MXPA97002772A - Agentes enlazantes para el tratamiento de padecimientos inflamatorios, autoinmunes o alergicos - Google Patents

Abstract

Agentes enlazantes a CD11b, CD11c, CD23, una proteína KDa 70 a 85 expresada en células endoteliales o una proteína KDa 115 expresada en células endoteliales, puede serútiles en el tratamiento de padecimientos inflamatorios autoinmunes o alérgicos.

Description

AGENTES ENLAZANTES PARA EL TRATAMIENTO DE PADECIMIENTOS INFLAMATORIOS, AUTOINMUNES O ALÉRGICOS.

La presentes invención se refiere en parti-cular a agentes enlazantes los cuales pueden ser usados en el tratamiento de padecimientos inflamatorios, autoinmunes o alérgicos.

La CD23 (FCERII ) es una molécula de tipo II de la familia de la lectina-C la cuál también incluye al receptor (MEL-14) que alberga al linfocito y la adhesión del leucocito endotelial a la molécula-1 (ELAM-1). Este es un receptor de baja afinidad para IgE. En humanos una variedad de tipos de células hematopoyéticas expresan moléculas de tipo CD23 en su superficie, incluyendo células dendríticas foliculares, células B, células T y macrófagas. Las moléculas de tipo CD23 se encuentran también en formas solubles, en fluidos bi ol 6-gicos. Las moléculas solubles de tipo CD23 (sCD23) están formadas por el desdoblamiento proteolítico de receptores de la transmembrana. La molécula CD23 tiene actividades pleiotrópicas que incluyen la mediación de la adhesión de la célula, regulación de igE y liberación de hista ina, el rescate de células REF: 24383 B a partir de la apoptosis y la regulación del crecimiento de la célula mieloide. Estas actividades funcionales son mediadas a través del enlace a los ligandos específicos de células asociadas CD23, o sCD23, el último actuando de una manera similar a la citocina. (Conrad, D.H., Annu Rev Im unol 8, 623-645 1990); Delespesse, G., et al., Adv Immunol 49, 149-191 (1991); Bonnefoy, J.Y., et al., Curr Opin Im unol 5, 944-947 (1993)).

La expresión incrementada de la molécula CD23 ha sido observada en un número de padecimientos inflamatorios. La molécula CD23 ha sido identificada en biopsias sinoviales de pacientes con sinovitis crónica, y la sCD23 puede ser medida a concentraciones que exceden del rango normal en el suero y fluí-do sinovial de pacientes con artritis reumatoidea (Bansal, A.S., Oliver, W., Marsh, M.N., Pumhrey, R.S., y ilson, P.B., I munology 79, 285-289 (1993); Hellen, E. A., Ro lands, D.C., Hansel, T.T., Kltas, G.D., y Crocker, J.J., Clin Pathol 44, 293-296 (1991); Chomarat, P., Brioloay, J., Banchereau, J., & Miossec, P., Arthritis Rheu 86. 234-242 (1993); Bansal, A., et al., Clin Exp Immunol 89, 452-455 (1992); Rezonzew, R., & Newkirk, M.M., Clin I unol Irmurophatol 71, (156-163) (1994)). Además, los niveles de suero sCD23 en pacientes con artritis reumatoidea están relacionados a un estado de enfermedad y cor elacionados con el factor del suero reumatoideo (Bansal, A.S., et al., Clin Exp Rheumatol 12, 281-285 (1994)). Se ha postulado que las citocinas pro-inflamatorias parecen ser particularmente importantes en artritis reumatoidea, y tener una función central para TNF-oi- y lL-1jfl en la destrucción de juntas o articulaciones artríti-cas (Brennan, F.M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R., & Feldman, M., Lancet 2, 244-247 (1989); Brennan, F. M., Maini, R. M., & Feldman M., Br J Rheumatol 31, 293-298 (1992)).

Se ha postulado también que las interacciones.

CD23-CD21, pueden desempeñar una función en el control de la producción de IgE (Flores-Romo L. et al., Science 261 1038-1041 (1993); Aubry et al., Nauture 358, 505-507 (1992)).

Las moléculas CD 11 b y CD 11 c son moléculas de adhesión que participan en muchas interacciones célula-célula y célula-matriz. Las moléculas CD11b/CD18 y CD11c/CD18 (una asociación de CD11 b y CD18 y de CD11c y CD18 respectivamente) se han reportado que enlazan varios ligandos, incluyendo la molécula CD54, fibrinogeno, factor X, LPS, con A y si osan (Sprin-ger, T.A., Nature 346, 425-434 (1990)). La función de éstas moléculas enlazantes de cualquier modo no es completamente entendida. Las moléculas CD 11 /CD 18 y CD11c/CD18 son también conocidas como MAC-1 y p 150 , 95 respectivamente. Ellas son miembros de la familia de la ^ integrina (algunas veces conocidas como Leu-CAM, es decir, moléculas de adhesión de células de leucocitos). Esta familia también incluye LFA-1 entre estos miembros (también conocidos como CD11a/CD18).

La Patente EP 0205405 pretende divulgar Mabs a receptores celulares del linfocito para IgE (FCpR) teniendo una reacción cruzada con el factor enlazante E de la inmunoglobulina humana (IgE-BF) y derivados del mismo.

La Patente W0 93/04173 pretende divulgar un polipéptido el cual es capaz de ser enlazante a una de las FCEL (FCERII del receptor IgE de baja afinidad) o FCEH (FC RI del receptor de alta * afinidad) pero el cuál es substancialmente incapaz de enlazar al otro de FCEL o FCEH. El tratamiento de un desorden alérgico es supuesto con un polipéptido específico FCEL ó FCEH ( provisto el polipéptido específico es incapaz de en 1 azarse en forma cruzada al pdlipéptido FCEH e inducir la liberación de histamina).

La Patente EP 0269728 pretende divulgar Mabs al receptor del IgE del linfocito humano.

La Patente EP 0259585 pretende divulgar Mabs reconociendo una superficie del receptor para IgE (FCER) en linfocitos B en un humano).

La Patente WO 93/02108 pretende divulgar anticuerpos primatizados para uso terapéutico.

Se ha descubierto de manera sorprendente que los agentes enlazantes a CD21, CD11 b , CD11c, a una proteína de 70-85 KDa expresada en células endotel iales, o a una proteína de 115 KDa expresada en células endotel iales, pueden ser de utilidad en el tratamiento o profilaxis de varios padecimientos y en particular en el tratamiento o profilaxis de la artritis. Antes de la presente invención, no fue presentada la información la cual soportaría tal utilidad, a pesar de la publicación de un gran número de documentos en los cuales las moléculas CD21, CD11b o CD 11 c han sido discutidas.

De conformidad con la presente invención, se provee de un agente enlazante a CD21, CD 11b, CD11 c , a una proteína de 70-85 KDa expresada en células endotel iales, o a una proteína de 115 KDa expresada en células endoteliales para uso en el tratamiento o profilaxis de padecimientos inflamatorios, auto-inmunes o alérgicos.

El agente enlazante puede funcionar por la obstrucción de la interacción entre la proteína y un ligando a los cuales se enlaza. En ensayos in vitro, por ejemplo, ensayos radio-inmunes se pueden usar para estudiarlos como un efecto de obstrucción.

El agente enlazante puede aislarse en forma o como parte de una composición farmacéutica.

Deseablemente está en forma estéril. Hablando en general de un agente enlazante en cual es específico para CD21, CD 11b, CD11c, a una proteína de 70-85 KDa expresado en células endoteliales, (por ejemplo, a una proteína de 76 KDa, una de 80 KDa o a una de 85 KDa expresada en células endoteliales, son útiles en el tratamiento / profilaxis divulgados.

Agentes enlazantes preferidos incluyen anti-cuerpos, fragmentos del mismo o anticuerpos que comprenden construcciones artificiales o fragmentos de los mismos o construcciones artificiales designados a imitar el enlace de anticuerpos o fragmentos del mismo. Tales agentes enlazantes son discu-tidos por Dougall et al en Tibtech 12, 372-379 (1994).

Ellos incluyen anticuerpos completos , fragmentos Fíab'J » fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos ScFv, otros fragmentos, péptidos CDR y miméticos o imitadores. Estos se pueden obtener o preparar por aquellos especializados en las técnicas. Por ejemplo, la digestión de la enzima puede ser usada para obtener fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab (por so e-ter una molécula de IgG a un desdoblamiento de papaína o pepsina respectivamente). Las referencias a los "anticuerpos" en la siguiente descripción se deberán tomar incluyendo todas la posibilidades mencionadas anteriormente.

Anticuerpos recombinantes se pueden usar. Los anticuerpos pueden ser humanizados; o quimerizados.

