MXPA96004757A - Microesferas gelificadas, su metodo de preparacion y sus aplicaciones - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a microesferas caracterizadas porque comprenden una matriz polar gelificada alrededor de la cual se sobreponen concéntrica y alternativamente, bicapas de lípidos n o capas acuosas n en el estado líquido, y capas polares gelificadas n, siendo n un número entero igual o mayor que 1, y porque son capaces de ser obtenidas por deslipidación de liposomas del tipo que contiene por lo menos, una bicapa de lípidos externa y por lo menos, una fase acuosa polar interna que contiene una sustancia gelificada, llamadas liposomas, con una matriz polar gelificada.

Description

MICROESFERAS GELIFICADAS, SU MÉTODO DE PREPARACIÓN Y SUS APLICACIONES La presente invención se refiere a microesferas gelificadas, su método de preparación y sus aplicaciones. Las microesferas, que son partículas de forma esférica, el tamaño de las cuales varía generalmente entre 1 y 1250 µm, están compuestas de un material de soporte que contiene la substancia encapsulada y son de ventaja particular, ya sea cuando se desea administrar un medicamento en una forma que hace posible la liberación controlada del componente activo durante cierto período, con el fin de proveer un efecto farmacológico prolongado, o cuando es necesario proteger dicho componente activo de la degradación prematura en el tracto digestivo. Dependiendo de la estructura del material de soporte, se distinguen dos tipos de microcápsulas: microcápsulas de tipo de depósito, en las cuales el material de soporte es una envoltura sólida de espesor variable que contiene la substancia que va a ser encapsulada, microcápsulas de tipo de matriz, también conocidas como microesferas, en las cuales el material de soporte es una red continua en la cual se dispersa la substancia que va a ser encapsulada. Dentro del significado de la presente invención, el término microcápsula o microesfera, comprende únicamente microcápsulas o microesferas de tipo de matriz.

Se pueden encapsular muchas substancias: puede referirse a químicos, tales como medicamentos, o alternativamente a macromoléculas, tales como enzimas, y también a células vivas. Las microesferas se utilizan en muchos campos, tales como el farmacéutico, la industria de biotecnología, cosmetología, la industria de productos agrícolas alimenticios, la industria de la manufactura de papel, y similares. Se han descrito numerosos métodos para la preparación de microcápsulas; se hace mención en particular de: - el método de separación de fases, descrito en particular en la Patente de E.U.A. 4,675,189 y la solicitud Eropea 52,510, que describe microcápsulas preparadas mediante una técnica de separación de fases que utiliza un agente de coacervación, tales como aceites minerales o aceites vegetales. Sin embargo, las microcápsulas preparadas mediante este método y mediante otros métodos análogos, tienen la desventaja de formar racimos (inter-adhesión de partículas) durante la preparación de dichas microcápsulas. el método de evaporación de solventes, descrito en particular en la Patente de E.U.A. 4,479,911, Solicitud Europea 301,969 y Solicitud Europea 145,240; este método comprende la formación separada • de una fase orgánica por disolución de un polímero adecuado en un solvente volátil inmiscible en agua y • de una fase acuosa que contiene el principio activo ventajoso, la adición de la fase acuosa a la fase orgánica, el mezclado de las dos fases con agitación y/o en la presencia de un agente emulsificante y después la evaporación del solvente, generalmente con agitación y a temperatura ambiente, con el fin de obtener las microcápsulas deseadas. La Solicitud Europea 145,240, describe más particularmente microcápsulas producidas preparando una emulsión W/O (emulsión primaria) comprendiendo una capa interna acuosa que contiene una substancia hidrofílica y una substancia de retención de medicamento, así llamada (mucílago natural o sintético o compuestos de alto peso molecular, y más particularmente gelatina) y una capa oleosa que contiene un polímero, preferiblemente un ácido poliláctico o un copolímero de ácido láctico, y de ácido glicólico o sus mezclas, en un solvente inmiscible en agua, tal como diclorometano, espesando o solidificando después dicha capa interna acuosa, de tal forma que se obtenga una viscosidad mayor que 5,000 centípoises, preparando después una emulsión secundaria de W/O/W en presencia de un agente de superficie activa adecuado y, finalmente, sometiendo la emulsión así obtenida a evaporación del solvente. El proceso descrito en esta Solicitud, hace posible obtener microcápsulas con un diámetro de entre 0.5 y 400 µm. Sin embargo, estas microcápsulas o microesferas de la técnica anterior, tienen la principal desventaja de tener diámetros del orden de un µm o más (1-1250 µm); ahora, existen muchas aplicaciones para las cuales es necesario y/o particularmente ventajoso, que sea posible tener partículas disponibles que tengan un diámetro significativamente más pequeño, en particular del orden de un nm o más, por ejemplo entre 20 y 600 nm. Consecuentemente, los solicitantes se han dedicado a la meta de desarrollar microesferas