KR20150101400A - 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 산화물에 의한 금속 나노입자 클러스터 구조의 ｓｅｒｓ 나노프로브 제조방법 - Google Patents

표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 산화물에 의한 금속 나노입자 클러스터 구조의 ｓｅｒｓ 나노프로브 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라만 리포터가 부착된 금속 나노입자를 준비하고; 나노 크기의 그래핀 옥사이드를 준비하고; 상기 라만 리포터가 부착된 금속 나노입자 표면을 소수성 분자인 파이렌(pyrene)으로 개질하고; 그리고 상기 나노 크기 그래핀 옥사이드와 상기 소수성 분자인 파이렌으로 개질된 라만 리포터가 부착된 금속 나노 입자를 혼합하여 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성하는 단계;를 포함하는, 표면 증강 라만 산란(SERS)기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법을 제공한다.

Description

표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 산화물에 의한 금속 나노입자 클러스터 구조의 ＳＥＲＳ 나노프로브 제조방법{Graphene Oxide induced Metallic Nanoparticle Clustering for Surface Enhanced Raman Scattering-based Biosensing and/or Bioimaging}
본 발명은 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 금속 나노 클러스터 구조의 SERS 나노프로브에 대한 것으로, 구체적으로 그래핀 산화물에 의해 매개되는 금속 나노입자 클러스터의 제조방법 및 이의 바이오센싱 및 바이오이미징 이용에 대한 것이다.
표면 증강 라만 분산(Surface Enhanced Raman Scattering, 이하 “SERS”라고 함)은 광감지(optical detection) 기반의 고감도 바이오센서의 개발을 진척시키는 데 있어서 중요한 관심 대상이다. 특히, SERS 나노프로브와 같은 클러스터 금속 나노입자는 핫 스팟 (hot spot) 접점(junction)이 증가되기 때문에, 초고감도로 특정 생물학적 및 화학적 모이어티를 감지하는 데 있어서 중요하다.
SERS는 매우 우수한 감도로 분석물로부터 독특한 스펙트럼을 얻을 수 있는 핑거프린팅 능력이 있기 때문에, 라벨링을 하지 않고도 다양한 생물학적 및 화학적 분자들을 빠르게 감지할 수 있다(비특허문헌 1). SERS-기반 바이오센싱 및 바이오이미징은 인 비트로 및 인 비보 분석에 적합한데, 수용성 및 고체상 샘플 모두를 고감도로 비파괴적으로 검출할 수 있기 때문이다(비특허문헌 2 및 3).
금, 은 또는 구리로 구성되는 다양한 금속 나노입자들(MNPs)이 SERS-기반 바이오메디컬 어플리케이션에 사용되었다. 라만 증강은 NPs 표면 분자의 흡수에 의해 발생하는데, 화학적 메커니즘(chemical mechanism: CM)과 전자기적 메커니즘(electromagnetic mechanism: EM)을 포함하는 두 가지 형태의 메커니즘으로 이해하여야 한다. 상기 CM은 분자와 MNP 표면 사이의 전하 이동 복합체 형성에 의한 것인 반면, EM은 MNP 상의 표면 플라즈몬 방출과 연관된다. 만약 MNPs가 서로 가까이 위치해 있다면, MNPs 는 입사광에너지를 간극들(interstices)이 고도로 편재화된(localized) 플라스몬 센터로 모을 수 있다. 이 간극들이 고도로 편재화된 플라스몬 센터는 전자기장으로 유의적으로 상승시켜서 현저하게 증강된 SERS 신호를 가지는 초증강 전자기장 핫 스팟이 생긴다. 따라서, 고감도SERS-기반 바이오센싱 및 바이오이미징을 달성하기 위해서 조절된 금속 나노입자 클러스터가 형성되었고 그 결과 단일 분자 검출을 위한 플라스몬 커플링을 통한 다수의 측정 접점(hot junctions)을 생성한다(비특허문헌 1).
그래핀 옥사이드(Graphene oxide, 이하 “GO”라고 한다)는 그래핀이 산화된 형태로, sp2-혼성화된 탄소 원자로 구성된 2가지 차원의 물질로 구성되고, 허니콤 구조로 배열되어 있다. 최근에, GO의 독특한 열적, 전기적, 기계적 및 광학적 특성으로 인해 GO-기반 어플리케이션에 대한 광범위한 연구가 수행되고 있다(비특허문헌 4 및 5).
GO가 바이오 메디컬에 사용되기 위해서는, (1) 생체적합성(biocompatibility) (2) 수용성, (3) 응집 메커니즘 및 (4) 적절한 나노 크기가 필요하다. 산소 관능기가 있으면 GO가 수용성이 되고 생체적합성을 가진다. 변형된 허머즈 방법(hummers method)으로 제조된 GO는 1에서 수 마이크론 미터의 다분산(polydisperse) 크기를 가진다. 이에 반하여 약 100 nm의 나노 크기 GO(nanoscale GOs, 이하 “NGOs”라고 한다)에 대한 연구는 아직 미비하다(비특허문헌 6). 비록 GO 및 NGO는 화학적 및 분광학적 성질이 유사하지만, NGO는 더 오랜 시간 동안의 개선된 콜로이드 안정성을 가진다(비특허문헌 6).
GO-MNP 복합체 제조방법은 넓게 두 가지 부류로 나눌 수 있다. 첫째, GO 상에서 금속 양이온의 in-situ 환원을 수행하는 것인데, 나노복합체의 형태와 크기 분산을 조절하는 것이 어렵다(비특허문헌 7 및 8). 두 번째, 미리 원하는 크기와 형태를 가진 MNP 를 합성하고 그 다음에 MNPs와 GO를 혼합하는 것을 포함하는 ex-situ 접근법으로, 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 GO-MNP 를 형성한다. 반면, GO, MNPs 또는 양쪽 모두는 다수의 비공유 상호작용 분자를 이용하여 화학적으로 개질되었다(비특허문헌 8 및 9). 화학적 기능화 및 변형의 정도로, NPs 제공 량, 크기 및 분산도를 잘 조절하면서, 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 GO에 MNPs와 같은 무기 나노입자의 로딩 밀도를 조절한다(비특허문헌 10). 단백질, 폴리도파민, DNAs, 및 폴리아닐린과 같은 거대분자가, π-π 스태킹, 반데르발스 힘, 소수성 힘, 및 정전기적 상호작용과 같은 비공유 상호작용 및 수용액 조건 하에서 GO 시트의 카르복시기 및 하이드록시기와 질소 염기의 제일 아민 사이의 수소 결합반응과 같은 반응을 유도하면서 GO를 개질하는 데 이용되었다(비특허문헌 7, 11 및 12). 예를 들면, 퓨린과 피리미딘을 가지는 DNAs가 π-π 스태킹을 통한 GO 나노하이브리드의 어셈블리를 촉진하기 위해 도입되었다. 피리미딘이 표지된 DNAs 및 티올화된 DNAs 양쪽 모두 GO 상에 GNPs를 추가하기 위해 사용되었다.
그러나 대부분의 선행 연구는 SERS-기반 바이오센싱 및 바이오이미징 어플리케이션을 위해서 어떠한 클러스터도 형성하지 않고 GOs 상에 다양한 MNPs를 단순히 안착(anchoring)하는 것에 기반을 두고 있다. SERS-기반 어플리케이션을 위한 GO- MNP 복합체에 대한 보고는 매우 적다. 예를 들면, NaCl을 포함하는 전해질을 이용하여 이온 세기를 조절함으로써 GO 상에 GNP 응집물을 제조하는 것을 보여주는데, 콜로이드 안정성이 떨어지는 단점이 있다(비특허문헌 13).
따라서 SERS-기반 어플리케이션 개발을 위해서는, NGO에 의해 매개된 새로운 부류의 제어된 GNP 클러스터를 생성하기 위한 방법에 대한 연구가 필요하다. 이에 본 발명자들은 새로운 바이오센싱, 바이오이미징 및 바이오어플리케이션을 위한 새로운 SERS 나노프로브(nanoprobe)를 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 비공유결합 반응을 통해 NGOs에 의해 매개되는 소수성 모이어티를 가지는 GNPs 클러스터 형성에 대해 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 SERS기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 표면 증강 라만 산란(SERS)기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법을 제공한다:
라만 리포터가 부착된 금속 나노입자를 준비하고;
나노 크기의 그래핀 옥사이드를 준비하고;
상기 라만 리포터가 부착된 금속 나노입자 표면을 소수성 분자인 파이렌(pyrene)으로 개질하고; 그리고
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드와 상기 파이렌으로 개질된 라만 리포터가 부착된 금속 나노 입자를 혼합하여 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성하는 단계.