Una preparación típica de un anticuerpo humanizado en la cuál el CDRs es derivado de una especie diferente que el dominio variable de la estructura de los anticuerpos se divulgan en la Patente EP-A-0239400. La CDRs puede ser derivada de un anticuerpo monoclonal de una rata o ratón. Los dominios variables y los dominios constantes de la estructura de los anticuerpos alterados, pueden ser derivados de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado provoca una respuesta inmune insignificante cuando se administra a un humano, comparado a la respuesta inmune iniciada por un humano contra un anticuerpo de rata ó ratón.

Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, por ejemplo, del tipo descrito en la Patente WO 86/01533.

Un anticuerpo quimerizado de conformidad con la Patente WO 86/01533 comprende una región enlazante al antigen y una región sin inmunoglobulina. La región enlazante antigen es un anticuerpo de dominio variable de cadena ligera o de dominio variable de cadena pesada. Típicamente el anticuerpo quimérico comprende los dos, dominios variables de cadena ligera o pesada. La región sin inmunoglobulina está unida en su C-terminal a la región enlazante del antígeno. La región sin inmunoglobulina es típicamente una proteína sin inmunoglobulina y puede ser una región de una enzima, una región derivada de una proteína que tiene especifidad enlazante conocida-, de una toxina proteína o de cualquier proteína de verdad expresada por un gene. Las dos regiones del anticuerpo quimérico pueden ser conectadas vía una secuencia de enlazador desdoblable.

El anticuerpo puede ser un IgG humano tales como IgG1; I gG2 ; IgG3; IgG4; IgM; IgA; IgE o IgD portando regiones variables de rata o ratón (quimérico) o CDRs (humanizado). Las técnicas Primati-zantes pueden ser usadas también, tales como aquellas divulgadas en la Patente W093/02108.

Otros agentes enlazantes preferidos como parte de los anticuerpos o derivados del mismo) son el Factor X (es decir, Factor 10), Epstein Barr Virus o una parte de Epstein Barr Virus.

En donde los virus intactos son usados en tratamientos médicos, ellos generalmente se suministrarán en una forma no virulenta. Esto puede llevarse a cabo usando técnicas conocidas para aquellos especializados en la técnica, la cual incluye atenuación y mutagénesis.

Como será apreciado por aquellos especializados en la técnica, en donde agentes enlazantes específicos están descritos aquí, derivados de tales agentes también pueden ser usados. El término "derivado" incluye variantes de los agentes descritos, que tienen una o más substituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones relativas a dichos agentes, aunque también tienen la actividad enlazante descrita. Preferiblemente estos derivados tiene substancial identidad de secuencia de aminoácidos con los agentes enlazantes especificados.

El grado de secuencia de identidad del aminoácido puede ser calculado usando un programa tal como el ajuste óptimo (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de similaridad entre cualquiera de las dos secuencias. El alineamiento está basado en el resultado máximi logrado, usando una matriz de aminoácidos similares, tales como los descritos por Schwarz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. 0., Ed pp 353-358.

El grado de secuencia de identidad preferible es por lo menos 50% y más preferible es de por lo menos 75%. Las identidades de secuencias de por lo menos 90% o de por lo menos 95% son las más preferidas.

Esto sin embargo, será apreciado por la persona especializada, que el alto grado de la secuencia de identidad no es requerida necesariamente ya que varios aminoácidos pueden ser luego substituidos por otros aminoácidos, los cuales tienen propiedades similares sin la alteración substanciamente o afectación desfavorablemente de ciertas propiedades de una proteína. Estas son algunas veces referidas como cambios de aminoácidos "conservativos". Además, los aminoácidos, glicina, valina, leucina o isoleucina pueden ser luego substituidos por otros más (aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidrdxilos alifáticos). Otros aminoácidos que pueden ser luego substituidos por otros más incuyen: fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales acídicas) ; asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amidas) y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre). Además, el término "derivado" puede también incluir una variante de una secuencia de aminoácidos que compren-den uno o más de los cambios "conservadores" relativos a dicha secuencia.

La presente invención también incluye fragmentos de los agentes enlazantes o de la presen-te invención, o de los derivados del mismo los cuales todavía tienen la actividad enlazante descrita. Fragmentos preferidos son por lo menos diez aminoácidos de longitud, pero pueden ser más largos (por ejemplo hasta 50 o hasta 100 aminoácidos de longitud).

Los agentes enlazantes de la presente invención están creados para ser útiles en el tratamiento o profilaxis de varios padecimientos humanos incluyendo artritis, lupus erite atosos, tiroiditis Mashi otos, esclerosis múltiple, diabetes, uveitis, dermatitis, soriasis, urticaria, síndrome nefrdtico, glo erulonefritis, padecimiento del intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohns, síndrome de Sjogrens, alergias, asma, rinitis, eczema, GHV, COPD, insulitis, bronquitis (particularmente bronquitis crónica) o diabetes (particularmente diabetes de Tipo 1). Ellos pueden también ser útiles estudiando las interacciones entre las moléculas de CD23 y varios ligandos por ejemplo entre CD23 y CD21, entre CD23 y CD11 b, entre CD23 y CD 11 c , entre CD23 .y la ya mencionada proteína de célula endotelial de 70 a 85 KDa (las cuales pueden ser una proteína de célula endotelial de 80-85 KDa) o entre CD23 y una proteína endotelial de 115 KDa (las cuales son creadas para ser relacionadas a la proteína endotelial de 70 a 85 KDa). Una o más de las interacciones mencionadas anteriormente están creadas para ocurrir o suceder in vivo. Los anticuerpos u otros agentes enlazantes los cuales son capaces de obstruir o bloquear estas interacciones son particularmente preferidos ya que se cree que puedan ser convenientes especialmente para reducir o aliviar los efectos infamatorios mediados por la citocina, Ellos pueden ser usados contra células tumorales o malignas tipo B tales como leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas.

Agentes enlazantes de la presente invención son aplicables para usarse en el tratamiento de profilaxis de artritis reu atoidea. Sin ser dirigidos por la teoría, se exponen las siguientes explicaciones posibles: En el sinovium inflamado de la artritis reumatoidea, se expresan ambos macrófagos CD23 y lasj&2 integrinas CDllb y CD11c, permitiendo posibles interacciones homotípicas que toman lugar en éstos tejidos. Adicionalmente, la difusión de moléculas solubles CD23 a través del sinovium y sus enlazamientos a los ligandos integrantes también son posibles. Por lo tanto, las interacciones CD23-CD11 /CD 11c involucran un enlace de activación posible que puede existir in vivo. Si se presenta en pacientes con artritis reumatoidea, se pueden explicar algunos de los mecanismos patogénicos de exacerbación y cronicidad del padecimiento, y podrían soportar la hipótesis de que una vez localizadas a las juntas o articulaciones, los acrófagos pueden ellos mismos mantener y exacerbar la inflamación vía un camino que involucra moléculas CD23, J32 integrinas CD11b y CD 11c, así como citocinas pro-inflamatorias TNF-*¿ IL-1^ y IL-6.

Se han encontrado que las moléculas CD23 enlazantes a las moléculas CD 11 b y CD 11 c son bloqueadas u obstruidas por el Factor X, ya que el Factor X enlaza a CD 11 b y a CD 11c. Además, la presente invención incluye el uso del factor X o de un fragmento del mismo para blo-quear u obstruir al CD23 enlazante a CD 11 y/o CD11c.

Un mecanismo alternativo de acción de terapia con anti CD23 puede involucrar el bloqueo u obstrucción de una respuesta inmune de igE.

En trabajos publicados previamente, se ha mostrado que el tratamiento in vivo de ratas con anticuerpos con moléculas anti-CD23 resulta en la inhibición del antigen específico de la producción de IgE, probablemente por el bloqueo u obstrucción de las interacciones CD23-CD21 necesarias para complementar la diferenciación de las células B cometidas por el IgE (Flores-Romo et al., Science 261, 1038-1041 (1993).

La presente invención también incluye agentes enlazantes a CD21 gue bloquean u obstruyen tal respuesta (por ejemplo el Epstein Barr Virus o una parte del mismo).

