MXPA94006538A - Inmunoensayo de complementacion enzimaticaelectroquimica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un equipo, el método, y el aparato de diagnóstico por inmunoensayo para determinar electroquímicamente la concentración de un analito o sustancia que se va a analizar en una muestra. Se forma un mezcla que incluye la muestra, un polipéptido receptor de enzima, un polipéptido donador de enzima ligado a un análogo del analito (conjugado polipeptídico donador de enzimas), un sustrato marcado, y un anticuerpo específico para el analito a ser medido. El analito y el conjugado polipeptídico donador de enzima se unen competitivamente al anticuerpo. Cuando el conjugado polipeptídico donador de enzima no se une al anticuerpo, se combinaráespontáneamente con el polipéptido receptor de enzima para formar un complejo enzimático activo. La enzima activa hidroliza el sustrato marcado, dando como resultado la generación de una marca electroactiva, la cual puede ser entonces oxidada en la superficie de un electrodo. Una corriente resultada de la oxidación del compuesto electroactivo puede ser la medida y correlacionada con la concentración de analito de la muestra.

Description

"INMUNOENSAYO DE COMPLEMENTACION ENZIMATICA ELECTROQUÍMICA" Inventores: MARY E. BROWN, norteamericano, domiciliado en 4242 Saffron Drive, Indianapolis, Indiana 46237, E.U.A.; LANCE S. KUHN, norteamericano, domiciliado en 11072 Lake Run, Fishers, Indiana 46038, E.U.A.; ROBERT J. MCENROE, norteamericano, domiciliado en 19140 Green Valley Drive, Noblesville, Indiana 46060, E.U.A.; REBECCA W. MUDDIMAN, norteamericano, domiciliado en 9310 Kungsholm Drive, Apt. E, Indianapolis, Indiana 46250, E.U.A.; MARY LUANN OCHS, norteamericano, domiciliado en 12539 Pewter Place, Fishers, Indiana 46038, E.U.A.; JOHN G.R. HURRELL, australiano, domiciliado en 11196 estminster Court, Carmel, Indiana 46032, E.U.A. y HANS-JOACHIM GUDER, alemán, domiciliado en Lindenweg 4, D-67269 Grunstadt, Alemania.