본 발명에서 상기 “금속 나노 입자 나노클러스터”란, 금속 나노 입자들이 모여서 응집된 응집물(aggregates)을 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.
상기 나노 크기란 이 기술분야의 통상의 기술자들이 이해하는 정도의 크기 범위를 포함한다. 구체적으로 상기 나노 크기란, 0.1에서 1000 nm일 수 있으며, 더 구체적으로는 10에서 1000 nm, 더욱 바람직하게는 20에서 500 nm, 더 더욱 바람직하게는 40에서 250 nm 일 수 있다.
상기 금속은 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에 널리 사용되고 있는 금속은 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 “라만 리포터”는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 소수성 분자인 파이렌은 1-파이렌메틸아민(1-pyrenemethylamine), 1-파이렌프로필아민(1-pyrenepropylamine), 1-파이렌부틸아민(1-pyrenebutylamine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에 널리 사용되고 있는 소수성 분자는 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있다.
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드를 준비하는 단계에서, 상기 그래핀 옥사이드 의 크기는 10 내지 1000 nm일 수 있다.
상기 제조방법은 금속 나노입자를 포함하는 용액 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 용액을 이용하여 제조될 수 있다. 이에 대해서는 하기 실시예에 구체적으로 기재하였다.
상기 파이렌의 농도는 10-9에서 10-7M일 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 라만 리포터의 농도는 10-8에서 10-5M일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드의 농도는 1.0 에서 0.001 mg/ml일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 전체의 크기는 10 내지 1000 nm일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
이하 실시예에서 구체적으로 설명하는 바와 같이, 그래핀 옥사이드의 크기는 소니케이션 시간을 통해 조절할 수 있다. 본 발명은 상기 NO에 금속 나노입자가 응집되면서 클러스터를 형성하고 그 결과 그래핀 옥사이드와 금속 나노입자의 클러스터를 형성하게 된다. 따라서 상기 그래핀 옥사이드의 크기가 작아지면 결과적으로 생성되는 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터의 전체 크기도 작아지게 된다. 즉, 본 발명의 방법을 이용하면 클러스터의 크기를 쉽게 조절할 수 있다.
구체적으로, 상기 나노 크기의 그래핀 옥사이드를 준비하는 단계에서 상기 그래핀 옥사이드의 크기를 조절하고, 상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성하는 단계에서 상기 크기가 조절된 나노 크기 그래핀 옥사이드를 이용하여 상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성함으로써, 크기가 조절된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 얻을 수 있다.
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드의 크기 조절은 소니케이션 처리에 의할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은,
파이렌으로 표면이 개질되고 라만 리포터가 결합된 금속 나노입자; 및
상기 금속 나노입자와 비공유 상호작용을 통해 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드;
로 이루어지고, 상기 금속나노입자는 상기 나노크기 그래핀 옥사이드 상에서 금속 클러스터를 형성하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS)기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터를 제공한다.
또한 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 표면 증강 라만 산란 (surface-enhanced Raman scattering; SERS) 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 방법을 제공한다:
항원을 준비하고;
상기 언급한 방법에 따라 제조된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터에 상기 항원에 특이적인 항체를 컨쥬게이션하여 항체가 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 제조하고;
자성 입자에 상기 항원에 특이적인 항체를 컨쥬게이션하여 항체가 결합된 자성 입자를 제조하고;
상기 항체가 결합된 자성 입자와 항원을 반응시켜 자성 입자-항원의 면역 복합체를 형성하고;
상기 자성 입자-항원의 면역복합체와, 상기 항원에 특이적인 항체가 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 혼합하여 샌드위치 면역복합체를 형성하고; 그리고
상기 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 단계.
상기 항체가 결합된 자성 입자는, 상기 자성 입자가 폴리머에 둘러싸여 캡슐화되어 있을 수 있다.
상기 자성 입자는 자성 나노입자를 포함하며, 이 기술분야에 널리 알려진 자성 입자는 어느 것이나 사용할 수 있다.
상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터에 결합된 항체는 상기 항원에 특이적인 폴리클론 항체일 수 있다.
상기 자성 입자에 결합된 항체는 상기 항원에 특이적인 모노클론 항체일 수 있다.
샌드위치 면역복합체의 형성(항체-항원-항체의 복합체)과 이를 SERS에 이용하는 것은 이 기술분야에 알려져 있으므로, 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.
상기 “바이오센싱 및/또는 바이오이미징”이란 생물학적 물질을 감지하고 그리고/또는 생체 이미지를 측정하는 것을 말한다.
본 발명자들은 바이오센싱 및/또는 바이오어플리케이션을 위한 새로운 SERS 나노태그(nanaotag)를 개발하기 위해, 약 10 내지 1000 nm, 바람직하게는 10 내지 250 nm, 더욱 바람직하게는 약 120 nm 의 평균 크기를 가지는 나노크기 그래핀 옥사이드(NGOs)를 이용하여 금속 나노입자, 구체적으로 골드 나노입자[gold nanoparticles (GNPs)]의 클러스터(cluster) 구조인, NGO-GNPC를 형성하는 방법을 개발하였다.
하기 실시예에서는, GNPs 표면에 소수성 모이어티를 도입하기 위해서 MPY (4-mercaptopyridine)를 라만 리포터로 가지는 GNPs가 PMA(1-pyrenemethylamine)로 개질되었고, 그 다음에 GNPs와 NGOs 사이의 π-π 스태킹(stacking)과 반데르발스 상호작용과 같은 비공유적 상호작용을 통해 GNPs와 NGO가 복합체를 형성하고, 그 결과 평균 크기 약 140 nm인 NGO-GNP 클러스터(NGO-GNPCs)를 형성한다. 간극들(interstices)이 고도로 편재화된(localized) 플라스몬 센터에서 전자기성이 증강되기 때문에, NGO-유도성 GNP 클러스터는 개별 GNP보다 SERS 신호가 3-4배 더 높게 나타났다. 이는 측정 스팟 접점들(hot spot junctions)로 불리는 간극들의 고도로 편재화된 플라스몬 중심에서 강한 전자기성 증강이 나타나기 때문이다.
라만 세기(Raman intensity)에 대한 MPY, PMA, GO의 농도 및 GO 크기의 효과를 연구한 결과, 이들의 몰비와 라만 세기 사이에 선형 상관관계를 나타냈다. 마지막으로, SERS 나노프로브인 NGO-GNPCs와 자기장 기반 분리 도구인 자성 입자, 구체적으로 자성 비드(MBs)를 포함하여 구성된 샌드위치형 면역복합체를 이용하여 다양한 생물학적 분자들을 검출할 수 있는 바이오센싱 응용을 증명하였다. 구체적으로, 항-인간 모노클론 항체(mAbs)가 -COOH기를 이용하여 MBs와 화학적으로 컨쥬게이션되는 동안 항-인간 IgG 폴리클론 항체(pAbs)와 NGO-GNPCs와 화학적으로 컨쥬게이션되었다. 항원으로 IgG가 존재하면서 NGO-GNPCs-항원-MBs 복합체가 형성되었고, 라만 세기와 IgG 농도 사이는 선형 상관관계를 나타내었으며, IgG 검출 LOD(limit of detection)는 45.0 ng/ml 이하를 나타냈다.
본 발명에 따른 NGO-GNPCs는 안정적이고 재현가능하며 그리고 고감도를 가지는 SERS 나노프로브로 유용하다. 그 이유는 콜로이드 안정성이 좋은 NGOs를 이용하여 GNP 클러스터의 크기를 잘 조절하여 만들 수 있기 때문이다. 이를 통해 고도로 증강된 전자기성 측정 스팟들이 만들어지고 생체적합성이 좋으므로 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 어플리케이션으로 이용하기에도 좋다. 또한 SERS 나노프로브로서 NGO-GNPCs의 장점은 SERS 나노프로브와 분석물 및 MBs 사이에 빠른 분자 반응이 일어난다는 것인데, 이는 고체상 기질의 확산-제한적 키네틱스(diffusion-limited kinetics)에 의해 야기되는 느린 면역반응을 극복할 수 있는 효과를 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 새로운 SERS 나노프로브인 NGO-GNPCs는 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 어플리케이션으로 이용될 수 있는 효과를 제공한다.
