MXPA06012690A - Gm3 sintasa como un objetivo terapeutico en complicaciones microvasculares de diabetes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de un inhibidor de la expresion o actividad del gen GM3 sintasa para el tratamiento de complicaciones microvasculares de diabetes, y a un metodo para clasificar los compuestos utiles en el tratamiento y/o prevencion de estas complicaciones.

Description

permeabilidad capilar excesiva, o que conduce a edemas, microaneurismas, y hemorragias que amenazan la vista (Forrester y otros, 1997 ) . La nefropatía afecta del 50 al 60 % de los pacientes con un historial de 20 a 3 0 años de diabetes. Se considera como la principal causa de mortalidad en estos pacientes ( ro-lewski y otros, 1997 ) . Una de las características principales de la condición patológica es el aumento glomerular, el cual es una consecuencia de adelgazamiento de la membrana basal y la expansión del mesangio debido a la hipertrofia de las células mesangiales en crecimiento interrumpido y debido a la acumulación de proteínas de la matriz extracelular . Estos eventos combinados con deficiencias hemodinámicas , inducen la esclerosis glomerular, la filtración glomerular o un nivel modificado de filtración glomerular y microalbuminuria, lo que conduce a una insuficiencia renal severa (Wolf y otros, 2000 ) . El riesgo de un sujeto diabético que desarrolla nefropatía generalmente se evalúa a través del control de la microalbuminuria. Los medios preventivos o terapéuticos actualmente utilizados para . retrasar la aparición y/o avance de la nefropatía diabética incluyen el monitoreo de la glicemia, la administración de hipertensivos , especialmente inhibidores de enzima que convierten la angiotensina, la adopción de una dieta baja en proteínas o la administración de hipolipidémicos tales como estatinas (Rippin y otros, 2004 ) .

Dado su impacto en términos de salud pública y económica, la identificación de formas novedosas para prevenir y tratar las complicaciones microvasculares de diabetes constituye un reto terapéutico principal. Aunque las bases celulares y moleculares de la patogénesis de la retinopatía diabética y la nefropatía diabética no están completamente entendidas, la regulación de la proliferación de la célula y las interacciones de célula-célula y célula-matriz parece que juegan un papel importante. Se han propuesto un número de hipótesis bioquímicas para explicar los mecanismos involucrados en el desarrollo de complicaciones microvasculares de diabetes, especialmente la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE) (Singh y otros, 2001) . Los azúcares de reducción tales como glucosa no reaccionan de forma enzimática con los grupos amino de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos a través de una serie de reacciones que forman las bases Schiff y los productos Amadori, finalmente produciendo AGE. La glicación, la cual depende de la concentración de glucosa, está aumentada en la diabetes . Ocurre preferencialmente con proteínas longevas expuestas en la glucosa en la sangre, tales como las proteínas de la matriz extracelular o las proteínas en circulación, por lo tanto se modifica su estructura y su función. Además, AGE puede enlazar los receptores de membrana para inducir las respuestas celulares a través de la generación de tensión oxidativa (Lal y otros, 2002; Schmidt y otros, 1994), la activación del factor KB nuclear (Singh y otros, 2002; Schmidt y otros, 1994) y la expresión de diferentes genes tales como citosinas proinflamatorias o moléculas de adhesión (Hofmann y otros, 1999; Schmidt y otros, 1995) . Todas estas modificaciones tienen importantes efectos biológicos que pueden explicar muchos de los cambios observados en complicaciones microvasculares de diabetes, especialmente el aumento en la permeabilidad vascular, el aumento en la producción y rigidez de la matriz extracelular, y el cambio en las interacciones de célula-matriz y el crecimiento de célula (Stitt y otros, 2003). De hecho, muchos estudios in vivo e in vitro han sugerido que AGE está involucrado en el desarrollo de la retinopatía y nefropatía asociada con diabetes (Stitt y otros, 2003; Wautier y otros, 2001) . Las gangliosidas son glicoesfingolípidos que están concentrados en los microdominios de la membrana plásmica y caracterizados por la presencia de ácido siálico en su estructura. Las sialilaciones sucesivas de lactosilceramida producen monosialogangliosida (GM3), disialogangliosida (GD3) y trisialogangliosida (GT3). Estas gangliosidas después se en gangliosidas más complejas convierten a través de la acción secuencial de glicosil transieras y sialiltransferasas, formando las series a, b y c, respectivamente (Van Echten y otros, 1993) . Se sabe las gangliosidas juegan un papel importante en el reconocimiento de célula-célula y célula-matriz a través de la interacción con receptores de adhesión tales como integrinas o proteínas de matriz (colágeno y fibronectina) , o con otros glicoesfingolípidos . También, las gangliosidas particularmente aquellas de la serie a, han estado implicadas en la regulación de proliferación de célula a través de la modulación de la actividad de los diferentes factores de crecimiento (Hakomori y otros, 1990) . Se ha reportado que AGE induce modificaciones en el metabolismo de glicoesfingolípidos en pericitos y células endoteliales de microvasos retínales (Natalizio y otros, 2001) . Estos cambios están acompañados especialmente por el aumento en la activación de GM3 sintasa (A. Daleme-Natalizio, tesis doctoral del Institut National des Sciences Appliquées de Lyon, febrero 8 del 2002) . Los inventores habrán demostrado que las gangliosidas están involucradas en los efectos mediados por AGE que conducen a las condiciones patológicas DR. y DN. Los inventores de esta forma han demostrado que la inhibición a través de AGE de la proliferación de pericitos retínales y de células mesangiales renales, los dos tipos de células involucrados en retinopatía diabética y nefropatía diabética, respectivamente, está por lo menos parcialmente basada en el aumento de la actividad de GM3 sintasa y la acumulación de series a de gangliosidas . Además se ha observado un aumento en la actividad de GM3 sintasa en el modelo de ratones diabéticos a los cuales se les ha dado AGE. Estos resultados identifican GM3 sintasa y series a de gangliosidas como objetivos para tratar complicaciones microvasculares de diabetes. Breve Descripción de la Invención La expresión "complicación microvascular de diabetes" denota una complicación crónica de diabetes tipo I o de tipo II que está caracterizada por cambios funcionales y estructurales en los microvasos . Estas complicaciones principalmente incluyen retinopat a diabética, nefropatía diabética y neuropatía diabética. La neuropatía periférica afecta los nervios de las extremidades del cuerpo, la pérdida de la sensibilidad en los pies, siendo una de las formas más ampliamente difundidas. Las molestias y el dolor (parestesia e hiperestesia) también son síntomas muy comunes y debilitadores. Esta neuropatía puede causar úlceras en los pies y serios daños de tejido que pueden necesitar amputación. Dentro del marco de trabajo de la solicitud de la presente patente, la expresión " GM3 sintasa" denota la oc2 , 3 -sialiltransferasa lactosilceramida de enzima (EC 2 . 4 . 99 . 