Estructuralmente, la proteina CD21 está compuesta de un dominio extracelular de 15 (Moore et al, Molecular cloning of the cDNA encoding the Epstein Barr Virus C3d receptor (Complement receptor type 2) of human B lymphocite, Proc Nati Acad Sci USA 84: 9194 (1987)) o 16 (Weis et al, Structure of the human B lymphocite receptor for C3d and the Epstein Barr Virus and relatedness to other member of the family of C3/C4 binding proteins, J Exp Med 167: 1047 (1988)) unidades relativas de 60 a 75 aminoácidos, llamadas relaciones consensúales cortas repetidas (SCRs), seguidas por un dominio de transmembrana (24 aminoácidos) y una región intracitoplásmica de 34 aminoácidos. Usando supresiones orientadas a los mutantes CD21 de SCRs extracitoplásmicos (Carel et al, Structural requeriments for C3d,g/Epstein Barr Virus receptor (CR2/CD21) ligand binding, internal ization, and viral infection J Biol Chem 265; 12293 (1990)). Se han encontrado , recientemente que CD23 enlaza a SCRs 5-8 y 1-2 en CD21. Los enlazantes de CD23 a SCRs 5-8 son una interacción similar a la lectina, involucrando carbohidratos en Asn 295 y 370. En contraste, CD23 enlazante a SCRs 1-2 es una interacción proteína-proteína (Aubry et al, CD23 interacts with a new functional extracytoplas ic do ain involving N-liked oligosac-charides on CD21, J immunol 152: 5086 (1994)). Se han probado o experimentado ahora los efectos de otros ligandos de CD21 (EBV, C3d,g y IFN-¿¿ ) en CD23 enlazante a CD21 y en la regulación de la producción de Ig en la presencia de IL-4. Únicamente las partículas EBV y un péptido derivado de EBV fueron capaces de inhibir al CD23 enlazante a CD21. Además, el péptido EBV disminuye selectivamente la producción de IgE y IgG4 e incrementa la producción de IgM. Estos datos indican que el CD23 enlazante al sitio del enlazante EBV en CD21 regula selectivamente la producción de Ig en la presencia de IL-4.

La presente invención por lo tanto, incluye dentro de éste ámbito el uso del Epstein Barr Virus o de una parte del mismo para el bloqueo u obstrucción del enlazante de CD23 a CD21. Una parte preferida del Epstein Barr Virus es la gl icoproteína gp350/gp220 o un fragmento de la misma. Alternativamente, se puede formar sin glicosilado de esta glico-proteína o de un fragmento de la misma.

De nuevo, sin ser dirigido por la teoria, se cree que la presente invención permite tratamientos efectivos para llevarse a cabo por la supresión de la síntesis de novo de las citocinas proinflama-torias.

Este contraste con los usos previos de los anticuerpos es simplemente para neutralizar directamente las moléculas de citocinas ya presentes en tejidos inflamados.

Debe también ser notado que hay publicaciones especulativas en la técnica, listando grandes números de anticuerpos asi como un gran número de padecimientos posibles en los cuales los anticuerpos se mencionan gue son útiles en el tratamiento pero no suministran cualquier evidencia sana o información para la mayoría de las combinaciones posibles. Una publicación tal es la Patente W093/0218 la cual es dirigida fundamentalmente a la producción de anticuerpos quiméricos particulares.

La presente invención se distingue claramente de tal publicación, por proveer agentes enlazantes a moléculas particulares las cuales son claramente indicadas por ser de utilidad en el tratamiento o profilaxis de ciertos padecimientos en vista de las informaciones y explicaciones provistas aquí.

Agentes enlazantes de esta invención son también de uso particular en el tratamiento o profilaxis de padecimientos alérgicos, incluyendo padecimientos mediados sin IgE. Ellos pueden ser usados en el tratamiento y profilaxis de colitis ulcerativa. También pueden ser usados en el tratamiento y profilaxis de la enfermedad de Crohn.

Los agentes enlazantes de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con agentes inmunosupresivos tales como esteroides, ciclos-porina o anticuerpos tales como un anticuerpo ant i-1 infocito o más preferiblemente con una tolerancia inducida, de agente anti-autoinmune o anti-inf lama-torio tales como un agente inhibidor de la célula CD4+T por ejemplo, un anticuerpo anti-CD4 (preferiblemente bloqueando u obstruyendo un anticuerpo sin agotamiento), un anticuerpo anti-CD8, un antagonista TNF por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF o un inhibidor TNF por ejemplo, un receptor TNF soluble, o agentes tales como el NSAIDs.

Los agentes enlazantes serán usualmente suministrados como parte de una composición estéril farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede ser en cualquier forma conveniente, dependiendo del método deseado de administración a un paciente. Se puede suministrar en forma de dosificaciones unitarios y pueden ser provistas como parte de un equipo. Como un equipo normalmente serán (aunque no necesariamente) incluidas las instrucciones para su uso.

Las administraciones de agentes enlazantes se dan en general parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente. Los agentes enlazantes están generalmente dados por inyección o por infusión. Para éste propósito, un agente enlazante es formulado por una composición farmacéutica que contiene un portador o diluente farmacéuticamente aceptable. Cualquier portador o diluente apropiado se puede usar, por ejemplo, una solución salina isotdnica. Se pueden añadir estabilizadores tales como un quelador de metal para evitar el desdoblamiento inducido por el cobre. Un quelador conveniente podría ser el EDTA, DTPA o el citrato de sodio.

Se pueden administrar ora lmente o nasa lmente por med i o de un rocío, es pec i a l mente para e l tratam i ento de desordenes resp i rator i os .

Se pueden formular como cremas u ungüentos o pomadas, especialmente para el uso en el tratamiento de desordenes de la piel.

Se pueden formular como gotas, o similares, para administrarse en los ojos, para uso en el tratamiento de desórdenes tales como conjuntivitis vernal.

Para soluciones inyectables, los excipientes que pueden ser usados incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes preservativos o conservadores, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humidi-ficantes o humidif icadores, emulsif icantes, endulzantes, colorantes, sales odorantes u olorantes ( las substancias de la presente invención pueden ser suministradas en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable), amortiguadores, agentes de revestimiento o antioxidantes. Pueden también contener otros agentes activos terapéuticamente.

Dosificaciones convenientes de la substancia de la presente invención, variarán dependiendo de los factores tales como los padecimientos o desórdenes a ser tratados, la vía de administración y la edad y peso del individuo a ser tratado. Sin llegar a ser ligado por cualquier dosificación particular, se cree que por ejemplo, para administración parenteral, una dosificación diaria a partir de 0.01 a 50 mg/kg de un agente enlazante de la presente invención ( usualmente presente como una parte de una composición farmacéutica como anteriormente se indicó ) puede ser conveniente para el tratamiento en un adulto típico. Más convenientemente, la dosis posible podría ser de 0.05 a 10 mg/kg, así como de 0.1 a 2 g/kg.

Esta dosificación se puede repetir tan frecuentemente como sea apropiado. La administración típicamente puede ser de 1 a 7 veces por semana. Si se desarrollan efectos laterales, la cantidad y/o frecuencia de la dosificación, se pueden reducir.

Una dosis unitaria típica para incorporación en una composición farmacéutica, sería además de por lo menos 1 mg de un agente enlazante, convenientemente de 1 a 1000 mg.

La presente invención incluye dentro de éste ámbito un ensayo para determinar de todos modos un agente particular el cual enlaza a CD21, CD 11b, CD 11 c o a una proteína de 70-85 o 115 KDa expresada en células endoteliales que pueden ser útiles en el tratamiento de un padecimiento inflamatorio, autoinmune o alérgico que comprende: determinar de todos modos si el agente es capaz de bloquear u obstruir la interacción entre CD23 y CD 11b, o la interacción entre CD23 y CD11c, o la interacción entre CD23 y CD21, o la interacción entre CD23 y una proteína de 115 KDa o de 70-85 KDa expresada en células endoteliales.

Este ensayo puede ser usado para la proyección de compuestos o moléculas usando las líneas celulares expresando las moléculas apropiadas. Preferiblemente el CD 11 b es usado en éstos ensayos como CD 11 b/CD 18 y CD 11 c es usado como CD11c/CD18. El CD 11 /CD 18 y el CD11c/CD18 pueden ser coexpresados en la superficie celular.

Cualquier técnica de ensayo apropiada puede ser usada, por ejemplo, ensayos de proteínas-sin proteínas (por ejemplo, ensayando la interacción de las proteínas con químicos o azúcares), ensayos de proteína-proteína o ensayos de proteína-célula.

La presente invención se describirá ahora por medio del ejemplo únicamente con referencia a los dibujos acompañantes, en donde: La FIGURA 1a. ilustra las liposomas CD23 enlazantes a células mononucleares de sangre positiva CD14; La FIGURA 1b ilustra varias proteínas purificadas de afinidad a CD23 en geles SDS-PAGE; La FIGURA 2 ilustra el porcentaje de inhibición de la liposoma CD23 enlazante a los monocitos de sangre activada obtenida usando ciertos anticuerpos monoclonales ; La FIGURA 3 ilustra al enlazante de la liposoma CD23 a varias células transfectadas; La FIGURA 4 ilustra los efectos de varias substancias en la interacción de CD23-CD11 b y CD23-CD11c; La FIGURA 5 ilustra los efectos en la producción de nitrito y el estallido oxidativo en monocitos causados por el CD23 enlazante a CD 11 b y CD 11 c ; y La FIGURA 6 ilustra que el enlazante de CD23 recombinante a CD 11 b y CD11c incrementa especí ficamente la producción de citocinas por los monocitos.

