MXPA06011240A - Inmunoglobulinas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a inmunoglobulinas, tales anticuerpos, que unen específicamente Oncostatin M (OSM), particularmente OSM humano (hOSM) y modula la interacción entre OMS y gp130. En modalidades típicas, OSM se glicosila. La invención también se refiere a anticuerpos que modulan la interacción entre tanto el Sitio II como Sitio III de OSM y sus patrones de interacción respectivos. Se describen además composiciones farmacéuticas, métodos de selección y tratamiento médico.

Description

INMUNOGLOBULINAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a inmunoglobulinas que unen específicamente Oncostatin M (OSM) y en particular OSM humano (hOSM). Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos que unen específicamente hOSM. La presente invención también se refiere a métodos para tratar enfermedades o desórdenes con dichas inmunoglobulinas, composiciones farmacéuticas comprendiendo dichas inmunoglobulinas y métodos de fabricación. Otros aspectos de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción.

Antecedentes de la Invención Oncostatin M es una glicoproteína 28 KDa que pertenece a la familia de citoquinas de interleuqina 6 (IL-6) que incluye IL-6, Factor Inhibidor de Leucemia (LI F), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cardiotropin-1 (CT-1 ) y citoquina similar a cardiotrofin (Ver Kishimoto T er al (1995) Blood 86: 1243-1254), que comparte el receptor de señalización de transmembrana gp130 (Ver Taga T and Kishimoto T (1997) Annu. Rev. immunol. 15: 797-819). OSM se descubre originalmente por su habilidad para inhibir el crecimiento de la estirpe de célula de melanoma A375 (Ver Malik N (1989) et al Mol Cell Biol 9: 2847-2853). Subsiguientemente, más efectos se descubren y se encuentra que es un mediador multifuncional como otras membranas de la familia I L-6. OSM se produce en una variedad de tipos celulares incluyendo macrófagos, células T activadas (Ver Zarling JM (1986) PNAS (USA) 83: 9739-9743), neutrófilos polimorfonucleares (Ver Grenier A et al (1999) Blood 93: 1413-1421 ) , eosinófilos (Ver Tamura S er al (2002) Dev. Dyn. 225: 327-31 ), células dendríticas (Ver Suda T et al (2002) Cytokine 17:335-340). Páncreas, riñon, testículos, bazo, estómago y cerebro (Ver Znoyko I et al (2005) Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283: 182-186), y médula ósea (Ver Psenak O et al (2003) Acta Haematol 109: 68-75) Sus efectos biológicos principales incluyen activación de endotelio (Ver Brown TJ er al (1993) Blood 82: 33-7), activación de la respuesta de fase aguda (Ver Benigni F et al (1996) Blood 87: 1851 -1854), inducción de proliferación celular o diferenciación, modulación de liberación mediadora inflamatoria y hematopoyesis (Ver Tanaka M et al (2003) 102: 3154-3162), re-modelación de hueso (Ver de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160: 1733-1743) y, promoción de angiogénesis (Ver Vasse M er al (1999) Arterioscler Thromb Vase Biol 19: 1835-1842) y curación de herida. Los receptores para OSM (receptor ß OSM, "OSMRß") se expresan en un amplio rango de células incluyendo células epiteliales, condorcitos, fibroblastos (Ver Langdon C et al (2003) J Immunol 170: 548-555), músculo liso neuronal, nodo linf, hueso, corazón, intestino delgado, pulmón, riñon (Ver Tamura S et al (2002) Mech Dev 1 15: 127-131 ) y células endoteliales. Varias líneas de evidencia sugieren que las células endoteliales son un objetivo primario para OSM. Estas células expresan números 10 a 20 veces más grandes de ambos receptores, de alta y baja afinidad, y muestran alteraciones profundas y prolongadas en fenotipo después de la estimulación con OSM (Ver Modur V er al (1997) J Clin Invest 100: 158-168). Además, OSM es un factor de crecimiento autócrino principal para células de sarcoma de Kaposi, que se enseña que son de origen endotelial (Ver Murakami-Mori K et al (1995) J Clin Invest 96: 1319-1327). En común con otras citoquinas de familia IL-6, OSM se une a la glicoproteína de transducción de señal de transmembrana gp130. Una característica clave de las citoquinas gp130 es la formación de complejos receptores oligoméricos que comprenden gp130 y uno o más co-receptores dependiendo del ligando (Revisado en Heinrich PC et al (2003) Biochem J . 374: 1 -20). Como un resultado, estas citoquinas pueden mediar ambas actividades biológicas, compartidas y únicas, in vitro e in vivo dependiendo de la composición del complejo receptor formado. OSM humano (hOSM) difiere de las otras citoquinas IL-6 en que puede formar complejos con gp130 y ya sea uno de los dos co-receptores, LIFR o el receptor de oncostatin (OSMR). FIG. 1 ilustra la interacción entre hOSM y gp130, LI FR y OSMR. La estructura de cristal de hOSM se ha resuelto y mostrado que comprende un haz helicoidal a cuatro con dos sitios de glicosilación potenciales. Dos sitios de unión de ligando se han identificado por mutagénesis dirigida de sitio en la molécula hOSM (Ver Deller MC et al (2000) Structural Fold Des. 8:863-874). El primero, llamado Sitio II (algunas veces, "sitio 2") interactua con gp130 y el segundo sitio, llamado Sitio I II (algunas veces "sitio 3"), en el extremo opuesto de la molécula interactúa con ya sea LIFR u OSMR. Experimentos de mutagénesis han mostrado que los sitios de unión para LI FR y OSMR son casi idénticos pero que una mutación de ácido nucleico única puede discriminar entre los dos. OSM se sintetiza como una proteína conteniendo una secuencia de señal de terminal N de 25 aminoácidos (AA) hidrofóbicos y un propéptido de terminal C de 33 AA, ambos de los cuales se separan para generar OSM maduro. Proproteína OSM no tiene actividad biológica pero se incrementa significativamente por separación del propéptido de terminal C (Ver Bruce A.G. et al (1992) Prog.Growth Factor Res. 4: 157-170, Malik N et al (1989) Mol. Cell Biol. 9: 2847-2853). OSM se ha descrito como una "molécula en forma de barrera, compacta" con dimensiones de aproximadamente 2TÁ x 27Á x 56Á. Existen cuatro regiones helicoidales alfa (hélice A 10-37AA, hélice B 67-90AA, hélice C 105-131AA y hélice D 159-185AA, numeración de AA inicia después del retiro de la secuencia de señal). Las hélices A y C contienen "rulos". Las hélices se unen por dos ciclos por lo alto (ciclo AB 38-66AA, ciclo CD 130-158 AA) y se instalan como dos pares anti-paralelos (A-D y B-C). (Ver Deller M. C et al (2000) Structure 8; 863-874). Parece que la unión OSM a través de Sitio II a gp130 permite la unión de otra molécula OSM a gp130 por una interacción de Sitio II I. OSM también se unirá a ya sea LIFR o OSMR a través del Sitio III.

De esta manera, OSM forma un complejo con su receptor consistiendo de: un gp130, un LIFR o OSMR, y dos moléculas OSM. (Ver Sporeno E (1994) J. Biol. Chem.269:10991-10995, Staunton D er al (1998) Prot.Engineer 11:1093-1102 y Gearing DP (1992) Science 225:306-312). Utilizando mutagénesis, los residuos importantes para unión OSM-gp130 Sitio II son Gln20, Gly120, Gln16 y Asn124. Para unión OSM-OSMR Sitio III, los residuos importantes son Phe160 y Lys163. La interacción del Sitio II OSM es por lo tanto dependiente de Gln20, Gly120, Asn124 y a menor grado Gln16 en hOSM. Tres residuos complementarios en gp130 (Phe169, Tyr196 y Glu282) se han identificado como de observación particular en la interacción entre OSM y gp130. (Ver Deller M eí al (2000) Structure 8:863-874, Aasland D er al (2002) J. Mol. Biol.315:637-646, Timmermann A et al (2000) FEBS Lett.468: 120-124). La secuencia de aminoácidos iniciando en la posición 1 para hOSM se establece como SEQ. I. D. NO: 13 MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLM QDTSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQ TLNATLGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNILGL RNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRF LHGYHRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRK GKRLMTRGQLPR. (SEQ. I. D. NO: 13).

Residuos Sitio II de observación particular se resaltan en negritas y se subrayan. Un cADN que codifica hOSM se establece en SEQ.I.D.NO:14.

ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTC CTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCGGCTATAG GCAGCTGCTCGAAAGAGTACCGCGTGCTCCTTGGCCAGCTCC AGAAGCAGACAGATCTCATGCAGGACACCAGCAGACTCCTGGA CCCCTATATACGTATCCAAGGCCTGGATGTTCCTAAACTGAGA GAGCACTGCAGGGAGCGCCCCGGGGCCTTCCCCAGTGAGGAG ACCCTGAGGGGGCTGGGCAGGCGGGGCTTCCTGCAGACCCTC AATGCCACACTGGGCTGCGTCCTGCACAGACTGGCCGACTTAG AGCAGCGCCTCCCCAAGGCCCAGGATTTGGAGAGGTCTGGGC TGAACATCGAGGACTTGGAGAAGCTGCAGATGGCGAGGCCGA ACATCCTCGGGCTCAGGAACAACATCTACTGCATGGCCCAGCT GCTGGACAACTCAGACACGGCTGAGCCCACGAAGGCTGGCCG GGGGGCCTCTCAGCCGCCCACCCCCACCCCTGCCTCGGATGC TTTTCAGCGCAAGCTGGAGGGCTGCAGGTTCCTGCATGGCTAC CATCGCTTCATGCACTCAGTGGGGCGGGTCTTCAGCAAGTGG GGGGAGAGCCCGAACCGGAGCCGGAGACACAGCCCCCACCA GGCCCTGAGGAAGGGGGTGCGCAGGACCAGACCCTCCAGGAA AGGCAAGAGACTCATGACCAGGGGACAGCTGCCCCGGTAG (SEQ. I . D. N0: 14) Artritis reumatoide (RA) comprende un síndrome de procesos patogénicos distintos pero interconectados. Son : inflamación local y sistémica, proliferación de células sinoviales, angiogénesis y deposición de matriz conduciendo a formación de tejido panoso que invade y destruye el cartílago y h ueso, resultando en deformación e incapacidad. El apuntalamiento de esta patolog ía es la liberación crónica de citoquinas y mediadores inflamatorios de células que entran y toman residencia en la articulación inflamada de células de tejido de articulación endógena (Ver Firestein G (2003) in Rheumatology. Eds Hochberg , Silman , Smolen , Weinblatt and Weisman. Pub. Mosby. 855-884) . Los eventos de iniciación en RA se desconocen pero una abundancia de evidencia sugiere q ue incluyen activación de linfocitos T por ya sea un "auto" antígeno autólogo o externo (Ver Firestein G (2004) J Clin Invest 1 14: 471 -4). El grado al cual las células T se requieren para mantener los procesos de enfermedad en progreso una vez que se han iniciado también es incierto aunque los agentes terapéuticos tal como CTL4lg, que específicamente tienen como objetivo las células T, pueden ser efectivos en enfermedad avanzada (Ver Kremer JM ef al (2003) New Engl J Med 349: 1907-15, Moreland L et al (2004) Annual meeting of the American College of Rheumatology Abstract 1475). Los eventos más tempranos en el desarrollo de sinovitis reumatoide incluyen reclutamiento de células polimorfonucleares o mononucleares para cruzar el endotelio en capilares en la capa de forro sinovial. Aunque los polimorfos migran en fluido sinovial (SF) los linfocitos permanecen próximos a los capilares y pueden organizarse subsiguientemente en folículos linfoides ectópicos. Este influjo de células inmunes se sigue por proliferación de sinoviocitos como fibroblasto (FLS). A pesar de sus contrapartes normales, RA FLS parece haber escapado de los procesos reguladores que resultan en detención de proliferación y apoptosis conduciendo a su acumulación continúa (Ver Yamanishi Y et al (2004) Arthritis Res Ther 7: 12-18). Además, el tejido panoso emergente ahora desarrolla nuevos vasos sanguíneos soportados por matriz extracelular para permitir expansión adicional. Este proceso incluye proliferación de fibroblasto, remodelación de matriz y angiogénesis se parece cercanamente a un evento de curación de herida no controlado. Los monocitos migran en el tejido panoso en desarrollo y experimentan diferenciación en macrófagos con un fenotipo activado crónicamente. De manera similar las células B experimentan diferenciación terminal para formar células de plasma que viven largo tiempo que secretan anticuerpos incluyendo factores reumatoides. La habilidad del sinovio inflamado a sostener la diferenciación local de mieloide y células linfoides se basa, en parte, en producción local de factores de crecimiento tales como GMCSF e IL-6. Tanto FLS como leucocitos mononucleares residentes liberan factores solubles que estimulan reclutamiento adicional de células inflamatorias de la sangre y, críticamente, activan la siguiente etapa en el proceso de enfermedad , la destrucción de cartílago articular y re-modelación de hueso. El tejido panoso es invasivo. Su borde guía secreta enzimas destructivas tales como MMPs y citoquinas que alteran el fenotipo de células que mantienen la integridad estructural de cartílago y hueso. Como un resultado, proteoglicanos se pierden y el colágeno tipo I I se separa de manera irreversible conduciendo a debilitamiento y pérdida de cartílago. El hueso experimenta un número de cambios profundos, que incluye erosiones focales, osteoporosis sub-condral. Por último estos cambios resultan en la deformidad característica y subluxación de las articulaciones observadas en RA avanzada (Ver Gordon D and Hastings D (2003) in Rheumatology. Eds Hochberg, Silman, Smolen, Weinblatt and Weisman. Pub. Mosby. 765-780). RA es una enfermedad sistémica, probablemente como un resultado del pasaje de mediadores inflamatorios de la articulación en la sangre. Esto afecto muchos sistemas de órgano en el cuerpo incluyendo piel, ojos, hígado, ríñones, cerebro y el forro vascular, conduciendo a mortalidad y morbidez incrementada (Ver Matteson EL (2003) in Rheumatology. Eds Hochberg, Silman, Smolen, Weinblatt and Weisman . Pub. Mosby. 781 -792). Mucha de la mortalidad en exceso se debe a enfermedad cardiovascular causada por ateroesclerosis ya que muchos de los procesos patogénicos incluidos en el desarrollo de sinovitis reumatoide son comunes para la formación de placas ateroescleróticas. Tratamientos para RA con el objetivo de controlar el dolor reducen la inflamación y detención de los procesos que resultan en destrucción de tejido. Tradicionalmente RA se ha tratado con fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAI DS), bajas dosis de esteroides y los así llamados fármacos anti-reumáticos modificando la enfermedad (DMARDS). Los bajos niveles de eficacia, inicio lento, toxicidad, tolerabilidad deficiente y resistencia incrementada con el tiempo infestan el uso de estos tratamientos que incluyen metotrexato (MTX), sulfasalazina, oro y Leflunomida. Más recientemente, la introducción de fármacos biológicos tales como Enbrel™ , Remicide™ y Humira™ , que inhiben el Factor de Necrosis de Tumor de citoquina (TNF), ha tenido un avance significativo (Ver Roberts L and McColl GJ (2004) Intern Med J 34:687-93). Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar un planteamiento terapéutico al tratamiento de RA y otras enfermedades y desórdenes, particularmente desórdenes y enfermedades inflamatorias tales como osteoartritis y psoriasis. En particular es un objeto de la presente invención proporcionar inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos que específicamente unen OSM (por ejemplo, hOSM , particularmente Sitio I I del mismo) y modulan (es decir, inhiben o bloquean) la interacción entre OSM y gp130 en el tratamiento de enfermedades y desórdenes en respuesta a modulación de esa interacción. Existe evidencia creciente para soportar la hipótesis de que modular la interacción OSM-gp130 puede ser de beneficio en el tratamiento de tales enfermedades y desórdenes.