9 ) , que cataliza la transferencia de un residuo de ácido siálico de un donador de ácido siálico a un grupo 3-hidroxilo de un residuo de galactosa de un aceptor de ácido siálico. De preferencia, el donador de ácido siálico es ácido CMP-N-acetilneurámico y el aceptor de ácido siálico es el residuo de galactosa de un glicolípido tal como lactosilceramida (LacCer) . La reacción catalizada puede ser C P-N-acetilneuraminato + S-D-galactosil-1 , 4-S-D-glucosilceramida = Cmp + a-N-acetilneuramil-2 , 3-S-D-galactosil-l , 4-S-D-glucosilceramida . Preferiblemente, la GM3 sintasa de acuerdo con la invención es una GM3 sintasa de ser humano o una GM3 sintasa de un mamífero no ser humano tal como un roedor (por ejemplo, rata o ratón) , un felino, un canino, un primate (mono), etc. Por ejemplo, los genes que codifican para GM3 sintasa humana y de murino han sido respectivamente depositados en la base de datos de Genbank bajo los números de registro NM_003896 (SEC ID No: 1) y NM_011375 (SEC ID No: 3). Las secuencias de aminoácido correspondientes se describen en las secuencias SEC ID No: 2 y SEC ID No: 4, respectivamente. Dentro del marco de trabajo de la solicitud de la patente de la presente, un "inhibidor GM3 sintasa" denota un compuesto que: (i) inhibe la actividad y/o expresión de GM3 sintasa in vitro y/o in vivo; y/o (ii) bloquea la transferencia de un residuo de ácido siálico de un donador de ácido siálico a un grupo 3-hidroxilo de un residuo de galactosa de un aceptor de ácido siálico, especialmente para formar glangliosida GM3 ; y/o (iii) bloquea la síntesis intracelular de gangliosida GM3. La inhibición o bloqueo puede ser parcial o total. "Gangliosida" se entiende que significa un glicoesfingolípido que comprende uno o más residuos de ácido siálico. Más específicamente, "series a de gangliosidas" denotan galgliosidas que llevan solamente un residuo de ácido siálico en la galactosa de la lactosilceramida. Las series a de gangliosidas incluyen los compuestos GM3 (a-N-acetil-neuraminil-2 , 3-S-D-galactosil-l , 4-S-D-glucosilceramida) , GM2, GM1, GDla y GTla (comparar Figura 2) . Aplicación Terapéutica Los inventores han demostrado que los productos finales de glicación avanzada (AGE) involucrados en el desarrollo de complicaciones microvasculares de diabetes median sus efectos a través de un aumento en la actividad de la enzima GM3 sintasa. La invención por consiguiente propone un método para tratar una complicación microvascular de diabetes en donde un inhibidor de la expresión o actividad del de GM3 sintasa se administra al paciente. La invención además se refiere al uso de un inhibidor de la expresión o actividad del gen G 3 sintasa para la fabricación de un fármaco previsto para el tratamiento de una complicación microvascular de diabetes . Preferiblemente, la complicación microvascular de diabetes se selecciona del grupo que comprende retinopatía diabética, nefropatía diabética, y neuropatía diabética. Particularmente preferible, la complicación microvascular de diabetes es nefropatía diabética. Dentro del marco de trabajo de la invención, la expresión "tratamiento" denota el tratamiento preventivo o curativo de una enfermedad, es decir, la acción de revertir, retardar, o inhibir el avance, o prevenir el desarrollo, de una enfermedad o de uno o más síntomas unidos a esta enfermedad. La expresión "paciente" denota un mamífero humano o no humano tal como un ratón, rata, perro, gato, puerco o mono, que está afectado o propenso a ser afectado por una complicación microvascular de diabetes. Preferiblemente, un paciente en términos de la invención es un sujeto en el cual se ha detectado la diabetes . Preferiblemente, el inhibidor es un inhibidor específico de la expresión o actividad del gen GM3 sintasa, es decir, un inhibidor sustancialmente desprovisto de un efecto sobre los genes o proteínas diferentes de la GM3 sintasa. En una primera modalidad, el método o uso de acuerdo con la invención utiliza un inhibidor de la expresión del gen GM3 sintasa y/o proteína. Dicho inhibidor puede inhibir o reprimir la trascripción del gen y/o la traducción del mensajero de trascripción (AR m) . Aquellos con experiencia en la técnica son capaces de seleccionar la estrategia más adecuada para este propósito. Se puede utilizar una estrategia antisentido para inhibir la expresión de la GM3 sintasa. Este método puede utilizar por ejemplo ácido nucleico antisentido o ribozimas que bloquean la transfeccion de un ARNm específico, ya sea a través del enmascaramiento del ARNm con un ácido nucleico antisentido o a través de la división del ARNm con una ribozima. En el contexto de la presente invención, "antisentido" ampliamente incluye las interacciones ARN-ARN las interacciones ARN-ADN, ribozimas, ARNs de interferencia, aptameros, y la inhibición mediada por ARNseH. Una terapia antisentido generalmente utiliza un vector, tal como un vector viral, que lleva la secuencia antisentido, la inhibición después es generalmente estable ya que el vector se integrará en el genoma. Esto también es posible para utilizar oligonucleótidos antisentido, que causan una inhibición transitoria de la expresión. Una presentación general de la técnica antisentido se puede encontrar en "Antisense DNA y RNA" (Cold Spring Harbor Laboratory, D. Melton, ed. , 1988) . Preferiblemente, el inhibidor de la expresión del gen y/o proteína de G 3 sintasa es por consiguiente seleccionado del grupo que comprende ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, ARNs de interferencia y aptámeros . Un "ácido nucleico antisentido" o un "oligonucleótido antisentido" es una molécula de ácido nucleico de estructura de cadena individual que, cuando se hibridiza bajo condiciones citoplásmicas con una molécula de ADN o AR complementaria, inhibe la función de la última. Los ácidos nucleicos antisentido se pueden codificar a través de un gen recombinante para la expresión en una célula (comparar, por ejemplo, las patentes de E. U. A. Nos. 5814500 y 5811234), o se pueden preparar a través de síntesis (comparar, por ejemplo, la patente de E. U. A. No. 5780607) . Los ácidos nucleicos antisentido de la GM3 sintasa se pueden diseñar para hibridizarse específicamente con una secuencia homologa que codifica para una GM3 sintasa, por ejemplo para hibridizarse específicamente con la secuencia GM3 sintasa humana mostrada en SEC ID No : 1 o la secuencia G 3 sintasa de murino mostrada en SEC ID No : 3. Una "secuencia capaz de hibridizarse específicamente con una secuencia de ácido nucleico" denota una secuencia que se hibriza con una secuencia de ácido nucleico de referencia bajo condiciones altamente severas (Sambrook y otros, 1989) . Los parámetros que definen las condiciones severas dependen de la temperatura a la cual se separan el 50% las estructuras de cadena equiparadas (Tm) , y en la resistencia iónica. Para las secuencias que comprenden más de 30 bases, Tm se define a través de la siguiente ecuación Tm = 81.5 + 0.41 (%G+C) + 16.61og (concentración de catión) - 0.63 (% de formamida) (600/número de bases) (Sambrook y otros, 1989) . Para secuencias más cortas de 30 bases, Tm se define por la siguiente ecuación: Tm - 4(G+C) + 2 (A+T) . Bajo condiciones severas apropiadas en donde las secuencias no específicas no se hibridizan, la temperatura de hibridación puede preferiblemente ser de 5 a 10 aC por debajo de Tm y los reguladores de pH de hibridación utilizados son preferidamente soluciones de resistencia iónica alta, tales como una solución 6x SSC. Por ejemplo, las condiciones de hibridación altamente severas corresponde a una Tm y a condiciones iónicas tales como aquellas obtenidas con una solución que contiene 50% de formamida y 5x o 6x SCC (0.15 M NaCl, 0.015 M de citrato de sodio) . El ácido nucleico antisentido de acuerdo con la invención se puede utilizar como tal, por ejemplo, después de la inyección en un ser humano o animal, para inducir la protección o tratar una complicación microvascular de diabetes. En particular, se pueden inyectar en la forma de ADN desnudo, de acuerdo con la técnica descrita en la solicitud de patente internacional WO 90/11092. También se pueden administrar en la forma de un complejo con, por ejemplo, dextrana-DEAE (Pagano y otros, 1967) , proteínas nucleares (Kaneda y otros, 1989) o lípidos (Felgner y otros, 1987) , en la forma de liposomas (Fraley y otros, 1980) o a través de otros métodos similares.

Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico forman parte de un vector. El uso de un vector hace posible mejorar la administración del ácido nucleico a las células que se van a tratar, y también mejora la estabilidad de estas células, dando un efecto terapéutico prolongado. El término "vector" denota el vehículo a través del cual la secuencia de ADN o ARN puede ser introducida en una célula huésped para así transformar las células hospederas y obtener la expresión (es decir, la transcripción y traducción) de la secuencia que ha sido introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc. "Ribozimas" son moléculas de ARN que tienen la capacidad específica de dividir otras moléculas de ARN de estructura de cadena individual en una forma equitativamente análoga con las endonucleasas de restricción de ADN. Las ribozimas fueron descubiertas a través de la demostración de que ciertos ARNms tienen la capacidad de dividir sus propios intrones . A través de la modificación de la secuencia de nucleótido de estas ribozimas, es posible producir moléculas que reconocen secuencias de nucleótido específicas en moléculas de ARN y las dividen (Cech, 1989) . Debido a esta especificidad, solamente los ARNms que tienen una secuencia particular están inactivados . La inhibición reversible de la transfección de GM3 sintasa también se puede lograr utilizando ARNs de interferencia. La técnica de interferencia de ARN (RNAi ) previene la expresión de genes a través del uso de pequeñas moléculas de ARN tales como "ARNs de interferencia pequeña" (RNAsis) . Esta técnica se beneficia del hecho de que la interferencia de ARN es un mecanismo biológico natural de la extinción del gen en la mayor parte de las células de numerosos organismos vivientes, de plantas a insectos y hasta mamíferos (Sharp, 2001) . La interferencia de ARN previene la producción de una proteína funcional a partir de un gen a través de conducirlo a la descripción del ARNm intermediario (Bass, 2000; Sharp, 2001). Los ARNsis se pueden utilizar en forma desnuda o incorporarse en un vector. Preferiblemente, una ARN de interferencia que bloquea la trascripción de GM3 sintasa puede tener la secuencia GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt (SEC ID No: 5) . Los aptámeros también se pueden utilizar para inhibir la trascripción de la GM3 sintasa. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos que tienen la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moléculas objetivo con una alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar de una colección de secuencias aleatorias a través del método de clasificación denominado SELEX (Evolución Sistemática de Ligandos a través del Enriquecimiento Exponencial) como se describe en Tuerk y Gold (1990) . La colección de secuencias aleatorias se puede obtener a través de la síntesis de ADN por medio de química de combinación. En dicha colección, cada miembro es un oligómero lineal (opcionalmente modificado químicamente) correspondiente a una secuencia única. Las modificaciones, aplicaciones, y ventajas posibles de esta clase de moléculas han sido estudiadas por Jayasena (1999) . En otra modalidad, el método o uso de acuerdo con la invención involucra el uso de inhibidor de la actividad de la proteína GM3 siñtasa. Los inhibidores de la actividad de GM3 sintasa pueden fácilmente identificarse a través de métodos de clasificación, incluyendo pruebas celulares o bioquímicas in vitro, como se describe en la solicitud de patente de la presente. Un inhibidor puede ser de una naturaleza de péptido, un péptido mimético o un mímico no de péptido (Rubin-Carrez, 2000), tal como una molécula orgánica pequeña capaz de interferir con la actividad enzimática de la GM3 sintasa, por ejemplo a través del bloqueo o reducción de la transferencia de un grupo de ácido siálico a partir de un donador a un aceptor de ácido siálico, y/o a través del bloqueo o reducción de la síntesis de GM3. El inhibidor de GM3 sintasa también puede ser un anticuerpo, particularmente un inhibidor dirigido contra la G 3 sintasa mostrada en la secuencia SEC ID No: 2 o en la G 3 sintasa de murino mostrada en la secuencia SEC ID No: 4. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos de los mismos, o anticuerpos quiméricos, especialmente aquellos que están humanizados, o inmunoconjugados . Los anticuerpos policlonales se pueden obtener a través de procedimientos ordinarios a partir del suero de un animal inmunizado contra una proteína. Por ejemplo, el antígeno utilizado puede ser un complejo de péptido apropiado tal como un complejo de GM3 sintasa acoplado a través de un residuo reactivo a una proteína (tal como una hemocianina de limpeto de bocallave, KLH) u otro péptido. Los conejos se inmunizaron con un equivalente de 1 mg del antígeno de péptido de acuerdo con el procedimiento descrito por Benoit y otros (1982). Los animales se trataron a intervalos de cuatro semanas con inyecciones de 200 \ig de antígeno y se sangraron de 10 a 14 días después. Después de la tercera inyección, se examinó el antisuero con el fin de determinar su capacidad de enlazarse al yodo-antígeno de péptido radiomarcado, preparado a través del método T de cloramina, y después se purificó a través de cromatografía en una columna de intercambio de ión de celulosa de carboximetilo (CMC) . Las moléculas del anticuerpo después se recolectaron de los mamíferos y se aislaron a una concentración deseada a través de lo métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo a través del uso de DEAE Sephadex para obtener la fracción IgG. Para aumentar la especificidad del suero policlonal, los anticuerpos se pueden purificar a través de cromatografía de inmunoafinídad utilizando polipéptidos de inmunización en la fase sólida. El anticuerpo se pone en contacto con el polipéptido de inmunización en la fase sólida durante un tiempo suficiente para causar que el polipéptido experimente una reacción inmune con la molécula de anticuerpo con el fin de formar un complejo inmunologico en la fase sólida. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a través de la fusión del linfocito convencional y el método de cultivo de hibridoma descrito por Kóhler y Milstein (1975) . También son conocidos otros métodos para preparar anticuerpos monoclonales (Harlow y otros, 1988) . Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar a través de la inmunización de un mamífero (por ejemplo, un ratón, rata o conejo, o aún un ser humano, etc.) y utilizando la técnica de fusión de linfocito para producir hibridomas (Kóhler y Milstein, 1975) . Existen alternativas a esta técnica ordinaria. Es posible, por ejemplo, producir anticuerpos monoclonales a través de la expresión de un ácido nucleico clonado de un hibridoma. Los anticuerpos también se pueden introducir a través de la técnica de despliegue de fago a través de la introducción de ADNcs de anticuerpo en vectores , lo anterior típicamente siendo fagos filamentosos con colecciones de gen V en la superficie del fago (por ejemplo, fUSE5 para E. coli, Scott y Smith, 1990) . Los protocolos para construir estas colecciones de anticuerpo se describen en Marks y otros (1991) . Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, o los fragmentos Fab y F(ab')2. También pueden tomar la forma de inmunoconjugados o anticuerpos marcados. Los aptameros constituyen una clase de moléculas que representan una alternativa para los anticuerpos en términos de recordar reconocimiento molecular. Los inhibidores de la expresión o actividad de GM3 sintasa se pueden formular con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Como se describió anteriormente, estos inhibidores pueden ser un compuesto químicamente sintetizado, un ARN antisentido o de interferencia,¦ o un anticuerpo anti-GM3 ' sintasa . "Excipiente" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende como cualquier solvente, medio de dispersión, retardador de absorción, etc., que no produce una reacción secundaria, por ejemplo una reacción alérgica, en seres humanos o animales . La dosificación naturalmente depende de la sustancia activa en cuestión, el modo de administración, la indicación terapéutica y la edad y estado del paciente. La dosis de proteína o anticuerpo es preferiblemente de 0.1 a 250 mg/kg por día y particularmente preferible de 1 a 100 mg/kg por día.

Cuando las composiciones farmacéuticas comprenden ácidos nucleicos, las dosis de ácido nucleico (secuencia o vector) que se van a administrar también se adaptan en particular de acuerdo con el modo de administración, la condición patológica objetivo y la duración del tratamiento. En general, si se utilizan virus recombinantes , se formulan y administran a dosis de aproximadamente 104 a 1014 ufp/ml y preferiblemente de 106 a 1010 ufp/ml. El término "ufp" (unidad formadora de placa) corresponde a la ineficacia de una solución viral y se puede determinar a través de la infección de un cultivo de célula apropiado inhibiendo el número de placas de células infectadas, generalmente después de 48 horas. Las técnicas para determinar la dosificación ufp de una solución viral se describen ampliamente en la literatura. Si se contempla la administración parenteral, más particularmente a través de inyección, las composiciones de la invención comprenden el (los) principio (s) activo (s) que toman la forma de soluciones y suspensiones inyectables empacadas en ampollas o botellas para una perfusión lenta. La inyección se puede efectuar especialmente a través de la ruta subcutánea, intramuscular, o intravenosa. En el caso de administración oral, las composiciones de la invención toman la forma de cápsulas de gelatina, tabletas efervescentes, tabletas cubiertas o no cubiertas, almohadilla, grajeas, ampollas o soluciones que se pueden tomar oralmente, microgránulos o formas de liberación prolongada. Las formas para administración parenteral se obtienen en forma convencional a través del mezclado del (de los) principio (s) activo (s) con reguladores de pH, estabilizadores, conservadores, solubilizadores , agentes isotónicos y agentes de suspensión. Al utilizar las técnicas conocidas, estas mezclas subsecuentemente se esterilizan y después se empaquetan en la forma de inyecciones intravenosas. Los reguladores de pH utilizados por los expertos en la técnica pueden ser aquellos basados en sales de fosfato orgánicas . Ejemplos de agentes de suspensión incluyen metil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, acacia, y carboximetil celulosa de sodio. Además, los estabilizadores útiles de acuerdo con la invención son sulfito de sodio y metabisulfito de sodio, mientras los conservadores que pueden mencionarse son p-hidroxibenzoato de sodio, ácido sórbico, cresol, y clorocresol . Para preparar una solución o suspensión oral, los principios activos se disuelven o suspenden en un vehículo apropiado con un dispersante, un humectante, un agente de suspensión (por ejemplo polivinilpirrolidona) , un conservador (tal como metilparaben o propilparaben) , y un corrector de sabor o un colorante.

