratamiento de los ratones con un anticuerpo anti-CD23, con respecto a la artritis establecida, donde se utilizan tratamientos -múltiples del anticuerpo;
La Figura 3 ilustra el efecto del tratamiento de los ratones con un anticuerpo anti-CD23, con respecto a la artritis establecida, donde se utiliza un tratamiento simple;
Las Figuras 4a) y 4b) ilustran el efecto del tratamiento de los ratones con un anticuerpo monoclonal anti-CD23, con respecto a la artritis establecida donde -se utilizan -tratamientos -múltiples;
Las Figuras 4c) y d) ilustran el efecto del tratamiento -de los ratones con los fragmentos F(ab')2 y Fab de un anticuerpo monoclonal anti-CD23, con respecto a ?a -artritis establecida donde se utilizan tratamientos múltiples;
La Figura 5a ilustra el enlace de CD23-liposomas a las células mononucieares sanguíneas positivas a CD14;
La Figura 5b ilustra diversas proteínas purificadas por afinidad a CD23, sobre geles de SDS-PAGE ;
La Figura 6 ilustra el por ciento de inhibición de CD23-liposoma que se enlaza a los monocitos sanguíneos activados, obtenidos utilizando ciertos anticuerpos monoclonales ;
La Figura 7 ilustra el enlace de los liposomas de CD23 a diversas células transfectadas;
La Figura 8 ilustra el efecto de diversas substancias sobre la interacción CD23-CDllb y CD23-CDllc;
La Figura 9 ilustra los efectos sobre la producción de nitrito y el estallido oxidativo en monocitos, provocado por CD23 que se enlaza a CDllb y CDllc; y
La Figura 10 ilustra que el enlace de CD23 recombinante a CDllb y a CDllc, incrementa específicamente la producción de citocina por parte de los monocitos.
EJEMPLOS
(En algunos de los siguientes ejemplos los términos "ip", "-id-" y n" son utili-xados. Esto significa "intraperitoneal", "intradérmico", "número de animales-", respectivamente) .
EJEMPLO 1 - Tratamiento Preventivo de Ratones contra la Artritis utilizando Anticuerpo Anti-CD23
Se sedaron ratones macho DBA/1 (de 8 a 12 semanas de edad) con G.l mi de una dilución 1:10 de "Hypnorm" Fentanilo/Fluanisol ip y se inyectaron intradérmicamente en la base de la cola con 100 mg de colágeno bovino tipo II (CII) emulsificado en adyuvante completo de Freund (Difeo) . En el dia 13 después de la inmunización con CII, los ratones de prueba se trataron con una inyección -simple de IgG -de conejo anti-CD23 purificada mediante proteína-A Sefarosa 1Bio Proces-sing, Reino Unido) (2 mgratón, ip) (n=16, D D) . La IgG anti-CD23 purificada contiene 3—5 % de anticuerpo específico. Una descripción detallada de su producción se da en Flores Romo L. y colaboradore-s, Science 261 1038-1041 (1993). En resumen, se produjo un anticuerpo policlonal de conejo para una forma truncada del CD23 humano, correspondiente a los aminoácidos 150 al 321 del CD23 de longitud completa [Kikutani y colaboradores, Cell 47 657 (19 6)]. El polipéptido truncado se produjo en E. col i y se produjo a partir de un botón de centrifugación lavado, de E . col i mediante intercambio iónico y filtración en gel. Este tuvo un peso molecular de 251D, y después de la purificación se inyectó dentro de un conejo. El antisuero resultante probó ser positivo en un ensayo de ELISA y en un inmunomanchado de proteína con CD23 humano recombinante. Se aisló luego una fracción de IgG mediante cromatografía de afinidad por proteína A-Sefarosa. Los animales control recibieron IgG purificada con proteína A, a partir de suero de conejo normal \~2 mg/ratón) (n=17, -• • ) . Los ratones se inspeccionaron diariamente para el desarrollo de los síntomas -clínicos de la artritis. La severidad de la enfermedad fue calificada en cada pata utilizando una escala de 0 = no síntomas a 3 -= hinchazón pronunciada, eritema y deterioro del movimiento, como se describe en Williams y colaboradores Proc Nati Acad. Sel. USA 89 9784-9788 (1992); el alistamiento de la pata se evaluó mediante el conteo del número de patas afectadas. Los grupos se compararon mediante análisis estadístico utilizando la prueba t de dos colas en (a) , y la prueba de Maun-Whitney no paramétrica en (b); *0.05 > p > 0.01, **0.01 > p > 0.005, ***0.005>p. No se observaron diferencias en el inicio de la enfermedad (día medio del comienzo + sem: 20 + 0.7 en el grupo de prueba y 200.5 en el -grupo control) o incidencia de la enfermedad (ratones 100 % artríticos en ambos -grupos) demostrando igne el tratamiento con el anticuerpo anti-CD23 no tuvo efectos sobre la inducción -de la enfermedad al tiempo -de la proliferación de las células T y la inducción del anticuerpo IgG -anti-colágeno. No -obstante, las calificaciones clínicas completas fueron menores en los ratones tratados con el anticuerpo anti-CL\23 (Figura la). Más notable fue la supresión marcada del alistamiento de las extremidades en el grupo -tratado con ant?-CD23 (Figura Ib) . Estos resultados indican una fuerte dpfluencia del tr tamiento sobre la progresión de la enfermedad a largo plazo.
