MXPA97002388A - Anticuerpo monoclonal para mioglobina cardiaca de humano - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene alta afinidad para mioglobina cardiaca de humano, que ha sufrido un cambio conformacional que resulta de la unión de la molécula a otra molécula;este anticuerpo monoclonal puede usarse en un sistema de inmunoensayo de doble anticuerpo de rápido formato para identificar niveles de mioglobina cardiaca en sangre, suero o plasma;dicho sistema de inmunoensayo puede usarse para diagnosticar y cuantificar microsis e infarto de miocardio.

Description

RNTICUERFíQ riQNQGLQNflL P Rñ piP6LQBINñ CRRDIflCñ DE HUflRNQ CRI1PQ PE fl INVENCIÓN Esta invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que demuestra unión específica a mioglobina cardiaca humana. Más específicamente, esta invención se refiere a un anticuerpo monoclonal q ,e reconoce un epítope de la molécula de rnioglobi a que solamente está expuesta corno resultado de haber sufrido un cambio de conformación que es el resultado de una molécula a otra molécula. La presente invención se refiere también a la linea de células de hibridoma, designada corno 5P1b-64 y al anticuerpo rronoclonal producido por la misma. La presente invención se refiere adicionalmente a un sistema de diagnóstico que utiliza el anticuerpo monoclonal procedente de 1.a linea de células de ibridoma 5Mb~64, como un anticuerpo en un análisis de emparedado para detectar de rnioglobina en sangre , suero o plasma. El anticuerpo es particularmente útil en UN sistema de análisis de formato rápido.

LOS ANTECEDENTES Y Lfl TÉCNICA ANTERIOR La mioglobina es una de las proteínas principales en el músculo esqueletal y cardiaco. Este heme proteína que une oxígeno consta de una sola cadena de péptidos con un peso molecular informado de 17.8 kDa. La estructura terciaria de la mioglobina ha sido estudiada extensamente y se informa que el 75% de la cadena principal está plegado en una conformación alfa-helicoidal (Edmundson F B., Biochem Prep. 1968; 12, 41-52; Kagen L.3. :i973) En: F. Borek (Ed. ) Myoglobin, Biochernical , P ysiological and Clinical flspects, Colu bia University Press, Nueva York) . Si bien su función fisiológica precisa sigue siendo controversia:., se sabe que su capacidad para combinarse reversiblemente con el oxigeno es reflejante de su papel en el transporte de oxígeno a las células musculares. Los niveles de mioglobina normales en el humano, en la sangre, varían desde 0 hasta 70 ng/ml. Después de un daño muscular, se incrementa dramáticamente los niveles de mioglobina en el suero tanto cardiaco como esqueletal. Como un reflejo de su tamaño molecular pequeño, la mioglobina es capaz de traslocarse hacia el sistema vascular sin procesar en el sistema linfático. En ciertas alteraciones y/o enfermedades, se sabe que se eleva la mioglobina €>n el suero. Esta elevación se cree que es provocada por la liberación de la rnioglobína a partir de células musculares dañadas o necróticas. El infarto al miocardio agudo (AMD afecta a millones de personas cada año, muchas de las cuales mueren debido a que no se tuvo a tiempo el diagnóstico o el tratamiento para salvar su vida. Los estudios han demostrado que si se lleva a cabo un diagnóstico correcto de RMI y si se efectúa una intervención terapéutica apropiada en el termino de las primeras se s horas desde el inicio del dolor de pecho, las probabil dades de sobrevivencia se incrementan en gran medida. Asi pues, la meta de los mvest igadores médicos ha sido desarrollar un sistema analítico que identifique aquellos indicadores tempranos de esta condición. En los pacientes de infarto al miocardio, se sabe que los niveles de rnioglobma en sangre, en suero y en plasma cardiacos están por encima de lo normal ya desde Jos 30 minutos después del inicio del dolor de pecho. De hecho, en algunos pacientes de infarto al miocardio los niveles de mio lobina cardiaca pueden aumentar hasta diez veces los de una persona normal durante el transcurso del infarto al miocardio. Se dice que la mioglobina exhibe una liberación temporal a la circulación. En los pacientes con infarto al miocardio los niveles de mioglobma pueden elevarse por encima de lo normal en el término de dos horas, llegando los niveles de suero al pico en 6-9 ñoras, y regresando nuevamente a niveles normales a las 24 hasts 36 horas después del inicio del dolor <1e pecho (Vaidya H.C., L ora+ory Medicine, 1992; 23:306-310). De tal manera, la vigilancia de ia liberación rápida de la rnioglobma cardiaca puede ser usada como un indicador de infarto al miocardio. Los pacientes con infarto al miocardio en las etapas tempranas de la enfermedad (antes de las 6 horas) frecuentemente reciben un tratamiento de reperfusion con estreptoqumasa o TPA (activador del plasminógeno del tejido) .

Estos agentes t romboi t i eos actúan para i establecer el flujo <le sangre en 1 DS vasos ocluidos. La mpdicion en serie de la rnioglobina ?a demost i ado se útil en l a vigilancia de estos tratamientos, puesto que los niveles pico de rnioglobma se presentan ap -oxirnadarnente 45 minutos después de la reperfusion satisfactoria (El lis A.K., y coautores, Circulation, 1985; 72:639-647) . Se ha establecido varios métodos de detección para ia rnioglobina, pero cada uno de ellos tienen limitaciones que afectan directamente su utilidad clínica. La necesidad de un método no invasor para la detección de rnioglobina fue efectuado hace mas de 25 años, y las primeras pruebas desarrolladas fueron los radioinmunoanál ísis (Stone M.J. y coautores, Clin. Invest., 197E>; 56:1334-1339). En esos análisis, se combino la muestra de suero con una rnioglobina radiomarcada y un anticuerpo policlonal antunioglobina. Luego se precipitaba el anticuerpo con un segundo anticuerpo policional radiornarcado. La concentración de mioglobina en la muestra se calculaba en base en la inversa de la cantidad de radioactividad precipitada. Este método estaba limitado ya que era necesario la presencia de técnicos extremadamente expertos, era tardada y poseía un riesgo de radiación. El método de aglutinación con látex, para ía detección de la ioglobina, utiliza anticuerpos onoclonales dirigidos a la ioglobina, que han sido inmovilizados sobre particular de látex (Chappelle 3.P. y coautores, Clin. Chirn. fleta 1985; 1 5:1 3-1 0). Estos anticuerpos inonoclonales se combinan con inioglobma de suero y ropnan agregados. La cuantificacion de la agregación os proporcional a la concentración de la rniogiobma. Este an lisis es mas r pido y práctico que el radioinmunoana isis (RÍA) pero solamente se produce resultados semicual i t<At ívos. Este método fue adaptado recien emen a tanto al sistema turbidorne* rico ( T?rt irner, Behring, Alemania, Tuengler P. y coautores, Behring Inst, Mi 1. , 1988; 82:202-308) como al sistema m unon folornetp co (NA Látex Hyoglobm, Behring, Alemania, Massoubr , C. Clin. Chirn. Acta., 1991; 201:223-230). Estos dos métodos informan variación baja mtraanal tsis e interanalisi s. Estas métodologias, sin embargo, están limitadas debido al tiempo de an lisis requerido, a la especificidad inadecuada y a la necesidad de analizadores costosos. Por lo tanto, sigue habiendo necesidad de un anticuerpo monoclonal que demuestre gran afinidad y especificidad para la mioglobma humana, que pueda ser usado como reactivo en un sistema de inrnunoanálisi para identificar los niveles de mioglobma en sangre, suero o plasma, en pacientes con daños en el m sculo cardiaco (por ejemplo, con infarto al miocardio). Dicho sistema de mrnunoanál isis puede ser- usado para diagnosticar y cuantificar la necrosis y el infarto al miocardio, de acuerdo con el procedimiento de formato rápido descrito en la patente estadounidense No. 5,290,678.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVFNCTnN Las limitaciones de la técnica anterior est n encaradas en la presente invención al proveer un anticuerpo monoclonal que sea especifico para, y tenga gran afinidad a la rnioglobma cardiaca humana. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce un epi ope único o una región única de la inioglobma cardiaca humana, que solamente esta expuesta corno resultado de que la molécula de rnioglobma haya sufrido un cambio de conformación corno resultado de la unión a otra molécula, por ejemplo, a un anticuerpo. Este anticuerpo monoclonal puede ser usado en la identificación rápida y especifica de la proteína mioglobma en sangre, suerc o plasma humanos. Así pues, de acuerdo con la presente invención se provee un anticuerpo monoclonal que reconoce un epi ope de rnioglobina cardiaca humana, que solamente está expuesto corno resultado de que la molécula de mioglobina haya sufrido un cambio de conformación como resultado de la unión a otra molécula. También de acuerdo con la presente invención se provee una línea de células de hibridoma que produce dicho anticuerpo monoclonal . En esta modalidad, la línea de células de hibpdoma es 5Mb-64, depositada en el American Type Culture Collection el 25 de agosto de 1994 con un número de acceso HB 11708.