도 1은 SERS 어플리케이션에 사용하기 위한, 나노 크기 그래핀 옥사이드(NGO) 매개된 제어 금속나노입자 클러스터(GNPCs)의 합성을 개략적으로 보여준다. 도 1의 (A)는 MPY의 티올기와 GNP 사이의 S-Au 결합의 형성을 통한 시트레이트-안정화된 GNP, 및 MPY-암호화된 GNP의 합성을 보여준다. 소수성 모이어티로서의 PMA 분자들은 GNP 표면 개질을 위해 선택되었고, PMA의 알킬아민류는 강한 이온성 상호작용으로 인해 GNP에 강하게 결합되어 있다. TEM 이미지는 MPY를 가지고 있고 PMA로 개질된 GNP가 균일하게 구 모양의 형태를 나타내고 있음을 보여준다. 도 1 (B)는 울트라-소니케이션을 통해 GO가 NGO로 단편화(fragmentation)되는 과정과, NGOs와 PMA-개질된 GNPs 사이의 π-π 스태킹 및 반데르발스 상호작용과 같은 비공유성 상호작용을 통해 NGO 매개 GNP 클러스터(NGO-GNPCs)의 형성 과정을 나타낸 개략도이다. TEM 이미지는 NGO-GNPCs의 형태가 잘 나오고 분산이 잘 되었음을 보여준다. NGO를 이용하였을때, SERS 스펙트럼이 현저하게 증강됨을 알 수 있다.
도 2는 NGO-GNPCs 어셈블리에 대한 소니케이션 처리 시간의 함수로서, 상이한 크기의 NGOs와 NGO-GNP 복합물(composite)를 분석하기 위한 TEM 이미지, SEM 이미지 및 DLS 측정 플롯(plot)을 보여준다. (A-F): GNPs 클러스터 형성에 대한 GO 크기의 영향을 조사하기 위하여, 1 시간(A-C) 및 2 시간(D-F) 동안 소니케이션 처리된 GOs를 이용한 NGOs(A, D)와 GO-GNP복합물(B, C, E, F)이다(0.01 mg/ml GO, 10-5M MPY 및 10-7 M PMA). (G-I): 3 시간 동안 소니케이션 처리된 NGOs (G)와 NGO 매개 GNP 클러스터(NGO-GNPCs)(H, I)의 TEM 이미지이며 인셋(inset)(G, I)은 NGOs 및 NGO 매개 GNP 클러스터의 확대된 TEM 이미지이고; (J): 3 시간 동안 소니케이션 처리된 NGO 매개 GNP 클러스터의 SEM 이미지로, NGO(G)의 평균 크기는 약 120 nm이고 이 크기에서 NGO의 다분산성(polydiversity)이 유의미하게 최소화됨을 보여준다. (K): NGOs와 함께 인큐베이션되는 PMA 모이어티가 없는 GNPs의 TEM 이미지이다. (L): NGOs가 없고 PMA 모이어티로 개질된 GNPs의 TEM 이미지이다. 대조군은, PMA 모이어티가 없거나 또는 NGO가 없는, 클러스터가 형성되지 않은 GNPs이다. (M, N): 는 DLS에 의해 분석된, 소니케이션 처리 시간의 함수로서 물에서의 NGOs의 유체 역학적 직경을 나타낸다. 소니케이션 처리 시간이 증가함에 따라 상기 직경은 점진적으로 감소하였다. (O): GO-GNP 복합물의 라만 세기를 명확하게 보여주는 그래프로, 다른 조건이 동일할 때, NGOs의 크기에 따른 GNPs 클러스터의 정도(degree)의 함수로서의 SERS 신호 증폭을 보여준다. GOs의 소니케이션 시간에 따라 NGOs의 크기가 감소하면서, 라만 세기는 증가하였다.
도 3은 라만 스펙트럼(A, C, E) 및 NGO-GNPCs의 각각의 라만 스펙트럼의 1096 cm-1에서의 라만 세기(B, D, F)이다. 신호 증강에 대한 영향을 알아보기 위해서, (A, B)는 라만 염료인 MPY 농도 함수로서의 그래프이고, (C, D)는 소수성 모이어티인 PMA의 농도 함수로서의 그래프이고, 그리고 (E, F)는 클러스터링 매개자인 NGO의 농도 함수로서의 그래프이다. (A): MPY 농도가 증가할수록 GNP 표면에 MPY의 티올기가 공유결합하여 GNP 표면에서 더 높은 SERS 신호가 발생하였다. (B) MPY 농도 함수로서 1096 cm-1의 SERS 신호의 크기는, 10-7 M PMA 및 0.01 mg/ml NGO를 사용할 때 MPY 농도와 NGO-GNPCs의 SERS 신호가 선형 관계임을 보여준다. (C, D): PMA 농도가 10-7 M 까지 증가할 때, 10-5 M MPY 및 0.01 mg/ml NGO를 사용하면 SERS 신호가 높게 나타난다. (E) 0.01 mg/ml까지 NGO의 농도가 증가하면 더 높은 SERS 신호가 발생하는데, NGO가 클러스터 형성을 위해 서로 작용하는(interfacing) 나노플레이트 역할을 하고 소수성으로 개질된 GNPs를 안정화시키기 때문이다.
도 4는 NGO-GNPCs 제조의 서로 다른 단계를 특성화하기 위한 DLS, UV 분광학적 측정 그래프이다. 그리고 NGO-GNPCs의 안전성, 재현성 및 생물학적 감지(biodetection) 능력을 확인하기 위한 라만 스펙트럼이다. (A): GNPs, MPY 부착 GNPs, MPY를 가지고 PMA로 개질된 GNPs 및 NGO-GNPCs의 유체역학적 직경을 나타낸다. GNP의 평균 유체역학적 직경은 20 nm에서 25 nm이고 MPY와 PMA가 부착된 후의 개별 GNPs의 유체역학적 직경의 변화는 무시할 정도이다. 또한, 물에서의 NGO-GNPCs의 유체역학적 직경은 대부분 140 nm이고 20 nm의 작은 피크가 동반되는데, 이는 NGOs 상에 안착되지 않은 GNP가 매우 극소수임을 의미한다. (B): MPY를 가지는 PMA로 개질된 GNPs의 NGO-매개 클러스터 형성을 확인하기 위한 UV 분광학적 측정 그래프이다. (C, D): 5개의 서로 다른 배치(batch)를 이용한 라만 스펙트럼으로, 물에서의 시간의 함수로서 이들의 콜로이드 안전성(C)과 SERS 신호의 배치-배치 가변성(D)을 보여준다. 물에서의 시간의 함수로서의 NGO-GNPCs 라만 스펙트럼은 며칠 동안 라만 세기를 유지하면서 1096 cm-1에서 라만 밴드를 사용하여 NGO-GNPCs의 SERS 신호의 좋은 재현성을 보여준다.