EJEMPLO 2 - Tratamiento de Artritis Establecida
_ (tratami.entos múltiples)
La artritis fue inducida como se describe para el ejemplo 1, y los ratones se verificaron periódicamente de manera diaria para el desarrollo de la inflamación visible. El tratamiento se administró en el primer día de la inflamación clínica (día 1) y dos días de-spués (día 3) sobre tres grupos de ratones divididos aleatoriamente. Estos ratones recibieron IgG antl—CD23 purificada por proteína A -(200 µg/inyección, n=6, D""-""-'"D; 400 µg/inyección, n=8
D D; los ratones control reoibieron la IgG no m l de conejo, purificada por proteína A (200 µg/inyeeción, n=15, -• •) . La severidad de la enfermedad (Figura 2a) fue evaluada como se describe en el ejemplo 1. La inflamación se evaluó mediante el incremento de la hinchazón desde el día 1 de que la primera pata llegó a ser artrítica, cedi a utilizando calibradores (Proctest 2T. Kroeplin Langenmesstechni ) . Los grupos se compararon utilizando la prueba t de dos colas, *0.05 > p > 0.01, **0.01 > p > .005, ***0.OQ05 = p. Puede ser observado el mejoramiento marcado en la -severidad de la enfermedad, lo cual está relacionado a la dosis. La propiedad antiinflamatoria de la IgG anti—-CD23 -es claramente demostrada por el hinchamiento reducido de las patas en el grupo de ratones -que reciben tratamiento con anticuerpo .
EJEMPLO 3 - Tratamiento de Artritis Establecida (tratamiento simple)
El diseño del experimento fue similar al ejemplo 2, con la excepció -de que los ratones fueron tratados únicamente una vez, en el día 1 de la artritis, con 2 mg/ratón de IgG anti-CD2-3 purificada por proteína A (n=10, D G) o IgG de conejo normal, purificada (n=10, • •) . Las calificaciones clínicas y el alistamiento de las extremidades se evaluarpn como para el ejemplo 1. El efecto significativo del alistamiento de las extremidades, obtenido después de una inyección en el día 1, demuestra que en términos del alistamiento de, las coyunturas, una inyección simple administrada cuando la artritis está ya establecida, es suficiente para proteger contra la progresión posterior de la enfermedad (Figura 3b) .
EJEMPLO 4 - Tratamiento de Artritis Establecida con Anti-CD23 Monoclsnal
Se obtuvieron ratones DBA/1 artríticos como se describe anteriormente para _el ejemplo 1. En el primer signo de la enfermedad clínica, los ratones fueron separados aleatoriamente en cuatro grupos, y se probaron en los días 1 y 3 con tres dosis de anticuerpo monoclonal para CD23 (B3B4, amablemente donado por el Profesor D. Conrad, Richmond, Virginia USA, y obtenible de Pharmingen. Se discute en J. Immunol 138: 1845-1-851 (19-87)); B3B4 25 µg/inyección, n=4 0 0, B3B4 50 µg/inyección, n=4; D D; B3B4
100 µg/ inyección, n=5 0 0) . Los ratones control recibieron PBS (n=6 • •) . Las calificaciones clínicas y el incremento en el espesor de las patas a partir del día 1 se evaluaron como se describe en el Ejemplo 2. Las inyecciones intraperitoneales de 50 µg de anticuerpo monoclonal B3B4 fueron suficientes para la terapia efectiva como se muestra por la disminución significativa en las calificaciones clinicas y el número de patas afectadas obtenidas usando este régimen de tratamiento. En contraste, la severidad de la enfermedad de los ratones tratados con 25 µg de anticuerpo monoclonal no mejoró el efecto terapéutico positivo obtenido con 50 µg de anticuerpo monoclonal B3B4 (Figura 4). El efecto antiinflamatorio relacionado a la dosis de la administración de B3B4, se ilustra en la Figura 4b la cual muestra que el hinchamiento de las patas artríticas no se incrementó desde el dia I en los grupos que recibieron inyecciones intraperitoneales de 50 ó 100 µg de anticuerpo monoelonal B3B4. De manera similar a lo que se observó con las otras mediciones clínicas, las dosis de 25 µg de anticuerpo monoclonal anti-CD23, administrado después del inicio de la enfermedad, fueron subterapéuticas y los incrementos en la hinchazón de las patas fueron similares a los controles (Figura 4b) . De igual modo, se obtuvo una reducción significativa en la severidad de la artritis establecida, después -del tratamiento con 50 µg de IgG policlonal anti-CD23, purificada por afinidad (datos no mostrados) . El mejoramiento en la severidad clínica después del tratamiento con -el anticuerpo anti—CD23
(tanto monoclonal como policlonal) fue confirmado mediante el examen histológico de las -patas artríticas. Los ratones tratados mostraron severidad reducida de la enfermedad con menos destrucción aparente del cartílago y del hueso, y una disminución notable en la infil ración celular de la capa de subrecubrimiento del sinovio. Además, la proporción de las coyunturas o articulaciones severamente afectadas, fue significativamente menor en los animales tratados con anticuerpo anti-CD23, en comparación a los ratones control (0 % vs . 94 %), mientras que la proporción de las coyunturas que mantienen la estructura normal fue significativamente incrementada (80 % vs . 0 %) . Esto es demostrado en la Tabla 1 siguiente:
Tabla 1: Histop to ogia- de las patas i Los, ratones fueron tratados y las coyunturas se procesaron como en la Figura 4_ Las preparaciones faistoiógicas fuersn calificadas como se describe en la metodología.