De acue do con otra modalidad de la presente invención se provee un método para detectar la ioglobina on una muestra, utilizando el anticuerpo inonoclonal producido por la línea de células de hibn orna 5Mb- 64, depositada en la American lyµe Culture Collection bajo el numero de accedo HB 11708, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo policlonal de conejo antirnioglobina para producir un complejo de mioglobina y anticuerpo policlonal; poner en contacto ol complejo con el anticuerpo rnonoclonal para producir un complejo de anticuerpo policlonal -mi oglobma-anti cuerpo monoclonal; y detectar el complejo de anticuerpo policlonal-rnioglobina- anticuerpo monoclonal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura l muestra la titulación de tres diferentes lotes de purificación del anticuerpo 5Mb-64 en un análisis de medio emparedado, en donde la mioglobma ha sido aplicada directamente sobre placas de políestireno. La figura 2 muestra la actividad del 5Mb -64 en un inrnunoanálisi s de mioglobina, utilizando anticuerpos antirnioglobma de conejo co o captura, y 5Mb~64 co o detector. La figura 3 muestra una curva de asociación/disociaci n utilizando BIAcore. La figura (A) muestra el an lisis SDS-PAGE de un anticuerpo monoclonal 5Mb-64 (O monoclonal de ioglobina <y~ humana, el manchado de Western del anticuerpo monoclonal 5MB-64 de rnioglobma a-humana de mi ogJobina humana con t?Mh-64, que muestra la . nmunoespecificidad de 5Mb-64 a la in oglo i a. (B) ei valor pl de 6.6 determinado por enfoque isoeléctrico manchado con escarlata de croceina. La figura 5 muestra la carencia de reactividad cruzada del anticuerpo 5Mb- 64 con un panel de proteínas cardiacas y no cardiacas. La figura 6 es un perfil de BIAcore que muestra: (a) la asociación de 5Mb- 64 con rnioglobma únicamente, el anticuerpo que une únicamente 18 RU de antígono y (b) la actividad incrementada de 5Mb-64 (154 RU) cuando esta presente el anticuerpc con Mb unida a anticuerpo policlonal de conejo, antes de la presentación a 5ML>-64.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se puede distinguir ei anticuerpo rnonocional de la presente invención de los anticuerpos conocidos on la técnica en términos de su valor de diagnóstico, debido a su especificidad, su sensibilidad y su gran afinidad a la rnioglobma cardiaca humana. Los anticuerpos empleados para obtener alta sensibilidad en los inmunoanalisis de diagnóstico deben tener tanto gran afinidad para el antígeno como buena cinética de unión. Como las i nteracciones óptimas de ios anticuerpos rnonoclonales con los antígenos son esenciales para obtener los niveles de sensibilidad requeridos, el sistema de selección es crucial para el éxito del análisis. Sin embargo, la inmunoselecti i ad de los anticuerpos rnonoclonales se puede alterar dramáticamente cuando se acopla a una matriz o se conjuga a una molécula de marcador. De igual manera, la uni n formada entre un anticuerpo y sus antigenos correspondientes, de hecho puede dar por resultado que el antígeno haya sufrido un cambio de conformación o un reacornodo estequiorné-» rico. Este cambio de conformación afectará grandemente la capacidad de un segundo anticuerpo para unirse al antígeno. Este impedimento estequiometpco o incremento estequiométpco, cuando se identifica, nuede afectar de gran manera el éxito o la falla de la sensibilidad del análisis Oohne B. y coautores, 3. Irnmunol. Methods, 1993, 160:191-198). El anticuerpo monoclonal de la presente invención únicamente fue capaz de unirse al antígeno, la rnioglobma, si la est ructura de la molécula se había cambiado corno resultado de que se hubiera unido a otra molécula. De acuerdo con los ejemplos de esta invención, este cambio de co formación puede ser el resultado de la unión de ia rnioglobina una placa de poliestireno o a un anticuerpo policlonal de conejo antirnioglobina. La in unoactividad del anticuerpo monoclonal de la presente invención se incremento cuando se unió por primera vez la mioglobina a un anticuerpo policlonal anticone o. En el análisis ELISA convencional se aplica un anticuerpo de captura sobre una placa de rnicrotitulacion u otra matriz soportadora sólida. A ese complejo de soporte s?lido-anticuerpo ds captura se añade un anti eno, que va seguido por un anticuerpo detector, que esta marcado. Es la molécula de marcador en el anticuerpo detector lo que permite que se visualice la interacción de ant ícuerpo-antígeno. De tal manera, en esta modalidad, el anticuerpo rnonoclonal de la presente invención es un anticuerpo detector, que reconoce un epitope de rnioglobina que únicamente esta expuesto corno resultado del cambio de conformación en ia molécula que es el resultado de la unión de la molécula a un primer anticuerpo (el anticuerpo de captura). En esta modalidad, el anticuerpo policlonal de conejo antimioglobina provocó este cambio de conformación en la mol cula de mioglobma cuando la molécula de ioglobma se unió al anticuerpo policlonai. Los anticuerpos policlonales preparados contra la rnioglobma pueden ser preparados utilizando procedimientos conocidos. Un protocolo típico emplearía 5 y 6 animales grandes, tales co o conejos, ovejas o cabras, inyectados en cualquiera de los apoyos de pata, para conejos o intrarnuscularmente dentro de múltiples sitios con alrededor de 1 a 5 mg en a yuvante completo de Freund en un volumen total de 0.25 a 0.5 mi. Con animales más pequeños, tales como ratones y cuyos, se inyecta cantidades de microgramos (1 a 100 µg en 0.02 a 2.0 mi) en los apoyos de pata subcutánea o intraperitonealmente. Se sangra a los animales semanal ente durante 6 semanas, comenzando aproximadamente 3 semanas después de la inmunización. Se separa los sueros y se prueba la producción de anticuerpo. Se puede sangrar los conejos y los animales mayores desde la vena posterior o por medio de punción en la vena yugular. Con los ratones, se puede obtener el suero por medio de sangrías re roorbitales. Se aplican inyecciones reforzadoras según se requiera. En general, el anticuerpo ie alta afinidad sigue la inmunización con bajas dosLS de an-i-igeno y se puede obtener el mejor suero en conejos aproxi adamente de 3 a 5 meses después de la inmunización. Hav varios métodos para evaluar y analizar las interacciones de anticuerpo- nt ígeno. Los métodos más comunmente usados y aceptados incluyen el ELISA de medio emparedado i An lisis In unosorbente enlazado con enzima), el ELISA de emparedado completo y el inrnunomanchado. Recientemente se ha introducido una nueva herramienta analítica que permite al investigador observar la asociación anticuerpo-antigeno en un marco de tiempo práctico y útil. El sistema BIAcore"'* (Sistema de análisis por interacción bioespecí fica, Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.3.) es un biosensor que utiliza el fenómeno mecánico cu ntico de resonancia plasmónica superficial (SPR) para detectar y analizar las interacciones de moléculas biológicas. Los reactivos biológicos (por ejemplo anticuerpo c antí genos) están unidos covalentemente a una matriz