Para preparar microcápsulas , los principios activos se combinan con diluyentes apropiados, estabilizadores apropiados, agentes que promueven la liberación prolongada de las sustancias activas, o cualquier otro tipo de aditivo para formar un núcleo central, el cual después se cubre con un polímero apropiado (por ejemplo, resina soluble en agua o una resina insoluble al agua) . Se utilizarán las técnicas conocidas por los expertos en la técnica para este propósito. Las microcápsulas resultantes después opcionalmente se formulan en unidades de dosificación apropiadas. También se puede contemplar la administración a través de la ruta ocular. En ese caso la composición farmacéutica de la invención toma la forma de una composición oftálmica para administración local en el ojo, por ejemplo, una loción para ojos o crema oftálmica. Los inhibidores también se pueden formular como liposomas. Los liposomas se forman de fosfolípidos , los cuales se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman vesículas bicapa concéntricas multilaminares . Estas vesículas generalmente tienen un diámetro de 25 nm a 4 um y se pueden sonicar, dando como resultado la formación de vesículas unilaminares más pequeñas, con un diámetro de 200 a 500Á, conteniendo una solución acuosa en su núcleo. Los liposomas pueden ser particularmente ventajosos para la administración de un principio activo a una célula precisa u objetivo tisular. Esto se puede hacer a través del acoplamiento mecánico de los lípidos con moléculas objetivo, tales como péptidos objetivo (por ejemplo, hormona) , o anticuerpos . Método de Clasificación La invención además se refiere a un método in vi tro para clasificar o identificar compuestos útiles en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes, en donde se evalúa la capacidad de por lo menos un compuesto de prueba para inhibir la actividad del GM3 sintasa, una disminución en el nivel de actividad de esta enzima es indicativo de un compuesto útil en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes. Preferiblemente, la complicación microvascular de diabetes se selecciona del grupo que comprende retinopatía diabética, nefropatía diabética y neuropatía diabética. Aún más preferible, la complicación microvascular de diabetes es nefropatía diabética. El compuesto de prueba puede ser de cualquier tipo.

Puede ser un compuesto natural o sintético o una mezcla de dichos compuestos. También puede ser una sustancia estructuralmente definida o una sustancia de estructura desconocida, por ejemplo un extracto biológico. El nivel de la actividad de GM3 sintasa en la presencia del compuesto de prueba se puede comparar con el nivel de control de actividad en la ausencia del compuesto de prueba . En una primera modalidad, el método de clasificación comprende los pasos que consisten en poner en contacto al menos un compuesto de prueba con una célula que expresa GM3 sintasa, y determinar la capacidad de dicho compuesto para inhibir, es decir, bloquear o reducir, la síntesis intracelular de gangliosida GM3. Una disminución en el nivel de la síntesis de gangliosida GM3 en la célula, comparado con una célula no expuesta al compuesto de prueba, es indicativo de un compuesto útil en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes. La célula puede ser una célula que expresa GM3 sintasa endógenamente, por ejemplo un pericito retinal o una célula mesangial renal . La célula también puede ser una célula transfectada en forma transitoria o estable para expresar una GM3 sintasa, con la ayuda de vectores para expresar el producto del gen GM3 sintasa. Estas células se pueden obtener a través de la introducción, en células hospederas procarióticas o eucarióticas , una secuencia de nucleótido insertada en un vector que contiene una secuencia de codificación para GM3 sintasa, y después cultivar dichas células bajo condiciones que permiten la replicación y/o expresión de la secuencia de nucleótido transfectada.

El vector de ADN, por ejemplo un vector de plásmido, que contiene una secuencia que codifica una G 3 sintasa se puede introducir en una célula huésped a través de cualquier técnica conocida por un experto en la técnica. En particular, es posible introducir el vector de ADN en una forma desnuda, es decir, con la ayuda de cualquier clase de vehículo o sistema que podría facilitar la transfeccion del vector en las células (EP 465 529) . Otras técnicas disponibles son aquellas de microinyección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio o formulación con la ayuda de nanocápsulas o liposomas . Las nanopartículas de cianoacrilato de polialquilo biodegradables son particularmente ventajosas. En el caso de liposomas, el uso de lípidos catiónicos favorece la encapsulación de los ácidos nucleicos, que están negativamente cargados, y facilitan la fusión con las membranas de células negativamente cargadas . Alternativamente, el vector puede estar en la forma de un virus recombinante que comprende, insertada en su genoma, una secuencia de ácido nucleico que codifica una GM3 sintasa. El vector viral puede preferiblemente seleccionarse de un adenovirus, un retrovirus, particularmente un lentivirus, un virus asociado con adeno (VAA) , un virus de herpes, un citomegalovirus (CMV) , un virus de vacuna, etc. La implementación de estas técnicas de expresión recombinantes es bien conocida por los expertos en la técnica.

Ejemplos de células hospederas incluyen especialmente células de mamífero tales como las células CHO, COS-7, 293 y MDCK, células de insecto tales como las células SF9 , bacterias tales como E. coli y las cepas de levadura. El nivel de expresión se puede evaluar a través de la determinación del nivel de trascripción del gen o del nivel de traducción de la proteína codificada por el gen GM3 de sintasa, ya sea directamente o a través de, por ejemplo, un gen reportero . Las pruebas más comunes para la siguiente trascripción (es decir, la determinación del nivel de trascripción) del gen objetivo (en este caso el gen GM3 de sintasa) o el gen reportero se basan en la técnica northern blotting. Las pruebas después de la traducción (es decir, la determinación del nivel de traducción) de la proteína GM3 sintasa o de la proteína reportera se pueden basar especialmente en técnicas de inmunoensayo o pueden utilizar las técnicas fluorimétricas , luminiscentes, u otras técnicas para detectar las proteínas reportero (proteína fluorescente verde, GFP; luciferasa; acetiltransferasa de cloranfenicol , CAT; etc . ) . Las técnicas de inmunoensayo se pueden llevar a cabo de acuerdo con varios formatos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo a través de ELISA, radioinmunoensayo , inmunoensayos in si tu, western blotting, inmunofluorescencia, etc. Los anticuerpos de la prote na anti-GM3 de sintasa útiles para detectar la proteína GM3 sintasa se pueden producir como se describe a continuación. En otra modalidad, el método de clasificación comprende los pasos que consisten en poner por lo menos un compuesto de prueba en contacto con una G 3 sintasa natural, mutada, o recombinante o una GM3 sintasa de origen biológico y determinar la capacidad de dicho compuesto para inhibir, es decir, bloquear o reducir la transferencia del residuo de ácido siálico a partir de un donador de ácido siálico a partir de un donador de ácido siálico a un grupo 3-hidroxilo de un residuo de galactosa de un aceptor de ácido siálico; Una disminución en el nivel de la actividad de transferencia del ácido siálico en la presencia de dicho compuesto, comparado con el nivel de transferencia del ácido siálico en ausencia de dicho compuesto, es indicativo de un compuesto que inhibe la GM3 sintasa y es útil en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes. El nivel de la actividad de la GM3 sintasa ventajosamente se evalúa poniendo en contacto la GM3 sintasa con un donador de ácido siálico y un aceptor de ácido siálico y un aceptor de ácido siálico bajo condiciones apropiados que permiten la transferencia del ácido siálico del donador al aceptor. En general, "las condiciones apropiadas" denotan un medio de reacción en el cual puede ocurrir la reacción catalítica. El medio puede incluir, por ejemplo, reguladores de pH, agentes de oxidación y/o reducción y cofactores. El pH, la temperatura, y la concentración iónica del medio generalmente se ajustan. Preferiblemente, la actividad de la GM3 sintasa se evalúa en un medio regulado en su pH a un pH de entre 6 y 7 preferiblemente de entre 6.5 y 6.7, a una temperatura de entre 35 y 39SC y preferiblemente de 31-C. La reacción ventajosamente se lleva a cabo en un medio que contiene 10 mM de Mn2+, por ejemplo, 10 mM de MnCl2. Las pruebas de la actividad de l GM3 sintasa han sido descritas especialmente en la solicitud de la patente internacional WO 97/47749, en la patente de E. U. A. 6555371 o el artículo de Wakarchuk y otros, (1996) . Preferiblemente la actividad de la GM3 sintasa se evalúa a través de la cuantificación de la transferencia del ácido siálico de un donador de ácido siálico, tal como CMP-N-acetilneuraminato, a el grupo 3-hidroxilo de un residuo de galactosa de lactosilceramida (LacCer) para formar gangliosida GM3. Una disminución en la desaparición de CMP-N-acetilneuraminato y/o lactosilceramida y/o en la formación de GM3 es indicativo de un compuesto que inhibe la GM3 sintasa. Un método de acuerdo con la invención por consiguiente comprende determinar el nivel de transferencia de ácido siálico a partir de CMP-N-acetilneuraminato a lactosilceramida en la presencia o ausencia del compuesto de prueba.