Esta tabla muestra una comparación de las preparaciones nistoiógica-s con respecto a las coyunturas tomadas de ratones tratados con anti-CD23 o de ratones control. Los ratones habían sido tratados como se describe anteriormente en relación a la Figura 4.
La histopatología se evaluó como sigue:
Una primera extremidad que se volvió artrítica se retiró post-Tiiortem, se fijó en iormalina amortiguada al 10 % (peso/volumen) y se descalcificó en EDTA en formalina amortiguada (5.5 %) . La~s patas fueron luego incrustadas en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina. Las preparaciones histológicas (3 secciones/pata) se calificaron usando los siguientes criterios-; leve = sinovitis mínima, pérdida de cartílago y erosiones óseas limitadas a focos discretss7 moderado = sinsvitis y erosiones presentes pero arquitectura coyuntural intacta; severo = sinovitis extensa y erosiones con desorganización de la arquitectura de las coyunturas. Todas las coyunturas presentes en cada -sección fueron evaluadas y se determinó el porcentaje que presentan calificaciones normal, leve, modetado o severa. La inflamación se evaluó mediante el incremento en el espesor de las patas con relación al espesor de la pata en el primer día de tratamiento, medido usando calibradores (Proctest 2T, Kroepiin Langenmesstechnik) . La evidencia adicional para apoyar la especificidad de ese tratamiento, se obtuvo mediante tratamiento de ratones artríticos con fragmentos Fab y F(ab')? del anticuerpo -monoclonal B3B4. Aunque son menos potentes que la molécula de IgG intacta, los fragmentos Fab y F(ab')2 de B3B4 fueron todavía efectivos, demostrando de este modo qu la porción Fe del anticuerpo no es indispensable para la actividad (Tabla 2) . Además, los anticuerpos para las moléculas de CD72 Y B220, ambas expresadas altamente en los linfocitos B, mostraron poca o ninguna actividad terapéutica (Tabla 2) . Además , la compa ación -con ios anticuerpos para TNF-a, (Williams y colaboradores Proc
Nati Acad Sci USA 36-. ^784-97-88 <i992)) y CD5 tPlater- Zyberk y colaboradores Clin Exp Immunol 98: 442-447
(1994} ) mostraron -que en las presentes condiciones experimentales, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD23 fue el más efectivo (Tabla 2) .
Tabla 2: Comparación en la respuesta a diferente régimen de tratamiento: Los ratones se inmunizaron con colágeno tipo II y se trataron terapéuticamente en el día 1 y 3 de la artritis clínica, mediante inyección intraperitoneal de anticuerpos monoclonales . La disminución en las calificaciones clínicas en el día 5 se calculó como un porcentaje del control isotipo utilizado en cada experimento.
Los datos adicionales con respecto a los anticuerpos monoclonales y fragmentos de lo~s mismos, se proporcionan en las Figuras 4c, y 4d. Estos datos están basados en el siguiente protocolo:
Ratones macho DBA/1 de 8 a 12 semanas de edad se inyectaron intradérmieamente con 100 µg de colágeno de bovino tipo II emulsificado en adyuvante completo de Freund. En el primer signo de la enfermedad clínica
(± 3 semanas después) los ratones se inyectan intraperitonealmente con las siguientes preparaciones de anticuerpos monoclonales (inyecciones en el día 1 y en el día 3)
B3B4, IgG2a completo 50 µg/inyección ip n = 8 Fab de B3B4 150 µg/inyección ip n= 6 F(ab')2 de B3B4 75 µg/inyección ip n = 7 IgG2a control de M6 50 µg/inyección ip n = 7
Los ratones se inspeccionan diariamente y se califica la severidad de la enfermedad clínica de cada pata (max/pata = 3; max/ratón = 12) . Los resultados para la calificación de la enfermedad clínica se muestran en la Figura 4c. La hinchazón de la primera pata artrítica es seguida usando calibradores. Los resultados para la calificación en la hinchazón de las patas se muestran en la Figura 4d. Los ratones son sacrificados en el día 10 de la artritis, la primera pata que se vuelve artrítica se secciona, se fija y se descalcifica para el examen histopalológico.