de dextrano que quede en la superficie de una mterfase de oblea «ensora de oro/vidrio. Se refleja luz casi infrarroja, dirigida sobre el lado opuesto de la superficie de oblea senso-a, y también induce una onda evanescente en la película de oro, lo que a su vez provoca una opacidad en la intensidad de la luz reflejada a un ángulo particular, que se conoce como el ángulo de resonancia. Si el índice de refracción de la superficie de la oblea sensora se altera (por ejemplo, mediante la unión de antígeno a anticuerpo), ocurre una desviación en el ángulo de resonancia. Esta desviación en el ángulo se puede medir y se expresa co o unidades de resonancia (RU) de tal manera que 1000 RU es equivalente a un cambio en :.a concentración de proteína de superficie de 1 ng/mrna. Estos cambios son registrados en un sensograma que ilustra la asociación y disociación de cualquier reacción biológica (en este caso los anticuerpos y los antigenos). Se preparó el anticuerpo rnonoclonal de la presente invención mediante procedimientos convencionales, siguiendo generalmente los métodos de Kohlers y Milstein (Nature 256, 495-497, 1975; Eur. 3. Im unol . 6, 511-519, 1976). De acuerdo con ese método, se funde las células de rnieloma de ratón adaptadas en el cultivo de tejido a células productoras de anticuerpo procedentes de ratones inmunizados para obtener las células híbridas que producen grandes cantidades de una sola molécula de anticuerpo. En general, las células productoras de anticuerpo son preparadas inmunizando un animal, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas, caballos o bovinos, con un antigeno. El programa de inmunización y la concentración del ant geno en suspensión son de tal naturaleza que se provee canti ades útiles de células productoras de anticuerpo adecuadamente sensibilizadas. Estas células productoras de anticuerpo rueden ser células de bazo, tirnocitos, células de nodo linfático y/o linfocitos de sangre periférica. Las células productoras de anticuerpo son fundidas entonces con células de rnielorna, líneas de células que se originan de diversos animales, tales co o ratones, ratas, < one os y humanos, pueden ser usadas utilizando un promotor de fusi n adecuado. Se conoce muchas lineas de células de mieiorna de ratón, y se pueden obtener generalmente de los miembros de la comunidad académica y de diversos depósitos, tales corno la American Type Culture Collection, Roc ville, Maryland. La linea de células de rnieloma usada preferiblemente debe ser sensible al medio de manera que las células de rnieloma no fundidas no sobrevivan en un medio selectivo, pero que las híbridas sobrevivan. La línea de células utilizada rnas comúnmente es una línea de células resistente a 8 azaguanina, que carece de la enzima hipoxantma-guanina-fosfirobosil-transferasa y, por lo tanto, no sera soportada por el medio HAT (hipoxantina-a idopterina-timidina) . En general, La línea de células preferiblemente también es del tipo "no secretor", por cuanto no produce ningún anticuerpo. El promotor de fusión preferido es polie* i lenglicoi que tiene un peso molecular promedio de 1000 a 4000, aproximadamente. Otros promotores de fusión, tales como alcohol polivinílico, un virus o un campo eléctrico también pueden ser usados. Luego se debe discriminar las células inmortalizadas (hibridorna) para aquellas que segregan anticuerpos de la especificidad correcta. La discrimi ación inicial generalmente se lleva a cabo utilizando un an lisis ín unosorbente enlazado con enzimas (ELISA). Específicamente, se añade los sobrenadante*; del cultivo de hibpdoma a placas de titulación que han sido revestidas previamente con el antígeno, en este caso la rn-oglobina. Un anticuerpo específico de uni n procedentes de los sobrenadantes de cultivo puede ser detectado utilizando un segundo anticuerpo marcado, por ejemplo, IgG anti ratón de cabra, marcado con peroxidasa (obtenible cornercialment e) . Los cultivos que son positivos contra el antigeno son sometidos entonces a clonación mediante el m todo de diluci n limitada. Los cultivos de hibpdorna secundario son rediscnrninaclos como se describió arriba y luego se examina los cultivos positivos adicionales utilizando el sistema BTAcore (Pharmacia Iiiosensor AB, Uppsala, Suecia) . A continuación se valoran los cultivos para determinar si el anticuerpo se une o no al antígero y para determinar el perfil emético de la unión al antígeno. Un cultivo seleccionado, con base en esos resultados, es sometido a clonación ulterior hasta que se obtenga estabilidad y clonabilidad del cultivo. Inmediatamente después de la hibridación los productos de fusión tendr n aproximadamente 80 cromosomas y a medida que estas células proceden a dividirse perderán aleatoriamente algunos de esos cromosomas. El proceso de clonaci n es para seieccionar aquellas calulae que todavía tienen los cromosomas que codifican la producción de anticuerpo. Fl proceso de clonación se repite "tasta que ei 100% de la subpoblacion exhiba la producción d3 un anticuerpo especifico, lo que es indicador «Je la "estabilidad" del hibndoma. Ademas, las concavidades de cultivo de hibridorna frecuentemente tienen colonias múltiples, algunas de las cuales pueden ser no productoras de anticuerpos. El proceso de clonación permite la selección de un híbrido positivo que se deriva de una sola célula. El anticuerpo rnonoclonal de la presente invención puede ser producido ya sea utilizando un bioreactor o a partir de ascitos, ambos procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser usado en un sistema de munoanalisis para deterrninar los niveles de mioglobina en sangre, suero o plasma. Los i n unoanálisis actuales utilizan un método de doble anticuerpo para detectar la presencia de un analito. Esas técnicas est n resumidas en "Basic Princip is of Antigen-Antibody Reaction", Elvin A. Labat (Methods in Enzyrnology, 70, 3-70, 1980). Dichos sistemas frecuentemente se denominan sistemas de formato rápido, debido a que están adaptados para determinaciones rápidas de la presencia de un analito. El sistema requiere gran afinidad entre el anticuerpo y el analito. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se determina la presencia de rnioglobina cardiaca utilizando un par de anticuerpos, cada uno específico para la nuoglobma » por lo menos un anticuerpo específico para la rnioglobina cardiaca. Uno de dichos pares de anticuerpos se denomina en la presente un "anticuerpo detector" y el otro del par de antic erpos se denomina en la presente un "anticuerpo de captura". El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser- usado co o un anticuerpo detector, en donde la miog lobina ya había sido unida por medio de un anticuerpo de captura. Una modalidad de la presente invención, de tal manera, uti Liza el método de emparedado de doble anticuerpo par-a detectar la rnioglobina cardiaca en una muestra de fluido biológico. En ese método el analito ( ioglob a cardiaca) es emparedado entre el anticuerpo detector y el anticuerpo de captura; estando inmovilizado irreversiblemente el anticuerpo de captura sobre un soporte sólido. El anticuerpo detector contendría una etiqueta o marcador detectable a fin de indicar la presencia de un emparedado de an icuerpo-analito-anticuerpo y, de tal manera, la presencia del anal to. Las formas tempranas comunes de dichos soportes solidos, eran placas, tubos o gr nulos de poliestireno que son bien conocidos en un campo del radioin unoanálisis y el rnunoanálisis enzirnatico. Más recientemente, se ha empleado corno soporte sólido diferentes materiales porosos, tales como nylon, nitrccelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos. Una modalidad de la presente invención utiliza un 1 ? dispositivo de mrnunoanalisis del tipo de flujo completo. Valkirs y coinven ores (patente estadounidense No. 4,632,901) describe un disposi ivo que comprende un anticuerpo, especifico par-a un ana lito antígeno, unido a una membrana porosa o filtro al que se añade una muestra liquida. Conforme fluye el liquido a través de la membrana, el analito de destino se une al anticuerpo. La adici n de la muestra va seguida por l a adición de un anticuerpo marcado. La detecci n visual del anticuerpo marcado ro ee una indicaci n de ia presencia del analito de destino en la muestra. O ro ejemplo de un dispositivo de flujo a \ raves del mismo esta descrito en Kromer y coinventores (EP-A-0 229 359), que describe' un sistema de suministro de reactivos que comprende una matriz saturada, un reactivo o sus componentes dispersados en un polímero soluble en agua, para controlar el régimen de disolución del reactivo a fin de suministrar a una matriz de reacción colocada debajo de la matriz. En los análisis del tipo de migración se impregna una membrana cor los reactivos que se necesitan para efectuar el análisis. Se provee la zona de detección de analitos en donde el analito rrarcado está unido y se leen los indicadores del análisis. Por ejemplo, véase Torne y coinventores (patente estadounidense No. 4,366,241) y Zul< (EP-A- 0 143 574). Los dispositivos de análisis por migración usualmente incorporan dentro de ellos reactivos que han sido unidos a marcadores de color, lo que permite la detección visible de los resultados del an lisis sin la adición de mas sustancias. Véase, por ejemplo, enstem (patente estadounidense No. 4,770,853), May y coinventores ( IO 88/08534) y Ching y coinventores (EP-A- 0 299 428). El anticuerpo rnonoclonal de la presente invención puede ser usado en todos estos tipos conocidos de dispositivos que fluyen a través de ellos. Los marcadores directos son un ejemplo de marcadores que pueden ser usados de acuerdo con la presente invenci n. Un marcador directo ha sido definido como una entidad que, en su estado natural, es fácilmente visible, ya sea a simple vista o con la ayuda de un filtro óptico y/o estimulación aplicada, por ejemplo, luz ultravioleta para promover la fluorescencia. Entre los ejemplos de los marcadores de color que pueden ser-usados de acuerdo con la presente invención incluyen partículas de sol metálico, por ejemplo, partículas de sol de oro, tal co o las descritas por Leuvepng (patente estadounidense No. 4,313,734), partículas de sol de tinte, tales corno las descritas por Gpbnau y coinventores (patente estadounidense No. 4,373,922) y May y coinventores ( IO 88/08534); l tex teñido, tal co o el descrito por May suor . Snyder (EP-A- 0 280 559 y 0 281 327); o tintes encapsulados en iiposornas, tal como fueron descritos por Campbell y coinventores (patente estadounidense No. 4,703,017). Otros marcadores directos incluyen un radionucleótido, una porción fluorescente o una porción luminiscente. Ademas de esos dispositivos marcadores directos, se puede usar también marcadores indirectos que comprenden enzimas, de acuerdo con la presente invención. Se conoce en la técnica diversos tipos de inrnunoanal LSIS enlazados por onzirna, por ejemplo, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de r bano picante, la lisozuna, la fosfato de glucosa- 6-deshi drogenasa, la deshidrogenase de lactato, la ureasa; estos y otros han sido discutidos detalladamente por Eva Engvall en Enzyrne Inrnunoassay ELISA and EMIT en Methods ín Enzyrnology 70, 419-439 y en la patente estadounidense No. 4,857,453. Otros ejemplos de dispositivos de diagnostico biológico qce pueden ser usados para la detección de la rnioglobma cardiaca, usando el anticuerpo monoclonal de la presente invención incluyen los dispositivos descritos por G. Grenner, P.E. Diagnostics Systems, Inc. en las patentes estadounidenses Nos. 4,906,439 y 4,918,025. En una modalidad de la presente invención la prueba de diagnostico utiliza un tubo de muestra de sangre que es usado comunmente para extraer muestras de sangre de pacientes. La pared interior del tubo actúa como un portador para los anticuerpos monoclonales o policlonales y los reactivos requeridos para los medios de detección, necesarios para producir una señal mensurable. En esta modalidad, el anticuerpo de captura es inmovilizado sobre ia pared del tubo de prueba. Después que r,e extrae la muestra del paciente, el usuario simplemente sacude ia muestra con el anticuerpo detector en el tubo, de manera que el anticuerpo detector reaccione con cualquier mioglobina cardiaca presente en la sangre. En este ejemplo, el anticuerpo rnonoclonal de la presente intención es el anticuerpo detector. Puede ser-necesario utilizar una muestra en la cual se haya eliminado los glóbulos rojos de la sangre, de manera que los glóbulos rojos no ínterti -an con el an lisis de los resultados. SL el analito esta presente en la sangre, estará emparedado entre en anticuerpo de captura y el anticuerpo detector que contiene un marcador adecuado para la detección directa o reacciona con los reactivos en un an lisis indirecto. El soporte solido (el tubo de prueba) puede ser lavado entonces hasta que este libre de material marcado no unido. Se puede utilizar una variedad de sopor-tes sol] dos de acuerdo con este método, por ejemplo, las paredes del tubo de ensayo, vasos de plástico, gr nulos, esferas de pl stico y cilindros de plástico, incluyendo placas de rnicrotitul ación, papel y fibras de vidrio. Existen varios tipos actualmente disponibles de aparato de análisis automatizado, que pueden efectuar análisis de formato rápido sobre varias muestras, al mismo tiempo. Estos aparatos de análisis automático incluyen los aparatos de análisis de acceso continuo/aleatorio. Cada uno de estos sistemas incluyen OPUSMR de PB Diagnostic System, Inc. y el analizador IMXMR introducido por Abbott Laboratories de North Chicago, Illinois en 1988. En general, se provee típicamente una muestra del fluido de prueba en un vaso de muestra y se efectúan automáticamente los pasos del procedimiento, incluyendo el paso con pipeta de la muestra hacia el elemento de tubo de ensayo, la incubación y la lectura de la señal obtenida. Los sistemas de análisis autom ticos generalmente incluyen una serie de estaciones de trabajo, cada una de las cuales efectúa uno de los pasos de procedimien o de prueba. FL elemento de an lisis