도 5의 (A)는 개별 자성 나노입자인 MNPs(magnetic nanoparticles)의 TEM 이미지이고 (B)는 폴리머 나노입자 내의 MNP의 TEM 이미지이다. (C)는 MNP-봉입형 폴리머 NPs의 SEM 이미지이다. (D)는 FITC-덱스트란(0.05 w/v%)를 이용한 MNP-봉입형 폴리머 NPs의 CLSM 이미지이다. 자성입자(magnetic beads, MBs)는, 종래 문헌(Jalani G, Lee S, Jung CW, Jang H, Choo J, Lim DW. Analyst. 2013;138:4756-9.)에 개시된 대로, EHD 분사(electrohydrodynamic jetting)를 통해 poly(acrylamide-co-acrylic acid) NPs 내에 캡슐화하여 합성하였다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 NGO-GNPCs와 MBs를 이용한 SERS-기반 바이오센싱 플랫폼의 모식도이다. (A)는 SERS 나노프로브로서 NGO-GNPCs가 항-인간 IgG pAbs와 화학적으로 컨쥬게이션되고, IgG의 존재하에 샌드위치형 면역복합체를 형성하기 위한 항-인간 IgG mAbs와 컨쥬게이션되어 자력에 의해 분리되는 MNP-봉입형 NPs를 보여준다. (A)의 아래 그림 부분은, 특정 분자 인식을 통한, 항-인간 IgG pAb, IgG, 및 항-인간 IgG mAb 사이의 면역복합체가 어떻게 바이오센싱을 발생시키는지를 보여준다. 샌드위치 면역복합체는 자석에 의해 유도되는 자기장을 이용하여 분리되고, 라만 세기를 발생시키고 이는 항원 농도에 정비례한다. (B)는 자기장을 통해 면역복합체가 분리되었을 때 IgG 농도의 함수로서 NGO-GNPCs-IgG-MBs 면역복합체의 라만 세기를 나타낸다. IgG 농도가 증가하면 이 증가된 농도 때문에 면역복합체의 라만 세기는 증폭된다. 그러나 대조군 실험을 보면, 최소 라만 세기가 관찰되는데, NGO-GNPCs 및 MBs에 IgG 항원과 Ab 모이어티가 없으면 면역복합체가 형성되지 않기 때문이다. (C)는 면역복합체의 라만 세기가 IgG 농도와 선형 관계(R2 =0.9110)임을 보여주는데, 이는 SERS 신호가 IgG 농도과 직접적으로 관계가 있음을 의미한다. 모든 측정에서, 각각 10-7 M, 10-6 M 및 0.01mg/ml의 PMA, MPY 및 GO 농도를 사용하여 NGO-GNPCs를 측정하였다.
도 7 은 SERS 나노프로브로서 NGO-GNPC를 바이오이미징에 적용하는 것을 보여주기 위한 개략도이다..
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 또한 본 발명에서 인용하고 있는 참고문헌은 본 발명의 명세서의 일부로 통합된다.
실시예 1 : 재료 및 방법
1-1: 재료
골드(III)클로라이드 하이드레이트(HAuCl4.3H2O), 소듐 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트(sodium citrate tribasic dehydrate), PMA (1-pyrenemethylamine) 하이드로클로라이드(hydrochloride)(95 %), 4-머캅토피리딘(4-mercaptopyridine, MPY) (95 %), 그래파이트 파우더 황산[graphite powder sulfuric acid (H2SO4, 95 - 98 %)], 소듐 니트레이트 (98 %), 포타슘 퍼망가네이트(potassium permanganate) (98 %), 하이드로젠 퍼옥사이드(hydrogen per oxide) (H2O2, 30 w/w%), HCl(hydrochloric acid), DMF (dimethylformamide), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester), EDC [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide], FeCl3·6H2O (ferric chloride hexahydrate), FeCl2·4H2O (ferrous chloride tetrahydrate), NaOH (sodium hydroxide), 및 NH4OH (ammonium hydroxide), 시트릭 액시드 모노하이드레이트(citric acid monohydrate) (≥99.0%), 고트에서 생산된 항-인간 IgG (γ-chain- specific)pAbs, 마우스에서 생산된 항-인간 IgG (Fc-specific), 및 인간 혈청으로부터의 IgG는 Sigma-Aldrich로부터 구입했다. 폴리(아크릴아미드-코-아크릴릭 액시드[poly(acrylamide-co-acrylic acid)], 폴리(AAm-co-aa)[poly(AAm-co-AA)] (MW 200 kDa, 10% acrylic acids)는 Polysciences, U.S.로부터 구입하였다. 모든 실험에 밀리포어 밀리-Q 탈이온수(Millipore Milli-Q deionized water)가 사용되었다.
1-2: 골드 나노입자( GNP ) 및 나노 크기 그래핀 옥사이드 ( NGO ) 합성
시트레이트로 안정화된 골드 나노입자(GNPs)를 Turkevich(Turkevich, J., Gold Bulletin, 1985. 18(4): p. 125-131. 및 Turkevich, J., P.C. Stevenson, and J. Hillier, Discussions of the Faraday Society, 1951. 11(0): p. 55-75.)의 제조방법에 따라 소듐 시트레이트를 사용하여 HAuCl4 환원법으로 제조하였고, Frens(Frens, G., Nature Physical Science, 1973. 241: p. 20-22.)에 기재된 방법에 따라 정제하였다. 0.01 w/v%의 골드(III) 클로라이드 하이드레이트 용액 100.0 ml을 둥근 바닥 플라스크에서 가열하였다. 용액이 끓기 시작하면 1.0 % 소듐 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트 10 ml을 첨가하였다. 이 용액을 15분 동안 끓여서 보관하였다.
그래핀 옥사이드(GO)는 허머즈의 방법(Hummers, W.S. and R.E. Offeman, Journal of the American Chemical Society, 1958. 80(6): p. 1339-1339.)에 따라 제조하였다. 그래핀 파우더 0.5 g, 황산 11.5 ml 및 소듐 니트레이트 0.25 g을 3구 환저 플라스크(three neck round flask)에 첨가하고 43.4 mg/ml의 최종 그래파이트 농도에서 격렬하게 교반하였다. 그 다음, 상기 반응 플라스크를 아이스 배쓰에 두고 과열을 피하기 위해 포타슘 퍼망가네이트 0.15 g을 10 분 동안 천천히 첨가하였다. 이 단계에서 용액은 진녹색을 띠고 아이스 배쓰를 워터 배쓰로 바꾸어 주었다. 온도는 35℃까지 올렸고, 용액을 12 시간 동안 계속 저어 주었다. 12 시간이 지나면 용액은 매우 끈적거리고 진갈색을 나타내었다. 워터 배쓰는 아이스 배쓰로 바꾸어 주었고 DI 워터 23 ml를 용액에 첨가하였다. 그 결과 생긴 진흙색의 슬러리 혼합물을 DI 워터 70.0 ml에 넣고 그 다음에 1.2 ml H2O2를 상기 용액에 첨가하였다. 용액의 온도가 40℃까지 증가하면 이 단계에서 상기 용액은 연한 노란색을 나타낸다. 이 용액을 1.21 M HCl 용액으로 3번 세척하고 DI 워터로 3번 세척하였고, DI 워터 50 ml에 현탁하였다. 온/오프 펄스 10/10 sec를 가지는 30% 진폭 세기에서 팁 소니케이터 VC 505(Vibra-cell Sonics and Materials, Inc. U.S.)를 이용하여 아이스 배쓰에서 0.5-2 시간 동안 소니케이션 처리를 수행하여 서로 다른 크기를 가지는 GO를 얻었다. 큰 플레이크와 박리되지 않은 그래파이트를 분리하기 위해, 상기 용액을 5 분 동안 8000 g에서 원심분리하였고 침전물을 버렸다. 그 다음 상등액을 DI 워터로 밤새 투석하여 남아 있는 염을 제거하고 25℃ 진공에서 동결 건조 (freeze-drying)하였다. GO 조각들을 100 nm 크기로 더 작게 만들기 위해, 2 시간의 소니케이션 후에 얻어진 0.2 mg/ml의 GO 용액을 아이스 배쓰에 넣고 온/오프 펄스 10/30 sec를 가지는 40% 진폭 세기로 추가 소니케이션을 수행하였다. 이 단계에서, 용액의 온도는 40℃ 이하로 유지하였고, 마지막으로 고속 원심분리를 12,000 rpm에서 10분 동안 수행하였다. NGOs를 포함하는 상등액을 이하의 실험에서 사용하였다.
1-3: SERS 나노프로브인 나노 크기 그래핀옥사이드 -골드 나노입자 클러스터 (NGO-GNPCs) 제조
시트레이트 안정화된 GNPs를 10,000 rpm에서 5 분 동안 세척하였다. 세척 후의 GNPs의 농도는 5.9 μg/ml로 측정되었다. 라만 염료로 MPY를 사용하였다. 다양한 농도의 MPY를, 농도 10-8에서 10-5 M의 최종 농도로 GNP 용액에 첨가하였고 60분 동안 교반하였다. GNPs를 PMA로 개질하기 위해서 DMF에서 1.0 mM의 PMA 100 μl를 최종 PMA 농도 0.1 μM에서 10 ml의 GNP와 첨가하였고 60분 동안 교반하였다. 상기 제조된 GNPs-PMA와 수용성 NGO 용액을 혼합하여 NGO-GNPCs를 형성하였다. 자세하게 설명하면, 0.1 mg/ml NGO 용액의 1.0 ml가 최종 NGO 농도 0.01 mg/ml에서 9 ml GNPs-PMA와 혼합되었고 실온에서 50분 동안 교반되어 NGO-GNPCs가 제조되었다.