Evidencia Clínica OSM se encuentra en SF de pacientes RA humanos (Ver Hui W et al (1997) 56: 184-7) . Estos niveles se correlacionan con; el número de neutrófilos en SF, niveles de TN F alfa (algunas veces "TNF") en SF, y marcadores de destrucción de cartílago (Manicourt DH et al (2000) Arthritis Rheum 43: 281 -288). Además, el tejido sinovial de pacientes RA secreta OSM espontáneamente ex vivo (Ver Okamoto H eí al (1997) Arthritis and Rheumatism 40: 1096-1 105). También se ha demostrado que OSM está presente en macrófagos sinoviales (Cawston TE eí al (1998) Arthritis Rheum 41 : 1760-1771 ) y como se trata anteriormente, receptores OSM y gp130 se expresan en células endoteliales, fibroblastos sinoviales, conodrocitos y osteoblastos. Además, las células infiltrando placas ateroescleróticas y aneurismas aórticos expresan OSM sugiriendo una asociación de esta citoquina con inflamación crónica (Ver Mirshahi F eí al (2001 ) Ann NY Acad Sci 936: 621 -4).

Evidencia in vitro Las células endoteliales expresan diez a veinte veces el número de receptores OSM que otros tipos celulares (Ver Brown TJ eí al (1991 ) J Immunol 147: 2175-2180, Linsley PS eí al (1989) J Biol Chem 264: 4282-4289). OSM solo o sinergísticamente en combinación con otras citoquinas, activa el endotelio para liberar las citoquinas y quimoquinas y unir los neutrófilos, monocitos y linfocitos mediando su extravasación en tejido sinovial (Ver ModurV eí al (1997) J Clin Invest 100: 158-168). OSM también ha demostrado ser un estimulador potente de angiogénesis (Ver Vasse M eí al (1999) Aterioscler Thromb Vase Biol 19: 1835-1842) y activación y proliferación de células de fibroblasto sinovial (FLS) (facilitando así la formación de tejido panoso, la liberación de I L-6, M MPs) y actúa sinergéticamente con TNF e IL-1 para inducir esta liberación de mediador (Ver Langdon C eí al (2000) Am J Pathol 157: 1 187-1 196). OSM también ha demostrado inducir (con I L-1 ) liberación de colágeno y proteoglican del cartílago (Ver Cawston T eí al (1995) Biochem Biophys Res Commun 215: 377-385). Además, OSM induce liberación de proteína de fase aguda y producción de receptor IL-6 de hepatocitos (Ver Cichy J eí al (1997) J Immunol 159: 5648-5643, Kurash JK (2004) Exp Cell Res 292: 342-58) y puede por lo tanto contribuir a los efectos sistémicos de inflamación reumatoide incluyendo fatiga. Además, OSM induce actividad y diferenciación de osteoclasto in vitro (Ver Palmqvist P eí al (2002) J Immunol 169: 3353-3362).

Evidencia In Vivo Expresión adenoviral de OSM de murino (mOSM) en las articulaciones de ratones normales resulta en una artritis erosiva e inflamatoria severa (Ver Langdon C eí al (2000) Am J Pathol 157: 1 187-1196). De manera similar, la enfermedad agresiva se observa en ratones noqueados carentes de TNF, IL-1 , IL-6 e iNOS siguiendo el suministro de mOSM adenoviral (Ver de Hooge ASK eí al (2003) Arthritis and Rheumatism 48: 1750-1761 ), demostrando que OSM puede mediar todos los aspectos de patología de artritis. La expresión de OSM de ratón utilizando un vector mOSM adenoviralmente expresado causa daño a la placa de crecimiento típica de Artritis Idiopática Juvenil (Ver de Hooge ASK eí al (2003) Arthritis and Rheumatism 48: 1750-1761 ). En un modelo experimental artritis inducida por colágeno, un anticuerpo anti-OSM administrado terapéutico a ratones previno progresión adicional de la enfermedad. Resultados similares se observan cuando anti-OSM se administra profilácticamente a los ratones con artritis inducida por pristana, un modelo retrasado/remitente reminescente de la enfermedad de humano (Ver Plater-Zyberk C eí al (2001 ) Arthritis and Rheumatism 44: 2697-2702). En monos, OSM inyectado subcutáneamnete induce una respuesta de fase aguda e inflamación crónica local (Ver Loy JK eí al (1999) Toxicol Pathol 27: 151 -155). OSM ha demostrado inducir infiltración PM N y mononuclear y liberación de proteoglican cuando se inyectan en articulaciones de cabra (Ver Bell MC eí al (1 999) Arthritis Rheum 42 : 2543-2551 ) . La sobreexpresión transgénica de mOSM en nodos linf de ratón resulta en madu ración de célula T extratímica, proliferación de células T de memoria y falla para eliminar células T autoinmunes (Ver Louis I eí al (2003) Blood 102: 1397-1404). La sobreexpresión transgénica de OSM en el páncreas causa fibrosis extensiva similar a aq uella observada en sinovio RA avanzada (Ver Malik N eí al (1 995) Mol Cell Biol 15: 2349-2358) . En W099/48523, se describe el uso de antagonistas OSM en el tratamiento de desórdenes y enfermedades inflamatorias. Esta descripción utilizó un anticuerpo OSM de anti-ratón en un modelo murino de artritis. Toda la patente y referencias de literatura descritas dentro de la presente especificación se incorporan expresa y completamente en la presente para referencia.

Breve Descripción de la Invención La presente invención postula que modular (en particular bloquear) la interacción entre Sitio I I de hOSM y gp1 30, con u n anticuerpo que une específicamente hOSM modulará la señalización por todos los complejos receptores de OSM potenciales, neutralizando efectivamente la actividad biológica de la citoquina a un grado terapéuticamente significativo. A pesar de esto, los presentes inventores han encontrado que el bloqueo ambos sitios, Sitio I I y Sitio I I I , de hOSM mejora sorprendentemente la neutralización de esta citoquina. Además, los presentes inventores han encontrado que la glicosilación de hOSM juega un papel inesperado en el evento de unión entre hOSM y un anticuerpo que une específicamente hOSM . La presente invención por lo tanto proporciona un anticuerpo terapéutico 15E10 o 10D3 (que puede ser quimérico, humano, humanizado, biespecífico o fragmentos de unión de antígeno de los mismos), que une específicamente hOSM e interactúa con el Sitio I I de hOSM. Ver Tabla A de abajo. En una modalidad de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula (es decir, inhibe o bloquea) la interacción entre Sitio II de hOSM y gp 130. En algunas modalidades, el anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo específicamente une Sitio II de hOSM. En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y comprende el siguiente CDRH3: SEQ. I . D. NO: 3 o SEQ. I. D. NO:42. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a hOSM y comprende los siguiente CDRs: CDRH 1 : SEQ. I.D.NO: 1 CDRH2: SEQ. I. D. NO: 2 CDRH3: SEQ. I. D. NO: 3 CDRL1: SEQ. I. D. NO: 4 CDRL2: SEQ. I. D. NO: 5 CDRL3: SEQ. I. D. NO: 6 En otra modalidad de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a hOSM y comprende los siguientes CDRs: CDRH1: SEQ. I. D. NO: 40 CDRH2: SEQ. I. D. NO: 41 CDRH3: SEQ.I.D.NO: 42 CDRL1: SEQ. I. D. NO: 43 CDRL2: SEQ. I. D. NO: 44 CDRL3: SEQ. I. D. NO: 45 Por toda esta especificación, los términos "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" siguen el sistema de numeración Kabat como se establece en Kabat eí al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987. Por lo tanto lo siguiente define los CDRs de acuerdo a la invención: CDR: Residuos CDRH1: 31-35B CDRH2: 50-65 CDRH3: 95-102 CDRL1: 24-34 CDRL2: 50-56 CDRL3: 89-97 En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico de murino o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo un dominio VH teniendo la secuencia: SEQ. I. D. NO: 7 y un dominio V teniendo la secuencia: SEQ. I. D. NO: 8. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico de murino o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo un dominio VH teniendo la secuencia: SEQ. I. D. NO: 46 y un dominio V teniendo la secuencia: SEQ. I. D. NO: 47. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo una cadena VH teniendo la secuencia establecida en SEQ. I. D. NO: 9 y un dominio V teniendo la secuencia establecida en SEQ.I.D.NO:10. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo una cadena VH teniendo la secuencia establecida en SEQ. I. D. NO: 48 y un dominio VL teniendo la secuencia establecida en SEQ.I.D.NO:49. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado, tal anticuerpo comprende una cadena pesada teniendo la secuencia establecida en SEQ. I. D. NO: 11 y una cadena ligera teniendo la secuencia establecida en SEQ.I.D.NO:12. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado, tal anticuerpo comprende una cadena pesada teniendo la secuencia establecida en SEQ. I. D. NO: 50 y una cadena ligera teniendo la secuencia establecida en SEQ.I.D.NO:51. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que modula (es decir, inhibe o bloquea) la interacción entre hOSM y gp130. En otra modalidad de la invención se proporciona un dominio VH aislado de un anticuerpo comprendiendo (o consistiendo esencialmente de) SEQ. I. D. NO: 7 o SEQ.I.D.NO:9 o SEQ.I.D.NO:46 o SEQ.I.D.NO:48. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo un dominio VH seleccionado del grupo que consiste de; SEQ. I. D. NO: 7, SEQ. I. D. NO: 9, SEQ. I. D. NO: 46, SEQ. I. D. NO: 48. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo terapéutico comprendiendo a CDRH3 de SEQ. I. D. NO: 3. En otra modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo terapéutico comprendiendo CDRs de SEQ. I. D. NO: 1,2, 3, 4, 5 y 6 con hOSM. En otra modalidad se proporciona anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo terapéutico comprendiendo una cadena pesada de SEQ. I . D. NO: 1 1 y una cadena ligera de SEQ. I . D. NO: 12 con hOSM . En otra modalidad de la invención se proporciona un método para tratar un paciente humano afligido con una enfermedad o desorden en respuesta a modulación de la interacción entre hOSM y gp130 tal método comprende la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para tratar un paciente humano afligido con un desorden o enfermedad inflamatoria tal método comprende la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para tratar un paciente humano afligido con una enfermedad artrítica, particularmente artritis reumatoide, artritis de inicio juvenil u osteoartritis tal método comprende la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente. En otra modalidad de la invención se proporciona un método para reducir o prevenir degradación de cartílago en un paciente humano aflig ido con (o susceptible a) tal degradación , tal método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo a dicho paciente como se describe en la presente. En otra modalidad de la presente invención se proporciona a método para reducir producción de TN F alfa en un paciente afligido con una enfermedad o desorden en respuesta a reducción de TN F alfa, tal método comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente En otra modalidad de la invención se proporciona un método para tratar las manifestaciones extracelulares de un desorden o enfermedad artrítica tal método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente al paciente humano afligido con las manifestaciones extraarticulares de un desorden o enfermedad artrítica. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para tratar un paciente humano afligido con una enfermedad de origen endotelial tal método comprende las etapas de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente.

Uso del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o desórdenes como se describe en la presente también se proporciona. En otra modalidad de la invención se proporciona un proceso para la fabricación de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente. En otra modalidad de la invención se proporciona un ensayo (particularmente un ensayo ELISA) para estudiar la interacciones entre OSM (particularmente hOSM) y un patrón de interacción (tal como gp130, LI FR, OSMR), tal ensayo comprende la etapa de proporcionar para dicho estudio, una muestra de OSM glicosilado (típicamente glicosilado por una célula huésped vertebrada tal como célula huésped de mamífero, por ejemplo, CHO glicosilado). En una modalidad adicional de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico que une específicamente hOSM glicosilado nativo y modula (es decir, inhibe o bloquea) la interacción entre hOSM glicosilado nativo y un patrón de interacción seleccionado del grupo que consiste de gp130, LIFR, OSMRß. Se proporciona un método para producir una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo terapéutico que une específicamente hOSM y modula (es decir, inhibe o bloquea) la interacción entre hOSM y gp130 tal método comprende las etapas de; (a) proporcionar un anticuerpo candidato (b) proporcionar OSM glicosilado (particularmente hOSM producido por una célula huésped mamífera recombinantemente transformada o transfectada tal como una célula CHO recombinantemente transformada y/o hOSM glicosilado nativo); (c) contactar el anticuerpo de la etapa (a) con hOSM de la etapa (b) bajo condiciones permisivas para unión ; (d) determinar si el anticuerpo de la etapa (c) modula la interacción entre hOSM y gp130; (e) humanizar opcionalmente dicho anticuerpo de etapa (a) o (d); (f) incorporar dicho anticuerpo de la etapa (d) o (e) en una composición farmacéutica. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción.

Breve Descripción de los Dibujos FIG. 1 es una ilustración esquemática de la interacción entre OSM y gp130, LIFR y OSMRß. FIG. 2 ilustra la inhibición de gp130 ELISA utilizando hOSM (panel superior) y cOSM (panel inferior) siguiendo el procedimiento establecido abajo de los ejemplos utilizando los anticuerpos quiméricos 15E10 y 10D3. Ver la descripción de abajo para detalles adicionales.