Venta osamente, el donador y/o aceptor de ácido siálico se marcan en una forma detectable. La marcación se puede llevar a cabo a través de cualquier técnica apropiada bien conocida por un experto en la técnica. Esta puede ser por ejemplo, la técnica de marcación radioactiva, enzimática, luminiscente o fluorescente o una combinación de estas técnicas . Una prueba de clasificación preferida de acuerdo con la invención se describe en la Figura 7. En esta prueba, la GM 3 sintasa se pone en contacto con ácido [1 C] -CMP-siálico y con lactosilceramida acoplada a biotina. La tecnología SPA® (Amersham Biosciences) se basa en la emisión de partículas ß a través de la desintegración de ciertos elementos radioactivos . Si la molécula radioactiva está suficientemente cerca de una perla de cintilación, la desintegración radioactiva estimula al grupo de cintilantes en la perla, produciendo una emisión luminiscente. La señal se puede detectar a través del contador de cintilación y/o el formador de imágenes CCD. Por el otro lado, en el caso de una molécula radioactiva libre en una solución que contiene perlas SPA, es decir, una molécula radioactiva que no interactúa con las perlas SPA, la emisión ß asociada con la desintegración de la molécula radioactiva no tiene suficiente energía para alcanzar una perla SPA y no se genera ninguna emisión de luz. En el contexto de la prueba presente, la medición de la señal luminiscente por lo tanto refleja la cantidad de GM3 ya que, en el medio de reacción, solamente este compuesto está asociado con las perlas SPA a través del complejo biotina/estreptavidina y lleva un grupo de ácido siálico radioactivo. Los ejemplos y las figuras que siguen ilustran la invención sin implicar una limitación. Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1B muestran la inhibición de la proliferación de pericitos (BRP) y las células mesangiales renales (CMR) por medio de AGE. Las células se expusieron a 3 uM de BSA o AGE durante 4 días (CMR) o 7 días (BRP) . Las células después se tripsinisaron y se contaron utilizando un hemocitómetro, y se determinó la cantidad total de proteínas. Los resultados se muestran como porcentaje del control BSA y representan la media ± SEM de 6 (BRP) o 9 (CMR) de experimentos independientes, cada uno llevado a cabo por duplicado. *p < 0.05 contra el control BSA. La Figura 2 muestra la ruta de biosíntesis de gangliosida modificada sobre las bases del artículo de Echten y otros, (1993) . Solamente se detectaron las series a y b de gangliosidas en el BRP y CMR (gangliosidas circundantes) . Las Figuras 3A-3D ilustran una modulación del perfil de gangliosida en pericitos y células mensangiales . Los pericitos (Figl. 3A) o células mesangiales (Fig. 3B) se expusieron a 3 uM de BSA o AGE durante 4 o 7 días, respectivamente, y después se cosecharon. Las gangliosidas después se extrajeron, se purificaron, analizaron a través de HPTLC y se desarrollaron a través de tinción con resorcinol, como se describe en la sección "Materiales y métodos". Los resultados se expresaron como un porcentaje del control BSA y representan la media ± SEM de 6 (BRP) o 9 (CMR) experimentos independientes, cada uno llevado a cabo por duplicado. *p< 0.05 contra control BSA. Las gangliosidas (Fig. 3C) y (Fig. 3D) se marcaron metabólicamente con 1 uCi/ml de [1C]-galactosa, se extrajeron, se separaron a través de HPTLC y se analizaron a través de auto-radiografía. Los resultados se expresaron como porcentaje del control BSA y representan la media ± SEM de tres experimentos independientes . Las Figuras 4A-4B muestran el aumento en la actividad de GM3 sintasa en glomérulos aislados y células causadas por AGE. (Fig. 4A) Las células se trataron con 3 µ? de BSA o AGE durante 4 días (CMR) o 7 días (BRP) . La actividad de la GM3 sintasa se midió en los homogenatos de célula como se describe en la sección "Materiales y métodos" . La actividad de control fue de 2.7 y 5.1 pmoles/h/mg de proteínas en el BRP y CMR, respectivamente. Los resultados se expresaron como porcentaje de control BSA y representa la media +SEM de 4 o 5 experimentos independientes. (Fig. 4B) La actividad de GM3 sintasa se midió en homogenatos altamente purificados de glomérulo de ratones de control (db/m) y ratones db/db. La actividad de control fue de 4.7 pmoles/h/mg de proteínas. Los resultados se expresaron como porcentaje de control y representan la media ±SEM de 4-5 animales. *p<0.05 contra control BSA o ratones de control . Las Figuras 5A-5B ilustra la inhibición de la proliferación de célula causada por series a exógenas de gangliosidas . Los pericitos (Fig. 5A) o células mesangiales (Fig. 5B) se trataron con los complejos de gangliosida-BSA durante 4 o 7 días, respectivamente. Al final del tratamiento, se midió el total de proteínas. Los resultados se expresaron como porcentaje de control BSA y representan la media ± SEM de 5-6 experimentos independientes, cada uno llevado a cabo por triplicado. *p<0.05 contra control BSA. Las Figuras 6A-6B muestran que las antiseries a de gangliosida de anticuerpos GM2 y GMl protegen contra los efectos de AGE. Los pericitos (Fig. 6A) o células mesangiales (Fig. 6B) se trataron con 3 uM de BSA o AGE en la presencia o ausencia de 5 ig por cavidad de anticuerpos policlonales anti-GM2 o anti-GMl. Al final del tratamiento, las células se lavaron y se lisaron y se midió la cantidad total de proteína. Los resultados se expresaron con un porcentaje de control BSA y representan la media ±SEM de 5-6 experimentos independientes, cada uno llevado a cabo por triplicado. *p<0.05 contra las células tratadas con AGE. La Figura 7 ilustra la detección de la actividad de GM3 sintasa a través de una prueba que combina la detección del producto de reacción, la gangliosida GM3 y a través de cintigrafía y luminiscencia. La G 3 sintasa cataliza la transferencia del ácido siálico marcado de ácido [1C]-CMP-siálico a lactosilceramida acoplada a biotina (Biotin-LacCer) . Las perlas SPA (Ensayo de Proximidad de Cintilación, Amersham Biosciences) acoplada a estreptavidina después se ponen en contacto con la gangliosida GM3 resultante acoplada a biotina y marcada con 1C . Después se mide la señal SPA resultante de la interacción entre la radioactividad GM3 y las perlas SPA . La Figura 8 muestra que la transfeccion con ARNsi de GM3 sintasa protege CMR. Después de 24 horas de la transfeccion de CMR con 400 nM de ARNsi de GM3 sintasa, las células se trataron con 3 uM de control BSA o AGE. Al final del tratamiento, se midió el total de las proteínas. Los resultados se expresaron como porcentaje del control BSA y representan la media ± SEM de 6 experimentos independientes . *p<0.05, contra las células tratadas con AGE. Las Figuras 9A-9C ilustran que las actividades de GM3 y GD3 sintasa y los niveles GM3 se regulan en la corteza renal de ratones diabéticos. La actividad de GM3 sintasa (Fig. 9A) y la actividad de GD3 sintasa (Fig. 9B) se midió en homogenatos de la corteza renal de los ratones de control (db/m) y ratones diabéticos (db/db) . Se muestran los niveles de GM3 (Fig. 9C) en ratones de control (db/m) y ratones diabéticos (db/db) . En los ratones de control, los niveles GM3 fueron de 66 ± 9 ng/ml de proteínas. Los resultados se expresaron como un porcentaje del control BSA y representan la media ± SEM de 4-6 animales. *p<0.05 contra las células tratadas con AGE . ' DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos Aislamiento y Cultivo de Célula Se aislaron pericitos retínales de bovino (BRP) de microvasos retínales de bovino como se describió previamente (Lecomte y otros, 1996) . Brevemente, las retinas se obtuvieron a través de la disección bajo condiciones estériles de ojos de bovino enucleados obtenidos de un matadero local . Después de que se hubieron removido las células epiteliales pigmentadas contaminadas de la retina, las retinas (2 por plato de cultivo) se cortaron en piezas pequeñas y se homogenizaron en un homogenizador Dounce en una solución salina balanceada Hanks (Ca2+/Mg2+-HBSS oxigenado libre suplementado con Hepes 10 mM, pH 7.4, antibióticos 1%, albúmina de suero de bovino (BSA, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) 0.5%)) . Los homogenatos se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos a 4SC y los residuos se volvieron a suspender en una solución enzimática conteniendo colagenasa/dispasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) (1 mg/ml en Ca2+/Mg2+-HBSS oxigenado libre, Hepes 10 mM, pH 7.4, antibióticos al 1%, DNase 20 U/ml y ?a-tosillisina clorometil cetona (TLCK) 150 ng/ml, Sigma) . Después de la digestión (20 minutos a 37 eC) , los fragmentos de microvasos se colocaron en un filtro de nylon de 40 um y se depositaron en platos de 6 cm cubiertos con fibronectina . Los cultivos primarios se cultivaron en un DMEM (Dulbecco modificado con medio Eagle) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (Gibco, Invitrogen Corporation, N. Y., Estados Unidos) , 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), y el medio se reemplazó cada 2 días. Después del período de adhesión, ocurrió una excrescencia de pericitos de los microvasos después de 48 horas y las células alcanzaron una confluencia en alrededor de 10 días. Los cultivos BRP fueron 100% puros, según caracterizados a través de morfología irregular poligonal con el uso de seudópodos y su crecimiento en células no yuxtapuestas, y según evaluado por marcación positiva tanto para (Xi-actina y un antígeno de glicolípido específico (anticuerpo 3G5) y a través de marcación negativa para el factor von illebrand expresado en las células endoteliales (Lecomte y otros, 1996) . Las células se hicieron pasar con tripsina-EDTA (Sigma) (1:3) y el cultivo continuó con el mismo medio hasta el segundo paso, durante el cual se trató el BRP. Las células mesangiales renales de rata (CMR) , se obtuvieron de glomérulos purificados de ratas istar macho jóvenes (Charles River, I'Arbresie, Francia). Brevemente, los fragmentos de la corteza se aislaron de ríñones de rata recientemente removidos bajo condiciones estériles. Las pequeñas piezas se forzaron mecánicamente a través de una malla de 230 um con regulador de pH HBSS. El glomérulo se hizo pasar a través de esta malla, después se forzó a través de una malla de 73 . 