gelificadas, el diámetro de las cuales puede ser controlado y puede alcanzar, si es necesario, 20 nm. El asunto de la presente invención es las microesferas, caracterizadas porque comprenden una matriz polar gelificada (MPG) alrededor de la cual se sobreponen, concéntrica y alternativamente, bicapas de lípidos r_ o capas acuosas n. en el estado líquido, y capas polares gelificadas n.. siendo n_ un número entero, y en cuanto a que son capaces de ser obtenidas por deslipidación de liposomas, llamados lipogelosomas® (marca aplicada a favor del lipogel de la compañía y denotando liposomas con una matriz polar gelificada), del tipo que contiene, por lo menos, una bicapa de lípidos externa y por lo menos una fase acuosa polar interna conteniendo una substancia gelificada. Ventajosamente, dichas microesferas: - exhiben un diámetro controlable, preferiblemente de entre 20 y 600 nm, - son estables, - pueden encerrar substancias activas solubles en agua, - permiten la preparación de ambas formas, de liberación inmediata o de liberación retardada, dependiendo del punto de fusión de la substancia gelificada, - se puede utilizar como la base para la unión de ligandos, de substancias que son reconocidas pobremente por el sistema reticuloendotelial (microesferas ocultas) o de compuestos cargados eléctricamente (teniendo como objetivo eléctrico la electroterapia), y - son capaces de ocultarse (sin ser reconocidas por el sistema reticuloendotelial) cuando exhiben un diámetro del orden de 20-40 nm. De acuerdo con la invención, la substancia capaz de gelificarse, se selecciona de compuestos capaces de gelificarse polimerizables o no polimerizables, tales como polisacáridos, polipéptido o poliacrilamidas. La substancia gelif icable no polimerizable, preferiblemente se selecciona de gelatina, agarosa o carrageninas, y la substancia gelificable polimerizable, se selecciona de geles de poliacrilamida. Dichos liposomas con una matriz polar gelificada, o lipogelosomas, se describen en particular en la Patente Europea 0,393,049, en la cual se especifica que están compuestos de una fase interfacial de bicapa, en el caso de lipogelosomas de una lámina, o de una pluralidad de fases interfaciales de dos capas superimpuestos concéntricamente, en el caso de lipogelosomas de láminas múltiples, y de una fase acuosa polar interna encapsulada, gelificada. Esta patente describe, en particular, el método para obtener dichos lipogelosomas de una lámina o de múltiples láminas: la fase acuosa encapsulada gelificada resulta de la fase acuosa líquida inicial, en la cual están preparados dichos lipogelosomas, mediante conversión de dicha fase acuosa en un gel, debido a la presencia, en dicha fase acuosa, de uno o un número de compuestos gelificables polimerizables o no polimerizables; además, la fase acuosa no encapsulada, puede volverse no gelificable mediante acción física, química o enzimática. La fase o fases interfaciales de dos capas están compuestas, por ejemplo, de lípidos de clase 4 (fosfolípidos), opcionalmente en combinación con lípidos de clase 2 y lípidos de clase 3 (sin colesterol) y/o lípidos de clase 5. Se utilizará esta clasificación de los lípidos, propuesta por el Profesor Hauton y otros, basada en los coeficientes de división KD entre una fase acuosa polar y una fase interfacial de una capa o dos capas y Kc entre una fase interfacial y una fase hidrofóbica o no polar (Hauton y Lafont, Biochimie, 1987, 69_, 177-204); también se describe en la Patente Europea 393,049 mencionada anteriormente.

Dichos lipogelosomas (LGS) generalmente están clasificados de acuerdo al número de bicapas: • como lipogelosomas pequeños de una lámina (GSPUC) y como lipogelosomas grandes de una lámina (GSGUC) y • como lipogelosomas de múltiples láminas (GSGM). De acuerdo con la invención, la etapa de deslipidación de dichos lipogelosomas, se puede llevar a cabo en numerosas maneras, y puede dar como resultado microesferas gelificadas de diámetro controlado: a) deslipidación superficial de lipogelosomas de una lámina o múltiples láminas mediante: (1) extracción de la bicapa de lípidos superficiales de dichos lipogelosomas de una lámina o de láminas múltiples mediante un solvente orgánico inmiscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua; (2) división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; y (3) separación de la fase acuosa que contiene las microesferas gelificadas de superficie deslipidada (remoción de la bicapa más externa). En el caso de la deslipidación de lipogelosomas de una lámina (remoción de la única bicapa de lípidos), se obtienen las microesferas gelificadas de acuerdo con la invención, también llamadas gelosomas® (GS) (marca aplicada en favor del Lipogel de la compañía) gelosomas homogéneos pequeños (GSHP); gelosomas homogéneos grandes (GSHG)) o polimerisomas® (marca aplicada a favor del lipogel de la compañía y también denotando microesferas gelificadas de acuerdo con la invención), las cuales son homogéneas, es decir, las cuales no contienen ninguna bicapa de lípidos, y por lo tanto están compuestas de microesferas acuosas gelificadas homogéneas que corresponden a la matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada mencionada antes.