1-4: 샌드위치 면역분석을 위한 자성 나노입자( MNP ) 합성 및 이의 폴리머 캡슐화( encapsulation )를 통한 MNP - 봉입형 폴리머 나노입자 제조
자성 나노입자들(MNPs)은 공개문헌의 방법으로 염화철 전구체를 이용하여 제조하였다(Laurent, S., et al., Chemical Reviews, 2008. 108(6): p. 2064-2110.). 구체적으로, 질소 환경 및 3구 플라스크(three-necked flask)에서 0.86 g FeCl2 및 2.35 g FeCl3 을 40 ml DI 워터에 첨가하였다. 온도를 80℃까지 올리고 30분 동안 격렬하게 교반하는 상황에서 5 ml NH4OH를 첨가하였다. 2.0 ml 물에 1.0 g 시트르산 무수물이 도입되었고 그 다음 온도를 95℃까지 올리고 추가로 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 소량의 분취량을 꺼내서 바이얼에서 두 번 희석하고 그 다음 수백 가우스의 정적 자기장(static magnetic field)에 두었다.
자성 나노입자의 폴리머 내 캡슐화는 공개 문헌의 방법을 기초로 제조하였다(Jalani, G., et al., Analyst, 2013. 138(17): p. 4756-9 및 대한민국 공개특허 제2012-0115125호). 구체적으로, 합성 MNPs는 자기장을 사용하여 물로 세 번 세척하였다. 상기 MNPs는, 3:1(v/v) 비율의 물과 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)의 혼합물에서 4.0 w/v% poly(AAm-co-AA)에서 현탁되었다. poly(AAm-co-AA)의 점도는 매우 높아서 안정적 EHD 분사 동안 안정적인 콘-제트(cone-jet) 모드를 유지할 수 있다. EG는 평균 입자 직경을 증가시키지 않고 용액의 점도가 증가하도록 해 준다. 그 다음 균일하게 분산된 현탁액은 23 모세관 게이지를 가지는 1 ml 시린지(Becton-Dickinson, New Jersey, US)에 로딩되었다. 상기 모세관에 고전압기 NNC HV 30(Nano NC, Korea)의 양성 터미널이 부착되고, 반면에 음성 터미널은 알루미늄 호일(Fisherbrand, US)의 콜렉팅 기질(collecting substrate)에 부착되었다. 마이크로 시린지 펌프 KDS-100 (Kd Scientific, U.S.)가 CF constant flow) 유지를 위해 사용되었다. 전압은 10에서 15 kV 로 다양하고 유량(flow rate)은 0.08에서 0.13 ml/hr로 유지되었다. SEM(scanning electron microscopy) 및 공초점 레이저 스캔 현미경 이미지에 적합하게 건조 상태에서 작은 커버 글래스를 알루미늄 호일 위에 놓았다. 콜렉팅 기질 위에서 MNP-봉입형 폴리머 NPs(MNP-embedded polymer NPs)를 175℃에서 6 시간 동안 전기적으로 가열하여 폴리머 체인의 열적 이미드화(imidization)를 수행하면서 열적 교차결합을 이루었다. 호일에서 폴리머성 NP를 긁어내고 DI 워터에 분산시키고 팁 소니케이터 sonicator VC 505(Vibra-cell Sonics and Materials, Inc. U.S.)을 사용하여 1 분 동안 소니케이션을 하였다.
1-5: GNPs , NGOs 및 NGO - GNPCs 의 특징 분석 방법
UV-Vis 흡광 분광법을 이용하여 GNPs 및 NGO에 의해 매개되는 이 클러스터들의 광학적 성질을 분석하였다. 모든 UV-Vis 흡광 측정은 실온에서 중간 스캔 속도로 싱글 10 스캔 모드의 너비 1 nm 고정 슬릿을 가진 UV-1800(Shimadzu, Japan)를 이용하였다. GNPs, GO 및 NGO-GNPCs의 콜로이드 용액 성질을 이해하기 위해, DLS(dynamic light scattering) 및 제타 전위 측정법(zeta potential measurements)을, 파장 633 nm, 스캐터링 각도 90°의 Ne-He 레이저가 공급되는 Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 수행하였다. 샘플은 DI 워터로 10:1로 희석하였다. TEM(transmission electron microscopy) 이미징은, 초박층 탄소로 코팅된 구리 그리드를 사용하여(Ted Pella Inc. U.S.) 200 kV 가속 전압에서 작동하는 투과 전자 현미경 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany)를 사용하여 개별 GNPs 및 플라스몬 결합 GNPCs를 조사하였다. 샘플 몇 방울을 실리콘 웨이퍼에 올려 두고 스캐닝 전자현미경을 이용하여 GNPs, GO-GNPCs의 특징을 조사하였다. GO의 절연 성질 때문에, 샘플을 K575X 터보 스퍼터 코터(K575X Turbo Sputter Coater)를 사용한 백금 스퍼터링으로 코팅하고 0.5 에서 30 kV의 가속 전압에서 작동하는 SEM VEGA (TESCAN, USA)를 사용하여 이미지를 찍었다. TEM 이미지의 NGO 크기는 National Institutes of Health USA에서 개발한 Image-J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 TEM 이미지는 노이즈를 최소화하기 위해 변형되었다. 수득한 TIF 이미지 포맷은 8비트 이미지 포맷으로 변환되어 바이크로매틱 이미지(bichromatic image)가 되었다. 한계값(threshold)을 조정하여 각각의 피사체를 더 정확하게 찾아내기 위해 콘트라스트(contrast)를 강화시켰다. 최소한의 입자 크기는 노이즈를 피하기 위해 30 nm로 하였다.
또한, 라만 측정은 현미경 통합 시스템을 사용하여 라만 분광법(Raman Reinshaw 2000, Reinshaw, UK)으로 수행하였고, 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)를 사용하여 수집된 스펙트럼으로부터 레일레이 선(Rayleigh lines)을 제거하였다. 633 nm에서 여기된 He/Ne 레이저 빔으로 최고 레이저 파워에서 10초 노출로 라만 리포터인 MPY를 여기시켰다. 레이저 스팟은 20X 대물렌즈에서 가시광선을 이용하여 모세관에 집중시켰다.
1-6: NGO - GNPCs 와 MNP - 봉입형 폴리머 나노입자( MNP - embedded polymer NPs )의 항체 컨쥬게이션
항원들(Ags)로서 IgG가 있을 때 샌드위치형 면역복합체를 형성하기 위해, SERS 나노프로브인 NGO-GNPCs가 항-인간 IgG-pAbs와 컨쥬게이션되었고, 반면에 자성 입자인 MNP-봉입형 폴리머 NPs는 항-인간 IgG mAbs와 결합하였다. NGO-GNPCs의 -COOH를 사용하여 종래에 알려진 방법으로 IgG 컨쥬게이션을 수행하였다(Alvarez-Puebla, R.A., et al., Angewandte Chemie International Edition, 2009. 48(1): p. 138-143.). 간단하게 설명하면, 상기 NGO-GNPCs는 최종 농도 0.01 mg/ml에서 PBS 버퍼에 현탁되었고, 10 μl의 1.917 mg/ml EDC가 상기 NGO-GNPC 용액에 첨가되었고, 그리고 한 시간 동안 계속 교반하였다. 10 μl의 항-인간 IgG pAbs 1.0 mg/ml가 최종 농도 9.0 μg/ml 로 EDC-활성화된 NGO-GNPCs에 첨가되었고, 한 시간 동안 계속 교반하였다. 마지막으로, 항-인간 IgG pAb-컨쥬게이티드 NGO-GNPCs는 4,000 rpm에서 원심분리되었고 그리고 PBS 버퍼로 세척되었다. 유사하게, MNP-봉입형 폴리머 NPs는 밤새 175℃에서 열적 안정화 이후에 폴리머 체인에 남아 있는 모이어티 -COOH기를 사용하여 항-인간 IgG mAbs와 화학적으로 컨쥬게이션되었다(Jalani, G., et al., Analyst, 2013. 138(17): p. 4756-9.) 간단하게, 1.25 mg MNP-봉입형 폴리머 NPs는 2.0 ml의 PBS 버퍼에서 현탁되었고 30% 진폭에서 팁 소니케이터를 사용하여 1 분 동안 소니케이션하였다. 균일하게 분산된 MNP-봉입형 폴리머NPs는 pH 7.4, PBS 버퍼에서, EDC와 sulfo-NHS의 최종 농도 1.766 M로, 100 μl의 3.5 mg/ml EDC 및 100 μl의 3.5mg/ml sulfo-NHS와 혼합하였다. 컨쥬게이션되지 않은 항-인간 IgG mAbs는 자기장을 사용하여 세척하였고 상기 용액은 IgG Ags의 바이오센싱을 위해 PBS 버퍼에서 재현탁되었다.