Causahabiente: BOEHRINGER MANNHEIM CORPORATION, corporación del Estado de Indiana, E.U.A. domiciliada en 9115 Hague Road, Indianapolis, Indiana 46250-0528, E.U.A.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un equipo, el método, y el aparato de diagnóstico por inmunoensayo para determinar electroquímicamente la concentración de un analito o sustancia que se va a analizar en una muestra. Se forma una mezcla que incluye la muestra, un polipéptido receptor de enzima, un polipéptido donador de enzima ligado a un análogo del analito (conjugado polipeptídico donador de enzimas), un sustrato marcado, y un anticuerpo específico para el analito a ser medido. El analito y el conjugado polipeptídico donador de enzima se unen competitivamente al anticuerpo. Cuando el conjugado polipeptídico donador de enzima no se une al anticuerpo, se combinará espontáneamente con el polipéptido receptor de enzima para formar un complejo enzimático activo. La enzima activa hidroliza el sustrato marcado, dando como resultado la generación de una marca electroactiva, la cual puede ser entonces oxidada en la superficie de un electrodo. Una corriente resultada de la oxidación del compuesto electroactivo puede ser medida y correlacionada con la concentración de analito en la muestra.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona de manera general con el campo del inmunoensayo electroquímico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El radioinmunoensayo fue desarrollado en 1960 por Yarlow y Berson como un método para detectar o cuantificar antígenos o anticuerpos utilizando reactivos radiomarcados . A partir de los estudios iniciales en 1960, el radioinmunoensayo (RÍA) ha evolucionado hacia una técnica analítica versátil, particularmente útil en los laboratorios clínicos para cuantificar una amplia variedad de compuestos. Con el RÍA, la concentración desconocida de un antígeno no marcado se determina comparando su efecto inhibidor sobre la unión de un antígeno marcado radioactivamente a un anticuerpo. Los RÍA tienen un número significativo de limitaciones, sin embargo, incluyendo una vida de anaquel limitada, costo elevado, y riesgos ambientales potenciales. Las desventajas asociadas con los RÍA condujeron al desarrollo del inmunoensayo enzimático (EIA), en el cual se mide la actividad de una enzima para cuantificar un analito o sustancia que se va a analizar. Los EIA se subdividen en ensayos heterogéneos y ensayos homogéneos. Los EIA heterogéneos requieren una separación física del analito marcado, unido al anticuerpo del analito marcado no unido. Con los EIA homogéneos, no se requiere un paso de separación. Los EIA han sido comercialmente exitosos debido a su velocidad, simplicidad, y automatización. La actividad enzimática asociada con los EIA con frecuencia se determina espectrofotométricamente, utilizando un sustrato que produce un cromóforo único como resultado de una reacción enzimática . Además de utilizar técnicas de detección espectrofotométrica, se han desarrollado EIA que utilizan la electroquímica para determinar la actividad de la enzima marcada. Con la detección electroquímica, la enzima activa provoca la formación de un mediador electrónico activo o un par redox a partir de un sustrato inactivo. El mediador activado o par redox lanza entonces electrones desde la enzima hacia el electrodo o desde el electrodo hacia la enzima. La corriente resultante puede ser medida y correlacionada con el nivel de analito o sustancia que se va a analizar. También se conocen ensayos enzimáticos electroquímicos directos (no inmunológicos) en los cuales la presencia o ausencia del analito a ser medido produce un compuesto electroactivo ha ser escindido de un sustrato no electroactivo. El compuesto electroactivo puede ser a continuación oxidado o reducido y la corriente resultante medida . Se han desarrollado inmunoensayos de complementación enzimática, tales como la tecnología CEDÍA® (Inmunoensayo Donador de Enzima Clonada - una marca registrada de Microgenics Corporation), un ejemplo de los cuales es descrito por Henderson, Patente norteamericana No. 4,708,929, concedida en Noviembre 24, 1987, la cual se incorpora aquí como referencia. La tecnología CEDÍA® implica el uso ' de polipéptidos receptores de enzima y donadores de enzima preparados por las técnicas del ADN recombinante o las técnicas de síntesis polipeptídica química que son capaces de combinarse espontáneamente en solución para formar un complejo enzimático activo. El polipéptido donador de enzima se une a un análogo del analito a ser medido (conjugado polipeptídico donador de enzima). La presencia del anticuerpo unido al conjugado polipeptídico donador de enzima previene el reensamblaje espontáneo de las subunidades enzimáticas. Cuando el analito se introduce en una muestra, el analito de la muestra compite con el conjugado polipeptídico donador de enzima por el anticuerpo, dando como resultado un incremento en la actividad enzimática con cantidades mayores de analito en la muestra. La cantidad de la actividad enzimática se determina entonces espectrofotométricamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa en la combinación novedosa de la tecnología CEDÍA® (inmunoensayo de complementación enzimática) con la detección electroquímica de la actividad enzimática para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido. Las ventajas que resultan de esta combinación incluyen la velocidad y simplicidad de un EIA homogéneo, mayor sensibilidad del analito, requerimientos- de volumen de muestra mucho más pequeños, y la adaptabilidad del ensayo a una amplia gama de analitos. Los componentes del ensayo incluyen un polipéptido receptor de enzima ("EA"), un polipéptido donador de enzima ligado a un análogo del analito (conjugado polipeptídico donador de enzima - "ED"), un sustrato para la reacción enzimática, una marca que se une al sustrato y que es preferiblemente no selectiva hasta que es escindida del sustrato, y un anticuerpo específico para el analito a ser medido. La muestra de fluido que contiene el analito se mezcla con un primer reactivo (reactivo EA) que incluye EA y anticuerpo. Esta mezcla se mezcla a continuación con un segundo reactivo (reactivo ED) el cual incluye ED y el sustrato marcado. Cuando EA y ED están presentes solos en un medio acuoso, ocurre la complementación, dando como resultado un complejo enzimático activo. Sin embargo, la presencia del analito y el anticuerpo en la muestra, ED y el analito de la muestra se unen competitivamente al anticuerpo. Cuando ED queda unido al anticuerpo, no está disponible para la complementación con EA para formar la enzima activa. Como resultado, la cantidad de analito en la muestra se incrementa, menos ED se une al anticuerpo y se forma más enzima activa. La enzima activa rompe entonces la marca del sustrato. La marca se vuelve electroactiva al potencial medido cuando se rompe y puede ser oxidada en la superficie de un electrodo. La corriente medida a partir de la oxidación de la marca puede ser correlacionada con la concentración del analito en la muestra .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama de bloques de los componentes principales del ensayo CEDÍA® y su interacción. La Figura 2 es un diagrama de bloques de los componentes principales de la presente invención y su interacción. La Figura 3 es una representación de los eventos bioquímicos de la presente invención, que utiliza el ejemplo de la 4- ( 1 , 4 , 7 , 10-tetraoxadecil ) -1-naftil-ß-D-galactopiranosido como un sustrato marcado. La Figura 4 es una vista superior esquemática de una modalidad de una celda electrolítica utilizada con la presente invención . La Figura 5 es una vista en corte transversal , esquemática, de la Figura 4 tomada a lo largo de la línea 5-5 de la Figura 4. La Figura 6 es una vista superior esquemática de una modalidad de un inmunodetector de la presente invención, que excluye el cuarto sustrato aislante. La Figura 7 es una vista en corte transversal, esquemática, de la Figura 6, tomada a lo largo de la línea 7-7 de la Figura 6, que incluye el cuarto sustrato aislante. La Figura 8 es una vista superior esquemática de una modalidad de un inmunodetector de la presente invención, que excluye el cuarto sustrato aislante. La Figura 9, es una vista en corte transversal, esquemática, de la Figura 8, tomada a lo largo de la línea 9-9 de la Figura 8, que incluye el cuarto sustrato aislante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una modalidad de la tecnología CEDÍA® , las subunidades inactivas de la enzima ß-galactosidasa se combinan espontáneamente en solución para formar una enzima que exhibe una actividad enzimática de ß-galactosidasa completa. Refiriéndose a la Figura 1 , el análogo del analito l se une covalente al polipéptido donador de enzima 2 para formar el conjugado polipeptídico donador de enzima 3 (ED) . Puede utilizarse el anticuerpo específico contra el analito 4 para inhibir el reensamblaje del ED 3 con el polipéptido receptor de enzima 6 (CA) . Cuando se introduce una muestra que contiene el analito 8, el analito 8 y ED 3 compiten por unirse al anticuerpo 4. A medida que la cantidad de analito 8 se incrementa, se une menos ED 3 al anticuerpo 4 y se forma más enzima activa 10. La enzima activa 10 hidroliza el sustrato de la enzima 11 (por ejemplo, rojo de clorofenol-ß-D-galactopiranosa (CPRG)), el cual experimenta a continuación un cambio de color y se determina espectrofotométricamente. El Theophylline System Pack (un ensayo de CEDÍA®, comercialmente disponible de Boehringer Mannheim Corporation, No. de Catálogo 1299883) es un EIA para la determinación cuantitativa de la teofilina en suero o plasma. El Theophylline System Pack fue modificado y optimizado para permitir que las mediciones se efectuaran de acuerdo con la presente invención. El contenido del Theophylline System Pack que ee hizo referencia anteriormente será descrito ahora. La enzima utilizada en el Theophylline System Pack es cortada en dos fragmentos inactivos, EA y ED, a través del uso de la tecnología del ADN recombinante . EA es un polipéptido relativamente grande que contiene aproximadamente un 95% de la secuencia de la proteína de la enzima ß-galactosidasa nativa. ED es un polipéptido pequeño que contiene aproximadamente 5% de la enzima ß-galactosidasa nativa. EA puede recombinarse espontáneamente con ED para formar una enzima catalíticamente activa. El análogo del analítico se une covalentemente a ED en una forma que no interfiere con la asociación de los fragmentos de enzima. - El Theophylline System Pack incluye cuatro componentes principales: (i) reactivo EA (liofilizado), (ii) amortiguador de reconstitución de EA, (iii) reactivo ED (liofilizado), y (iv) amortiguador de reconstitución de ED. El reactivo EA (liofilizado) incluye el fragmento EA de la enzima, anticuerpo monoclonal anti-teofilina, sales amortiguadoras, tensoactivos, proteínas portadoras, y preservativo. Un frasco del reactivo EA se reconstituye con 20 mi (mililitros) de amortiguador de reconstitución de EA. El amortiguador de reconstitución de EA incluye solución amortiguadora de ácido 3-(N-morfolino)propansulfónico (MOPS), estabilizadores, y preservativo. El reactivo ED (liofilizado) incluye el fragmento ED de la enzima, amortiguador, rojo de clorofenol-ß-D-galactosidasa (CPRG), tensoactivos, estabilizadores, anticuerpo secundario, y preservativo. Un frasco del reactivo ED se reconstituye con 16 mi de amortiguador de reconstitución de ED, el cual es de composición similar al amortiguador de reconstitución de EA. El Theophylline System Pack descrito anteriormente puede ser modificado para utilizarse en la presente invención. Refiriéndose a la Figura 2, el análogo del analito 1, el polipéptido donador de enzima 2, ED 3, el anticuerpo 4, EA 6, el analito de la muestra 8, y la enzima activa 10 tienen todos la misma función que en el ensayo CEDÍA® descrita en" la Figura 1. Sin embargo, el sustrato marcado 12 se hace enlazando covalentemente la marca 14 al sustrato 13 en tal forma que la marca 14 no es electroactiva al potencial medido hasta ser rota del sustrato 13 por hidrólisis enzimática. La marca 14 puede entonces ser oxidada en la superficie del electrodo 15 para producir una corriente que puede ser correlacionada para la detección o medición del analito 8 presente en la muestra que es analizada. La presente invención permite efectuar un ensayo sobre una muestra de aproximadamente 25 ßl (microlitros) , mientras que el Theophylline System Pack requiere un volumen de muestra de aproximadamente 250 µl. El Theophylline System Pack fue modificado como se describe en las tablas 1 hasta 4, que identifican los componentes, concentraciones, y funciones de los componentes de acuerdo con la presente invención.

