MXPA06012282A

MXPA06012282A - Nanoparticulas compuestas activas por espectroscopia mejoradas en la superficie.

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Publication number: MXPA06012282A
Application number: MXPA06012282A
Authority: MX
Inventors: Michael J Natan; Sharron Gaynor Penn; Griffith R Freeman; Gabriela S Chakarova; William E Doering; Ian D Walton
Original assignee: Oxonica Inc
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2005-04-25
Publication date: 2007-04-30
Also published as: EP3656735A1; SG152259A1; CA2563694C; EP1749122A4; DK1749122T3; CN101019019A; CA2563694A1; EP1749122B1; WO2006073439A2; ES2752457T3; PL1749122T3; WO2006073439A3; EP1749122A2; SG185328A1; AU2005323511A1; BRPI0510116B1; KR101230180B1; KR20120058630A; KR20070064553A; BRPI0510116A

Abstract

Se describen particulas o marcas con tamano de submicras que pueden fijarse de manera covalente o no covalente a entidades de interes con el proposito de cuantificacion, ubicacion, identificacion, rastreo y diagnostico.

Description

NANOPART1CULAS COMPUESTAS ACTIVAS POR ESPECTROSCOPIA MEJORADAS EN LA SUPERFICIE CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona generalmente con partículas o marcas con tamaño de submicras que pueden fijarse de manera covalente o no covalente a entidades de interés para el propósito de cuantificación, ubicación, identificación o rastreo. Más particularmente, se relaciona con nanopartículas compuestas activas por espectroscopia mejoradas en la superficie, métodos de fabricación de las partículas y usos de las partículas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fluorescencia es un medio primario mediante el cual las biomoléculas se rastrean y cuantifican. Las marcas fluorescentes se utilizan en el secuenciamiento del ADN, los análisis de expresión del gen que utilizan microarreglos, citometría de flujo y sus variantes, RT-PCR y una multitud de otras aplicaciones. Una aplicación de especial interés y de importancia que se incrementa, es la formación de imágenes intracelulares. Los eventos de unión/desunión bimolecular se han verificado mediante transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET), en donde los cambios accionados por el evento en la distancia entre un fluoróforo y un extinguidor conducen a cambios en la intensidad de la fluorescencia. La unión covalente de los fluoróforos a los marcadores de los anticuerpos de la superficie en las células blancas sanguíneas es la base de la cítometría; de igual manera, la unión covalente de la marcas fluorescentes se ha utilizado para visualizar cualquier organelo dentro de una célula, y virtualmente cualquier proceso que experimenten las células. A pesar de sus numerosas ventajas, los fluoróforos orgánicos tienen varias limitaciones. (i) Son altamente susceptibles a fotoblanqueamiento y fotodescomposición, puesto que los estados excitados son mejores oxidantes y mejores reductores que el estado fundamental, (ii) La capa de emisión de la fluorescencia es amplia, limitando el número de marcas espectralmente ortogonales, (iii) La fluorescencia es típicamente excitada en lo visible, una región en donde las muestras biológicas exhiben fluorescencia de fondo intrínseca, (iv) Diferentes colores de fluoróforos con frecuencia tienen estructuras y propiedades químicas muy diferentes, requiriendo diferentes protocolos de unión y manejo. El desarrollo de semiconductores nanoparticulados fluorescentes (puntos cuanto), ha extendido la utilidad de las marcas de detección ópticas basadas en la fluorescencia (Chan, et al., Science 1998, 281 , 2016-18; Bruchez, et al., Science 1998, 281 , 2013-16). La descripción de Chan et al., y todas las otras patentes, publicaciones de patente y publicaciones referidas en la presente se incorporan como referencia en la presente en su totalidad. Los puntos cuanto exhiben mucho menos fotoblanqueamiento que los fluoróforos orgánicos, y en lo visible, tienen anchos de banda de emisión más estrechos. Una consecuencia de la capa de emisión más estrecha, sin embargo, es la capa de excitación más estrecha en lo visible; como resultado, se requiere luz ultravioleta para excitar múltiples marcas, lo cual es menos que lo óptimo para sistemas biológicos. Además, los anchos de banda de los puntos cuanto se incrementan considerablemente conforme las partículas emiten en lo rojo y especialmente cerca del IR, y en consecuencia, mucho menos colores están disponibles. Sin embargo, los puntos cuanto se han utilizado de manera extensa para aplicaciones de formación de imágenes intracelulares, con resultados promisorios. Los reportes recientes han utilizado puntos cuanto para rastrear la unión y la endocitosís del factor de crecimiento epidérmico y para la formación de imágenes a largo plazo de puntos cuanto que se endocitozaron o unieron a proteínas superficiales biotiniladas de células vivientes. Sin embargo, el grueso de la literatura describe procedimientos no dirigidos para el suministro celular. Un dominio de traslocación peptídica se utilizó para introducir varias relaciones de 5 colores de puntos cuanto en subconjuntos de células para producir 10 códigos únicos. Varios reportes describen el rastreo de células inyectadas en ratones después de haberse codificado por puntos cuanto, incluyendo el uso de un reactivo de lipofección y péptidos de transducción. El desarrollo de embriones Xenopus también se rastreo después de la inyección de puntos cuanto encapsulados en micelas. Desafortunadamente, los puntos cuanto endocitosados se secuestraron y no fueron capaces de participar en el marcado intracelular adicional y los puntos cuanto marcados mediante transfección y electroporación son propensos a la agregación. La microinyección permite el suministro de puntos cuanto no agregados, pero en un proceso en serie que requiere de mucha habilidad. Además, la formación de imágenes a largo plazo con luz UV puede causar la degradación de los puntos cuanto, resultando en desplazamientos espectrales y citotoxicidad. De igual manera, se ha descrito la introducción de nanopartículas metálicas en las células. Las nanopartículas metálicas mostraron ser introducidas exitosamente dentro de células vivientes en 1990, cuando se utilizó la microscopia con electrones para examinar la captación nuclear de oro coloidal microinyectado en el citoplasma. (Feldherr, et al, J Cell Biol 1990, 111 , 1-8; Feldherr, et al., J Cell Biol 1991 , 115, 933-39). La técnica avanzó utilizando la microscopia a color mejorada con video para rastrear la capacidad nuclear de selección del oro coloidal modificado con péptidos. Varios reportes han tomado ventaja de la fuerte resonancia del plasmón de nanopartículas de Ag y Au, modificándolas con moléculas biológicas para rastrear la dinámica de la membrana-proteína transportadora en las células vivientes en tiempo real. La ausencia de fotoblanqueamiento en ambas técnicas permite la formación de imágenes a largo plazo sin ninguna degradación de las partículas. En teoría, el tamaño, la forma y la composición de la partícula puede controlarse para permitir experimentos multiplexados de formación de imágenes con resonancia del plasmón, pero en la práctica, la gama de características acopladas con dificultad para hacer todas las partículas de un tamaño dado, reduce el número de colores a 2-3. La dispersión de Raman es fácilmente excitada utilizando luz monocromática en el rojo lejano o cerca de IR, energías de fotón demasiado bajas para excitar la fluorescencia de fondo inherente en las muestras biológicas. Puesto que el espectro de Raman cubre típicamente las energías vibracionales de 200-3500 cm"1, y puesto que las vibraciones individuales típicamente tienen anchos de banda muy estrechos, es decir <50 cm"1, uno podría considerar medir una docena (o más) de reporteros de manera simultánea, todos con una sola fuente de luz; sin embargo, el Raman normal es muy débil, limitando su utilidad para uso en la química bioanalítica. En SERS, las moléculas en proximidad muy estrecha a características aproximadas a nanoescala en superficies de un metal noble (oro, plata, cobre), dan lugar a incrementos de mil millones a un billón de veces [conocido como factor de mejora (EF)] en eficiencia de la dispersión. SERS también puede utilizarse para detectar moléculas absorbidas en nanopartículas metálicas individuales y se ha utilizado para demostrar la detección de una sola molécula. .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método, que comprende: causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada unida al poro; repetir la deposición de un metal; y liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar el menos dos nanopartículas metálicas libres. La presente invención también proporciona un método que comprende causar la deposición de un primer metal en el poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; causar la deposición de un segundo metal en el poro de la plantilla; causar la deposición de un tercer material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; repetir los pasos de depositar el primer metal y el segundo metal; y liberar el tercer material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro, para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres, cada una que comprende el primer metal y el segundo metal. La presente invención también proporciona un método que comprende, preparar una SACN optimizada, en donde la SACN optimizada se prepara mediante un método que comprende retirar un material unido de manera irreversible a la superficie de la partícula durante el curso de la preparación de la SACN, en donde la señal de fondo del espectro se reduce en comparación a un espectro generado por una SACN correspondiente que no está optimizada. La presente invención también proporciona un método que comprende reducir la señal de fondo en el ensayo utilizando una partícula de SACN, en donde la reducción comprende eliminar las impurezas de un componente seleccionado del grupo que consiste de la muestra a ser analizada, la partícula de SACN, y el recipiente del ensayo. La presente invención también proporciona un método que comprende preparar una pluralidad de partículas de SACN, cada una que comprende una marca Raman diferente; medir la relación de intensidad de las marcas Raman; y preparar una segunda pluralidad de partículas de SACN que tienen las intensidades de las marcas normalizadas a aquélla de la marca que tiene la intensidad más débil, por lo que se prepara una pluralidad de SACN que tienen intensidades máximas sustancialmente iguales en el espectro de Raman. En algunas modalidades, las marcas se normalizan preparando SACN con una cantidad disminuida de la marca, en donde la cantidad disminuida se define por el inverso de la relación de la intensidad de aquella marca con aquélla de la marca más débil. En otras modalidades, las marcas se normalizan preparando SACN con una cantidad incrementada de silano, en donde la cantidad incrementada se define por el inverso de la relación de intensidad de esa marca con aquélla de la marca más débil. \ La presente invención también proporciona una SACN, que comprende un núcleo de nanopartícula, una molécula reportera activa en Raman, un encapsulante de SÍO2, y un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2, y un grupo -COO". La presente invención también proporciona un método, que comprende: proporcionar una nanopartícula; asociar una molécula reportera activa en Raman con la nanopartícula; encapsular la nanopartícula con S¡O2 y modificar el SiO2 para que porte un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2, y un grupo -COO", por lo que se prepara una SACN activada. La presente invención también proporciona una SACN bioconjugada, que comprende: una nanopartícula; una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula; un encapsulante de SiO2; y una biomolécula seleccionada del grupo que consiste de una proteína y un ácido nucleico. La presente invención también proporciona un método para detectar un analito que comprende: obtener una muestra biológica; y poner en contacto la muestra con una SACN bioconjugada que comprende una biomolécula que se une al analito; y detectar el analito unido a la SACN bioconjugada. La presente invención también proporciona un método, que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un analito con al menos un compañero de unión específico al analito en una superficie de ensayo con flujo lateral para unirse al analito en la muestra; previamente, de manera simultánea o posterior al paso (a), unir al menos un compañero que se une al analito con una SACN; y detectar una señal SERS por lo que se determina la presencia del analito en la muestra por la intensidad o presencia de la señal, por lo que se determina la presencia de al menos un analito en la muestra. La presente invención también proporciona un método que comprende, proporcionar un microscopio acoplado a una cámara CCD; proporcionar una célula; poner en contacto la célula con al menos una SACN capaz de unirse de manera específica a la célula o una porción de la célula; proporcionar un dispositivo de filtración del número de onda entre la célula y la cámara; adquirir una pluralidad de conjuntos de datos; y montar los conjuntos de datos; por lo que se adquiere un perfil espacial de la SACN. La presente invención también proporciona una nanopartícula, una nanopartícula metálica; más de una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula; y un encapsulante de S1O2. La presente invención también proporciona un método que comprende: poner en contacto HAuCI con clorhidrato de hídroxilamina; además poner en contacto la solución resultante del paso a) con una mezcla de deshidrato de citrato sódico y NaBH4, por lo que se produce una nanopartícula de oro. La presente invención también proporciona un método que comprende proporcionar una nanopartícula de oro preparada mediante el método descrito previamente; asociar una molécula reportera activa en Raman con la nanopartícula; y encapsular la nanopartícula con S¡O2; por lo que se prepara la SACN. La presente invención también proporciona una nanopartícula que comprende: una nanopartícula metálica anisotrópica; una molécula reportera activa en SERS asociada con la nanopartícula metálica anisotrópica; SiO2 que encapsula ia nanopartícula metálica anisotrópica. La presente invención también proporciona un método que comprende administrar un agente para la formación de imágenes de una nanopartícula de SACN a un paciente, explorar al paciente utilizando un sistema que puede realizar formación de imágenes espectrales; y generar un espectro o imagen de una región interna del paciente. La presente invención también proporciona un método ;que comprende: introducir una pluralidad de SACN dirigidas a una molécula en una patología anormal en un paciente con la patología anormal, en donde el SACN se asocia a la molécula asociada con la patología anormal; y obtener una imagen de la SACN asociada, por lo que puede diagnosticarse una patología anormal. La presente, invención también proporciona un método para marcar a un animal con una SACN, que comprende introducir una SACN en un animal, en donde la introducción se selecciona del grupo que consiste de implantación subcutánea, introducción intravenosa. La presente invención también proporciona un método que comprende poner en contacto una muestra de tejido con al menos una partícula de SACN conjugada con una biomolécula capaz de unirse de manera específica a la muestra de tejido; y (b) adquirir una imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula. La presente invención también proporciona una nanopartícula que comprende una nanopartícula con núcleo/cubierta, al menos una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula con núcleo/cubierta, y un encapsulante de SiO2. La presente invención proporciona un método que comprende causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; repetir el paso de deposición del metal; y liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro con un tratamiento ácido para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres porosas. - BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra un espectro de Raman típico. La Fíg. 2 muestra una comparación de la SACN hecha con cinco diferentes moléculas de marca. De parte superior a la parte inferior: quinolinetiol, isotiocianato de verde dé malaquita, mercaptobenzamidazol, bis(4-piridil)etileno, Bodipy. La Fig. 3 muestra la intensidad de dispersión vs. el desplazamiento de Raman para PVDF, nitrocelulosa, y una membrana de flujo lateral. La Fig. 4' muestra la intensidad de la dispersión vs. el desplazamiento de Raman para superficies de vidrio y cuarzo. La Fig. 5 muestra una imagen TEM de nanovarillas preparadas en un método basado en solución. La Fig. 6 muestra el espectro SERS de 4-MPIBPE-SACN obtenido utilizado excitación de 633 nm (Trazo A) y excitación de 785 nm (Trazo B). La Fig. 7 muestra el espectro de Raman de BPE-SACN (línea punteada) y SACN 4 MP (línea sólida). La Fig. 8 muestra el número de moléculas de biotina unidas a las nanopartículas conjugadas con relaciones variables de NeutrAvidin™ y seroalbúmina bovina (BSA). La Fig. 9 muestra la linealidad de la SACN midiendo la señal después de la exposición de una muestra a varias cantidades de energía de excitación. La Fig. 10 muestra la señal de una muestra vs. la función del tiempo para una SACN expuesta a la luz emitida. La Fig. 11 muestra la evidencia de la reproducibilidad lote a lote para la preparación de SACN. La Fig. 12A muestra el espectro de Raman obtenido a una excitación de 633 nm de partículas de Au de 65x30 nm y 90x30 nm liberadas en QSH. La Fig. 12B muestra el espectro de Raman obtenido a una excitación de 785 nm de partículas de Au de 65x30 nm y 90x30 nm liberadas en QSH. La Fig. 13 muestra el espectro de Raman obtenido a una excitación de 633 nm de partículas de Au de 65x30 nm y 90x30 nm liberadas en MP. La Fig. 14A muestra una imagen TEM de nanovarillas de Au con un diámetro de 35 nm liberadas en ME. La Fig. 14B muestra un espectro de Raman obtenido a excitación de 633 nm, el ME reemplazado con QSH. Las Figs. 15A y B muestran imágenes SEM de SACN de Au de 250 nm x 250 nm. Las Figs. 16A y B muestran imágenes TEM de SACN de Au de 250nm x 250 nm. Las Figs. 17A y B muestran espectros de Raman de SACN de Au de 250 nm x 250 nm a excitación de 785 nm y 633 nm. La Fig. 18 muestra los resultados de un experimento de inmunoensayo emparedado con un microarreglo de proteína en el cual se tituló la lL-7. La Fig. 19 muestra los resultados de un inmunoensayo de flujo lateral para Bot tox.