7 'um. Finalmente, se colocaron sobre una malla de 70 um y se colocaron en platos de 6 cm cubiertos con fibronectina ( 4 platos para 2 glomérulos renales) en DMEM suplementado con 20% de suero de bovino fetal, 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina. Después del periodo de enlace, la excrescencia de CMR a partir del glomérulo ocurrió después de 3 semanas y las células después se cultivaron para un quinto paso con el fin de remover las células epiteliales y endoteliales residuales. Las CMR se caracterizaron a través del criterio morfológico (forma de estrella, forma de mecha cuando estuvieron confluentes) y a través de la marcación positiva con vimentina, cc-actina del músculo liso y el antígeno Thy-1. Las células después se cultivaron en DMEM suplementado con 15% de suero de becerro fetal, 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina. Estas se utilizaron entre el quinto y quinceavo paso. Aislamiento del glomérulo de ratón Se obtuvieron glomérulos altamente purificados de ratones de 11 semanas de edad diabéticos (db/db) o de control (db/m) (Charles River) a través de la técnica de perfusión de perlas magnéticas, como se describe por Takemoto y otros (Takemoto y otros, 2002 ) . Brevemente, los ratones se inundaron a través del corazón con una solución de Dynabeads (Dynal, Compiégne, Francia) y los ríñones después se removieron, finalmente se dividieron finamente y se digirieron con colagenasa (Roche Diagnostics) . Después de la filtración, el glomérulo que había acumulado las perlas en sus capilares se retuvieron a través de magnetismo y después se lavaron dos veces antes de la homogenización. Esta técnica provee preparaciones puras de glomérulos con un bajo grado de contaminación de tejido. Aislamiento de cortezas renales de ratón Los fragmentos de corteza renal se aislaron de ríñones de ratones de 11 semanas de edad diabéticos (db/db) o de control (db/m) (Charles River) . Brevemente, los animales se anestesiaron y se sacrificaron y se removieron los ríñones. Los fragmentos de la corteza renal después se obtuvieron a través de la disección y se homogeneizaron mecánicamente con un homogenizador Dounce en un regulador de pH Hepes en 25 mM conteniendo 1 mM de EDTA y 10 µ?/ml de inhibidores de proteasa . Preparación de AGE El AGE se preparó a través de la incubación de albúmina de suero de bovino (concentración final de 7 . 2 mg/ml) (Sigma) con 100 mM de metilglioxal (Sigma) a 372C durante 50 horas. La albúmina de suero de bovino (BSA) se incubó bajo las mismas condiciones en ausencia de metilglioxal y se utilizó como una preparación de control (control BSA) . El control AGE y BSA se purificó con columnas G25 de PD10 Sephadex (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para remover las sales y los carbonilos no reaccionados, y después se esterilizó a través de la filtración y se mantuvo a -20aC hasta uso. Tratamiento con AGE El control AGE y el BSA (concentración final de 3 uM) se agregó a un medio de cultivo 24 horas después de la inoculación. Cada tipo se célula se trató para un paso (alrededor de 7 días para BRP y 4 días para CMR) . El medio de cultivo se reemplazó con un medio fresco cada 2 días. Medición del crecimiento de célula Al final del tratamiento, las células se cosecharon con tripsina y los residuos de célula se lavaron dos veces con una solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS congelado) (Sigma) . Para cada muestra, se contó una alícuota de células utilizando un hemocitómetro con el fin de determinar el número de células. Se utilizó otra alícuota para medir las proteínas a través de la técnica Bradford. Análisis de Gangliosidas Para la marcación metabólica de las gangliosidas, se agregaron 2 uCi/ml o 1 uCi/ml de [14C (U) ] -D-galactosa (329.5 mCi/mmoles) ( PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) al medio de cultivo durante la noche para los experimentos de marcación con una actividad específica alta (experimento de medición de GM2 y GM1) . Las células (5-8 x 105 pericitos o 12-20 x 105 células mesangiales) después se cosecharon a través de tripsinación y se lavaron tres veces en PBS. Las gangliosidas se extrajeron de los residuos de célula a través del método descrito por Bouchon y otros (Bouchon y otros, 1990) , modificado por Natalizio y otros, (Natalizio y otros, 2002) . Brevemente, los residuos de célula se dispersaron en 2 mi de cloroformo (C)/metanol (M) (1:1, v/v) , mezclado vigorosamente y se extrajo durante la noche a 4aC. Después de la centrifugación, los residuos se extrajeron dos veces con 2 mi del mismo solvente. Los extractos combinados de los lípidos totales se secaron a través de evaporación y se separaron con la ayuda de una solución de 1 mM de C/MPBS (10:10:7, v/v/v) . Las fases superiores, conteniendo las gangliosidas, después se desalaron en una columna de gel de sílice C18 (Waters Corporarion, Milford, MA) , y se analizaron a través de HPTLC (Merck, Damstadt, Alemania) . Las placas se desarrollaron en 0.2% de C/M/CaCl2 (55:45:10, v/v/v) . Las gangliosidas se visualizaron a través de auto-radiografía utilizando una pantalla de visualización de fósforo y una Store 820 (Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, Estados Unidos) y a través de la marcación con resorcinol (un tinte especifico para gangliosidas : resorcinol 0.3% (Sigma), CuS04 0.03%, HC1 30%) utilizando un Image Master VDS-CL (Amersham Pharmacia Biotech) . La cuantificación se llevó a cabo utilizando un Image Quant (Molecular Dynamics) . Cuando GTlb estuvo ausente de los perfiles de gangliosida tanto de BRP como de CMR, se agregó a las muestras como un estándar interno antes de la extracción de lipidos. Medición de la actividad de GM3 sintasa Al final del tratamiento, las células se lavaron con PBS, se incubaron durante 20 minutos a 42C en 50 µ? de regulador de pH lisis (20 mM de cacodilato de sodio, pH 6.6 (Sigma), 0.2% de Tritón X-100, 1 mM de EDTA, 10 µ?/m.l de inhibidores de proteasa, Calbiochem, La Jolla, California, Estados Unidos) y después se recolectaron a través de raspado. Se combinaron 4 platos de BRP (aproximadamente 2-3 x 106 células) y 3 platos de CMR (alrededor de 3-6 x 106 células) . Los lisatos de célula se centrifugaron a 10,000 g durante 5 minutos y las proteínas en los sobrenadantes se utilizaron para medir la actividad de GM3 sintasa. Los residuos glomerulares se homogenizaron mecánicamente con una jeringa en 25 mM de Hepes conteniendo 1 mM de EDTA y 10 µ?/ml de inhibidores de proteasa. Los homogenatos después se centrifugaron al 1000 g durante 2 minutos, y se utilizó el sobrenadante póstnuclear para mediar la actividad de GM3 sintasa. Se utilizaron cantidades equivalentes de proteína para cada muestra (alrededor de 500 ug para las células y 100 pg para los glomérulos) para llevar a cabo la prueba. Las muestras se mezclaron con un volumen igual de regulador de pH de reacción conteniendo concentraciones finales de 0.1 mM de lactosilceramida (Matreya, Biovalley, Mame la Vallée, Francia), 4 yCi ml de ácido [siálico-4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9-1C] -CMP-siálico (325.2 mCi/mmoles) (PerkinElmer Life Sciences), 100 uM de ácido CMP- siálico (Sigma) , 10 mM de MgCl2, 0.2% de Tritón X-100 y 100 M de cacodilato de sodio, pH 6.6. Después de la agitación, las mezclas de reacción se incubaron a 37 aC durante 50 minutos. Las reacciones se detuvieron cargando las muestras sobre columnas de gel de sílice 60 (Merck) para separar los sustratos en exceso de los productos. Después de que se hubieron lavado las columnas con agua, las gangliosidas se eluyeron con C/M (1:1, v/v) y el solvente se secó bajo nitrógeno. Finalmente, las gangliosidas se separaron a través de cromatografía de capa delgada (Merck) y los productos de reacción se desarrollaron a través de auto-radiografía. La activad de GM3 sintasa se expresó en pmoles de GM3 producido/h/mg de proteínas. Tratamiento con gangliosidas exógenos Para evaluar el efecto de las gangliosidas exógenas en la proliferación de BRP y CMR, las células se cultivaron en placas de 96 cavidades. Se agregaron los glicolípidos exógenos GM3 , GM2, GMl y GDla, glucosilceramida y lactosilceramida (Matreya) al medio de cultivo completo a una concentración final de 50 uM en la forma de complejos con BSA en una relación de 1:1 en DMEM/10 mM Hepes, pH 7.4. Al final del tratamiento, las células se lavaron 2 veces con PBS y se lisaron durante 30 minutos a 37 eC en 50 µ?, de un regulador de pH de lisis Ripa (PBS 10 mM, NP40 1% (Pierce, Perbio Science, Brebiéres, Francia), desoxicolato de sodio 0.5%, SDS 0.1%, inhibidores de proteasa 10 µ?