MXPA06012574A - Sistema de perfusion rapida y tecnica de pinzamiento zonal de membrana que utiliza un sistema de camara de interfaz con alto rendimiento y requisitos de bajo volumen. - Google Patents

Abstract

Se describe un sistema para llevar a cabo perfusion rapida para las tecnicas de pinzamiento zonal de membrana utiles en el estudio del efecto de compuestos sobre canales de transferencia ionica en tejidos biologicos. La invencion adicionalmente incluye conjuntos de camaras de microperfusion capaces de utilizar pequenas cantidades de material a ser probado y pequenas cantidades de portador liquido, permitiendo por tanto que sean realizadas multiples pruebas en un corto periodo de tiempo. La invencion mas ampliamente se refiere a la manipulacion y preparacion de aplicacion de un farmaco electrofisiologico para deteccion de sustancias quimicas tales como farmacos ofreciendo, al mismo tiempo, alto rendimiento y bajos volumenes de soluciones y muestras.

Description

que exponen el sitio de adherencia del soluto secuencialmente en un lado de la membrana y, después, en el otro. Algunas proteínas portadoras simplemente transportan un único soluto "cuesta abajo", es decir, a lo largo de su gradiente de concentración y/o electroquímico. Otras proteínas portadoras pueden actuar como bombas para transportar un soluto "cuesta arriba" contra su gradiente de concentración y/o electroquímico, usando energía suministrada por la hidrólisis del ATP o por un flujo "cuesta abajo" de otro soluto (tal como sodio) para accionar la serie requerida de cambios de adaptación (examinados en B. Alberts et al., 1994, Molecular Biology of the Cell, 3o. edición, Garland Publishing, Inc., New York, N.Y.). Varias proteínas portadoras, tales como la superfamilia de transportadores ABC, son especialmente importantes desde el punto de vista clínico. Estas proteínas son conocidas como responsables de la fibrosis cística, así como de la resistencia a fármacos en células cancerosas y parásitos causadores de la malaria. Diferente de las proteínas portadoras, proteínas de canal iónico son proteínas transmembrana que forman poros en membranas biológicas que permiten que iones y otras moléculas pasen de un lado a otro. Existen varios tipos de canales iónicos. Por ejemplo, "canales de escape" se encuentran abiertos bajo todas las condiciones fisiológicas de membrana. "Canales accionados por voltaje" se abren en respuesta al potencial eléctrico a través de la membrana. "Canales accionados por ligandos" responden al enlace de moléculas especificas, tales como mediadores extracelulares (por ejemplo, neurotransmisores ) , o mediadores intracelulares (por ejemplo, iones o nucleótidos) . Otros canales iónicos son modulados por interacciones con proteínas, tales como las proteínas G. Proteínas de canal iónico median primariamente la penetración de un ión particular. Por ejemplo, han sido identificados canales de sodio (Na+) , potasio (K+) , cloruro (Cl~) y calcio (Ca2+) . Canales iónicos son en gran medida responsables de la creación del potencial celular de membrana, que es la diferencia en carga eléctrica sobre los lados opuestos de la membrana celular (B. Alberts et al., supra) . En células animales, Na+ y K+ ATPases mantienen la concentración intracelular Na+ baja y la concentración intracelular de K+ alta. En oposición a estas ATPases, los canales de escape de K+ permiten a los iones K+ iones descender el gradiente de concentración de K+ y salir de las células. De esta manera, varios canales iónicos colectivamente contribuyen a la formación del potencial celular de membrana. Los canales iónicos accionados por voltaje y accionados por ligandos son responsables de la generación de los potenciales de acción de la membrana celular en células eléctricamente excitables, incluyendo la mayoría de las células musculares y nerviosas (B. Alberts, supra) . Por ejemplo, un potencial de acción es disparado por la despolarización de la membrana celular, que es causada por un influjo de Na+ a través de los canales de Na+ accionados por voltaje. Potenciales de acción disparan la liberación de hormonas y neurotransmisores en células secretoras y neuronas; ellas provocan contracciones en células musculares e influyen eventos bioquímicos y niveles de expresión genética. Debe ser notado, sin embargo, que los canales iónicos no están limitados a células excitables. De hecho, canales de Na+, K+, o Ca2+ accionados por voltaje están presentes en varios tipos de células no-excitables (B. Alberts, supra) . La amplia variedad de proteínas portadoras y canales iónicos representa una rica colección de nuevos objetivos para agentes farmacéuticos. Se sabe que muchos productos químicos, compuestos y ligandos afectan la actividad de la proteína portadora y/o del canal iónico. Además, agentes que modulan proteínas portadoras y canales iónicos pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas que pueden ser usadas en el tratamiento de varias enfermedades, lesiones, o condiciones (S. A. N. Goldstein et al., 1996 , Neuron 16 : 913 - 919 ) . Por ejemplo, agentes que modulan la actividad de los Transportadores ABC pueden ser usados en el tratamiento de fibrosis cística y/o cáncer. Agentes que modulan la actividad de los canales Ca+ pueden ser usados en el tratamiento de epilepsia, ansiedad, y Enfermedad de Alzheimer. Aparte de eso, agentes que modulan la actividad de canales de Na+ pueden ser usados para tratar espasmos musculares, tortícolis, temblor, disturbios del aprendizaje, cáncer cerebral, dolor y Enfermedad de Alzheimer. Agentes que bloquean los Canales de Na+ pueden ser usados como anestésicos locales. Agentes que modulan los Canales epiteliales de Na+ pueden ser usados en el tratamiento de fibrosis cística, asma e hipertensión. Adicionalmente, agentes que modulan la actividad de los Canales de K+ pueden ser usados para contrarrestar los efectos dañinos de disturbios anóxicos e isquémicos y de la hipertensión, y proteger los glóbulos rojos contra daños en malaria y anemia drepanocítica (J. R. Enfeild, et al., 1995, Pharmaceutical News 2:23-27) . La actividad del canal iónico puede ser medida usando la técnica del análisis por pinzamiento zonal de membrana. La idea general de aislar eléctricamente un parche de membrana usando una micropipeta y estudiar las proteínas del canal en este parche bajo condiciones de voltaje-pinza fue descrito por Neher, Sakmann, y Steinback en "The Extracellular Pinzamiento zonal de membrana, A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels In Biological Membranes, " Pflueger Arch. 375 ; 219 -278 , 1978 . Ellos notaron que, presionando una pipeta conteniendo acetilcolina (ACH) contra la superficie de la membrana de una célula muscular, ellos pudieron observar saltos discretos en la corriente eléctrica atribuible a la apertura y cierre de canales iónicos activados por ACH. Sin embargo, ellos fueron limitados en su trabajo por el hecho de que la resistencia del sello entre el vidrio de la pipeta y la membrana ( 10- 50 megaohms) era muy pequeña en relación con la resistencia del canal (cerca de 10 gigaohms) . Fue descubierto que mediante acabado por fuego de las pipetas y aplicando una delicada succión al interior de la pipeta cuando ésta entra en contacto con la superficie de la célula, pueden ser obtenidos sellos de resistencia muy alta ( 1-100 gigaohms) . Esta técnica redujo el ruido de fondo en un orden de magnitud a niveles en los cuales la mayoría de los canales de interés biológico podrían ser estudiados. Este sello mejorado ha sido denominado "giga-sello, " y la pipeta ha sido rotulada como "pipeta parche." Por su trabajo en el desarrollo de la técnica de pinzamiento zonal de membrana, Neher y Sakmann recibieron en 1991 el Premio Nobel en Fisiología y Medicina. La técnica pinzamiento zonal de membrana representa un desarrollo importante en biología y medicina. Por ejemplo, la técnica permite medir el flujo iónico a través de proteínas simples del canal iónico, y permite el estudio de respuestas simples del canal iónico a fármacos. En pocas palabras, en una técnica pinzamiento zonal de membrana estándar, una fina pipeta de vidrio (con una punta típicamente de cerca de 1 i de diámetro) es presionada contra la superficie de una membrana celular. La punta de la pipeta se pega estrechamente a la célula y aisla algunas proteínas del canal iónico en una pequeña porción de la membrana. La actividad de estos canales puede ser medida eléctricamente (registro de canal único) o, alternativamente, la porción de membrana puede ser rota permitiendo que la actividad de canal de toda la membrana celular sea medida (registro por célula completa) . Tanto durante el registro por canal simple como por célula completa, la actividad de subtipos individuales de canales puede ser adicionalmente resuelta imponiendo una "pinza de voltaje" a través de la membrana. A través del uso de un lazo de retroalimentación, la "pinza de voltaje" impone un gradiente de voltaje a través de la membrana, que limita y controla la actividad general del canal y permite la resolución de subtipos de canales discretos. La resolución temporal y el control de voltaje en estos experimentos son imprevisibles, frecuentemente en el rango de msec o inclusive µseg. Sin embargo, el principal obstáculo de la técnica