Interacciones entre CD23 y CDllb y entre CD23 y CDllc
Sin desear comprometerse por teoría, ya que no se comprende completamente cómo logran los anticuerpos anti-CD23 los sorprendentes resultados descritos anteriormente, es posible que esto pueda ser debido a la interacción de CD23 con CDllb y/o CDllc. Los ejemplos 5 al 10 y las Figuras anexas (ver más adelante) ilustran esto. En estos ejemplos, el CD23 recombinante de longitud completa, incorporado dentro de los liposomas fluorescentes, se mostró que se enlaza a las células COS con ADNc que codifica para CDllb/CD18 o CDllc/CD18, pero no con los transfectantes que expresan CDlla/CD18. La interacción entre CD23-liposomas y CDllb/CD18 o CDllb/CD18-células COS transíectadas , fue específicamente inhibida por los anticuerpos monoclonales anti-CDllb o anti-CDllc, respectivamente, y por anti-CD23. El significado funcional de este apareamiento de ligandos fue demostrado mediante el disparo de CDllb y CDllc sobre los monocitos, ya sea con CD23 recombinante o los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc, para provocar un incremento marcado en el nitrito (N02~,), productos oxidantes (H202) y citocinas proinflamatorias (IL-lß, IL-6 y TNFa) . Estas actividades mediadas por CD23 fueron disminuidas por los fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales para CDllb, CDllc y CD23. Estos resultados demuestran que las moléculas de adhesión superficial CDllb y CDllc, son receptores para CD23, y que este nuevo apareamiento de ligando regula las actividades importantes de los monocitos. La siguiente discusión explica brevemente el diseño experimental y la relación entre los ejemplos 5 al 10 ( siguientes) : Las células mononucleares sanguíneas totales fueron incubadas con CD23 recombinante de longitud completa incorporado dentro de liposomas fluorescentes y se analizaron mediante citometría de flujo (Pochon, S. y colaboradores J. Exp. Med 176, 389-398 (1992)). Una fracción se enlazó a CD23-liposomas (Ejemplo 5, Figura 5a) la cual se mostró luego mediante tensión doble, que consiste de células positivas a CD14 (por ejemplo monocitos) . Para confirmar que los monocitos eran capaces de enlazarse a CD23-liposomas, las células mononucleares sanguíneas fueron seleccionadas por FACS en poblaciones positivas a CD14 y negativas a CD14 (ejemplo 5, Figura 5a) . Se mostró que CD23-liposomas se enlazan únicamente a la población positiva a CD14 (ejemplo 5 Figura 5a) . Ya que se encontró que los monocitos no expresan el IgE membranal ni CD21 (no mostrados), los ligandos conocidos para CD23, se investigó si los monocitos expresan un receptor diferente para CD23. Los monocitos se usaron y los extractos celulares se purificaron sobre una columna de afinidad acoplada con CD23 soluble, recombinante. El análisis de SDS-PAGE y tinción con plata del material eluido, reveló bandas de alrededor de 80 y 160 kDa de peso molecular
(ejemplo 5, Figura 5b). Los anticuerpos que identifican antígenos dentro de este intervalo de peso molecular, y que se reporta son expresados sobre monocitos, fueron probados mediante FACS por su capacidad para inhibir el enlace de CD23-liposoma a los monocitos (Ejemplo 6, Figura 6) . Los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc inhibieron ambos el enlace de CD23-liposoma a los monocitos, con grados variantes de potencia (Ejemplo 6, Figura 6) . Anti-CD13, anti-CD49, anti-CD21 (no expresados sobre los monocitos) y anti-CDlla (el tercer miembro de la familia de integrina ß2 de las moléculas de adhesión) no tuvieron efecto significativo (Ejemplo 6, Figura 6) . Los anticuerpos contra MHC Clase I, Clase II, CD14 y CD45, todos los cuales se expresaron altamente sobre los monocitos, fueron también probados por su efecto sobre el enlace a CD23-liposomas . No obstante, ninguno tuvo algún efecto (no mostrado) . El anticuerpo monoclonal anti-CD18 dio una inhibición parcial del enlace a CD23. Esto pudo ser debido ya sea al impedimento esférico o a la inducción de un cambio conformacional en las moléculas de CDllb y CDllc después del enlace al anticuerpo monoclonal anti-CD18. Las proteínas derivadas de monocitos eluidas de las columnas de afinidad por CD23, fueron inmunorreactivas con los anticuerpos anti-CDllc (Ejemplo 5, Figura 5b) y anti-CDllc/CD18 (no mostrado) . Para confirmar que la cadena alfa de CDllb/CD18 y CDllc/CDllb eran receptores para CD23, los ADNcs de longitud completa, que codifican para CDllb y CDllc fueron transitoriamente cotransfectados con el ADNc de CD18 dentro de células COS. Los transfectantes que expresan CDllb/CD18 y CDllc/CD18 mostraron ambos que se enlazan a CD23-liposomas, en contraste a los transfectantes que expresan CDlla/CD18