FIG. 3 ilustra el ensayo de célula KB utilizando hOSM (panel superior) y cOSM (panel inferior) siguiendo el procedimiento de los ejemplos utilizando los anticuerpos quiméricos 15E10 y 10D3 de los ejemplos. FIG. 4 ilustra inhibición de gp130 ELISA contra hOSM (panel superior) y cOSM (panel inferior) en donde % de inhibición como una función de concentración de anticuerpo para cuatro anticuerpos humanizados (B1L1, B1L2, B4L1, B4L2) y quimérico 15E10 se diagrama. FIG. 5 ilustra la inhibición de gp130 ELISA de los ejemplos donde varios anticuerpos humanizados (B2L2, B3L2, B4L2) se comparan con el quimérico 15E10 para unirse a hOSM producido por CHO. FIG. 6 ¡lustra el ensayo de FIG. 5 utilizando cOSM en lugar de hOSM. FIG. 7 ¡lustra el ensayo de FIG. 5 utilizando hOSM producido por CHO en 25% suero AB humano. FIG. 8 ilustra el ensayo de FIG. 7 utilizando cOSM en lugar de hOSM. FIG. 9 ilustra la inhibición de gp130 ELISA de OSM neutrófilo de cuatro muestras humanas diferentes utilizando anticuerpos humanizado B2L2, B3L2, B4L2 y quimérico 15E10. FIG. 10 ilustra la inhibición de gp130 ELISA utilizando tres anticuerpos humanizados (B2L2, B3L2, y B4L2) y anticuerpo quimérico 15E10 contra hOSM aislado del fluido sinovial de pacientes RA humanos. FIGs. 11 a 16 ilustran los resultados de FIGs. 5 a 10 en el ensayo de célula KB en lugar de inhibición de gp130 ELISA con la excepción de que el ensayo de célula KB de OSM de neutrófilo de la FIG. 15 utilizó una muestra de humano de OSM de neutrófilo. De esta manera FIG. 11 ilustra el ensayo KB de hOSM producido por CHO, FIG. 12 de cOSM producido por CHO, FIG. 13 de hOSM producido por CHO en 25% suero AB humano, FIG. 14 de cOSM producido por CHO en 25% suero AB humano, FIG. 15 de OSM de neutrófilo, FIG. 16 de OSM aislado de células SF de pacientes RA. FIG. 17 ilustra la inhibición de gp130 ELISA del murino de origen 15E10, el quimérico 15E10, una construcción de anticuerpo humanizada B3L2, y un muíante lítico Fe de B3L2 contra hOSM producido por CHO. Ver descripción para más detalle. FIG. 18 ilustra el ensayo de FIG. 17 utilizando cOSM. FIG. 19 ilustra el ensayo de célula KB del murino de origen 15E10, quimera 15E10, construcción humanizada B3L2 y un muíante lítico Fe de B3L2 contra hOSM producido por CHO. FIG. 20 es una ilustración esquemática del ensayo de competición de los ejemplos. FIG.21 ilusíra la inhibición de 15E10 (construcción humanizada B3L2) por anficuerpo compeíidor 10D3 de murino de los ejemplos. El porceníaje de inhibición de 15E10 por compeíidor 10D3 a equimolaridad (0.15ug/ml):62.3%. FIG. 22a ilustra una curva estándar típica en gp130-OSMELISA utilizando OSM no glicosilado. y donde la concentración gp130 para revestir la placa ELISA es 1 µg/ml. FIG. 22b ¡lustra la sensibilidad incrementada de gp130-OSM ELISA cuando la concentración gp130 utilizada para revesíir la placa se incremenía a 4µg/ml FIG. 22c ilusíra que gp130-OSM ELISA funciona con íanío OSM glicosilado como no glicosilado, OSM no glicosilado; círculos llenos, OSM glicosilado; triángulos abiertos. Observe que la sensibilidad de ELISA es mayor para OSM no glicosilado, posiblemente como un resulíado de epílopos de oculíamienfo de glicosilación reconocidos por el aníicuerpo de deíección uíilizado. FIG. 23a ilusíra el efecío de aníicuerpo neufralizaníe OSM , Mab295 (R&D Syíems) en gp130-OSM ELISA. OSM solamente; círculos abiertos, OSM + Mab296; íriángulos llenos, OSM + MAb295 pero sin gp130 en la placa de ELISA; cuadros llenos. FIG. 23b es una ilusíración esquemáíica de como Mab295 puede poíenciar la señal OSM en gp130-OSM ELISA. FIG. 24 ilusíra datos del ensayo de célula KB mostrando la efecfividad de neuíralización OSM por Mab 295. Las células se esíimulan con 1 ng/ml OSM solameníe, o esía conceníración de OSM mezclada con varias conceníraciones de Mab295 anfes del ensayo. OSM solamenfe; íriángulos llenos, OSM + Mab295; círculos abieríos, sin esíimulación OSM; cuadros llenos. FIG. 25 ilusfra el efecto de un anticuerpo específico de sitio II de OSM , OM4-1 1 .31 en gp130-OSM ELISA. OSM solamente; círculos abieríos, OSM + IgG de conírol de isoíipo; Triángulos inveríidos llenos, OSM + anficuerpo específico OSM sitio II; cuadros abiertos, OSM + OM4-11.31; círculos llenos. FIG. 26 ilustra la inhibición de unión de un complejo de OSM con un anticuerpo específico de silio III (OM4-11.17) a go130 por un anficuerpo OSM específico de siíio II, OM4-5.3. 12.5ng/ml OSM solameníe; barra sólida, OSM+OM4-11.17; barra de línea diagonal, OSM + OM4-11.17+lgG conírol; barra cruzada; OSM + OM4- 11.17+OM4-5.3; barra punteada. FIG. 27 ilustra la emergencia de aníicuerpos OSM específicos de siíio II y no siíio II en sueros de raíones inmunizados con OSM humano, como se detecta uíilizando gp130-OSM ELISA. Análisis de suero después de refuerzos, primero, segundo y íercero con OSM humano; a, b y c respecíivameníe. Suero OSM + pre-inmune; círculos abierfos, OSM + aníisueros de raíón inmunizado; triángulos invertidos llenos, OSM+antisuero de raíón inmunizado, pero sin gp130 en placa de ELISA; íriángulo abierío invertido. FIG. 28 ilusíra la sinergia en neutralización OSM entre un anticuerpo específico de OSM de sitio II ("15E10 hum", 15E10 humanizado) y un aníicuerpo OSM específico de sifio III, (17H10) como se mide en un ensayo de célula KB. La neulralización OSM por 17H10 solo (a) o 15E10 hum solo (b); círculos llenos, neuíralización de OSM por la combinación de aníicuerpo; friángulos abieríos. FIG. 29 ilustra la eficacia de anticuerpo 15E10 humanizado para in hibir secreción de I L-6 esíimulada por OSM de fibroblasíos sinoviales RA. Cada símbolo se refiere a un fibroblasío obíenido de pacieníes difereníes. FIG. 30 ilusíra la inhibición de unión de OSM a gp1 30 por aníicuerpo aníi-OSM OM4-5.3. OSM (25ng/ml) se pre-incuba con las conceníraciones de OM4-5.3 indicadas aníes de la adición a la placa de ELISA. OSM solameníe; círculos sólidos, OSM+OM4-5.3; círculos abieríos. FIG . 31 a Musirá la diferencia en polencia de OM4-41 .5 para inhibir la u nión de OSM glicosilado y no glicosilado a gp 1 30. OSM ; no glicosilado; círculos sólidos, OSM glicosilado; íriángulos abierlos. FI G. 31 b ilusíra la diferencia en potencia de OM4-5.3.1 para inhibir la unión de OSM glicosilado y no glicosilado a gp1 30. OSM no glicosilado; círculos sólidos, OSM glicosilado; triángulos abiertos. FIG . 32 muestra la acíividad de dos anticuerpos específicos de OSM de sitio I I (a; 1 5E1 0, b; 5H2) coníra glicosilado (círculos llenos) y no glicosilado (íriángulos abieríos) en gp130-OSM ELISA FIG . 33 ilustra la correlación entre suero y fluido sinovial [OSM] en muestras de SF y suero en pares tomadas de pacientes RA . FIG . 34a, 34b y 35 ilustran las conceníraciones de OSM medidas en fluido sinovial OA uíilizando ELISA OSM de los ejemplos. FIG. 34b ilusíra esas que dos muestras tuvieron concenfraciones de fluido sinovial de OST parlicularmenle alias. FIG . 36 ilusfra la conceníración de OSM enconírada en suero de pacieníe OA duraníe un periodo de prueba clínica de 12 meses. #número es el idenfificador de pacieníe. FIG. 37 ilusíra una curva esíándar de OSM íípica en 25% suero AB humano Descripción Detallada de la Invención 1. Estructuras del Anticuerpo 1.1 Anticuerpos Intactos Los aníicuerpos infacíos son usualmente glicoproteínas heteromultiméricas comprendiendo al menos dos cadenas pesadas y dos ligeras. Además de IgM, los aníicuerpos iníacíos son glicoproíeínas heferotetraméricas de aproximadameníe 150Kda, compuesíos de dos cadenas ligeras (L) idénlicas y dos cadenas pesadas (H) idéníicas. Típicamenfe, cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covaleníe mieníras que el número de enlaces de disulfuros eníre las cadenas pesadas de difereníes isoíipos de inmunoglobulina, varía. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro de intracadena. Cada cadena pesada íiene en un exíremo un dominio variable (VH) seguido por un número de regiones consíanles. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) y una región constante en su otro extremo; la región constaníe de la cadena ligera se alinea con la primer región consfaníe de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de aníicuerpos de la mayoría de las especies de veríebrados pueden asignarse a uno de dos fipos llamados Kappa y Lambda en base a la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos pueden asignarse a cinco diferentes clases, IgA, Ig D , IgE, IgG e IgM. IgG e IgA puede subdividirse además en subclases, lgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4; y IgAl e lgA2. Variantes de especies existen con ratón y raía íeniendo al menos lgG2a, lgG2b . El dominio de región variable del aníicuerpo confiere especificidad de unión en el aníicuerpo con ciertas regiones desplegando variabilidad particular llamadas regiones de determinación complemeníarias (CDRs) . Las porciones más conservadas de la región variable se llaman regiones de esírucíu ra (FR). Los dominios variables de cadenas iníaclas pesadas y ligeras cada una comprende cuafro FR conecíadas por íres CDRs. C DRs en cada cadena se mantienen juntos en proximidad cercana por las regiones FR y con las CDRs de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de anticuerpos. Las regiones constantes no se incluyen directamenfe en la unión del anticuerpo al antígeno pero muestran varias funciones efectoras tales como participación en ciíoíoxicidad mediada por célula dependieníe de aníicuerpo (ADCC) , fagociíosis a fravés de la unión al recepíor Fc?, íasa de vida media/despeje a íravés del recepíor Fe neonaíal (FcRn) y ciíoíoxicidad dependieníe de complemenío a íravés del componeníe C1 q de la cascada complemenlo. En u na modalidad por lo íanto se proporciona un anticuerpo íerapéuíico iníaclo que une específicameníe hOSM , íal aníicuerpo modula la inleracción eníre hOSM y gp130. El anlicuerpo puede unir específicameníe Silio I I de hOSM e inhibir y bloquear la inferacción entre hOSM y sus residuos correspondientes en gp130 incluidos en interacción de OSM . El procedimiento ELISA de los ejemplos puede ufilizarse para deíerminar si cualquier aníicuerpo paríicular o fragmenío de unión de aníígeno del mismo modula la inferacción eníre hOSM y gp130. El anficuerpo íerapéuíico iníacío puede comprender una región conslanle (ya sea pesada o ligera) de cualquier isotipo o subclase de la misma descrita supra. En una modalidad, el anticuerpo es de isoíipo IgG, parlicularmeníe lgG1. El aníicuerpo puede ser rafa, ralón, conejo, primaíe o humano. En una modalidad típica, el anticuerpo es primate (tal como cinomolgo, mono del Viejo Mundo o Chimpancé grande, ver por ejemplo. W099/55369, WO93/02108) o humano. En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéuíico iníacío comprendiendo un CDRH3 de SEQ. I. D. NO: 3 o SEQ. I . D.NO :42. En ofra modalidad se proporciona un aníicuerpo íerapéuíico infaclo comprendiendo una región variable íeniendo CDRs de SEQ. I. D. NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 o una región variable de SEQ. I . D.NO:40, 41 ,42, 43, 44 y 45. En oíra modalidad, se proporciona un aníicuerpo ferapéuíico infacío de murino o fragmenío de unión de anfígeno del mismo comprendiendo un dominio VH feniendo la secuencia de SEQ. I. D. NO: 7 y un dominio V de la secuencia de SEQ. I . D. NO: 8.

En otra modalidad, se proporciona un aníicuerpo terapéutico intacío de murino o fragmenlo de unión de aníígeno del mismo comprendiendo un dominio VH íeniendo la secuencia de SEQ. I. D.NO: 46 y un dominio V de la secuencia de SEQ. I . D.NO: 47. 1.1.2 Anticuerpos Humanos Los aníicuerpos humanos pueden producirse por un número de méíodos conocidos por aquellos experíos en la maíeria. Los anticuerpos humanos pueden hacerse por el método de hibridoma utilizando estirpes de célula de heíeromieloma de raíón-humano o mieloma ver Kozbor J . Immunol 133, 3001 , (1984) y Brodeur, Monoclonal Aníibodv Producíion Techniques and Applications, pp51 -63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Los mélodos alfernaíivos incluyen el uso de bibliolecas de fago o raíones íransgénicos ambos de los cuales uíilizan reperlorios de región V de humano (ver Winíer G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J . Immunol. meíhods 231 , 1 1 -23). Varias cepas de ralones íransgénicos esfán ahora disponibles en donde sus lugares de inmunoglobulina de raíón se han reemplazado con segmeníos de gen de inmunoglobulina (ver Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D. M (1996) Nafure Biofechnol. 14, 845-851 , Méndez MJ , 1997, Naíure Geneíics, 15, 146-156). En el reío de aníígeno íales como raíones son capaces de producir un reperíorio de aníicuerpos humanos de los cuales los aníicuerpos de inferes pueden seleccionarse.