En el caso de la deslipidación superficial de los lipogelosomas de múltiples láminas /remoción de la bicapa de lípidos más externa), se obtienen las estructuras, llamadas gelosomas de múltiples láminas (GS), híbridos, (MGS híbrido = gelosomas de múltiples capas híbridos) o polimerisomas de múltiples capas híbridos, los cuales son híbridos entre los liposomas (LGS) y gelosomas (GS) y los cuales están compuestos de una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada, sobre la cual hay bicapas de lípidos superimpuestas concéntricamente, separadas mediante capas acuosas gelificadas polimerizadas o no polimerizadas, la capa más externa siendo una capa acuosa gelificada polimerizada o no polimerizada. De hecho, dichas microesferas de acuerdo con la invención representan: - LGS de una lámina, cuando los LGS de partida no deslipidados, que fueron utilizados para su preparación, fueron de dos láminas, o LGS de múltiples láminas, cuando los LGS de partida no deslipidados, los cuales fueron utilizados para su preparación, fueron de múltiples láminas; estas microesferas están rodeadas por una capa superficial acuosa polimerizada o no polimerizada (Cuadro I y Figuras 2 y 3). El solvente orgánico inmiscible en agua, en particular, y de manera no limitante, es heptano. b) deslipidación completa de liposomas de una lámina o múltiples láminas mediante: (1) extracción de lípidos de lipogelosomas de una lámina o múltiples láminas mediante un solvente orgánico miscible en agua o parcialmente miscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos miscibles en agua o parcialmente miscibles en agua; (2) división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; (3) separación del solvente orgánico o solventes de la fase acuosa; y (4) separación de las microesferas gelificadas y completamente deslipidadas. De acuerdo con la invención, cuando la etapa (1) es llevada a cabo utilizando una fase orgánica miscible en agua, se añade un solvente orgánico no polar antes de la etapa (2), haciendo posible así la división en dos fases. En el caso de la deslipidación completa de los lipogelosomas de una lámina (remoción de la única bicapa de lípidos), se obtienen los gelosomas homogéneos (GS) o polimerisomas homogéneos, como se definió antes. En el caso de la deslipidación completa de lipogelosomas de dos láminas, se obtiene una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada en el estado gelificado. En el caso de la deslipidación completa de lipogelosomas de múltiples láminas, se obtienen gelosomas de múltiples láminas (GS) (MGS= gelosomas de múltiples capas) o polimerisomas de múltiples capas, los cuales están compuestos de una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada, sobre la cual hay capas acuosas gelificadas polimerizadas o nc polimerizadas, superimpuestas concéntricamente, separadas una de la otra mediante capas acuosas en el estado líquido. El solvente orgánico ventajosamente, pero no de forma limitante, es n-butanol. Otro asunto de la presente invención, es un método para la preparación de microesferas de acuerdo con la invención, que comprende una matriz polar gelificada (MPG= matriz polar gelificada) alrededor de la cual opcionalmente, hay bicapas de lípidos n. o capas acuosas a, concéntrica y alternativamente, de manera opcional, superimpuestas, en el estado líquido y capas polares gelificadas a, asiendo un número entero, cuyo método se caracteriza porque comprende. (a) la preparación de liposomas, llamados lipogelosomas, del tipo que contiene n + 1 bicapas de lípidos, incluyendo una bicapa de lípídos externa, y por lo menos una fase acuosa polar interna, conteniendo una substancia gelificada, y (b) la deslipidación de dichos lipogelosomas. La etapa (a) se describe en la Patente Europea 0,393,049. De acuerdo con una modalidad ventajosa de dicho método, antes de la etapa de deslipidación, los lipogelosomas son seleccionados de acuerdo con su diámetro, preferiblemente mediante tratamiento por ultrasonido. De acuerdo con otra modalidad ventajosa de dicho método, antes de la etapa de deslipidación, son removidas las substancias no encapsuladas, preferiblemente mediante ultrafiltración tangencial. Así se obtiene un concentrado de lipogelosomas en el dispositivo de retención para ultrafiltración, la etapa de deslipidación se lleva a cavo entonces en dicho dispositivo de retención para ultrafiltración. De acuerdo con otra modalidad ventajosa de dicho método, la etapa de deslipidación (b) comprende, para deslipidación superficial: (1) la extracción de la bicapa de lípidos superficial de dichos lipogelosomas de una lámina o de múltiples láminas mediante un solvente orgánico inmiscible en agua, o una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua; (2) la división en dos fases de la fase orgánica y la fase acuosa; y (3) la separación de la fase acuosa que contiene las microesferas gelificadas de superficie deslipidada, como se definió antes. De acuerdo aún con otra modalidad ventajosa de dicho método, la etapa de deslipidación (b) comprende, para deslipidación completa: (1) la extracción de lípidos de lipogelosomas de una lámina o de múltiples láminas, mediante un solvente orgánico miscible en agua o parcialmente miscible en agua, o una mezcla de solventes orgánicos miscibles en agua o parcialmente miscibles en agua; (2) la división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; (3) la remoción del solvente orgánico de la fase acuosa; y (4) la separación de las microesferas gelificadas y deslipidadas completamente, como se definió antes. Además de las disposiciones precedentes, la invención también comprende otras disposiciones que surgirán de la siguiente descripción, la cual se refiere a los ejemplos de implementación del método el cual es el asunto de la presente invención y los dibujos anexos en los cuales: - La Figura 1, ilustra una microesfera gelificada obtenida por deslipidación de un lipogelosoma de una lámina; - La Figura 2, ilustra una microesfera gelificada obtenida por deslipidación superficial o completa de un lipogelosoma de dos láminas; - La Figura 