(Ejemplo 7, Figura 7) . Esto puede ser explicado con el más alto grado de homología- entre CDllb y CDllc, cuando se comparan a su homología a CDlla. La especificidad de la interacción fue demostrada mediante la inhibición del enlace a CD23-liposoma utilizando anticuerpos monoclonales anti-CDllb, anti-CDllc y anti-CD23. Fueron obtenidos los mismos resultados utilizando células BHK que expresan CDllb/CD18 y CDllc/CD18 (no mostrados) . Como prueba adicional de la especificidad de la interacción de CD23, los monocitos sanguíneos activados provenientes de un paciente con Deficiencia de Adhesión de Leucocitos, que carecen de la expresión de la integrina ß2 debido a una mutación en el gen que codifica para la subunidad ß, fueron incapaces de enlazarse a CD23-liposoma (no mostrado) . Conjuntamente, estos datos demuestran que CD23 interactúa con CDllb y CDllc sobre monocitos humanos normales y sobre los transfectantes. CDllb y CDllc son moléculas de adhesión que participan en muchas interacciones célula-célula y célula-matriz los ejemplos muestran que CDllb/CD18 y CDllc/CD18 pueden mostrar una función de adhesión adicional en virtud de su habilidad para enlazarse a CD23. CD23 parece identificar un epítope parecido o idéntico al factor X, como se observa por la capacidad del factor X para inhibir, de una manera dependiente de la dosis, el enlace a CD23-liposoma (Ejemplo 8 Figura 8), sin afectar la expresión superficial de CDllb o CDllc sobre los monocitos (no mostrado) . Ninguno de los otros ligandos probados tuvieron ningún efecto. CD23 puede estar actuando como una lectina tipo C en su interacción con CDllb y CDllc. El EDTA disminuye el enlace de CD23 con los monocitos (Ejemplo 8 Figura 8) mediante la quelación del Ca2+, lo cual es necesario para el enlace de CD23 y/o por la quelación de los cationes divalentes que son necesarios para el enlace de los ligandos a CDllb y CDllc (Altieri, D. C. J. Immunol 147, 1891-1898 (1991)). La interacción CD23-CDllb/CDllc parece involucrar azúcares, pero no el ácido siálico, como se observa por la capacidad de la tunicamicina, pero no la neuraminidasa, para disminuir el enlace de CD23 a los monocitos. CD23 posee extracelularmente un triplete de aminoácidos
(Asp, Gly, Arg) (Kikutani, H. y colaboradores Cell 47,
867-885 (1986)), el cual en la orientación inversa es un sitio de reconocimiento común para los receptores de integrina. Por lo tanto, el efecto de un anticuerpo policlonal dirigido contra este tripéptido, fue probado por su capacidad para inhibir el enlace de CD23 a los monocitos. No se observó inhibición, confirmando la ausencia de inhibición obtenida con el fibrinógeno (Ejemplo 8 Figura 8) . IgE, el cual se enlaza en el dominio de la lectina de CD23, inhibe parcialmente el enlace de CD23 a los monocitos (Ejemplo 8, Figura 8). Estos resultados indican que CD23 parecería estar actuando como una lectina tipo C que reconoce parcialmente las estructuras sacáridas y proteicas, recordativo de lo que ha sido observado para la interacción de CD23 con CD21 (Aubry, J-P. y colaboradores J. Immunol 152, 5806-5813 (1994)). Para evaluar el significado funcional de la interacción de CD23 con CDllb o CDllc, se investigó si la interacción CD23-CD1 lb/CDllc podría provocar que los monocitos liberen mediadores proinflamatorios tales como óxido nítrico, H202 y citocinas. El disparo de los monocitos normales activados por adherencia utilizando CD23 soluble recombinante, anticuerpos anti-CDllb, anti-CDllc, incrementó la generación de N02", indicando la activación de la vía del NO (Moneada, S., Palmer, R. M. J. & Higgs, E. A. Pharmacol. Rev. 43, 109-144 (1991)). El efecto de CD23 sobre la producción de nitrito fue inhibida por los fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales anti-CD23 y por la nitroarginina, un inhibidor específico de la vía de la sintasa del óxido nitroso (NO) (Ejemplo 9, Figura 9a) . Se mostró también que el estallido oxidativo es regulado a través de CDllb y CDllc, ya que el CD23 soluble recombinante, los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc, provocaron todos oxidación de la hidroetidina a bromuro de etidio en monocitos (Ejemplo 9, Figura 9b) . Esto confirma y extiende el hallazgo de que los anticuerpos monoclonales anti-CDllb inducen un estallido oxidativo en los monocitos (Trezzini, C, Schüepp, B., Maly, F. E. & Jungi, T. W. Brit. J. Haematol. 77, 16-24 (1991)). El enlace de CD23 a CDllb y CDllc, estuvo asociado con un flujo temprano de Ca2+ específico, en monocitos sanguíneos (no mostrado) . Ya que los macrófagos activados son una fuente importante de citocinas proinflamatorias, se evalúa el efecto de CD23 soluble recombinante y de los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc, sobre la producción de tales citocinas por los monocitos. El CD23 soluble recombinante, los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc, fueron potentes estimuladores de IL-ß, IL6 y TNFa. Nuevamente, la especificidad de inducción fue mostrada por el uso de fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales anti-CDllb, anti-CDllc y anti-CD23 (Ejemplo 10, Figura 10). De manera interesante, IL-1 y TNFa fueron potentes inductores del enlace de CD23-liposoma a los monocitos (no mostrado), sugiriendo una vuelta autócrina de citocina, potencial, a través de la estimulación y regulación de CDllb y CDllc.
EJEMPLO 5
a) CD23-liposomas se enlazan a las células mononucleares sanguíneas positivas a CD14 (ver Figura 5a) .