puede ser transportado de una est ción íe trabajo a la siguiente por diversos medios, tales co o una cremallera da carrusel o movible para permitir que se efectúen secuencialmente los pasos de prueba. Los elementos de análisis también pueden incluir- depósitos para «linacenar reactivos mezclar fluLdos, diluir muestras, etc. Los elementos de an lisis también incluyen una abertura para permitir la administración de una cantidad redeterminada de un fluido de muestra y, de ser necesario, cualquier otro reactivo requerido, a un miembro poroso. El elemento de muestra también puede incluir una ventana para permitir que una señal obtenida co o resultado de los pasos de procedimiento, típicamente un cambio fluorescente o colopmetpco en los reactivos presentes sobre los miembros porosos, sea leída, por ejemplo, por medio de un espectroscopj o o un fluoró etro, que puede estar incluido dentro del sistema de análisis. Los instrumentos de análisis autom ticos de PB Diganostic Systems, Inc. están descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,051,237; 5,138,868; 5,141,871 y 5,147,609. Una descripción del analizador IMX está incluida en "Abbott [MX Autornated Bench Top Irnrnunoachemístry Analyzer 92 System" por Fiore, M. y coinventores, Clínica! Chemistry, 35 No. 9, 198B. Otro ejemplo de estos analizadores ha sido descrito en la patente estadounidense No. 4,956, L48, titulada "LocUng Rae-- and Dispoeable Sarnple Cartpdge", expedida a CL Gr-andone el 1 de septiembre de 1990, y cedida a Abbott Laboratories, que describe un carrusel par-a llevar una pluralidad de celdas de reacción para uso con respecto ai sistema Abbott TMXMR. Otro desarrollo en la técnica ha sido descrito en la solicitud de patente canadiense No. 2,069,531, de Chadwicl- M. Dunn y coinventores, cedida a Abbott Laboratories, en donde el sistema analizador de i nrnunoquímica, descrito en esta solicitud de la técnica anterior, tiene la capacidad de probar hasta tres o cuatro analitos en una sola carga durante una sola operación, utilizando instrumentación actualmente disponible. El sistema descrito en la solicitud canadiense a la que se hace referencia arriba permite que los usuarios agrupen tres pequeñas cargas de análisis juntas en lugar de operar tres análisis separados. El anticuerpo rnonoclonal de la presente invención puede ser usado en estos analizadores automáticos. Otra clase mas de sistemas analizadores munoquímicos, en la cual el anticuerpo monoclonal de la presente ?nv€>nc?ón puede ser usado, son los biosensores o ios sistemas inmunosensores ópticos. En general, un biosensor óptico es un dispositivo que utiliza principios ópticos cuantitativamente para convertir la concentración química o bioquímica o las actividades de ínteres a señales eléctricas. Estos sistemas se pueden agrupar en cuatro categorías principales: las técnicas de reflexión; la resonancia de plarnón superficial; las técnicas de fibra óptica y los dispositivos ópticos integrados. Las técnicas de reflexión incluyen elipso etría, espectroscopia de reflexión integral múltiple y los dispositivos de hilo capilar fluorescente. Las técnicas de fibra óptica incluyen la fluorescencia de campo evanescente, el tubo capilar de fibra óptica y los sensores de fluorescencia de fibra óptica. Los dispositivos pticos integrados incluyen la fluorescencia de campo evanescente planeador, el inmunosensor acoplador de clasificación de entrada, el inerferó etro de Mach-Zehnder, ei inte er?rnetro de Hartrnan y ios. sensores de interferómetro por diferencia. Estos ejemplos de i rnunosensores ópticos están descritos en general en un artículo de resumen por G.A. Robins (Advances m Biosensors), torno 1, páginas 229-256, 1991. Una descripción más específica de estos dispositivos se encuentra, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 4,810,658; 4,978,503; 5,186,897; R.A. Brady y coautores (Phil. Trans. R. soc. Land B 316, 143-160, 1987) y G.A. Robinson y coautores (en Sensors and Actuators, Elsevier, 1992). En una modalidad de la presente invención se detecta mioglobina cardiaca en una muestra de sangre, suero o plasma, utilizando el anticuerpo monoclonal de la presente invención, en un dispositivo que comprende una membrana de filtro o sopor-te solido con una sección de detección y una sección de captura. L=? secci n de etección contiene un an icuerpo (un anticuerpo detector) que reaccionará con la rnioglobi a. F-"l anticuerpo detector es inmovilizado eje manera reversible sobr-e el soporte solido y migrará con la muestra, cuando esta en uso. Se prefiere que se marque el anticuerpo detector, por ejemplo, con un radionucleótido, una enzima, una porción fluorescente, una porción Luminiscente o un marcador- de color, tales como los que est n descritos en la técnica anterior y que fueron discutidos mas arriba. La sección de captura comprende un anticuerpo de captura que está inmovilizado irreversiblemente sobre un sopor-te solido. Los anticuerpos, el anticuerpo do captura y el anticuerpo detector, y los reactivos necesarios están inmovi izados sobr-e el soporte sólido utilizando técnicas normales, reconocidas en este campo, co o las descritas en los dispositivos de mmunoanálisis del ipo de flujo pasante, anteriormente discutidos. En general, los anticuerpos son absorbidos sobre los soportes sólidos co o resul tado de interacciones hidrófobas entr-e subestructuras de proteínas no polares y material de matriz soportadora no polar. De acuerdo con esta modalidad de la presente invención, si esta presente rnioglobma cardiaca en la muestra, reaccionará con el anticuerpo detector en la sección detectora y rnigrará sobre la membrana de filtro hacia la sección de captura, en donde el anali+o se unirá adicionaJ ente con eJ anticuerpo de captura. Así pues, la rnioglob a cardiaca sera 2F; emparedada entre el anticuerpo de captura y el anticuerpo detector que contiene un marcador adecuado. En este ejemplo de la presente invenci n, si el anticuerpo detector esta marcado con una etiqueta de color- o cualquier enzima que produzca un marcador de color, la sangre del paciente requeriría primero centrifugar o filtrar previamente de alguna manera a fin de eliminar los glóbulos rojos de la sangre, de manera que el color- de los glóbulos rojos de la sangre no interfiera con los marcadores de color-. Si se va a utilizar marcadores radioactivos o marcador-es fluorescentes, puede ser innecesario un paso de filtración o de centrifugación. En esta rnod Lidad, el anticuerpo rnonoclonal de la presente invención es el anticuerpo de captura y el anticuerpo policlonal de conejo es el anticuerpo detector, ya que en esta modalidad ia muestra hace contacto primero con el anticuerpo detector. Es-.e sistema de inmunoanalisis es-t á descrito generalmente en ia patente estadounidense No. 5,290,678. El anticuerpo rnonoclonal de esta invención es particul rmente utiJ en este sistema debido a su elevada afinidad y especificidad para al rniog-obina cardiaca. Los siguientes ejemplos detallados ilustrarán la invención, pero no se deben considerar limitándola.