Tabla 1 - Modificaciones del Theophylline System Pack -reactivo ED Tabla 2 - Modificaciones del Theophylline System Pack Amortiguador de reconstitución de ED Tabla 3 - Modificaciones del Theophylline System Pack Reactivo EA Tabla 4 - Modificaciones del Theophylline System Pack amortiguador de reconstitución de EA Preparación de los Reactivos Los reactivos EA y ED y los amortiguadores de reconstitución descritos anteriormente se prepararon como sigue. Reactivo EA: se preparó un volumen de amortiguador de fosfato de potasio con una concentración de 4.000 mM en agua desionizada, destilada. (Debido a que se hace una medición electroquímica la presente invención, es importante que el amortiguador sea electroquímicamente inactivo al potencial de medición). El pH se ajustó a 7.1 a 25°C mediante la adición de HCl (ácido clorídrico) ÍN (normal). El amortiguador fue filtrado a continuación a través de acetato de celulosa estéril de 0.2µm (micrómetros). El fragmento receptor- de enzima (EA) se cortó utilizando sulfato de sodio y la concentración de EA se tituló antes de ser adicionada al volumen de amortiguador a aproximadamente 200 U/ml (unidades de ß-galactosidasa definidas por su reacción con rojo de clorofenol-ß-D-galactopiranósido (CPRG), en base al coeficiente de extinción del sustrato escindido). El anticuerpo monoclonal contra la teofilina se adicionó al reactivo a una concentración de aproximadamente 25 µl/ml. A continuación se adicionó un exceso de teofilina al reactivo a una concentración de 40 mg/ml. El exceso de teofilina incrementa la linealidad del sistema desplazando el extremo inferior de la curva de calibración hacia el intervalo lineal. A continuación se ensayó el reactivo frente a un reactivo de referencia y se ajustó para alcanzar la actividad apropiada (una titulación para asegurar que existe suficiente ß-galactosidasa, teofilina, y anticuerpo monoclonal contra la teofilina para medir la concentración más alta de teofilina a ser detectada por el ensayo). El reactivo fue filtrado a continuación a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.2 µm y se liofilizaron 4 mi en una botella de vidrio. Reactivo ED: se preparó un volumen de amortiguador de fosfato de potasio con una concentración de 80.000 mM en agua desionizada, destilada. (Como se estableció anteriormente, es importante que el amortiguador sea electroquímicamente inactivo al potencial de medición).- A continuación se adicionó BSA digerido con pepsina al amortiguador a una concentración de 2.0 mg/ml. La adición de BSA (fragmentos de proteínas) al reactivo ED reduce la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la muestra de fluido (es decir, BSA aumenta la estabilidad del anticuerpo y ED y las interacciones hidrofóbicas resultantes mantienen la conformación de las proteínas). Las síntesis de BSA digerida con pepsina es descrita por Coty et al, en el ejemplo 2, columna 1 , líneas 26-40 (utilizando el periodo de incubación de 60 minutos) de la Patente norteamericana No. 5,212,081, otorgada en Mayo 18, 1993, la cual se incorpora a la presente como referencia. El pH se ajustó a continuación a 7.1 a 25°C. A continuación se adicionó suero anti-ratón de cabra (GAMS) inactivado para lograr una concentración de proteína de 10 g (gramos)/l. El GAMS contiene un segundo anticuerpo, capaz de unirse al anticuerpo monoclonal contra la teofilina, que ayuda a reducir la señal de ruido proporcionando impedimento estérico extra para asegurar que el fragmento ED no se complemente con EA cuando ED está unido al anticuerpo monoclonal contra la teofilina. Se preparó una solución patrón de 120 mg/ml de un sustrato marcado con ß-galactosidasa apropiado (por ejemplo, 4-( 1 , 4 , 7 , 10-tetraoxadecil )-l- naftil-ß-D-galactopiranósido, 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido o p-aminofenil-ß-D-galactopiranósido) . La síntesis de esos sustratos marcados se describe más adelante. La solución patrón de sustrato marcado fue adicionada a continuación en suficiente cantidad para asegurar que el sustrato marcado estuviese disponible para la hidrólisis enzimática a una alta concentración de analito. A continuación el reactivo ee filtró a través de un filtro de acetato de celuloea de 0.2 µm. Finalmente, se adicionó el conjugado polipeptídico donador de enzima (ED). A continuación se ensayó el reactivo frente a un reactivo de referencia, el cual contenía los componentes del reactivo ED en concentraciones conocidas. A continuación se liofilizaron 4 mi del reactivo ED en una botella de vidrio. Amortiguador de reconstitución de EA: se preparó un amortiguador de fosfato de potasio a una concentración de 0.05 M. Se adicionó cloruro de sodio hasta que la solución fue 1.0 M en cloruro de sodio, y se adicionó acetato de magnesio hasta que su concentración fue 0.078 M. A continuación se adicionó una pequeña cantidad de detergente de Tween 20 (véase la tabla 4 anterior). El Amortiguador de reconstitución ED se preparó de la misma manera, excepto que no se adicionó acetato de magnesio. La preparación del fragmento receptor de enzima EA y el conjugado polipeptídico donador de enzima ED por los métodos del ADN recombinante de acuerdo con la presente invención se describe completamente en la Patente norteamericana No. 4,708,929 (Henderson, concedida - en Noviembre 24, 1987), incorporada aquí como referencia.

Sustratos En la presente invención, la actividad enzimática se determina electroquímicamente utilizando un sustrato enzimático que se une covalentemente a una marca. Un ejemplo de tal sustrato marcado se muestra en la Figura 3. El sustrato marcado 16 (4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranósido) no es electroactivo hasta que la hidrólisis enzimática rompe la marca electroactiva 17 (4-(l,4,7,l0-tetraoxadecil ) -1-naftil ) del sustrato 18(ß-D-galactopiranósido) . La marca 17 (4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-1-naftol) se oxida a continuación en la superficie de un electrodo, dando como resultado una corriente que puede ser medida . La enzima ß-galactosidasa es especialmente adecuada para utilizarse con la presente invención. El uso de esta enzima da como resultado una señal de ruido más pequeña y por lo tanto mayor sensibilidad al analito, puesto que no existe actividad de ß-galactosidasa natural en la sangre humana. Ahora se describirán los sustratos de la ß-galactosidasa que pueden ser utilizados con la presente invención. (si- se utilizan otras enzimas diferentes a la ß-galactosidasa en la preparación del fragmento receptor de enzima EA y el conjugado polipeptídico donador de enzima ED, como se describió anteriormente, se vuelven necesarios otros sustratos). De acuerdo con la presente invención, el sustrato marcado deberá ser soluble en medio acuoso y es preferiblemente electroquímicamente inactivo cuando se explora en el intervalo de potencial de -0.6 V (volts) a +1.0 vs. Ag/AgCl. Cuando es escindida del sustrato, la marca deberá ser electroquímicamente activa en este mismo intervalo de potencial. Las preferencias para la marca escindida incluyen un potencial redox cercano a cero (0.0V<E°<0.5V vs. Ag/AgCl), reversibilidad electroquímica, y solubilidad acuosa. El sustrato utilizado en el Theophylline System Pack, CPRG, no es un sustrato marcado preferible para la presente invención debido a que la marca tiene un potencial de oxidación alto y es electroquímicamente irreversible. Las característicae electroquímicas de algunos sustratos marcados con ß-galactosidasa y sus marcas escindidas se proporcionan en la tabla 5.

Tabla 5 - Ejemplos de sustratos marcados con ß-galactosidasa y sus marcas escindidas Aunque es preferible que el sustrato marcado sea electroquímicamente inactivo y la marca escindida electroquímicamente activa, ambos pueden ser electroquímicamente activos de modo que eean activoe a potenciales de al menos 118 mV aparte. (Por ejemplo, el sustrato marcado 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido ee electroquímicamente activo a +0.05 V y +1.00 V, pero la marca escindida 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftol es únicamente electroactivo a +0.38 V) . Refiriéndose a la tabla 5, el sustrato marcado 4-( 1 , 4 , 7 , 10-tetraoxadecil ) -1-naftil-ß-D-galactopiranóeido es el sustrato marcado preferido para la presente invención debido a su solubilidad en agua, la cual facilita la formulación del reactivo. Los suetratos marcados p-aminofenil-ß-D-galactopiranósido y 4-metoxi-1-naftil-ß-D-galactopiranóeido también trabajan bien pero no se prefieren puesto que el 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido es menos soluble que el 4-(1,4, 7, 10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido y el p-aminofenil-ß-D-galactopiranóeido tiene una cinética más lenta (es decir, que la marca libera máe lentamente bajo las condiciones de hidrólieie enzimática) que 4-(1,4,7, 10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido. El euetrato marcado reeorufin-ß-D-galactopiranóeido ee un ejemplo de un suetrato marcado con ß-galactosidasa que no trabaja con. la presente invención puesto que es electroquímicamente activo al potencial de medición antes y después del rompimiento o separación .