Las células mononucleares sanguíneas fueron teñidas con anticuerpo monoclonal anti-CD14 (Becton Dickinson, Erembodegem, Bélgica) seguido por los anticuerpos F(ab')2 conjugados a FITC de oveja, para IgG e IgM de ratón (Bioart, Meudon, Francia) , ambos diluidos en PBS, BSA al 0.5 % y azida de sodio al 0.05 % antes de la selección por FACS (FACStar Plus, Becton Dickinson) , dentro de poblaciones celulares positivas a CD14 y negativas a CD14. Las células separadas fueron luego teñidas con CD23-liposomas o control (glucoforina A)-liposomas diluidos en BSA al 0.5 %, azida de sodio al 0.1 %, CaCl2 2 mM, NaCl 140 mM, Hepes 20 mM, pH 7 e incubados por dos horas a 4° C (Pochon, S. y colaboradores J. Exp. Med. 176 389-398 (1992)). Después de los lavados, las células (5,000 eventos/condición) fueron analizadas por FACS.
b) Peso molecular aparente de las proteínas de monocitos sanguíneos, purificadas por afinidad a CD23, e inmunorreactividad con un anticuerpo monoclonal anti-CDllc (ver Figura 5b) .
Los usados de monocitos sanguíneos fueron purificados por afinidad sobre una columna de CD23, las proteínas eluidas se separaron sobre geles de SDS-PAGE y se transfirieron sobre nitrocelulosa . Los marcadores Mr se muestran a la izquierda. El gel fue teñido con plata (banda izquierda) . Los filtros se incubaron ya sea con un anticuerpo acoplado a isotipo (banda intermedia) o con un anticuerpo monoclonal anti-CDllc (BU-15, banda derecha) , luego con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano (Kpl; Gaithersburg, Massachusetts) .
EJEMPLO 6
Los anticuerpos monoclonales anti-CDllb y anti-CDllc disminuyen el enlace de CD23-liposoma a los monocitos sanguíneos activados (ver Figura 6) .
Los monocitos se enriquecieron a partir de células mononucleares mediante Ficoll y adherencia de toda la noche a plástico en RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementadas con glutamina 2 mM y 10 % de FCS inactivados por calor (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) . Los monocitos activados fueron luego incubados con CD23-liposomas en presencia de diferentes anticuerpos monoclonales (aCD) o controles acoplados a isotipo (CTRL) (Becton Dickinson) , todos probados a 10 µg/ml . Los anticuerpos monoclonales anti-CDlla, 25.3 y B-B15 fueron obtenidos de Immunotech (Luminy, Francia) y Serotec (Oxford, Reino Unido), respectivamente. El anticuerpo monoclonal anti-CDllb 44 fue de Serotec, mon. gran 1 fue Janssen (Beerse, Bélgica) , Leu-15 fue de Becton Dickinson (Erembodegem, Bélgica) y (Bear-1) fue de Sera-Lab LTD (Sussex, Gran Bretaña) . El anticuerpo monoclonal anti-CDllc, 3.9, fue de Serotec, SL9 fue de Sera-Lab y BU-15 fue de The Binding Site (Birmingham, Reino Unido) . Los anticuerpos monoclonales anti-CD13 (SJ1D1), anti-CD18 (BL5), anti-CD23 (mAb25) y anti-CD49d (HP2.1) fueron de Immunotech. El anticuerpo monoclonal anti-CD21, BL13, fue de Immunotech, 0KB7 de Ortho y BU-33 se obtuvo del Dr . MacLennan (Universidad de Birmingham, Reino Unido) , HB-5 de ATCC, OKB7 de Ortho Diagnostics System Inc. (Raritan, N. J.). Los anticuerpos monoclonales anti-CD14, anti-CD13, anti-CD16 y anti-CD20 fueron de Becton Dickinson. Las células se analizaron mediante FACS y se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI) . Los datos de un experimento representativo son presentados. El MFI de las células teñidas con control-liposomas, fue de 6.5 y con CD23-liposomas fue 84.5. El porcentaje de inhibición utilizando los valores lineales aritméticos de MFI se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:
[(CD23-lipo) ]-[(CD23-lipo)+Mab]
% de inhibición = MFI xlOO (CD23-lipo)
EJEMPLO 7
Los CD23-liposomas se enlazan a las cadenas a de CDllb/CD18 y CDllc/CD18 sobre transfectanfes recombinantes (ver Figura 7) .