La FIGURA 7a ilustra la inhibición de la liposoma CD23 enlazante a las células RPMI 8226 por varios CD21 ligandos.

La FIGURA 7b ilustra la inhibición de IL-4 inducida por la producción de IgE y IgG4 por un péptido EBV enlazante a CD21.

La FIGURA 7c ilustra la modulación de la producción de inmunoglobulina por un péptido EBV enlazante al CD21.

La FIGURA 7d ilustra la falta de inhibición de la producción de IgE con un péptido C3 enlazante a CD21.

La FIGURA 8 ilustra la inhibición del enlazante de la liposoma CD23 a ciertas células endoteliales debido a la presencia de un anti-CD23 MAb.

EJEMPLOS (En algunos de los siguientes ejemplos son usados los términos "ip", "id" y "n". Estos significan "intraperitoneal" , " intradermal" y "número de animales" respectivamente).

EJEMPLOS 1-6 Interacción entre CD23 y CD 11 b y entre CD23 y CD11c. Los ejemplos 1 a 6 y las figuras acompañan-tes (ver al final) ilustran la interacción de CD23 con CD11b y/o CD11c.

En estos ejemplos, el CD23 recombinante de tamaño natural es incorporado en liposomas fluorescentes como se muestra, para enlazar a COS de células transfectadas con cDNA codificando cualquiera de los CD11b/CD18 o CD11c/CD18 pero no con transfectantes expresando CD11a/CD18. La interacción entre las liposomas CD23 y CD11 b/CD18 o CD11c/CD18 con células COS transfec-tadas fueron inhibidas específicamente por anti -CD11 b o anti CD11c, respectivamente, y por anticuerpos monoclonales anti-CD23. La significancia funcional de estas parejas de ligandos fue demostrada por el funcionamiento de CD 11 b y CD11c en monocitos con cualquier CD23 recombinante o anti CD 11 b y anticuerpos onoclopales anti-CD11c a causa de un marcado incremento en nitritos (N02), productos oxidativos (H202) y citocinas proinf lamatorias (IL-1/*, IL-6 y TNF<=> . Estas actividades mediadas por CD23 fueron disminuidas por los fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales a CD11b, CD 11 c y CD23. Estos resultados demuestran que la superficie de adhesión de las moléculas CD11 y CDllc son receptoras para CD23 y que éstas nuevas parejas de ligandos regulan actividades importantes de los monocitos.

Las discusiones siguientes explican brevemente el diseño experimental y la explicación racional de los ejemplos 1 a 6 (como siguen): Células mononucleares de sangre total fueron incubadas con el recombinante de tamaño natural CD23 e incorporados en liposomas fluorescentes y analizados por citometría de flujo (Pochon, S. et al. J. Exp. Med. 176, 389-398 (1992)). Un fracción - de enlace a las liposomas CD23 (Ejemplo 1, fig 1a) el cuál después mostró por el doble teñido que consiste de células positivas de CD14 (por ejemplo, monocitos). Para confirmar que los monocitos son capaces de enlazar a los liposomas CD23, células mononucleares de sangre fueron de FACS clasificadas dentro de las poblaciones de CD14 positivo y CD14 negativo (Ejempl 1, Fig. 1a). Las liposomas CD23 mostraron únicamente el enlace a la población de CD14 positivo (Ejemplo 1, Fig. 1a). Ya que los monocitos encontrados no expresan membranas IgE o CD21 (no se muestra), los ligandos conocidos para CD23, fueron investigados aunque los monocitos expresan un receptor diferente para CD23. Los monocitos fueron disueltos por las lisinas y los extractos de células purificadas sobre una pareja de columnas de afinidad con el recombinante soluble de CD23. El SDS-PAGE y el análisis de la solución de plata del material eludido reveló bandas de aproximadamente 80 y 160 KDa MW (Ejemplo 1, Fig. 1b). Los antigenes identificantes de los anticuerpos dentro de éste rango de MW y el reportado expresados en monocitos fueron probados por FACS por su capacidad para inhibir las liposomas CD23 enlazantes a los monocitos (Ejemplo 2, Fig. 2). Los anticuerpos monoclonales ant i-CD 11 y anti-CD11c ambos inhibieron a la liposoma CD23 enlazante a los monocitos, con grados variantes de potencia (Ejemplo 2, Fig. 2.). Los anti-CD13, anti-CD49d, anti-CD21 (no expresados en monocitos) y anti-CD11a ( el tercer miembro de la familia 2 integrina de las moléculas de adhesión ) no tienen efectos significantes (Ejemplo 2, Fig. 2). Los anticuerpos contra los MHC Clase I, Clase II, CD14 y CD45, todos son expresados altamente en monocitos, fueron experimentados por sus efectos en las liposomas CD23 enlazantes.

De cualquier forma, no tiene efecto cualquiera ( no mostrado). El anticuerpo monoclonal anti-CD18 da una inhibición parcial del enlazante CD23. Esto puede ser debido a cualquier impedimento estérico o a la inducción de un cambio conforrnacional en las moléculas C D 11 b y CD11c sobre el enlazante anti CD18 Mab. Las proteínas derivadas del monocito, eluídas de la columna de afinidad CD23 fueron inmunoreacti vas con los anticuerpos anti-CD11c (Ejemplo 1, Fig, 1b) y anti-CD11c/CD18 (no mostrados)..

Para confirmar que la cadenaoL de CD 11 b/CD 18 y CD 11 c/CD 11 b fueron receptores para CD23, las codificaciones cDNAs de tamaño natural para CD 11 b y CD 11 c fueron transitoriamente co-transfectadas con CD18 cDNA dentro de células COS. Los transfectantes expresantes de CD11 b/CD18 y CD 11 c/CD 18 ambos mostraron enlazar liposomas CD23, en contraste con los transfectantes expresantes de CD11a/CD18 (Ejemplo 3, Fig.3 ). Estos posiblemente serán explicados por el alto grado de homología entre CD 11 b y CD 11 c cuando se comparan sus homologías a CD 11 a- La especificidad de la interacción fue mostrada por la inhibición de las liposomas CD23 enlazantes usando anticuerpos monoclonales ant i -CD 11 b , antiCDHc y antiCD23. Se obtuvieron los mismos resultados usando las células BHK expresantes de CD 11 /CD 18 y CD11c/CD18 (no mostradas ). Como una prueba adicional de la especificidad de la interacción de CD23, monocitos de sangre activada de un paciente con Deficiencia de Adhesión al Leucocito, carente de expresión de 1 a B2 integrina debido a una mutaciónenel gen codificante, la subunidad S fue incapaz de enlazar las liposomas CD23 (no mostradas) Juntos, estos datos mostraron que los CD23 actúan recíprocamente con CD11b y CD11c en monocitos humanos normales y en transfectantes.

Las CD11b y CD11c son moléculas de adhesión que participan en muchas interacciones célula-célula y célula-matriz. Los ejemplos muestran que CD11 b/CD18 y CD 11 c/CD18 pueden exhibir una función adhesiva adicional en virtud de su habilidad para enlazar a CD23. Las CD23 parecen identificar un epitope parecido o idéntico al Factor X como se observó por la capacidad del Factor X para inhibir en una dosis de manera independiente a la liposoma CD23 enlazante (Ejemplo 4, Fig.4) sin afectar la superficie de expresión de CD11b o CD 11 c en los monocitos (no mostrados). Ninguno de los otros ligandos experimentados tienen algún efecto. La CD23 puede actuar como una lectina de tipo C en ésta interacción con CD 11 b y CD 11c. El EDTA disminuye a CD23 enlazante a los monocitos 2+ (Ejemplo 4, fig.4) por quelación de Ca el cual es necesario para el CD23 enlazante y/o por quelacidn de los cationes divalentes los cuales son necesarios para los enlazantes de los ligandos a CD 11 b y CD11c (Altieri, D.C. J. Immunol 147, 1891-1898 (1991)). Las interacciones CD23-CD11 b/CD11c parecen involucrar azúcares, pero no ácido siálico, como se observó por la capacidad del tunica icin, pero no de la neuraminidasa, para disminuir a CD23 enlazante a los monocitos. Las CD23 llevan extracelularmente un triplete de aminoácidos (Asp, Gli, Arg) (kikutani, H. et al. Cell 47, 865-885 (1986)), el cual en la orientación opuesta es un lugar de reconocimiento común para los receptores de integrinas. Por lo tanto, el efecto de un anticuerpo policlonal dirigido contra éste tripéptido fue experimentado por su capacidad para inhibir a CD23 enlazantes a los monocitos. Sin inhibición se observó, confirmando la ausencia de la inhibí-cidn obtenida con fibrinogeno (Ejemplo 4, Fig. 4.). El IgE el cual es enlazante en el dominio de la lecticina de CD23, parcialmente inhibe las CD23 enlazantes a los monocitos (Ejemplo 4. Fig, 4). Estos resultados indican que CD23 puede aparecer actuando como una lectina de tipo C, parcialmente reconociendo estructuras de azúcar y proteínas, recordando de que han sido observados por la interacción de CD23 con CD21 (Aubry, J-P. et al. J. Immunol. 152, 5806-5813 (1994)).