1-7: 항원 IgG 의 SERS 기반 바이오센싱
항-인간 IgG mAbs를 가진MNP-봉입형 폴리머 NPs를 사용하여 PBS의 IgG를 특이적으로 포획하였고, 반면에 항-인간 IgG pAb를 가진 NGO-GNPCs는 SERS 프로브로서 샌드위치 면역복합체를 형성하여 IgG를 감지하기 위해 사용하였다. 이 샌드위치 복합체는 2 단계를 통해 만든다. 첫 번째 단계는, 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이티드 자성입자를 IgG 항원이 포함된 PBS 버퍼 용액에 첨가하였다. 두 번째 단계에서는, 제조된 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이션된 자성입자를 SERS 프로브인 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이티드 NGO-GNPCs와 혼합하여 항-인간 IgG pAb, IgG 및 항-인간IgG mAb 사이의 특이적 분자 반응을 통해 샌드위치형 면역복합체를 형성하였다. 구체적으로, 10 μl 의 10 mg/ml 인간 IgG를 항-인간IgG mAb-컨쥬게이티드 MBs의1.0 ml 용액과 최종 IgG 농도 90 μg/ml로 혼합하였고 그 다음에 1 시간 동안 교반하였다. 항-인간 mAb-컨쥬게이티드 자성 입자 및 IgG 사이의 복합체는 자기장을 이용하여 분리되었고, 그 다음 상기 용액은 PBS로 세 번 세척되었고, PBS에 재현탁되었다. PBS 버퍼의 1.0 ml의 항-인간 IgG pAb-컨쥬게이티드 NGO-GNPCs가 상기 결과 만들어진 용액에 첨가되었고, 그 다음 1 시간 동안 교반하였다. 항-인간 IgG pAb, IgG 및 항-인간 IgG mAb 사이의 샌드위치 면역복합체는 자기장을 이용하여 분리되었고, 라만 측정을 위해 재현탁되었다. IgG 항원 및 Ab 모이어티가 없는 것을 제외하고는 모든 조건을 동일하게 하여 대조군 실험을 수행하였다.
도 1은 바이오센싱 적용을 위한 GNP의 NGO 매개 제어 클러스터를 생산하기 위한 전체 실험 프로토콜의 개략도를 보여준다. 도 1의 (A)는 MPY의 티올기와 GNP 사이의 S-Au 결합의 형성을 통한 시트레이트-안정화된 GNP, 및 MPY-암호화된 GNP의 합성을 보여준다. 소수성 모이어티로서의 PMA 분자들은 도 1(A)에 도시된 바와 같이 GNP 표면 개질을 위해 선택되었다. PMA의 알킬아민류는 강한 이온성 상호작용으로 인해 GNP에 강하게 결합되어 있었다. 도 1 (B)는 NGO와 PMA-개질된 GNP를 함께 인큐베이션 했을 경우에 이들 사이의 π-π 스태킹 및 반데르발스 상호작용과 같은 비공유성 상호작용을 통해 NGO-GNPCs의 형성을 나타낸 개략도이다.
실시예 2: NGO 의 크기 분석
도 2는 NGO-GNPCs어셈블리에 대한 소니케이션 처리 시간의 함수로서 다양한 크기의 NGOs분석을 위한 TEM, SEM 이미지 및 DLS 프로파일을 보여준다. 다양한 크기의 NGOs는 이전에 보고된 바와 같이 변형된 허머즈 방법(modified Hummer method)에 의해 제조되었다(Hummers, W.S. and R.E. Offeman, Journal of the American Chemical Society, 1958. 80(6): p. 1339-1339.). 통계학적으로, 그래파이트는 NGO의 제조를 위해 35℃에서 12 시간 동안 산화시켰고, 집중 소니케이션 처리는 GO를 나노크기의 GO로 단편화하기 위해 사용되었다. NGO는 물에서 콜로이드 안정성이 높은 것으로 알려져 있다. 도 2(A) 및 (D)는 1시간 및 2시간 동안의 소니케이션 처리 이후에 NGO의 TEM 이미지를 나타내는 것으로, 1시간 동안 소니케이션 처리된 NGO의 평균 크기는 약 475 nm인 반면에 소니케이션 처리 2시간 이후에는 NGO의 평균 크기가 230 nm로 감소하였다는 것을 보여준다. 도 2(G)는 3 시간 소니케이션으로 얻어졌을 때의 NGOs의 TEM 이미지이고, 인셋(inset)은 확대시킨 NGOs의 TEM 이미지이고, NGO의 평균 크기는 약 113 nm이다. 도 2의 (A, D, G)의 TEM 이미지는 3 시간의 소니케이션 처리 후에 상기 크기에 따른 이들의 다분산성은 유의하게 최소화되었다는 것을 보여준다. DLS에 의해 분석된 바와 같이, NGO의 크기 분산 프로필은 1, 2, 3 시간 소니케이션 후 얻어진 것을 도 2 (M)에 나타내었는데, 500 nm, 245 nm, 120 nm 보다 조금 큰 것을 보여주는데, NGO의 비구체인 평면 성질에 잠재적으로 기이한 것이다. 도 2(N)은 소니케이션 시간의 함수로서의 물에서의NGOs의 유체역학적 직경을 보여준다. 초기 그래파이트의 박리 이후에 GO의 평균 유체 역학적 직경은 2.0 μm이었으며, 이는 소니케이션 처리 시간이 증감함에 따라 점진적으로 감소하였다. NGO의 평균 유체 역학적 직경이 감소하게 되는 반면, NGO의 제타 전위 값은 소니케이션 처리 시간이 증가함에 따라 약 -35.0 mV로서 일정하게 유지되었으며, 그 결과 NGO가 제타 전위를 일정한 음의 값으로 유지한다는 것은 소니케이션 처리 도중에 NGO의 표면 상의 산소 작용기의 순손실(net loss)이 없다는 것을 의미하는 것이다. 이를 통해, 본 발명에 따른 NGO-GNPCs의 크기는 NGO의 소니케이션 처리 시간을 조절하여 얼마든지 조절할 수 있음을 알 수 있고, 10 내지 1000 nm의 NGO-GNPCs 뿐만 아니라 100 nm 이하의 NGO-GNPCs 제작도 가능함을 알 수 있다.