pinzamiento zonal de membrana como método general en detección farmacológica ha sido el número limitado de compuestos que podrían ser probados por día. Aparte de eso, las técnicas estándar son adicionalmente limitadas por la baja velocidad de cambio del compuesto de la muestra, y la precisión espacial requerida por las pipetas de pinzamiento zonal de membrana. Una limitación importante que determina el rendimiento de la técnica pinzamiento zonal de membrana es la naturaleza del sistema de perfusión, que dirige el compuesto de prueba disuelto a las células y parches. En configuraciones tradicionales de pinzamiento zonal de membrana, células son colocadas en grandes cámaras experimentales (cavidades de 0.2-2 mi), que son continuamente bombeadas con una solución fisiológica salina. Son, entonces, aplicados compuestos, cambiando la entrada para una válvula conectada a un pequeño número de frascos de solución. Sin embargo, esta técnica posee varios inconvenientes. En primer lugar, el número de diferentes compuestos que puede ser conectado a la vez es limitado por el número de frascos. Segundo, los volúmenes de líquido y/o muestra de soporte requeridos para pruebas continuas siendo un paso limitador de la velocidad, debido al tiempo y costos de abastecimiento. Tercero, el tiempo requerido para cambiar la composición del soluto en torno de las células y parches sigue siendo alto. Por consiguiente, hubo varios intentos de aumentar la capacidad de rendimiento de registros de pinzamiento zonal de membrana . El desarrollo de sistemas sofisticados para aplicación local de compuestos para activar los canales neurotransmisores regulados, como la capilaridad U y otros sistemas, reduce los tiempos efectivos de aplicación. Sin embargo, el volumen de solución en baño intercambiado por estos sistemas de aplicación rápida es demasiado grande y resulta en una capacidad limitada para detectar múltiples compuestos por día. Esto limita el uso de estos procedimientos en la industria médica debido al costo excesivo del reactivo en el tiempo requerido para probar decenas de miles de compuestos o diferentes concentraciones. Una razón importante es la inflexibilidad y baja capacidad de los sistemas de alimentación que llenan la capilaridad U, que son virtualmente idénticos a los sistemas usados en experimentos convencionales de pinzamiento zonal de membrana. Las Patentes de E. U. A. Nos. 6,063,260, 6,117,291, y 6,470,226 a Olesen et. al. (colectivamente, "Olesen") revelan un sistema de control de motor computarizado que hace que una pipeta de parche parche una célula automáticamente seleccionada de un baño celular. La punta de la pipeta y la célula permanecen, entonces, pegados en una cámara de perfusión para mediciones de pinzamiento zonal de membrana. Un auto-muestreador controla una válvula que, alternadamente, dirige fluido de varias fuentes hacia la cámara de perfusión, incluyendo una o más soluciones químicas de prueba y soluciones de lavado. Un ducto en la cámara de perfusión aspira el fluido usado hacia fuera de la cámara. Mediciones por pinzamiento zonal de membrana pueden ser efectuadas cuando la célula es bañada en una solución de prueba. En Olesen, la cámara de perfusión no se mueve. Más Bien, un complicado conjunto de tubos y bombas es usado para bombear productos químicos de prueba y baños de lavado hacia dentro y fuera de la cámara de interfaz . Por lo tanto, en lugar de mover la célula (y la pipeta) hacia diferentes soluciones de prueba y de lavado, las soluciones son llevadas hasta la célula estacionaria mediante un auto-muestreador . Para minimizar la solución de prueba, Olesen posiciona el auto-muestreador muy cerca de la cámara de perfusión. Debe tomarse especial cuidado para minimizar la interferencia eléctrica (y vibraciones) causadas por el automuestreador al efectuar mediciones por pinzamiento zonal de membrana. La Patente de E. U. A. No. 6,048,722 a Farb et . al. ("Farb") revela un sistema automático de perfusión por pinzamiento zonal de membrana que bombea células parchadas con una gran variedad de soluciones de prueba y lavado. Las soluciones de prueba y lavado drenan desde una serie de depósitos a través de un colector multi-barril hacia la cámara de registro, que contiene la célula parchada. Una válvula controla cuáles soluciones inundan la célula en un momento dado. Como en el sistema Olesen, el sistema Farb hace que las soluciones se muevan hacia la célula en lugar de mover la célula hacia las soluciones. La Solicitud de E. U. A. No. 09 / 900 , 627 presentada el 6 de julio de 2001 por Weaver et . al. ("Weaver") revela un sistema que puede medir propiedades eléctricas de células que no usan la punta de una pipeta para unirse a membranas celulares. En lugar de eso, una serie de poros en una superficie porosa se une y sella una pluralidad de membranas celulares. Un lado de la superficie porosa es acoplado a un electrodo tierra, y el otro lado es acoplado a un electrodo de medición. En una modalidad en donde la superficie porosa es un microchip, cada célula puede ser unida a su propia tierra y electrodos de medición, permitiendo mediciones especificas de la célula. Cuando soluciones de prueba son aplicadas a uno o más lados de la superficie porosa, un registro por pinzamiento zonal de membrana puede ser medido para las células unidas. El sistema puede ser automatizado de modo que múltiples superficies porosas son probadas simultáneamente en una placa multi-cavidad. La Solicitud de Patente de E. U. A. No. 10 /239 , 046 (Pub. No. US 2003 / 0139336 Al) presentada el 21 de marzo de 2001 por Norwood et. al. ( "Norwood" ) provee un sistema en el cual una pipeta de parche es unida a una célula ubicada en la interfaz líquido-aire de un líquido suspendido, tal como una gota de líquido suspendida en la parte inferior de un tubo capilar. El aumento (o disminución) de la presión dentro del tubo hace que el menisco, la interfaz líquido-aire, abulte hacia afuera (o hacia dentro) . Como la célula está ubicada en el menisco, la posición de la célula puede ser controlada regulando la presión interna del tubo. Hacer que el menisco sobresalga hace que la célula contacte una pipeta de parche ubicada exactamente debajo del tubo y que está apuntando hacia arriba en dirección al menisco. Una vez que la célula toca la pipeta de parche, la pipeta puede formar un giga-sello (sello giga-ohm) y "parche" la célula en preparación para medidas por pinzamiento zonal de membrana. En el sistema Norwood, la célula está afuera de la pipeta de parche antes de ser parchada. También, el sistema de presión de aire es aplicado a un segundo tubo que mantiene y suspende el líquido celular; la presión de aire no es aplicada a la pipeta de parche en si. Permanece en pie la necesidad de un método más rápido, barato y/o práctico de efectuar la detección de alto rendimiento. Tales detecciones de alto rendimiento podrían ser inestimables para la búsqueda e identificación de agentes que modulan la actividad del canal iónico. A su vez, estos agentes podrían ser útiles para el tratamiento de varias enfermedades, tales como cáncer, cardiopatías , fibrosis cística, epilepsia, dolor, ceguera y sordera.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee un sistema para la manipulación y aplicación automática de fármacos, y utiliza el sistema para detección de productos químicos tales como fármacos . En particular, los métodos y sistema pueden ser usados para medir el efecto sobre la transferencia del canal iónico, al tiempo que ofrecen alto rendimiento y requisitos de bajo volumen de fluido. Para los fines de la invención "canales iónicos" se refieren a canales de escape, canales accionados por voltaje, canales accionados mecánicamente, canales accionados por ligandos, y cualquier otra clase de proteína de canal . Una modalidad de la invención reduce la cantidad de compuesto químico requerida para pruebas. Otra modalidad presenta un método mediante el cual un gran número de detecciones puede ser aplicado a una única célula resultando en una mayor velocidad de detección. Otra modalidad provee un sistema y métodos de uso del sistema para mantener una célula inmersa en líquido durante todo el proceso de detección. Otra modalidad minimiza el tiempo de equilibrio para que la perfusión rodee la membrana celular bajo control de pinzamiento zonal de membrana, necesario para estudiar los canales iónicos accionados por ligandos con rápida desensibilización. Una modalidad de la invención presenta un sistema que comprende una cámara de interfaz, en la cual la referida cámara de interfaz proporciona un baño de interfaz capaz de suspender una célula. El sistema es particularmente aplicable a métodos para la ejecución de técnicas de pinzamiento zonal de membrana . Otra modalidad provee un sistema de interfaz que comprende una cámara de interfaz, en la cual una célula es sujeta a un capilar a través de un giga-sello, y en la cual la referida cámara de interfaz y capilar son respectivamente móviles, de manera que el capilar puede deslizar a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo apropiada para suspender un líquido. Otra modalidad provee un sistema pinzamiento zonal de membrana que comprende un capilar que comprende un electrodo; una célula acoplada al referido capilar de una manera suficiente