Para evaluar la significancia funcional de la interacción de CD23 con CD11b o CD11c, investigamos si la interacción CD23-CD11 b/CD11c puede poner en funcionamiento monocitos para liberar los mediadores proinflamatorios tales como óxido nítrico H202 y citocinas. El funcionamiento de la adherencia activada de los monocitos normales usando recombinantes solubles de CD23, anticuerpos anti -CD11 b o anti-CD11c incrementa la generación de N02 indicando la activación del camino NO (Moneada, S., Palmer, R.M.J. & Higgs, E.A. Pharmacol. Rev. 43, 109-144 (1991)). El efecto de CD23 en la producción de nitrito fue inhibida por los fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales anti-CD23 y por nitroargi-nina, un inhibidor específico de la vía sintasa NO (Ejemplo 5, Fig.5a). El estallido oxidativo mostró también gue es regulado a través de CDllb y CDllc ya gue el recombinante soluble CD23, y los anticuerpos monoclo-nales anti-CD11b y anti-CD11c todos causan oxidación de la hidroetidina a bromuro de etidio en monocitos (Ejemplo 5, Fig, 5b). Esto confirma y amplia el resultado de que los anticuerpos onoclonales ant i-CD11 b inducen un estal la iento oxidativo en los monocitos. (Trezzini, c, Schfiepp, B., Maly, F.E. & Jungi, T.W. Brit. J. Haematol, 77, 16-24 (1991)). La CD23 enlazante a CD 11 b y a CD11c fue asociada con un flujo de Ca 2+ específicos prematuros en monocitos de la sangre (no mostrado).

Ya que la actividad de los acrófagos es una fuente importante de citocinas proinflamatorias, evaluamos los efectos del CD23 recombinante soluble y de anticuerpos monoclonales anti-CD11b y anti-CD11c en la producción de tales citocinas por los monocitos. La CD23 recombinante soluble y los anticuerpos monoclonales anti -CD11 y anti-CD11c fueron-potentes estimuladores de IL-1JJ, IL-6 y TNF<=<.. Nuevamente, la especificidad de esta inducción fue demostrada por la utilización de fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales anti-CD11b, anti-CD11c y anti-CD23 (Ejemplo 6, Fig. 6). Interesantemente, IL-1^ y TNF--- fueron potentes inductores de la liposoma CD23 enlazante a los monocitos (no mostrado), sugiriendo un ciclo potencial de citocina autocrina a través de la estimulación y regulación de CD 11 b y CD11c.

EJEMPLO 1 a) Liposomas CD23 que enlazan a células mono-nucleares de sangre CD14 positiva (ver figura 1a).

Células mononucleares de sangre fueron teñidas con anticuerpos monoclonales anti-CD14 (Becton Dickinson, Erembodegem, Bélgica) seguido por anticuerpos F(ab')2 de carnero FITC conjugados a ratones IgG y IgM (Bioart, Meudon, Francia), ambos diluidos con PBS, 0.5% BSA y 0.05% de azide de sodio antes de la distribución de FACS (FACStar Plus, Becton Dickinson) dentro de las poblaciones de células CD14 positivas y CD14 negativas. Las células separadas luego fueron teñidas con liposomas CD23 o de control (glicoforina A), las liposomas diluidas en 0.5% de BSA, 0.1% de azida de sodio, 2mM de CaCl2, 140 mM de NaCl, 20 mM de Hepes, a pH 7 e incubadas por 2 horas a 4°C (Pochon, S. et al., J. Exp. Med. 176 389-398 (1992)). Después de lavadas, las células; (5,000 eventos/condiciones) fueron analizadas por FACS. b) Peso molecular aparente de proteínas de monocitos de sangre purificada afines a CD23 e inmunoreacti vadas con un anticuerpo monoclonal anti-CD11c (ver Fig. 1b) .

Disueltas por las lisinas de los monocitos de la sangre fueron purificados semejantemente en una columna CD23, las proteina eluídas separadas en geles SDS-PAGE y transferidas sobre nitrocelulosa. Los marcadores Mr están mostrados en la izquierda. El gel fue teñido con plata (vía izquierda). Los filtrados fueron incubados con cualquiera de los dos anticuerpos de igual isotipo (vía intermedia) o con un anticuerpo monoclonal anti-CD11c (BU-15 vía derecha), luego con peroxidasa de rábano picante conjugado con anticuerpos anti-ratdn de cabra (Kpl; Gaithersburg, Massachusetts) .

EJEMPLO 2 Decremento de anticuerpos monoclonales anti-CD11b y anti-CD11c en liposomas CD23 enlazantes a monocitos de sangre activada (ver figura 2).

Los monocitos fueron enriquecidos con células mononucleares por Ficcol y toda la noche con adherencia al plástico en RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementada con 2mM de glutamina y 10% de FCS inactivado por calor (Flow Laboratories, Irvine, Escocia). Los monocitos activados luego fueron incubados con liposomas CD23 en la presencia de diferentes anticuerpos monoclonales (* CD) o con controles de isotipos iguales (CTRL) (Becton Dickinson), todos experimentados a lO^g/ml. Los anticuerpos monaclonales anti-CD 11 a 25.3 y B-B15 fueron obtenidos de Im unotech ( Luminy, Francia) y Serotec (Oxford, UK) respectivamente. Los 44 anticuerpos monoclonales anti-CD11b provinieron de Serotec, mon.gran 1 de Janssen (Beerse, Bélgica), Leu-15 de Becton Dickinson (Erembodegem, Bélgica) y (Bear-1) de Sera-Lab Ltd (Sussex, GB). 3.9 anticuerpos monoclonales anti-CD11c provinieron de Serotec, SL9 fue de Sera-Lab y BU- 15 provino de The Binding Site (Birmingham, UK). Los anticuerpos monoclonales anti-CD13 (SJ1D1), anti-CD18 (BL 5), anti-CD23 (mAb25) y anti-CD49d (HP2.1) provinieron de Im unotech. El anticuerpo monoclonal anti-CD21 BL13 provino de Im unotech, 0KB7 de Ortho y BU-33 fueron obtenidos del Dr. MacLennan (Birmingham University, UK), HB-5 de ATCC, 0KB7 de Ortho Diagnostics System Ine (Raritan, NJ). Los anticuerpos monoclonales anti-CD14, anti-CD3, anti-CD16 y anti-CD20 provinieron de Becton Dickinson, Las células fueron analizadas por FACS y medidos por medio de la intensidad fluorescente ( MF I ) . Son presentado s l os resu l tados de un experimento representativo.

Las células MFI teñidas con liposomas de control, fueron 6.5 y con liposomas CD23 fueron 8.5. El porcentaje de inhibición usando aritmética linear, evaluadas por MFI se calculó de conformidad con la siguiente fórmula: de inhibición = MFI 1 O ÍPQ- D 3) [-| ( 1 ipo-CD23)+Mab | ? ] Q Q (lipo-CD23) EJEMPLO 3 Liposomas CD23 enlazan a cadenas<>¿- de CD 11 b/CD 18 y CD 11 c/CD 18 en transfectantes recombinantes (ver figura 3).