실시예 3: NGO - GNPCs 특징 분석
도 2(B, C)는 1시간, (E, F)는 2시간 동안 소니케이션된 GOs를 사용하여 서로 다른 크기 배율을 가지는 GO-GNP 복합물의 TEM 이미지로, GOs의 상대적으로 넓은 표면으로 인해 유의미한 클러스터 형성 없이 무작위로 떨어져 위치한 GNPs를 보여 준다. 그러나 도 2(H, I)는 3 시간의 소니케이션 후에 얻어진 평균 크기 약 120 nm의 NGO가 GNP 클러스터를 잘 만드는 것을 보여준다. 특히, GNP 크기가 약 120 nm일때, GNP 안착(anchoring)이 가능하고, 이 GNPs는 서로 인접한 GNPs의 단지 작은 표면에만 구속되므로 매우 높은 정도로 클러스터를 형성할 수 있다. 또한, 도 2(I)에 나타난 것과 같이 NGO-GNPs의 어두운 영역은 NGOs의 양쪽 사이드에 부착된 GNPCs 때문이다. 도 2(J)에서 NGO-GNPCs의 SEM 영상은 NGO에 의해 매개된 3차원 GNPs 클러스터를 명확하게 보여준다. 또한 소수성 PMA 모이어티와 NGO가 없는 MPY-부착 GNPs 사이의 비공유 반응의 정도를 대조군으로서 측정하였다. 도 2(K)에 나타난 것과 같이, NGOs와 함께 인큐베이션되는 PMA 모이어티가 없는 GNPs의 TEM 이미지로 클러스터가 형성되지 않은 NGOs의 표면에서는 매우 극소수의 MPY-부착 GNP가 관찰되었는데, 이들 사이에 파이-파이 반응이나 반데르발스 반응이 없기 때문이다. 이는 PMA를 이용한 GNPs 표면 개질 정도에 따라 NGO-GNPCs 형성을 위한 파이-파이 스태킹 및 반데르발스 반응을 조절할 수 있음을 의미한다. 도 2(L)은 또한 또 다른 대조군으로서, NGOs가 없고 MPY를 가지고 PMA로 개질된 GNPs의 TEM 이미지를 보여주는데, NGOs 없이는 유의미한 GNP 클러스터 형성이 없음을 보여준다. 이러한 구체적인 NGO-GNPCs 분석을 통해, 도 2(O)는 GO-GNP 복합물의 라만 세기를 명확하게 보여주는 그래프로, 다른 조건이 동일할 때, NGOs의 크기에 따른 GNPs 클러스터의 정도(degree)의 함수로서의 SERS 신호 증폭을 보여준다. GOs의 소니케이션 시간에 따라 NGOs의 크기가 감소하면서, 라만 세기는 증가하였다. 특히, 3 시간의 소니케이션으로 얻어진 NGOs 상의 GNPCs의 세기는 약 1 시간의 소니케이션으로 얻어진 GO를 가지는 GNPs와 비교하여 약 3-4 배 높은 라만 세기를 보여준다. 이는 약 120 nm의 평균 크기를 가지는 NGOs의 매우 작은 표면이 매우 높은 정도로 GNPs의 클러스터 형성을 유도한다는 것을 의미한다. NGO-GNPCs의 정성적 및 정량적 분석은 라만 염료를 가진 PMA 개질된 GNPs가 NGOs에 의해 파이-파이 스태킹 및 반데르발스 힘과 같은 비공유 반응을 통한 제어된 방식으로 클러스터화됨을 알 수 있다.
도 3은 라만 스펙트럼(A, C, E) 및 NGO-GNPCs의 각각의 라만 스펙트럼의 1096 cm-1에서의 라만 세기(B, D, F)이다. 신호 증강에 대한 영향을 알아보기 위해서, (A, B)는 라만 염료인 MPY 농도 함수로서의 그래프이고, (C, D)는 소수성 모이어티인 PMA의 농도 함수로서의 그래프이고, 그리고 (E, F)는 클러스터링 매개자인 NGO의 농도 함수로서의 그래프이다. (A): MPY 농도가 증가할수록 GNP 표면에 MPY의 티올기가 공유결합하여 GNP 표면에서 더 높은 SERS 신호가 발생하였다. (B) MPY 농도 함수로서 1096 cm-1의 SERS 신호의 크기는, 10-7 M PMA 및 0.01 mg/ml NGO를 사용할 때 MPY 농도와 NGO-GNPCs의 SERS 신호가 선형 관계임을 보여준다(R2=0.95). (C, D): PMA 농도가 10-7 M 까지 증가할 때, 10-5 M MPY 및 0.01 mg/ml NGO를 사용하면 SERS 신호가 높게 나타난다. 이는, GNP크러스터의 정도가 직접적으로 NGO 상의 PMA 분산도에 비례하는 것을 나타내는데, 이는 10-5 M MPY 및 0.01 mg/ml NGO 를 사용할 때 NGO 상의 PMA 개질된 GNPs 사이의 핫 스팟 접점(hot spot junction)의 증가된 밀도에 기인한다. (E) 0.01 mg/ml까지 NGO의 농도가 증가하면 더 높은 SERS 신호가 발생하는데, NGO가 클러스터 형성을 위해 서로 작용하는(interfacing) 나노플레이트 역할을 하고 소수성으로 개질된 GNPs를 안정화시키기 때문이다. NGOs의 농도가 0.001 mg/ml로 너무 낮으면 NGOs 상의 GNPCs의 밀도가 낮아서 라만 신호 증강이 나타나지 않았고 NGOs의 농도가 1.0 mg/ml 이상으로 너무 높으면 큰 분산 및 배경 노이즈가 발생하였다.
도 4는 NGO-GNPs 제조의 서로 다른 단계를 특성화하기 위한 DLS, UV 분광학적 측정 그래프이다. 그리고 NGO-GNPCs의 안전성, 재현성 및 생물학적 감지(biodetection) 능력을 확인하기 위한 라만 스펙트럼이다. 도 4 (A)는 물에서 나노구조가 균질한지 확인하기 위한, GNPs, MPY 부착 GNPs, MPY를 가지고 PMA로 개질된 GNPs 및 NGO-GNPCs의 유체역학적 직경을 나타낸다. GNP의 평균 유체역학적 직경은 20 nm에서 25 nm이고 MPY와 PMA가 부착된 후의 개별 GNPs의 유체역학적 직경의 변화는 무시할 정도이다. 또한, 물에서의 NGO-GNPCs의 유체역학적 직경은 대부분 140 nm이고 20 nm의 작은 피크가 동반되는데, 이는 NGOs 상에 안착되지 않은 GNP가 매우 극소수임을 의미한다. 도 4 (B)는 MPY를 가지는 PMA로 개질된 GNPs의 NGO-매개 클러스터 형성을 확인하기 위한 UV 분광학적 측정 그래프이다. 직경이 약 20nm인 합성 GNPs는 525 nm에서 피크를 갖는 흡수 밴드를 나타내는 반면, MPY를 갖는 PMA-개질된 GNPs가 NGOs에 의해 클러스터링되는 경우, SPR 흡수 밴드는 742 nm에서의 부가적인 피크의 발생에 의해 적색 이동하였다. 적색 이동(red shift)은, 클러스터 형성을 나타내는 추가적인 밴드와 함께, 입자간 플라스몬성 커플링에 기인한다. NGO-GNPCs의 GNPs의 기하학적 배열에서의 이러한 변화는, 또한 적색에서 옅은 청색으로의 색 변화에 의해 증명되었다. 게다가, 개별 GNPs의 제타 전위값은 -36 mV인 반면, NGO-GNPCs의 제타 전위값은 약 -30 mV이며, 그 결과 NGO-GNPCs가 콜로이드 상태로 있다는 것을 확인하였다. 제타 전위에서의 약간의 감소는 GNPs 표면 상의 양으로 하전된 파이렌 분자들의 흡수에 기인한다.
도 4(C, D)는 5개의 서로 다른 배치(batch)를 이용한 라만 스펙트럼으로, 수용맥 및 PBS 버퍼에서 이들의 콜로이드 안전성(C)과 SERS 신호의 배치-배치 가변성(D)을 보여준다. 물에서의 시간의 함수로서의 GO-GNPCs 라만 스펙트럼은 며칠 동안 라만 세기를 유지하면서 1096 cm-1에서 라만 밴드를 사용하여 NGO-GNPCs의 SERS 신호의 좋은 재현성을 보여준다. NGOs 매개GNPs 클러스터는 이들 사이의 정전기적 척력에 의해 안정한 콜로이드 상태 형성을 촉진하고, 이는 NGO-GNPC가 라만 분산 기반 바이오센싱 어플리케이션용 SERS 프로브로 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 4: SERS 기반 바이오센싱 플랫폼 제조
도 5 (A)는 MNP-봉입형 폴리머 나노입자인 자성 비드(magnetic beads, MBs) 제조에 사용된 초상자성 입자의 TEM이미지이다. 초상자성 입자는 평균 크기 약 10 nm이고 좋은 구형 형태를 가진다. MBs는 종래 문헌(Jalani G, Lee S, Jung CW, Jang H, Choo J, Lim DW. Analyst . 2013;138:4756-9.)에 개시된 대로, EHD 분사(electrohydrodynamic jetting)를 통해 poly(acrylamide-co-acrylic acid) NPs 내에 캡슐화하여 합성하였다. 도 5(B)는 MNP-봉입형 폴리머 NPs의 TEM 이미지, 5(C)는 MNP-봉입형 폴리머 NPs의 SEM 이미지 그리고 5(D)는 수용성 조건 하에서 팽윤 상태(swollen state)의 MNP-봉입형 폴리머 NPs의 형광 이미지이다. 건조 상태의 MNP-봉입형 PNPs는 평균 크기가 1.0 μm이고 구형이다.