para formar un giga-sello entre el capilar y la membrana celular de la referida célula; una cámara de interfaz que comprende un electrodo, en la cual la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar se puede deslizar a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo apropiadamente conformada para contener y suspender un líquido; un dispositivo para medir por lo menos la corriente o el voltaje entre los electrodos; y una placa que comprende una serie de depósitos, en la cual por lo menos un depósito comprende un compuesto de prueba. En una modalidad, la invención presenta un método de medición de las propiedades de una célula que comprende colocar la célula en una cámara de interfaz en que la referida cámara de interfaz suspende una célula en un baño de interfaz en la cámara de interfaz, y donde la célula es fijada a un capilar. Una o más propiedades de la célula pueden entonces ser medidas. En otra modalidad, la invención presenta un método de medición de las propiedades de una célula que comprende colocar una célula en una cámara de interfaz, donde la célula es fijada a un capilar a través de un giga-sello, y donde l referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizarse a través de la cámara de interfaz . Una o más propiedades de la célula pueden entonces ser medidas . Otra modalidad más provee un método de medición de las propiedades de una célula, que comprende el establecimiento de un sistema de interfaz, que comprende una cámara de interfaz, donde una célula es fijada a un capilar de una manera suficiente para formar un sello entre el capilar y la célula, y donde la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizarse a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo apropiadamente conformada para contener y suspender un líquido; que establece un medio para medir por lo menos la corriente o el voltaje entre los referidos electrodos; transferir el sistema de interfaz a un depósito que comprende un compuesto de prueba; y medir la corriente eléctrica que fluye a través de la membrana celular . Otra modalidad presenta un método para adherir una célula a un capilar. La presión positiva es aplicada dentro del capilar. El capilar es insertado en una capa de células. La presión dentro del capilar es disminuida para formar un giga-sello entre una célula específica y el capilar. Después del paso de disminución, el capilar es retirado de la capa de. células. Después del paso de retirada, la presión dentro del capilar es adicionalmente disminuida para establecer una configuración completa de célula para la célula específica. Los anteriores y otros objetos, ventajas y rasgos característicos de la invención se tornarán evidentes a partir de la siguiente descripción de ciertas modalidades ilustrativas de la misma, consideradas conjuntamente con las figuras anexas, los números de referencia semejantes significan elementos semejantes a lo largo de todas las figuras .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1C ilustran un sistema pinzamiento zonal de membrana modelo donde una cámara de interfaz en forma de bobina es posicionada relativamente a la célula para formar un sistema de interfaz. Las ¦ Figuras 2A-2C muestran un pinzamiento zonal de membrana ciego de alta densidad celular de acuerdo con una modalidad de la invención. La Figura 3 ilustra un sistema de pinzamiento zonal de membrana modelo que comprende un sistema de interfaz y placa muíti-cavidad. La Figura 4 muestra una modalidad modelo de capilar y célula. La Figura 5 ilustra un sistema de interfaz modelo. La Figura 6 es un diagrama de flujo que muestra un método de uso del sistema de las Figuras 1A-1C. La Figura 7 ilustra una gráfica que muestra la corriente a través de una membrana celular contra tiempo. La Figura 8 ilustra una gráfica que muestra la corriente pico y un bloque fraccionario contra la concentración de una sustancia de prueba. La Figura 9 ilustra una gráfica que muestra la corriente a través de una membrana celular contra tiempo. Las Figuras 10A-10B ilustran una gráfica que muestra mediciones de corriente de canal iónico obtenidas usando una modalidad de la invención. Las Figuras 11A-11B ilustran una gráfica que muestra corrientes iónicas obtenidas de células HEK293 expresando establemente canales hERG. Las Figuras 12A-12B ilustran una gráfica que muestra el efecto de E4031 sobre corriente de potasio en células HEK293 expresando establemente canales hERG.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las Figuras 1A-1C ilustran un sistema de interfaz 7 de acuerdo con una modalidad de la invención. El sistema de interfaz 7 puede comprender una célula 10, un capilar 2 que puede acoplarse a la membrana celular 10a, una cámara de interfaz 6 movible para envolver la punta del capilar 2a, una Barra 8 acoplada a la cámara de interfaz 6, y un líquido 12 que puede sumergir la punta del capilar 2a. Como se muestra en la Figura 1A, a una configuración de célula completa de la técnica pinzamiento zonal de membrana puede ser establecida, por ejemplo debajo de un microscopio. En la Figura IB, la cámara de interfaz en forma de bobina 6 puede ser halada sobre la punta del electrodo y la célula puede ser bañada en solución, formando un sistema de interfaz 7. En la Figura 1C, el sistema de interfaz 7 puede ser retirado de la solución. Como se muestra en las Figuras. IB, 1C, y 3, un "sistema de interfaz" 7 puede comprender un capilar 2 , una célula 10 fijada a la punta del capilar 2a de una manera suficiente para formar un sello entre el capilar 2 y la membrana celular 10a , y una cámara de interfaz 6 que incluye la punta del capilar 2a , la célula 10 , y un pequeño volumen de liquido 26 suspendido en la cámara de interfaz 6 por fuerzas capilares y/o la tensión superficial del líquido. El líquido 26 puede ser suspendido en una región interior de la cámara de interfaz 6 . El capilar 2 puede ser hueco en uno o ambos extremos, y es preferiblemente aproximadamente cilindrico en forma. El capilar 2 puede comprender una abertura en su punta 2a . El capilar 2 puede ser aproximadamente cónico en forma. La punta del capilar 2a puede ser de un tamaño y forma que pueda ser sujeto a una célula 10 , de un mamífero, insecto, anfibio, u otra célula. Por ejemplo, la abertura de la punta del capilar 2a puede tener un diámetro de aproximadamente 0 . 1 a 10 mieras. El capilar 2 puede comprender cualquier dispositivo tubular o cualquier porción de un dispositivo que sea tubular en forma. Preferiblemente el capilar 2 comprende una pipeta de parche. Conforme aquí usado, el termino "pipeta de parche" se refiere a cualquier tubo usado en técnicas de pinzamiento zonal de membrana que se une a una célula 10 y forme un giga-sello. Más preferiblemente, el capilar 2 comprende un tubo que termina en forma cónica con una punta de capilar 2a y es llamado una "micropipeta . " La abertura de la punta de la micropipeta 2a puede ser configurada para ser sujeta a la membrana celular 10a de una célula animal 10, tal como una célula de mamífero. Las Figuras 2A-2C muestran un pinzamiento zonal de membrana ciego de alta densidad celular de acuerdo con una modalidad de la invención. Este pinzamiento zonal de membrana ciego de alta densidad celular puede ser usado para sujetar una célula 10 a un capilar 2. En una modalidad, células que expresan establemente canales hERG pueden ser enzimáticamente aisladas por métodos convencionales, recogidas en un tubo, y centrifugadas. Las células puede ser posteriormente recogidas en otro tubo y dejadas asentar en una capa densa de células 11, por ejemplo, una capa de 1-10 mm de profundidad, preferiblemente 2-7 mm de profundidad, más preferiblemente 3-5 mm de profundidad. La naturaleza de la capa de células antes mencionada 11 permite la inserción de una pipeta de parche 2 en las células sin romper la punta de la pipeta 2a. Por ejemplo, la punta de la pipeta de parche 2a puede ser insertada 1-4 mm de profundidad en la capa celular 11. Esto puede permitir la manipulación ciega de la pipeta de parche y una formación ciega de una fuerte unión eléctrica de alta resistencia (giga-sello) entre la membrana celular de una célula particular 10 y la pipeta de parche 2. Un método de alcanzar esto es descrito de la siguiente manera. Primero, refiriéndose a la Figura 2A, la presión positiva puede ser aplicada dentro de la pipeta de parche 2. La presión positiva puede ser, por ejemplo, de 900-1000 mm Hg (absoluto) . La pipeta 2 puede ser posicionada dentro del tubo encima de la superficie de la capa de celular 11, por ejemplo, 10 mm encima de la superficie. Segundo, refiriéndose a la Figura 2B, la pipeta de parche 2 puede ser insertada en la capa celular 11. La profundidad de la inserción puede variar entre cualquier rango de milímetros o micrómetros. En el ejemplo mostrado en la Figura 2B, la profundidad puede variar, por ejemplo, entre 1 y 5 mm. Cambiando la presión (por ejemplo, para 700 mm Hg) puede causar la formación espontánea de un giga-sello entre la pipeta 2 y la célula específica 10. Después de la formación del giga-sello, la pipeta de parche 2 y la célula 10 unida a la punta de la pipeta 2a pueden ser retiradas de la capa de células 11. La pipeta 2 y la célula 10 pueden entonces ser colocadas sobre la capa de células 11, por ejemplo, 10-15 mm encima de