Códigos cDNAs para CD11 a (Corbi, A.L., Miller, L.J., O'Connor, K., Larson, R.S. & Springer, T.A. EMBO J. 6, 4023-4028 (1987)) fueron reclonados en pCDNAl (Invitrogen, San Diego, CA). El cDNA para CD 11 b (Corbi, A.L., Kishimoto, T.K, Miller, L.J. & Springer, T.A. J. Biol. Chem 263, 12403-12411 (1988)) y CD18 (Kishimoto, T.K, O'Connor, K, Lee, A, Roberts T.M. & Springer, T.A. Cell 48, 681-690 (1987)) fueron reclonados en pCDM8 (Seed, B., Nature 329 840-842 (1987)). 20 ^g alícuotas de DNA fueron transfectados en células C0S-7 (ATCC) por electroporación (260 V, 960 juFD) usando un aparato Pulsador de Gen (Bio-Rad, Rich on, CA) y probetas de 0.4 cm en 20mM de Hepes a pH de 7.4, en 150 mM de NaCl. Las cotransfecciones de CD 11a, b o c con CD18 fueron realizadas en orden para obtener la expresión de las 2 integrinas a la superficie de la célula. Los controles fueron hechos con transfecciones de cadenas individuales, 48 horas después de la transfeccidn, las células COS fueron teñidas con anticuerpos monoclonales anti-CD11a, anti -CD 11 y anti-CD11c o anticuerpos mono-clónales de isotipos iguales (control) seguido por anticuerpos anti-raton de carnero rotulados como FITC. Entre un 10 a 15% de las células se mostraron para expresar CD 11a, b, c o CD18 por la coloración con los anticuerpos monoclonales respectivos. Antes de teñir con las liposomas CD23, las células COS transfectadas con CD18 positivas, luego fueron de tipo FACS a fin de incrementar el porcentaje de células expresantes de la ^2 integrinas. Las transfectantes CDlla/CD CD11b/CD18 y CD11c/CD18 luego fueron incubadas con liposomas CD23 (traza 2) o control (glicoforina A)- liposomas (traza 1). La especificidad de la interacción de CD23 con CD 11b y CD11c fue demostrada por la inhibición del liposoma CD23 enlazante a CD11 b/CD18 y CD11 c/ CD 18 transfectantes, usando anticuer-pos monoclonales anti -CD11 b ( traza 4), anti-CD23 ( traza 5) y anti -CD11 c ('traza» 6), respectivamente. Sin las liposomas enlazantes CD23 observadas en transfectantes CD 11 a/CD 18 no se encontró efecto de anticuerpo monoclonal anti-CD11a (traza 3).

EJEMPLO 4 Caracterización estructural de la interacción CD23-CD11 b, y CD11c, (ver figura 4) . (a) Participación de azúcares y cationes divalentes.

Monocitos de sangre activada purificada fueron tratados o no con tunicamicin (10 jug/ml) por 48 horas o con neuraminidasa (0.1 U/ml; ambos provenientes de Boehringer Menhei , Mannhein, Alemania) por 45 minutos. Las células fueron luego incubadas con liposomas CD23 o con liposomas de control en la ausencia o presencia de EDTA (5 mM; panel izquierdo superior), 2+ 2+ Ca O Mn (1 a 10 M; panel derecho superior) (b) El Factor X hace inhibir la CD23 enlazante a los monocitos.

Monocitos de s angre activada purificada fueron incubados con liposomas CD23 en la ausencia o o presencia del Factor X (0.1 a 10 U/ml; Sigma) (panel izguierdo inferior), fibrinogeno (50 jug/ml; Sigma), ICAM-1 recombinante purificado (producido en nuestro laboratorio), LPS (1 /ig/ml; Sigma), zimosan opsonizado con suero (1 mg/ml; Sigma), IgE (50 µg/ml; The Binding Site, Birmingham) ó anticuerpo policlonal al péptido RGD (1/500, ATCC) (panel derecho inferior). Las células fueron analizadas por FACS y medidas por MFI. El porcentaje de inhibición fue calculado como en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 5 CD23 recombinante, mediante el enlace a CD 11 b y CD11 c incrementa específicamente a, el producto nitrito y b, el esta-llido oxidativo por los monocitos.

Los monocitos fueron incubados a, por 4 días a 37°C o b, en la ausencia o presencia de un CD23 soluble recombinante (Graber P. et al., J. Immunol, Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/ml), anticuerpos monoclonales anti-CD11a (clon 25.3), anti-CD11b (clon 44), anti CD11c (clon BU-15) (todos a 10 /jg/ml).

Pa a valorar la cantidad de NO producida, (la cual se muestra en la figura 5a), el sobrenadante del cultivo fue experimentado por los productos finales estables de NO, N02 y NOl de conformidad con Green et al., Annu. Rev. I unol. 2 199-218 (1984). La especificidad del incremento del CD23 mediador de la producción de N02 fue demostrado por la inhibición de la producción de NOl por fragmentos de Fab de anticuerposs monoclonales anti-CD23 (mab 25) (experimentado a 10 ug/ml ) y por la inhibición con nitroargi-nina (N-Arg a 1 M) (Sigma).

Los monocitos activados fueron incubados con hidroetidina (Molecular probes, Eugene, OR) (0.3 µ g/ml) por 30 minutos a 37°C (Rothe G. et al., J. Leukoc. Biol. 47 440-448 (1990)) y analizado por FACS. El incremento del porcentaje en la fluorescencia roja de los monocitos estimulados se muestra en comparación con los monocitos sin tratamiento (ver figura 5b). Los monocitos los cuales experimentaron un estallido oxidativo muestran un incremento de las señales fluorescentes rojas comparados con los monocitos sin tratamiento reflejando oxidación de la hidroetidina a bromuro de etidio (Lacal P. M. et al., Biochem, J. 268 707-712 (1990)). Los valores de MFI de los monocitos solos fueron 159+/-10. Se presentan valores de 6 experimentos Medio +/-SD. Con A, el cual es conocido para inducir un estal lamiento respiratorio en los monocitos, fue usado como un control positivo. La especificidad de la interacción de CD23 con CD 11 b y CD 11 c fue demostrada por la inhibición del incremento del CD23 mediador de la producción de H202 6or los fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales ant i -CD 11b (clon 44), anti-CD11c (clon BU-15) y anti-CD23 (mAb25) (experimentados a , 0 ßg/ \ ) .

EJEMPLO 6 Mediante el enlace de CD23 recombinante a CD 11 b y CD11 c , se incrementa específicamente la producción de citocina por los monocitos (ver fig. 6).

Los monocitos fueron incubados durante la noche a 37°C en la ausencia o presencia de CD23 soluble recombinante (Graber P. et al., J. Immunol. Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/ml) anticuerpos mono-clónales anti-CD11a (clon 25.3), anti-CD11 b (clon 44), anti-CD11c (clon BU- 15), anti-CD23 (mAb-25- este anticuerpo es obtenible de Immunotech. Esto está discutido en la publicación de la Solicitud de Patente Europea EP=A= 0269728), con A (Sigma) (todos a 10/tg/ml), LPS (1 ng/ml) (Sigma) o PMA (5 nl/ml) (Calbioche , La Jolla.CA). Las citocinas fueron medidas en el sobrenadante del cultivo por la prueba específica ELISA. Con la prueba de ELISA el límite de sensitividad es 0.05 ng/ml para IL-1JJ (Ferrua et al., J. Im unol, Methods 114 41-48 (1988)) 0.01 ng/ml para THf c (Medgenix; Biotecnie, Rungis, F) y <0.01 ng/ml para IL-6 (Manie et al., Eur. Cytocine Netw. 4 51-56 (1993)). La especificidad de la interacción de CD23 con CD 11 b y CD 11 c fue demostrada por la inhibición del mediador CD23 del incremento de la producción de citocina por los fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales ant i -CD 11b (clon 4), anti-CD11c (clon BU- 15), y anti-CD23 (mAb25) (experimentados a 10 yug/ml) Medio +/-SD de valores de 4 experimentos son presentados.

EJEMPLO 7 Los siguientes materiales y métodos fueron usados en éstos ejemplos: Lineas Celulares Células mononucleares de sangre o amígdalas fueron separadas en subpoblaciones celulares T y B empleando células de sangre roja de carnero.

La línea de célula B RPMI 8226 fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, MD) y cultivada en un medio completo de RPMI 1640.

Polipéptidos y ligandos CD21 Dos péptidos, de gp350 de EBV y C3 conocidos por enlazar a CD21 (Servís et al., C3 sybthetic peptides support growth of human CR2-positive lymphoblas-toid B cell, J. Immunol 142:207 (1989)) fueron sinte-tizados. El PepEBV (TGEDPGFFNVEIC-NH2) fue producido en un sintetizador ABI 431 A usando química FastMoc y PepC3 (GKQLYNVEAT-SYAC-NH2) fue obtenida de Neosystem (strasbourg, Francia). C3d,g agregado fue preparado como se describió previamente (Caret et al (1990) supra). El gradiente de sucrosa purificado EBV fue obtenido de Advanced Biotechnologies (Columbia, ML) y IFN-oC fue obtenido de Sigma (ST. Louis, MO).