/ml) . Según se correlacionó el número de células en nuestros experimentos con las concentraciones de proteína totales (comparado, Figura 1) , el total de proteínas se midió utilizando la prueba de proteínas BCA (Pierce) con el fin de evaluar la proliferación de célula. Tratamiento con anticuerpos de gangliosxda de las anti-series a Para bloquear los efectos potenciales de las series a de gangliosidas , las células se cultivaron de placas de 96 cavidades y se trataron con 3 uM de AGE o BSA de control en la presencia o ausencia de 50 ug/ml del anticuerpo policlonal anti-GM2 (Calbiochem) o anticuerpo policlonal GMl (Matreya) . Al final del tratamiento las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron en 50 µ? de regulador de pH de lisis Ripa y las proteínas se midieron con el fin cuantificar la proliferación de célula. Transfección de CMR con un ARNsi de GM3 sintasa Para bloquear la actividad de GM3 sintasa, se cultivaron CMR en placas de cultivo de 6 cavidades hasta con 30% de confluencia y después se transíectaron con un ARN de interferencia (ARNsi) específico para GM3 sintasa, en cual se designó contra la. secuencia de ADNc de ratas (Ambion, Huntingdon, U ) utilizando un reactivo de Oligofectamina (Invitrogen Corporation) . La secuencia antisentido GM3 sintasa utilizada fue GGGUUAUUCUGAACAUGUU11 (SEC ID No: 5) . En los experimentos preliminares, se llevó a cabo un estudio de dosis-respuesta a través de la transfección de células con concentraciones en aumento de ARNsi (0-800 nM) . Después de 72 horas de la transfección, la actividad de GM3 sintasa se midió en homogenatos de células transfectadas . La proliferación después se evaluó en células transfectadas con ARNsi. Para este propósito, 24 horas después de la transfección con 400 nM de ARNsi, las células se trataron con control 3 µ? de BSA o AGE (3 días) . Las células después se lavaron 2 veces con PBS y se lisaron en regulador de pH de lisis Ripa y las proteínas se midieron con el fin de evaluar la proliferación de células. Análisis estadístico Los datos se expresaron como medias ± SEM y se presentaron como un porcentaje de los controles. En los estudios de célula, se utilizó la prueba de categoría ilcoxon utilizada para evaluar el significado de la diferencia entre los grupos. Se utilizó la prueba t de Student para la actividad de la GM3 sintasa en los experimentos en ratones. p<0.05 se consideró como estadísticamente importante.

Ejemplo 2 Resultados 1 - AGE inhibe la proliferación de pericitos y células mesangiales Para comparar el efecto de AGE en la proliferación de pericitos y células mesangiales, las células se trataron con BSA o AGE a una concentración de 3 uM durante 4 a 7 días . Los conteos de célula mostraron que AGE redujo el número de pericitos y células mesangiales en 33 y 40%, respectivamente (Figura 1) . Las proteínas totales también se midieron y se encontró que habían disminuido en correlación con el número de células. Estos resultados demuestran que AGE tiene efectos adversos similares sobre la proliferación tanto de pericitos como células mesangiales y habilitó a los inventores para el elucidar los mecanismos comunes involucrados en la respuesta de AGE en ambos de estos tipos de célula. 2 - AGE aumenta la serie a de gangliosidas en pericitos y células mesangiales Los resultados previos de los inventores sugieren que AGE podrían modular el perfil de gangliósida en células microvasculares retínales (Natalizio y otros, 2001) . Los perfiles de gangliósida se analizaron en BRP y CMR en respuesta a control BSA o el AGE. El perfil de gangliósida es específico para el tipo de célula. Bajo condiciones de control, las gangliosidas principales en los pericitos fueron series a de gangliosidas GM3 (63% del total de gangliosidas detectados) y GMl (9%) y las series b de gangliosidas GD3 (28%) . El perfil en las células mesangiales difirió por una pequeña cantidad de GD3 (5%) y, en el caso de la serie a, por la presencia de GDla (20%) GM3 aún siendo el gangliosida principal (75%) . Se observó un aumento en la serie a de gangliosidas y una disminución en la serie b de gangliosidas en ambos tipos de células tratadas con AGE (Figura 3). En los pericitos, la serie a de gangliosidas GM3 y GMl se incrementó en aproximadamente 40%, mientras las series b de gangliosidas GD3 se redujo en 24% (Figura 3A) . En las células mesangiales, GM3 se incrementó en un 33%, mientras GD3 se redujo en un 30%; los niveles de GDla no se afectaron (Figura 3B) . Se obtuvieron resultados similares a través de la auto-radiografía después de la marcación con galactosa. Ya que las series a de gangliosidas GM2 en BRP y GM2 y GMl en CMR fueron difíciles de detectar a través de la marcación con resorcinol, las células se marcaron con [1C] -D-galactosa de alta actividad específica y las gangliosidas después se analizaron en células de control y en células tratadas con AGE. Los resultados demostraron que GM2 se incrementó en un 55% en BRP (Figura 3C) y que GM2 y GMl se incrementaron en un 25 a 35% en CMR (Figura 3D) . Estos resultados indicaron que AGE induce modificaciones similares a los perfiles de gangliosida tanto en pericitos como células mesangiales. Esto también sugiere que los aumentos en la serie a de gangliosidas puede ser un mecanismo común que fundamentalmente disminuye la proliferación de células. 3 - AGE aumenta la actividad de la GM3 sintasa en pericitos y células mesangiales En un intento de explicar el mecanismo responsable para el aumento observado en la serie a de gangliosidas, la actividad de la GM3 sintasa, la enzima limitante para la síntesis de la serie a de gangliosidas, se midió en células de control y células tratadas. Los resultados presentados en la Figura 4 muestran que el tratamiento con AGE incrementó la actividad de GM3 sintasa por un factor de aproximadamente 1.8 en los pericitos y de aproximadamente 1.5 en las células mesangiales, muy probablemente a través del aumento del grado máximo de la reacción enzimática. Estos resultados sugieren que AGE ejerce mecanismos comunes en CMR y BRP a través de la regulación de GM3 sintasa. 4 - Gangliosidas de serie a exógenas inhiben la proliferación de pericitos y células mesangiales Los inventores estudiaron si la adición exógena de gangliosidas de la serie a podrían afectar la proliferación de pericitos y células mesangiales. Las células se trataron para un paso (7 días para BRP y 4 días para CMR) con 50 uM de gangliosidas y, como control, con la glucosilceramida no sialilada y los precursores de lactosilceramida. La Figura 5 muestra que GM2 , GMl y GDla inhibieron la proliferación de pericitos y células mesangiales más efectivamente (aproximadamente de 15 a 30%) . GM3 débilmente inhibió la proliferación de los pericitos, pero no tuvo un efecto significante sobre las células mesangiales. La glucosilceramida y la lactosilceramida, utilizada como control, no tuvieron efecto. Estos resultados indican que las gangliosidas de la serie a inhiben la proliferación de pericitos y células mesangiales. En particular, GM2 y GMl se aumentaron en BRP y CMR en respuesta a AGE y degradaron la proliferación de ambos de estos tipos de células; estas gangliosidas de la serie a podrían por consiguiente ser los mediadores comunes del efecto AGE. 5 - Los anticuerpos de gangliosxda de anti-series a protegen los pericitos en la células mesangiales contra inhibición de la proliferación causada por AGE Para estudiar si GM2 y GMl median los efectos de AGE, las células se trataron con AGE en la presencia de anticuerpos anti-GMl y anti-GM2. En las células de control tratadas con BSA, la proliferación no difirió en la presencia o ausencia de los anticuerpos anti-gangliosida . El tratamiento de las células con AGE en la presencia de los anticuerpos anti-GM2 y anti-GMl parcialmente previnieron la disminución en la proliferación de pericitos y células mesangiales (Figura 6) . En vista de los efectos de las gangliosidas exógenas, estas observaciones sugieren que las gangliosidas de la serie a, particularmente GMl y GM2, son las mediadores comunes de la inhibición de la proliferación inducida por AGE en pericitos y células mesangiales. 