De particular observación es el sistema Trímera™ (ver Eren R eí al, (1998) Immunology 93: 154-161 ) donde los linfocitos humanos se transplanta en ratones irradiados, el Sistema de Anticuerpo de Linfociío Seleccionado (SLAM , ver Babcook eí al, PNAS (1996) 93:7843-7848) donde los linfocifos humanos (u oirás especies) se ponen efecfivameníe a fravés de un procedimienío de generación de anticuerpo in vitro agrupado masivo seguido por procedimienío de selección y dilución limiíaníe, deconvulada y Xenomouse I I™ (Abgenix Inc). Un planíeamienío alíernaíivo está disponible de Morphotek Inc uíilizando la lecnología Morphodoma™ . La íecnología de despliegue de fago puede uíilizarse para producir anficuerpos humanos (fragmeníos de los mismos), ver McCafferíy; Naíure, 348, 552-553 (1990) y Griffiíhs AD eí al (1994) EMBO 13:3245-3260. De acuerdo a esios genes de dominio V de aníicuerpo lécnico se clonan en eslrucíura en ya sea un revestimiento mayor o menos de gen proteínico de un bacíeriófago filameníoso íal como M13 o fd se despliega (usualmeníe con la ayuda del fago ayudanle) como fragmenios de anticuerpo funcionales en la superficie de la paríícula de fago. Las selecciones en base a las propiedades funcionales del aníicuerpo resultan en selección del gen codificando el anticuerpo mosírando aquellas propiedades. La fécnica de despliegue de fago puede uíilizarse para seleccionar aníicuerpos específicos de aníígeno de biblioíecas hechas de células B fomadas de individuos afligidos con una enfermedad o desorden descriío arriba o alíernalivameníe de donadores humanos no inmunizados (ver Marks; J. Mol . Bio. 222,581 -597, 1991 ) . Donde un anticuerpo humano intacto se desea comprendiendo un dominio Fe es necesario volver a clonar el fragmento derivado desplegado de fago en un vector de expresión mamífero comprendiendo las regiones constaníes deseadas y esfablecer estirpes de células de expresión esíable. La íécnica de maduración de afinidad (Marks; Bio/íechnol 10,779-783 (1992)) puede uíilizarse para mejorar la afinidad de unión donde la afinidad del aníicuerpo humano primario se mejora al reemplazar secuencialmeníe las regiones V de cadena H y L con varianfes que ocurren de manera naíural y seleccionar en la base de afinidades de unión mejoradas. Las variantes de esta íécnica fales como "impresión de epííopo" íambién esíán disponibles ver WO 93/06213. Ver íambién Walerhouse; Nucí. Acids Res 21 , 2265-2266 (1993). De esta manera en otra modalidad se proporciona un aníicuerpo íerapéuíico inlacfo humano o fragmenío de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula (es decir, inhibe y bloquea) la interacción entre hOSM y gp130. En oíra modalidad se proporciona un aníicuerpo íerapéutico intacío humano o fragmenío de unión de aníígeno del mismo que une específicamenfe Siíio II de hOSM y modula (es decir, inhibe y bloquea) la iníeracción eníre hOSM y gp130. En olro aspecío se proporciona un anficuerpo íerapéuíico inlaclo humano o fragmenío de unión de aníígeno del mismo comprendiendo un CDRH3 de SEQ. I. D. NO: 3 o SEQ.l.D.NO:42 que une específicamenfe hOSM y modula (es decir, inhibe y bloquea) la iníeracción enfre hOSM y gp130. En olra modalidad se proporciona un aníicuerpo ferapéuíico iníacío humano o fragmenfo de unión de aníígeno del mismo comprendiendo una región variable íeniendo CDRs de SEQ. I . D. NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 o una región variable íeniendo SEQ. I. D.NO:40, 41 ,42, 43, 44 y 45. 1.2 Anticuerpos Humanizados y Quiméricos El uso de anticuerpos no humanos infacfos en el tratamienío de enfermedades o desórdenes humanos lleva con el los problemas ahora bien esíablecidos de inmunogenicidad poíencial especialmeníe en adminisíración repetida del anficuerpo que es el sisíema inmune de los pacieníes, puede reconocer el aníicuerpo infacío no humano como no auíónomo y moníar una respuesta neutralizanfe. Además de desarrollar los aníicuerpos complefameníe humanos (ver arriba) varias íécnicas se han desarrollado con los años para superar esíos problemas y generalmeníe incluyen reducir la composición de secuencias de aminoácidos no humanos en el anficuerpo íerapéuíico iníacío mieníras se mantiene la facilidad relaíiva para obíener anticuerpos no humanos de un animal inmunizado, por ejemplo, raíón, rala o conejo. Ampliameníe dos planleamienlos se han uíilizado para lograr esío. Los primeros son anticuerpos quiméricos, que generalmente comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo, roedor tal como raíón) a una región consía?íe humana. Debido a que el siíio de unión de aníígeno de un aníicuerpo se localiza dentro de las regiones variables, el anticuerpo quimérico retiene su afinidad de unión para el antígeno pero adquiere las funciones efectoras de la región consíanfe humana y por lo lanío son capaces de realizar funciones efectoras tal como se describe arriba. Los anticuerpos quiméricos se producen típicamente utilizando métodos de ADN recombinaníe. ADN codificando los aníicuerpos (por ejemplo, cADN) se aisla y se secuencia uíilizando procedimienlos convencionales (por ejemplo, al uíilizar sondas de oligonucleólido que son capaces de unirse específicamente a genes codificando las cadenas H y L del anticuerpo de la invención , por ejemplo, ADN codificando SEQ. I . D. NO 1 , 2, 3,4, 5 y 6 descritas supra). Las células de hibridoma sirven como una fuente típica de tal ADN. Una vez aisladas, el ADN se coloca en vectores de expresión que se íransfectan entonces en células de huésped tales como E. Coli, células COS, células CHO o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina para obtener síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse al sustituir la secuencia de codificación para cadenas L y H de humano por las regiones constantes H y L no humanas (por ejemplo, murino) correspondientes ver por ejemplo. Morrison; PNAS 81 , 6851 (1984). El segundo planteamienlo incluye la generación de anticuerpos humanizados en donde el contenido no humano del anticuerpo se reduce al humanizar las regiones variables. Dos técnicas para humanización han obtenido popularidad. El primero es humanización por injerto CDR. CDR forma ciclos próximos al término N del anticuerpo donde forman una superficie moníada en un microandamio proporcionado por las regiones de esíructura. La especificidad de unión de antígeno del anticuerpo se define principalmente por la topografía y por las características químicas de su superficie CDR. Estas características se determina, a su vez, por la conformación de las CDRs individuales, por la disposición relativa de las CDRs, y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los residuos comprendiendo las CDRs. Una gran disminución en inmunogenicidad puede lograrse al injertar solamente las CDRs de un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) (anticuerpos "donadores") sobre una estructura humana adecuada ("estrucíura acepíadora") y regiones consíaníes (ver Jones eí al. (1986) Naíure 321 , 522-525 and Verhoeyen M eí al (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el injerío de CDR per se puede no resulíar en la reíención completa de propiedades de unión de antígeno y se encuentra frecueníemeníe que algunos residuos de esírucíura del anficuerpo donador necesiían conservarse (algunas veces referirse como "mutaciones posteriores") en la molécula humanizada si afinidad de unión de antígeno significativa está por recuperarse (ver Queen C eí al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M eí al (1991 ) Nature 351 , 501 -502). En este caso, las regiones V de humano mosírando la mayor homología de secuencia (íípicamenfe 60% o más) al anficuerpo donador no humano pueden elegirse de una base de daíos para proporcionar la esfrucfura de humano (FR). La selección de FRs de humano puede hacerse ya sea de consenso humano o anticuerpos humanos individuales. Donde sea necesario los residuos clave del anticuerpo donador son subsíifuidos en la estructura aceptadora de humano para conservar conformaciones CDR. El modelado por computadora del aníicuerpo puede uíilizarse para ayudar a identificar fales residuos esírucfuralmente imporíanles, ver W099/48523. Alfernativamenle, humanización puede lograrse por un proceso de "revestimiento". Un análisis estadístico de regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de murino y humano únicas reveló que los patrones precisos de residuos expuesíos son diferentes en anticuerpos de murino y humano, y posiciones de superficie más individuales tienen una fuerte preferencia para un número pequeño de diferentes residuos (ver Padlan E.A. eí al; (1991 ) Mol. Immunol.28, 489-498 and Pedersen JT. eí al (1994) J . Mol. Biol. 235; 959-973). Por lo tanío es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano al reemplazar residuos expuesíos en sus regiones de esírucíura que difieren de aquellos usualmente encontrados en anficuerpos humanos. Debido a que la aníigenicidad de proteína puede correlacionarse con accesibilidad de superficie, reemplazo de los residuos de superficie puede ser suficiente para volver la región variable de ratón "invisible" al sisíema inmune humano (ver íambién Mark G . E. eí al (1994) in Handbook de Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134). Esíe procedimienfo de humanización se refiere como "revesíimienlo" debido a que solamente la superficie del anticuerpo se altera, los residuos de soporíe permanecen sin perlurbar. Un planíeamienlo allernaíivo adicional se esfablece en WO04/006955. De esta manera otra modalidad de la invención proporciona un aníicuerpo terapéutico quimérico comprendiendo un dominio variable no humano (por ejemplo, roedor) fusionado a una región constaníe humana (que puede ser un isoíipo IgG por ejemplo, . lgG1 ) que une específicameníe hOSM y modula la iníeracción enfre Sitio II de hOSM y gp130. En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéutico quimérico comprendiendo una región variable no humana (por ejemplo, roedor) y una región constaníe humana (que puede ser un isoíipo IgG por ejemplo, IgG 1 ) que une específicameníe hOSM , íal anticuerpo comprende además un CDRH3 de SEQ.I.D. NO:3 o SEQ. I . D. NO :42. Tales anticuerpos pueden comprender además una región constaníe humana del isotipo IgG, por ejemplo, lgG 1 . En otra modalidad se proporciona un anticuerpo íerapéuíico quimérico comprendiendo una región variable no humana (por ejemplo, roedor) y una región consíante humana (que puede ser de un isoíipo IgG por ejemplo, lgG 1 ) que une específicamente hOSM teniendo las CDRs de SEQ. I . D. NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 o SEQ. I .D.NO:40, 41 , 42, 43, 44 y 45. En otra modalidad se proporciona un anficuerpo lerapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula (es decir, inhibe y bloquea) la interacción entre Sitio II de hOSM y gp130. En otra modalidad se proporciona un anticuerpo ferapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y comprende un CDRH3 de SEQ. I . D. NO: 3 o SEQ.I.D.NO:42. Tales anticuerpos pueden comprender una región constante humana del isotipo IgG, por ejemplo, lgG1 En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéuíico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y comprende CDRs de SEQ. I . D. NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 o SEQ. I .D.NO:40, 41 , 42, 43, 44 y 45. Tales anticuerpos pueden comprender una región constanfe humana del isotipo IgG, por ejemplo, IgG 1 . En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéuíico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 y comprende (o consisíe esencialmente de) la cadena pesada de SEQ. I. D. O: 1 1 y una cadena ligera de SEQ. I. D. NO: 12. En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéuíico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 tal anticuerpo comprende (o consisle esencialmeníe de) una cadena pesada de SEQ. I. D. NO:50 y una cadena ligera de SEQ. I.D.NO:51. En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula la iníeracción enfre hOSM y gp130 en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende CDRH3 de SEQ . I . D . NO: 3 además comprendiendo opcionalmente CDRs de SEQ. I . D. NO : 1 , 2 , 4, 5 y 6 en donde los resid uos en posiciones 28, 29, 30, 71 y 94 de la región de estrucíura de cadena pesada acepfadora de humano y posiciones 49 y 71 de la estructura de cadena ligera aceptadora de h umano se substituyen por los resid uos correspondientes encontrados en la esírucfura de aníicuerpo donador de la cual se deriva CDRH3. En oíra modalidad se proporciona un aníicuerpo terapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp 1 30 en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende CDRH3 de SEQ . I . D. NO: 42 opcionalmente comprendiendo además CDRs de SEQ. I . D. NO: 40, 41 , 43, 44, 45 en donde los residuos en posiciones 28, 44, 48, 67, 69, 71 , 73 de la región de estructura de cadena pesada aceptadora de humano y posiciones 36, 38, 46, 47, 71 de la esíructura de cadena ligera aceptadora de humano se substiíuyen por los residuos correspondienfes enconlrados en la esírucíura de anficuerpo donador del cual se deriva CDRH3. Será apárenle para aquellos experfos en la materia que el término "derivado" iníenía definir no solamente la fuente en el sentido de ser el origen físico para el material sino q ue también definir material que es estrucfuralmente idéntico al material que no se origina de la fuente de referencia. De esta manera "residuos encontrados en el anficuerpo donador del cual CDRH3 se deriva" no necesariamente se ha purificado del anticuerpo donador. En otra modalidad se proporciona u n anticuerpo íerapéutico humanizado o fragmento de unión de antígeno del mismo que une específicamente hOSM en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende CDRH3 de SEQ. I . D . NO : 3 opcionalmente comprendiendo además CDRs de SEQ. I. D. NO: 1 , 2, 4, 5 y 6 en donde la estrucfura de cadena pesada de humano comprende uno más (por ejemplo, iodos) los siguienfes residuos (o un substiíuto conservador de los mismos): Posición Residuo 28 S 29 L 30 T 71 K 94 K y la cadena ligera de humano comprende cualquiera o ambos de los siguientes residuos (o substiíuío conservador de los mismos); Posición Residuo 49 E 71 Y En otra modalidad se proporciona u n anticuerpo terapéutico humanizado o fragmenío de unión de anlígeno del mismo que une específicamenfe hOSM en donde dicho aníicuerpo o fragmenío del mismo comprende CDRs de SEQ. I . D. N O: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 en donde la estructura de cadena pesada de humano comprende uno o más (por ejemplo, todos) los siguientes residuos (o un substituto conservador de los mismos) : Posición Residuo 28 S 29 L 30 T 71 K 94 K y la cadena ligera de humano comprende cualquiera o ambos de los siguientes resid uos (o subsíiíuto conservador de los mismos); Posición Residuo 49 E 71 Y En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado o frag mento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a hOSM en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende CDRH3 de SEQ.I.D.NO :42 opcionalmente comprendiendo además CDRs de SEQ. I . D. NO: 40, 41 , 43, 44, 45 en donde la estrucíura de cadena pesada de humano comprende u no o más (por ejemplo, iodos) los siguientes residuos (o un substiíuto conservador de los mismos) : Posición Residuo 28 I 48 I 44 K 67 A 69 L 71 V 73 K y la cadena ligera de humano comprende uno o más (por ejemplo, todos) los siguientes residuos (o subsíituío conservador de los mismos) ; Posición Residuo 36 F 38 K 46 R 47 W 71 Y En otra modalidad se proporciona un anticuerpo terapéuíico humanizado o fragmenío de unión de aniígeno del mismo que se une específicamente a hOSM en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende CDRs de SEQ . I . D. NO: 40, 41 , 42, 43, 44, 45 en donde la estructura de cadena pesada de humano comprende uno o más (por ejemplo, todos) los siguienfes residuos (o un substituto conservador de los mismos) : Posición Residuo 28 I 48 I 44 K 67 A 69 L 71 V 73 K y la cadena ligera de humano comprende uno o más (por ejemplo, todos) los siguieníes residuos (o subsíifuto conservador de los mismos); Posición Residuo 36 F 38 K 46 R 47 W 71 Y También se reconoce en la materia que ciertas substiíuciones de aminoácido son consideradas como siendo "conservadoras". Los aminoácidos se dividen en grupos en base a propiedades de cadena lateral comunes y substituciones dentro los grupos que mantienen toda o subsíancialmeníe loda la afinidad de unión del anticuerpo de la invención o fragmento de unión de antígeno del mismo se consideran como substituciones conservadoras, ver la siguiente tabla: 1.3 Anticuerpos Biespecíficos Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo teniendo especificaciones para al menos dos epítopos diferentes. Los métodos para hacer lales anticuerpos se conocen en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena L- cadena H de inmunoglobulina, donde dos cadenas H tienen difereníes especificidades de unión ver Millstein eí al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 y Traunecker eí al EMBO, 10, 1991 , 3655-3659. Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas H y L, una mezcla potencial de diez estructuras de anticuerpo difereníes se producen de las cuales solamenle una fiene la especificidad de unión deseada. Un planteamienfo alternativo incluye fusionar los dominios variables con las especificidades de unión deseadas a región constaníe de cadena pesada comprendiendo al menos paríe de la región de articulación, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la región CH1 confeniendo el siíio necesario para unión de cadena ligera preseníe en al menos una de las fusiones. ADN codificando estas fusiones, y si se desea la cadena L se insertan en vectores de expresión separados y se contransfectan eníonces en un organismo huésped adecuado. Por lo íanto es posible inseríar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas en un vector de expresión. En un planfeamienío preferido, el aníicuerpo biespecífico se compone de una cadena H con una primer especificidad de unión en el otro brazo, ver WO94/04690. Ver también Suresh eí al Methods in Enzymology 121 , 210, 1 986.