3, ilustra una microesfera gelificada obtenida por deslipidación superficial o completa de un lipogelosoma de múltiples láminas; - La Figura 4, ¡lustra las variaciones en los volúmenes molares de lipogelosomas de una lámina como una función del radio R (coordenadas log/log); - La Figura 5, ilustra las variaciones en los volúmenes molares de lipogelosomas homogéneos (GSHP o GSHG) como una función del radio R-h (coordenadas log/log); - La Figura 6, ilustra las variaciones en los volúmenes molares de lipogelosomas de capas múltiples, como una función del radio R (coordenadas log/log). Sin embargo, se deberá entender claramente que estos ejemplos se dan únicamente a manera de ilustración del asunto de la invención, de la cual no constituyente una limitación en ninguna forma. Los diferentes tipos de microesferas gelificadas de acuerdo con la invención, se ilustran en el Cuadro I siguiente y en las Figuras 1 a 3. CUADRO I Las microesferas gelificadas polimerizadas o no polimerizadas obtenidas mediante deslipidación superficial o completa de un lipogelosoma de una lámina, se ¡lustran en la Figura 1. Los lipogelosomas de una lámina (GSPUC y GSGUC) comprenden una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada (representada en blanco) con un radio RMPG y una bicapa de fosfolípidos (representada en negro) con un grosor de h = 10"8 cm; el radio de dichos lipogelosomas de una lámina es R= RMPG + h. Por deslipidación del lipogelosoma de una lámina, se obtiene un gelosoma homogéneo (GSHP y GSHG), si la matriz polar gelificada no es polimerizada, o un polimerisoma homogéneo, si la matriz polar gelificada es polimerizada, como se especificó antes. El radio de la microesfera gelificada polimerizada o no polimerizada, de acuerdo con la invención, es igual a RMPG- La fase acuosa líquida que rodea los LGS, y las microesferas, se representa por una serie de rayas (sombreado). Las microesferas gelificadas polimerizadas o no polimerizadas obtenida por deslipidación superficial o completa de un lipogelosoma de los láminas, se ilustran en la Figura 2. La Figura 2A, representa un lipogelosoma de dos láminas, que comprende una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada (representada en blanco) con un radio RMPG y dos bicapas de lípidos (representadas en negro) con un espesor h = 10"8 cm separada por una capa acuosa gelificada con un grosor H; el radio de dichos lipogelosomas (LGS) de dos láminas RLGS = RMPG + 2h + H (1). La Figura 2B, representa los gelosomas de capas múltiples híbridos o polimerisomas obtenidos por deslipidación superficial de dichos LGS de dos láminas: dado que solamente se extrae la bicapa de lípidos superficial, se obtienen las microesferas que comprenden una matriz polar gelificada polimerizada o no polimerizada rodeada por una bicapa de lípidos y después por una capa acuosa de superficie gelificada polimerizada o no polimerizada con un grosor H. El radio de estas microesferas de acuerdo con la invención es La Figura 2C, representa los gelosomas o polimerisomas de capas múltiples, obtenidos mediante deslipidación completa de dichos LGS de dos láminas: dado que se extraen ambas bicapas de lípidos, se obtiene un gelosoma o polimerisoma no homogéneo, compuesto de una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada, una capa acuosa en el estado líquido con un grosor h y finalmente una capa acuosa de superficie gelificada polimerizada o no polimerizada con un grosor H; el radio de estas microesferas es R = RMPG + + H. La Figura 3, representa los gelosomas o polimerisomas de capas múltiples, obtenidos por deslipidación superficial o deslipidación completa de lipogelosomas de capas múltiples (GSGM).

Estos GSGM, comprenden una matriz polar gelificada polimerizada o no polimerizada (MPG) (representada en blanco) con un radio RMPG y bicapas de lípidos n (representadas en negro), con n = 3, el grosor de cada bicapa siendo h = 10"8 cm; el radio de dichos lipogelosomas de láminas múltiples R?_Gs = RiviPG + nh + (n-1 )H (3) es, cuando n = 3, igual a RMpG + 3h + 2H (4). Mediante deslipidación superficial de dichos LGS de tres láminas, se obtienen gelosomas o polimerisomas de capas múltiples híbridos, comprendiendo una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada, una bicapa de lípidos, después una primera capa acuosa gelificada, una segunda capa de lípidos, y después, en la superficie, una segunda capa acuosa gelificada polimerizada o no polimerizada. El radio de dichas microesferas de acuerdo con la invención es R = RMPG + 2h + 2H (5). Mediante deslipidación completa de dichos LGS de tres láminas, se obtienen gelosomas o polimerisomas de capas múltiples, comprendiendo una matriz polar gelificada (MPG) polimerizada o no polimerizada, una primera capa acuosa en el estado líquido (representada de forma sombreada), una primera capa acuosa gelificada, una segunda capa acuosa en el estado líquido y después, en la superficie, una segunda capa acuosa gelificada polimerizada o no polimerizada. El radio de dichas microesferas de acuerdo con la invención es R=RMPG+2h+2H. Ejemplo 1: Determinación de los parámetros físicos de los lipogelosomas (LGS) y de las microesferas de acuerdo con la invención (deslipidada superficialmente o deslipidada completamente): evaluación del control del diámetro de las microesferas. Una condición necesaria para obtener un método normalizado para calcular los parámetros físicos del tipo bien definido de partícula esférica, es observar estrictamente un sistema de las unidades de LMT. Entre los varios sistemas de unidades, el primer sistema C.G.S. es el mejor adecuado a las prácticas de biólogos. Sin embargo, es fácil cambiar de un sistema de unidades a otro mediante el uso de factores de conversión apropiados. Con respecto al sistema C.G.S., es necesario por lo tanto, expresar siembre una longitud en cm, un área superficial en cm2, un volumen en cm3, una densidad en g.cm"3, una concentración en g.cm"3 o en mol.cm"3 y un tiempo en segundos, cuyas condiciones son necesarias, con el fin de ser capaz de obtener modelos normalizados, la ausencia de lo cual constituye una deficiencia en las ciencias biológicas dada la ausencia del uso de unidades que son coherentes entre ellos (Hauton J.C. y otros, Biochimie, 1987, 69, 177-204 Lipid Biodynamics: new perspectives). 