La Fig. 20 muestra la intensidad de dispersión vs. el desplazamiento de. Raman a una excitación de 758 nm para sangre completa sin y con SACN. La Fig. 21 A muestra imágenes de campo brillante y SERS de células marcadas con SACN, y la Fig. 21 B muestra el espectro de Raman de puntos tratados y no tratados en un ensayo de histopatología. La Fig. 22 muestra un espectro adquirido sobre el hígado 45 minutos después de que las SACN se inyectaron en la cola del ratón. La Fig. 23 muestra un espectro adquirido después de que las SACN se inyectaron subcutáneamente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las Nanopartículas Compuestas Activas por Espectroscopia Mejoradas en la Superficie se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,514,767, titulada "Nanopartículas Compuestas Activas por Espectroscopia Mejoradas en la Superficie", la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/345,821, presentada en Enero 16, del 2003, titulada "Nanopartículas Compuestas Activas por Espectroscopia Mejoradas en la Superficie", y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/557,729, presentada en Marzo 29, del 2004, titulada "Nanopartículas Compuestas Activas por Espectroscopia Mejoradas en la Superficie", cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. La presente invención proporciona nuevos métodos para la preparación de Nanopartículas Compuestas Activas por Espectroscopia Mejoradas en la Superficie (SACN), y métodos para preparar SACN mejoradas. Tales nanopartículas comprenden cada una nanopartícula metálica activa en SES, una submonocapa, una monocapa, o multicapa de especies activas por espectroscopia en proximidad estrecha con la superficie metálica, y una cubierta encapsulante que comprende un polímero, vidrio (SiO2), o cualquier otro material dieléctrico. Esto coloca a la molécula activa por espectroscopia (referida en la presente como el "reportero") en la interfaz entre la nanopartícula metálica y el encapsulante. En una modalidad típica, la SACN comprende (i) un núcleo de nanopartícula metálica (por ejemplo, Au o Ag), (ii) un reportero activo en Raman, que proporciona una firma vibracional única, y (iii) un encapsulante de S¡O2 que "asegura" las moléculas reporteras en su lugar, mientras que también proporciona una superficie altamente compatible para la inmovilización posterior de las biomoléculas. El recubrimiento de vidrio, que es esencialmente inactivo a SERS, también estabiliza las partículas contra la agregación y evita la adsorción competitiva de especies indeseadas. En algunas modalidades, el reportero y el encapsulante se introducen al núcleo de la nanopartícula secuencialmente. En algunas modalidades, el encapsulante comprende la molécula reportera. En algunas modalidades, la SACN comprende además recubrimientos poliméricos adyacentes a la nanopartícula. El núcleo de nanopartícula puede ser cualquier nanopartícula conocida en la técnica. Como se utiliza en la presente, el término "nanopartícula", "nanoestructura", "nanocristal", "nanomarca" y "nanocomponente", se utilizan de manera indistinta para referirse a una partícula, generalmente una partícula metálica, que tiene una dimensión en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, incluyendo cualquier valor entero entre 1 nm y 1000 nm. En algunas modalidades, el núcleo de nanopartícula metálica es una partícula esférica o casi esférica de 20-200 nm de diámetro. En algunas modalidades, el intervalo es de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 50 nm, en algunas modalidades en el intervalo de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 50 nm (por ejemplo, aproximadamente 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 nm). Las nanopartículas anisotrópicas pueden tener una longitud y un ancho. En algunas modalidades, la longitud de una nanopartícula anisotrópica es la dimensión paralela a la apertura en la cual la nanopartícula se produjo. En el caso de nanopartículas anisotrópicas, en algunas modalidades, la nanopartícula tiene un diámetro (ancho) de 350 nm o menor. En otras modalidades, la nanopartícula tiene un diámetro de 250 nm o menos, y en algunas modalidades, un diámetro de 100 nm o menos. En algunas modalidades, el ancho es de entre 15 nm a 300 nm. En algunas modalidades, la nanopartícula tiene una longitud de aproximadamente 10-350 nm. Las nanopartículas pueden ser isotrópicas o anisotrópicas. Las nanopartículas incluyen nanobarras huecas o llenas de metal coloidal, nanopartículas magnéticas, paramagnéticas, conductoras o aislantes, partículas sintéticas, hidrogeles (coloides o barras), y lo similar. Se apreciará por alguien con experiencia en la técnica que ías nanopartículas pueden existir en una variedad de formas, incluyendo de manera no exclusiva, esferoides, varillas, discos, pirámides, cubos, cilindros, nanohélices, nanorresortes, nanoanillos, nanopartículas con forma de varilla, nanopartículas con forma de flecha, nanopartículas con forma de lágrima, nanopartículas con forma de tetrápodo, nanopartículas con forma de prisma y una pluralidad de otras formas geométricas y no geométricas. Otra clase de nanopartículas que se ha descrito incluye aquéllas con un área superficial interna. Estas incluyen partículas huecas y partículas porosas y semíporosas. Además, se entiende que los métodos para preparar partículas de estas formas, y en ciertos casos para preparar partículas activas a SERS de estas formas, se han descrito en la literatura. Aunque se reconoce que la forma de la partícula y la relación de aspecto pueden afectar las características físicas, ópticas y electrónicas de las nanopartículas, la forma específica, la relación de aspecto o presencia/ausencia de un área superficial interna no pesa en la calificación de una partícula como una nanopartícula. Mucha de la literatura de SERS (tanto experimental como teórica), sugiere que las partículas anisotrópicas (varillas, triángulos, prismas), pueden proporcionar una mejora- incrementada en comparación con las esferas. Por ejemplo, el llamado "efecto antena", predice que se espera que la mejora Raman sea mayor en las áreas de curvatura mayor. Muchos reportes de partículas anisotrópicas que se han descrito recientemente, incluyen prismas de Ag y partículas de Au "ramificadas". Tales partículas anisotrópicas, utilizadas como bloques de construcción para la formación de SACN, están dentro del alcance de la invención.

Las nanovarillas de Au y Ag anisotrópicas pueden producirse mediante la electrodeposición en plantillas de alúmina preformadas, de una manera similar a la producción de las partículas Nanobarcodes®. Véase, por ejemplo, Nicewarner-Peña, S. R.; Freeman, R. G.; Reiss, B. D.; He, L.; Peña, D. J.; Walton, I. D.; Cromer, R.: Keating, C. D.; Natán, M. J. "Submicrometer metallic barcodes", Science 2001, 294, 137-141.; Walton, I. D.: Norton, S. M.: Balasingham, A.; He, L.; Oviso, D. F. J.; Gupta, D.; Raju, P. A.; Natán, M. J.; Freeman, R. G. "Particles for multiplexed analysis in solution: detection and identification of striped metallic particles using optical microscopy", Anal. Chem. 2002, 74, 2240-2247. Estas partículas de nanocódigos de barras se preparan por la deposición de capas alternas de materiales, típicamente Au y Ag, en plantillas de alúmina preformadas. En una modalidad típica, las partículas de nanocódigos de barras son de aproximadamente 250 mn de diámetro y 6 mieras de largo. Para hacer > nanopartículas metálicas para utilizarse en SACN, la electrodeposición puede -llevarse a cabo en poros de diámetro más pequeño, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 10. En algunas modalidades, el diámetro del poro es menor que 100 nm y en algunas modalidades, entre 10 y 50 nm. Las plantillas de alúmina uniformes con estas dimensiones se han reportado por varios grupos de investigación. Tales plantillas están ahora comercialmente disponibles. Así, en una modalidad, la invención proporciona un método que comprende causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; causar nuevamente la deposición de un metal en el poro; y liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres. En esta modalidad, la nanopartícula segmentada unida al poro tiene la composición ABA, y tras la liberación de B y la plantilla, se producen dos partículas de A. Las deposiciones pueden repetirse para generar segmentos que tienen la composición (AB)n o A(BA)n, en donde n es cualquier entero entre 1 y 1000, y tras la liberación de la plantilla, se producen n o n+1 partículas de A. En una modalidad, las SACN preparadas mediante este métodos, son de aproximadamente 250 nm de diámetro y 250 nm de largo. Un ejemplo de este método se describe en el Ejemplo 10B. La Fig. 15A y B muestran una vista de las SACN preparadas mediante este método. Aunque estas partículas parecen tener forma de varilla, una vista más cercana, mostrada en las Figs. 16A y B, revela que tienen una forma no geométrica. Se cree que la forma no geométrica resulta de la falta de una interfaz lisa entre el metal (por ejemplo, Au) y el material a ser liberado (por ejemplo, Ag) en la preparación de las partículas. La falta de una interfaz lisa puede resultar de la interdifusión de los dos metales para formar aleaciones, y posteriormente la desaleación durante el paso de liberación. Estas partículas no geométricas son útiles para SERS, como se muestra en las Figs. 17A y B. La deposición simultánea deliberada de Au y Ag (por ejemplo, 80:20 Au:Ag), conducirá a una aleación significativa, y la disolución accionada por ácido posterior de la Ag, puede conducir a superficies altamente perforadas que exhiben un área superficial interna considerable. Al grado en que las moléculas reporteras puedan tener acceso a tales sitios interiores, experimentando por lo tanto los campos electromagnéticos elevados entre las nanocaracterísticas activas SERS, tales superficies pueden exhibir un comportamiento SERS mejorado. En algunas modalidades, la invención proporciona un método que comprende causar la deposición de un primer metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; causar la deposición de un segundo metal en el poro de la plantilla; causar la deposición de un tercer material en el poro de la. plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; repetir los pasos de causar la deposición del primer y segundo metales; y liberar el tercer material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres, cada una que comprende el primer metal y el segundo metal. En esta modalidad, la nanopartícula segmentada unida al poro tiene la composición ACBAC, y tras la liberación de B y la plantilla, se producen dos partículas de AC. Las deposiciones pueden repetirse para generar segmentos que tienen la composición (ACB)n, en donde n es cualquier entero entre 1 y 1000, y tras la liberación de la plantilla, se producen n partículas de AC. En algunas modalidades, uno de los metales es magnético. De acuerdo con algunas modalidades, el metal incluye al menos un elemento seleccionado de la Tabla Periódica de los Elementos, que se conocen comúnmente como metales. El metal puede incluir principalmente un solo elemento. De manera alterna, el metal puede ser una combinación de al menos dos elementos, tal como una aleación, por ejemplo, una aleación binaria. Los metales incluyen los metales del Grupo II (Cu, Ag y Au), o cualquier otro metal conocido por aquellos con experiencia en la técnica para soportar SERS. En otras modalidades, el metal incluye un componente adicional, tal como en una partícula de núcleo-cubierta de Au2S/Au. Las partículas de núcleo-cubierta de Au2S/Au se han reportado como que tienen una resonancia óptica cercana a IR ampliamente afínable. (Averitt, et al., Octubre 1999, JOSA B, Volumen 16, Fascículo 10, 1824-1832). De manera alterna, pueden utilizarse partículas de núcleo de Ag/cubierta de Au, tales como aquéllas descritas en J. Am. Chem. Soc. 2001 , 123, 7961 , o partículas de núcleo de Au/cubierta de Ag, o cualquier combinación de núcleo-cubierta que involucren metales activos de SERS. Otras combinaciones adecuadas para utilizarse en las partículas núcleo-cubierta, se incluyen en ;esta invención, tales como coloides de sílice-alúmina funcionalizados con nanopartículas de Au o Ag, coloides de TiO2 funcionalizados con Au o Ag, nanopartículas de Au coronadas con nanopartículas de Au (véase, por ejemplo, Mu e, et al.,-J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12674), coloides de TiO2 coronados con nanopartículas de Au, partículas que tienen un núcleo de Si con una cubierta metálica ("nanocubiertas"), tales como los coloides de SiO2 coronados con plata o coloides de SiO2 coronados con oro. (Véase, por ejemplo, Jackson, et al., 2004 Proc Nati Acad Sci USA. 101 (52): 17930-5). Pueden utilizarse nanopartículas huecas tales como nanoesferas huecas o cristales huecos en las SACN. En consecuencia, la presente invención también proporciona una nanopartícula para utilizarse en una SACN que comprende una partícula de núcleo-cubierta activa para SERS o una nanopartícula hueca activa para SERS. La señal de SERS mejorada de estas partículas, puede demostrarse fabricando lotes de estas partículas siguiendo un procedimiento en la literatura y comparando la señal SERS con las partículas metálicas descritas en el mismo. Los métodos para preparar SACN se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,514,767. Los métodos adicionales se describen en la presente, incluyendo la sección de Ejemplos. Las SACN referidas en la presente son fotoestables (no exhiben blanqueamiento de la señal), térmicamente estables, muestran linealidad de la señal, y exhiben reproducibilidad lote a lote como se explica en el Ejemplo 8. Los ejemplos de reporteros activos en Raman adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen 4-mercaptopiridina (4-MP): trans-4,4' bis(piridil)etiIeno (BPE); quinolinetiol; 4,4'-dípir¡dilo, 1 ,4-fenildiisocianuro; mercaptobenzamidazol; 4-cianopiridina; yoduro de I\3,3,3',3'-hexametilindotricarbocianina; 3,3'-dietilt¡atricarbocianina; isotiocianato de verde de malaquita; bis-(piridil)acetilenos y Bodipy. Los datos para 5 reporteros diferentes se muestran eñ la Fig. 2. Esta claro que los espectros son diferentes, y que para cada especie, hay al menos una banda que es única. Las características adicionales de los reporteros activos en Raman adecuados, se describen a continuación. En una modalidad, la invención proporciona una SACN que comprende más de un reportero. La preparación de una de tales SACN se describe en el Ejemplo 3. En una modalidad, la SACN comprende un núcleo de nanopartícula metálica, : un reportero de trans-1 ,2-b¡s(4-p¡ridil)etileno, y un reportero de 4-mercaptopiridina. Hay una señal de fondo asociada con los sustratos SERS que está típicamente ausente del Raman normal. La presente invención también proporciona métodos para la reducción de la señal de fondo de las SACN, así como SACN mejoradas que exhiben señales de fondo reducidas. En la Fig. 1 , por ejemplo, la señal de fondo a 1600 cm"1 es de -7000 conteos, mientras que la señal de S es de ~11 ,000 conteos por encima del fondo. Si las mediciones están limitadas por el ruido del disparo (N) [N = fondo1 2, la S/N = 130:1 , pero los picos restantes en el espectro son significativamente menores. La reducción del fondo por un factor de 2.25 conduciría a una mejora de 50% en S/N, lo que a su vez ayudaría a resolver las señales débiles y generalmente a mejorar la distinción de los diferentes espectros. La presente invención proporciona, por lo tanto, métodos que comprenden reducir la señal de fondo en un ensayo que utiliza una partícula de SACN, en donde la reducción comprende eliminar las impurezas fuertemente activas en SERS de un componente seleccionado del grupo que consiste de la muestra a ser analizada, la partícula de SACN, y otros amortiguadores o materiales relacionados involucrados en un ensayo. Se sabe que las impurezas en trazas (incluso aquéllas presentes en los reactivos para colocar Au coloidal), pueden adsorberse de manera irreversible en la superficie de la partícula. En consecuencia, la purificación rigurosa de todos los materiales, y especialmente el reportero utilizando ultrafiltración, HPLC, destilación, sublimación y/o recristalización, puede reducir la señal de fondo. Por ejemplo, en el caso de un inmunoensayo de flujo lateral, los sustratos comunes son PVDF (difluoruro de polivinilideno) y nitrocelulosa. Se ha encontrado que la nitrocelulosa es deseable en términos del fondo Raman por dos razones. Primero, el • PVDF exhibe alguna autofluorescencia, como se indica por la caída en el fondo después de 2 minutos de exposición continua a la fuente de excitación (láser a 785 nm, aproximadamente 200 mW de potencia en la muestra) en la Fig. 3. Aunque hay pocas características Raman en el fondo, la variabilidad de la intensidad es más difícil de tratar que con los picos pequeños. Incluso después de esta disminución, el fondo total es mayor que el obtenido de dos fuentes de nitrocelulosa separadas, ninguna de las cuales muestra cambios fotoinducidos en la emisión Raman durante iluminaciones extendidas. Un fenómeno similar se observa en la Fig. 4, que muestra que el vidrio tiene un fondo Raman débil pero mensurable cuando se excita con luz a 785 nm. El espectro de Raman se .'adquirió de portaobjetos de vidrio obtenidos de dos vendedores separados. Se utilizó un tiempo de integración de 1 segundo para cada adquisición, mientras que se utilizó un tiempo de integración 5 segundos para obtener el fondo Raman de un portaobjetos de cuarzo. El portaobjetos de cuarzo es difícilmente reconocible por encima de la línea basal, mientras que cada portaobjetos de vidrio tiene niveles mensurables de fondo. Aunque el fondo puede sustraerse del espectro, la presencia de un fondo mensurable limita los tiempos de integración y puede impedir posiblemente la detección de cantidades en trazas de los reporteros Raman. En otra ilustración de este efecto, el fondo de las partículas hechas con reactivos altamente purificados, puede compararse con aquéllos de composición idéntica hechos como reactivos "como se proporcionan". En consecuencia, la presente invención proporciona un método para la reducción de la señal de fondo en un espectro de Raman generado por la SACN, que comprende preparar una SACN optimizada, en donde la SACN optimizada comprende una molécula: reportera, y en donde la molécula reportera se purifica antes de la incorporación en la SACN optimizada, y generar un espectro de Raman con la SACN optimizada, en donde la señal de fondo del espectro se reduce en comparación con el espectro generado por una SACN correspondiente que no se ha optimizado. ; En algunas] modalidades, las SACN mejoradas de la presente invención, proporciona una señal SERS incrementada cuando se compara con SACN conocidas. Para ciertos tamaños y formas de partícula y a ciertas longitudes de onda de excitación, las partículas de Ag con frecuencia proporcionan una señal > SERS más grande que las partículas de Au. Se esperaría que la mejora :de la reproducibilidad de la síntesis del coloide de Au resultara en mejores candidatos SACN. En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para mejorar la síntesis de coloide de Au. Un ejemplo de tal método se describe en el Ejemplo 2. Este método utiliza una combinación de NaBH , citrato de Na3, y NH2OH para la reducción del metal. El método mejorado es más fácil y resulta en partículas más monodíspersas cuando se compara con otros métodos (tal como la síntesis tradicional de Au coloidal utilizando sólo citrato como el reductor). En otra modalidad, una nanopartícula para utilizarse en una SACN, se prepara mediante un método que comprende depositar un recubrimiento de submonocapa en la superficie de Ag en la superficie de una nanopartícula de Au, como en Freeman, et al., Journal of Physical Chemistry (1996), 100(2), 718-24. Se espera que una SACN que incluya tal nanopartícula recubierta pueda utilizarse para incrementar la señal SERS de nanopartículas esféricas por aproximadamente dos veces. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para optimizar la carga del reportero y el recubrimiento de S¡O2 en las SACN. Para cada reportero incorporado exitosamente en la SACN, es deseable determinar las condiciones bajo las cuales la máxima cantidad de reportero está presente en la superficie metálica antes de que se termine la cubierta de S¡O2. En algunas modalidades, se preparan SACN con moléculas precursoras de SiO2 qué también pueden proporcionar la porción de la marca Raman. Este método debe ayudar a incrementar la señal SERS de la SACN. Por ejemplo, el 4-propilpiridinatrimetoxisilano puede proporcionar el reportero Raman (el grupo piridilo) y actuar como un precursor de SÍO2 a través del trimetoxisilano. Debido 'a que el precursor de SÍO2 y la marca tendrán que competir por el espacio en la partícula de Au, debe alcanzarse una cobertura superficial más alta de la marca. Los silanos comercialmente disponibles, por ejemplo, son una fuente fácil de silanos que pueden aplicarse como reporteros/precursores unimoleculares. Los ejemplos de silanos incluyen 3-(2,4-dinitrofeniIamino)propiltrietoxisilano, 2-cianoetiltrimetoxisilano, y p-aminofeniltrimetoxisilano,?n-(3-trietoxisililpropil)-4,5-dihidroimidazol. En otra modalidad, una nanopartícula se recubre con un polímero activo en Raman, tal como un copolímero de poliestireno adecuado, un poliacetileno o un politiofeno. Tales polímeros pueden contener de manera conveniente grupos reactivos, tales como aminas o tioles para facilitar la bioconjugación (véase a. continuación) o para la unión de los precursores de S¡O2.