도 6(A)에 나타난 바와 같이, GO 기저면과 GNPC 표면의 -COOH기의 활성화에 의해 항-인간 IgG pAbs와 SERS 나노프로브인 NGO-GNPCs가 화학적으로 컨쥬게이션 되었다. 분리용 MBs인 MNP-봉입형 폴리머 NPs는, IgG의 존재하에 샌드위치 면역복합체 형성을 위해 175℃에서 밤새 열적 안정화된 후에 폴리머 체인에 남아 있는 -COOH기를 이용하여 항-인간 IgG와 컨쥬게이션되었다. 도 6(A)의 아래 그림 부분은 면역복합체를 형성하는 두 단계의 과정을 보여준다. 첫 번째로, 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이션 MBs가 인간 IgG가 포함된 PBS 버퍼에 첨가되어 특이적으로 IgG를 포획한다. 그리고 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이션 MBs와 IgG 사이에 복합체가 형성되고 자기장을 사용하여 분리한다. 그 다음 용액을 세척하고 재현탁한다. 두 번째로, 제조된 상기 면역복합체를, SERS 프로브인 항-인간 IgG pAb-컨쥬게이션 NGO-GNPCs와 혼합한다. 상기 항-인간 IgG pAb-컨쥬게이션 NGO-GNPCs와; 항-인간 IgG mAb-컨쥬게이션 MBs가, 항-IgG pAb, IgG, 및 항-인간 IgG mAb 사이에 특정 분자 반응을 통해 샌드위치 면역복합체를 형성한다. 이 샌드위치 면역복합체를 자기장을 이용하여 분리한다. 측정된 라만 세기는 항원 농도에 직접적으로 비례한다. 도 6 (B)는 자기장을 통해 면역복합체가 분리되었을 때 IgG 농도의 함수로서 NGO-GNPCs-IgG-MBs 면역복합체의 라만 세기를 나타낸다. IgG 농도가 증가하면 이 증가된 농도 때문에 면역복합체의 라만 세기는 증폭된다. 그러나 대조군 실험을 보면, 최소 라만 세기가 관찰되는데, NGO-GNPCs 및 MBs에 IgG 항원과 Ab 모이어티가 없으면 면역복합체가 형성되지 않기 때문이다. 도 6(C)는 3차원의 면역복합체의 라만 세기가 IgG 농도와 선형 관계(R2 =0.9110)임을 보여주는데, 이는 SERS 신호가 IgG 농도와 정비례함을 의미한다.
1,096cm-1에서 라만 세기를 이용한 면역 복합체의 LOD(limit of detection)는 45.0 ng/ml이하로 측정되었다. 이 LOD값은 통상적인 ELISA 방법(Ihara T, Mori Y, Imamura T, Mukae M, Tanaka S, Jyo A. Analytica chimica acta. 2006;578:11-8. 및 Goldman ER, Clapp AR, Anderson GP, Uyeda HT, Mauro JM, Medintz IL, et al. Analytical chemistry. 2003;76:684-8.)을 사용하여 측정한 값보다 낮았다. NGO-GNPCs가 SERS 나노프로브로 이용하기 좋은 장점 중 하나는, 어떠한 광퇴색(photobleaching)을 보이지 않고 분석시간도 길지 않으면서 SERS 기반 바이오센싱을 위한 높은 민감도를 나타내고, 샘플 용액 내에서 SERS 나노프로브, 바이오거대분자 및 MBs 사이에 신속한 분자간 상호작용이 일어난다는 것이다.
실시예 5: SERS 기반 바이오이미징 플랫폼 제조
도 7은 SERS 나노프로브로서 NGO-GNPC를 바이오이미징에 적용하는 것을 보여주기 위한 개략도로서, 구체적으로는 세포 바이오마커에 대한 항체가 컨쥬게이션된 NGO-GNPC를 SERS 나노프로브로 사용해서 얻는 세포 이미징 및 라만 신호에 대한 그래프이다. NGO-GNPC를 이용한 세포의 SERS 맵핑 이미지 모식도이고, 라만 이미지는 라만 밴드 중에서 가장 강한 라만 피크를 이용하여 측정한 그래프 모식도이다.

Claims (21)

  1. 라만 리포터가 부착된 금속 나노입자를 준비하고;
    나노 크기의 그래핀 옥사이드를 준비하고;
    상기 라만 리포터가 부착된 금속 나노입자 표면을 소수성 분자인 파이렌(pyrene)으로 개질하고; 그리고
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드와 상기 소수성 분자인 파이렌으로 개질된 라만 리포터가 부착된 금속 나노 입자를 혼합하여 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성하는 단계;
    를 포함하는, 표면 증강 라만 산란(SERS) 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속은 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 라만 리포터는 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 분자인 파이렌은 1-파이렌메틸아민(1-pyrenemethylamine), 1-파이렌프로필아민(1-pyrenepropylamine), 1-파이렌부틸아민(1-pyrenebutylamine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드를 준비하는 단계에서, 상기 그래핀 옥사이드의 크기는 10 내지 1000 nm인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 분자인 파이렌의 농도는 10-9에서 10-7M인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 라만 리포터의 농도는 10-8에서 10-5M인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드의 농도는 1.0 에서 0.001 mg/ml인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 전체의 크기는 10 내지 1000 nm인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노 크기의 그래핀 옥사이드를 준비하는 단계에서 상기 그래핀 옥사이드의 크기를 조절하고, 상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성하는 단계에서 상기 크기가 조절된 나노 크기 그래핀 옥사이드를 이용하여 상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 형성함으로써, 크기가 조절된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 얻는 것을 특징으로 하는 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드의 크기 조절은 소니케이션 처리로 조절하는 것을 특징으로 하는 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 구조의 SERS 나노프로브 제조방법.
  12. 파이렌으로 표면이 개질되고 라만 리포터가 결합된 금속 나노입자; 및
    상기 금속 나노입자와 비공유 상호작용을 통해 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드;
    로 이루어지고, 상기 금속나노입자는 상기 나노크기 그래핀 옥사이드 상에서 금속 클러스터를 형성하는 것을 특징으로 하는, 표면 증강 라만 산란 (surface-enhanced Raman scattering; SERS) 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 금속은 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 라만 리포터는 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 소수성 분자인 파이렌은 1-파이렌메틸아민(1-pyrenemethylamine), 1-파이렌프로필아민(1-pyrenepropylamine), 1-파이렌부틸아민(1-pyrenebutylamine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드의 크기는 10 내지 1000 nm인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터 전체의 크기는 10 내지 1000 nm인 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속나노입자 클러스터.
  18. 항원을 준비하고;
    제12항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따라 제조된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터에 상기 항원에 특이적인 항체를 컨쥬게이션하여 항체가 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 제조하고;
    자성 입자에 상기 항원에 특이적인 항체를 컨쥬게이션하여 항체가 결합된 자성 입자를 제조하고;
    상기 항체가 결합된 자성 입자와 항원을 반응시켜 자성 입자-항원의 면역 복합체를 형성하고;
    상기 자성 입자-항원의 면역복합체와, 상기 항원에 특이적인 항체가 결합된 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 혼합하여 샌드위치 면역복합체를 형성하고; 그리고
    상기 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 단계;
    를 포함하는 표면 증강 라만 산란 (surface-enhanced Raman scattering; SERS) 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 항체가 결합된 자성 입자는, 상기 자성 입자가 폴리머에 둘러싸여 캡슐화되어 있는 것을 특징으로 하는 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터에 결합된 항체는 상기 항원에 특이적인 폴리클론 항체인 것을 특징으로 하는 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 자성 입자에 결합된 항체는 상기 항원에 특이적인 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 SERS 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 나노 크기 그래핀 옥사이드-금속 나노입자 클러스터를 이용한 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
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