la capa 11. Tercero, refiriéndose a la Figura 2C, una configuración de célula completa puede ser establecida cambiando la presión dentro de la pipeta de parche 2, por ejemplo, para 600-650 mm Hg. Posteriormente, la presión puede ser mantenida en otro valor, por ejemplo, una presión superior como 700-740 mm Hg, para asegurar la estabilidad de los registros pinzamiento zonal de membrana. Debe notarse que una cámara de interfaz 6 puede ser usada para contener la célula 10 y/o líquido 12 en cualquier punto durante el proceso mostrado en las Figuras 2A-2C. Por ejemplo, mientras la pipeta 2 esta en la posición mostrada en la Figura 2B, la cámara de interfaz 6 puede ser movida de una posición en el eje de la pipeta 2 encima de la superficie del líquido 12 para una posición debajo de la superficie del líquido 12 donde la cámara de interfaz 6 contiene la célula 10, como es mostrado en la Figura 2C. Esto puede ocurrir después (o antes) de que la pipeta 2 forme un giga-sello con la célula 10. En una modalidad preferida, la cámara de interfaz 6 no es insertada en la capa de células 11, ya que esto podría dañar potencialmente las células y en secuencia aumentar la tasa de falla (Figura 2B) . Una vez que la célula 10 es fijada a la pipeta de parche 2, la misma es retirada de la capa de células 11 (Figura 2C) y la cámara de interfaz 6 es posicionada de manera que cubra la célula parchada 10. La cámara de interfaz 6 y la pipeta 2 pueden entonces ser movidas como una entidad compuesta, es decir, como el sistema de interfaz 7, preservando la posición relativa de la célula 10, la pipeta 2, y la cámara de interfaz 6. Si es deseable, el sistema de interfaz 7 puede ahora ser movido del tubo y hacia uno o más depósitos diferentes 18, a través del aire, con seguridad. Un método relacionado puede ser preferido cuando es deseable evitar la exposición de la célula 10 al aire, ya que la cámara de interfaz 6 es capaz de suspender un baño líquido alrededor de la célula 10. Otras modalidades de la invención son dirigidas a métodos de uso del sistema de interfaz 7 de la invención, por ejemplo, Figuras IB, 1C, y 3, para medir las propiedades de una célula 10. El sistema de interfaz 7 comprende un capilar 2, una célula 10 sujeta a la punta del capilar 2a de una manera suficiente para formar un sello entre el capilar 2 y la membrana celular 10a de la célula 10, y una cámara de interfaz 6 que incluye la punta del capilar 2a, la célula 10, y un pequeño volumen de líquido 26 suspendido en la cámara de interfaz 6 por fuerzas capilares y/o la tensión superficial del líquido. La Figura 3 ilustra un sistema de pinzamiento zonal de membrana modelo que comprende un sistema de interfaz y placa muíti-cavidad. El sistema pinzamiento zonal de membrana puede comprender una placa multi-cavidad 16 que comprende uno o más depósitos 18. Conforme aquí usado, el termino "depósito" se refiere a cualquier superficie capaz de contener un pequeño volumen de líquido. Esto incluye cavidades y depresiones, así como superficies planas donde un pequeño volumen de líquido forme una gotícula definida de líquido, mantenida unida por la tensión superficial del líquido. Preferiblemente, el depósito 18 puede mantener un volumen mínimo de líquido de 1 ul, 5 ul, 10 ul, 50 ul, 100 ul, 200 ul, o 500 ul . El depósito 18 puede preferiblemente mantener un volumen máximo de líquido de 1 mi, 2 mi , 5 mi, o 10 mi. El depósito puede también mantener cualquier combinación de estos valores máximo y mínimo; por ejemplo, el depósito 18 puede mantener cantidades crecientes de líquido, tales como entre 5 ul y 2 mi, o entre 100 ul y 1 mi, así como incrementos entre los incrementos. Más preferiblemente, el depósito 18 puede mantener entre 10 ul y 2 mi de líquido. Incluso más preferiblemente, el depósito 18 puede mantener entre 20 ul y 1 mi, de líquido. Los depósitos 18 pueden cada uno comprender uno o más compuestos de prueba 20, o pueden comprender una solución neutra. El compuesto de prueba 20 puede comprender un fármaco, o alternativamente, puede comprender un líquido inerte, tal como una solución acuosa o salina inerte. Preferiblemente la cámara de interfaz 6 comprende un electrodo, y preferiblemente la punta del capilar 2a está sellada a la membrana celular 10a. En una modalidad, el sistema de interfaz 7 puede ser transferido a un depósito 18 que comprende una solución que comprende un compuesto de prueba 20. El electrodo 4 está preferiblemente sujeto a un dispositivo que mide corriente a través del electrodo 4 y/o un dispositivo que mide voltaje a través del electrodo 4 y otra referencia, tal como la cámara de interfaz 6 . Una corriente eléctrica externa puede ser impuesta sobre los referidos electrodos para establecer un voltaje o corriente de referencia a un valor deseado. Adicionalmente, la corriente eléctrica que fluye a través de la membrana celular 10a (y/o voltaje a través de la cámara de interfaz 6 y electrodo 4 ) puede ser medida en un medio de medición eléctrica que comprende un circuito conectado entre la cámara de interfaz 6 y el electrodo 4 antes y/o después de la introducción del sistema de interfaz 7 a una solución... que comprende un compuesto de prueba 20 . En modalidades preferidas uno o más de los siguientes parámetros (por ejemplo, propiedades eléctricas) pueden ser medidos en la célula: corriente en pinza-voltaje, voltaje a través de los electrodos y/o a través de la célula o membrana celular, resistencia eléctrica, impedancia, capacitancia eléctrica, fluorescencia óptica, resonancia plasmática, resonancia mecánica, fluidez y/o rigidez. En otro aspecto de esta invención, pruebas adiciónales pueden ser conducidas sobre la misma célula 10 . En este aspecto de la invención, el sistema de interfaz 7 puede ser retirado del depósito 18 y lavado mediante la introducción del sistema de interfaz 7 hacia una solución 20 sin compuesto de prueba. Preferiblemente el lavado es realizado 2 a 5 veces, de modo que cualesquiera compuestos de prueba que permanezcan en el fluido contenido en la cámara de interfaz 6 sean diluidos debajo de su nivel de actividad en la célula 10 . El sistema de interfaz 7 puede entonces ser transferido hacia otro depósito 18 que comprende una solución que comprende otro compuesto de prueba 20 (o una solución de lavado) . Alternativamente, si la célula 10 va a ser movida desde concentraciones inferiores hacia concentraciones más altas del mismo compuesto de prueba, el paso de lavado puede ser eliminado conforme práctica estándar de laboratorio.' Propiedades eléctricas de la célula, membrana celular o sistema puede ser medido, conforme se discutió anteriormente. Este proceso es repetido todas las veces que sea necesario. Los depósitos 18 son preferiblemente provistos de una placa multi-cavidad 6 micro-titulador 16 . Para propósitos de la invención, el depósito 18 debe significar cavidades y depresión para mantener líquidos, así como conjuntos de placas planas que ofrecen suficiente tensión superficial para permitir la coalescencia de una muestra de prueba suficiente para la inserción de la cámara de interfaz en el depósito 18 . Los depósitos 18 pueden comprender uno o más compuestos diferentes. En un aspecto de esta invención, el compuesto de prueba 20 comprende un candidato a fármaco o agente activo, tal como un agente de bloqueo o de activación de un canal o transportador. Por ejemplo, los depósitos 18 pueden contener una solución de un fármaco para tratamiento de cáncer. El compuesto de prueba 20 puede también comprender un líquido inerte, tal como una solución salina o acuosa inerte. Preferiblemente, la solución del compuesto de prueba 20 requerido para medir las propiedades de una célula 10 es menor que 5 mililitros en volumen. Los volúmenes mínimos requeridos pueden ser 10 ul, 20 ul, 30 ul, 50 ul, y 80 ul, e incrementos entre estos volúmenes. Los volúmenes máximos requeridos pueden ser 0 . 5 mi , 1 mi , 2 mi, y 5 mi , e incrementos entre estos volúmenes. El volumen de la solución de prueba puede también ser cualquier combinación de estos valores máximo y mínimo; por ejemplo, el volumen puede ser cantidades crecientes de líquido, por ejemplo, entre 30 ul y 0 . 5 mi, o entre 50 ul y 5 mi. Más preferiblemente, el volumen está entre 20 ul y 1 mi. Por ejemplo, puede ser una placa de 96 cavidades donde cada cavidad es proyectada para mantener hasta 0 . 3 - 0 . 35 mi de solución. Una ventaja de la invención es que permite la rápida transferencia de la célula objetivo 10 de un depósito 18 hacia otro. El sistema de interfaz 7 puede simplemente ser retirado de un depósito 18 e insertado en otro. No hay necesidad de operaciones que consumen tiempo, como dilución de compuestos y ajustes de sistema de perfusión. Notablemente, el paso frecuentemente lento de sustituir el contenido de una cámara de baño que tiene una célula 10 por perfusión es reducido al tiempo que toma mover el sistema de interfaz 7 de un depósito 18 al próximo. Además, la invención dispensa la necesidad de tuberías o accesorios adiciónales, lo que reduce significativamente el costo y la contaminación accidental con residuos que podrían encontrarse dentro de un sistema de perfusión. Los compuestos de prueba 20 pueden frecuentemente adherirse a la tubería usada para sistemas de perfusión, requiriendo limpieza o sustitución de la tubería. Este problema es eliminado por el sistema de prueba de la presente invención. Otra ventaja de la invención es que provee un volumen de baño de interfaz pequeño 26 alrededor de la célula 10 mientras la célula 10 se encuentra en el sistema de interfaz 7 , lo que asegura un pequeño volumen de dilución al moverse la célula 10 de un depósito 18 hacia otro. Por ejemplo, en una modalidad preferida, el volumen del baño de interfaz 26 esta entre 1 / 50 y 3 / 10 del volumen de la solución en un depósito 18 , así como cualesquiera incrementos entre estos volúmenes . Más preferiblemente el volumen del baño de interfaz 26 es menor que 2 / 10 del volumen de la solución en un depósito 18 . Preferiblemente, el baño de interfaz 26 puede mantener cantidades crecientes de un líquido, por ejemplo, un volumen mínimo de 0 . 