Preparación de Liposomas Los liposomas CD23 fueron hechos como se describió previamente (Pochon et al, Demostration of a second ligand for the low affinity receptor for i unoglobulin E (CD23) using recombinant CD23 reconsti-ted into fluorescent liposomes, J. Exp Med 176: 389 (1992)) usando 10 u moles de fosfolípidos sintéticos POPC (Avanti Polarlipids Inc. Alabaster, AL) mezclado con 50 nmoles de color fluorescente D i 018 (Molecular Probes, Eugene, OR) y luego dializado con HEPES amortiguador junto con el CD23 recombinante purificado o con glicoforina A ( 0.2 /imoles cada uno) referido como una proteína de control.

Cito etria de flujo Ensayo de enlace de liposomas Se resuspendieron células (10 ) en 50 jal de la suspensión de liposomas, diluidas 10 veces en 0.5% de BSA, 0.1% de NaN3, 2mM de CaCl2> 140 mM de NaCl, 20 mM de Hepes, a pH de 7.0 e incubadas por dos horas a 4°C.

Las células fueron lavadas dos veces antes del análisis en una FACStar Plus (Becton Dickinson Erembodeggen, Bélgica).

Competición de liposomas CD23 con EBV, péptido EBV, INF-oL péptido C3 y C3d,g. Células de RPMI 8226 fueron coincubadas con liposomas de glicoforina o liposomas CD23 y EBV ( 1 x1 O5 a 1x10 particulas/ml) , el péptido EBV y el péptido C3 (50 nM a 50 µM), agregando C3d,g (4 ng/ml a 1 jug/ l) y iFN-ac (1000 U/ml) por 2 horas a 4°C. Las células fueron analizadas como se describió anteriormente.

Ensayo de la producción de Ig inducida por IL-4 Las células fueron incubadas a 10 /mi por 14 días en un medio Iscove enriquecido con transferina, insulina bovina, ácido oléico, ácido 1 i nol éi co, ácido pal-mítico, BSA (todos de Sigma) y 10% de FCS (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) como se describió por Claa-sen el at (A cell culture system that enhances mononuclear cell IgE synthesis induced by recombinant interleukin-4, J. Immunol Methods 126: 213 (1990)). Los ensayos fueron realizados usando PBMNC total con IL-4 solo (200 U/ml) o IL-4 plus anti-CD40 (1 µ g/ml) (Serotec Ltd. Oxford, UK), o usando células B de amígdalas, purificadas con IL-4 y anti-CD40. Ig, G, A y M fueron cuanti ficadas por la prueba específica de ELISA como se describió previamente (Bonnefoy et al, Inhbition of human interleukin-4-induced IgE synthe-sis by a subset of anti-CD23/Fc epsilon RII monoclonal antibodies, Eur J immunol 20: 139 (1990)). El IgG4 fue medido por la prueba de ELISA como sigue. Un anticuerpo IgG4 antihumano de ratón (Southern Biotech-nology, Birmingham) diluido a 10 µg/ml en un amortiguador de bicarbonato, pH de 9.6 fue revestido durante la noche en placas de 96 pozos ( 100 /jl/pozo ). La saturación luego fue realizada con PBS plus 1% de BSA (200 µl/pozoO por 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras experimentada fueron diluidas en PBS plus 0.5% de BSA y 0.1% Tween (100 µl/pozo) e incubado durante la noche a 4°C. Después de lavarlos con PBS plus Tween, un anticuerpo IgG4 antihumano de cordero rotulado con peroxidato (Vital products, ST Louis, M0) diluido 1/5000 en PBS/BSA plus Tween fue añadido por 1 hora a temperatura ambiente. Despué de lavarlos con PBS plus Tween, diamina o-fenilina (Sigma) se añadió y la reacción colorimétrica fue detenida con 2 M de H2S0». Las placas fueron finalmente leídas a 492 nm.

Los resultados obtenidos se discuten a continuación: El CD21 humano ha sido descrito previamente por ser un receptor para las proteínas C3d,g y iC3b del sistema complementario (Weis et al, Identification of a 145,000 Mr membrane protein as the C3d receptor (CR2) of human B ly phocites Proc Nati Acad Sci USA 81: 881 (1994)) para el gp350/220 involucrando glucopro-teína de EBV (Nemerow et al., Identification of gp 350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein Barr Virus (EBV) to the EBV/C3d receptor of B cells: sequence ho ology of gp350 and C3 complement fragment C3d, J Virol 61: 1416 (1987); Tanner et al, Epstein Barr Virus gp 350/220 binding to the B lymphocite C3d receptor ediates adsorption, capping and endocytosis, Cell 50: 203 (1987)) y para IFN- (Delcayre et al, Epstein Barr Virus/comple ent C3d receptor is an interferon receptor, EMBO J 10:919 (1991)). Se ha experimentado por lo tanto, a estos ligandos por su habilidad para inhibir la liposoma CD23 enlazante a las células expresantes de CD21, células RPMI 8226 (Pochon et al., (1992) supra). Partículas intactas de EBV fueron capaces de inhibir a CD23 enlazante a CD21 en una dosificación de forma independiente. Esto se muestra en la figura 7a, la cual ilustra la inhibición del liposoma CD23 enlazante a células RPMI 8226 por algún ligando CD21. [células de RPMI 8226 fueron coincubadas por 2 horas con liposomas CD23 o liposomas de glicoforina a varias concentraciones de EBV (partículas/mi), PepEBV y PepC3 (µM). El porcen-taje de inhibición se calculó como sigue: (MFI CD23-L -(MFI CD23-L + ligandos) x 100 (MFI CD23-L) El MFI de las liposomas glicoforinas fue substraído del MFI de las liposomas CD23. Perfiles de flujo-FACS de células de RPMI 8226 teñidas con liposomas glicoforina (traza 1) o liposomas CD23 (traza 3) solas o en la presencia de partículas de EBV (superior ) ,PepEBV (medio) y PepC3 (inferior)( traza 2). Los resultados se tomaron de un experimento representativo] .

De los otros ligandos CD21 experimentados por la inhibición de la liposoma CD23 enlzante, únicamente EBV disminuye al enlazante de CD23. Una inhibición completa de enlazantes CD23 fue observada con partículas intactas de EBV, aunque la EBV se reportó para enlazar a SCR 2 de CD21 y no para SCRs 5-8 en donde los CD23 enlazan a los azúcares en ésta última región (Aubry et al., (1994) supra). Esta inhibición completa de CD23 enlazantes puede ser debido al tamaño de las partículas del virus o al factor que EBV puede modificar en la conformación de la molécula CD21. A fin de excluir que la inhibición fue debido a impedimentos estéricos por las partículas del virus, fue probado el efecto de un péptido de gp350/220, conocido para enlazar a CD21 ( Servis et al., (1989) supra). Este péptido EBV fue capaz de inhibir a CD23 gue enlaza a CD21 en una dosis de forma dependiente con un máximo de 55% de inhibición (fig. 7a). Estos experimentos sugieren que el péptido EBV enlazante está cercano al sitio de enlace CD23 y parcialmente bloquea el enlace CD23. Esta información nos confirma la gue se encontrol previamente gue CD23 se enlaza a CD21 (Aubry et al, CD21 is a ligand for CD23 and regulates IgE production, Nature 358:505 (1992)) al grado gue se puede mostrar gue SCR2 es probablemente una región interactuante con CD23. En contraste, un péptido C3 correspondiente al sitio enlazante CD21 en C3d (Servís et al., (1989) supra) (Fig 7 a), agregando C3d,g y IFN-?. (datos no mostrados) fueron incapaz de inhibir los enlazantes de CD23 a células de RPMI 8226. Esto significa que SCRs 1 Y 3-4 , en donde C3 y IFN-^ se enlazan respectivamente, no puede ser involucrado el enlazante CD23.

El EBV enlazante a CD21 no requiere de gl icosi lacidn de SCR2 de CD21 (Moore et al., Inhibition of Epstein Barr Virus infection in vitro and in vivo by soluble CR2 (CD21) containing two consensus repeats, J Virol 67: 3559 (1991)). Del mismo modo, el CD23 enlazante a la región SCR2 es independiente de azúcares (Aubry et al., (1994) supra). Esto está en línea con nuestra observación de que un péptido sintético no glicosilado es capaz de disminuir a CD23 enlazante a CD21. Por lo tanto, CD23 enlaza a un sitio de enlace mediante en SCR2 o CD21 que es parecido o idéntico al sitio del enlazante EBV el cual difiere de los sitios enlazantes descritos previamente para C3d,g y IFN-¿.