EJEIIPLQS EJEMPLO. 1 PREPARACIÓN DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONTRA MIOGLOBINA CARDIACA HUMANA Inmunización Se purifico rnioglobina cardiaca humana procedente del ventrículo de corazón humano de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se sometió ei producto de homogeneizacion de corazón humano a precipitación inicial ( HA)sj O_v (al 40%) seguido por centrifugación a 6000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Se precipitó el sobrenadante adicionalrnente mediante acido acético 1 M y se recogió el sobrenadante resultante después de centrifugar a 12,000 x g (20 minutos a 4°C). Se ajustó el pH del sobrenadante a 7.0 y se sometió adicional ente a fraccionacion con ÍNH^^SO.* (80% de saturación). Luego se dial izo el sobrenadante resultante con 50 rnM de regulador fosfato-bora o, pH 8.0. Se purifico la mioglobma a una forma cruda mediante filtración en gel en una columna Bio-Gel P-60 (Bio-Rad, He-rcules, California, Cat #150-4160). Se purifico adicionalment e la mioglob na hasta homogeneidad en una columna de afinidad Affi-Blue Bio-Gel (Bio-Rad, Hercules, California, Cat. #153-73C2). Se administró a ratones Balb/c, una raza con un haplotipo H-2<3, de Charles River Canad , St. Constant, Quebec, Canadá, he tras, de 7 a 9 semanas de edad, una inmunización primaria de 50 µg de rnioglobma en una mezcla 1:1 con adyuvante completo de Freund, subcutáneamente en la base del cuello. Se administró jna inmunización secundaria 4 semanas después, que consistió de una inyección intraperitoneaJ d.p.) de 50 µg de ioglobma en una mezcla 1:L con un adyuvante incompleto de Freund. Es o fue seguido por un refuerzo i nt rapeptoneal terciario de 100 µ de rnioglobma en soluci n salina regulada con fosfato (PBS pH 7.4), administrada 4 semanas después. Cuatro días antes de la fusión se administro al ratón otros 100 µg de rniogJobina en PBS pH 7.4, mt rapeptone linente. Se sacrificó el ratón y se extirpo el bazo.

Producción de los hibridomas v anticuernos Se produjo la linea de células de hibpdoma designada como 5 Mb-64 mediante la fusión de los mmunocitos obtenidos del bazo de ratones Balb/c inmunizados con c lulas de» mielorna de mundo Sp2/0, que fueron descritas por Fuller S.A., Takahashi M. , y Hurrell 3.G.R., (Preparation of Monoclonal Antibodies; en Ausubel F., Brent B. , Kingston R., y coautores, eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York: Green Publishmg Associates, 1987: Umt 11). Se suspendió las células fundidas resultantes en el medio de selección HAT y se aplico a placas de 96 concavidades que habían sido previamente sembradas con células de alimentador, PEC (células de exudado per-itoneal ) , como se describió por Fuller y coautores (véase la referencia anterior). Se anadio medio HAT nuevo ei día 7; y el día 9 se eliminó el 50% del medio de cuLtivo y se reemplazo porfiedlo HAT nuevo. Se discrimino los cultivos de hibp dorna para la producción de anticuerpos que son sumamente inmunoactivos par-a la rnioglobma. Esto se efectuó mediante el análisis de sobrenadantes de cultivo agotado mediante análisis munosorbente enlazado por- enzima indirecto. Se revistió placas de m. crot itulación de 96 concavidades, de poliestireno ( [rnrnunolon- 4 , Dynatech Labs., Chantilly VA) con ? µg/ l de inioglobina cardiaca humana en 100 M de regulador de carbonato/bicarbonato, pH 9.6, durante la noche a 4°C. Se bloqueo los sitios de unión excesivos por medio de albúmina de suero bovino (BSA) en salina regulada con fosfato (PBS), pH 7.2. Luego se lavó cuatro veces las placas con PBS/0.05% de Tween-20. Luego se añadió el sobrenadante de cultivo de hibridoma a las concavidades (100 µl) y se incubó durante 1 hora a 37°C en un incubador de C0a. Luego se lavó cuatro veces las placas ccn PBS/Tween-20 ( H 7.2). A continuación se incubó las concavidades con 100 µl de IgG Fc-HRP de cabr-a y anti ratón (Jac son Irnmuno Research Lab. Inc. West Grove Penn.) a 0.5 µg/rnl durante 60 minutos a 37°C. Se lavo cuatro veces las placas con PBS/Tween-20 ( pH 7.2 ) . Se añadió la solución de substrato (0.5 mg/rnl de o-fenilendiamina, OPD (Sig a Chemicals, St. Louis Missouri) y se 0.03% de HaOs» en 0.1 M de i egulador ci rato- fosfato (pH 5.0) a 100 µl/ concavidad y se dejó que se revelara durante 30 minutos on la oscuridad. A continuación se detuvo la r ea< ion utilizando 25 µl de solución 4 N de HaSO-v/concavidad. Se leyó las placas 490 nrn en un ioctoi de rnicroplacas BIORAD (Bio-Rad, Hercules, Cali ornia). La linea de c lulas especifica, 5Mb-64 (ratón No. , concavidad de nicrotitulacion No. 64) fue aislada ya que pareció ser una linea de células ex remadamente j nnunoactivas, que exhibía D.O. > 2.0 de sobrenadante de cultivo analizado utilizando ^1 sistema descrito ar iba. La i nrnunoact ividad permaneció sumamente repetida y consist ntemente <=>n las diversas etapas de clonaci n y discriminación. Por ejemplo, la figura 1 muestra l a titulación de tres lotes diferentes de purificación del anticuerpo 5MP-64 en un an lisis de medio emparedado, en la que la mioglobina había sido aplicada directamente sobre placas de poliesti reno. Es linea de células tarntuen fue probada en un análisis ELISA de emparedado completo, utilizando un anticuerpo policlonal de conejo corno la captura de antigeno (anticuerpo i movilizado o de ancla) y SMb-64 corno el detector de antígeno (anticuerpo marcado o etiqueta) y viceversa Cuando se utilizó 5MP-64 co o un anticuerpo de captura en oste análisis, no se observó actividad y, de tal manera, no se registro unión de rnioylobma. Sin embargo, cuando se invirtió Los anticuerpos, es decir, el anticuerpo policlonal de conejo como captura y 5Mb-64 como detector, se obtuvo sensibilidades de menos de 0.5 ng/rnl, véase la igui a 2. Esta línea de células de hibpdorna fue depositada en la American Type Culture Collection el 25 de agosto de 1994, ba o el número de acceso HB 11708. Se inyecto ra ones Balb/c, tal como se describi anteriormente, previamente tratados con 0.5 mi de ppstano, íntraperiton almente con 1-5 x 10* células de hibndorna clonadas en 0.5 mi de solución salina regulada con fosfato (PBS), pH 7.4. Aproximadamente dos semanas después se recogió los ascitos v se purificó por afinidad el anticuerpo rnonoclonaL en una columna de proteína A o de proteina G, utilizando procedimientos conocidos. El anticuerpo rnonoclonal purificado de la presente invención fue utilizado entonces par-a diversos estudios mmunoquírnicos. Algunas propiedades, que fueron determinadas utilizando .os métodos descritos en Fuller y coautores (véase rnas arriba) de la línea de células de hibpdoma 5Mb-64 son las siguientes. (1) ti€>mpo de duplicaci n de células - 12.06 horas. (2) el promedio de mi de acites producidos varia de 3 a 5 rnl/ratón (3) rendimiento promedio de anticuerpo - 1.2 mg/ml de acites (4) estabilidad, más de 25 pasadas.