02 ul, 0 . 1 ul, 0 . 2 ul , 1 ul , 2 ul , 5 ul , 10 ul, o 20 ul , así como cualesquiera incrementos entre estos volúmenes. El baño de interfaz 26 puede preferiblemente mantener volumen máximo de líquido de 0 . 03 mi, 0 . 05 mi, 0 . 1 mi, 0 . 5 mi, 1 mi, 2 mi, o 5 mi, así como cualesquiera incrementos entre estos volúmenes. El baño de interfaz 26 puede también mantener cualquier combinación de estos valores máximo y mínimo; por ejemplo, el baño de interfaz 26 puede mantener entre 2 ul y 0 . 5 mi , o entre 10 ul y 0 . 05 mi. Más preferiblemente, el baño de interfaz 26 puede mantener entre 10 ul y 0 . 5 mi de líquido. Incluso más preferiblemente, el baño de interfaz 26 puede mantener entre 0 . 02 mi y 0 . 03 mi de líquido. Por ejemplo, el baño de interfaz 26 puede tener un volumen de 0 . 02 - 0 . 03 mi y el volumen de solución del depósito puede ser 0 . 3 - 0 . 35 mi. Un pequeño volumen de baño de interfaz 26 provee además un tiempo mejorado de equilibrio en la medida en que la dilución del baño de interfaz 26 va a ocurrir más rápido por el compuesto 20 , y permite los compuestos de prueba 20 sean conservados, ya que menores volúmenes de baño pueden ser usados . Otra ventaja es que, debido al tiempo rápido de aplicación de soluciones de prueba y lavado, algunas modalidades de la invención son cómodas para medir canales accionados por ligandos. Esta ventaja podría ser mas evidente con canales desensibilizados accionados por ligandos, ya que corrientes iónicas podrían ser detectadas antes de su desensibilización (es decir antes de que disminuyan por debajo de sus niveles esenciales) . En esta solicitud, un registro de una célula expresando un canal apropiado accionado por ligando podría ser obtenida conforme se describió anteriormente. Un ligando soluble podría ser colocado en cavidades de la placa, y con el movimiento de la célula hacia dentro de la cavidad, la corriente podría ser inducida. Las cavidades podrían también contener un compuesto de prueba (aparte del ligando) , y por lo tanto efectos de compuestos sobre canales accionados por ligandos podrían ser examinados. En otro aspecto de esta invención, cualquier método de uso del sistema de interfaz 7 de las Figuras 1 y 3 para medir las propiedades de una célula 10 puede opcionalmenté ser automatizado por robots estándar y dispositivos mecánicos controlados por computadoras. Por ejemplo, un sistema mecánico puede acoplarse al capilar 2 y barra 8 y mover el sistema de interfaz 7 desde un depósito 18 hacia otro. También, una serie de capilares 2 , cada uno con una célula sellada a la punta del capilar 2a , puede ser acoplada a otra. La serie de capilares 2 y barras 8 puede ser insertada a una serie de depósitos 18 . Esto podría permitir pruebas de múltiples células 10 al mismo tiempo. La Figura 4 muestra una modalidad ilustrativa del capilar 2 y célula 10 conforme a una modalidad de la invención.

La longitud del capilar 2 no es crítica para la invención siempre que permita la formación de una punta del capilar 2a que pueda obtener un sello apropiado sobre una célula 10, preferiblemente un sello-gigaohm. Preferiblemente, el capilar 2 puede ser hecho de diferentes materiales no -conductores, tal como plásticos (por ejemplo poliestireno) o vidrio. Más preferiblemente, el capilar 2 es fabricado de cualquier material que se adhiera fuertemente a membranas biológicas, que tenga buenas propiedades dieléctricas, sea inerte a un amplio rango de productos químicos, y pueda ser limpiado fácilmente. Por ejemplo, el capilar 2 puede comprender vidrio. Un electrodo 4 puede estar dentro de la punta del capilar 2a, y puede ser conectado a un amplificador electrónico. El electrodo 4 puede ser configurado para medir corriente a través de la membrana celular 10a. Conforme aquí usado, el termino "electrodo" se refiere a un transmisor o conductor físico que pueda conducir o de otro modo pasar señales eléctricas de una solución capilar 25 (o célula 10) a un amplificador. La solución capilar 25 puede conducir electricidad entre la célula 10 y el electrodo 4. Aquí, el electrodo 4 puede estar dentro (o parcialmente dentro) del capilar 2. Cuando el electrodo 4 toca la solución capilar 25 dentro del capilar 2, el capilar 2 actúa como un electrodo-parche. Conforme aquí usado, el termino "electrodo-parche" se refiere a una pipeta de parche 2, que comprende además un electrodo 4, todos los cuales se conectan a la célula 10. Por consiguiente, los términos "electrodo-parche" y "electrodo-capilar" son intercambiables para los fines de esta invención. Para los propósitos de esta solicitud, el electrodo 4 se refiere a la estructura que es usada para medir (o afecta) las propiedades eléctricas de la célula desde dentro del capilar 2 (es decir, el "electrodo-parche") . Esta estructura puede comprender el electrodo 4 así como la solución 25. Esta estructura 4 es diferente del electrodo de referencia 28 que es usado para medir (o afectar) las propiedades eléctricas fuera del capilar 2. El sello gigaohm en la punta del capilar 2a crea una barrera eléctrica entre el área de influencia de los dos electrodos 4, 28. En una modalidad preferida el electrodo parche 2 es un microelectrodo . Conforme aquí usado, el termino "microelectrodo " se refiere a un electrodo parche 2 de tamaño apropiado para registrar señales de células individuales. Conforme una modalidad de la invención, la punta del electrodo parche 2 puede ser puesta en contacto con la célula 10 para formar un registro por pinzamiento zonal de membrana. Conforme aquí usado, el termino pinzamiento zonal de membrana se refiere a una configuración de electrodo parche que permite el registro de señales a partir de una membrana biológica colocando un electrodo parche en contacto con una pequeña área de la membrana celular. El pinzamiento zonal de membrana puede ser un "pinzamiento zonal de membrana de célula completa", que se refiere a una configuración de electrodo parche que permite el registro de señales a partir de toda la membrana de una célula mediante la colocación de un electrodo parche en contacto con una pequeña área de la membrana celular y después rompiendo esa pequeña área de la membrana celular (el parche) . Cuando la punta del capilar 2a contacta la membrana celular de la célula 10a, un sello puede ser formado entre la punta del capilar 2a y la célula 10. Preferiblemente, el sello es suficientemente fuerte, y una resistencia excediendo 1 gigaohm, preferiblemente 10 gigaohms, es obtenida entre la membrana celular 10a y la punta del capilar 2a. Métodos de elaboración de sellos-gigaohm son bien conocidos en la técnica . El electrodo 4 puede ser conectado a un dispositivo de medición que mide corriente y/o voltaje a través del electrodo 4 y otra referencia, tal como la cámara de interfaz 6 o electrodo de referencia 28. El electrodo 4 puede ser configurado para medir el voltaje y/o corriente a través de la membrana 10a de una célula 10 en contacto con la punta del capilar 2a, una célula 10 y punta del capilar 2a siendo incluidas dentro de una cámara de interfaz 6 que comprende un electrodo . Volviendo a las Figuras 1A-1C y Figura 3, la cámara de interfaz 6 de la invención puede ser configurada de forma tal que comprenda una cavidad hueca . La cavidad es preferiblemente de un tamaño y forma tales que la tensión superficial y/o fuerzas capilares son suficientes para que el líquido 26 se adhiera dentro de la cámara de interfaz 6 . Preferiblemente, la cámara de interfaz 6 puede suspender tan poco como 1 ul y tanto como 1 mi. Por lo tanto, la cámara de interfaz 6 puede suspender cantidades crecientes de líquido, por ejemplo, 1 ul , 5 ul , 10 ul , 20 ul , 50 ul , 100 ul , 200 ul , 500 ul, 750 ul, o 1 mi de líquido, así como incrementos entre los incrementos. Conforme aquí usado, el término "suspender" se refiere a la capacidad de contener o mantener un líquido. En algunas modalidades, la cavidad de la cámara de interfaz 6 es más ancha que el ancho de la punta del capilar 2a de modo que la punta del capilar 2a puede ser totalmente incluida dentro de la cámara de interfaz 6. Preferiblemente la cámara de interfaz 6 es sustancialmente cilindrica en forma, conforme ejemplificado en la Figura 1A. La cámara de interfaz 6 puede estar compuesta de cualquier material sólido. Preferiblemente, la cámara de interfaz 6 esta compuesta de un material conductor, tal como metal. En algunas modalidades la cámara de interfaz 6 tiene la capacidad de actuar como un electrodo de referencia 28.