Preparación del sustrato Síntesis del 4-(l,4,7.10-tetraoxadecil)-l-naftol (descrita por Goeltner et al . , Liebigs Ann.Chem., 1991, 1085-1089): se adiciona 2.0 g (12.5mmol) de naftohidroquinona a 80 mi de trietilenglicol para producir 3.4 g (92%) de un aceite violáceo, el cual, después de la cromatografía en columna (acetato de etilo saturado con S02), endurece en agujas rosae con un punto de fueión de 70°C. El producto crudo, 4-(l,4,7,l0-tetraoxadecil-l-naftol, se une entonces a la ß-D-galactopiranosa para formar el euetrato marcado 4-( 1 ,4,7 , 10-tetraoxadecil )-1-naftil-ß-D-galactopiranósido como ee deecribe más adelante en la síntesis del 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido, excepto que ee utiliza 4-(1,4, 7,10-tetraoxadecil)-l-naftol en lugar de 4-metoxi-l-naftol. Síntesis del 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido (deecrita por Hermann et al .. Patente norteamericana No. 5,202,233, concedida en Abril 13, 1993, la cual se incorpora en la presente como referencia): Se disuelven 96.1 g de acetobromogalactosa ( l-bromo-2 ,3,4, 6-tetra-O-acetil-f-D-galactopiranosa-de Fluka) en 200 mi de acetona y se desoxigenan pasando por nitrógeno. La solución ee calienta hasta ebullición con agitación continua y a continuación se adiciona por goteo primero una solución de 14.3 g de hidróxido de potasio en 13 mi de agua y posteriormente una solución de 18.5 g de 4-metoxi-l-naftol en 200 mi de acetona, en cada caso dentro del curso de 10 minutos. Durante la adición, la mezcla de reacción deberá ebullir continuamente bajo reflujo. Posteriormente, se continúa agitando por 4 horas a la misma temperatura, a continuación se enfría, los insolubles se filtran y el filtrado ee evapora al alto vacío. El reeiduo del jarabe reetante se digiere tres veces con, en cada caso, 100 mi de agua y a continuación se utiliza como producto crudo, sin mayor purificación, en el siguiente paso de síntesis (más adelante). A una suspensión de 4-metoxi-l-naftil-2,3,4,6-tetra-0-acetil-ß-D-galactopiranósido en 150 mi de metanol anhidro se adicionan, con la exclusión de humedad y dentro del cureo de 1 hora, 25 mi de una eolución de metalonato de eodio 0.5 M de metanol anhidro de modo que el pH de la mezcla de reacción ee mantenga en aproximadamente 13. Deepués de concluir la reacción (verificando con CCF) el producto se aiela por cromatografía en columnae sobre gel de sílice. Los métodoe de eíntesis para el p-aminofenil-ß-D-galactopiranóeido y el p-nitrofenil-ß-D-galactopiranóeido eon públicamente conocidos. Loe otroe euetratos marcados comercialmente disponiblee que podrían eer utilizadoe de acuerdo con la preeente invención incluyen, pero no se limitan a, p-nitrofenil-ß-D-galactopiranóeido, rojo de clorofenol-ß-D-galactopiranóeido (CPRG), o-nitrofenil-ß-D-galactopiranóeido, umbeliferil-ß-D-galactopiranósido, o-metoxi-p-nitrofenil-ß-D-galactopiranóeido, 3 ,4-dinitrofenil-ß-D-galactopiranóeido, m-ciano-p-nitrofenil-ß-D-galactopiranóeido, 4-nitrosalicilaldehído-ß-D-galactopiranósido, y 4-metil-umbeliferil-ß-D-galactopiranóeido.

Celda Electroguímica La ejecución de un ensayo de acuerdo con la preeente invención utilizando los reactivos acuosos descritoe anteriormente implica hacer una medición electroquímica. Ahora se describirá un ejemplo de una celda electroquímica que puede ser utilizada para hacer tal medición electroquímica. Haciendo referencia ahora a las Figuras 4 y 5, la Celda Electroquímica (e-cell) 19 tiene un primer suetrato aielante 20, el cual ee de aproximadamente 360 micronee de eepeeor y eetá hecho de poliéster. También podrían utilizarse otros sustratoe y eepeeantee. Típicamente, loe pláeticos talee como loe polímeroe de vinilo y poliimidae proporcionan lae propiedadee eléctricas y eetructurales que son deseables. El electrodo de trabajo 22 y el electrodo contador 23 son cada uno de aproximadamente 0.1 micronee de eepeeor, hechoe de paladio, y ee fijan al primer eustrato aislante 20 mediante el uso de un adhesivo fundido en caliente (no se muestra). Además del paladio, pueden utilizarse otros materiales eléctricamente conductores para los electrodos 22 y 23, incluyendo el platino, oro, plata, carbón, titanio y cobre. Se prefieren los metalee noblee debido a que proporcionan una área superficial de electrodo más constante, reproducible. Se prefiere particularmente el paladio debido a que es uno de los metales nobles más difíciles de oxidar. No se prefiere la plata debido a que esta es máe rápidamente oxidada por el aire que loe otros metales nobles listadoe anteriormente. Loe electrodos 22 y 23 deberán estar suficientemente separados de modo que los eventos electroquímicos en un electrodo no interfieran con los eventos electroquímicos en el otro electrodo. Los electrodos 22 y 23 se depositan sobre un soporte o refuerzo de material aislante 24, una poliimida, para reducir la posibilidad de desgarre del electrodo antes de ser fijado al sustrato 20. El soporte o refuerzo 24 es de aproximadamente 25 micrones de espeeor. El electrodo y la combinación de poliimida eetá comercialmente disponible de Courtaulds Performance Filme en California. Loe electrodoe 22 y 23 ee extienden deede un extremo del euetrato 20 hacia el otro extremo en una configuración en paralelo. La dietancia entre loe electrodoe 22 y 23 ee de aproximadamente 1.2 mm (milímetros) . El eegundo euetrato aielante 21 se fija sobre la parte superior del primer sustrato aislante 20 y los electrodos 22 y 23 mediante el uso de adhesivo fundido en caliente (no ee mueetra). El euetrato 21 ee de aproximadamente 250 micronee de espesor, hecho de poliéster, e incluye una ventana de muestra 25 la cual expone euetancialmente áreas superficialee igualee de loe electrodoe 22 y 23. La ventana de mueetra 25 ee ds 4 mm por 6 mm y loe electrodoe 22 y 23 son cada uno de 1.5 mm de ancho. Por lo tanto, se expone una área superficial de aproximadamente 6 mm2 para cada uno de los dos electrodos. El sustrato 21 también tiene una porción de corte 26 en un extremo para permitir una conexión eléctrica entre loe electrodos y una fuente de energía (no ee muestra) y un dispositivo para medir corriente (no se muestra). Como se discutió anteriormente con el sustrato 20, pueden utilizarse otros suetratoe y espesantes por el sustrato 21. En la modalidad de celda electroquímica descrita anteriormente, que ee describe el uso de un electrodo de trabajo y un contador. Esta modalidad tiene la ventaja de eer fácil de fabricar. Aunque la modalidad deecrita únicamente tiene la forma reducida de la marca unida al sustrato, la forma oxidada de la marca (por ejemplo, 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftal) también deberá estar preferiblemente presente en el reactivo en una alta concentración (al menos dos veces la concentración de la cantidad de la forma reducida de la marca escindida (por ejemplo, 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftol) se espera sea producida por el ensayo) cuando se utiliza el diseño de electrodo de trabajo/contador descrito anteriormente. Puesto que se mide la oxidación de la marca, la oxidación y no la reducción deberá eer el evento limitante de corriente. Tener un exceeo de la forma reducida de la marca ayuda aeegurar que la reducción de la marca no eea limitante de la corriente. Son posibles otras dos configuraciones de electrodos. Por ejemplo, son posibles celdas electroquímicas de dos electrodoe que utilizan un electrodo de referencia (por ejemplo Ag/AgCl) en lugar de un electrodo contador o una celda electroquímica de tres electrodos que utiliza electrodos de trabajo, contador y de referencia. La modalidad preferida de las celdas electroquímicas de dos o tres electrodos de las que se hizo referencia podrían no necesitar la forma oxidada de la marca presente en el reactivo.