EJEMPLO 2 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Clase v subclase de anticuerpo Se determino la clase y la subclase de anticuerpo mediante ELCSA con un equipo de análisis comercial (Bio-Rad, Hercules, California, Cat# L72-2055) , utilizando el método descrito por el fabricante. La linea de células 5Mb-64 se determino mediante este sistema de an lisis que era del isótopo _ de IgGl.

Punto isoeléctrico (DII Se llevo a cabo la determinación del punto isoeléctrico utilizando la celda Mini IEL modelo III (Bio-Rad, Hercules, California, Cat# 70- 2975) siguiendo las instrucciones provistas por- el fabricante. Se determinó que el valor pl para la linea de células 5Mb-64 era de 6.6 Cinética v constante de afinidad (A) Constante de régimen de asociaci n (ka) Se puede determinar- el régimen de asociación o el régimen al que se unen el rnonoclonal y su antigeno, utilizando la curva de unión generada por BIAcore. El sistema utiliza resonancia plasmonica superficial que detecta los cambios en las propiedades ópticas en la superficie de una película delgada de oro sobre un soporte de vidrio. El antecedente teórico detallado y ios productores están descritos por- R. Karlsson y coautores (J. Irnmunol. Methods, 145, 229, 1991). Se llevo a cabo operaciones cinéticas de la siguiente manera. El anticuerpo monoclonal, a una concentración constante de 30 µg/rnl en 10 rnM de Hepes, 0.15 M de NaCi , 3.4 M de la sal de disodio de ácido etiiendiammotet raacetico, 0.05% de agente tensioac ivo 20 (HBS, pH 7.4), se dejó que ínter-actuara con superficies sensor s sobre las que se había inmovilizado IgGh<_ antiraton de cone-jo (Jackson Irnmuno Research Lab, Inc.). El antígeno, la rnioglobina, a concentraciones que van desde 1.25 µg/ml hasta 20 µg/ml, se dejo interactuar con el anticuerpo nonoclonal unido. Luego se efectuó operaciones a 25°C, a un régimen de flujo de 5 µl/rnmuto durante 6 minutos (inyección de 30 µl ) , lo que se llevó un total de 24 puntos de informe. Después que se completó la inyección del antígeno, se vigiló la disociación del antígeno del anticuerpo lo que torno un total de 18 puntos de informe. Después de la operación, se regeneró la superficie inyectando una solución i M de acido fórmico durante 1 minuto (inyección de 5 µl). El programa de aplicación d€>l instrumento produce un cuadro de valores dR?/dt y R? que se puede usar directamente en un programa de graficación (Microsoft Excel). Al graficar la gráfica dRft/dt contra R a cinco concentraciones diferentes de antigeno y graficar subsecuentemente las pendientes de esas líneas contra la concentre cion de antígeno, la pendiente de esta segunda gráfica es la constante de régimen de asociación ka (M~ , s-1-).

En donde: Dr/dt es el régimen de formaci n de complejos de anticuerpo de antígeno, es decir, el derivado de la curva de unión; y R es el complejo de antigeno/anticuerpo corno fue medido por el BIAcore en unidades de resonancia. (B) La constante de régimen de disociación (kd) El régimen de disociación o el régimen al cual se puede determinar una liberación inonoclonal y su antígeno, u ilizando la curva de disociación generada en el BTAcore. Al graficar y determinar la pendiente del logaritmo de la caída en la respuesta contra la curva de tiempo, se puede medir la constante kd (s~ ) del régimen de disociación. (C) La constante de afinidad o equilibrio (Ka o Kd) Las constantes de afinidad o de equilibrio son La proporción de las constantes de asociación y del régimen de di sociación. En donde: Ka = ka/kd Kd = kd/ka Una curva típica de asociación y disociación está mostrada en la figura 3. Se determinó las constantes de afinidad de dos maneras. Se llevó a cabo el experimento utilizando el antígeno solo y también utilizando el antígeno unido a un anticuerpo policlonal antimioglobina de conejo. Estos resultados est n mostrados en el cuadro i.

CUADRO 1 CONSTANTES PE AFINIDAD 5Mb~b4 5Mb-64 (Ag* solamente) ( Policlonal** y AG) ka (en régimen) no mensurable 6. 19 E3 M" kd ( fuera e régimen ) no mensurable 2.09 E-3 s- 1 Ka ( constante de no mensurable 3.01 E6 M- 1- a f mi dad ) L O Kd (constante de no mensurable 3.33 E-7 M a fin idad) * Mioglobina cardiaca humana ** anticuerpo policlonal antirnioglobina de conejo. 15 Tal como se discutió previamente no se observa unión cuando el anticuerpo monoclonai de la presente invención se prueba di rectamenté contra La mioglobina unida. Sin embargo, ocurre unión cuando el anticuerpo rnonoclonal de la presente invención se prueba contra rnioglobina que ya se había unido a un anticuerpo policlonal de conejo.