En una modalidad preferida, la cámara de interfaz 6 puede comprender un electrodo 28 , tal como una bobina metálica conforme ejemplificado en las Figuras 1 y 3 . Por consiguiente, la cámara de interfaz 6 puede tener dos funciones, como una cámara de interfaz 6 para contener líquido 26 y como un electrodo de referencia 28 para mediciones por pinzamiento zonal de membrana. Preferiblemente la bobina 6 , 28 tiene un diámetro de entre 1 milímetro a 10 milímetros. Preferiblemente la distancia entre los anillos de la bobina es entre 0 . 01 milímetros a 2 milímetros. Una ventaja de la cámara de interfaz/electrodo en forma de bobina 6 , 28 es que provee un área máxima de superficie de líquido, permitiendo por tanto un efecto máximo de las fuerzas capilares y/o tensión superficial para mantener el líquido 26 dentro de la cámara de interfaz 6 . Esto, a su vez, provee la medición estacionaria del voltaje de referencia del líquido 26 (mantenido en parte por el electrodo de referencia 28 ) , lo que ayuda a obtener mediciones exactas de pinzamiento zonal de membrana. La Figura 5 muestra otra modalidad de la cámara de interfaz 6 . En esta modalidad, la cámara de interfaz 6 comprende un tubo. El tubo 6 puede ser hecho de plástico u otro material (tal como otro material no-conductor) . Un electrodo de referencia 28 puede estar fuera del tubo 6 . El electrodo de referencia 28 puede ser acoplado al tubo 6 . El tubo 6 puede tener un radio casi igual (pero ligeramente mayor) que el radio del capilar 2, de modo que el capilar 2 pueda ser acoplado al tubo 6 deslizando el capilar 2 dentro del tubo 6 (o el tubo 6 dentro del capilar 2) . La fricción entre el tubo 6 y el capilar 2 puede hacer que estos se acoplen juntos en la inserción, de una manera similar a como una pluma puede acoplarse a su tapa. En una modalidad preferida, una barra 8 puede ser acoplada a la cámara de interfaz 6, como se muestra en la Figura 1 y Figura 2. En una modalidad alternativa, la barra 8 y la cámara de interfaz 6 juntas comprenden un dispositivo rígido de componente. La barra 8 puede comprender cualquier material rígido. Preferiblemente, la barra 8 es apropiada para acoplarse a una máquina, de modo que la máquina pueda controlar el movimiento de la cámara de interfaz 6 mediante el movimiento de la barra 8. Preferiblemente, la superficie de la barra 8 comprende un material no-conductor, tal como plástico o cerámica, de modo que cuando humanos o máquinas toquen la superficie de la barra 8, no afecten las propiedades eléctricas de la cámara de interfaz 6. En algunas modalidades, la barra 8 tiene un núcleo interno que comprende el electrodo de referencia 28 o un conductor conectado al electrodo de referencia 28. (Por lo tanto, la cámara de interfaz 6, la barra 8, o tanto la cámara de interfaz 6 como la barra 8 puede comprender el electrodo de referencia 28.) La barra 8 puede ser acoplada a la cámara de interfaz 6 en un extremo y a un dispositivo de medición eléctrica en el otro extremo. El dispositivo de medición eléctrica puede también ser acoplado al electrodo 4, de modo que el dispositivo de medición eléctrica, electrodo 4, y electrodo de referencia 28 son parte de un circuito cerrado. El circuito cerrado puede también incluir la célula 10 y el líquido 26 dentro de la cámara de interfaz 6. El núcleo interno de la barra 8 puede por lo tanto permitir que el dispositivo de medición eléctrica controle y/o monitoree las propiedades eléctricas de la cámara de interfaz 6, tal como el paso de la corriente a través de la membrana celular 10a o el voltaje a través del electrodo de referencia 28 y otro dispositivo, tal como el electrodo 4. La barra 8 puede ser usada para mover la cámara de interfaz 6. En una modalidad preferida, la barra 8 es usada para mover la cámara de interfaz 6 a lo largo del eje del capilar 2. De esta manera, los movimientos relativos del capilar 2 y de la cámara de interfaz 6 pueden hacer que la punta del capilar 2a se mueva hacia dentro de la cámara de interfaz 6. En una modalidad, la barra 8 puede ser usada para mover la cámara de interfaz 6 en un movimiento de vaivén a lo largo de la longitud de la barra 8. Por ejemplo, una persona o máquina podrían mover la barra 8 y por consiguiente mover la cámara de interfaz 6 acoplada a la barra. La barra 8 puede ser acoplada al capilar 2 por un broche 22 (mostrado en la Figura 1C) de modo que ambos puedan ser movidos juntos con facilidad con movimiento relativo. pequeño o no . El broche 22 puede ser unido al capilar 2, y/o puede ser unido a la barra 8. El broche 22 puede comprender cualesquiera medios de acoplamiento para acoplar el capilar 2 a la barra 8. De esta manera, la punta del capilar 2a puede permanecer en una posición fija relativa a la cámara de interfaz 6. En una modalidad preferida, la barra 8, cámara de interfaz 6, y broche 22 comprenden un aparato rígido que puede ser movido con movimiento relativo pequeño o no de sus partes componentes. También, en una modalidad preferida, la posición fija de la punta del capilar 2a puede estar cerca o en el centro del sistema de interfaz 7. Alternativamente, el broche 22 puede acoplar el capilar 2 directamente a la cámara de interfaz 6. En este caso, el broche 22 preferiblemente comprende un material no conductor para evitar afectar las propiedades eléctricas de la cámara de interfaz 6. Si un líquido 26 es suspendido dentro de la cámara de interfaz 6, la punta del capilar 2a puede moverse dentro del líquido 26. Alternativamente, si la punta del capilar 2a ya esta en un baño líquido 12, la cámara de interfaz 6 puede ser movida hacia dentro del baño 12 de modo que la cámara de interfaz 6 incluya la punta del capilar 2a y/o todo o una porción del baño líquido 12. Cuando la cámara de interfaz 6 es retirada del baño líquido 12, todo o una porción del líquido del baño líquido 12 es contenido en la cavidad de la cámara de interfaz 6 como resultado de la tensión superficial y/o fuerzas capilares del líquido. Este volumen de líquido 26 contenido en la cavidad de la cámara de interfaz 6 es llamado en lo sucesivo como el "baño de interfaz" 26. Una variedad de diferentes tipos de células pueden ser examinados con el presente sistema. Una lista no-exhaustiva de algunas de las células que pueden ser examinadas incluye: células de linfoma Jurkat; células de HEK293; células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, canal iónico/proteínas de transporte que contienen líneas de células); células primarias de tejido de neuronas tales como hipocampo, ganglios, y células neuroendocrinas ; músculos esqueléticos; músculos lisos; músculo cardiaco; células inmunes; células sanguíneas; epitelios; endotelios; células de plantas; y células modificadas genéticamente. En una modalidad preferida de la invención, una célula animal 10 es sellada al capilar 2 y probada. Más preferiblemente, la célula contiene canales iónicos o proteína de transporte en su membrana celular 10a, ya sean naturales o introducidos artificialmente por técnicas bien conocidas de biología molecular. En una modalidad, la célula 10 es una célula de un mamífero, insecto, o anfibio. Más preferiblemente, la célula es una célula humana. La Figura 6 ilustra un diagrama de flujo mostrando un método preferido de usar el sistema de interfaz 7 de las Figuras 1 y 3 de acuerdo con una modalidad de la invención. En el paso 101, mostrado en la Figura 1A, la punta del capilar 2a es conectada a la membrana celular 10a de una célula 10. La célula 10 puede estar en un baño líquido 12 en el momento de la conexión. La conexión puede ocurrir de modo que los capilares puedan ser conectados a células, que pueda implicar una ligera succión y voltaje para sellar la punta del capilar 2a a la célula 10. El capilar 2 es preferiblemente fijado a la célula 10 de manera tal que la punta del capilar 2a cubra uno o más canales iónicos de proteína de la membrana celular 10a. Más preferiblemente, el parche de membrana celular 10a dentro de la punta del capilar 2a es roto por succión y/o voltaje más fuerte para formar un registro de parche de célula completa de toda la membrana celular 10a. El capilar 2 preferiblemente comprende un electrodo 4. La cámara de interfaz 6 preferiblemente comprende un electrodo en forma de bobina. Durante este paso, la cámara de interfaz 6 puede incluir al capilar 2 en una posición remota de la punta del capilar 2a. En el paso 102, el capilar 2 y la cámara de interfaz 6 son movidos relativamente uno al otro de modo que la cámara de interfaz 6 incluye la punta del capilar 2a y la célula 10 fija al mismo. Esto puede ser efectuado moviendo la barra 8 acoplada a la cámara de interfaz 6 de modo que la cámara de interfaz 6 se mueva a lo largo del eje del capilar 2 hacia la punta del capilar 2a , o" moviendo el capilar 2 de modo que la punta del capilar 2a y célula 10 sean incluidas por la cámara de interfaz 6 . El sistema de interfaz 7 es formado cuando la cámara de interfaz 6 incluye a la punta del capilar 2a y a la célula 10 . En el paso opcional 103 , el capilar 2 (o portador del capilar) y la cámara de interfaz 6 son abrochados juntos con un broche 22 de manera que puedan ser fácilmente movidos juntos con poco o nada de movimiento relativo. Alternativamente, en este paso 103 el broche 22 puede ser usado para acoplar el capilar 2 directamente a la cámara de interfaz 6 . En este caso, el broche 22 preferiblemente comprende un material no-conductor para evitar afectar las propiedades eléctricas de la cámara de interfaz 6 . En el paso 104 , el sistema de interfaz 7 es retirado del baño líquido 12 , y en el proceso preferiblemente retira y suspende una porción del baño líquido 12. Debe notarse que el sistema de interfaz 7 es movido como un todo compuesto; los componentes del sistema 7 pueden ser sujetados juntos para facilitar moverlos como un sistema 7 (conforme descrito en el paso opcional 103 ) , o los componentes pueden ser movidos juntos a la misma vez para moverlos como un sistema 7 . El pequeño volumen de líquido 26 suspendido en la cavidad de la cámara de interfaz 6 es el baño de interfaz 26 , y rodea continuamente a la célula 10 . Las fuerzas capilares y/o tensión superficial del baño de interfaz 26 preferiblemente evita que el líquido se derrame hacia afuera a través de cualesquiera aberturas o huecos en la cámara de interfaz 6 . Por ejemplo, si la cámara de interfaz 6 tiene la forma de una bobina, la tensión superficial del baño de interfaz 26 evitará que se escape a través de los vestigios de la bobina. En una modalidad preferida, la punta del capilar 2a permanecerá en una posición fija en relación con la cámara de interfaz 6 y el baño de interfaz 26 como el capilar 2 y la célula 10 son retirados del baño 12 . En un paso opcional 105 , la célula 10 es lavada.