Los ADNcS que codifican para CDlla (Corbi, A. L., Miller, L. J., O'Connor, K. , Larson, R. S. & Springer, T. A. EMBO J. 6, 4023-4028 (1987)) se reclonaron en pCDNAl (Invitrogen, San Diego, C. A.). El ADNc para CDllb (Corbi, A. L., Kishimoto, T. K., Miller, L. J. & Springer, T. A. J. Biol. Chem. 263, 12403-12411 (1987)) y CD18 (Kishimoto, T. K. O'Connor, K, Lee, A., Roberts, T. M. & Springer, T. A^ Cell 48, 681-690 (1987)) se reclonaron en pCDM8 (Seed, B., Nature 329 8 Q--S-42 /19-87)}. Alícuotas de 20 µg de ADN se transfectaron en células COS-7 (ATCC) mediante eleetroporación (.-60 V, 9üQ -µTD) utilizando un dispositivo Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, C. A.) y celdas de 0.-4 cm en Hepes -20 mM, pH 7.-4, Wa i 150 M. Las cotransfecciones de CDlla, b o c con CD18 se realizaron con el fin de obtener la expresión de las integrinas ß2 en la superficie de la célula. Se realizaron controles con transfecciones de cadena simple. 48 horas después de la transfección, las células COS se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-CDlla, anti-CDllb y anti-CDllc o anticuerpos monoclonales acoplados a isotipo (control) seguido por anticuerpo de oveja anti-ratón, marcado con FITC. Entre 10 a 15 % de las células mostraron expresar CDlla, b o c, o CD18 mediante tinción con los anticuerpos monoclonales respectivos. Antes de la tinción con CD23-liposomas, las células COS transfectadas positivas a CD18, fueron luego seleccionadas por FACS con el fin de incrementar el porcentaje de células que expresan las integrinas ß2. Los transfectantes CDlla/CD18, CDllb/CD18 y CDllc/CD18 fueron luego incubados con CD23-liposomas (trazo 2) o control (glucoforina A)-liposoma (trazo 1). La especificidad de la interacción de CD23 con CDllb y CDllc, se demostró mediante la inhibición del enlace de CD23-liposoma, a los transfectantes CDllb/CD18 y CDllc/CD18, utilizando anticuerpos monoclonales anti-CDllb (trazo 4), anti-CD23 (trazo 5) y anti-CDllc (trazo 6), respectivamente. No se observó enlace de CD23-liposoma sobre los transfectantes de CDlla/CD18 y no se encontró efecto del anticuerpo monoclonal anti-CDlla (trazo 3) .
EJEMPLO 8
Caracterización -estructural de CD23-CDllb, interacción de CDllc (Ver Figura 8) .
a) Involucramiento de los azúcares y de los cationes divalentes .
Los monocitos sanguíneos activados, purificados, se trataron o no con tunicamicina (10 µg/ml) por 48 horas o con neuraminidasa (0.1 U/ml; ambos de Boehringer Mannheim-, Mannhein, Alemania) por 45 minutos. Las células se incubaron luego con CD23-liposo as o con control-liposoma en ausencia o presencia de EDTA (5 mM; panel izquierdo superior), Ca'+ o Mn2+ (1 a 10 mM; panel derecho superior) .
b) El factor X no inhibe el enlace de CD23 a los monocitos .
Los monocitos sanguíneos activados, purificados, se incubaron con CD23-liposomas en ausencia o presencia del factor X (0.1 a 10 U/ml;
Sigma) (panel inferior izquierdo) , fibrinógeno (50 µg/ml; Sigma) , ICAM-1 recombinante, purificado (producido en nuestro laboratorio), LPS (1 µg/ml; Sigma), zimosan opsonizado con suero humano (1 mg/ml; Sigma), IgE (50 µg/ml; The Binding Site, Birmingham) o anticuerpo policlonal para el péptido RGD (1/500, ATCC) (panel inferior derecho) . Las células se analizaron mediante FACS y se midieron por MFI. La inhibición porcentual se calculó como para el ejemplo 6.
EJEMPLO 9
CD23 recombinante al enlazarse a CDllb y CDllc específicamente, incrementa (a) el producto nitrito y (b) el estallido oxidativo por los monocitos.
Los monocitos se incubaron a) por 4 días a 37° C, o b) toda la noche en ausencia o presencia de CD23 soluble recombinante (Graber P y colaboradores J. Immunol. Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/ml), anticuerpos monoclonales anti-CDlla (clon 25.3), anti-CDllb (clon 44), anti-CDllc (clon BU-15) (todos a 10 µg/ml) . Para evaluar la cantidad de NO producido (el cual se muestra en la Figura 9a) lo-s sobrenadantes de cultivo se ensayaron para los productos finales estables de NO, N02~ y N03" de acuerdo a Green y colaboradores, Annu. Rev. Immunol 2 199-218 (1984). La especificidad del incremento de la producción de N02" mediado por CD23, se demostró por la inhibición de la producción de N02" por fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales anti-CD23 (mab25) (probados a 10 µg/ml) y mediante la inhibición con nitroarginina (N-Arg a 1 mM) (Sigma) . Los monocitos activados se incubaron con hidroetidina (Molecular Probes, Eugene, Oregon) (0.3 µg/ml) por 30 minutos a 37° C (Rothe G. y colaboradores J. Leukoc. Biol 47 440-448 (1990)) y se analizaron mediante FACS. El incremento porcentual en la fluorescencia roja de los raonocitos estimulados, se muestra en comparación a los monocitos no tratados
(ver Figura 9b) . Los monocitos que habían sufrido un estallido oxidativo, mostraron un incremento de las señales de fluorescencia roja en comparación a los monocitos no tratados que reflejan la oxidación de la hidroetidina a bromuro de etidio (Lacal P. M. y colaboradores, Biochem. J. 268 707-712 (1990)). Los valores MFI de los monocitos solos fueron de 159+/-10. Los valores de la Media +/- Desviación Estándar de 6 experimentos, son presentados. Con A, el cual se sabe que induce un estallido respiratorio de los monocitos, se utilizó como un control positivo. La especificidad de la interacción de CD23 con CDllb y CDllc se demostró mediante la inhibición del incremento de la producción de H202 mediado por CD23, por los fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales anti-CDllb (clon 44), anti-CDllc (clon BU-15) y anti-CD23 (mAb25) (probados a 10 µg/ml) .