1) Parámetros físicos de una especie en partículas esféricas bien definida: Una partícula esférica X, tal como un liposoma (LGS), un gelosoma (GS) o una estructura híbrida entre lipogelosomas (LGS) y gelosomas (GS) con un radio R en cm, es una entidad polimolecular con un volumen vx en cm3, una densidad dx en g.cm'3, una masa mx en g y un área superficial sx en cm2 (los parámetros físicos de una partícula, estando expresados por caracteres de capa inferior). Por lo tanto, una mol de X, es decir, partículas N de X o 6.023 x 1023 partículas (los parámetros físicos molares estando expresados por caracteres de capa superior) tiene un VM (Volumen Molar) VMX de vxN cm3, igual a 4/3 p R3N cm3 o 25.22 x 1023 R3 cm3, una MM (masa Molar) MMX de mxN g o 25.22 x R3dx g y una SM (Superficie Molar) SMX de sxN cm2, igual a Ap R2N cm2 o 75.68 x 1023 R2 cm2 (4/3pN = 25.23x1023, 4 =12.5664 y 4pN = 75.69x1 O23). Si la concentración de la especie en partículas X es expresada en mol.cm"3 por [X]X, existe entonces, por cm3 de un volumen de referencia bien definido (fase acuosa, in vitro, sangre total, plasma, fluido intersticial, bilis, contenidos intraluminales, y similares), la siguiente relación dando el número nx de las partículas por cm3: nx=[X]N o nx = [X]/N"1 (la inversa del número de Avogadro N"1, igual a 0.166 x 10'23, se convierte una constante que expresa en mol.cm"3, la concentración de un solo átomo, de una sola molécula o de una sola partícula). Un parámetro físico o químico molar de una especie en partículas, multiplicado por N o dividido por N'1, da el valor de este parámetro por partícula. 2) Deslipidación de lipogelosomas de una lámina (LGS): En el caso de lipogelosomas de una lámina (LGS) con un radio dado R en cm, existe una fase acuosa gelificada, polimerizado o no polimerizada, encapsulada, conocida como FP (Fase Polar), la cual existe en la forma de una esfera con un radio (R-h) cm, h expresando el grosor en cm de la bicapa de lípidos superficial, conocida como FB (Fase Interfacial de Bicapa). La esfera acuosa gelificada encapsulada, es denotada por le símbolo MPG (Matriz Polar Gelificada). Los resultados son obtenidos a partir del método de cálculo explicado antes y muestra las características físicas de lipogelosomas de una lámina (LGS) de varios diámetros y de microesferas de acuerdo con la invención, es decir, microesferas gelificadas obtenidas por deslipidación (es decir, MPG). Se utilizan los siguientes símbolos: R= radio dado de los lipogelosomas (LGS) en cm. = grosor en cm de una bicapa de lípidos superficial (BLS) que está en la región de 40x10"8 cm (es decir, 40 A o 4 nm). Por lo tanto, medio BLS está en la región de 20x10'8 cm. MVLGS= volumen molar en cm3 de lipogelosomas) con un radio dado R. volumen molar en cm3 de la matriz polar gelificada (MPG) de lipogelosomas de una lámina (LGS) con un radio dado r, es decir, el volumen molar de las microesferas obtenidas por la deslipidación de los lipogelosomas de una lámina (LGS).

MVB S= volumen molar en cm3 de la única BLS superficial que rodea los lipogelosomas de una lámina (LGS) con un radio dado R. MVBLS(O)= volumen molar de la monocapa de fosfolípidos exterior, de la única BLS superficial que rodea los lipogelosomas de una lámina (LGS) con un radio dado R. MVBLS(¡)= volumen molar de la monocapa de fosfolípidos interior, de la única BLS superficial que rodea los lipogelosomas de una lámina (LGS) con un radio dado R. MSLGS= superficie molar en cm2 de los lipogelosomas (LGS) con un radio dado R. MSMPG= superficie molar en cm2 de MPG con un radio (R-h) cm, es decir, la superficie molar de las microesferas gelificadas obtenidas por deslipidación. Se muestran cuatro ejemplos. a) Lipogelosomas de una lámina (LGS) con R=100x10"8 cm (es decir, diámetro de 20 nm): MVLGS= 2.55 x 106 cm3 MVMPG= 0.54 x 106 cm3 (es decir, 22% de MVLGS), MVBLs= 1 98 x 106 cm3 (es decir, 78% de MVLGS), MVBLS(O)= 1.23 x 106 cm3 (es decir, 62.2% de MVBLS), MVBLS(Í)= 0.75 x 106 cm3 (es decir, 37.8% de MVBLS), MSLGS= 7.57 x 1012 cm2, MSMPG= 2.72 x 1012 cm2. b) Lipogelosomas de una lámina (LGS) con R = 500x10"8 cm (es decir diámetro de 100 nm): MVLGS= 315 x 10" CITT MVMPG= 247 x 106 cm3 (es decir, 77.9% de MVLGs), MVBLs= 70 x 106 cm3 (es decir, 22.1% de MVLGS), MVBLS(O)= 36 x 106 cm3 (es decir, 52% de MVBLS), MVBLs(¡)= 33 X 106 cm3 (es decir, 48% de MVB s), MSLGS= 189 x 1012 cm2, MSMPG= 160 x 1012 cm2. c) Lipogelosomas de una lámina (LGS) con R = 2,500x10"8 cm (es decir diámetro de 500 nm): MVLGS= 39,413 x 106 cnr MVMPG= 37,545 x 1 O6 cm3 (es decir, 93.3% de MVLGS), MVBLS= 1,862 x 106 cm3 (es decir, 4.7% de MVLGS), MVBLS(O)= 939 x 106 cm3 (es decir, 50.4% de MVBLs), 923 x 106 cm3 (es decir, 49.6% de MVBLS), MSLGS= 4,730 x lO1^ cm' MSMPG= 4,580 x 1012 cm2. d) Lipogelosomas de una lámina (LGS) con R = 10, 000x10" cm (es decir diámetro de 2,000 nm o 2 micrones): MVLGS= 2,522,432 x 106 cm3 MVMPG= 2,494,284 x 106 cm3 (es decir, 98.8% de MVLGS), MVBLs= 15,108 x 106 cm3 (es decir, 1.2% de MVLGS), MVBLS(O)= 15,108 x 106 cm3 (es decir, 50.1% de MVB s), MVBLS(¡)= 15,047 x 1 O6 cm3 (es decir, 49.9% de MVB s), MSLGS= 75,690 x 1012 cm2, MSMPG= 75,076 x 101¿ cm Por deslipidación de lipogelosomas pequeños de una lámina (GSPUC) o de lipogelosomas grandes de una lámina (GSGUC), se extrae la única bicapa de lípidos superficial: solamente permanece la MPG (Matriz Polar Gelificada), dando así gelosomas (GS) homogéneos polimerizados (polimerisomas homogéneos) o gelosomas (GS) homogéneos no polimerizados, como se especifica antes. Las Figuras 4 y 5, por un lado, muestran en coordenadas de log/log, las variaciones en los valores de VMLGs en cm3 como una función del radio R, expresado en cm, y, por otro lado, aquellos en los valores de VMGS como una función del radio (R-h), expresado en cm. Los resultados, expresados como VM (Volumen Molar) en cm3.mol"1, pueden ser expresados como MM (Masa Molar) en g.mol'1 multiplicando la VM por la densidad d en g.cm"3. Dado que se conocen la densidad dpp de la fase polar acuosa gelificada, polimerizada o no polimerizada, encapsulada, y la de la bicapa de lípidos superficial DBLS, es posible entonces calcular la densidad d Gs de los lipogelosomas (LGS) o la dGS de los gelosomas (GS). 