Este paso puede comprender insertar el sistema de interfaz 7 en un líquido de lavado, tal como una solución acuosa neutra. Este líquido de lavado preferiblemente no contiene ningún ingrediente activo ni fármacos de prueba. Más exactamente, el líquido de lavado enjuaga la célula 10 . El líquido de lavado puede también limpiar o sustituir el líquido suspendido en la cámara de interfaz 6. Este paso de lavado puede ocurrir siempre que la célula 10 precise ser lavada conforme requiera el proceso; por ejemplo, la célula 10 puede ser lavada después de ser inmersa en solución que comprende un compuesto de prueba 20. Preferiblemente la solución de lavado está localizada en un depósito 18 de una placa 16. En el paso 106, la célula 10 es insertada en un depósito 18. El depósito 18 preferiblemente comprende una solución de prueba, por ejemplo un fármaco candidato 20. En el paso 107, corriente y/o voltaje son medidos a través del electrodo 4 y membrana celular 10a. En el paso opcional 108, el sistema de interfaz 7 es extraído del depósito 18 y opcionalmente lavado, como se describe en el paso 105. En el paso opcional 109, el sistema de interfaz 7 es insertado en otro depósito 18, y el proceso de medición es repetido (opcionalmente con paso de lavado 105) para un número de depósitos 18. Preferiblemente, cada depósito 18 comprende una concentración diferente del mismo fármaco, o alternativamente, los depósitos 18 pueden contener diferentes fármacos en la misma o diferentes concentraciones. Una ventaja de usar la cámara de interfaz 6 que comprende un electrodo es que la misma maximiza la eficiencia de la difusión del fármaco hacia la membrana celular 10a debido al pequeño volumen de solución contenido en la cámara de interfaz 6. El mismo electrodo de referencia es usado, y la capacitancia de la pipeta de parche permanece igual con los cambios de solución, lo que mantiene la exactitud de los registros.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 La Figura 7 muestra el efecto de nueve concentraciones 4-AP en corrientes de potasio salientes en neuronas DRG de acuerdo con un ejemplo de la invención. Son mostrados la corriente a través de un electrodo de medición por pinzamiento zonal de membrana y célula contra tiempo. Fueron obtenidas mediciones de registro de célula completa vía métodos convencionales . La cámara de interfaz fue movida para rodear la célula como en los pasos 101- 103 anteriores. Una medición de corriente fue registrada mientras la célula estaba en una cavidad conteniendo una solución salina normal (control). La célula después fue movida de salina normal para una cavidad conteniendo concentraciones crecientes (de 0 a 10 mM en incrementos crecientes) del bloqueador 4-AP del canal K+. Para cada una de las mediciones, células fueron mantenidas a -50 Vm, intercalado con un prepulsor a - 100 Vm durante 400 ms y después intercalado para la prueba a +40 Vm. Después del pulso de prueba, las células fueron repolarizadas a - 60 Vm. Barridas fueron obtenidas cada 10 seg, y 5 barridas fueron obtenidas por cavidad. La interfaz fue movida de una cavidad hacia la próxima en un tiempo corto, tal como 2 segundos . Son mostradas corrientes salientes debidas al flujo de K+ a partir de la célula. A la concentración más alta probada, ninguna corriente inactivadora permanece, mientras que persisten corrientes significativas no-inactivadoras (persistentes) . Conforme mostrado, concentraciones crecientes del bloqueador 4-AP del canal K+ disminuyeron la corriente a través de la membrana celular. La menor corriente es consistente con el bloqueo esperado efectuado del 4-AP. Tanto la corriente pico (el aumento a la izquierda de la gráfica de cada medición) y la corriente final (valor final de corriente para cada medición) disminuyeron a medida que la concentración de 4-AP aumentó.

EJEMPLO 2 La Figura 8 ilustra una gráfica mostrando la corriente pico de un bloque fraccionario contra la concentración de una sustancia de prueba de acuerdo con un ejemplo de la invención. En la Figura 8 la corriente pico del Ejemplo 1 (Figura 7) es mostrada como un bloque fraccionario contra la concentración de la sustancia de prueba 4-AP. Conforme mostrado, la corriente pico disminuyó, mientras la concentración de 4-AP aumentó, conforme previsto. La curva de respuesta de dosis mostrada ilustra la capacidad de este sistema para medir concentraciones múltiples de sustancia de prueba con exactitud.

EJEMPLO 3 La Figura 9 muestra la medición del cambio de voltaje a través de ün electrodo de medición por pinzamiento zonal de membrana contra tiempo de acuerdo con un ejemplo de la invención. Un registro es obtenido de una membrana celular CHO en la configuración de célula completa. La cámara de interfaz es movida alrededor de la célula y fijada al electrodo (pasos 102 y 103). La célula es movida de 5 mM KC1 para 20 mM KC1 durante el registro. Esta acción cambia el voltaje a través de la membrana debido a un salto en el gradiente de potasio. Conforme mostrado, el voltaje alcanzó un estado estacionario dentro de aproximadamente 0.2 segundos, que es un tiempo de respuesta mas rápido (es decir intercambio de solución) que el disponible usando sistemas y métodos del estado de la técnica anterior diseñados para detección .

EJEMPLO 4 Las Figuras 10A-10B ilustran una gráfica mostrando mediciones de corriente de canal iónico obtenidas usando una modalidad de la invención. En este ejemplo, una célula fue sujeta a una pipeta de cuerdo con el método mostrado en las Figuras 2A-2C. En la Figura 10A, registros representativos son mostrados para corrientes iónicas obtenidas a partir de células HEK293 expresando establemente canales hERG. Células fueron mantenidas a -80 Vm. Corrientes salientes de potasio fueron suscitadas por voltajes de prueba larga de 1 seg que iban de -60 a 80 Vm en pasos de 20 Vm seguido de pulso hiperpolarizador de 1 seg a -100 Vm. EL intervalo de tiempo de barrido a barrido fue de 10 segundos. En la Figura 10B, una curva G/Gmax (conductancia/máxima conductancia) es mostrada para canales hERG. Los datos representan media ±SD, donde el número de mediciones de muestra es 7.

EJEMPLO 5 Las Figuras 11A-11B ilustran una gráfica que muestra corrientes iónicas obtenidas de células HEK293 expresando establemente canales hERG. En este ejemplo, una célula fue sujeta a una pipeta de acuerdo con el método mostrado en las Figuras 2A-2C. En la Figura 11A, son mostrados vestigios de corriente. En la Figura 11B, es mostrada una curva correspondiente corriente-voltaje de corriente de cola. En la obtención de estas mediciones, la célula fue mantenida a -80 Vm. Corrientes salientes de potasio fueron suscitadas por voltajes de prueba larga de 1 seg a +40 Vm seguidos de pulso hiperpolarizador de 2 seg que iban de entre -100 Vm y -20 Vm en pasos de 10 Vm. El intervalo de tiempo de barrido a barrido para estas mediciones fue de 10 segundos.