Se mostró precisamente gue CD23 regula positivamente la producción de IgE por un enlace con CD21 en células B (Aubry et al (1992) supra). Basado en la observación de que un CD23 bloqueado en el péptido EBV se enlaza al CD21, se investigó el efecto de éste péptido EBV en la producción de IgE. El péptido EBV fue capaz de inhibir la producción de IgE inducida por IL-4 en una dosis de forma dependiente. Esto se muestra en la figura 7b, la cual ilustra la inhibición de la producción de IgG4 y IgE inducida por IL-4 por un péptido enlazante a CD21, [células B de amígdalas purificadas o PBL (10 /mi) fueron incubadas por 14 días con 200 U/ml de IL-4 solo o en la presencia de un anticuerpo anti-CD40 (1 µg/ml) e incrementando las concentraciones del péptido EBV. El IgE y IgG4 fueron medidos por la prueba específica ELISA y los valores medios +/-SD de un experimento representativo son presentados (n=4)].

Este efecto fue observado en las células T dependientes y también en las células T independientes de los sistemas de producción de IgE (Fig 7b), en la cual la ayuda de las células T es reemplazada por un anti-CD40 Ab. Esto confirma nuestra observación previa (Henchoz et al ,Stimulation of human IgE production by a subset of anti-CD21 monoclonal antibodies: requirement of a co-signal to modulate transcripts, 81: 285 (1994)) que CD23-CD21 puede regular la producción de IgE aún en la ausencia de células T por una interacción de células B-B homotípicas ya que las células B pueden expresar ambas moléculas CD23 y CD21. El EBV intacto ha sido reportado por proveer señales permitidas para intercambiar IgE (Thypronitis et al., IgE secretion by Epstein-Barr Virus infected purified human B lymphocites is stimulatés by interleukin-4 and suppressed by interferon-Y , Proc Nati Acad Sci USA 86: 5580 (1989)), de las mismas células T o CD40L. En contraste con las partículas EBV, el péptido EBV es incapaz probablemente de enlazarse en forma cruzada a la membrana CD21 y es por lo tanto, incapaz de incrementar la producción de IgE. El péptido EBV es más inhibidor disminuyendo la producción de IgE por la prevención de la interacción CD23-CD21.

Ya que IL-4 se conoce por inducir IgG4 así como IgE (Lundgren et al, Interleukin-4 induces synthesis de IgE and IgG4 in human cells, Eur J Immunol 19:1311 (1989)), se investigó el efecto del péptido EBV en la producción de IgG4 inducida por IL-4. Como se mostró en la Fig 7b el péptido EBV fue también capaz de inhibir IgG4 en una dosis de manera dependiente. Esta observación sugiere que la interaccioón CD23-CD21 también controla la producción de IgG4.

El efecto del péptido EBV fue luego investigado en la producción de otras clases de Ig. No se encontró efecto significante en la producción policlonal de IgG y de IgA. Esto se muestra en la Figura 7c, la cual ilustra la regulación de la producción de inmunoglobulina por un péptido EBV enlazante a 6 CD21. [PBL o células B de amígdalas purificadas (10 /mi incubadas por 14 días con 200 U/ml de IL-4 solas o en presencia de un anticuerpo anti-CD40 (1 µg/ml) e incrementando las concentraciones del péptido EBV. El Ig fue medido por la prueba específica de ELISA y los medios valorados +/-SD de un experimento representativo son presentados En contraste, la producción de IgM fue incremen-tada significativamente en la presencia del péptido EBV, especialmente cuando el PBL fue usado completamente (Fig 7c).

No todos los ligandos CD21 pueden regular la producción de IgE/IgG4. Un péptido C3 enlazante a CD21 no hace inhibir la producción de IgE y de IgG4 (no mostrado). Esto se muestra en la figura 7d, la cual ilustra la ausencia de la inhibición de la producción de IgE con un péptido enlazante a CD21 [células B de amígdalas purificadas (10 /mi) incubadas por 14 días con 200 U/ml de IL-4 y un anticuerpo anti-CD40 (1 µg/ml) e incrementando las concentraciones del péptido C3 o el péptido EBV. El IgE fue medido por la prueba específica de ELISA y los valores medios +/-S de un experimento representativo son presentados El péptido C3 no inhibe al CD23 enlazante (Fig 7a.). Estos resultados destacan la correlación entre la pereja de CD23-CD21 y la producción de IgE/IgG4. El IFN-?. no se experimentó ya que es conocido que el IFN-Jc inhibe la producción de IgE (Pene et al., IgE producción by normal human lymphocites is induced by IL-4 and suppressed by < -interferon, -inter-feron, and prostaglandin E2, Proc Nati Acad Sci USA 85: 8166 (1988)), aunque el IFN-O- no tiene efecto en el CD23 enlazante a CD21 (no mostrado).

En conclusión, estos estudios por lo tanto, muestran que un péptido EBV disminuye al CD23 enlazante a CD21 y disminuye selectivamente la producción de IgE y de IgG4 por células humanas B.

EJEMPLO 8 CD23 enlazan a células endoteliales Una línea de células endoteliales (LT2, Endo-lethium vol 2, p 191-201, 1994) o células endoteliales de vénula umbilical purificadas de un humano, fueron incubadas con liposomas CD23 (CD23L), o liposomas glicoforina (L-Gly) como un control. La especificidad del enlazante fue demostrada por la inhibición de la liposoma CD23 enlazante por un anti-CD23 mAb(mAb25= a-CD23). Las células fueron analizadas por FACS y medidas por MFI.

Los resultados están mostrados en la figura 8.

Las proteínas derivadas de LT2 fueron 5 purificadas en una columna de afinidad a CD23. Dos bandas de 76 y 115 KDa fueron identificadas.

Se hace constar que con relación a ésta fecha, el mejor método conocido por la Solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el concenvional para la manufactura de los objetos a los que la misma se refiera.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como proiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un agente enlazante a CD21, CD 11b, CD 11c, a una proteína de 70-85 KDa expresada en células endoteliales, o a una proteína de 115 KDa expresada en células endoteliales, para uso en el tratamiento o profilaxis de padecimientos inflamatorios, autoinmunes o alérgicos.

2. Un agente enlazante, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente enlazante es un anticuerpo, un fragmento del mismo, o una construcción artificial que comprende un anticuerpo o que comprende un fragmento del mismo, o imitación, o un derivado de cualquiera de esos agentes enlazantes.

3. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado o quimerizado.

4. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un virus de Epstein Barr un Factor X, una parte del virus de Epstein Barr (el cual puede estar en forma glicosilada o sin glicosilar), un fragmento del Factor X, o un derivado de cualquiera de esos agentes enlazantes.

5. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es la gl icoproteína gp350/220 del virus de Epstein Barr , la proteína correspondiente en forma sin glicosilar, un fragmento de la gl icoproteína o proteína antes mencionada, o un derivado de cualquiera de esos agentes enlazantes.

6. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es un pépti do con la secuencia de aminoácidos TGEDPGFFNVEIC, un fragmento de la misma, o un derivado de dicho péptido o fragmento.

7. Un agente enlazante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, carac-terizado porque bloquea u obstruye la interacción entre el CD23 y los ligandos los cuales lo enlazan in vivo.

8. Un agente enlazante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso en el tratamiento de artritis, lupus erite- matosus, lupus eritematosus sistémico, tiroiditis Mashi otos, esclerosis múltiple, diabetes, uveitis, dermatitis, soriasis, urticaria, síndrome nefrótico, glomeru- lonefritis, padecimiento del intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren, alergias, asma, eczema, GVH, COPD, Bronquitis, insulitis, rinitis o diabetes.

9. Un agente enlazante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en el tratamiento de artritis, alergias, colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.

10. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de artritis reumatoidea.

11. El uso de un agente enlazante a CD21, CD11b, CD11C, a una proteína de 70 a85 KDa expresada en célulasendoteliales, o a una proteína de 115 KDa expresada en células endotelialesrpara la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la artritis, lupus eritematosus, lupus eritematosus sistémico, tiroiditis Mashimotos, esclerosis múltiple, diabetes, uvitis, dermatitis, soriasis, urticaria, síndrome nefró-tico, glo erulonefritis, padecimiento del intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren, alergias, asma, eczema, GVH, COPD, bronquitis, insulitis, rinitis o diabetes.

12. El uso de un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por ser para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de artritis, alergias, colitis ulcerativa, o enfermedad de Crohn.

13. El uso de un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porgue se emplea para la preparación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoidea.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un agente enlazante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un agente enlazante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado como substancialmente se describió aquí.

16. Un método de tratamiento de un padecis- miento inflamatorio, autoinmune o alérgico, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de un agente enlazante a CD21, CD 11 b , CD 11 c , a una proteína de 70-85 KDa expresada en células endoteliales, o a una proteína de 115 KDa expresada en células endoteliales en un paciente. 10 15 20 25