En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo terapéuíico biespecífico en donde al menos una especificidad de unión de dicho anticuerpo es para hOSM , en donde dicho anticuerpo modula (es decir inhibe o bloquea) la inferacción entre Sitio II de hOSM y gp130. Tales anticuerpos pueden comprender además una región constaníe de humano del isoíipo IgG, por ejemplo, lgG1. En una modalidad de la invención se proporciona un aníicuerpo terapéuíico biespecífico en donde al menos una especificidad de unión de dicho anficuerpo es para hOSM, en donde dicho aníicuerpo comprende al menos uno de CDRH3 de SEQ. l. D.NO: 3 o SEQ. I . D.NO:42. Tales anticuerpos pueden comprender además una región constante de humano del isoíipo IgG, por ejemplo, lgG1 . En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo térapéufico biespecífico en donde al menos una especificidad de unión de dicho aníicuerpo es para hOSM , en donde dicho anticuerpo comprende al menos CDRs de SEQ. l.D.NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 o SEQ.l. D.NO: 40,41 , 42, 43, 44 y 45. Tales anticuerpos pueden comprender además una región constante de humano del isotipo IgG, por ejemplo, lgG 1 . 1.4 Fragmentos de Anticuerpo En ciertas modalidades de la invención se proporcionan fragmentos de anticuerpo terapéuíico que modulan la iníeracción enlre OSM (parficularmeníe hOSM) y gp130. Tales fragmentos pueden ser fragmentos de unión de antígeno funcional de anticuerpos intacíos y/o humanizados y/o quiméricos tales como fragmentos Fab, Fd, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv de los anticuerpos descritos supra. Tradicionalmente, tales fragmentos se producen por la digestión proteolítica de aníicuerpos iníactos, por ejemplo, por digestión de papain (ver por ejemplo, WO 94/29348) pero pueden producirse directamente de células huésped recombinantemeníe transformadas. Para la producción de ScFv, ver Bird eí al; (1988) Science, 242, 423-426. Además, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse utilizando una variedad de técnicas de formación como se describe abajo. Fragmentos Fv parecen tener energía de iníeracción inferior de sus dos cadenas que los fragmentos Fab. Para establecer la asociación de los dominios VH y VL, se han enlazado con péptidos (Bird eí al, (1988) Science 242, 423-426, Huston eí al, PNAS, 85, 5879-5883), puentes de disulfuro (Glockshuber eí al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) y mutaciones "botón en agujero" (Zhu et a/ (1997), Proíein ScL, 6, 781 -788). Fragmeníos ScFv pueden producirse por méfodos bien conocidos por aquellos expertos en la materia ver Whiílow eí al (1991 ) Meíhods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 y Huston eí al (1993) Int. Rev.lmmunoI 10, 195-217. ScFv puede producirse en células bacíerianas tal como E. Coli pero se producen más típicamenfe en células eucarióíicas. Una desventaja de ScFv es la monovalencia del producto, que produce una avidez incrementada debido a unión polivalente, y sus vida media corta. Intenfos por superar esíos problemas incluyen (ScFv')2 bivalenfe producido de ScFv coníeniendo una cisíeína de lerminal C adicional por acoplamiento químico (Adams eí al (1993) Can. Res 53, 4026-4034 y McCartney eí al (1995) Proíein Eng. 8, 301 -314) o por dimerización específica de sitio espontánea de ScFv conteniendo un residuo de cisteína de terminal C no en par (ver Kipriyanov eí al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204). Alternaíivameníe, ScFv puede forzarse para formar multímeros al acoríar el enlazador de péptido a entre 3 a 12 residuos para formar "diacuerpos", ver Holliger eí al PNAS (1993), 90, 6444-6448. La reducción del enlazador aún además puede resultar en trímeros ScFv ("triacuerpos", ver Kortt eí al (1997) Protein Eng, 10, 423-433) y tefrámeros ("feíracuerpos", ver Le Gall eí al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). Construcción de moléculas ScFV bivalentes también puede lograrse por fusión genética con motivos de dimerización de proteína para formar "minianticuerpos" (ver Pack eí al (1992) Biochemistry 31 , 1579-1584) y "minicuerpos" (ver Hu eí al (1996), Cáncer Res. 56, 3055-3061 ). Aleatorios ScFv-Sc-Fv ((ScFV)2) también puede producirse al enlazar dos unidades ScFv por un tercer enlazador de péptido, ver Kurucz eí al (1995) J.lmmol.154, 4576-4582. Los diacuerpos biespecíficos pueden producirse a través de la asociación no covalente de dos productos de fusión de cadena única consistiendo de dominio VH de un aníicuerpo coneclado por un enlazador corío al dominio VL de oíro aníicuerpo, ver Kipriyanov eí al (1998), Iní.J .Can 77,763- 772. La esíabilidad de fales diacuerpos biespecíficos puede mejorarse por la introducción de puentes de disulfuro o mutaciones "botón en agujero" como se describe supra o por la formación de diacuerpos de cadena única (ScDb) en donde dos fragmenfos ScFv h íbridos se conecían a través de un enlazador de péptido ver Kontermann eí al (1999) J . Immu nol . Meíhods 226 1 79-1 88. Moléculas biespecíficas íeíravalentes están disponibles al, por ejemplo, fusionar un fragmento ScFv al dominio CH3 de una molécula IgG o a un fragmento Fab a través de la región de articulación ver Coloma eí al., (1997) Nafure Biolechnol. 1 5, 1 59-163. Alíernaíivameníe, las moléculas biespecíficas teíravaleníes se han creado por la fusión de diacuerpos de cadena única biespecífica (ver Alt eí al, (1 999) FEBS Letí 454, 90-94. Moléculas biespecíficas tefravalentes más pequeñas íambién pueden formarse por la dimerización de cualquier aleatorio ScFv-ScFv con un enlazador conteniendo un motivo de hélice-ciclo-hélice (minianticuerpos DiBi , ver MuIIer eí al (1 998) FEBS Lett 432 , 45-49) o una molécula de cadena única comprendiendo cuatro dominios variables de aníicuerpo (VH y VL) en orientación previniendo el par intramolecular (diacuerpo aleaíorio, ver Kipriyanov eí al, (1 999) J . Mol . Biol. 293, 41 -56) . Fragmentos F(ab')2 biespecíficos pueden crearse por acoplamiento químico de fragmentos Fab' o por heterodimerización a través de cierres de leucina (ver Shalaby eí al, (1 992) J. Exp. Med. 1 75, 21 7-225 y Kostelny eí a/ (1 992), J. lmmunol. 148, 1547-1553). También esíán disponibles los dominios VH y V (Domaníis pie) , ver US 6,248,51 6; US 6,291 , 158; US 6, 1 72 , 197. En una modalidad se proporciona un fragmenío de aníicuerpo íerapéufico (ver por ejemplo, ScFv, Fab, Fd, Fab', F(ab')2) o un fragmento de anticuerpo formado como se describe arriba) que se une específicamente a hOSM y modula (es decir, inhibe o bloquea) la interacción entre Siíio II de hOSM y gp130. El fragmento de anticuerpo íerapéuíico puede comprender un CDRH3 íeniendo la secuencia de SEQ.l.D.NO: 3 opcionalmenfe junio con CDRs teniendo la secuencia establecida en SEQ.l.D.NO: 1, 2, 4, 5 y 6 o un fragmento de anticuerpo terapéutico comprendiendo un CDRH3 of SEQ.I.D.NO:42 opcionalmente junto con CDRs teniendo la secuencia establecida en SEQ.l.D.NO: 40, 41, 43, 44 y 45. 1.5 Anticuerpos Heteroconiugados Los anticuerpos heleroconjugados también forman una modalidad de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemeníe unidos formados utilizando cualquier método de degradación convenieníe. Ver US 4,676,980. 1.6 Otras Modificaciones La inieracción entre la región Fe de un anticuerpo y varios recepíores Fe (Fc?R) se cree que media las funciones efectoras del anticuerpo que incluyen citoíoxicidad celular dependieníe de aníicuerpo (ADCC), fijación de complemento, fagocitis y vida media/despeje del anticuerpo. Varias modificaciones a la región Fe de anticuerpos de la invención pueden llevarse a cabo dependiendo de la propiedad efectora deseada. Por ejemplo, las mutaciones específicas en la región Fe para volver un anticuerpo de otra manera lííico, no lííico se detalla en EP 0629 240B1 y EP 0307434B2 o uno puede incorporar un epítopo de unión de recepíor salvaje en el aníicuerpo para incrementar la vida media de suero ver US 5,739,277. Existen cinco receptores Fc? de humano actualmeníe reconocidos, Fc?R (I), Fc?Rlla, Fc?Rllb, Fc?RI l Ia y FcRn neonalal. Shields eí al, (2001 ) J . Biol. Chem 276, 6591 -6604 demostró que un conjunto común de residuos IgG 1 se incluye en la unión de iodos los Fc?Rs, mieníras Fc?RI I y Fc?RI I I uíilizan siíios disíintos fuera de este conjunto común . Un grupo de residuos lgG1 reduce la unión de todos los Fc?Rs cuando se altera a alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio IgG y se agrupan cerca de la unión de articulación CH1 y CH2. Aunque Fc?RI utiliza solameníe el conjunío común de residuos lgG1 para unirse, Fc?RI I y Fc?RI I I iníeracíúan con residuos disíiníos además del conjunto común. La alteración de algunos residuos redujo la unión solamente a Fc?RI I (por ejemplo, Arg-292) o Fc?RI I I (por ejemplo, Glu-293). Algunas varianíes mosíraron unión mejorada a Fc?RI I o Fc?RIII pero no afectaron la unión a otro receptor (por ejemplo, Ser-267Ala mejoró la unión a Fc?RI I pero unión a Fc?RII I no se afectó). Otras varianfes mosfraron unión mejorada a Fc?RI I o Fc?RII I con reducción en unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-298Ala mejoró la unión a Fc?RII I y redujo la unión a Fc?RI I). Para Fc?RIIIa, las mejores variantes lgG 1 de unión tuvieron substiíuciones de alanina combinadas en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. El recepíor FcRn nenonaíal se cree que se incluye fanto en despeje del cuerpo como la transcitosis a fravés de los íejidos (ver Junghans RP (1997) Immunol. Res 16.29-57 y Ghefie eí al (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766). Residuos lgG1 de humano se deíerminan para interacfuar directameníe con FcRn de humano incluye Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435. La presente invención por lo tanto se refiere a anticuerpos de la invención teniendo cualquiera (o más) de los cambios de residuo detallados arriba para modificar vida media/despeje y/o funciones efectoras tales como ADCC y/o lisis complemento. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un anticuerpo terapéutico humanizado que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 teniendo substituciones de alanina (u olra interrupción) en posiciones 235 (por ejemplo, L235A) y 237 (por ejemplo, G237A). En una modalidad adicional de la invención se proporciona un anticuerpo terapéuíico humanizado que une específicamente hOSM y comprende una cadena pesada de SEQ.I.D.NO:61 y una cadena ligera de SEQ.I.D.NO:12. Otras modificaciones incluyen variantes de glicosilación de los aníicuerpos de la invención. Glicosilación de aníicuerpos en posiciones conservadas en sus regiones conslantes se conoce por fener un efecío profundo en función de aníicuerpo, paríicularmenfe funcionamíenío efecíuador íal como aquellos descrifos arriba, ver por ejemplo, Boyd eí al (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Variantes de glicosilación de los anticuerpos terapéuticos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención en donde una o más porción de carbohidrato se agrega, substituye, elimina o modifica, se contemplan. La introducción de un moíivo de asparagina-X-serina o asparagina-X-íreonina crea un sitio potencial para una unión enzimática de porciones de carbohidrato y puede ufilizarse por lo tanfo para manipular la glicosilación de un aníicuerpo. En Raju eí al (2001 ) Biochemistry 40, 8868-8876 la sialiación terminal de una inmunoadhesina TN FR-IgG se incrementa a través de un proceso de regalaclosilación y/o resialilación utilizando beta-1 , 4-galacíosilfransferasa y/o alfa, 2,3 sialiltransferasa. Incrementando la sialilación terminal se cree que incremenía la vida media de la inmunoglobulina. Los aníicuerpos, en común con la mayoría de las glicoproíeínas, se producen íípicameníe en naíuraleza como una mezcla de glicoformas. Esía mezcla es particularmente apareníe cuando los aníicuerpos se producen en células eucarióíicas, particularmeníe mamíferas. Una variedad de métodos se han desarrollado para fabricar glicoformas definidas, ver Zhang eí al Science (2004), 303, 371 , Sears eí al, Science, (2001 ) 291 , 2344, Wacker eí al (2002) Science, 298 1790, Davis eí al (2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang eí al (2001 ) Acc. Chem. Res 34, 727. De esta manera, la invención se refiere a una pluralidad de anticuerpos terapéuticos (íípicamenfe monoclonales) (que puede ser el isoíipo IgG, por ejemplo, lgG1 ) como se describe en la presente comprendiendo un número definido (por ejemplo, 7 o menos, por ejemplo 5 o menos tales como dos o una glicoforma(s) única(s) de dichos anticuerpos o fragmentos de unión de antígeno de los mismos. Las modalidades adicionales de la invención incluyen anticuerpos íerapéuticos de la invención o fragmentos de unión de antígeno de los mismos acoplados a un polímero no proteínico fal como glicol de polietileno (PEG) , glicol de polipropileno o polioxialquileno. La conjugación de proteínas a PEG es una íécnica esíablecida para incrementar la vida media de proteínas, así como también reducir la aníigenicidad e inmunogenicidad de profeínas. El uso de PEGílación con diferentes pesos moleculares y estilos (lineal o ramificado) se ha investigado con anticuerpos intactos así como también fragmentos Fab', ver Koumenis I.L. eí al (2000) Int.J .Pharmaceuf. 198:83-95. Suminisíro de proteínas terapéuticas al cerebro se ha dificultado por la presencia de la barrera cerebral sanguínea (BBB). Donde se desea suministrar un anticuerpo de la invención o fragmento de anticuerpo de la invención a íravés de la BBB, se han propuesío para mejorar lal suminisfro donde se necesiíe. Para obfener nuírienles requeridos y factores de la sangre, la BBB posee algunos receptores específicos, que transporían compuesíos de la sangre circuíanle al cerebro. Los estudios han indicado que algunos compuestos como insulina (ver Duffy KR eí al. (1989) Brain Res. 420:32-38), transferin (ver Fishman JB et al (1987) J. Neurosci 18:299-304) y los factores 1 y 2 de crecimiento similares a insulina (ver Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7:314-330 y Duffy KR eí al (1986) Metabolism 37: 136-140) atraviesan la BBB a través de la transcitosis mediada por receptor. Los receptores para estas moléculas de esía molécula proporcionan un medio poíencial para anficuerpos de la invención y/o fragmentos de anticuerpo de la invención para acceder al cerebro utilizando los aníicuerpos así llamados "vecíorizados" (ver Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321 ). Por ejemplo, un anlicuerpo a receptor de transferrin se ha mostrado por transporíarse dinámicameníe en la parenquimia de cerebro (ver Friden PM eí al (1991 ) PNAS 88:4771 - 4775 y Friden PM eí al (1993) Science 259:373-377). De esía manera, un planíeamiento poíencial es producir un aníicuerpo biespecífico o fragmento biespecífico tal como se describe supra en donde una primer especificidad es hacia Sitio II de hOSM (por ejemplo, la primer especificidad comprende CDRH3 de SEQ. l.D.NO: 3 opcionalmente junto con CDRs of SEQ.l .D.NO: 1 , 2, 4, 5 y 6 o comprende un CDRH3 de SEQ.I.D.NO:42 opcionalmente junto con CDRs de SEQ.l.D.NO: 40, 41 , 43, 44, 45) y una segunda especificidad hacia un receptor de transporfe ubicado en la BBB, por ejemplo, una segunda especificidad hacia el receptor de transporíe de íransferrin. 2. Inmunoglobulinas Competentes La presente invención también proporciona inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de unión de antígeno de anticuerpos y oirás entidades de proteína tales como inmunoadhesinas que unen específicamente hOSM e inhiben competitivamente, la unión entre hOSM y el anticuerpo terapéuíico de la invención fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo una cadena pesada de SEQ. I . D.NO: 1 1 y una cadena ligera de SEQ. I. D.NO: 12. La inmunoglobulina competenle, anficuerpo y fragmentos de unión de antígeno de anticuerpos y otra entidad de proíeína íal como despliegues de inmunoadhesin, a conceníraciones equimolares, al menos 25% inhibición, lípicamente 35% o mayor, más íípicameníe al menos 50% inhibición. De esla manera en una modalidad de la invención se proporciona un méíodo para seleccionar un anticuerpo candidato o fragmento de anticuerpo para deferminar si el anficuerpo candidato o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo competeníe como se describe en la présenle fal mélodo comprende las etapas de; (a) incubar el anticuerpo candidato o fragmento de anticuerpo con un anticuerpo terapéutico comprendiendo una cadena pesada de SEQ. I. D.NO: 1 1 y una cadena ligera de SEQ. I . D.NO: 12 o fragmento de unión de antígeno del mismo; (b) deíerminar si el anlicuerpo candidato o fragmento de anticuerpo del mismo de la etapa (a) inhibe competitivamente la unión entre el anlicuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo y OSM y en particular hOSM. Típicamente un ensayo a base de ELISA se emplea tal como ELISA establecida en los ejemplos. Típicamente, OSM y/o hOSM se glicosilan. Típicamente, OSM y hOSM se han glicosilado por una célula mamífera tal como una célula CHO transformada, célula NSO o humana. En otras modalidades, OSM y hOSM se han glicosilado por una célula nativa de la cual se deriva, es decir, hOSM se ha glicosilado por una célula de humano (por ejemplo hOSM puede aislarse del cuerpo humano).