EJEMPLO 6 Las Figuras 12A-12B ilustran una gráfica mostrando el efecto de E4031 sobre corriente de potasio en células HEK293 expresando establemente canales hERG. En este ejemplo, una célula fue sujeta a una pipeta de acuerdo con el método mostrado en las Figuras 2A-2C. En la Figura 12A, son mostrados vestigios de corriente para una célula de control. En la Figura 12B, vestigios de corriente son mostrados para una célula después de la aplicación de solución de 5 micromoles de E4031. La célula fue mantenida a -80 Vm. Corrientes salientes de potasio fueron suscitadas por voltajes de prueba larga de 1 seg a +40 Vm seguidos de pulsos hiperpolarizadores de 2 seg de duración a -100 Vm aplicados a 0.1 Hz.

EJEMPLO 7 Los datos pueden también ser obtenidos por un experto en la técnica a partir de canales accionados por ligando con métodos similares a los vistos anteriormente. Concentraciones de ligando suficientes para abrir los canales en estudio, pueden ser añadidas a una cavidad, y por la inserción de una célula en una cavidad, corrientes iónicas son obtenidas. Vestigios de datos pueden parecer muy similares a aquellos del Ejemplo 3 para un canal con cinéticos de accionamiento rápido. Esta técnica podría ser aplicable a cualquier canal accionado por ligando, incluyendo canales sensibles a glutamato, GABA, y acetilcolina . Se entenderá que las modalidades especificas de la invención mostradas y descritas en la presente son apenas a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios, sustituciones y equivalentes se les ocurrirán a los expertos en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. En particular, los términos usados en esta solicitud deben ser leídos de manera amplia a la luz de términos similares utilizados en las solicitudes relacionadas. Adicionalmente, debe ser reconocido que esta dentro de la experiencia de un experto en la técnica el usar varias características de una modalidad descrita con las características de otra modalidad. Por consiguiente, se pretende que el asunto descrito en la presente y mostrado en los dibujos acompañantes sean considerados apenas como ilustrativos y no en un sentido limitador y que el alcance de la invención sea solamente determinado por las reivindicaciones anexadas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. - Un sistema que comprende una cámara de interfaz, caracterizado porque la referida cámara de interfaz presenta un baño de interfaz capaz de suspender una célula.
2. 2. - El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una pipeta que comprende un electrodo acoplado a una célula.
3. 3. - El sistema de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la referida cámara de interfaz es un electrodo.
4. 4. - Un sistema de interfaz, que comprende una cámara de interfaz, caracterizado porque una célula es acoplada a un capilar en una interfaz de giga-sello, y donde la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizarse a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo adecuada para suspender un líquido.
5. 5. - El sistema de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la micropipeta comprende un electrodo.
6. 6. - El sistema de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la referida cámara de interfaz es un electrodo.
7. 7 . - El sistema de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque la barra esta acoplada a la referida cámara de interfaz.
8. 8. - El sistema de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque la referida cámara de interfaz es sustancialmente cilindrica en forma.
9. 9 . - El sistema de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque la referida cámara de interfaz es una bobina.
10. 10 . - El sistema conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque la referida cámara de interfaz es apropiada para suspender un liquido que tiene un volumen no superior a 100 ul .
11. 11 . - El sistema de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque la célula es una célula de mamífero.
12. 12 . - El sistema de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado porque comprende un dispositivo para medir por lo menos la corriente y el voltaje entre los electrodos.
13. 13 . - El sistema de conformidad con la reivindicación 12 , caracterizado porque comprende un medio de registro para registrar por lo menos el voltaje o la corriente medidos por al menos, un electrodo de cámara de interfaz o un electrodo de capilar.
14. 14. - Un sistema pinzamiento zonal de membrana, caracterizado porque comprende: a) un capilar que comprende un electrodo; b) una célula acoplada a un capilar de una manera suficiente para formar un giga-sello entre el capilar y la membrana celular de la referida célula; c) una cámara de interfaz que comprende un electrodo, donde la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizarse a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo apropiadamente conformada para contener y suspender un líquido; d) un dispositivo para medir por lo menos la corriente o el voltaje entre los electrodos; y e) una placa que comprende una serie de depósitos, en la cual por lo menos un depósito comprende un compuesto de prueba.
15. 15. - Un método de medición de las propiedades de una célula, caracterizado porque comprende: a) colocar una célula en una cámara de interfaz, donde la referida cámara de interfaz suspende a la célula en un baño de interfaz, y donde la célula es fijada a un capilar; y b) medir una o más propiedades de la célula.
16. 16. - Un método de medición de propiedades de una célula, caracterizado porque comprende: a) colocar una célula en una cámara de interfaz, donde la célula es fijada a un capilar a través de un giga-sello, y donde la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizar a través de la cámara de interfaz; y b) medir una o más propiedades de la célula.
17. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la referida cámara de interfaz es un electrodo .
18. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el referido electrodo de cámara de interfaz y el electrodo de micropipeta están configurados para medir corriente a través de la membrana de la célula.
19. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la referida cámara de interfaz está acoplada a una barra, que comprende además el uso de la barra para mover la cámara de interfaz a lo largo del eje del capilar.
20. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero.
21. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque además comprende: a) transferir el sistema de interfaz hacia un depósito, donde el depósito comprende una solución de compuesto de prueba; y b) medir la corriente eléctrica que fluye a través de la membrana celular .
22. 22 . - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque la solución de compuesto de prueba tiene un volumen de menos de 350 ul .
23. 23 . - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque el depósito es uno de una serie de depósitos dispuestos en una placa.
24. 24 . - El método de conformidad con la reivindicación 23 , caracterizado porque la referida pluralidad de depósitos contiene uno o más compuestos de prueba diferentes.
25. 25 . - El método de conformidad con la reivindicación 24 , caracterizado porque comprende además, la repetición de los pasos de transferencia y medición para la referida pluralidad de depósitos, donde el sistema de interfaz es transferido hacia un depósito diferente antes de cada paso de medición .
26. 26 . - El método de conformidad con la reivindicación 25 , caracterizado porque el referido sistema de interfaz es lavado antes de por lo menos un paso de transferencia.
27. 27 . - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque uno o más pasos son automatizados.
28. 28 . - El método de conformidad con la reivindicación 16 , caracterizado porque además comprende la medición de corriente a través de uno o más canales accionados por ligandos en la membrana celular.
29. 29 . - El método de conformidad con la reivindicación 28 , caracterizado porque el canal accionado por ligandos es sensible a un compuesto seleccionado de un grupo consistente de glutamato, GABA, y acetilcolina .
30. 30 . - El método de conformidad con la reivindicación 16 , caracterizado porque comprende además la medición de corriente a través de uno o más canales accionados por voltaje en la membrana celular.
31. 31 . - Un método de medición de las propiedades de una célula, caracterizado porque comprende: a) establecer un sistema de interfaz, que comprende una cámara de interfaz, donde una célula es fijada a un capilar de una manera suficiente para formar un sello entre el capilar y la célula, y donde la referida cámara de interfaz y capilar son relativamente móviles de manera que el capilar puede deslizar a través de la cámara de interfaz, la referida cámara de interfaz siendo apropiadamente conformada para contener y suspender un líquido; b) establecer un medio para medir por lo menos la corriente y el voltaje entre los referidos electrodos; c) transferir el sistema de interfaz hacia un primer depósito que comprende un compuesto de prueba; y d) medir la corriente eléctrica que fluye a través de la membrana celular.
32. 32 . - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado porque comprende además, la repetición de los pasos de transferencia y medición para uno o más depósitos diferentes, donde el sistema de interfaz es transferido hacia un depósito diferente antes de cada paso de medición.
33. 33 . - El método de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizado porque la capacitancia no-compensada del electrodo capilar permanece sustancialmente igual durante el periodo de tiempo cuando la cámara de interfaz es transferida de un depósito a otro depósito.
34. 34 . - Un método para adherir una célula a un capilar, caracterizado porque comprende: a) aplicar presión positiva dentro del capilar; b) insertar el capilar en una densa capa de células, donde el capilar es insertado a una profundidad apropiada para fijar una célula al capilar sin romper la punta del capilar; y c) disminuir la presión dentro del capilar para formar un giga-sello entre el capilar y la célula.
35. 35 . - El método de conformidad con la reivindicación 34 , caracterizado porque además comprende: a) retirar el capilar de la capa de células; y b) disminuir adicionalmente la presión dentro del capilar para establecer una configuración de célula completa para la célula.
36. 36.- Un método para adherir una célula a un capilar, caracterizado porque comprende: a) aplicar presión positiva de cerca de 900-1000 mm Hg (absoluta) dentro del capilar; b) insertar el capilar en una densa capa de células ; c) disminuir la presión dentro del capilar hasta cerca de 700 mm Hg para formar un giga-sello entre el capilar y una célula. d) retirar el capilar de la capa de células; y e) disminuir adicionalmente la presión dentro del capilar hasta cerca de 600-650 mm Hg para establecer una configuración de célula completa para la célula.
37. 37.- Un método de medición de las propiedades de una célula, caracterizado porque comprende: a) colocar una célula en una cámara de interfaz, donde la referida cámara de interfaz suspende a la célula en un baño de interfaz en la cámara de interfaz, y donde la célula es fijada a un capilar de conformidad con el método de las reivindicaciones 34 o 35; y b) medir una o más propiedades de la célula.