Ejemplo 1 - ensayo de teofilina utilizando reactivos acuosos Se efectuó un ensayo para la teofilina de acuerdo con la presente invención y utilizando los reactivoe hechos como se describió anteriormente como sigue. Se adicionaron 20 mi de amortiguador de reconetitución de EA al reactivo EA liofilizado y se adicionaron 16 mi del amortiguador de reconstitución de ED al reactivo de ED liofilizado. 293 µl (microlitro) del reactivo EA reconstituido se administraron e incubaron en un tubo. A continuación se adicionaron 23 µl de una muestra de suero al reactivo EA reconstituido y la solución se mezcló breve y suavemente. La mezcla de reactivo EA reconstituido/mezcla ee dejó incubar a una temperatura de 35-37°C por 4 minutoe y 36 eegundoe. A continuación se adicionaron 220 µl del reactivo ED reconstituido a la mezcla de reactivo EA reconstituido/muestra y la solución se mezcló breve y suavemente. La mezcla completa se dejó a continuación incubar a una temperatura de 35-37°C por 19 minutos y 16 segundoe . Deepuée de la incubación final, se aplicaron aproximadamente 20 µl de mezcla completa a la ventana de muestra de la celda electroquímica deecrita anteriormente. Loe electrodoe se conectaron eléctricamente a una fuente de energía y un dispositivo de medición de corriente. Se aplicó una diferencia de potencial de 450 mV (milivolts) entre los dos electrodoe. Lae diferenciae de potencial menoree de -450 mV pueden reeultar en corrientes limitadas ein difusión. Diferencias de potencial mayoree de 450 mV pueden dar como resultado la oxidación inneceearia de loe compueetoe que interfieren con la mueetra. La corriente generada ee midió por aproximadamente 5 eegundoe. La cantidad de corriente medida 3 segundos después de la aplicación de la diferencia de potencial fue comparada a continuación con una curva de calibración y se determinó la concentración de teofilina en la muestra de suero. Tiempos de lectura de corriente de menos de 3 segundos dan como resultado una medición menos precisa, mientrae que loe tiempos de lectura de corriente mayores de 3 segundos dan como resultado corrientes más pequeñas y eensibilidad inferior. La señal de ruido mínima se observó, debido a que no existe actividad de ß-galactosidaea en la sangre humana, los fragmentos de EA y ED sin combinar no son electroquímicamente activoe, y debido a que existen pocos compuestos electroquímicamente activoe endógenos en la sangre. Como resultado, la práctica de la presente invención da como resultado una seneibilidad del analito aumentada.

Ejemplo 2 - ensayo de teofilina utilizando un inmunodetector químico seco Además de utilizar los reactivos acuosoe de la celda electroquímica deecrita anteriormente, la preeente invención también podría eer practicada utilizando un inmunodetector químico eeco. Ahora ee describirán dos ejemploe de tal inmunodetector . Ahora ee hará referencia al inmunodetector 28 moetrado en las Figuras 6 y 7. El primer suetrato aislante 29, el electrodo de trabajo 31, el electrodo contador 32, y el material aislante 33 son todos similaree en compoeición y función al primer sustrato aislante 20, el electrodo de trabajo 22, el electrodo contador 23, y el material aislador 24 descritoe anteriormente en lae Figurae 4 y 5. (También eon poeiblee celdas electroquímicas de doe electrodoe y celdae electroquímicas de tres electrodos, que utilizan electrodos de trabajo y referencia, como ee describió anteriormente para la celda electroquímica 19). El inmunodetector 28 también tiene un segundo suetrato aislante 30, fijo sobre la parte superior del primer sustrato aislante 29 y los electrodos 31 y 32 mediante el uso de un adhesivo fundido en caliente (no se muestra). El suetrato 30 es de aproximadamente 250 micrones de espesor, hecho de poliéster, e incluye la ventana 35 que expone suetancialmente áreas superficiales iguales de los electrodos 31 y 32. El sustrato 30 también tiene una porción cortada 34 en un extremo para permitir una conexión eléctrica entre los electrodos y la fuente de energía (no se muestra) y un dispositivo de medición de corriente (no se muestra). " El inmunodetector 28 también tiene una malla de poliéster 36. La malla de poliéster 36 puede eer cualquier euetrato poroeo que tenga suficiente porosidad para permitir el paso de una mueetra de eangre completa. Los ejemplos de sustratos porosos que pueden ser utilizados incluyen mallas, películas, polímeros solubles, y membranas. La malla de poliéster 36 es impregnada con el reactivo ED (deecrito anteriormente) administrando aproximadamente 5 µl del reactivo ED directamente sobre la malla 36. La malla 36 es a continuación secada calentando a aproximadamente 50°C por aproximadamente 15 minutos. Después de que el reactivo ha sido secado, la malla 36 es fijada encima de la ventana 35 en el segundo sustrato aislante 30 como se muestra en la Figura 7.

Se administran aproximadamente 6 µl de reactivo EA 37 (descrito anteriormente) directamente sobre el segundo sustrato aislante 30 como se muestra en la Figura 7. Se coloca un tercer suetrato aislante 38 sobre el segundo sustrato aislante 30. El tercer sustrato aislante 38 es un sustrato aislante delgado que preferiblemente tiene material adhesivo sobre cada lado para mantenerse en su lugar. El tercer eustrato aislante 38 incluye una porción cortada 41. El cuarto sustrato aislante 39 (no se muestra en la Figura 6) se coloca sobre el tercer euetrato aislante 38, de modo que se forma un espacio capilar dentro de la porción cortada 41 -del tercer suetrato aislante 38 que permite el flujo capilar del reactivo EA 37 hacia la malla de poliéster 36 (la cual está impregnada con el reactivo ED) . El cuarto sustrato aislante 39 es de aproximadamente 250 micrones de espeeor, hecho de poliéeter, e incluye la ventana de muestra 40 (no se muestra en la Figura 6) que expone el reactivo EA 37, y un orificio de ventilación 42 (no se muestra en la Figura 6). El inmunodetector 28 puede ser utilizado para determinar la concentración de un analito en una muestra de sangre completa por el siguiente método. La muestra de sangre completa 43 (aproximadamente 20 µl) se aplica a la ventana de muestra 40 del inmunodetector 28. Se forma una mezcla de reactivo EA 37 y una muestra de sangre 43 la cual es extraída hacia la malla de poliéster 36 por la acción capilar provocada por la porción cortada 41 y el orificio de ventilación 42. El reactivo ED, impregnado en la malla 36, se vuelve entonces parte de la mezcla. La mezcla del reactivo EA 37, el reactivo ED, y la muestra de sangre 42 sedimentan a continuación sobre los electrodos 31 y 32 a través de la ventana 35 del segundo sustrato aislante 30. Después de un periodo de incubación de aproximadamente 20 minutos, se aplica una diferencia de potencial de 450 mV entre los electrodos 31 y 32 (eléctricamente conectados a una fuente de energía y un dispoeitivo de medición de corriente). La corriente generada ee mide por aproximadamente 5 segundos. La cantidad- de corriente medida 3 segundoe deepués de la aplicación de la diferencia de potencial se compara a continuación con una curva de calibración y se determina la concentración de analito en la muestra de sangre completa.