6 - La actividad de GM3 sintasa se aumenta en glomérulos de ratón diabético Para evaluar el efecto de un entorno diabético sobre la actividad de GM3 sintasa in vivo, se midió la actividad enzimática en glomérulos altamente purificados de un modelo de ratones diabéticos db/db. Los resultados presentados en la Figura 4B muestran que la actividad de GM3 sintasa se aumentó en un 50% en los glomérulos de células diabéticas, comparados con los controles (db/m) . 7 - Un ARNsi de GM3 sintasa parcialmente da protección de los efectos inducidos por AGE Para aclarar con mayor detalle el papel de las gangliosidas de la serie a en la mediación de los efectos AGE, las CMR se transíectaron con ARNsi de GM3 sintasa. Los experimentos preeliminares mostraron que ARNsi efectivamente inhibe la actividad de GM3 sintasa en CMR. Después se midió la proliferación de las células transíectadas y de las células tratadas . Como se muestra en la Figura 8, los efectos de AGE en la proliferación de CMR se inhibieron parcialmente en las células transfectas con ARNsi de GM3 sintasa. Estos resultados claramente demuestran la intervención de las gangliosidas en la mediación de los efectos AGE. La naturaleza parcial de los efectos se puede explicar a través del hecho de: (i) los efectos AGE fueron menos potentes en los experimentos previos, dado que las células se trataron a un nivel más avanzado de confluencia para así incrementar la eficacia de la transfección, y (ii) la actividad de la GM3 sintasa se inhibió solamente en un 50%. 8 - Las actividades de GM3 y GD3 sintasa y los niveles de GM3 se modificaron en la corteza renal de ratones diabéticos Para evaluar ex vivo el efecto de un entorno diabético en la trayectoria de la biosíntesis de gangliosida, la actividad de GM3 y GD3 sintasa se midió en homogenatos de corteza renal en el modelo de ratón diabético db/db. Los resultados presentados en la Figura 9A-9B mostraron que la actividad de GM3 sintasa se aumentó en un 80%, mientras la actividad de GD3 sintasa se redujo , en un 50% en las cortezas renales de ratones diabéticos, comparados con los controles (db/m) . Las gangliosidas también se analizaron y mostraron un aumento, aunque no fue estadísticamente significativo, en los niveles GM3 en la corteza renal de ratones diabéticos db/db (Figura 9C) . En general, estos resultados por lo tanto demuestran el sentido fisiopatológico de los resultados obtenidos en CMR y BRP tratados con AGE. Referencias Bass, Cell, 2000,101, 235-238 Benoit y otros (1982) PNAS USA, 79,917-921 Bouchon y otros (1990) Biochim. Biophys . Acta, 1051, 1-5 Cech T.R. (1989) RNA as an enzyme. Biochem. Int., 18, 7-14 Felgner P. L., Ringold G. M. (1989) Cationic liposome-mediated transfection. Nature, 337,387-8 Fong y otros (2003) Diabetes Care, 26,226-229 Forrester y otros (1997) Pathogenesis of diabetic retinopathy and cataract. In Textbook of diabetes. Pickup J., Williams G.( Eds Oxford, 45.1-45.19 Fraley R. , Subramani S., Berg P., Papahadjopoulos D. (1980) Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J. Biol. Chem. , 255, 10431-5 Harlow E. y otros (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York Hakomori y otros (1990) J. Biol. Chem., 265, 18713- 18716 Hatanaka Y. y otros (1996) Synthesis and characterisation of a carbene-generating biotinylated lactosylceramide analog as a novel chromogenic photo-probe for GM3 synthase. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) , 44(5), 1111-4 Hofmann y otros (1999) Cell, 97,889-901 Inokuchi J. y otros (1998) A synthetic ceramide analog (L-PDMP) up-regulates neuronal function. Ann. NY Acad. Sci., 845, .219-24 Jayasena (1999) Aptamers : an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. , 45(9) , 1628-50 Kaneda Y. , lwai K . , Uchida . (1989) Increased expression of DNA co-introduced with nuclear protein in adult rat liver. Science, 243, 375-8 Krolewski y otros (1997) Clinical features and epidemiology of diabetic nephropathy. In Textbook of diabetes, Pickup J., Williams G., Eds Oxford, 53.1-53.13 Kóhler and Milstein (1975) Nature, 256, 495-497 Lal y otros (2002) Kidney Int., 61, 2006-2014 Lecomte y otros (1996) J. Neurochem. , 66, 2160-2167 Marks y otros (1991) J. Mol. Biol . , 222, 581-597 Natalizio y otros (2001) Biochem. Biophys . Res. Commun., 281, 78-83 Pagano J. S., McCutchan J. H. , Vaheri A. (1967) Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J. Virol., 1, 891-7 Rippin J.D., Barnett A.H., Bain S. C. (2004) Cost-effective strategies in the prevention of diabetic nephropathy. Pharmacoeconomics , 22(1) , 9-28 Rubin-Carrez C. (2000) . Les mimes peptidiques (Peptide mimics) . Le technoscope, Biofutur, vol . 199 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Schmidt y otros (1994) Arterioscler . Thromb. , 14, 1521- 1528 Schmidt y otros (1995) J. Clin. Invest., 96,1395-1403 Sharp, Genes Dev. , 2001, 15, 485, 49 Singh y otros (2001) Diabetologia, 44, 129-146 Scott J. K. and Smith G. P., Science, 1990, 249, 386-390 Stitt y otros (2003) Exp. Mol. Pathol . , 75, 95-108 Takemoto y otros (2002) Am. J. Pathol., 161, 799-805 Tuerk C. and Gold L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 3, 249, 505-10 Van Echten y otros (1993) J. Biol. Chem. , 268, 5341-5344 Wakarchuk y otros (1996) Functional relationships of the genetic locus encoding the glycosyltransferase enzymes involved in expression of the lacto-N-neotetraose terminal lipopolysaccharide structure in Neisseria meningitidis . J. Biol. Chem., 271 (32), 19166-73 Wautier y otros (2001) Diabetes Metab. , 27, 535-542 Wolf y otros (2000) Kidney Int. Suppl . , 77, S59-S66 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro del a presente descripción de la invención.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - El uso de un inhibidor GM3 sintasa para la fabricación de un fármaco previsto para el tratamiento de una complicación microvascular de diabetes. 2. - El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la complicación microvascular de diabetes es una nefropatía diabética.
3. 3. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor es un inhibidor de la expresión del gen o proteína de GM3 sintasa.
4. 4. - El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, AR s de interferencia y aptámeros .
5. 5. - El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el inhibidor es una secuencia de ácido nucleico antisentido que hibridiza específicamente con la secuencia SEC ID No: 1 bajo condiciones altamente severas.
6. 6. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2 en donde el inhibidor es un inhibidor de la actividad de GM3 sintasa.
7. 7. - El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el inhibidor es un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra GM3 sintasa.
8. 8. - El método in vitro para clasificar o identificar compuestos útiles en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes, caracterizado porque se evalúa la capacidad de al menos un compuesto de prueba para inhibir la actividad de GM3 sintasa, una disminución en el nivel de la actividad de G 3 sintasa es indicativo de un compuesto útil en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes.
9. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la complicación microvascular de diabetes es nefropatía diabética.
10. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el método de clasificación comprende los pasos que consisten en poner en contacto por lo menos un compuesto de prueba con una célula que expresa una GM3 sintasa, y determinar la capacidad del compuesto para inhibir la síntesis intracelular de la gangliosida GM3 , una disminución en el nivel de la síntesis de la gangliosida GM3 en la célula que es indicativo de un compuesto útil en el tratamiento y/o prevención de las complicaciones microvasculares de diabetes .
11. 11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dicho método de clasificación comprende los pasos que consisten en poner en contacto al menos un compuesto de prueba con una GM3 sintasa y determinar la capacidad de dicho compuesto para inhibir la transferencia de un residuo de ácido siálico de un donador de ácido siálico a un grupo 3-hidroxilo de un residuo de galactosa de un aceptor de ácido siálico, un disminución en el nivel de la actividad de transferencia de ácido siálico que es indicativo de un compuesto que inhibe la GM3 sintasa y es útil en el tratamiento y/o prevención de complicaciones microvasculares de diabetes.
12. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se determina el nivel de transferencia de ácido siálico de CMP-N-acetilneuraminato a lactosilceramida .
13. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque el donador y/o aceptor de ácido siálico se marca en una forma detectable.