Con el fin de generar SACN de un diámetro mínimo, el espesor de SiO2 puede reducirse. En las modalidades típicas, el espesor de la cubierta de Si?2 varía de 1-40 nm. En algunas modalidades, el encapsulante de SiO2 es de 5-15 nm de espesor. Aunque en teoría es posible hacer la cubierta de SiO2 de cualquier espesor arbitrario, esto puede hacerse a expensas de mantener la integridad del recubrimiento. En algunas modalidades, es importante que la cubierta de SÍO2 (i) proteja el núcleo metálico y las moléculas de marca de Raman del ataque; (ii) evita la adsorción de interferentes espectrales potenciales en la superficie metálica; (iii) proporciona una superficie de SÍO2 para la biofuncionalizacíón y/o (iv) evita la agregación inducida por las fuerzas de Van der Waals entre los núcleos metálicos. Las SACN con intensidad de señal mejoradas en comparación con las SACN basadas en nanopartículas esféricas, pueden prepararse utilizando nanovarillas de Au o Ag de un solo cristal. Las condiciones de electrodeposición (sobrepotencial, temperatura, aditivos, etc.), determinan la estructura de las nanovarillas que, a su vez, determinan las propiedades físicas y mecánicas de las nanovarillas. La señal SERS de las nanovarillas puede potencialmente incrementarse de manera significativa si son de un solo cristal. Se sabe generalmente que el • mecanismo de nucleación/crecimiento epitaxial, bidimensional (2D), requiere la electrodeposición a un sobrepotencial muy bajo. Recientemente, la electrodeposíción de nanoalambres de Cu, Ag y Au de un solo cristal se logró con una concentración iónica del metal reducida, bajo sobrepotencial, temperatura elevada y adición de tensoactivo a la solución de deposición. Wang, et al.,:J. Phys. Chem. B 2004, 108, 841-845; Tian, et al., Nano Lett. 2003, 3, 919-923. : Las plantillas comercialmente disponibles con diámetros de poro de 18 nm y 35 nm pueden utilizarse para sintetizar nanovarillas metálicas de un solo cristal, incluyendo nanovarillas de Au, con longitudes entre 50 y 100 nm. Ag evaporada con una orientación de crecimiento (111) y un espesor de 200 nm puede utilizarse como un: sustrato. La electrodeposición puede realizarse en un modo potenciostático, utilizando un electrodo de referencia para controlar de manera precisa el sobrepotencial durante la deposición. Las condiciones significativas, tales como la composición de la solución y la temperatura, pueden evaluarse para lograr una nucleación y crecimiento epitaxial, 2D, lenta, de las nanovarillas de Au. La TEM de alta resolución revelará la estructura de las nanovarillas y la difracción con rayos X puede utilizarse para determinar la orientación del cristal. Para hacer mejor uso de las plantillas, múltiples partículas por poro pueden fabricarse mediante la deposición secuencial de las nanovarillas de Au separadas por delgados segmentos de Ag (10-20 nm) con la misma orientación (111). En teoría, sería posible llenar completamente un poro utilizando este método. Puesto que las platillas son típicamente de 50-60 µm de espesor, sería posible preparar más de 400 partículas de 100 nm de longitud por poro. La misma técnica de electrodeposición (potenciostática), puede aplicarse para la síntesis de nanovarillas de Ag utilizando un sustrato de Cu (111) como la base de deposición grabable de manera selectiva. Como un método alterno (y posiblemente menos caro), pueden prepararse nanovarillas de Au utilizando o adaptando el método basado en solución reportado por Nikoobakht y El-Sayed. Nikoobakht, B. y El-Sayed, M. A. "Preparation and growth rhechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method", Client. Mater. 2003, 15, 1957-1962. Una imagen TEM de nanovarillas preparadas en un método basado en solución, se muestra en la Fig. 5. En esta muestra, la nanovarilla promedio es de aproximadamente 10 nm x 50 nm de tamaño, pero hay una variación considerable en el tamaño y forma de la partícula, como se observa por la formación de nanocubos. Los métodos basados en solución se escalan fácilmente a volúmenes más grandes. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para la reducción de la señal de fondo en un espectro de Raman generado por las SACN, que comprende preparar una SACN optimizada, en donde la SACN optimizada se prepara mediante un método que comprende eliminar el material unido de manera irreversible a la superficie de la partícula durante el curso de preparación de la SACN,' en donde la señal de fondo del espectro se reduce en comparación a un espectro generado por una SACN correspondiente que no está optimizada. En una modalidad, la eliminación se logra mediante la oxidación vigorosa del intermediario de SACN seguido por una reducción leve. La eliminación puede comprender el tratamiento de la nanopartícula metálica con un oxidante, tal como una combinación de radicales de ozono/oxígeno generados por UV, seguido por el tratamiento con un reductor, tal como etanol, para eliminar lo orgánicos exógenos. Un ejemplo de limpieza de una superficie metálica activa a SERS se describe en: Ron, et al., Langmuir 1998, 14, 1116-1121. En una modalidad, el the metal es Au. En el curso del método, la superficie de Au se convierte al óxido de oro inestable, y posteriormente se reduce con metanol. En otra modalidad, el método comprende el tratamiento del metal con una combinación de radicales de ozono/oxígeno generados por UV (el oxidante), seguido por el tratamiento con una solución del reportero en etanol, de manera que la adsorción del reportero puede ocurrir inmediatamente tras la reducción. En otras modalidades, el etanol se elimina mediante centrifugación, y el reportero se agrega en un paso adicional. En algunos casos, las especies que contribuyen al ruido de fondo se introducen. Por ejemplo, se han encontrado ciertas membranas utilizadas para la filtración y preparación de las muestras para introducir un fondo en un espectro de Raman de. ensayos que involucran partículas de SACN. En consecuencia, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la señal de fondo en un espectro de Raman de una partícula de SACN, que comprende preparar una muestra para el análisis, la preparación comprende eliminar las especies de la muestra o el sistema de ensayo que contribuyen a una señal- de fondo. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir una señal de fondo en un espectro de Raman de una partícula de SACN, que comprende eliminar las especies de los componentes del ensayo que contribuyen a una señal de fondo.

USOS DE LAS SACN El descubrimiento de nuevos fármacos que utilizan sistemas múltiplex de alto rendimiento, es un área de investigación activa. La química automatizada y combinatoria puede producir millones de nuevas estructuras. Los análisis de estos fármacos requieren alto rendimiento y detección altamente múltiplex. El uso de la tecnología SACN proporciona un procedimiento altamente multiplexado. La espectroscopia Raman es ideal para proporcionar la capacidad múltiplex de las marcas, debido a la nitidez de los picos Raman, y SERS ofrece muchas oportunidades de marcado únicas. En algunas modalidades, los ensayos multiplexados pueden realizarse utilizando un número de SACN que puede incluir tanto una molécula activa en Raman como una o más porciones. Las porciones pueden ser capaces de unirse de manera selectiva a una o más sustancias detectables dentro de un fluido de muestra, mientras que las moléculas reporteras pueden utilizarse para identificar la SACN dentro del fluido (y por lo tanto la porción asociada). Puesto que las SACN individuales son relativamente pequeñas, y como el número de objetivos que pueden identificarse de manera independiente puede ser potencialmente bastante grande, pueden realizarse grandes números de ensayos individuales dentro de una sola muestra de fluido, incluyendo un gran número de SACN diferentes. Un espectro de Raman típico abarca más de 3000 cm"1. Véase la Fig. 1. En una modalidad, una región relativamente estrecha del espectro se enfoca generando una pluralidad de diferentes SACN que comprenden moléculas reporteras relacionadas estructuralmente. Por ejemplo, un conjunto de moléculas reporteras relacionadas estructuralmente puede incluir piridina, pirid¡na-d5 (piridina deuterada), y piridina-15N, 4-(met¡lam¡no)piridina, 4-aminopíridína, 4-mercaptopiridina, 4-piridinmetanol, 4-hídroxipiridina y 2,3,5-trimetilpiridina. Debido a que el espectro de Raman se basa en modos de vibración, pequeños cambios en la estructura química pueden proporcionar bandas Raman únicas. Por lo tanto, una sola estructura activa en SERS, por ejemplo, una nanopartícula, se modifica con una pluralidad de reporteros relacionados estructuralmente, para producir una pluralidad de SACN, cada una de las cuales tiene un espectro SERS único, pero reactividad química similar. Este procedimiento puede requerir una resolución espectral muy alta, y por lo tanto, monocromadores potencialmente grandes y/o caros.