De esta manera también se proporciona un aníicuerpo terapéutico competente o fragmento de unión de antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo terapéulico o fragmento de unión de antígeno del mismo íal aníicuerpo íerapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo comprende CDR teniendo las secuencias establecidas en SEQ. l . D.NO: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6. También se proporciona un anticuerpo terapéutico competente o fragmento de unión de antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo terapéulico o fragmento de unión de antígeno del mismo tal anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo comprende una cadena pesada de SEQ . I . D. NO: 1 1 y una cadena ligera de SEQ. I. D. NO: 12. Un anticuerpo terapéutico competeníe o fragmento de unión de antígeno del mismo puede ser de cualquiera de las estructuras de anticuerpo aníeriores. Por ejemplo, el aníicuerpo íerapéuíico compeíeníe puede ser un aníicuerpo infaclo humano o primate o un anticuerpo humanizado típicamente de un isoíipo IgG por ejemplo, lgG1 o lgG4. Fragmeníos de aníicuerpo íerapéuíicos compeíeníes pueden ser Fab, Fab', Fd, F(ab')2, ScFv y lo similar. Un anticuerpo terapéuíico compeíeníe puede producirse de acuerdo a los méíodos descritos dentro de esta presente especificación.

Un procedimiento típico para el método de selección descrito supra, se establece en los ejemplos abajo. 10D3 es un ejemplo de un anticuerpo competeníe de la invención. Ver Tabla A abajo. 2.1 Otros Métodos de Selección Un aspecío adicional de la preseníe invención se basa en paríe en un descubrimienío de que la glicosilación de hOSM juega un papel inesperado en el evenfo de unión eníre un aníicuerpo aníi- hOSM y hOSM. La preseníe invención por lo tanío se extiende a un método para seleccionar un anticuerpo que une específicamente hOSM tal mélodo comprende incubar dicho anticuerpo con OSM glicosilado, particularmenfe hOSM, bajo condiciones permisivas para unión y medir la afinidad de unión del anticuerpo, procedimiento ELISA detallado abajo permite tal método. Los anticuerpos (que pueden ser de cualquiera de las estructuras detalladas arriba) pueden seleccionarse en la base de tener una afinidad de unión (Kd) mayor a 1 µM, típicamente mayor a 100nM, más típicamente mayor a 1 nM por ejemplo, 100pM o mayor. Los anticuerpos pueden seleccionarse además en la base de su habilidad para unir OSM no glicosilado, por ejemplo, hOSM . De esta manera, los aníicuerpos se seleccionan típicameníe en la base que son capaces de unir OSM glicosilado por ejemplo, hOSM y íambién además capaces de unir OSM no glicosilado, por ejemplo, hOSM, al mismo o grado similar (por ejemplo, íienen la misma o similar afinidad de unión como se mide en un ensayo Biacore™). Los anticuerpos seleccionados de acuerdo al presente método pueden formarse además (por ejemplo, humanizarse si es necesario mediante, por ejemplo, manipulación de polinucleótidos codificando el anticuerpo) e incorporan en una composición farmacéutica. Los anticuerpos seleccionados por el presente método y polinucleótidos codificando tales anticuerpos forman una modalidad de la presente invención . De esía manera la preseníe invención proporciona un método para seleccionar un anticuerpo que une puíaíivamente OSM, particularmeníe hOSM (por ejemplo, un anticuerpo que se ha originado contra OSM/hOSM), lal méfodo comprende; (a) incubar dicho anticuerpo con OSM glicosilado, particularmente hOSM glicosilado bajo condiciones permisivas para unión; (b) medir la afinidad de unión de dicho anticuerpo; (c) seleccionar dicho anticuerpo si dicho anticuerpo fiene una afinidad de unión mayor a 1 uM , típicameníe mayor a 100n M; (d) proporcionar un polinucleófido codificando dicho anficuerpo de la eíapa (c) y íransformar o fransfecíar una célula huésped mamífera con un vector comprendiendo dicho polinucleótido; (e) culíivar dicha célula huésped de la eíapa (d) bajo condiciones permisivas para secreción de dicho aníicuerpo en el medio de culíivo; (f) purificar opcionalmenle el medio de cultivo de la etapa (e); (g) incorporar el anticuerpo de la eíapa (e) o (f) en una composición farmacéuíica.

Uso de un aníicuerpo identificado por este método en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o desórdenes detallados abajo también se proporciona. Uso de un anticuerpo (por ejemplo, intacto, humano, humanizado, quimérico) que une específicamente hOSM glicosilado nativo (paríicularmeníe une un epííopo de Sitio II de hOSM glicosilado) y modula la iníeracción enlre dicho hOSM glicosilado y gp130 en la fabricación de un medicamenfo para el fratamiento de una enfermedad o desorden detallado abajo también se proporciona. Se proporcionan además los anticuerpos que unen específicamente hOSM glicosilado nativo con la misma o similar afinidad de unión como hOSM no glicosilado bajo las mismas condiciones experimentales. Una modalidad de la invención es anticuerpos que unen específicamente OSM glicosilado, particularmente aquellos que unen hOSM glicosilado. Anticuerpo 15E10 es un ejemplo de un anticuerpo que une específicamente hOSM glicosilado. En algunas modalidades, el método utiliza hOSM glicosilado por una célula huésped mamífera tal como CHO o NSO. En otras modalidades, el método utiliza hOSM que se ha glicosilado por una célula humana por ejemplo, una célula huésped humana transfecíada o íransformada recombinantemente o hOSM nativo que se ha aislado del cuerpo humano (por ejemplo hOSM hecho por células enconíradas en el fluido sinovial de un paciente humano artrítico (por ejemplo, RA)). 3. Métodos de Producción Los anticuerpos de la invención pueden producirse como una población policlonal pero se producen más típicamente como una población monoclonal (es decir, como una población substancialmeníe homogénea de anticuerpos idénticos dirigidos coníra un siíio de unión aníigénico específico). Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en organismos transgénicos tales como cabras (ver Pollock eí al (1999), J . Immunol. Methods 231 : 147-157), pollos (ver Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1 -55) , ratones (ver Pollock eí al ibid) o plantas (ver Doran PM, (2000) Curr. Opinión Biotechnol. 1 1 , 199-204, Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601 -606, Baez J eí al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E eí al; (2000) Plant Mol . Biol. " 42:583-590). Los anticuerpos también pueden producirse por síntesis química. Sin embargo, los anticuerpos de la invención se producen íípicamente utilizando tecnología de cultivo de célula recombinaníe bien conocida por aquellos experíos en la materia. Un polinucleótido codificando el anticuerpo se aisla e inserta en un vector replicable tal como un plásmido para clonación adicional (amplificación) o expresión. Tal sistema expresión útil es un sistema de sinteíasa de glutamaío (tal como se vende por Lonza Biologies), particularmeníe donde la célula huésped es CHO o NSO (ver abajo). Polinucleófido codificando el aníicuerpo es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas de oligonucleótido). Los vectores que pueden utilizarse incluyen plásmido, virus , fago, transposones, minocromosomas de los cuales los plásmidos son una modalidad típica. Generalmente, tales vectores incluyen además una secuencia de señal, origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento aumeníador, u n promoíor y secuencias de íerminación de íranscripción operaíivamente enlazadas al polinucleótido de cadena pesada y/o ligera para facilitar la expresión . El polinucleótido codificando las cadenas ligera y pesada pueden inserfarse en vecíores separados y se introducen (por ejemplo, por eleclroporación) en la misma célula huésped o, si se desea íanío la cadena pesada como la cadena ligera pueden inseríarse en el mismo vecíor para íransfección en la célula huésped.

De esta manera, de acuerdo a una modalidad de la presente invención se proporciona u n proceso para construir un vector codificando las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo de la invención , tal méfodo comprende inseríar en un vecfor, un polinucleófido codificando ya sea de una cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo terapéutico de la invención . Ver Tabla A abajo. En otra modalidad de la invención se proporciona un polinucleótido codificando un dominio VH de murino íeniendo la secuencia establecida como SEQ. I . D. NO: 15 o SEQ. I . D. NO:52 En otra modalidad de la invención se proporciona un polinucleótido codificando un dominio V de murino teniendo la secuencia establecida como SEQ. l. D. NO: 16 o SEQ. I . D. NO:53.

En otra modalidad se proporciona un polinucleótido codificando un dominio VH humanizado teniendo la secuencia establecida como SEQ.l.D.NO: 17 o SEQ.I.D.NO:54. En otra modalidad se proporciona un polinucleótido codificando una cadena V humanizada teniendo la secuencia establecida como SEQ.l.D.NO: 18 o SEQ.I.D.NO:55. En otra modalidad se proporciona un polinucleóíido codificando una cadena pesada humanizada teniendo la secuencia establecida como SEQ.l.D.NO: 19 o SEQ.I.D.NO:56. En otra modalidad se proporciona un polinucleótido codificando una cadena ligera humanizada íeniendo la secuencia establecida como SEQ.I.D.NO:20 o SEQ.l.D.NO:57. Será inmediatameníe apárenle para aquellos experíos en la maferia que debido a la redundancia del código genético, polinucleófidos alíernativos a aquellos descritos en la presente íambién están disponibles, que codificarán los polipéptidos de la invención. 3.1 Secuencias de Señal Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse como una proteína de fusión con una secuencia de señal heíeróloga teniendo un sitio de separación específico en el termino N de la proteína madura. La secuencia de señal debe reconocerse y procesarse por la célula huésped. Para células huésped procarióticas, la secuencia de señal puede ser una fosfatasa alcalina, penicilinasa, o guías de enterotoxin I I estables por calor. Para secreción de levadura, las secuencias de señal puede ser una guía de invertasa de levadura, guía de facíor a o guías de fosfatasa de señal ver por ejemplo, WO90/13646. En sistemas de célula mamífera, guías secretores virales tal como señal gD simple de herpes y una secuencia de señal de inmunoglobulina nativa (tal como cadena pesada Ig) esíán disponibles. Típicamente, la secuencia de señal se liga en estrucíura de lecíura a ADN codificando el anticuerpo de la invención. 3.2 Origen de réplica Origen de réplicas se conocen bien en la materia con pBR322 adecuado para la mayoría de las bacterias de gramnegativo, 2µ plásmido para la mayoría de la levadura y varios orígenes virales tales como SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV para la mayoría de las células de mamífero. Generalmente, el origen de componente de réplica no se necesita para vecíores de expresión de mamífero pero el SV40 puede uíilizarse ya que contiene el promotor anterior. 3.3 Marcador de Selección Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióíicos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicin, metotrexaío o letraciclina o (b) complementar deficiencias auxiotrófica o suminisírar nuírienles no disponibles en el medio de complejo. El esquema de selección puede incluir detener el crecimiento de la célula huésped . Las células, que se han íransformado exitosamente con los genes codificando el anticuerpo terapéutico de la presente invención , sobreviven debido a por ejemplo, resistencia de fármaco conferida por el marcador de selección . Otro ejemplo es el así llamado marcador de selección DH FR en donde los transformadores se cultivan en la presencia de metoírexato. Las células CHO son una esfirpe de célula particularmente útil para la selección de DH F R. Los métodos para amplificar y seleccionar las células huésped utilizando el sistema DH FR también se esíablecen bien en la maferia ver Kaufman R.J . eí al J. Mol . Biol. (1 982) 159, 601 -621 , para revisión, ver Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M ," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1 998 Aug . U n ejemplo adicional es el sistema de expresión de sintetasa de glutamato (Lonza Biologies) . U n gen de selección adecuado para usarse en levadura es el gen trp l ; ver Stinchcomb eí al Natu re 282, 38, 1 979. 3.4 Promotores Promotores adecuados para expresar anticuerpos de la invención se enlazan operativamenle ADN/polinucleótido codificando el anticuerpo. Los promotores para huéspedes procarióticos incluyen promotor phoA, Beta-lactamasa y sistemas promotores de lacíosa, fosfatasa alcalina, tripíofan y promotors h íbridos tal como Tac. Los promotores adecuados para expresión en células de levadura incluyen quinasa 3-fosfoglicerato u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceralderh ído 3 fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, decarboxilasa de piruvato, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfaía isomerasa, 3-fosfoglicerato muíasa y glucoquinasa. Los promoíores de levadura inducibles incluyen dehidrogenasa de alcohol 2, isociíocromo C, fosfatasa de ácido, metaloíioneina y enzimas responsables de metabolismo de hidrógeno o utilización de m a liosa/galactosa. Los promofores para expresión en sistemas celulares de mamífero incluyen promotores virales tales como polioma, erupción en aves, y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma aviar, ciíomegalovirus (en particular el promotor genético íemprano inmediato), retrovirus, virus de hepaíitis B, acfin , virus de sarcoma rous (RSV) y el virus 40 de Simio íemprano o posferior. Por supuesío, la elección del promolor se basa en compatibilidad adecuada con la célula huésped utilizada para expresión . 3.5 Elemento Aumentador Donde sea apropiado, por ejemplo, para expresión en eucarióticas grandes, u n elemento aumentador operativamente enlazado al elemento promotor en un vector puede uíilizarse. Las secuencias aumenladoras de mamífero adecuadas incluyen elementos aumentadores de globin , elastasa, albúmina, feíoproteína e insulina. Alíernaíivamente, uno puede uíilizar un elemenío aumeníador de un virus de célula eucariótica, aumentador de polima, aumentador baculoviral o lugar IgG2 de murino (ver WO04/009823). El aumeníador es íípicamente ubicado en el vector en un sitio aguas arriba al promotor. 3.6 Células Huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar vecíores codificando aníicuerpos de la invención son células procarióíicas, levadura o eucarióticas más grandes. Las células procarióticas adecuadas incluyen eubacteria, por ejemplo, eníerobacteriaceas tales como E. Coli (por ejemplo ATCC 31 ,446; 31 ,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella así como también Bacilli tal como B.subtilis y B.licheniformis (ver DD 266 710), Pseudomonas tal como P. aeruginosa y Streptomyces. De las células huésped de levadura, Saccharomyces cerevisiae, schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), milhojas (EP402, 226), Pichia Pastoris (EP183, 070, ver también Peng eí al J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 234J , Penicillin, Tolypocladium y huéspedes Aspergillus tales como A.nidulans y A.niger también se contemplan. Aunque las células huésped de levadura y procarióticas se contemplan específicamente por la invención, típicamente sin embargo, las células huésped de la presente invención son células vertebradas. Las células huésped vertebradas adecuadas incluyen células de mamífero tales como COS-1 (ATCC No. CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651 ), línea de riñon embriónica de humano 293, células de riñon hámster de bebe (BHK) (ATCC CRL.1632) , BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células de ovario de hámster chino CHO (por ejemplo, CHO-K1 , ATCC NO: CCL 61 , estirpe de célula DHFR-CHO tal como DG44 (ver Urlaub eí al, (1986) Somatic Cell Mol . Geneí.12, 555-556)), particularmeníe aquellas estirpes de célula CHO adaptadas para cultivo de suspensión, células serloli de ratón , células de riñon de mono, células de riñon de mono verde (ATCC CRL-1587), células HELA, células de riñon caninas (ATCC CCL 34), células de pulmón de humano (ATCC CCL 75), Hep G2 y células de linfoma o mieloma por ejemplo, NSO (ver US 5,807,715), Sp2/0, YO. De esta manera en una modalidad de la invención se proporciona una célula huésped transformada comprendiendo un vecíor que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera del anficuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente. Típicamente, tales células huésped comprenden un primer vector codificando la cadena ligera y un segundo vector codificando dicha cadena pesada.