3) Deslipidación de lipogelosomas de láminas múltiples (LGS): Los lipogelosomas de láminas múltiples (LGS) (GSML) consiste de una MPG (Matriz Polar Gelificada) polimerizada o no polimerizada con un radio RMPG, expresado en cm, sobre el cual se sobreimponen concéntricamente una primera bicapa de lípidos con un grosor h en la región de 40x10"8 cm, después una capa acuosa gelificada polimerizada o no polimerizada con un grosor H del orden de 100 x 10"8 cm, después una segunda bicapa de lípidos, y así sucesivamente. Dado que el símbolo n representa el número de bicapas de lípidos, el radio R de un lipogelosoma de láminas múltiples (GSML) se da por la ecuación (3) anterior. El Cuadro II muestra, como un ejemplo, las variaciones en los valores de VMLGS y los porcentajes respectivos de volumen %VM Gs y los porcentajes respectivos de volumen %VMPP de la fase acuosa gelificada, polimerizada o no polimerizada, encapsulada, y % MVBLS de la fase de lípídos de un LGS que tiene un RMPG de 210 x 10"8 cm. La Figura 6, muestra los parámetros mencionados antes, en coordenadas log/log, para lipogelosomas de múltiples láminas. En la práctica, es necesario determinar los parámetros de RMPG, n, h y H de una especia definida de lipogelosoma de láminas múltiples (GSML) con el fin de especificar completamente sus características físicas. CUADRO II De acuerdo con la invención, durante la deslipidación de superficie, solamente se la superficie o la bicapa de lípidos exterior con un grosor h de los lipogelosomas de múltiples láminas (GSML). Las estructuras híbridas entre lipogelosomas (LGS) y gelosomas (GS), son obtenidas entonces comprendiendo una capa acuosa gelificada polimerizada o no polimerizada con un grosor H y conteniendo (n-1) bicapas de lípidos rodeando la MPG polimerizada o no polimerizada. El radio de estas estructuras híbridas será igual a RLGS-GI, RLGS siendo el radio de los lipogelosomas de múltiples lámina (GSGM) antes de la deslipidación. De acuerdo con la invención, durante la deslipidación completa, se extraen todas las capas de lípidos de los lipogelosomas de láminas múltiples (GSML), dejando un espacio que será ocupado por la fase polar acuosa en el estado líquido durante la división de fase orgánica/fase acuosa. Por lo tanto se obtienen las estructuras no homogéneas, denotadas como gelosomas de múltiples capas (MGS), la fase acuosa gelificada encapsulada de partida de los cuales, se origina de los lipogelosomas de láminas múltiples (GSML), pueden ser polimerizados (polimerisomas de capas múltiples) o pueden ser no polimerizados. El radio de estos gelosomas (GS) no homogéneos, será igual a RLGs-h, RLGS siendo el radio de los lipogelosomas de capas múltiples (GSML) antes de la deslipidación. Después de las deslipidación completa, el porcentaje molar del espacio de lípidos así liberado y ocupado por la fase acuosa liquida que se origina de la división de solvente/agua, será igual al % MVBLS de los lipogelosomas de múltiples láminas (GSML) no deslipidados. Ejemplo 2: Preparación de microesferas de acuerdo con la invención. A. Productos: a) Fosfolípidos: La fase de lípidos está compuesta de fosfolipidos de soya sin aceite de "Stern-France", presentados en la forma seca, y se utiliza a una concentración de 7.5% en peso/volumen. b) Agentes gelificables no polimerizables: - gelatina, del tipo de "B150 Blooms", de "Sanofi-Bioindustries", Francia; tiene una temperatura de fusión entre 30 y 35°C y se utiliza a una concentración de 7.5% en peso/volumen. - carragenina de "Sanofi-Bioindustries", Francia. La mezcla de gelatina/carragenina a 80/20 (p/p), tiene una temperatura de fusión de 50°C. Esta mezcla se utiliza a una concentración de 7.5% en peso/volumen. La gelatina o la mezcla de gelatina/carragenina, en las proporciones y concentraciones mencionadas antes, da una fase acuosa gelificada no polimerizada por debajo de las temperaturas de fusión respectivas de 30-35°C y 50°C. c) Agente gelificable polimerizable: - Acrilamida/bis-acrilamida de "Sigma". Una fase acuosa gelificada polimerizada se obtiene mezclando acrilamida/bis-acrilamida de "Sigma" "TemedV de "bio-Rad" y persulfato de amonio de "Bio-Rad" bajo condiciones de concentración apropiadas; en particular se utiliza una concentración de 15 en volumen/volumen de acrilamida/bis-acrilamida- El gel de poliacrilamida es un ejemplo no limitante seleccionado de los compuestos polimerizables. d) Agente Crioprotector: - sacarosa de "Sigma" (utilizado a 7.5% en peso/volumen). B. Procedimiento: Las concentraciones dadas son aquellas utilizadas en la fase acuosa de partida, en la cual los fosfolípidos son dispersados. Se prefiere el siguiente proceso, entre los diferentes procesos utilizados para la preparación de liposomas y lipogelosomas y que son adecuados sobre una escala industrial, dado que contiene una etapa de tratamiento por ultrasonido, (adecuada en una escala industrial) lo cual hace posible obtener una gran mayoría de lipogelosomas (LGS) con un diámetro del orden de 100 nm, es decir, un radio R de 500 x 10"8 cm. Por barrido casi elástico, medido con un dimensionador de partículas de láser de "Sema-Tech" (Nice), el 81% por número de población de lipogelosomas (LGS) se centra en un diámetro de 92.7 nm (un radio R de 413 x 10'8 cm) y 19% en un diámetro de 312 nm (un radio r de 1,560 x 10"8 cm). Este proceso comprende: 1) Agitación mecánica lenta de fosfolipidos de soya sin aceite de "Stern-France" a una concentración de 7.5% (p/v) durante 3 horas, dispersado en una fase acuosa que contiene el agente gelificador (7.5% de gelatina o de la mezcla de gelatina/carragenina 15% de acrilamida/bis-acrilamida sin Temed® y persulfato de amonio), en el estado líquido. Opcionalmente se añade el 7.5% (p/v) de sacarosa, como agente crioprotector. a) Para los agentes de gelificación no polímerizables (gelatina o mezcla de gelatina/carragenina), la etapa de agitación mecánica, se lleva a cabo por arriba del punto de fusión de estos agentes gelificadores. b) Para poliacrilamida como agente de gelificación polimerizable, esta agitación mecánica se lleva a cabo sin la adición de "Temed®" y de persulfato de amonio, lo cual evita el proceso de polimerización. Esta etapa de agitación mecánica, produce liposomas de láminas múltiples (dado que aún no se han convertido a lipogelosomas) con un diámetro que varía de 297 a 2,084 nm con un diámetro medio de 504 nm (es decir, un radio R de 2,520 x 10"8 cm). 