En otra modalidad, se utiliza el espectro completo (más que una pequeña región del mismo). En esta modalidad, una pluralidad de SACN se prepara, que colectivamente tiene bandas vibracionales ampliamente separadas. En algunas modalidades, un programa de computadora puede utilizarse de manera conveniente para hacer la selección de un grupo dado de SACN o reporteros, cada uno que tiene ciertas características espectrales. En una modalidad, el programa de computadora puede diseñarse para seleccionar una pluralidad de SACN o reporteros basados en un criterio de separación espectral especificado por el usuario. De manera alterna, el programa de computadora puede diseñarse para generar una SACN posible o conjuntos de reporteros de acuerdo con la magnitud de separación espectral. No se esperaría que una sola clase de moléculas reporteras exhibirá bandas vibracionales sobre toda la ventana espectral, y por lo tanto, en esta modalidad, una variedad de moléculas se utilizan como reporteros. La selección de las moléculas puede hacerse guiándose en los siguientes cuatro criterios: 1. El reportero tiene modos vibracionales activos en Raman, es decir, modos que causan un cambio en la polarizabilidad durante la vibración. 2. El reportero se adsorbe a cualquier superficie activa de SERS, es decir, AGads «.0. 3. El reportero tiene tan pocas bandas como sea posible, para maximizar el "espacio espectral" libre. Las moléculas no lineales con átomos de N exhiben vibraciones permitidas 3N-6 (IR + Raman). Claramente, las moléculas más pequeñas son útiles, aunque es necesario equilibrar N con AGaCis, que típicamente es más negativa para moléculas más grandes. 4. El reportero es compatible con el medio acuoso de la síntesis de la partícula y los protocolos de coronación, así como la química de formación del vidrio misma. Una gran cantidad de información tabulada está disponible sobre espectros de Raman de :varias moléculas. Véase, por ejemplo, Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds; 4a Ed., John Wiley & Sons, Inc: New York; 1986; Lín-View, D.; Colthup, N. B.; Feld, M. S.; Grasselli, J. G. The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules; Academic Press: San Diego, CA; 1991 ; Sócrates. G. Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies; Tabla y Gráficas; 3a Ed., John Wiley & Sons, Ltd: Chichester; 2001 ; Workman, J., Jr. Handbook of Organic Compounds; NIR, IR, Raman, and UV-Vis Spectra Featuring Polymers and Surfactants; Academic Press: San Diego, CA: 2001; Vol. 3; Schrader, B. Raman/infrared Atlas of Organic Compounds; 2a Ed., VCH Publishers: New York, NY; 1989; Hendra, P. J. y Agbenyega, J. K. The Raman Spectra of Polymers; John Wiley & Sons Ltd.: Chichester; 1993, todas incorporadas aquí como referencia. Utilizando los criterios expuestos anteriormente, las siguientes clases de reporteros candidatos, se han identificado como útiles para moléculas reporteras para las SACN. Moléculas orgánicas: tamaño pequeño, insaturación, heteroátomos y sustituyentes electronegativos conducen todos a características únicas. Los ejemplos con características Raman conocidas: piridinas, triacinas, pirimidinas, pirróles, oxazoles, ¡midazoles, furanos, cianidas, cianamidas y sus derivados (es decir, 2-, 3-, 4-funcionalizádos). Acetilenos, nitro/nitroso, -CCI2 y -CCI3, dan todos bandas características únicas. Los ¡socianatos (R-N=C=S) y las isocianídas (R-N=C) son particularmente atractivas, puesto que son dispersadotes Raman fuertes, se adsorben a Au, tienen vibraciones a energías no compartidas por ningún grupo funcional común, y los espectros vibracionales dependen fuertemente de la electronegatividad del grupo R. Aniones orgánicos/inorgánicos: los espectros extremadamente simples (con frecuencia de un solo pico), son una gran ganancia. Los ejemplos de reporteros que dan espectros simples incluyen cianuro, SCN", CIO3", HCO2" y otros. Algunos de estos pueden incluirse al momento de la síntesis de la partícula metálica. Por ejemplo, el Au coloidal tiene CI" residual unido estrechamente que surge del HAuCI . Es posible iniciar con otras sales metálicas, especialmente si se utilizan fuertes agentes reductores tales como NaBH4. Complejos de coordinación y otros compuestos que contienen metales de transición: el enlace metal-ligando es una oportunidad excelente para generar características vibracionales a desplazamientos Raman más bajos, es decir, 200-800 cm"1. De igual manera, las vibraciones basadas en el ligando mismas, se desplazan con relación al estado no complejado, y en donde es posible, el cambio del estado rédox del metal, mueve las energías de ambas bandas. Lo ligandos ambidentados como SCN" son particularmente atractivos, puesto que pueden unir un ion metálico y la superficie metálica. En otra modalidad, pueden utilizarse los complejos que tienen uno o más ligandos fuertemente activos en SERS (por ejemplo, cianuro en [Fe(CN)63"] o [Fe(CN)64*]) o 2,2'-bipiridina (bipy) en [Ru(bipy)32+]). De manera alterna, las especies organometálicas, es decir, aquéllas con uno o más enlaces de metal-carbono (por ejemplo, ferroceno), pueden exhibir espectro de Raman intensos. Especies valentes mezcladas: El azul de Prusia y el WO3 son ejemplos de materiales cuyos espectros vibracionales cambian como una función del estado rédox del ion metálico. Lo último es particularmente interesante puesto que la intercalación de H+ (es decir, para hacer HxW?3), D+ o Li+ permite la afinación continua. Isótopos: El -cambiar la masa reducida de un modo vibracional es un excelente procedimiento para desplazar su energía, y esto es fácilmente disponible a través de la sustitución isotópica. Por ejemplo, BPE deuterado, 4,4'-dipiridilo deuterado y bis-(pirid¡l)acet¡lenos deuterados, así como piridina, piridina-d5 (piridina deuterada) y piridina-15N. La independencia espectral puede valorarse de manera independiente utilizando un programa de desconvolución espectral, que combina la sustracción del fondo y la detección del pico, junto con métodos tales como Mínimos Cuadrados clásicos directos. El uso de tal programa permite la evaluación de las moléculas reporteras candidatas contra otros reporteros candidatos. Tal programa permite la introducción de los espectros puros de los reporteros y produce un resultado que cuantifica cada componente en mezclas. Una vez que un reportero se ha seleccionado, la intensidad de la señal de las SACN puede normalizarse, resultando así en SACN con señales iguales por número de partículas. Esta capacidad, que no es posible con fluoróforos moleculares, asegura el intervalo dinámico máximo posible para una medición dada. En una modalidad, el proceso de normalización comprende dos pasos. En el primer paso, se miden las relaciones de la intensidad de la característica identificante para los reporteros. En el segundo paso, las SACN que comprenden una cantidad disminuida de un reportero, definida por el inverso de su relación de intensidad con aquélla del reportero más débil, se preparan, con la excepción de la SACN que comprende la señal con la intensidad más baja. Este método supone una adsorción lineal a bajas concentraciones del reportero, que se observa de manera rutinaria para una gama de reporteros (véase también el Ejemplo 8). En otra modalidad, la normalización de la adsorción del reportero puede lograrse incrementando la cantidad del precursor de SÍO2 (silano) en la superficie de la nanopartícula durante la síntesis de la SACN, reduciendo por lo tanto la adsorción del reportero. Estos métodos resultan en una pluralidad de SACN que tienen intensidades del pico sustancialmente iguales. Como se utiliza en la presente, en algunas modalidades, sustancialmente igual se refiere a intensidades del pico que están dentro del 10% unas de las otras. En otras modalidades, sustancialmente igual se refiere a las intensidades del pico que están dentro del 5% unas de las otras, y en aún otras modalidades, sustancialmente igual se refiere a intensidades que están dentro de 1 % unas de las otras. La presente invención comprende SACN que comprenden un grupo reactivo en la parte accesible al solvente de la partícula, tal como un grupo -SH, un grupo -NH2 o un grupo -COO". En algunas modalidades, el grupo reactivo está asociado con el encapsulante. La presente invención proporciona métodos para preparar SACN bióconjugadas, incluyendo la preparación de SACN que comprenden un grupo reactivo, tal como SACN activas en tiol para la bioconjugación. En las modalidades en donde las SACN están encapsuladas con S¡O2, los grupos silanol de la superficie pueden derivarse. La cubierta de sílice de las SACN puede funcionalizarse para portar grupos sulfhidrilo libres ya sea durante el curso de la fabricación de la cubierta de SÍO2 ("modificación directa") o después de que la cubierta se ha formado completamente ("postmodificación"). Muchas reacciones para la modificación de los grupos silanol se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, la superficie del SiO2 puede modificarse para presentar aminas, (mediante la reacción con aminopropil trimetoxisilano (APTMS)) o etóxidos de (3-glicidiloxipropil-trimetoxisilano (GPTMS)). También existen reactivos para incorporar sulfhidrilos, carboxilo y otros sitios potenciales para la conjugación. La preparación de las SACN activas en tiol se describe en el Ejemplo 4. Las SACN activas en tiol son útiles para la preparación de SACN conjugadas a las biomoléculas, por ejemplo, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Para la unión a anticuerpos, puede utilizarse APTMS para obtener grupos amina, la química de la carbodiimida posterior para unir los anticuerpos. De manera alterna, pueden utilizarse GPTMS para producir una superficie del etóxido con la cual las aminas en los anticuerpos reaccionarán directamente. En otras modalidades, los silanos terminados en grupos alquilhaluro, haloacetilo y bencilhaluro pueden utilizarse para la reacción con los grupos cisteína en las proteínas. La preparación de una SACN bioconjugada se describe en el Ejemplo 5. La limpieza y la presencia de iones en una superficie de vidrio pueden tener influencia en el éxito de la derivación. En algunas modalidades, las SACN como se producen directamente, pueden utilizarse como se describe en la presente. Sin embargo, en otras modalidades, pueden obtenerse mejores resultados después de que la superficie de S¡O2 se "limpia" o modifica, incluyendo reacciones con ácidos o bases. Para cada método desarrollado, los agentes de derivación (por ejemplo, silanos) y la biómolécula pueden titularse con el fin de controlar los niveles de derivación. Pueden utilizarse anticuerpos marcados de manera fluorescente, incluyendo muchos de aquéllos disponibles comercialmente, para cuantificar la cantidad de material presente en la superficie. Esto puede verificarse puesto que las variables se optimizan. Para determinar si la biomolécula permanece : reactiva, los compañeros de unión a la molécula, marcados con un tinte fluorescente, pueden mezclarse con las partículas, utilizando las partículas no recubiertas como un control. Por ejemplo, las SACN recubiertas con estreptavidina pueden mezclarse con biotina marcada con un tinte fluorescente. Las partículas resultantes pueden centrifugarse, el 5 sobrenadarse eliminarse y la fluorescencia de las partículas medirse. En algunas modalidades, las biomoléculas se unen a reporteros activados con tiol utilizando el reticulador heterobifuncional 4-[N- maleimidometil]ciclohexan-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC). Esta molécula contiene tanto un grupo maleimida que es reactivo hacia los sulfhidrilos 0 . como un sulfo-NHS éster, que reacciona de manera preferencial con las aminas primarias. En este caso, puede utilizarse una reacción simple en un solo recipiente para unir la estreptavidina, y es fácilmente adaptable para la unión de la mayoría de las proteínas, oligonucleótidos terminados en amina u otras moléculas que portan las aminas primarias. 5 Las SACN con funcionalidad amina en la superficie pueden tratarse con anhídrido succínico, .que reacciona con las aminas primarias para dejar un carboxilato libre. Puede utilizarse una carbodiimida para enlazarse a las aminas en las biomoléculas, tales como la estreptavidina. Las partículas recubiertas con amina también pueden enlazarse a las aminas en la biomolécula utilizando un 0 enlazante tal como glutaraldehído. Una opción alterna es primero convertir una porción de las aminas de la proteína a sulfhidrilos utilizando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) y posteriormente enlazar a las partículas utilizando sulfo- SMCC. Las SACN bioconjugadas pueden purificarse, en parte con el 5 propósito de reducir la unión no específica. En el caso de una SACN conjugada a un anticuerpo, el anticuerpo libre competirá con la SACN por los antígenos, reduciendo la sensibilidad. En una modalidad, las SACN son purificadas mediante centrifugación, incluyendo más de una centrifugación. La eficiencia de la purificación puede determinarse espectroscópicamente adulterando las o proteínas marcadas de manera fluorescente. Debido a que se sabe que los tintes fluorescentes pueden ¡nteractuar con las superficies de vidrio, puede ser necesario confirmar los resultados con proteínas marcadas radiactivamente. Puede utilizarse un dispositivo de filtración de flujo tangencial para la purificación de las partículas recubiertas con sílice, así como para la purificación de las SACN conjugadas. Es deseable eliminar o reducir la unión no específica (NSB) de las SACN. Las SACN pueden probarse en portaobjetos de vidrio, placas de micropozos y superficies de células fijas. El nivel al cual cada uno de los diferentes protocolos de conjugación y la cobertura de la superficie afecta la NSB puede identificarse. Por ejemplo, el efecto de los agentes de bloqueo estándar y los amortiguadores de lavado, tales como Tween®, y caseína, además de diferente pH y amortiguadores, puede determinarse. En una modalidad, la NSB puede reducirse bloqueando las partículas con un agente bloqueante, incluyendo los agentes descritos en la presente. En una modalidad, el agente bloqueante es BSA, como se describe en el Ejemplo 6. De manera alterna, la NSB puede reducirse o eliminarse mediante derivación basada en un polímero de la cubierta de SiO2, tal como con poliacrilamida, polietilenglicol y dextranos, polietilenimina y dendrímeros, todos conocidos por tener baja NSB. Además, también pueden utilizarse reactivos con recubrimiento de vidrio de microarreglo, comercialmente disponibles. En una modalidad, una SACN conjugada comprende una molécula separadora entre la SACN y la biomolécula conjugada. Sin apegarse a una teoría, se cree que ciertas moléculas separadores, tales como polietilenglicol o dextrano, reducirán la NSB. Las moléculas separadoras pueden introducirse en la SACN bioconjugada mediante métodos descritos en la presente, y otros métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse reticulantes comercialmente disponibles que incorporan una subunidad de PEG discreta en un sulfo-SMCC. Una biomolécula puede unirse a este enlazante basado en PEG. De manera similar, las moléculas de PEG funcionales pueden coconjugarse a las SACN junto con el anticuerpo. A este respecto, el PEG actúa como un separador para reducir al mínimo la exposición de la superficie desnuda de la sílice a las especies indeseadas en el ensayo. De manera alterna, es posible conjugar primero las moléculas de PEG bifuncionales a las SACN. El grupo funcional disponible del PEG puede utilizarse entonces para la conjugación adicional a un anticuerpo u otra biomolécula. En una modalidad, se proporcionan ensayos y equipos en la presente invención para la detección de un analito objetivo. Un analito puede ser cualquier sustancia o componente específico que uno desea detectar y/o medir. Los analitos de interés incluyen, por ejemplo, antígenos (tales como antígenos específicos para los organismos bacterianos, virales o protozoarios); anticuerpos, incluyendo aquéllos inducidos en respuesta a una infección, reacción alérgica o vacuna; hormonas, proteínas y otras sustancias fisiológicas (por ejemplo, gonadotropina coriónica humana, estrógenos, progestinas, testosteronas, corticosteroides, factores de crecimiento humanos, hemoglobina y colesterol); ácidos nucleicos; una variedad de enzimas; compuestos terapéuticos y fármacos ilícitos; contaminantes y polutantes ambientales o cualquier número de sustancias naturales o sintéticas. En una modalidad, la invención proporciona un ¡nmunoensayo emparedado utilizando SACN que pueden utilizarse para reemplazar un ensayo del tipo ELISA. La técnica analítica del enzimoinmunoensayo de adsorción (ELISA) y las técnicas relacionadas son los inmunoensayos más ampliamente conocidos. Las etapas de un procedimiento ELISA convencional incluyen inícialmente adsorber un anticuerpo de captura en un soporte sólido. Tras la incubación con una muestra, se forma un complejo de anticuerpo-proteína objetivo. El complejo del inmunoensayo emparedado final incluye típicamente una enzima indicadora que permite las mediciones ópticas de la concentración del antígeno. En un ¡nmunoensayo emparedado utilizando SACN, sin embargo, en lugar de una enzima indicadora, se utiliza una SACN para permitir la detección óptica. En esta modalidad, las SACN bioconjugadas pueden prepararse con concentraciones conocidas de manera precisa de especies de anticuerpos activas específicas unidas a sus superficies, y pueden cuantificarse utilizando un ensayo de unión con un ensayo de cuantificación de la proteína, tal como el ensayo BCA. Tal ensayo puede ser multiplexado, como se describe en el Ejemplo 11. Los métodos de acuerdo con la presente invención son útiles para la detección de analitos en muestras de orígenes biológicos. Tales muestras incluyen, de manera no exclusiva, sangre o suero; saliva, esputo, lagrimas, sudor u otros fluidos secretados; orina o materia fecal; así como fluidos derivados biológicamente tales como fluido cerebroespinal, fluido intersticial, extractos celulares y lo similar. La sangre completa es un medio adecuado para las mediciones SERS de las SACN. Véase ia Fig. 20. Un volumen mínimo de la muestra se utiliza para el ensayo, incluyendo volúmenes de la muestra que varían de aproximadamente 1 µL a aproximadamente 500 µL en algunas modalidades, de aproximadamente 1 µL a aproximadamente 100 µL en otras modalidades, de aproximadamente 5 µL a aproximadamente 50 µL en otras modalidades, y entre aproximadamente 10 µL y aproximadamente 30 µL en aún otras modalidades. Pueden utilizarse volúmenes de muestra más grandes si la situación lo amerita, tal como en el caso de verificación de sangre a granel en un banco de sangre, en donde los volúmenes de la muestra pueden ser del orden de mililitros. Pueden también utilizarse volúmenes más pequeños si la situación lo amerita; por ejemplo, en el caso de un ensayo para una célula, el volumen de la célula puede utilizarse. En el caso de un ensayo que selecciona un componente intracelular, el volumen del componente intracelular puede utilizarse. En tales ensayos celulares o subcelulares, el volumen puede ser tan bajo como 1 pL. Los ensayos de la presente invención se basan en ensayos de unión tales como, de manera no exclusiva, inmunoensayos. Los compañeros de unión involucrados en tales ensayos de unión incluyen, de manera no exclusiva, los siguientes pares de unión: anticuerpo y antígeno o hapteno; hormona y receptor; biotina y avidina; carbohidrato y lectina; moléculas efectoras y receptoras; enzimas y cofactores, sustratos o inhibidores; aptámeros y sus objetivos y secuencias nucleotídicas complementarias. Así, las descripciones y ejemplos incluidos a continuación son para propósitos de demostración y no deben considerarse como que limitan las aplicaciones particulares tratadas.

En una modalidad, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de al menos un analito, que comprende los siguientes pasos: (a) poner en contacto la muestra que se sospecha que contiene el analito con al menos un compañero de unión específico al analito en una superficie de ensayo con flujo lateral para unirse al analito en la muestra; (b) previamente, de manera simultánea o posteriormente al paso (a), unir al menos un compañero de unión del analito con una SACN para formar una SACN conjugada; y (c) detectar una señal SERS por lo que la presencia del analito se determina en la muestra por ia intensidad o presencia de la señal. En una modalidad, la muestra se coloca en una zona de la muestra.