Fermentación Bacteriana Los sistemas bacterianos son particularmente adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpo. Tales fragmentos se ubican intracelularmente o deníro del periplasma. Las proíeínas periplásmicas insolubles pueden exíraerse y redoblarse para formar proteínas activas de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos experfos en la materia, ver Sánchez eí al (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 and Cupit PM ef ai (1999) Leít Appl Microbiol, 29, 273-277. 3.7 Métodos de Cultivo Celular Las células huésped íransformadas con vectores codificando los anticuerpos terapéuticos de la invención o fragmentos de unión de antígeno de los mismos pueden cultivarse por cualquier método conocido por aquellos expertos en la materia. Las células huésped pueden cultivarse en matraces giratorios, botellas giratorias o sistemas de fibra hueca pero se prefiere para producción a gran escala que reactores de tanque agitados se utilizan particularmente para cultivos de suspensión. Típicamente, los tanques agitados se adaptan para aeración utilizando, por ejemplo, rociadores, reguladores o impulsores bajo cortaníes. Para columnas de burbuja y reactores de aire dirigen aeración con burbujas de oxígeno o aire pueden utilizarse. Donde las células huésped se cultivan en un medio de cultivo libre de suero se prefiere que el medio se complemente con un agente proíeclor de célula tal como F-68 plurónico para ayudar a prevenir el daño celular como un resultado del proceso de aeración. Dependiendo de las caracterísíicas de célula huésped, cualquier microvehículo puede ser uíilizado como subsíratos de crecimiento por estirpes de célula dependientes de sujeción o las células pueden adaptarse al cultivo de suspensión (que es típico) . El cultivo de las células huésped , particularmente células huésped vertebradas pueden utilizar una variedad de modos operacionales íales como grupo de alimeníación , procesamiento de grupo repetido (ver Drapau eí al., (1 994 cyfoíechnology 15: 1 03-1 09), proceso de grupo exfendido o culíivo de perfusión . Aunque las células huésped mamíferas transformadas pueden cultivarse en medio conteniendo suero tal medio comprendiendo suero de bovino fetal (FCS) , se prefiere que tales células h uésped se cultiven en medio libre de suero sintéfico tal como se describe en Keen eí al (1 995) Cytoíechnology 17: 1 53-1 63, o medios comercialmeníe dispon ibles tales como ProCHO-CDM o U ltraCHO ™ (Cambrex NJ , USA) , complemeníado donde sea necesario con una fueníe de energ ía íal como glucosa y facfores de crecimiento sintético íal como insulin recombinante. El cultivo libre de suero de células huésped puede req uerir que aquellas células se adapíen para desarrollarse en condiciones libre de suero. U n planteamienío de adaptación es cultivar íales células huésped en suero coníeniendo medio e iníercambiar repeíidameníe 80% del medio de culíivo para el medio libre de suero de manera que las células huésped aprenden a adapíarse en condiciones libre de suero (ver por ejemplo, Scharfenberg K eí al (1 995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21 st century (Beuvery E. C. eí al eds) , pp61 9-623, Kluwer Academ ic publishers). Los aníicuerpos de la invención secreíados en los medios pueden recuperarse y purificarse de los medios utilizando una variedad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para el uso propuesto. Por ejemplo, el uso de anticuerpos íerapéuticos de la invención para el tratamienío de pacientes humanos típicamenfe manda al menos 95% pureza, más típicamenfe 98% o 99% pureza en comparación con el medio de cultivo comprendiendo los anticuerpos ferapéuficos. En el primer caso, los residuos celulares del medio de cultivo se remueven típicamenfe utilizando cenfrifugación seguido por una eíapa de clarificación del sobrenadanfe, uíilizando, por ejemplo, microfilfración, ulírafilfración y/o filtración profunda. Una variedad de otras íécnicas tales como diálisis y electroforesis de gel y técnicas cromatográficas tal como hidroxiapatita (HA), cromatografía de afinidad (opcionalmente incluyendo un sistema de marcado de afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrofóbica (H IC, ver US 5,429,746) están disponibles. En una modalidad, los anticuerpos de la invención, siguiendo varias etapas de clarificación, se capturan utilizando cromatografía de afinidad de Proteína A o G seguida por efapas de cromafografía adicionales tal como intercambio de ion y/o cromatografía HA, intercambio de anión o caíión, cromaíografía de exclusión de tamaño y precipitación de sulfato de amonio. Típicamente, varias eíapas de retiro de virus también se emplean (por ejemplo, nanofiltración uíilizando, por ejemplo, filtro DV-20). Siguiendo estas diversas etapas, una preparación purificada (íípicameníe monoclonal) comprendiendo al menos 75mg/ml o más por ejemplo, 100mg/ml o mayor del anticuerpo de la invención o fragmento de unión de aníígeno del mismo se proporciona y por lo tanto forma una modalidad de la invención. De manera adecuada tales preparaciones están substancialmeníe libres de formas agregadas de aníicuerpos de la invención. 4. Composiciones Farmacéuticas Las preparaciones purificadas de anticuerpos de la invención (particularmenfe preparaciones monoclonales) como se describe supra, pueden incorporarse en composición farmacéuticas para utilizarse en el tratamiento de enfermedades humanas y desordenes tales como aquellos subrayados arriba. Típicamente, tales composiciones comprenden además un vehículo farmacéuticameníe aceptable (es decir, inerte) como se conocen y llaman por prácfica farmacéufica acepíable, ver por ejemplo, Remingíons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co. Ejemplos de tales vehículos incluyen vehículo esterilizado fal como salina, solución de Ringer o solución de dextrosa, regulada con reguladores adecuados a un pH deníro de un rango de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas para inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, iníradérmica, subcuíánea, intramuscular o ¡ntraporta!) o infusión continua están subsfancialmente libres de materia particulada visible y pueden comprender entre 0.1 ng a 100mg de anticuerpo, típicameníe eníre 5mg y 25mg de aníicuerpo. Méíodos para la preparación de fales composiciones farmacéuticas se conocen bien por aquellos experíos en la materia. En una modalidad , composiciones farmacéuticas comprende entre 0.1 ng a 100mg de anticuerpos terapéuticos de la invención en forma de dosificación unitaria, opcionalmente junio con insfrucciones para usarse. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden liofilizarse para reconstilución antes de administración de acuerdo a métodos bien conocidos o apareníes para aquellos experíos en la maíeria. Donde las modalidades de la invención comprenden anticuerpos de la invención con un isotipo lgG1 , un quelador de cobre tal como citraío (por ejemplo, citraío de sodio) o EDTA o histidina puede agregarse a la composición farmacéutica para reducir el grado de degradación mediada por cobre de anticuerpos de este isotipo, ver EP0612251 . Las dosis efectivas y regímenes de tratamienío para administrar el anticuerpo de la invención generalmente se determinan empíricameníe y son dependienfes de factores tales como la edad, peso y estado de salud del pacieníe y enfermedad o desorden a traíarse. Tales factores están dentro del campo del médico. Guía para seleccionar dosis apropiadas puede encontrarse en, por ejemplo, Smilh eí al (1977) Aníibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York, pero en general será entre 1 mg y 1000mg. En una modalidad, el régimen de dosificación para traíar un pacieníe humano afligido con RA es 100mg o aproximadamente (es decir, entre 50mg a 200mg) de anticuerpo de la invención (o fragmento de unión de antígeno del mismo) administrado subcutáneameníe por semana o cada dos semanas. Composiciones de la presente invención también pueden utilizarse de manera profiláctica. Dependiendo de la enfermedad o desorden a traíarse, las composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticameníe efectiva del anticuerpo de la invención puede utilizarse de manera simultánea, separada o secuencial con una caníidad efectiva de otro medicamento lal como un agente antiinflamatorio por ejemplo NSAID, metotrexato, bucilamine, tiomilato de sodio o uno o más de un tratamiento alfa anti-TNF tal como Enbrel™ (etanercepl), Remicade™ (infliximab), Humira™ (adalimumab) y/o CDP870. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con una cantidad efectiva de un anticuerpo receptor alfa anti-TNF, ver Davis MW eí al. (2000) Ann Rheum Dis 59(Suppl 1 ): 41 -43. En otras modalidades, anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con una canfidad efectiva de un agente dirigido contra; IL-1/IL-1 R (por ejemplo, Kineret™), CTLA4-lg, IL-6 (ver Choy eí al, (2002) Ann. Rheum. Dis 61 (suppl 1 ): 54), IL-8, IL-15, VEGF, IL-17, IL-18 (ver Taylor eí al (2001 ) Curr. Opin. lmmunol.13:61 1 -616), anti-ICAM y/o anticuerpos anti-CD4, agentes dirigidos contra un miembro de la familia MMP, por ejemplo, MMP-1 , 2, 3 y/o 13. Anticuerpos de la invención también pueden utilizarse en combinación con un agente que extirpa las células conocidas por incluirse en el proceso inflamatorio, por ejemplo, células B positivas CD20 utilizando por ejemplo Mabthera™ . Otras lerapias en combinación con aníicuerpos de la invención incluyen íerapias aníi-angiogénicas íales como aníagonistas de la integrin avß3, Kringles "1 -5 (ver Sumariwalla P eí al (2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39.), Flt-1 soluble (ver Miotla eí al, (2000) Lab. Invest. 80: 1 195-1205) o un agente anti-COX-2. Convencionalmente, una composición farmacéutica comprendiendo un kit de partes del anticuerpo de la invención o fragmento de unión de antígeno del mismo junto con tal otro medicamento opcionalmenfe junto con instrucciones para usarse también se contempla por la presente invención. La invención proporciona además una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad terapéuficameníe efectiva de anficuerpo terapéutico monoclonal o fragmento de unión de antígeno del mismo como se describe en la presente para usarse en el tratamienlo de enfermedades en respuesta a modulación de la interacción entre OSM Sitio I I y gp130. También se proporciona una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo íerapéutico monoclonal íal anticuerpo comprende una cadena pesada teniendo la secuencia esíablecida en SEQ. l .D.NO: 1 1 y una cadena ligera leniendo la secuencia esíablecida en SEQ. l . D.NO: 12. También se proporciona una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad terapéuticameníe efectiva de un anticuerpo terapéutico monoclonal íal aníicuerpo comprende una cadena pesada íeniendo la secuencia esfablecida en SEQ. l. D. NO: 50 y una cadena ligera íeniendo la secuencia esfablecida en SEQ. l . D.NO: 51 4.1 Composiciones Farmacéuticas para la Modulación de Interacción tanto de Sitio II como Sitio III Un aspecío de la preseníe invención se basa, al menos en parfe, en el descubrimiento inesperado de que la modulación de la interacción de tanto el Sitio II como Sitio III de hOSM con sus patrones de iníeracción respecíivos (es decir, Siíio I I , gp130, para Sifio I I I OSMRß y/o LI FR, y/o gp130 para unión de una segunda molécula OSM) despliega sinergia en comparación con la modulación de la interacción de cualquiera de estos dos sitios solos. La presente invención por lo íanío proporciona un método para modular la interacción entre hOSM y gp130 y LIFR y/o OSMRß íal méíodo comprende proporcionar un aníagonisía de Siíio I I capaz de modular (es decir, inhibir o bloquear) la iníeracción entre Sifio I I de hOSM con gp130 y proporcionar un antagonista de Sifio I I I capaz de modular (es decir, inhibir o bloquear) la inleracción eníre Sitio II I de hOSM y OSMR y/o LI FR, y gp130 (para unión de una segunda molécula OSM) despliega sinergia en comparación con la modulación de la inieracción de cualquiera de esíos dos siíios solos. La presente invención por lo tanío proporciona un méíodo para modular la interacción entre hOSM y gp130 y LIFR y/o OSMRß fal méíodo comprende proporcionar un aníagonista de Siíio I I capaz de modular (es decir, inhibir o bloquear) la inferacción enfre Sitio I I de hOSM con gp130 y proporcionar un antagonisía de Siíio I I I capaz de modular (es decir, inhibir o bloquear) la interacción entre Sitio I I I de hOSM y OSMR y/o LIFR. En una modalidad se proporciona una composición farmacéutica comprendiendo un primer agente íerapéutico que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 (un anticuerpo de Sitio II, ejemplos de los cuales se proporcionan por esta especificación) y un segundo anticuerpo terapéulico que une específicameníe hOSM y modula la iníeracción eníre hOSM y OSMR y/o LIFR (un anticuerpo de Sitio I I I , un ejemplo del cual está comercialmente disponible como MAB295, R&D sysíems). El segundo aníicuerpo terapéutico puede reconocerse por su habilidad para modular (es decir, inhibir o bloquear) la interacción eníre hOSM y OSMRß y/o LIFR en un ensayo a base de ELISA o como se esíablece en los ejemplos, es decir, por su habilidad para neutralizar OSM en el ensayo KB de los ejemplos y no inhibir la unión de OSM y gp130 en el ensayo ELISA de los ejemplos. Un anticuerpo de Sitio I I puede reconocerse por su habilidad para inhibir unión de OSM en el ensayo ELISA de los ejemplos. Típicamente, ambos, el primero y segundo, anticuerpos terapéuticos son monoclonales. Por supuesto será aparente para aquellos expertos en la materia que no es necesario que la composición farmacéuíica comprenda dos entidades anlagonisías (por ejemplo, dos entidades de anticuerpo terapéuíico) ya que es posible proporcionar, por ejemplo, aníicuerpo biespecífico que une específicameníe hOSM y modula íanío la iníeracción de Sitio I I como Sitio II I con sus patrones de interacción respectivos.

En otra modalidad se proporciona un kit de partes comprendiendo una primer composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo terapéutico que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Sitio I I de hOSM y gp130 y una segunda composición farmacéuíica comprendiendo un aníicuerpo íerapéutico que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Sitio III de hOSM y OSMRß y/o LIFR opcionalmente junto con instrucciones para usarse. En otra modalidad lambién se proporciona un mélodo para fratar un pacieníe humano afligido con una enfermedad o desorden en respuesta a la interacción entre hOSM y sus patrones de interacción (por ejemplo, . gp130 y OSMRß y/o LI FR) tal como un desorden o enfermedad inflamatoria (por ejemplo, enfermedades artríticas tal como aríriíis reumatoide u osteoartritis) tal méíodo comprende administrar simultánea, secuencial o por separado una cantidad terapéuticameníe efectiva de un primer antagonista terapéutico (por ejemplo, anticuerpo) que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Sitio I I de hOSM y gp130 y una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo antagonista (por ejemplo, anticuerpo) que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Sitio I I I de hOSM y OSMRß y/o LI FR. Por supuesto será aparente para aquellos expertos en la materia al menos un primer antagonista (tal como un anticuerpo) que une gp130 y modula (por ejemplo, bloquea) la interacción entre (a) gp130 y hOSM y también (b) OSMRß y/o LIFR y hOSM puede lograr el mismo objetivo como se establece arriba.

Usos Clínicos Anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar una variedad de enfermedades o desórdenes en respuesta al tratamienío que modula la interacción entre Sitio II de hOSM y gp130. Se hace mención particular de enfermedades o desórdenes incluyendo la producción de niveles patológicos de TNF alfa (es decir, un desorden o enfermedad mediada por TNF alfa) y aquellas enfermedades o desordenes caracterizados por la interrupción o destrucción de cartílago, cartílago articular particular. Como se describe en detalle supra, anticuerpos de la invención pueden utilizarse en el traíamiento de atropatías inflamaíorias lal como RA ya sea como una monolerapia o en combinación con otro tratamienlo para tal artropatía. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar una forma clínicamente estable de la enfermedad en cuestión o para prevenir el inicio en pacientes susceptibles o disminuir o detener el progreso de la enfermedad hacia significado clínico. Para el tratamiento de RA, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para prevenir el relapso una vez que la remisión de la enfermedad ha ocurrido. Donde el paciente se aflige con una forma intermilente de la enfermedad, los aníicuerpos de la invención pueden utilizarse para prolongar el iníervalo de íiempo entre fases agudas de la enfermedad. Anticuerpos de la invención también pueden utilizarse para tratar las manifestaciones extra-aríiculares de RA, por ejemplo, síndrome Feltys y/o tratar la formación de placas ateroescleróticas. Para el tratamiento de RA, combinaciones de anticuerpos de la invención junto con medicamentos descritos supra pueden utilizarse. Otras enfermedades artríticas que pueden beneficiarse de la administración de un anticuerpo de la invención incluye aríriíis de Inicio Juvenil, aríritis psoriáfica y espondilitis de anquilosis. Osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa, crónica de origen desconocido caracterizada por la pérdida gradual de cartílago aríicular y función de unión. Se clasifica actualmeníe en dos grupos.