2) Tratamiento con ultrasonido mediante un generador de ultrasonido sonoro-reactor ("Undatim Utrasonics", Louvain-La-Neuve, Bélgica) con sonotrodos de titanio adecuados al volumen de la suspensión de liposomas. Se utiliza una frecuencia de 20 kHz, la potencia siendo adecuada al volumen de la suspensión de liposomas.

Para volúmenes del orden de 10 cm3, el tiempo de tratamiento con sonido está entre 3 y 4 minutos, mientras que se eleva a 10 minutos para volúmenes de 700 a 750 cm3 a) Para los agentes gelificadores no polimerizables, mencionados antes, el tratamiento con sonido se lleva a cabo por arriba del punto de fusión de estos agentes. b) Para el agente de gelificación polimerizable de poliacrilamida, "Temed®" y persulfato de amonio, el cual induce el proceso de polimerización, son añadidos al principio del tratamiento con ultrasonido. La dilución acuosa inmediata al final del tratamiento con sonido (1/10 a 1/20°) evita la polimerización de la fase acuosa la cual no está encapsulada en los liposomas, mientras que la fase acuosa encapsulada en la última, será polimerizada. 3) Remoción de los compuestos no encapsulados por ultrafiltración tangencial, los liposomas y/o lipogelosomas que permanecen en el dispositivo de retención. El equipo utilizado, proveniente de "Filtron" (Francia), puede ser ajustado como una función del volumen que será tratado. Las membranas utilizadas tienen un umbral disminuido de 300 kDa o 1,000 kDa (es decir, más correctamente, de 3000,000 o 1 millón de g.mol'1). En ausencia de dilución acuosa, la ultrafiltración tangencial de los liposomas tiene que ser llevada a cabo a una temperatura mayor que la temperatura de fusión de los agentes de gelificación no polimerizables (gelatina o mezcla de gelatina/carragenina). La dilución acuosa apropiada después del tratamiento con sonido, puede permitir que la ultrafiltración tangencial sea utilizada a temperatura ambiente. Se ha utilizado papaina para fragmentar la gelatina no encapsulada con el fin de incrementar el rendimiento de la diálisis de los compuestos gelificados encapsulados no polimerizables. Subsecuentemente, la disminución de la temperatura, convertirá los liposomas a lipogelosomas, lo cual será concentrados en el dispositivo de retención. Para poliacrilamida como agente de gelificación polimerizable, la dilución apropiada y ultrafiltración inmediatamente después del tratamiento con sonido, remueve el agente polimerizable no encapsulado, mientras que el agente polimerizable encapsulado convertirá los liposomas a lipogelosomas. 4) Deslipidación superficial o completa de los lipogelosomas (LGS): Los lipogelosomas (LGS), más o menos concentrados en el dispositivo de retención para ultrafiltración, de acuerdo con las condiciones de operación elegidas, son deslipidadas superficialmente por un solvente inmiscible en agua (o una mezcla de solventes inmiscibles en agua). Se ha utilizado heptano como solvente inmiscible en agua. Se obtiene deslipidación completa utilizando un solvente miscible en agua, o preferiblemente solvente parcialmente miscible en agua, tal como n-butanol. Después de la separación en dos fases de fase orgánica/fase acuosa, se recuperan las diferentes microesferas descritas antes, en la fase acuosa polar, es decir: los gelosomas homogéneos pequeños (GSHP) no polimerizados o gelosomas homogéneos grandes (GSHG), gelosomas pequeños homogéneos (GSHP) polimerizados, o gelosomas homogéneos grandes (GSHG) (o polimerisomas homogéneos), lipogelosomas de múltiples capas (GSMC) rodeados por una capa acuosa gelificada no polimerizada (estructuras híbridas entre lipogelosomas (LGS) y gelosomas (GS)), lipogelosomas de múltiples capas (GSMC) rodeados por una capa acuosa gelificada polimerizada (estructura híbridas entre lipogelosomas (LGS) y gelosomas (GS)), y gelosomas de capas múltiples no polimerizados o gelosomas de capas múltiples polimerizados (polimerisomas de capas múltiples). Mediante el monitoreo de la disminución en los diámetros obtenidos por deslipidación superficial o completa de los lipogelosomas (LGS) de una lámina, por determinación con láser de tamaño de partícula y microscopía electrónica, se hace posible la confirmación de que el procesos utilizado ha sido llevado a cabo correctamente. Además, la determinación cuantitativa de los lípidos en la fase orgánica obtenida después de la división de solvente(s)/agua, hace posible confirmar la eficiencia de la deslipidación. Como surge de lo anterior, la invención en ninguna manera está limitada a aquellos métodos de implementación, producción y aplicación, que han sido descritos más explícitamente; por el contrario, abarca todas las variaciones de los mismos, que pueden venir a la mente de un experto en la materia, sin alejarse del contexto o del alcance de ia presente invención.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Microesferas, caracterizadas porque comprenden una matriz polar gelificada alrededor de la cual, se sobreponen concéntrica y alternativamente, bicapas de lípidos a o capas acuosas en el estado líquido y capas polares gelificadas a. siendo a un número entero, igual o mayor que 1, y dado que son capaces de ser obtenidos por deslipidación de liposomas, llamados liposomas con una matriz polar gelificada, del tipo que contiene por lo menos una bicapa de lípidos externa y por lo menos una fase acuosa polar interna que contiene una substancia gelificada.