La muestra se filtra hacia abajo a través de la zona de la muestra, y a continuación a través de una zona de la marca que contiene una marca, por ejemplo, una SACN conjugada. La SACN se une al analito de la muestra para formar complejos, y los complejos migran a continuación a lo largo de la membrana o tira de detección. Los complejos de SACN-analito, sí están presentes, se unen a al menos un compañero de unión específico que se inmoviliza en una zona de detección en la membrana. La formación de este complejo de SACN marcada con este compañero de unión específico, resulta en una señal SERS detectable, indicando un resultado positivo de que el analito está presente en la muestra. En el caso en donde el analito es IL-5, por ejemplo, la SACN puede conjugarse a un anticuerpo de IL-5 y un anticuerpo de captura correspondiente para IL-5 puede estar presente en la zona de detección. Un ensayo de flujo lateral se describe en el Ejemplo 12. En una modalidad, la muestra biológica es una célula. La célula puede estar viva o muerta. Las imágenes de células que contienen información espectral Raman pueden obtenerse mediante varios métodos. Un microscopio puede acoplarse a una cámara CCD de manera que pueden obtenerse imágenes completas del objeto. A continuación, entre la muestra y la cámara, se inserta un dispositivo de filtración del número de ondas, tal como un filtro afinable de cristal líquido o un monocromador. El dispositivo de filtración solo permite que un ancho de banda estrecho de la radiación dispersa alcance la cámara en cualquier momento. Se recolectan múltiples imágenes, cada una que cubra un pequeño intervalo espectral de la radiación dispersa. El especto de cada punto en la imagen se monta en un programa. En el otro extremo, la luz de un solo punto de una imagen puede dispersarse a través de un monocromador y el espectro completo de ese punto puede adquirirse en un detector de arreglo. El objeto se expone a continuación de manera que cada punto en la imagen se adquiere de manera separada. La imagen Raman se monta a continuación en un programa. En otro procedimiento, un instrumento de exploración en línea puede construirse, que excite la muestra con una línea de radiación. Se forma la imagen de la línea espacialmente a lo largo de un eje de una cámara CCD, mientras que, de manera simultánea, se dispersa espectralmente a lo largo del eje ortogonal. Cada lectura de la cámara adquiere el espectro completo de cada píxel espacial en la línea. Para terminar la imagen, la línea se explora a través de la muestra. Así, de acuerdo con esta invención, las células o poblaciones de células pueden identificarse utilizando una SACN conjugada con un anticuerpo, preparada con un anticuerpo que se une a un receptor antigénico de la superficie celular, que se expresa en una subpoblación de células. La identificación de las células y las poblaciones de células puede lograrse también vía un procedimiento emparedado. Por ejemplo, el Ejemplo 13 describe un ensayo en el cual las SACN conjugadas con NeutrAvidina se aplicaron a células SK-BR-3 teñidas para el receptor Her2 y el anticuerpo anti-ratón biotinilado. Se necesitan tecnologías de selección basadas en células de alto rendimiento, novedosas, para mantener el paso con las bibliotecas de compuestos recientes y el descubrimiento casi diario de nuevos objetivos terapéuticos. Por ejemplo, la tarjeta CelIPlex™ de Vitra Biosciences permite multíplexar los ensayos celulares. Otro procedimiento, que permitiría la versatilidad en los formatos del ensayo, es codificar las células con identificadores únicos. Esto permitiría que se estudiaran poblaciones de células de manera simultánea, incrementando por lo tanto el rendimiento. Por ejemplo, una célula tipo A puede codificarse con una SACN tipo 1 , una célula tipo B codificarse con una SACN tipo 2, y así sucesivamente. Estas células pueden mezclarse antes de que se realice el ensayo celular. El ensayo celular se realizaría utilizando métodos de fluorescencia tradicionales, tales como GFP. El análisis final se terminaría leyendo la fluorescencia para determinar el resultado del experimento, y SERS para decodificar el tipo de célula, utilizando un microscopio Raman o una célula clasificada con una detección Raman. Esta estrategia permitiría el estudio de fenotipos en poblaciones de células mezcladas. Las SACN también pueden utilizarse para detectar objetivos intracelulares. Las SACN pueden introducirse en las células vía microinyección, electroporación, procedimientos mediados por endocitosis incluyendo el uso de péptidos antipáticos, tales como PEP-1 , el uso de reactivos basados en lípídos catiónicos, tales como Lipofectamina (Invitrogen), y el uso de micelas y reactivos de transfección, tales como transferrina, mañosa, galactosa y Arg-Gly-Asp (RGD), y otros reactivos tales como el reactivo basado en dendrímero SuperFect (Qiagen). Intracelularmente, pueden utilizarse métodos indirectos para probar que las partículas están unidas a los objetivos deseados. El método más sencillo para demostrar la especificidad de las sondas es utilizar inmunofluorescencia para verificar la ubicación de las SACN. Existen varias sondas fluorescentes comercialmente disponibles que son útiles para marcar las estructuras celulares (tales como la mitocondria, el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico) en células vivientes. Conjugando un anticuerpo que selecciona la misma estructura, puede determinarse que fracción de partículas está marcando de manera activa su objetivo, y que porcentaje no está unido de manera específica. Otro procedimiento para verificar la ubicación de las SACN, es utilizar fusiones de proteína fluorescente, tal como GFP y sus análogos. La presente invención está dirigida a agentes para la formación de imágenes que muestran importantes propiedades en el diagnóstico médico. Más particularmente, la presente invención está dirigida a agentes para la formación de imágenes que comprenden SACN. Los agentes para la formación de imágenes de la presente invención son útiles en la formación de imágenes de un paciente generalmente y/o en diagnosticar de manera específica la presencia de tejido enfermo en un paciente. Mediante la elección de la composición, la excitación y emisión de las SACN puede afinarse para que ocurra entre 633 nm y 1000 nm, en la región mínima para la absorción y dispersión por los tejidos. El proceso de formación de imágenes puede llevarse a cabo administrando un agente para la formación de imágenes de la invención a un paciente, y a continuación explorar al paciente explorando cualquier sistema que pueda realizar la formación de imágenes espectrales, tales como microscopios confocales de exploración de un punto, sistemas de exploración en línea y sistemas tomográficos de coherencia óptica. Las SACN de la presente invención pueden también observarse en cualquier sistema de formación de imágenes que detecte sólo sobre una sola banda de longitud de onda, la lista anterior así como cualquier sistema para la formación de imágenes por fluorescencia que tenga una fuente de luz de excitación y una detección de imagen filtrada. Otros sistemas y métodos para formación de imágenes adecuadas se describen en HANDBOOK OF OPTICAL AND BIOMEDICAL DIAGNOSTICS, Valery Tuchín editor (2004) Springer. También incluidos están los métodos del dominio de tiempo, tales como la espectroscopia y tomografía de dispersión de luz dinámica, formación de imágenes de tiempo de vuelo, espectroscopia de dispersión de luz cuasi elástica, espectroscopia de correlación del fotón, espectroscopia Doppler y espectroscopia de onda de difusión. Todas estas técnicas permiten diferenciación entre fotones y en donde han estado basándose en sus firmas temporales. Puesto que las SACN tendrán diferentes firmas temporales que las sustancias fluorescentes, etc., pueden discriminarse contra los tejidos y otras marcas con estos métodos. Los parámetros del instrumento útiles son una fuente de luz modulada y un detector sensible al tiempo. La modulación puede ser por impulsos o continua. La exploración resulta en un espectro o imágenes de una región interna de un paciente y/o de cualquier tejido enfermo en esa región. Por región de un paciente, se entiende todo el paciente o un área o porción particular del paciente. El agente para la formación de imágenes puede emplearse para proporcionar imágenes de la vasculatura, corazón, hígado y bazo, y en la formación de imágenes de la región gastrointestinal u otras cavidades del cuerpo, o de otras maneras, como será fácilmente evidente para aquellos con experiencia en la técnica, tales como en la caracterización de tejidos, formación de imágenes de la recolección de sangre, etc. Esta invención también proporciona un método para diagnosticar una patología anormal in vivo que comprende, introducir una pluralidad de SACN dirigidas a una molécula involucrada en la patología anormal en un fluido corporal en contacto con la patología anormal, en donde las SACN se asocian a una molécula involucrada en la patología anormal, y formar la imagen de las SACN asociadas ¡n vivo. El método es generalmente aplicable a cualquier órgano accesible por las sondas: tracto gastrointestinal, corazón, pulmón, hígado, cérvix, mama, etc. En algunas modalidades, las SACN pueden introducirse vía un endoscopio, como en el caso de un colonoscopio o una aguja, o utilizarse con una punta o manguito desechable. En otras modalidades, las SACN pueden introducirse directamente por la sonda misma para la formación de la imagen. Por ejemplo, pueden introducirse fibras ópticas individuales, o haces de fibras ópticas en los organismos vivientes para la formación de imágenes, y se ha demostrado para la formación de imágenes de nervios, cerebro, microvasos, así como para caracterizar la biodistribución. Las fibras ópticas recubiertas con gel son muy bien conocidas en la literatura de sensores. Las SACN pueden no estar unidas covalentemente al gel, difundiéndose en el tejido relevante tras la introducción. Puede considerarse una variedad de otros métodos para inmovilizar las SACN en la superficie externa de las fibras de manera que se difundan en las fases líquidas con las cuales están en contacto. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para marcar un animal con SACN, que comprende introducir una SACN en un animal. Las SACN pueden introducirse en animales mediante cualquier medio adecuado, tales como implante subcutáneo o intravenosamente, y detectarse utilizando equipo apropiado (véase 15). La presente invención también proporciona un sistema de identificación y métodos relacionados para animales tales como ganado o mascotas caseras utilizando una SACN implantada bajo el cuero o piel para identificar al animal. Deberá notarse que la descripción anterior es únicamente ilustrativa de la invención. Varias alternativas y modificaciones pueden considerarse por aquellos con experiencia en al técnica sin apartarse de la invención. En consecuencia, la presente invención pretende abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caigan dentro del alcance de la invención descrita. 5 Por integridad, varios aspectos de la invención se exponen en las siguientes cláusulas numeradas: 1. Un método, que comprende: a) causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; o b) causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; c) repetir el paso a); y 5 d) liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres. 2. El método de la cláusula 1 , en donde la nanopartícula metálica libre tiene una longitud de 10-300 nm y un ancho de 15-300. 0 3. El método de la cláusula 1 , que comprende además repetir el paso b) y c). 4. El método de la cláusula 1 , en donde la plantilla es alúmina. 5. El método de la cláusula 1, en donde el segundo material es un metal. 5 6. El método de la cláusula 5, en donde el segundo material es Ag. 7. El método de la cláusula 1 , en donde el metal es Au. 8. El método de la cláusula 4, en donde el segundo material es Ag. 9. El método de la cláusula 8, en donde la plantilla es alúmina. 10. El método de la cláusula 1 , en donde la liberación comprende tratar o con un ácido fuerte seguido por una base fuerte. 11. El método de la cláusula 10, en donde el ácido fuerte es ácido nítrico y la base fuerte es NaOH. 12. El método de la cláusula 1 , en donde la electrodeposición se selecciona del grupo que consiste de deposición por impulsos, deposición con corriente por impulsos, deposición con corriente por impulsos inversa y deposición por impulsos doble. 13. El método de la cláusula 1 , que comprende además proporcionar una molécula SAM durante el paso c). 14. El método de la cláusula 1 , en donde la liberación comprende utilizar una solución que proporciona una molécula activa en SERS. 15. Un método, que comprende: a) causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; b) causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; c) repetir el paso a); y d) liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro con un tratamiento ácido para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres porosas. 16. Un método, que comprende: a) causar la deposición de un primer metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; b) causar la deposición de un segundo metal en el poro de la plantilla; c) causar la deposición de un tercer material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; d) repetir el pasos a) y b); y e) liberar el tercer material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres, cada una que comprende el primer metal y el segundo metal. 17. El método de la cláusula 16. 18. El método de la cláusula 16, en donde el segundo metal es magnético. 19. Un método, que comprende: preparar una SACN optimizada, en donde la SACN optimizada se prepara mediante un método que comprende eliminar el material unido de manera irreversible a la superficie partícula durante el curso de la preparación de la SACN, en donde la señal de fondo del espectro se reduce en comparación con el espectro generado por una SACN que no está optimizada. 20. El método de la cláusula 19, en donde la eliminación comprende los pasos de: a) oxidación y b) reducción. 21. El método de la cláusula 20, en donde la oxidación comprende poner en contacto la SACN con un radical de ozono/oxígeno generado por UV. 22. El método de la cláusula 20, en donde la reducción comprende poner en contacto la SACN con etanol. 23. El método de la cláusula 22, en donde la solución del reportero en etanol, de manera que la adsorción del reportero puede ocurrir inmediatamente tras la reducción. En otras modalidades, el etanol se elimina mediante centrifugación, y el reportero se agrega en un paso adicional. 24. Un método, que comprende reducir la señal de fondo en un ensayo utilizando una partícula de SACN, en donde la reducción comprende eliminar las impurezas de un componente seleccionado del grupo que consiste de la muestra a ser analizada, la partícula de SACN, y el recipiente del ensayo. 25. Un método, que comprende a) preparar una pluralidad de partículas de SACN, cada una que comprende un reportero Raman diferente: b) medir la relación de intensidad de los reporteros Raman; y c) preparar una segunda pluralidad de partículas de SACN gue tienen las intensidades de los reporteros normalizadas con aquélla del reportero que tiene la intensidad más débil, por lo que se prepara una pluralidad de SACN que tienen intensidades de picos sustancialmente iguales en un espectro de Raman. 26. El método de la cláusula 25, en donde las intensidades de los reporteros se normalizan preparando SACN con una cantidad disminuida de reportero, en donde la cantidad disminuida se define por el inverso de la relación de intensidad del reportero a aquélla del reportero más débil. 27. El método de la cláusula 25, en donde las intensidades de los reporteros se normalizan preparando SACN con una cantidad incrementada de silano, en donde la cantidad incrementada se define por el inverso de la relación de intensidad de ese reportero a aquélla del reportero más débil. 28. Una SACN que comprende un núcleo de nanopartícula, una molécula reportera activa en Raman, un encapsulante de SÍO2, y un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2 y un grupo -COO-. 29. Un método que comprende a) proporcionar una nanopartícula; b) asociar una molécula reportera activa en Raman con la nanopartícula; c) encapsular la nanopartícula con S¡O2; y d) modificar el SiO2 para portar un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2 y un grupo -COO", por lo que se preparar una SACN activada. 30. El método de la cláusula 29, en donde la modificación comprende la modificación durante ei paso de encapsulación. 31. El método de la cláusula 29, en donde la modificación comprende la modificación después del paso de encapsulación. 32. El método de la cláusula 29, en donde la modificación comprende la modificación para presentar aminas. 33. El método de la cláusula 32, en donde la modificación se logra mediante la reacción con aminopropil trimetoxisilano (APTMS)) o etóxidos de (3- glicidiloxipropiltrimetoxisilano (GPTMS)). 34. El método de la cláusula 29, que comprende además unir una 5 biomolécula a la SACN activada, por lo que se prepara una SACN bioconjugada. 35. El método de la cláusula 34, en donde la biomolécula se selecciona del grupo que consiste de una proteína y un ácido nucleico. 36. El método de la cláusula 34, en donde ia unión comprende hacer reactivar la SACN activada y la biomolécula a través de un compuesto o seleccionado del grupo que consiste de un reticulador heterobif uncional, 4-[N- male¡midometil]ciclohexan-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo, anhídrido succínico, una carbodiimida, un enlazante homobifuncional, glutaraldehído, 2- iminotiolano, y una combinación de cualquiera de lo anterior. 37. El método de la cláusula 34, que comprende además purificar la 5 SACN bioconjugada. 38. El método de la cláusula 37, en donde la purificación se selecciona del grupo que consiste de centrifugación y filtración en flujo tangencial. 39. El método de la cláusula 34, que comprende además unir una molécula separadora a la SACN bioconjugada, en donde la molécula separadora 0 está entre la nanopartícula y la biomolécula. 40. El método de la cláusula 39, en donde la molécula separadora se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol y dextrano. 41. Una SACN bioconjugada, que comprende: a) una nanopartícula 5 b) una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula c) un encapsulante de SiO2; y d) una biomolécula seleccionada del grupo que consiste de una proteína y un ácido nucleico. o 42. La SACN bioconjugada de la cláusula 41 , en donde la proteína es un anticuerpo. 43. La SACN bioconjugada de la cláusula 41 , que comprende además una molécula separadora entre la nanopartícula y la biomolécula. 44. La SACN bioconjugada de la cláusula 43, en donde la molécula separadora se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol y dextrano. 5 45. Un método para detectar un analito, que comprende: a) obtener una muestra biológica; y b) poner en contacto la muestra con una SACN bioconjugada que comprende una biomolécula que se une al analito; y c) detectar el analito a la SACN bioconjugada. 0 46. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula es un antígeno y el analito es un anticuerpo. 47. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito son péptidos o proteínas. 48. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito se 5 seleccionan de manera independiente de una hormona y un receptor. 49. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito se seleccionan de manera independíente de biotina y avidina. 50. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito se seleccionan de manera independiente de un carbohidrato y lectína. 0 51. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito se seleccionan de manera independiente de moléculas efectoras y receptoras. 52. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito se seleccionan de manera independiente de enzimas y un miembro del grupo seleccionado del grupo que consiste de cofactores, sustratos e inhibidores. 5 53. El método de la cláusula 45, en donde la biomolécula y el analito son secuencias nucleotídicas complementarias. 54. El método de la cláusula 45, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, saliva, esputo, lagrimas, sudor, otro fluido secretado, orina, materia fecal; fluido cerebroespinal, fluido intersticial, un o extracto celular y una célula. 55. Un método que comprende, a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un analito con al menos un compañero de unión específico al analito en una superficie de ensayo con flujo lateral para unirse al analito en la muestra; b) de manera previa, simultánea o posterior al paso (a), unir al menos un compañero de unión del analito con una SACN; y c) detectar una señal SERS, por lo que se determina la presencia del analito en la muestra por la intensidad o presencia de la señal, por lo que se determina la presencia de al menos un analíto en la muestra. 56. Un método que comprende: a) proporcionar un microscopio acoplado a una cámara CCD; b) proporcionar una célula; c) poner en contacto la célula con al menos una SACN capaz de unirse de manera específica a la célula o una porción de la célula; d) proporcionar un dispositivo de filtración del número de ondas entre la célula y la cámara e) adquirir una pluralidad de conjuntos de datos; y f) montar los conjuntos de datos; por lo que se adquiere un perfil espacial de la SACN. 57. El método de la cláusula 56, en donde el dispositivo de filtración del número de ondas se selecciona del grupo que consiste de un monocromador, un filtro de muesca, una rueda de filtro, un filtro afinable acustoóptico, un filtro de interferencia de la transformada de Fourier, un filtro afinable de cristal líquido y combinaciones de lo anterior. 58. El método de la cláusula 56, en donde el dispositivo de filtración del número de onda comprende un filtro afínable de cristal líquido y la adquisición comprende: a) adquirir datos a una primera frecuencia; y b) opcionalmente, adquirir datos a una segunda frecuencia y frecuencias posteriores. 59. El método de la cláusula 56, en donde la adquisición comprende: a) dispersar la luz desde un solo punto de una ubicación a través del monocromador; b) adquirir el espectro de Raman completo de ese punto en un detector de arreglo; y c) repetir a) y b) en múltiples ubicaciones. 60. El método de la cláusula 56, en donde la adquisición comprende: a) excitar la muestra con una línea de radiación; b) adquirir el espectro completo de cada píxel espacial en la línea; y c) explorar la línea a través de la muestra. 61. Un nanopartícula, que comprende: a) una nanopartícula metálica; b) más de una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula; y c) un encapsulante de SÍO2. 62. La nanopartícula de la cláusula 61 , en donde la más de una molécula reportera activa en Raman comprende 4-mercaptopiridina y trans-4,4' bís(piridil)etileno. 63. Una nanopartícula, que comprende: a) una nanopartícula con núcleo/cubierta; b) al menos una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula con núcleo/cubierta; y c) un encapsulante de SÍO2. 64. La nanopartícula de la cláusula 63, en donde además, la nanopartícula con núcleo/cubierta se selecciona del grupo que consiste de una partícula de núcleo de Au S/cubierta de Au, una partícula de núcleo de Ag/cubierta de Au, partículas de núcleo de sílice/cubierta de Au, partículas de núcleo de sílice/cubierta de Ag, partículas de núcleo de alúmina/cubierta de Au, partículas de núcleo de alúmina/cubierta de Ag, partículas de núcleo de T¡O2/cub¡erta de Au, y partículas de núcleo de TiO2/cubierta de Ag. 65. Un método que comprende, a) poner en contacto HAuCI con un clorhidrato de hidroxilamina; b) además, poner en contacto la solución resultante del paso a) con una mezcla de deshidrato de citrato sódico y NaBH , por lo que se produce una nanopartícula de oro. 66. Un método que comprende, a) proporcionar una nanopartícula de oro preparada mediante el 5 método de la cláusula 65; y b) asociar una molécula reportera activa en Raman con la nanopartícula; c) encapsular la nanopartícula con Sí?2; por lo que se prepara una SACN. o 67. Una nanopartícula que comprende: a) una nanopartícula metálica anisotrópica; b) una molécula reportera activa en SERS asociada con la nanopartícula metálica anisotrópica; c) SÍO2 que encapsula la nanopartícula metálica anisotrópica. 5 68. La nanopartícula de la cláusula 67, en donde la nanopartícula metálica anisotrópica tiene una forma seleccionada del grupo que consiste de un esferoide, varilla, disco, pirámide, cubo, cilindro, nanohélice, nanorresorte, nanoanillo, nanopartícula con forma de varilla, nanopartícula con forma de flecha, nanopartícula con forma de lágrima, nanopartícula con forma de tetrápodo, 0 nanopartícula con forma de prisma, porosa y con forma no geométrica. 69. La nanopartícula de la cláusula 68, en donde la nanopartícula es de forma no geométrica, y se aproxima a una nanovarílla. 70. El método de la cláusula 69, en donde la nanopartícula tiene un diámetro de aproximadamente 250 nm y una longitud de aproximadamente 250 5 nm. 71. Un método que comprende, a) administrar un agente para la formación de imágenes de una nanopartícula de SACN a un paciente, b) explorar al paciente utilizando un sistema que puede realizar la o formación de imágenes espectrales; y c) generar un espectro o imagen de una región interna del paciente. 72. El método de la cláusula 71 , en donde el sistema se selecciona del grupo que consiste de un microscopio confocal de exploración de un punto, un sistema de exploración en línea, un sistema tomográfico de Coherencia Óptica, un sistema que detecta únicamente sobre una sola banda de longitud de onda, un sistema de formación de imágenes por fluorescencia que comprende una fuente de luz de excitación y una detección de la imagen filtrada. 73. El método de la cláusula 71 , en donde la región de un paciente se selecciona del grupo que consiste de todo el paciente, la vasculatura, corazón, hígado y el bazo, la región gastrointestinal. 74. El método de la cláusula 71 , en donde el sistema que puede realizar la formación de imágenes espectrales es un sistema portátil. 75. Un método que comprende: a) introducir una pluralidad de SACN dirigidas a una molécula involucrada en una patología anormal en un paciente con la patología anormal, en donde las SACN se asocian a una molécula asociada con la patología anormal; y b) obtener una imagen de las SACN asociadas, por lo que puede diagnosticarse una patología anormal. 76. El método de la cláusula 75, en donde la ubicación de la patología anormal comprende el tracto gastrointestinal, corazón, pulmón, hígado, cérvix, mama y colon. 77. El método de la cláusula 71 , en donde la SACN está asociada de manera covalente con una sonda para la formación de imágenes, en donde la administración comprende introducir la sonda para la formación de imágenes, en donde las SACN se disocian en el tejido o un fluido corporal. 78. Un método para marcar un animal con una SACN, que comprende introducir una SACN en un animal, en donde la introducción se selecciona del grupo que consiste de implantación subcutánea, introducción intravenosa. 79. El método de la cláusula 78, que comprende además detectar la SACN o el animal marcado. 80. Un método que comprende: a) poner en contacto una muestra de tejido con al menos una partícula de SACN conjugada a una biomolécula, capaz de unirse de manera específica a la muestra de tejido; y b) adquirir una imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula. 81. El método de la cláusula 80, en donde el tejido se pone en contacto con uno más reactivos adicionales que no son de SACN. 82. El método de la cláusula 81 , en donde el reactivo adicional se selecciona del grupo que consiste de eosina, hemotoxilina y una combinación de hemotoxilina y eosina. 83. El método de la cláusula 80, que comprende además: a) adquirir una imagen Raman de base de una muestra de tejido antes del paso (a) de la cláusula 80; y b) sustraer el espectro de base de la imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula adquirida en el paso (b) de la cláusula 80. 84. El método de la cláusula 83, en donde el tejido se pone en contacto con uno o más reactivos adicionales que no son de SACN. 85. El método de la cláusula 83, en donde el reactivo adicional se selecciona del grupo que consiste de eosina, hemotoxilina y una combinación de hemotoxilina y eosina. 86. El método de la cláusula 80, que comprende además comparar la imagen Raman con una imagen de la muestra de tejido que se ha teñido con tintes orgánicos fuertemente coloreados para visualizar el tamaño y la forma de la célula.