Ejemplo 3 - ensayo de teofilina utilizando un inmunodetector químico seco Ahora se describirá otro ejemplo de un inmunodetector químico seco que puede ser utilizado para practicar la presente invención. El inmunodetector 44 mostrado en las primeras 8 y 9 incluye el primer suetrato aielante 45, el electrodo de trabajo 47, el electrodo contador 48, el material aislante 49, el segundo sustrato aislante 46, la porción cortada 50, y la ventana 51, loe cualee eon similares en composición y función con el primer sustrato aislante 29, electrodo de trabajo 31, electrodo contador 32, material aislante 33, segundo sustrato aislante 30, porción cortada 34, y ventana 35 descritos anteriormente descritos anteriormente en las Figuras 6 y 7. (También son poeiblee una celda electroquímica de doe electrodoe, que utiliza electrodoe de trabajo y de referencia, y una celda electroquímica de tree electrodos, como se deecribió anteriormente para la celda electroquímica 19 y el inmunodetector 28). Se adminietran aproximadamente 5 µl de reactivo ED 52 y 6 µl de reactivo EA 53 directamente eobre el eegundo sustrato aislante 46 como se muestra en las Figuras 8 y 9. El reactivo ED 52 y el reactivo EA 53 se hacen como se describió anteriormente, se administran sobre el segundo suetrato aielante 46, a continuación ee secan calentando a aproximadamente 50°C por aproximadamente 15 minutos. El segundo sustrato aislante 46 también tiene polímero 54, colocado entre el reactivo ED 52 y el reactivo EA 53. El polímero 54 puede ser cualquier polímero hidrosoluble, tal como polivinilpirrolidina, polivinilpirrolidona, o polivinilimidazol y preferiblemente deberá ser no electroactivo y no reactivo. El tercer suetrato aislante 55 se coloca sobre el segundo sustrato aislante 46. El tercer sustrato aislante 55 es un sustrato aislante delgado que preferiblemente tiene material adhesivo sobre cada lado para mantenerse en su lugar. El tercer sustrato aislante 55 incluye una porción cortada 58. El cuarto sustrato aislante 56 (no se muestra en la Figura 8) se coloca sobre el tercer sustrato aislante 55, de modo que se forma un espacio capilar dentro de la porción cortada 58 del tercer suetrato aislante 55 que permite el flujo capilar desde el reactivo EA 53 hacia el reactivo ED 52. El cuarto suetrato aielante 56 ee de aproximadamente 250 micronee de espesor, hecho de poliéster, e incluye una ventana de muestra 57 (no- se muestra en la Figura 8) que expone el reactivo EA 53, y un orificio de ventilación 59 (no se muestra en la Figura 8). El inmunodetector 44 puede ser utilizado para determinar la concentración de un analito en una muestra de sangre completa mediante el siguiente método. La muestra de sangre completa 60 (aproximadamente 20 µl) se aplica a una ventana de muestra 57 del inmunodetector 44. Se forma una mezcla del reactivo EA 53 y la muestra de sangre 60. El polímero 54 permite que la muestra de sangre completa 60 y el reactivo EA 53 se mezclen y reaccionen por un periodo de tiempo predeterminado, durante el cual el tiempo del polímero 54 se disuelve. Después de que el polímero 54 se ha disuelto, la eolución de la mueetra de eangre completa 60, reactivo EA 53 y polímero 54 fluye a continuación hacia el reactivo ED 52 para completar el mezclado de los componentes de la reacción del inmunoensayo. La mezcla de reactivo EA 53, reactivo ED 52, polímero 54, y muestra de sangre 60 es extraída a continuación por la acción capilar (causada por la porción cortada 58 y el orificio de ventilación 59) hacia la ventana 51 y sedimenta sobre los electrodos 47 y 48. Después de un periodo de incubación de aproximadamente 20 minutos se aplica una diferencia de potencial de 450 mV entre los electrodos 47 y 48 (eléctricamente conectados a una fuente de energía y un iispoeitivo de medición de corriente). La corriente generada se mide por aproximadamente 5 segundos. La cantidad- de corriente medida 3 segundos despuée de la aplicación de la diferencia de potencial se compara a continuación con una curva de calibración y se determina la concentración de analito en la muestra de sangre completa. El dispoeitivo de medición y la fuente de energía deecritoe anteriormente para utilizarse con la celda electroquímica 19 y el inmunodetector 28 y 44 normalmente se adaptarán para aplicar un algoritmo a la medición de corriente, por lo que el analito es proporcionado y presentado visualmente. Las mejoras en tal fuente de energía y dispositivo de medición son el objeto de la Patente norteamericana No. 4,963,814 concedida comúnmente "Regulated Bifurcated Power Supply" (Parks et al.. concedida en Octubre 16, 1990), la Patente norteamericana No. 4,999,632- "Analog to Digital Conversión with Noise Reduction" (Parks, concedida en Marzo 12, 1991), Patente norteamericana No. 4,999,582-"Biosensor Electrode Excitation Circuit" (Parks et al . , concedida en Marzo 12, 1991), y la Solicitud de Patente norteamericana No. de Serie 07/451,305- "Bioseneing Instru ent and Method" (White, presentada en Diciembre 15, 1989; notificación de concesión expedida por Oficina de Patentes de los Estados Unidos en Abril 19, 1993, pago de impuesto de expedición en Junio 16, 1993), las descripcionee de las cuales se incorporan aquí como referencia. La presente invención ha sido descrita en -las enseñanzas y dibujos anteriores con suficiente claridad y consistencia para permitir que un experto en la técnica haga uso de la invención, para que conozca el mejor modo de llevar a cabo la invención, y para distinguirla de otras invenciones y que son viejas. Muchas de las variaciones y adaptaciones obvias de la invención se vendrán fácilmente a la mente, y se pretende que esae eetén contenidae dentro del alcance de la invención como se reclama a continuación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetoe a que la miema ee refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en lae siguientes:

Claims (58)

REIVINDICACIONES

1. Un equipo de diagnóetico útil para el imnunoeneayo de un analito o euetancia que ee va a analizar en una mueetra de fluido, en donde el inmunoeneayo utiliza una medición electroquímica, el equipo está caracterizado porque comprende; (a) un reactivo donador de enzima, el cual incluye 1) un conjugado polipeptídico donador de enzima, y 2) un sustrato marcado, en donde la marca es 4-tetraoxadecil-l-naftol o 4-metoxi-l-naftol; y (b) un reactivo receptor de enzima, el cual incluye 1) un polipéptido receptor de enzima capaz de combinarse con el conjugado polipeptídico donador de enzima para formar un complejo enziraático activo capaz de catalizar la separación de la marca del sustrato del sustrato, y 2) un primer anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente, competitivamente al analito y al conjugado polipeptídico donador de enzima e impedir la formación del complejo enzimático activo cuando ee une al conjugado polipeptídico donador de enzima .

2. El equipo de diagnóetico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el reactivo donador de enzima y el reactivo receptor de enzima incluyen además un amortiguador que es sustancialraente no electroactivo al potencial utilizado para la medición electroquímica.

3. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el reactivo donador de enzima incluye además una cantidad de péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas suficientes para reducir la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la muestra de fluido.

4. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye ademáe un eegundo anticuerpo capaz de uniree inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo que impide, además, la formación de un complejo enzimático activo, cuando el primer anticuerpo ee une al conjugado polipeptídico donador de enzima .

5. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además una cantidad suficiente de analito para aeegurar que loe cambios en la concentración del analito en la muestra de fluido están sustancialmente relacionados de manera lineal con los cambioe en la corriente medida por la medición electroquímica.

6. El equipo de diagnóetico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el euetrato marcado ee 4-( 1 ,4 ,7 , 10-tetraoxadecil )-1-naftil-ß-D-galactopiranóeido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido .

7. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el sustrato marcado es 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D- galactopiranósido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido y el analito es teofilina.

8. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el sustrato marcado es 4-( 1 ,4 , 7 , 10-tetraoxadecil )-1-naftil-ß-D-galactopiranóeido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido, el analito ee teofilina, los péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínae eon albúmina de suero bovino, y el segundo anticuerpo es suero anti-ratón de cabra inactivada por calor.

9. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: (c) una celda electroquímica, la cual incluye 1) un primer euetrato aielante; 2) electrodoe de trabajo y contador fijoe al primer sustrato aislante; y 3) un segundo sustrato aislante, el cual recubre loe electrodoe de trabajo y contador, y tiene una porción cortada en un extremo para permitir el contacto entre loe electrodoe y un diepoeitivo de medición y una fuente de energía.

10. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los electrodos de trabajo y contador están comprendidos de paladio, platino, oro, plata, titanio, cobre o carbón.

11. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los electrodos de trabajo y contador están hechos del mismo material y son suetancialmente del mismo tamaño.

12. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el reactivo donador de enzima y el reactivo receptor de enzima incluyen además un amortiguador que es sustancialmente no electroactivo al potencial utilizado para la medición electroquímica.

13. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el reactivo donador de enzima incluye además una cantidad de péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas suficientes para reducir la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la muestra de fluido.

14. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además un segundo anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo que impide además la formación del complejo enzimático activo cuando el primer anticuerpo se une al conjugado polipeptídico donador de enzima .

15. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además una cantidad de analito suficiente para aeegurar los cambios en la concentración del analito en la muestra de fluido estén relacionados suetancialmente de forma lineal con los cambios en la corriente medida por la medición electroquímica.

16. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además: (d) la fuente de energía en conexión eléctrica con loe electrodoe de trabajo y contador y capaz de euminietrar una diferencia de potencial eléctrico entre los electrodoe de trabajo y contador euficiente para provocar la electrooxidación de la forma reducida de la marca en la superficie del electrodo de trabajo; y (e) el diepositivo de medición en conexión eléctrica con los electrodoe de trabajo y contador, y capaz de medir la corriente producida por la oxidación de la forma reducida de la marca en la euperficie del electrodo de trabajo.

17. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el eustrato marcado es 4-( 1 , 4, 7 , 1O-tetraoxadecil )-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido y el analito o sustancia que se va a analizar es teofilina..

18. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sustrato marcado es 4-( 1 ,4 , 7 , 1O-tetraoxadecil )-l-naftil-ß-D-galactopiranóeido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido, el analito es teofilina, los péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas son albúmina de suero bovino fragmentada, y el segundo anticuerpo es suero anti-ratón de cabra inactivado por calor.

19. Un método de inmunoensayo para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido, en donde el inmunoensayo utiliza una medición electroquímica, el método está caracterizado porque comprende: (a) preparar una mezcla que incluye 1) la mueetra de fluido, 2) un polipéptido receptor de enzima, 3) un sustrato marcado, en donde la marca es 4-tetraoxadecil-l-naftol o 4-metoxi-l- naftol , 4) un conjugado polipeptídico donador de enzima capaz de combinarse con el polipéptido receptor de enzima para formar un complejo enzimático activo capaz de catalizar la separación de la marca del suetrato, la marca ee electroactiva al potencial utilizado para la medición electroquímica cuando se separa del sustrato, y 5) un primer anticuerpo, capaz de unirse inmunológicamente, competitivamente al analito y el conjugado polipeptídico donador de enzima e impedir la formación del complejo enzimático activo cuando se une al conjugado polipeptídico donador de enzima; (b) aplicar la mezcla a una celda electroquímica que tiene electrodos de trabajo y de referencia; (c) aplicar después de la incubación de la mezcla, una diferencia de potencial entre los electrodos de trabajo y de referencia suficiente para oxidar la marca que ha sido separada del sustrato, generando por lo tanto una corriente; y (d) medir la corriente y correlacionar la corriente con la concentración de analito.

20. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la mezcla incluye ademáe un amortiguador que es sustancialmente no electroactivo al potencial utilizado para la medición electroquímica.

21. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la mezcla incluye además una cantidad de péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas suficientee para reducir la hidrólieis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la mezcla.

22. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la mezcla incluye además un eegundo anticuerpo capaz de uniree inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo cual impide ademáe la formación de un complejo enzimático activo cuando el primer anticuerpo se une al conjugado polipeptídico donador de enzima.

23. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la mezcla incluye además una cantidad de analito suficiente para asegurar que los cambios en la concentración de analito en la muestra de fluido se relacione eustancialmente de manera lineal con los cambios en la corriente medida por la medición electroquímica.

24. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la celda electroquímica comprende: (a) un primer sustrato aislante; (b) electrodos de trabajo y de referencia fijos al primer sustrato aislante; y (c) un segundo sustrato aislante, el cual recubre los electrodos de trabajo y de referencia, que tiene una ventana para exponer una porción de los electrodos de trabajo y de referencia, y tiene una porción cortada en un extremo para permitir el contacto entre los electrodos y el dispositivo de medición de corriente y una fuente de energía.

25. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sustrato marcado es 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranósido o 4-metoxi-1-naftil-ß-D-galactopiranóeido.

26. El método de inmunoeneayo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el analito ee teofilina.

27. EL método de inmunoeneayo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas son albúmina de suero bovino fragmentada, y el segundo anticuerpo es suero anti-ratón de cabra inactivado por calor.

28. Un método de inmunoensayo para determinar la presencia de un analito en una muestra fluida, en donde el inmunoensayo utiliza una medición electroquímica, el método está caracterizado porque comprende: (a) preparar una mezcla que incluye 1) la muestra de fluido, 2) un polipéptido receptor de enzima, 3) un sustrato marcado, en donde la marca es 4-tetraoxadecil-l-naftol o 4-metoxi-l- naftol, 4) un conjugado polipeptídico donador de enzima, capaz de combinarse con el polipéptido receptor de enzima para formar un complejo enzimático activo capaz de catalizar la separación de la marca del suetrato, la marca es electroactiva al potencial utilizado para la medición electroquímica cuando se separa del sustrato, y 5) un primer anticuerpo, capaz de unirse inmunológicamente, competitivamente al analito y el conjugado polipeptídico donador de enzima e impedir la formación del complejo enzimático activo cuando se une al conjugado polipeptídico donador de enzima; (b) aplicar la mezcla a una celda electroquímica que tiene electrodoe de trabajo y contador; (c) aplicar una diferencia de potencial entre los electrodos de trabajo y contador suficiente para oxidar la marca que ha sido separada del suetrato, generando por lo tanto una corriente; y (d) medir la corriente y la correlación de la corriente con la preeencia del analito.

29. El método de inmunoeneayo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la mezcla incluye ademáe un amortiguador que ee euetancialmente no electroactivo al potencial utilizado para la medición electroquímica.

30. El método de inmunoeneayo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la mezcla incluye además una cantidad de péptidos adicionales, fragmentoe de proteína, o proteínae euficientee para reducir la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteaeae en la mezcla.

31. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la mezcla incluye además un segundo anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo que impide además la formación del complejo enzimático activo cuando el primer anticuerpo se une al conjugado polipeptídico donador de enzima.

32. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la celda electroquímica comprende: (a) un primer sustrato aislante; (b) electrodos de trabajo y contador fijos al primer sustrato aislante; y (c) un segundo suetrato aielante, el cual recubre loe electrodos de trabajo y contador, que tiene una ventana para exponer una porción de los electrodos de trabajo y contador, y que tiene una porción cortada en un extremo para permitir el contacto entre loe electrodos y un dispoeitivo de medición de corriente y una fuente de energía.

33. El método de inmunoeneayo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el sustrato marcado es 4-( 1 ,4 ,7 , 10-tetraoxadecil ) -l-naftil-ß-D-galactopiranósido o 4-metoxi-l-naftil-ß-D-galactopiranósido y el analito es teofilina.

34. El método de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque los péptidos adicionalee, los fragmentoe de proteína, o lae proteínas eon albúmina de euero bovino fragmentada, y el eegundo anticuerpo ee euero anti-ratón de cabra inactivado por calor.