EJEMPLO 10
El enlace de CD23 recombinante a CDllb y CDllc, incrementa específicamente la producción de citocina por los monocitos (ver Figura 10) .
Los monocitos se incubaron toda la noche a
37° C en ausencia o presencia de CD23 soluble recombinante (Graber P y colaboradores J. Immunol Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/ml), los anticuerpos monoclonales anti-CDlla (clon 25.3), anti-CDllb (clon 44), anti-CDllc (clon BU-15) , y anti-CD23
(mAb 25 - este anticuerpo es disponible de Immunotech.
Se discute la Solicitud de Patente Europea publicada
No. EP-A-0269728) , con A (Sigma) (todos a 10 µg/ml),
LPS (1 ng/ml) (Sigma) o MA (5 ng/ml) (Calbiochem, La Jolla, CA) . Las citocinas se midieron en el sobrenadante de cultivo mediante ELISA específico. El límite de sensibilidad de ELISA es de 0.05 ng/ml para IL-lß (Ferrua y colaboradores., J. Immunol. Methods 114 41-48 (1988)) 0.01 ng/ml para TNFa (Medgenix, Biptechnie, Rungis, F) y <0.01 ng/ml para IL-6 (Maine y colaboradores, Eur. Cytokine Netw 4 51-56 (1993)). La especificidad de la interacción de CD23 con CDllb y CDllc fue demostrada por la inhibición del incremento de la producción de citocina mediada por CD23, por los fragmentos de Fab de los anticuerpos monoclonales anti-CDllb (clon 4), anti-CDllc {clon BU-15) y anti-CD23 (mAb25) (probados a 10 µg/ml) . Los valores de media +/- desviación estándar de los 4 experimentos son presentados.
EJEMPLO 11
Los anticuerpos monoclonales para CD23 humano soluble derivado de E. col i , recombinante (25 kD, aminoácidos 150-321) fueron producidos en ratones, mediante procedimientos estándares excepto que se utilizan nodulos linfáticos no de células esplénicas. Estos Moquearon la actividad de CD23 humano in vi tro .
EJEMPLO 12
Colitis ulcerativa
3 monos tití se dosificaron con anticuerpo monoclonal anti—CD23 sin efectos adversos, dando como resultado un mejoramiento en la calificación fecal subjetiva. La dosis fue de 1 mg cada 4 días mediante inyección intramuscular.
EJEMPLO 13
No se observaron efectos tóxicos en ninguna de las pruebas reportadas aquí.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
Claims (20)
1. Un agente de enlace para CD23f caracterizado porque es para utilizarse en el tratamiento o profilaxis de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o alérgicas.
2. Un agente de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de enlace es un anticuerpo, un fragmento del mismo, una construcción artificial que comprende un anticuerpo o que comprende un fragmento del mismo, un agente mimético, o un derivado de cualquiera de estos agentes de enlace.
3. Un agente de enlace de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado o quimérico.
4. Un agente de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque bloquea la interacción de CD23 y los ligandos que se enlazan a éste in vi vo .
5. Un agente de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es para usarse en el tratamiento de artritis, lupus eritematoso, lupus eritematoso sisté ico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, diabetes, uveitis, dermatitis, psoriasis, urticaria, síndrome nefrótico, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren, alergias, asma, eczema, GVH, COPD, bronquitis insulitis, rinitis o diabetes.
6. Un agente de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, caracterizado porque es para el uso en el tratamiento de artritis, alergias, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.
7. Un agente de enlace de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es para el uso en el tratamiento de artritis reumatoide.
8. El uso del agente de enlace para CD23, caracterizado porque es para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de artritis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, diabetes, uveitis, psoriasis, urticaria, síndrome nefrótico, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de S^jogren, alergias, asma, eczema, GVH, COPD, bronquitis, insulitis, rinitis o diabetes.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque es para el tratamiento de artritis, alergias, colitis ulcerativa o enfermedad de -Cronn.
10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es para el tratamiento de artritis reumatoide.
11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un agente de enlace p ra CD23 y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. Una composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque contiene una dosis unitaria de agente de enlace de al menos 1 mg.
13. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque el agente de enlace es un anticuerpo.
14. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerizado .
15. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, subst el lme te como se describe en la presente.
16 . Un agente de- enlace, el uso o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivi dicaciones precedentes, caracterizado porque el agente de enlace está en combinación con un agente inmun supere-sor, inductor de la tolerancia, anti-autoinmune o antiinflamatorio.
17. Un agente de en 1 ace, el uso o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente de enlace está en combinación con el agente inhibidor de células CD4+T, o un antagonista de TNF.
18. Un agente de enlace, el uso o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el agente de enlace está en combinación con un anticuerpo anti-CD4.
19. Un agente de enlace de conformidad con la reivindicación 1, substancialmente como se describe anteriormente en la presente.
20. Un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria, autoinmune o alérgica, caracterizada porque comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente de enlace para CD23, a un paciente.
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