EJEMPLO 3 ESPECIFICIDAD ANTIGENICA Se determinó la especi icidad del anticuerpo 5Mb-64 mediante inrriuno anchado, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en Tsang V.C.U. y coautores, Msthode Enzyrnol . tomo 92, 377, 1983. Se sometió a electroforssis rnioglobina cardiaca humana ^obre gel SDS-PAGE y se transfirió a ni trocelulosa. Se incubo la ni t oc l ulosa pn una solución de 5% de leche descremada en salina regulada con Tris, con Tween-20 (TTBS), pH 7.5 , fin de bloquear cualquier unión no específica. Esto fue seguido por- incubación de 1 a 10 µg/rnl del 5MIJ-64 monoclonal en TTBS durante 1 hora. Se lavo la n trocelulosa en TTBS, pH 7.4, y se incubó con IgG antiratón de cabr-a, marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Bio- Rad, Hercules, California, Cat#l70 -6516 ) . El anticuerpo unido HRP fue visualizado por la incubación on reactivo de revelado de color 4-cloro-l -naftol , tal como se describió previamente. El revelado de color se detuvo lavando en agua destilada. El inmunornanchado se muestra en la figura 4. Este indica claramente la mmunoespecificidad de 5Mb- 64 a la única banda je proteina de La mioglobina. A - de confirmar adicionalmente la especificidad de 5Mb-64, se usó este anticuerpo en un an lisis ELISA de fase sólida con un panel de proteínas cardiacas y no cardiacas. Se aplicaron estas proteínas sobre placas de poliestireno par-a ELISA a 2 µg/rnl , como se describió previamente. Se probó el anticuerpo monoclonal para estos ant ígenos a una concentración que va desde 4 µg/ml hasta 0.004 µg/ml, cayendo la concentración en pasos de 50%. Se detectó el anticuerpo unido mediante un anticuerpo Fe anti atón de cabra (Jackson ImmunoResearoh Lab, Inc.) a 0.5 µg/ml y se visualizó utilizando un substrato OPD , tal como se describió previ amente . Los resultados ís t an mostrados en la figura 5 . El anti cuerpo monoclonal 5?1b-64 no muestra reac t ividad cruzada con ninguna de las proteína s probadas , except o con la rni oglobi na .

EJEMPLO h DETECCIÓN DE MIOGLQBINA CARDIACA EN UNA MUESTRA BIOLÓGICA Ya que los niveles normales de nioglobma en sangre, el suero o el plasma pueden llegar hasta 70 ng/ml , se ha llevado ai punto óptimo ei presenta análisis para detectar los niveles de rnj oglobina en el suero de 80 ng/ l o mayores. Se ha logrado esto mediante el uso de un anticuerpo policlonal de conejo corno el anticuerpo detector y 5Mb-64 co o el anticuerpo de captura. El 5Mb-64 rnonoclonal exhibe la capacidad singular de reconocer la rnioglobina muy efectivamente cuando se ha unido la mioglobina mediante otro anticuerpo. Utilizando el sistema BIAcore, co o se describió previamente, es posible observar esta interacción bastante clara. Cuando el anticuerpo rnonoclonal 5Mb-64 fue unido covalentemente a la oblea sensora y se introdujo mioglobina cardiaca humana libre, se observó muy poca unión ce antigeno (18 RU). Sin embargo, cuando estaba presente el anticuerpo con mioglobina que había sido prernezclada con anticuerpo policional de conejo, se incrementó la asociación del antígeno en más de cinco veces. Asi pues, parece que 5Mb- 64 reconoce un epitope de la molécula de ] / mioglobina que únicamente es expuesto como resultado de que ha sufrido un cambio de conformación corno resultado de la unión a otra molécula, por ejemplo, a otro anticuerpo (véase la figura 6). Ad LCionalrnent e, un an lisis de la cinética de unión y la determinación de la constante de afinidad (cuadro i) muestra que 5Mb-64 t. ene una afinidad t n baja para la mioglobina libre que no pudo ser medida. La afinidad de 5Mb-64 al epitope expuesto de .a ioglobina unida al anticuerpo fue de 1.01 x 10* M-1. Los experimentos extensos por pares con un panel de anticuerpos monoclonales y policionales, han demostrado que el par más sens ble de anticuerpos que obtuvo sensibilidad óptima, especificidad y requerimientos de tiempo óptimos (es decir, 2 a 3 segundos) , fueron el anticuerpo policlonal de conejo antimioglobina y 5Mb~64. Consecuentemente, 5Mb-64 reconoce un epi tope o determinante antige ico en La molécula de inioglob a únicamente e> puesto como resultado de un cambio de conformación que surge de la unión de mioglobma a otra molécula, por ejemplo, al anticuerpo policlonal de conejo antimioglob a,. El inrnunoanálisis del anticuerpo 5Mb-64 se incrementa dramáticamente mediante este cambio de conformación. En este ejemplo, el anticuerpo onoclonal producido a partir de la línea de células de hibpdorna 5Mb-64 fue usado como un anticuerpo de captura en un flujo a través de un sistema de análisis, con base en el análisis de emparedado con doble anticuerpo. Se anadio una muestra de suero de un paciente (50 µl a 150 µl) al sistema de análisis a través de una abertura para muestra, que estaba en comunicación de fluido con un cojín de reactivos que contenía el anticuerpo detector policlonal de conejo antimioglobina marcado. Si el tamaño de la muestra fue pequeño, se añadió un fluido portador después de la aplicación de la muestra. El fluido portador puede ser cualquier soluci n reguladora; ">or ejemplo, regulador fosfato, salina, Trie-HCl o agua. Si la muestra contenía rnioglobina cardiaca, se adheriría al anticuerpo detector presente en el cojín de reactivos. Se inmovilizo -eversiblemente el anticuerpo detector y, de tal manera, fue igrable con la muestra. La muestra continuo fluyendo desde el cojín de reactivos hacia la membrana de filtro, sobre la cual estaba inmovilizado irreversiblemente el anticuerpo monoclonal de la presente invención (anticuerpo de captur-a). El complejo de anticuerpo detector marcado -rnioglobma cardiaca, de estar presente, se unirá al anticuerpo de captura en La membrana de filtro. La presencia del analito, ha sido mar-cada con el anticuerpo detector marcado, sera colocada de esa manera en la ubicación del anticuerpo de captura, que generalmente coincide en posición con una ventana exhibidora en el sistema de análisis. Todas las referencias citadas aquí quedan incorporadas específicamente por referencia. Si bien la descripción describe e ilustra modalidades preferidas de la invención, se debe entender que la invención no está limitada a esas modalidades particulares. Los expertos en la materia idearán muchas modificaciones y variaciones. Para una definición de la invención tiene que hacerse referencia a las reivindicaciones que vienen a continuación.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. La línea de células de hibridorna Mf>-64, depositada en La American Type Culture Collection bajo el numero de acceso HB 11708. 2.- Un anticuerpo rnonoclonal producido por- la línea de células de hibpdoma 5M -64, depositada en la American Type Culture Coil ction bajo el numero de acceso HB 11708. 3.- Un método para detectar rnioglobina en una muestra utilizando un anticuerpo monoclonal producido por la linea de células de hibridoma 5Mb-64, depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 11708, caracterizado porque comprende poner en contacto la muest ra con un anticuerpo policlonal de conejo antimioglobi na, para producir un complejo de anticuerpo políclonal-mioglobma; poner en contacto el complejo con un anticuerpo ^rnonoclonal para producir- un complejo de anticuerpo policlonal-mioglobina-anticuerpo rronoclonal; y detectar el complejo de anticuerpo policlonal-mioglobina-anticuerpo monoclonal.