2. 2. Microesferas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque la substancia gelificable se selecciona de compuestos gelificables polimerizables o no polimerizables, tales como polisacáridos, polipéptido o poliacrilamidas.
3. 3. Microesferas de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizadas porque la substancia gelificable no polimerizable se selecciona de gelatina, agarosa o carrageninas y la substancia gelificable polimerizable se selecciona de geles de poliacrilamida.
4. 4. Microesferas, caracterizadas porque están constituidas por una matriz polar gelíficada, porque son capaces de ser obtenidas por deslipidación de liposomas, llamados liposomas con una matriz polar gelificada, del tipo que contiene por lo menos una bicapa de lípidos externa y por lo menos una fase acuosa polar interna que contiene una substancia gelificada y porque la substancia gelificable se seleccionan de compuestos gelificables polimerizables o no polimerizables, tales como polisacáridos, polipéptidos o poliacrilamidas, dichos compuestos gelificables no polimerizables siendo seleccionados de gelatina, agarosa o carrageninas, excepto una mezcla de gelatina-agarosa.
5. 5. Microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque exhiben un diámetro de entre 20 y 600 nm.
6. 6. Microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque la deslipidación se lleva a cabo por deslipidación superficial de liposomas de una lámina o múltiples láminas con una matriz polar gelificada por: (1) extracción de la bicapa de lípidos superficial de dichos liposomas de una lámina o múltiples láminas, con una matriz polar gelificada mediante un solvente orgánico inmiscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua; (2) división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; y (3) separación de la fase acuosa que contiene las microesferas gelificadas de superficie deslipidada.
7. 7. Microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque la deslipidación se lleva a cabo por deslipidación completa de liposomas de una lámina o múltiples láminas con una matriz polar gelificada mediante: (1) extracción de lípidos de lipogelosomas de una lámina o múltiples láminas mediante un solvente orgánico miscible en agua o parcialmente miscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos miscibles en agua o parcialmente miscibles en agua; (2) división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; (3) separación del solvente orgánico o solventes de la fase acuosa; y (4) separación de las microesferas gelificadas y completamente deslipidadas.
8. 8. Microesferas de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizadas porque, cuando se lleva a cabo la etapa (1) utilizando una fase orgánica miscible en agua, se añade un solvente orgánico no polar antes de la etapa (2).
9. 9. Método para la preparación de microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo una matriz polar gelificada, alrededor de la cual, se sobreponen concéntrica y alternativamente, bicapas de lípidos a ° capas acuosas a en el estado líquido y capas polares gelificadas a. siendo un número entero, cuyo método se caracteriza porque comprende: (a) la preparación de liposomas con una matriz polar gelificada del tipo que contiene bicapas de lípidos n + 1, incluyendo una bicapa de lípidos externa, y por lo menos una fase acuosa polar interna que contiene una substancia gelificada, y (b) la deslipidación de dichos liposomas con una matriz polar gelificada.
10. 10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque, antes de la etapa de deslipidación, los liposomas con una matriz polar gelificada, se seleccionan de acuerdo con su diámetro, preferiblemente por tratamiento con ultrasonido.
11. 11. Método de acuerdo a la reivindicación 9, o la reivindicación 10, caracterizado porque antes de la etapa de deslipidación, se remueven las substancias no encapsuladas, preferiblemente por ultrafiltración tangencial.
12. 12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la etapa de deslipidación (b) comprende, para deslipidación superficial: (1) la extracción de la bicapa de lípidos superficial de dichos liposomas de una lámina o múltiples láminas con una matriz polar gelificada por un solvente orgánico inmiscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua; (2) la división en dos fases de la fase orgánica y la fase acuosa; (3) la separación de la fase acuosa conteniendo las microesferas gelificadas deslipidadas superficialmente.
13. 13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la etapa de deslipidación (b) comprende, para deslipidación completa: (1) extracción de lípidos de lipogelosomas de una lámina o múltiples láminas mediante un solvente orgánico miscible en agua o parcialmente miscible en agua o una mezcla de solventes orgánicos miscibles en agua o parcialmente miscibles en agua; (2) división en dos fases de la fase orgánica y de la fase acuosa; (3) separación del solvente orgánico o solventes de la fase acuosa; y (4) separación de las microesferas gelificadas y completamente deslipidadas.
14. 14. Aplicación de las microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como vehículos para substancias activas.
15. 15. Aplicación de las microesferas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como un reactivo de diagnóstico.