EJEMPLOS Eiemplo 1 Se describe una síntesis típica de un coloide de Au de diámetro de ~45 nm en combinación con borohidruro de sodio, citrato de sodio y clorhidrato de hidroxilamina. Todo el material de laboratorio se lavó con agua regia y se enjuagó rigurosamente con agua 18 MO. Las reacciones se llevan a cabo en una sala fría. Se preparan soluciones de HAuCl »3H2O al 0.01% (peso/peso) en agua, dihidrato de citrato de sodio al 8% (peso/peso) en NaOH 0.01 N, borohidruro de sodio a la 10"4% en NaOH 0.01 N, y clorhidrato de hidroxilamina 400 mM en agua. A continuación, se prepara una mezcla de soluciones de citrato y borohidruro combinando 1 mL de la solución de citrato de sodio con 100 µL de la solución de borohidruro de sodio y 500 µL de NaOH 0.01 N. Después de preparar esta mezcla, 200 µL de la solución de hidroxilamina se inyectan en 100 mL de la solución de HAuCl en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, y se agita brevemente. Después de 20 minutos, la mezcla de borohidruro/cítrato se inyecta en una solución agitada rápidamente de HAuCI e hidroxílamina. Se obtienen mejores resultados cuando la mezcla se inyecta a mitad de camino entre el centro del vórtice de agitación y la pared del matraz.

Ejemplo 2 Preparación de las Nanopartículas de Oro. Se preparan soluciones patrón de HauCI4»3H2? a concentraciones de 1 % o 2% (peso/volumen) en H2O. Estas soluciones se filtran a través de membranas de 0.2 µm antes de colocarse en la sala fría. Las botellas que contienen las soluciones patrón, se cubren también típicamente con papel aluminio para reducir la exposición a la luz. Se preparan típicamente las siguientes soluciones: 1. 1.0 L de HauCI4 al 0.02% en H2O. 2. 5 mL de deshidrato de citrato sódico al 32% (peso/volumen) en NaOH 0.01 N. 3. 10 mL clorhidrato de hidroxilamina 1.6 M en H2O. 4. 10 rhL NaBH4 al 4% (peso/volumen) en NaOH 1.0 N que se prepara mediante dilución de la solución patrón. Todas las reacciones se llevan a cabo en una sala fría después de dejar que las soluciones alcancen la temperatura de la sala. La solución de HauCI4 se coloca en un matraz de fondo redondo de 2 L y una varilla de agitación de vidrio con paleta de Teflón se inserta en el matraz para proporcionar agitación. 1.0 mL de la solución de hidroxilamina se agrega al matraz y se agita. Inmediatamente después de la adición de la hidroxilamina, se prepara una solución de NaBH4 al 4 x 10"4% mediante dilución serial del patrón al 4%. Estas diluciones se hacen en NaOH al 0.01 N. A continuación, 1 mL de citrato de sodio al 32% se mezcla con 525 µL de NaOH 0.01 N y 75 µL del NaBH4 ai 4 x 1(r*%. A 20 minutos después de la adición de la hidroxílamina, se agrega 1.0 mL de la mezcla de citrato/borohidruro al matraz de reacción mientras que se agita rápidamente.

Eiemplo 3 Espectro SERS de SACN marcadas con 4-mercaptopiridina (4-MP) y trans-4,4'-bis(pir¡dil)etiIeno (BPE). Materiales: El agua utilizada para todas las preparaciones fue 18.2 MO, destilada a través de un sistema nanopuro Barnstead. El 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS), HAuCI4»3H2O, dihidrato de citrato trisódico, hidróxido de sodio, borohidruro de sodio, clorhidrato de hidroxilamina, trans-1 ,2-bis(4-piridiI)etileno (BPE), 4-mercaptopiridina, silicato de sodio, ortosilícato de tetraetilo (TEOS), alcohol etílico y el amoniaco en etanol 2.0 M se obtuvieron de Sigma-Aldrich. El BPE se recristalizó antes del uso. Preparación del coloide: El Au coloidal de 35 nm se preparó a partir del HAuC*4»3H2O. Se prepararon soluciones acuosas de citrato de sodio al 4% y clorhidrato de hidroxilamina 400 mM inmediatamente antes de la síntesis, como una solución de borohidruro de sodio al 10"2% en NaOH 0.001 N. Una alícuota de 300 µL de esta solución de borohidruro se mezcló con 500 µL de citrato y 350 µL de la hidroxilamina y se inyectaron inmediatamente en 200 mL de HAuCI4 al 0.01% bajo agitación vigorosa. El tamaño de las partículas resultantes se determinó mediante microscopía electrónica de transmisión, utilizando un programa ImageJ. Preparación de las SACN: Todas las reacciones se realizaron en matraces de plástico. Un experimento típico utilizó 30 ml del coloide de 35 nm.

El coloide se volvió vitreofílico con la adición de 40 µL de APTMS 1.0 mM y se dejó agitar durante 15 minutos. La mezcla de la marca Raman (600 µL de 4- mercaptopíridina 10"5 M y 50 µL de BPE 10"5 M), se agregaron a la solución, que a continuación se agitó durante 15 minutos adicionales. Finalmente, se agregaron 1.2 mL de silicato de sodio al 0.54% y se dejó reaccionar durante 42 horas. Después de este tiempo, se agregaron 120 mL de EtOH a la solución, seguida por 1 mL de amoniaco 2 M (en etanol) y 20 µL de ortosilicato de tetraetilo (TEOS). Esta reacción se dejó proceder 1 día antes de purificar vía centrifugación. Esta cantidad de TEOS varió, si se desea una cubierta más delgada o más gruesa. Las SACN resultantes tuvieron una mezcla de dos diferentes especies de moléculas activas en Raman, 4-MP y BPE, a una relación de 12:1. Los espectros SERS de estas SACN 4-MP/BPE obtenidas utilizando excitación a 633 nm (Trazo A) y excitación a 785 nm (Trazo B), se grafican en la Fig. 6. Por comparación, las características del espectro de Raman de BPE-SACN (línea punteada) y 4-MP-SACN (línea sólida), se grafican en la Fig. 7. Puede observarse que las características de la señal de Raman de 4-MP dominan el espectro de las SACN 4-MP/BPE obtenidas utilizando la excitación a 785 nm, mientras que las características de las señales de Raman de BPE y 4-MP son evidentes en el espectro obtenido utilizando la excitación a 633 nm. Así, por la elección cuidadosa de dos o más diferentes especies de moléculas activas en Raman y sus relaciones relativas, es posible preparar SACN que proporcionan diferentes espectros de dispersión de Raman dependiendo de la longitud de onda de excitación. Esto permite un nivel adicional de capacidad de multiplexíón.

Ejemplo 4 Preparación de las SACN activas en tiol A. Modificación de la Sílice: La cubierta de sílice de las SACN pueden funcionalizarse para portar grupos sulfhidrilo libres ya sea durante el curso de la fabricación de la cubierta de SÍO2 ("modificación directa"), o después de que la cubierta se ha formado completamente ("postmodificación").

B. Postmodificación: Preparar un lote de 50 mL de SACN de acuerdo con los protocolos estándar. Proceder a través de todas las etapas del crecimiento de la sílice, excepto que las SACN deben resuspenderse a únicamente 10 mL en agua después de la centrifugación final. Suponiendo pérdidas despreciables, esto deja a las SACN a una concentración 5x del coloide original. Agregar 40 mL de etanol a las SACN. Bajo agitación magnética moderada, agregar 1 mL de NH4OH concentrado (30%, J.T. Baker #9733-01). Mientras que esto se agita, hacer una solución que es de 900 µL de etanol, 95 µL de ortosilicato de tetraetilo (TEOS, Sigma #333859) y 5 µL de (3-mercaptopropiI)trimetoxisilano (MPTMS, Fluka #63800). Agregar 100 µL de esta mezcla (efectivamente 9.5 µL de TEOS y 0.5 µL de MPTMS) a las SACN en agitación, y dejar que la reacción proceda durante la noche. Purificar mediante centrifugación repetida. Disminuir la centrifugación y resuspender la pelotilla en agua un mínimo de 3 veces para asegurar la eliminación completa del etanol y los reactivos en exceso. Resuspender a 5 mL (10x) después de la centrifugación final. C. Modificación Directa: Nuevamente, empezar a preparar un lote de 50 mL de SACN utilizando las condiciones típicas. El único cambio es durante el paso de crecimiento de Stóber. Como antes, agregar 1 mL de NH4OH concentrado y agitar durante 5 minutos. A continuación, mezclar 47.5 µL de TEOS con 2.5 µL de MPTMS, y agregarlos a las marcas. Agitar durante la noche y purificar mediante centrifugación, resuspendiendo las marcas purificadas a 5 mL (10x).

Ejemplo 5 Bioconjugación de las SACN Con las SACN activadas con tiol, las biomoléculas se unen utilizando el reticulador heterobifuncional 4-[N-maleimidometil]ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC, Pierce Biotechnology, Inc). Esta molécula contiene tanto un grupo maleímida que es reactivo hacia los sulfhidrilos como un éster sulfo-NHS que, de manera preferida, reacciona con las aminas primarias. En este caso, puede utilizarse una reacción simple de un solo recipiente para unir la estreptavidina, y debe ser fácilmente adaptable para la unión de la mayoría de las proteínas u otras moléculas que portan aminas primarias. Las marcas pueden concentrarse antes de la conjugación. Para conjugar las marcas activadas con tiol como se describió anteriormente, primer agregar 0.25 mg de estreptavidina a 5 mL de amortiguador PBS 2 mM (KCl 0.54 mM, NaCI 27.6 mM, pH = 7.4). Agregar las marcas activadas con tiol (5 mL a una concentración 10x) y mezclar bien. A continuación, pesar 1 mg de sulfo-SMCC y agregarlo a las marcas y SAv. Inmediatamente mezclar con vórtice y dejar reaccionar durante 1 hora mientras que gira a temperatura ambiente. Después de 1 hora, las marcas se purifican mediante centrifugación y resuspensión en amortiguador PBS 2 mM. Una pequeña cantidad (concentración final de 0.1 %) de BSA puede agregarse para reducir al mínimo la adhesión de las partículas a las paredes de la centrifuga. Aunque esta reacción utiliza estreptavidina, otras proteínas (incluyendo anticuerpos), se han conjugado utilizando métodos similares. Si es necesario más control sobre la reacción, la proteína puede "preactivarse", agregando las marcas. Debido a que el grupo maleimida del sulfo-SMCC es bastante estable en soluciones acuosas (-60 horas), las biomoléculas pueden activarse mediante la reacción con sulfo-SMCC durante 30-120 minutos, seguido por la purificación en una columna de desalación. Esto crea esencialmente una biomolécula activada con maleimida que puede agregarse directamente a los SACB que portan el sulfhidrilo. Para la avidina, pueden utilizarse análogos (incluyendo estreptavidína y NeutrAvidin™), y la biocitina fluorescente Alexa Fluor® 594 (Molecular Probes # A 12922; "biocitina-594") para cuantificar el número de biomoléculas unidas a las SACN. La fuerte absorción visible de las SACN, sugieren el uso de esta detección fluorescente altamente sensible más que utilizar métodos colorimétricos comunes (incluyendo peroxidasa de rábano biotinílada) para la cuantifícación de la estreptavidina. Este tinte excitado rojo es útil en una región en donde las partículas coloidales tienen poca absorción que pueden interferir con las mediciones. Todas las mediciones de la fluorescencia se hicieron utilizando un Fluorolog-3 de Jobin Yvon-Spex. Para aliviar las preocupaciones de que las SACN altamente absorbentes pueden influenciar las mediciones de la fluorescencia, el experimento se llevó a cabo de dos diferentes formas. La primera es la más directa; las partículas biofuncionalizadas se incubaron en la biocitina-594 durante una cantidad de tiempo dado (nominalmente 2 horas, protegidas de la luz para evitar fotoblanqueamiento). Las marcas se purifican a continuación repitiendo la centrifugación (2 veces es suficiente si la cantidad del tinte se controla cuidadosamente), y se mide su fluorescencia. Lo inverso a tomar las mediciones de fluorescencia directas de las marcas, es medir la cantidad de moléculas fluorescentes que no se unen a las marcas. Nuevamente, las marcas se incuban en una cantidad cuidadosamente elegida de tinte, y se centrifugan sólo una vez. El sobrenadante se recolecta cuidadosamente y se mide par ala fluorescencia. La cantidad de tinte que se ha unido a las partículas puede determinarse por la sustracción de este valor de la concentración original conocida del tinte. Un punto importante a notar es que se utilizaron tubos para microcentrífuga no adhesivos (Corning Costar), puesto que la biocitina Alexa Fluor® 594, se adsorbe rápidamente en las paredes de los tubos regulares. Pueden utilizarse protocolos similares con anticuerpos secundarios marcados de manera fluorescente si las partículas se conjugan a anticuerpos en lugar de análogos de avidina. Estos métodos de cuantificación se han utilizado para mostrar que la cantidad de una biomolécula dada conjugada a las marcas puede controlarse agregando otra molécula reactiva. En la Fig. 8, el número de moléculas de biotina que se unieron a las nanopartículas conjugadas con varias relaciones de NeutrAvidin™ y seroalbúmina bovina (BSA) se muestra. Las condiciones de conjugación fueron equivalentes para todas las reacciones, con la relación de biomoléculas siendo la única variable. Como se esperaba, cantidades mayores de BSA condujeron a menores niveles de biotina unida. Suponiendo que cada NeutrAvidin™ (NAv) es capaz de unirse a dos 2 biotinas (la conjugación a la partícula probablemente bloquea alguna cantidad de los 4 sitios de unión), hay hasta 300-400 moléculas de NeutrAvídin™ unidas a cada marca. Pero, la medición de las partículas conjugadas con BSA puras, los cálculos muestran menos que 10 moléculas de biocítina-594 unidas en cada nanopartícula. Esto es consistente con niveles muy bajos de unión no específica que se esperarían mediante la conjugación de BSA (un reactivo bloqueante común) a las partículas.