35. Un inmunodetector útil para un inmunoeneayo electroquímico de un analito en una mueetra de fluido, caracterizado porque comprende: (a) un primer eustrato aislante; (b) electrodos de trabajo y contador fijos al primer sustrato aislante; (c) un segundo sustrato aislante, el cual recubre los electrodoe de trabajo y contador, que tiene una ventana para exponer áreae euperficialee sustancialmente iguales de los electrodos de trabajo y contador, y tiene una porción cortada en un extremo para permitir el contacto entre los electrodos y un dispoeitivo de medición y una fuente de energía; (d) un sustrato poroso, el cual es impregnado con un reactivo donador de enzima, que recubre la ventana, y se desplaza espacialmente desde los electrodos de trabajo y contador, el reactivo donador de enzima incluye 1) un conjugado polipeptídico donador de enzima, y 2) un eustrato marcado, la marca es sustancialmente no electroactiva al potencial utilizado para la medición electroquímica cuando se une - al suetrato, y ee electroactiva al potencial utilizado para la medición electroactiva cuando ee eepara del suetrato; (e) un reactivo receptor de enzima, el cual ee coloca eobre el segundo eustrato aielante, el reactivo receptor de enzima incluye 1) un polipéptido receptor de enzima capaz de combinaree con el conjugado polipeptídico donador de enzima para formar un complejo enzimático activo capaz de catalizar la separación de la marca del sustrato, y 2) un primer anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente, competitivamente al analito y al conjugado polipeptídico donador de enzima e impedir la formación del complejo enzimático activo cuando se une al conjugado polipeptídico donador de enzima; (f ) un tercer suetrato aielante, el cual recubre el segundo suetrato aielante y tiene una porción cortada para exponer el reactivo donador de enzima, el reactivo receptor de enzima, y la ventana en el eegundo eustrato aislante; y (g) un cuarto euetrato aislante, el cual recubre el tercer sustrato aislante de modo que ee forma un espacio capilar dentro de la porción cortada del tercer suetrato aielante, que tiene una ventana para exponer una porción del reactivo receptor de enzima, y tiene un orificio de ventilación.

36. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque loe electrodos de trabajo y contador están comprendidos de paladio, platino, oro, plata, titanio, cobre, o carbón.

37. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque los electrodos de trabajo y contador están hechos del mismo material y son sustancialmente del mismo tamaño.

38. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el sustrato poroso es una malla, una membrana, o una película porosa.

39. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el sustrato poroso es una malla de poliéster.

40. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende además: (h) la fuente de energía en comunicación eléctrica con los electrodos de trabajo y contador y que ee capaz de suministrar una diferencia de potencial eléctrico entre los electrodoe de trabajo y contador suficiente para provoca la electrooxidación de la forma reducida de la marca en la superficie del electrodo de trabajo; y (i) el dispositivo de medición en conexión eléctrica con los electrodos de trabajo y contador y que es capaz de medir la corriente producida por la oxidación de la forma reducida de la marca en la superficie del electrodo de trabajo.

41. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la marca es 4-tetraoxadecil-1-naftol o 4-metoxi-l-naftol.

42. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el suetrato marcado ee 4-( 1 , 4 , 7 , 1O-tetraoxadecil ) -l-naftil-ß-D-galactopiranósidoo 4-metoxi-1-naftil-ß-D-galactopiranósido.

43. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el analito es teofilina.

44. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el reactivo donador de enzima inlcuye además una cantidad de péptidos adicionales, fragmentos de proteína, o proteínas suficientes para reducir la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la muestra de fluido.

45. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además un segundo anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo que impide además la formación del complejo enzimático activo cuando el primer anticuerpo se une al conjugado polipeptídico donador de enzima .

46. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye ademáe una cantidad de analito euficiente para aeegurar que loe cambios en la concentración del analito en la muestra de fluido eetén eustancialmente relacionados de manera lineal con los cambios en la corriente medida por la medición electroquímica.

47. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el analito es teofilina, loe péptidoe adicionales, los fragmentos de proteína, o proteínas son albúmina de suero bovino fragmentada, y el segundo anticuerpo es suero anti-ratón de cabra inactivado por calor.

48. Un inmunodetector útil para el inmunoensayo electroquímico de un analito en una muestra de fluido, caracterizado porque comprende: (a) un primer sustrato aislante; (b) electrodos de trabajo y referencia fijos al primer sustrato aislante; (c) un segundo sustrato aislante, el cual recubre los electrodos de trabajo y de referencia, que tiene una ventana para exponer sustancialmente áreas superficialee iguales de los electrodos de trabajo y de referencia, y que tiene una porción cortada en un extremo para permitir el contacto entre los electrodos y el dispositivo de medición y una fuente de energía; (d) un reactivo donador de enzima, el cual se coloca sobre el segundo suetrato aielante, el reactivo donador de enzima incluye 1) un conjugado polipeptídico donador de enzima, y 2) un euetrato marcado, la marca ee eustancialmente no electroactiva al potencial utilizado para la medición electroactiva cuando está unida al euetrato, y es electroactiva al potencial utilizado para la medición electroquímica cuando se separa del sustrato; (e) un reactivo receptor de enzima, el cual se coloca sobre el segundo sustrato aislante, el reactivo receptor de enzima incluye 1) un polipéptido receptor de enzima capaz de combinarse con el conjugado polipeptídico donador de enzima para formar un complejo enzimático activo capaz de catalizar la eeparación de la marca del sustrato del suetrato, y 2) un primer anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente, competitivamente al analito y el conjugado polipeptídico donador de enzima e impedir la formación del complejo enzimático activo cuando se une al conjugado polipeptídico donador de enzima; (f) un polímero, el cual se coloca sobre el segundo sustrato aislante entre el reactivo receptor de enzima y el reactivo donador de enzima; (g) un tercer sustrato aislante, el cual recubre el segundo sustrato aislante y tiene una porción cortada para exponer el reactivo donador de enzima, el reactivo receptor de enzima, el polímero, y la ventana en el segundo sustrato aislante; y (h) un cuarto suetrato aielante, el cual recubre el tercer euetrato aislante de modo que se forma un espacio capilar dentro de la porción cortada del tercer euetrato aielante, que tienen una ventana para exponer una porción del reactivo receptor de enzima y tiene un orificio de ventilación.

49. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque loe electrodoe de trabajo y contador están comprendidos de paladio, platino, oro, plata, titanio, cobre, o carbón.

50. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el electrodo de referencia ee un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata .

51. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque comprende ademáe: (i) la fuente de energía en conexión eléctrica con los electrodos de trabajo y de referencia y que es capaz de euministrar una diferencia de potencial eléctrico entre los electrodos de trabajo y de referencia suficiente para provocar la electrooxidación de la forma reducida de la marca en la superficie del electrodo de trabajo; y (j) el dispoeitivo de medición en conexión eléctrica con los electrodos de trabajo y de referencia y que es capaz de medir la corriente producida por la oxidación de la forma reducida de la marca en la superficie del electrodo de trabajo.

52. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la marca es 4-tetraoxadecil-1-naftol o 4-metoxi-l-naftol.

53. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el suetrato marcado ee 4-(l,4,7,10-tetraoxadecil)-l-naftil-ß-D-galactopiranósido o 4- metoxi-1-naftil-ß-D-galactopiranóeido.

54. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el analito es teofilina.

55. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el reactivo donador de enzima inlcuye ademáe una cantidad de péptidoe adicionalee, fragmentoe de proteína, o proteínas suficiente para reducir la hidrólisis del conjugado polipeptídico donador de enzima de las proteasas en la muestra de fluido.

56. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además un segundo anticuerpo capaz de unirse inmunológicamente al primer anticuerpo, por lo cual impide además la formación del complejo enzimático activo cuando el primer anticuerpo ee une al conjugado polipeptídico donador de enzima .

57. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el reactivo receptor de enzima incluye además una cantidad de analito suficiente para asegurar que los cambios en la concentración del analito en la muestra de fluido esté sustancialmente relacionada de manera lineal con los cambios en la corriente medida por la medición electroquímica .

58. El inmunodetector de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el analito o sustancia que se va a analizar es teofilina, los péptidos adicionales, fragmentoe de proteína, o proteínae eon albúmina de euero bovino fragmentada, y el segundo anticuerpo es suero antiratón de cabra inactivado por calor. En testimonio de lo cual firmo la presente en esta Ciudad de México, D.F., el 26 de agosto de 199¿+ . Por: BQEHRINGER MANNHEIM CDPORATIDN