Ejemplo 6 Características de unión no específicas Como un primer paso de caracterización se considera un experimento simple para considerar si las SACN recubiertas con estreptavidina podrían unirse de manera específica a BSA biotinilada. Ocho pozos de una placa con micropozos de poliestireno se recubrieron con BSA biotinilada o BSA incubando con una solución al 0.5% en PBS durante treinta minutos. Todos los pozos se lavaron a continuación 4 veces con PBS durante 1 minuto, y a continuación se bloquearon durante 30 minutos con un amortiguador de PBS que contiene EDTA 1 mM, BSA al 0.1% y Zwittergent 3-08 al 0.01%. Después de aspirar la solución de bloqueo de cada pozo, se agregaron 20 µL de la muestra y 20 µL de PBS y se incubaron durante 2 horas. Las muestras comprendieron SACN recubiertas neutravidina (NAv), SACN recubiertas con estreptavidina (SAv), SACN que se han modificado con tiol (pero no conjugado), y marcas de control sin funcionalización del recubrimiento de sílice. Los pozos se lavaron con amortiguador de bloqueo durante 15 minutos, seguido por PBS (3 x 5 minutos) y agua (3 x 1 minuto). Se dejaron secar, y la cantidad de la marca unida se cuantificó midiendo la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas de micropozos (datos no mostrados). Los valores se sustrajeron del fondo, basándose en la absorbáncía promedio de los pozos que no se habían tratado. Las marcas de NAv y SAv se unieron con alta especificidad a los pozos recubiertos con biotina y exhibieron poca unión no específica a los pozos recubiertos con BSA. Sin embargo, las marcas recubiertas con tiol y las marcas recubiertas con sílice estándar mostraron niveles bajos de unión a los pozos. Los experimentos posteriores han mostrado que este fenómeno puede evitarse bloqueando las partículas agregando una pequeña cantidad de BSA a las partículas, centrifugando y resuspendiendo en PBS. Después de determinar que las marcas conjugadas con SAv y NAv fueron específicas para la biotina, el número de sitios de unión de biotina que estaban presentes en cada marca se midió mediante dos métodos. Un análogo fluorescente de biotina, biocitina Alexa Fluor® 594, se hizo reaccionar con las SACN. Después de pasos de lavado apropiados, el número de fluoróforos unidos se determinó mediante medición directa y por disminución de la fluorescencia. Los valores obtenidos por los dos métodos son consistentes (Fig. 12), aunque la medición directa de la fluorescencia siempre produjo un número menor. El número promedio de biotinas unidas fue de aproximadamente 700 por nanopartícula bajo condiciones de reacción óptimas.

Ejemplo 7 Conjugación Oligonucleotídica La misma química sulfo-SMCC descrita anteriormente se utilizó para unir los oligonucleótidos terminados en amina a las SACN modificadas con tiol. Después de la unión y purificación, una hebra complementaria marcada con tinte se incubó con las partículas modificadas. La cuantificación de la sonda fluorescente (después de la centrifugación para eliminar la sonda no unida), indicó que aproximadamente 15 oligonucleótidos se unieron a cada nanopartícula. Los oligonucleótidos se unieron directamente a marcas NAv, en las cuales los oligonucleótidos tenían un grupo biotina en un extremo para la unión a la marca y un fluoróforo en el otro, para permitir una medición directa de la eficiencia de la conjugación. Esto también proporcionó aproximadamente 15 oligonucleótidos conjugados por nanopartícula. Las SACN modificadas con amina se acoplaron a oligonucleótidos fluorescentes terminados con tiol utilizando la misma química de sulfo-SMCC descrita anteriormente, nuevamente con resultados similares.

Ejemplo 8 Dos características que se desean de las marcas ópticas cuantitativas es que respondan linealmente a la fuente de excitación y de que estén relativamente no afectadas por la exposición a largo plazo a la excitación. La primera cualidad se ha demostrado con SACN exponiendo una muestra a varias cantidades de energía de excitación y midiendo la señal resultante. Estos resultados se muestran en la Fig. 9. Para demostrar la fotoestabilidad, una muestra de SACN se depositó en un portaobjetos de cuarzo y se colocó en el soporte de la muestra de un espectrómetro Raman. Para este experimento, el espectrómetro suministró 60 mW de potencia a 647.1 nm. La luz emitida se recolectó a través de un objetivo de microscopio de 50 x 0.8 NA, pasó a través de un filtro de muesca holográfico para rechazar la dispersión de Rayleigh, se enfocó en un monocromador 0.5 m y se detectó con una CCD enfriada con nitrógeno líquido. Los espectros se recolectaron aproximadamente cada hora durante 6 horas, tiempo durante el cual la muestra se iluminó continuamente. La señal de la muestra se gráfica como una función del tiempo en la Fíg. 10. Estos datos muestran que estas partículas son bastante estables, con solo una pérdida del 20% en la señal durante 6 horas. La estabilidad térmica de las SACN también es deseable. Para demostrar esto, dos lotes de SACN de BPE 1.5 X (en 35 mL), se pusieron a ebullición durante una hora. (Las marcas se concentraron de 50 mL a 35 mL, a aproximadamente una concentración 1.5X. Los espectros UV-Vis y SERS se registraron antes y después de la ebullición. Las pequeñas diferencias en la absorbancia y SERS antes y después de la ebullición son en su mayoría atribuibles a una ligera diferencia en la concentración. Las SACN son esencialmente no afectadas por la ebullición. Eiemplo 9 Evidencia de la reproducibilidad lote a lote Para determinar la reproducibilidad de hacer las marcas del inicio al final del proceso, se hicieron un total de 6 coloides, y se marcaron B-G. Estos coloides se utilizaron para preparar un total de 13 lotes diferentes de marcas, utilizando protocolos idénticos para cada lote. El espectro de absorción (normalizado) de estos coloides se muestra en la Fig. 11, y es evidente que son bastante similares después de que todos los pasos se terminan. Después de normalizar la concentración equilibrando la densidad óptica de cada solución a 1.0, la respuesta SERS se midió utilizando excitación a 785 nm. Las señales SERS se verificaron en el pico principal (-1200 cm"1) (no mostrado). Utilizando todas las muestras, la RSD del grupo es 12.5%. Si se elimina un resultado aislado significativo, las restantes doce muestras exhiben una RSD de 7.5%.

Eiemplo 10 A. Preparación de nanovarillas anisotrópicas con un diámetro de 18-90 nm Se utilizaron varillas comercialmente disponibles con diferente tamaño de poro (18 nm a 90 nm), para la electrodeposición de nanovarillas de Au anisotrópicas. Ag evaporada, de aproximadamente 1 µm de espesor, sirvió como el sustrato para la deposición. Inmediatamente antes de la electrodeposicíón, la plantilla se montó en la celda electroquímica y se remojó en una solución de deposición de Ag bajo vacío del alojamiento durante 1 hora, para asegurar la humectación adecuada de los poros, seguido por la electrodeposición en los poros de 1 µm de espesor de Ag fresca. Posteriormente, ocurrió la electrodeposición de nanoalambres que consisten de tiras alternas de Au y Ag. Se utilizaron soluciones de deposición comerciales: Cyless Silver (Technic, Inc.) y Microfab Au 100 (solución de Au basada en Sulfito de Enthone-OMI, Inc.). La longitud de los segmentos de Au se determinó por la relación de aspecto deseada de las nanovarillas de Au; la longitud de los segmentos de Ag puede estar en el intervalo de 10-200 nm; el número total de tiras por poro se determinó por la concentración final deseada (después de la liberación de la plantilla) de la solución de nanovarillas de Au/ml.

Se utilizaron diferentes técnicas de deposición dependiendo del diámetro del poro de la plantilla. Para un diámetro del poro de 65 nm y 90 nm, se utilizó un sintetizador semiautomático para partículas de nanocódigos de barras en un modo de corriente constante. La deposición de los nanoalambres de AuAg con 59 tiras (cada tira de 30 nm de longitud) depositadas secuencialmente en una plantilla conduce después de la eliminación de Ag a 3 x 1011 nanovarillas de Au/plantílla se ha demostrado. Un protocolo de liberación se desarrolló iniciando con la disolución del Ag (sustrato y tiras de Ag) en ácido nítrico, seguido por la disolución de la plantilla en NaOH. Para evitar la aglomeración de las nanovarillas de Au liberadas, se agregó una molécula SAM corta (monocapa automontada) al NaOH durante la disolución de la plantilla. Los ejemplos para moléculas que contienen tiol cortas son mercaptoetanol (ME), ácido mercaptopropiónico (MPA) y ácido mercaptoetansulfónico (MESA). Estas moléculas cortas se reemplazaron posteriormente con la molécula reportera Raman. Un método alterno que produce mejores resultados fue introducir la molécula reportera Raman directamente al NaOH durante la disolución de la plantilla. Se utilizaron exitosamente 4-mercaptofenol (MP) y 2-quinolintiol (QSH) y demostraron una señal Raman con nanovarillas de Au. La Fig. 12 muestra el espectro de Raman de partículas de Au de 65 x 30 nm y de 90 x 30 nm liberadas en QSH. La Fig. 13 ilustra el espectro de Raman de 65 x 30 nm y de 90 x 30 nm liberadas en MP. El modo de corriente constante de la electrodeposición no fue eficaz para plantillas con un diámetro de poro de 35 nm y menor. Pueden utilizarse diferentes técnicas de deposición por impulsos (corriente por impulsos, corriente por impulsos inversa e impulsos dobles). Utilizando plantillas de policarbonato con un diámetro del orificio en el intervalo de submicras, se ha aplicado exitosamente electrodeposición de corriente ¡nversa con agitación ultrasónica para hacer crecer cristales únicos de Au de soluciones de cianuro. Sin embargo, el Au policristalino se depositó de soluciones de sulfito de Au utilizando una variedad de condiciones de impulso inversas: Dobrev, D; Vetter, J.; Angert. N.; Neumann. R.; Electrochimíca Acta 2000, 45, 3117-3125. Se ha mostrado anteriormente que la deposición potencioestática impulsada de una solución de sulfito de Au mejora la distribución del metal en estructuras con patrón de fotorresistencia, pero no influencian en gran medida las propiedades (tensión, pureza, resistencia) de las películas de Au, lo cual se explicó por la irreversibilidad del par Au/Au(1 ) en soluciones de sulfito: Horkans. J.; Romankies, L.T.; J. Electrochem. Soc. 1977, 124, 1499-1505. Los parámetros del impulso (corriente del impulso, frecuencia y ciclo de trabajo) se han variado de tal manera que la corriente de deposición promedio fue algo baja (0.25-1 mA/cm2) para asegurar un crecimiento lento de las tiras de Au y Ag. La deposición exitosa de logró a las siguientes condiciones de deposición por impulsos: corriente del impulso de 2 mA/cm2; intervalo de la frecuencia 0.02.5 - 2.5 Hz y ciclo de trabajo 0.1-0.3. Las mismas condiciones del impulso se utilizaron para tiras de Au y Ag dentro de un experimento. Se utilizó un Potenciostato/Galvanostato con Múltiples canales (Princeton Applied Research); después de depositar cada tira, la solución se cambió, seguido por un enjuague y relleno con la siguiente solución, de manera manual. Se ha demostrado la deposición un rendimiento de 19 tiras alternas de Au/Ag, después de la eliminación de la Ag, 3xE11 nanovarillas de Au/plantilla (35 nm de diámetro de poro) y 1xE12 nanovarillas de Au/plantilla (18 nm de diámetro de poro). La automatización de la deposición por impulsos puede incrementar además el número de partículas por otro orden de magnitud, debido a que el espesor de la plantilla es de 50 µm. La Fig. 14 muestra una imagen TEM de nanovarillas de Au con 35 nm de diámetro, liberadas en ME y el espectro de Raman de las nanovarillas después del reemplazo de ME con QSH. B. Preparación de las partículas de Au anisotrópicas de 250 nm x 250 nm. Se prepararon partículas de Au de 250 nm x 250 nm, similares a las partículas en la parte A. Se utilizaron plantillas de alúmina con un tamaño de poro de 250 nm para la electrodeposición de las partículas de Au. Ag evaporada, de aproximadamente 1 µm, sirvió como el sustrato de la deposición. Se electrodepositó Ag fresca, de 5 µm de espesor, en los orificios para el sellado adicional de la plantilla, seguido por la electrodeposición secuencial de nanoalambres que consisten de tiras alternadas de Au y Ag, cada una de 250 nm de largo. Se utilizaron soluciones de deposición comerciales: Cyless Sílver (Technic, Inc.) y Microfab Au 100 (Enthone-OMI, Inc.). Se utilizó un sintetizador semiautomático para las partículas de Nanocódigos de barras para depositar 9 tiras de Au y Ag, cada una a una corriente constante de 1 mA. Se desarrolló un protocolo de liberación iniciando con la disolución de la Ag (sustrato y tiras de Ag) en ácido nítrico, seguido por la disolución de la plantilla en Hidróxido de Sodio. Para evitar la aglomeración de las nanopartículas de Au liberadas, se introdujo una molécula reportera de Raman en tiol, 4-Mercaptofenol (MP), predisuelto en Etanol (EtOH), en el Hidróxido de Sodio durante la liberación. Los pasos de liberación son como sigue: 1. 12 ml de HNO3 al 40%, 60 minutos 2. 2 ml de MP/EtOH 28 mM + 8 ml de NaOH/20% de EtOH/80% de H2O 3M, 30 minutos 3. 200 µl de MP/EtOH 28 mM + 800 µl de NaOH/20% de EtOH/80% de H2O 3M, 30 minutos 4. Centrífuga: 4200 rpm, 2 minutos 5. 3x enjuagues con 200 µl de MP/EtOH + 800 µl de EtOH/H2O (1 :4) 6. Centrífuga: 4200 rpm, 1 después de cada muestra SEM/TEM, 10 µl cada una 7. 0.1 ml de muestra: diluir a 1 ml con H2O para UV-vis 8. 2x enjuague con H2O, centrifugar a 6200 rpm, 10 minutos cada vez 9. Adquirir el Raman La concentración de las partículas de Au después de la liberación fue de 5x109/ml. Las partículas de oro se resuspendieron en Etanol y se tomó una alícuota de 300 µl para el recubrimiento del vidrio. Se agregaron 490 µL de Etanol, 160 µL de agua 18 M, 10 µl de Hidróxido de Amonio al 30% y 40 µL de ortosílicato de tetraetilo (TEOS) puro a la alícuota de partículas de oro. La muestra se sónico y se colocó en un vórtice al ajuste más bajo para mezclar durante 45 minutos. La muestra se enjuagó a continuación tres veces en agua 18 M. Las Figs. 15A y B muestran imágenes SEM para las partículas anisotrópicas resultantes. Las Figs. 16A y B muestran una vista más cercana de una sola partícula. El espectro de Raman de las partículas se muestra en las Figs. 17A y B.

Ejemplo 11 Inmunoensayo emparedado con IL7 Un experimento de microarreglo de la proteína se simuló imprimiendo anticuerpos de IL-7 de captura en un portaobjetos de microarreglo. Cada punto fue de 500 µm en un lado, y se repitió seis veces en cada sustrato de vidrio (impreso por Telechem, Inc., Sunnyvale, CA). Se utilizó una pluma hidrofóbica para proporcionar una barrera líquida en el portaobjetos de vidrio, de manera que cada uno de los seis puntos puede tratarse de manera independíente. Después de que la pluma se secó, el portaobjetos se bloqueó durante al menos 60 minutos con seroalbúmina bovina al 5% (BSA) en suero fisiológico amortiguado con fosfato 10 mM (PBS). Todos los pasos de incubación y lavado se llevaron a cabo en un oscilador o agitador orbital, y las soluciones se aspiraron con pipeta antes de la adición de nuevas soluciones. Después del bloqueo, los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada vez (3x5) con BSA/PBS al 0.5%. Los antígenos se prepararon en una solución de BSA/PBS al 0.5% y se incubaron en los arreglos durante 45 minutos a 2 horas, después de los cual, los arreglos se lavaron una vez más (3x5) en BSA/PBS al 0.5%. SACN modificadas con IL-7 (utilizando anticuerpos biotilinados en SACN recubiertas con neutravidína) se incubaron entonces en los arreglos durante 90 minutos. Esto se siguió por un lavado (3x5) en BSA/PBS al 0.5% y enjuagues rápidos en PBS y agua. Los portaobjetos se secaron con un chorro de gas nitrógeno inmediatamente después del enjuague con agua. El espectro de Raman de estos arreglos se adquirió utilizando un láser de diodo (785 nm, 200 mW) y un espectrómetro y programa Ocean Optics USB-2000. El tiempo de integración típico para los espectros adquiridos en los arreglos de vidrio fue de dos segundos. La sustracción de la base se utilizó para eliminar la amplia base del vidrio de todos los espectros. Sin optimización, se alcanzó un límite de detección de entre 10-100 pg/ml (Fig. 18), que es comparable con muchos inmunoensayos con enzimas comerciales. El potencial para ensayos múltiplex se demostró entonces, sondeando tres diferentes analitos (ovoalbúmina, bacillus globigií y proteína reactiva C) en puntos adyacentes de un microcircuito de proteína. Los anticuerpos para cada antígeno se conjugaron a las SACN con diferentes moléculas reporteras, proporcionando partículas BPE-anti Bg, QSH-anti Ova y Bodipy-anti CRP. Un arreglo de puntos que contiene los anticuerpos de captura a los antígenos, se expuso a una mezcla de los tres antígenos. Después de un enjuague apropiado, los puntos se expusieron a las tres SACN de detección. Los espectros de Raman se recolectaron entonces para cada uno de los puntos. Los datos muestran una señal limpia en cada punto, con el punto que se diseñó para capturar CRP, dando una fuerte señal de la marca Bodipy, por ejemplo.

Eiemplo 12 Se realizó un ¡nmunoensayo de flujo lateral para Bot tox, utilizando un cartucho de flujo lateral de Tetracore, Inc.'s (Gaíthersburg, MD). En este experimento, el dispositivo se abrió, se retiró la almohadilla que contiene su reactivo de detección colorimétrico (que comprende Au coloidal conjugado a un Ab de detección), y se reemplazó con un conjugado que comprende SACN conjugadas al mismo Ab (proporcionado por Tetracore). Los espectros de Raman se recolectaron el instrumento descrito previamente. Los datos muestran una unión no específica mínima, y una captura exitosa del conjugado en la presencia del antígeno, con un límite de detección no optimizado similar a su producto comercial. Los resultados se muestran en la Fig. 19.

Ejemplo 13 Tinción de las células SK-BR3 con SACN Las células se cultivaron en un portaobjetos de cámara. Las células se lavaron con* PBS tres veces, 1 minuto cada vez. Las células se fijaron con formaldehído/PBS al 3.7% durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron como antes. Las células se bloquearon con BSA/PBS al 1% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con 1 µg/ml de anticuerpos anti-her2 de ratón (diluidos con un amortiguador de bloqueo) durante 30 minutos a temperatura ambiente, a continuación se lavaron como en lo anterior. Las células se incubaron entonces con 1 µg/ml de IgG anti-ratón biotílinada durante 30 minutos y se lavaron como en lo anterior. Las células se incubaron con 50 µl de 2X SANC conjugada con estreptavidina a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavaron como en lo anterior. Se agregó el tinte Hoechest (diluido 1 :500) y las células se incubaron durante 5 minutos. Las células se lavaron como en lo anterior. Las células se montaron con una cubierta deslizante utilizando glicerol al 90% en PBS, y los bordes se sellaron con barniz de uñas. La Fig. 21A muestra el campo brillante y las imágenes SERS de la muestra resultante, y demuestra la unión de las SACN a ubicaciones específicas en la superficie celular y el interior de la célula.

Eiemplo 14 Detección de las SACN en las muestras del tejido. Las partículas SACN también pueden detectarse en la presencia de muestras de tejido teñidas con tintes orgánicos fuertemente coloreados. Por ejemplo, la hematoxilina y eosina (H&E) son los tintes estándar utilizados para visualizar el tamaño y la forma de la célula. Ambas moléculas exhiben fluorescencia en lo visible, haciendo difícil o imposible el uso de métodos ¡nmunohistoquímicos convencionales en la misma muestra. Sin embargo, con una excitación a 785, se obtiene un fondo mínimo, volviendo las SACN fácilmente visualizables. Así, un arreglo de tejido de ratón de Zymed se trató con H&E de acuerdo con los protocolos de histopatología estándar, resultando en puntos altamente coloreados. Varios puntos se trataron con polilisina y a continuación con SACN de BPE. La Fig. 21 B muestra un espectro de Raman de los puntos no tratados y tratados, indicando la facilidad con la cual las SACN pueden observarse sobre un fondo de tinciones con H&E. En consecuencia, la presente invención proporciona 1. Un método, que comprende poner en contacto una muestra de tejido con al menos una partícula SACN conjugada con una biomolécula, capaz de unirse de manera específica a la muestra de tejido; y adquirir una imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula. El tejido se pone en contacto con uno o más reactivos adicionales que no son de SACN, tales como eosina, hemotoxilina, y una combinación de hemotoxilina y eosina. La imagen de Raman de fondo de una muestra de tejido puede obtenerse y sustraerse de la imagen de Raman de la mezcla de tejido/partículas SACN conjugada a la biomolécula. Además, ia imagen Raman puede compararse además con la imagen Raman con una imagen de una muestra de tejido que se ha teñido con tintes orgánicos fuertemente coloreados, para visualizar el tamaño y la forma de la célula, tal como una tinción con H&E.

Eiemplo 15 Marcado de animales con SACN, in vivo Se inyectaron SACN en ratones atímicos de 2 maneras: a) mediante inyección en la cola para la circulación en la corriente sanguínea y b) mediante inyección subcutánea para la ubicación bajo la piel. En ambos casos, la sonda óptica se sostuvo sobre la piel y la señal Raman detectada se emitió desde debajo de la piel. Los picos de las SACN pueden observarse sobre el fondo. El sistema de detección portátil tenía un láser a 785 nm para la excitación, fabricado por Ahura Corp. 106mW de luz se suministraron al espécimen vía una fibra óptica y una cabeza óptica fabricada por InPhotonics Inc. La luz dispersa de Raman se detectó por la misma cabeza óptica. Un filtro dicroíco envía la luz recolectada a una segunda fibra óptica, unida a un espectrómetro Ocean Optics USB2000 con una rendija de 50 mieras y un enrejado de 1200 ranuras/mm flameado a 750 nm. Los datos del espectrómetro se recolectaron por una computadora portátil.

En el caso de a) la señal se detectó a aproximadamente 45 minutos. En este momento, se detectó una señal, cuando la sonda se sostuvo sobre el hígado del ratón, Fig. 22. El espectro de la marca SERS aparece en un fondo que es una mezcla de fluorescencia del tejido y retrodispersión de Rayleigh. El fondo real medido depende de la posición de la sonda sobre la piel. Si la sonda está en contacto con la piel, entonces el espectro puede contener más fluorescencia del tejido. Si la sonda está desplazada de la piel, el espectro puede contener más retrodispersión de Rayleigh. Por ejemplo, en el caso de un espectro adquirido en el hígado, y un espectro adquirido en el flanco del ratón, los fondos son diferentes. Puesto que el fondo puede variar, las SACN tienen una ventaja, puesto que las marcas pueden cuantificarse por la altura del pico sobre el fondo. En el caso de b), la señal se detectó inmediatamente después de la inyección, como se muestra en la Fig. 23. La Fig. 23 también contiene un espectro tomado de un ratón sin SACN, adquirido en el flanco. La señal disminuiría con el tiempo conforme la marca se difunde en el cuerpo del ratón. El espectro subcutáneo también contiene algo de fluorescencia de fondo y dispersión de Rayleigh, sin embargo, la señal de la SACN es mucho más fuerte sobre el fondo.

Ejemplo 16 Experimentos de formación de imágenes celulares multiplexados Se utilizará la línea celular LNCaP, una línea celular adherente sensible a los andrógenos, derivada del carcinoma de la próstata humana. Las células LNCaP están disponibles de la ATCC (Rockville, MD). Las células LNCaP son modelos excelentes para el cáncer de próstata. Hay varios anticuerpos comercíalmente disponibles para biomarcadores, que son conocidos por ser importantes en el cáncer de la próstata, tales como la alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR) y el Antígeno Específico de la Próstata (PSA). Otros anticuerpos útiles como marcadores o controles incluyen anticuerpos para CDH1 , CTNNB1 , CCND1 , HPN, TP53, CDKN1 B y BCL2. Los anticuerpos de estos marcadores se conjugarán a las SACN.

Se realizarán experimentos de marcado y formación de imágenes celulares en los cuales las células LNCaP se tratan con varios compuestos y condiciones. El efecto en la viabilidad de la célula y la ubicación espacial de las SACN conjugadas al anticuerpo, se verificará. Las SACN conjugadas a anticuerpos AMACR y anticuerpos PSA se utilizarán para comparar la expresión de la proteína de AMACR y PSA en las líneas celulares LNCaP, DU-145 y PC-3, como se detalla por Kuefer, et al., Am J Pathol 2002, 161 , 841-48. Las células se tratarán con bicalutamida, un medicamento oral de la clase antiandrógenos de tratamientos con fármacos de prescripción para el cáncer de próstata. La LNCaP, una línea celular tumoral sensible a las hormonas, demuestra una expresión de AMACR más fuerte mediante análisis de transferencia Western que las líneas celulares DU-145 y PC-3. Tras tratar las líneas LNCaP con bicalutamida, la expresión de la proteína AMACR en las células permaneció sin cambios, mientras que el antígeno específico de la próstata, conocido por ser regulado por los andrógenos, demostró una expresión disminuida de la proteína. Se realizará la ubicación espacial de las SACN. En la formación de imágenes intracelulares, a diferencia de los experimentos de marcado superficiales, no es posible lavar las marcas no unidas. Por lo tanto, estos experimentos nos permitirán entender que pasa con las SACN en exceso que no se unen a un objetivo específico dentro de la célula (por ejemplo, si ese objetivo está desregulado, tal como PSA en este ensayo). Arnold, et al., Am. J. Physiol. Endocrinol Metab. 2004, 288, E573-E584 publicaron recientemente un estudio del efecto de la deshidroepiandrosterona (DHEA), un suplemento dietético que se vende sin receta, en la expresión del gen y la proteína de las células LNCaP. Encontraron que la DHEA afectaba la proliferación celular e incrementaba la expresión de la proteína PSA, así como el número de receptores de IGF. Utilizando las SACN conjugadas a anticuerpos de PSA, y a anticuerpos indicativos del crecimiento celular en las células cancerosas, tales como CCND1 (ciclina D1), se investigará este sistema biológico. Las células se tratarán con DHEA, testosterona, ácido retinoíco y 17beta-estradiol (E2), y se compararán los resultados de la formación de imágenes celulares con aquéllos reportados por Arnold et al.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula que comprende: a) una nanopartícula metálica anisotrópica; b) una molécula reportera activa en SERS asociada con la nanopartícula metálica anisotrópica; c) SiO que encapsula la nanopartícula metálica anisotrópica.

2. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la nanopartícula metálica anisotrópica tiene una forma seleccionada del grupo que consiste de esferoides, varillas, discos, pirámides, cubos, cilindros, nanohélices, nanorresortes, nanoanillos, nanopartículas con forma de varilla, nanopartículas con forma de flecha, nanopartículas con forma de lágrima, nanopartículas con forma de tetrápodo, nanopartículas con forma de prisma y nanopartículas porosas con formas no geométricas.

3. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la nanopartícula es de forma no geométrica, y se aproxima a una nanovarilla.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la nanopartícula tiene un diámetro de aproximadamente 250 nm y una longitud de aproximadamente 250 nm.

5. Una nanopartícula, que comprende: a) una nanopartícula con núcleo/cubierta; b) al menos una molécula reportera activa en Raman asociada con la nanopartícula con núcleo/cubierta; y c) un encapsulante de SiO2.

6. La nanopartícula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la nanopartícula con núcleo/cubierta se selecciona del grupo que consiste de una partícula de núcleo de Au2S/cubierta de Au, una partícula de núcleo de Ag/cubierta de Au, partículas de núcleo de sílice/cubierta de Au, partículas de núcleo de sílice/cubierta de Ag, partículas de núcleo de alúmina/cubierta de Au, partículas de núcleo de alúmina/cubierta de Ag, partículas de núcleo de TiO2/cubierta de Au, y partículas de núcleo de Ti?2/cubierta de Ag.

7. Un método, que comprende: a) poner en contacto una muestra de tejido con al menos una partícula de SACN conjugada con una bíomolécula, capaz de unirse de manera específica a una muestra de tejido; y b) adquirir una imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tejido se pone en contacto con uno o más reactivos adicionales que no son de SACN.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el reactivo adicional se selecciona del grupo que consiste de eosína, hemotoxilina y una combinación de hemotoxilína y eosina.

10 El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende además: a) adquirir una imagen Raman de fondo de una muestra de tejido antes del paso (a) de la reivindicación 42; y b) sustraer el espectro de fondo de la imagen Raman de la mezcla de tejido/partículas de SACN conjugadas a la biomolécula adquirida en el paso (b) de la reivindicación 42.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el tejido se pone en contacto con uno o más reactivos adicionales que no son de SACN.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el reactivo adicional se selecciona del grupo que consiste de eosina, hemotoxilina y una combinación de hemotoxilina y eosina.

13. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende además comparar la imagen Raman con una imagen de una muestra de tejido que se ha teñido con tintes orgánicos fuertemente coloreados para visualizar el tamaño y la forma de la célula.

14. Un método, que comprende, a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un analito con al menos un compañero de unión específico al analíto en una superficie de ensayo con flujo lateral para unirse al analito en la muestra; b) previamente, de manera simultánea o posterior al paso (a), unir al menos un compañero de unión del analito con una SACN; y c) detectar una señal SERS, por lo que se determina la presencia del analito en la muestra por la intensidad o presencia de la señal, por lo que se determina la presencia de al menos un analito en la muestra.

15. Un método, que comprende a) proporcionar una nanopartícula; b) asociar una molécula reportera activa en Raman con la nanopartícula; c) encapsular la nanopartícula con SÍO2; y d) modificar el SÍO2 para portar un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2 y un grupo -COO", por lo que se prepara una SACN activada.

16. Un método para detectar un analito, que comprende: a) obtener una muestra biológica; y b) poner en contacto la muestra con una SACN bioconjugada que comprende una biomolécula que se une al analito; y c) detectar el analito unido a la SACN bioconjugada.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la biomolécula y el analito son secuencias nucleotídicas complementarias.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, saliva, esputo, lágrimas, sudor, otro fluido secretado, orina, materia fecal, fluido cerebroespinal, fluido intersticial, un extracto celular y una célula.

19. Una SACN, que comprende un núcleo de nanopartícula, una molécula reportera activa en Raman, un encapsulante de SiO2 y un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de un grupo -SH, un grupo -NH2 y un grupo -COO".

20. Un método que comprende, a) administrar un agente para la formación de imágenes de una nanopartícula de SACN a un paciente, b) explorar al paciente utilizando un sistema que pueda realizar formación de imágenes espectrales; y c) generar un espectro o imagen de una región interna del paciente.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sistema se selecciona del grupo que consiste de un microscopio confocal de exploración de un punto, sistema de exploración en línea, un sistema tomográficos de coherencia óptica, un sistema que detecta sólo sobre una sola longitud de onda, un sistema de formación de imágenes con fluorescencia que comprende una fuente de luz de excitación y una detección de la imagen filtrada.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la región del paciente se selecciona del grupo que consiste de todo el paciente, la vasculatura, el hígado y el bazo, la región gastrointestinal.

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sistema que puede realizar la formación de imágenes espectrales es un sistema portátil.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la SACN está asociada de manera no covalente con una sonda para la formación de imágenes, en donde la administración comprende introducir la sonda para la formación de imágenes, y en donde las SACN se disocian en el tejido o en el fluido corporal.

25. Un método, que comprende: a) introducir una pluralidad de SACN dirigidas a una molécula involucrada en una patología anormal, en un paciente con la patología anormal, en donde las SACN se asocian a una molécula asociada con la patología anormal; y b) obtener una imagen de las SACN asociadas, por lo que puede diagnosticarse una patología anormal.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la ubicación de la patología anormal comprende el tracto gastrointestinal, corazón, pulmón, hígado, cérvix, mama y colon.

27 Un método para marcar a un animal con una SACN, que comprende introducir una SACN en un animal, en donde la introducción se selecciona del grupo que consiste de implantación subcutánea, introducción intravenosa.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además detectar la SACN o el animal marcado.

29. Un método, que comprende: a) causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; b) causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; c) repetir el paso a); y d) liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la nanopartícula metálica libre tiene una longitud de 10-300 um y un ancho de 15-300.

31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además repetir el paso b) y c).

32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la plantilla es alúmina.

33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el segundo material es un metal.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el segundo material es Ag.

35. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el metal es Au.

36. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el segundo material es Ag.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la plantilla es alúmina.

38. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la liberación comprende tratar con un ácido fuerte seguido por una base fuerte.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el ácido fuerte es ácido nítrico y la base fuerte es NaOH.

40. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la electrodeposición se selecciona del grupo que consiste de deposición por impulsos, deposición con corriente por impulsos, deposición con corriente por impulsos inversa y deposición por impulsos doble.

41. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además proporcionar una molécula SAM durante el paso c).

42. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la liberación comprende utilizar una solución que proporciona una molécula activa en SERS.

43. Un método, que comprende: a) causar la deposición de un metal en un poro de una plantilla, el diámetro del poro de la cual es menor que 300 nm; b) causar la deposición de un segundo material en el poro de la plantilla, en donde la deposición de al menos uno del primer material y el segundo material involucra procesos electroquímicos faradaicos para generar una nanopartícula segmentada, unida al poro; c) repetir el paso a); y d) liberar el segundo material y la plantilla de la nanopartícula segmentada, unida al poro con un tratamiento ácido para generar al menos dos nanopartículas metálicas libres porosas. 0

44. Un método, que comprende: a) proporcionar un microscopio acoplado a una cámara CCD; b) proporcionar una célula; c) poner en contacto la célula con al menos una SACN capaz de unirse de 5 manera específica a la célula o a una porción de la célula; d) proporcionar un dispositivo de filtración del número de onda entre la célula y la cámara e) adquirir una pluralidad de conjuntos de datos; y f) montar los conjuntos de datos; o por lo que se adquiere un perfil espacial de la SACN.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el dispositivo de filtración del número de onda se selecciona del grupo que consiste de un monocromador, un filtro de muesca, una rueda de filtro, un filtro afinable acustoóptico, un filtro de interferencia de la transformada de Fourier, un filtro afinable de cristal líquido y combinaciones de lo anterior.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el dispositivo de filtración del número de onda comprende un filtro afinable de cristal líquido, y la adquisición comprende: a) adquirir datos a una primera frecuencia; y b) opcionalmente, adquirir datos a una segunda frecuencia y frecuencias posteriores.

47. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la adquisición comprende: a) dispersar la luz desde un solo punto de una ubicación a través del monocromador; b) adquirir el espectro de Raman completo de ese punto en un detector de arreglo; y c) repetir a) y b) en múltiples ubicaciones.

48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la adquisición comprende: a) excitar la muestra con una línea de radiación; b) adquirir el espectro completo de cada píxel espacial en la línea; y c) explorar la línea a través de la muestra.