OA primaria puede localizarse o generalizarse, la última encontrada más comúnmente en mujeres posí-menopáusicas, con el desarrollo de nodos de Heberdens. OA secundaria íiene una causa subyaceníe tal como trauma, obesidad, enfermedad de Paget o artritis inflamatoria. La pérdida de cartílago articular con frecuencia se acompaña por cambios óseos hipertróficos con formación de osteofito, espesamiento óseo subcrondral e inflamación de le membrana sinovial. De particular interés es la incapacidad afligida a articulaciones que llevan peso tales como la rodilla, manos y cadera. OA es una enfermedad extremadamente debilitaníe que en lo más severo requiere el reemplazo de la articulación para restaurar la movilidad y detener el dolor de la articulación. Osfeoartritis de la cadera se ha dividido en formas hiertróficas y atróficas (ver Solomon L (1976) J Bone Joiní Surg 58, 176) en la base de una íendencia del paciente para desarrollar osteofitos grandes: otras articulaciones pueden responder de manera similar a la presencia de la enfermedad. OA hiperfrófica puede asociarse con deposición de crisfal de pirofosfaío y difundir la hiperostosis esqueléíica idiopática. Los tratam?enfos actuales incluyen el uso de analgésicos no opioides tales como acetaminofen, y Tramadol, NSAI DS íal como un inhibidor específico de Cox-2 por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, opioide analgésicos y glucosamina y sulfato de condroitin. De esía manera en una modalidad de la invención se proporciona un método para tratar osteoartritis (por ejemplo, primaria os secundaria) en un paciente humano afligido con tal enfermedad, tal método comprende administrar a dicho pacieníe una cantidad terapéulicamenfe efectiva de un anticuerpo íerapéuíico o fragmento del mismo de la invención como se describe en la presente. La invención se refiere a una combinación del anticuerpo ferapéufico de la invención junto con otro íraíamiento paríicularmente uno o más de los traíamientos de CA arriba descriíos. Psoriasis es una enfermedad de la piel crónica con morbidez significativa que afecta aproximadamente 2% de la población Caucásica. Aunque para muchos puede ser una enfermedad relativameníe suave, puede tener efectos profundos en aquellos afectados. La incapacidad de pacientes con psoriasis se ha mostrado que es similar a aquella de pacientes con angina y acercamientos de los pacientes con falla cardiaca (Finlay eí al, (1990); Br. J. Dermatol, 123, 751 ). La forma más común de psoriasis es enfermedad de placa crónica. Esta se presenta como placas de escala roja bien definidas típicamente distribuidas sobre el cuero cabelludo, espalda inferior y aspectos extensores de los limbos. Las variantes clínicas incluyen psoriasis de gota, sebopsoriasis y formas pustulares de la enfermedad . Una minoría de pacientes también desarrollan artritis inflamatoria seronegativa. Microscópicamente, la piel lesional muestra proliferación incrementada y diferenciación anormal de queratinocitos, infilíración por linfocitos auxiliares T y neutrófilos e inacíivación de la vasculatura subcuíánea. Esíos cambios corresponden a sobreexpresión de facíores de crecimienío y sus receplores, ciíoquinas proinflamatorias y pépíidos angiogénicos. Sin embargo, a pesar de la investigación investiga la etiología y patogénesis de esta enfermedad permanece obscura aunque un papel central jugado por células T activas se ha demostrado en sistemas de modelo animal (ver Nickoloff eí al (1999) Arch. Dermatol.135, 546-552). Los tratamientos corrientes incluyen tratamientos tópicos tales como análogos de Viíamina D, coríicoesferoides, ditranol y relinoides íal como gel Tazaroteno. Fototerapia incluye el uso de ultravioleta B o psoralen o ultravioleta A, y láser excimador. Tratamienfos retinoides sistémicos incluyen Etretinaío y acifreíin, isotreíinoin, liarozola. Otros tralamieníos incluyen meíotrexaío, hidroxiurea, ciclosporin y antagonistas de calcineurin, 6-tioguanina, azatioprina, sulfasalazina y ésíeres de ácido fumárico. Más recientemeníe, los tratamientos biológicos tales como Ontak™ (Denileukin Diftifox), Zenapax™ (Daclizumab), Basiliximab, anticuerpos anti-CD4, Efalizumab, Alefacept™ , Siplizumab, I DEC-1 14 y BMS 188667 (CTLA4Ig) han propuesto o demostrado ser útiles en el tratamiento de esta enfermedad. Además, tratamientos alfa anti-TNF tales como Enbrel™ (etanercept), Remicade™ (infliximab), Humira™ (adalimumab) y/o CDP870 pueden utilizarse como psoriasis (incluyendo variantes de las mismas). Evidencia para el papel de OSM en lesiones psoriáíicas se encuenfra en Boifati eí al (1998) Arch. Dermatol. Res 290:9, 13. Oncostatin M se secreta de manera espontánea por cultivos de órgano de corto plazo de piel psoriática lesional (Ver Bonifati C eí al ibid). Además de la activación constitutiva de STAT3, la molécula de señalización principal aguas abajo del receptor OSM, en queraíinociíos de rafón resulta en desarrollo espontáneo de lesiones psoriáticas (Ver Sano S eí al (2005) Naíure Medicine 1 1 :43-49). Los anticuerpos de la preseníe invención pueden por lo íanto utilizarse en el tratamiento de psoriasis (placa crónica, gota, sebopsoriasís, pustular, psoriasis asociada con artritis inflamatoria seronegativa), dermatitis atópica/eczema, acén, ictiosis, penfigo, verrugas virales ya sea como una monoterapia o en combinación con estos tratamientos descritos supra. Eritematoso lupus sistémico (SLE) es una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por producción de auto-anticuerpos, formación de complejo inmune y daño de tejido mediado inmunológicameníe (Revisado en Rheumatology (2003). Eds Hochberg, Silman, Smolen, Weinblatt and Weisman. Pub.

Mosby.1291 -1430). Manifestaciones patológicas incluyen necrosis de fibrinoide, cuerpos de hemotoxilin, lesión vascular, e interrupción de la unión dérmica-epidérmica de piel, artritis inflamatoria y glomerulonefritis. SLE puede preseníarse en cualquier edad incluyendo neonafos. Es uno de los desordenes más comunes afectando mujeres en edad de llevar niños, es significativameníe más común en mujeres que en hombres y afecta gente de origen Africano significativamente más frecuentemente que Caucásicos. Su incidencia se ha estimado entre 1 .8 y 7.6 casos por 100,000 personas-años en EE. UU. SLE se asocia con mortalidad incrementada, principalmente de infección, y complicaciones CNS y renales. Tratamiento de lupus y sus complicaciones se determinan por necesidades individuales del paciente. Fármacos antiinflamatorios no esferoidales son de una terapia de primer línea importante para síntomas músculo-esqueléticos, señales consíitucionales y serositis suave. . Anti-malarios (por ejemplo, hidroxicloquina, cloroquina y quinacrina) se ufilizan para traíar síntomas músculo-esqueléticos y señales constiíucionales que son refracatarias para no esferoidales y esteroides de baja dosis. La mayoría de las manifestaciones clínicas de SLE responden a tratamienlo con esteroides pero los efectos secundarios de estos fármacos pueden limitar tanío la dosis como duración de tratamiento. Los fármacos inmunosupresores, notablemente Azatioprina, pueden utilizarse para enfermedad más severa. Recientemente, el traíamienfo con la célula B eliminado el aníicuerpo Riíuxan ha mostrado resultados promefedores en SLE (Revisado en Looney RJ eí al (2005) Cu rr Dir Aufoimmune 8: 1 93-205) . O ncosíatin M se ha enconlrado en niveles elevados en suero para pacientes SLE y los niveles muestran correlacionar con acíividad de enfermedad (Ver Robak E et al (1 997) Eu r Cytokine Neíw 8: 281 -286) . De esía manera, la invención se refiere al uso de anticuerpos de la invención en el fratamienío (ya sea como u na monoíerapia o en combinación con uno o más del os tratamieníos SLE actuales detallados arriba) de SLE. Esclerosis sisíémicos (SS) que incluye variantes de escleroderma y fenómeno de Raynaud es un desorden generalizado de la piel y órganos internos. Se caracíeriza por acumulación de maíriz exlracelular en la piel y viscera . O ncosíaíin M puede estimular acumulación de matriz exíracelular excesiva (Ver Bamber B eí al (1 997) J Mol Med Abstrací Vol 76: 61 -69). Oncostaíin M se produce espontáneamente de células mononucleares cultivadas de pacientes con esclerosis sistémica (Ver Hasegawa M eí al (1999) Rheumatology (Oxford) 38: 61 2-61 7) y se encuentra en fluido de lavado bronoalveolar de fibrosis pulmonar en escleroderma (Revisado en Atama SP and Whiíe B (2003) Cyíokine g rowth Facíor Rev 14: 537-550) . De esfa manera, la invención se refiere al uso de anficuerpos de la invención en el fraíamienío de SS y varianíes de los mismos como una monoíerapia o en combinación con oíro medicamenío. OSM se ha deíectado en el fluido de lavado broncoalveolar de pacientes durante lesión de pulmón aguda, particularmente en casos de neumonía (Tamura S eí al (2002) Develop Dyman 225:327-331 ). Los neutrófilos parecen ser la fuente celular de OSM en estos pacientes, y concentraciones de OSM en el fluido BAL se correlacionan con números PMN. Ya que los neutrófilos son una fuente de OSM, y en la activación secreían OSM, es probable que OSM esfará preseníe en los pulmones de cualquier pacienfe en donde neutrófilos son un componente significativo de inflamación de vías respiratorias, incluyendo COPD y asma severo. Además, OSM también se expresa por eosinófilos de tejido (ratón) y podría ser una fuente significativa de OSM durante inflamación (ver Tamura ibid). La sobreexpresión de OSM en vías respiratorias de raíón ufilizando un vector adenovirual indujo la inflamación eosionofílica profunda y deposición de matriz (ver Langdon C eí al (2003) J. lmmunol. 170:548-555 y también expresión de TIM P-1 (ver Kerr C eí al (1999) J . I nterfer. Cytokine Res. , 19: 1 195-1205. Exposición de fibroblastos de pulmón de ratón a OSM estimuló la liberación de eotaxin, un quimioatrayente de eosinófilo potente. Además, OSM estimula la proliferación, induce producción de colágeno y previene la apoptosis de fibroblastos de pulmón de humano (ver Scaffidí, A.K. eí al (2002) Brit.J. Pharamcol 136:793-801 ). Aunque los mecanismos más allá de esías observaciones son desconocidos, la deposición de malriz podría, en paríe, ser el resulíado de una fuerte supraregulación específica de síntesis de inhibidor de proteinaza a1 (ver Cichy, J. eí al (1998) Biochem. J 329:335-339). OSM íambién se ha enconírado que promueve proliferación de célula germinal dependiente de fibroblasto y un incremento marcado en contenido de histamina (ver Gyotoku E eí al (2001 ) Arch. Dermaíol. Res 293:508- 514). La instalación directa de OSM en pulmones de raía aislados indujo secreción de I L-6 sosíenida y rápida (ver Li, H . L. (2002) J. Drug Targ 10:55-62). De esta manera, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos de la invención (ya sea como una monoterapía o en combinación con ofro medicamento) en el tratamiento de enfermedades de pulmón inflamatorias tal como asma y COPD (desorden pulmonar obsírucíivo crónico). OSM se ha defecíado en los cerebros de pacientes con esclerosis múltiple (MS) , donde se localiza microglia, aslrosiíos y leucocitos infiltrantes (ver Ruprecht K ef al Journal of Neuropathology & Experimeníal Neurology. 60(1 1 ): 1087-98, 2001 Nov). OSM induce secreción de I L-6 y MCP-1 de células endoteliales cerebrales, y adición de TNFa con OSM causa una respuesta sinergíslica. OSM lambién induce la expresión de ICAM1 en células endofeliales microvasculares cerebrales, que podrían aumenfar la infiltración de leucocito en tejido cerebral (Ruprecht K eí al ibid). Además de promover la inflamación en el cerebro, OSM puede contribuir directameníe a pérdida de neurona. Los sobrenadaníes de monocifo de paciente con VI H causa profunda inhibición de crecimiento de neuroblasto también muerte celular neuronal, y el mediador de esíos efectos se muestra que es Oncostatin M. Ya que muchos pacientes con VI H sufren de aírofia cerebral causada por pérdida de célula neuronal. OSM puede ser un mediador de esta patología. Claramente, OSM podría también jugar un papel en otras enfermedades CNS donde la pérdida neuronal ocurre. De manera interesante en enfermedad de Alzheimer (AD), antiquimotripsin a1 (ACT) es una de las proteínas asociadas amiloides y su expresión es dramáticamente incrementada en áreas de enfermedad, tal vez facilitando deposición de proteínas anormales en placas amiloides y enredos neurofibrilares. OSM, que se conoce por secretarse tanto por células T activadas de infiltración como monocitos, y microglia, es un inducíor poíeníe de ACT, y podría por lo íanío coníribuir a la patología AD (ver Kordula T et al (1998) J Biol. Chem. 273:41 12-41 18 and Kordula T Journal of Neuroscience. 20(20): 7510-6, 2000). El trabajo por Tamura eí al sugiere que OSM puede incluirse en el desarrollo y mantenimíenío de dolor neuroático (ver Tamura S. eí al (2003) Eur.J . Neurosci. 17:2287-2298). Sus esíudios revelaron un subconjunto de neuronas sensoriales nocicepíivas que expresan el receptor OSMß. Todas las neuronas OSM ßR +ve también expresaron receptores VR1 y P2X3, que se han mostrado que son cruciales para desarrollo tanto dolor neuroático como inflamatorio (ver Jarvis M . F. et al (2002) PNAS 99: 179-184 y Walker K.M eí al (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther 304, 56-62). Además, los ratones OSM-/- tienen respuestas nocivas reducidas a dolor químico, térmico, visceral o mecánico, correlacionándose con una reducción de neuronas pequeñas VR1 +ve P2X3+ve (ver Morikawa, Y. eí al (2004): J Neurosci 24, 1941 -1947). De esía manera, la preseníe invención íambién se refiere al uso (ya sea como una monoferapia o en combinación con ofro medicamento) de anticuerpos de la invención en el íratamienío de enfermedades del sistema nervioso central o desordenes tal como se describe supra íales como esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer (AD) y otras demencias y además se refiere al uso en el tratamiento de dolor, particularmeníe dolor inflamatorio y/o neuropático. OSM se encuentra en macrófagos de tejido en lesiones aíeroescleróticas (ver Modur V. eí al J.Clin I nvest. 100, 158-168) y como un factor angiogénico puede promover la neovascularización característica de placas ateroescleróticas que se piensa que contribuye a fragilidad de la pared del vaso. Así como también la respuesta angiogénica, OSM causa inducción de tanto secreción de I L-6 en células endoteliales, donde sus efectos son aditivos o sinergísticos con IL-1 y TN Fa respecíivameníe, y la expresión COX-2 (ver Brown JT eí al (1991 ) J. Immunol.147:2175-2180). La inducción de la célula endolelial de COX2 es necesaria para las propiedades angiogénicas de OSM (ver Brown JT eí al, ibid). Sin embargo, OSM también induce la expresión de otros factores angiogénicos en células endoteliales; VEGF (Vasse, M eí al (1999) Arterioscler Thromb Vase Biol. 19:1835-1842) y bFG F (Wijelah E.S. eí al (1997) J.Cell Sci 1 10:871 -879) De manera interesante, células endoteliales humanas tienen aproximadamente 10-20 veces más de densidad de receptor OOSM que otras células (ver Modur V. eí al ibid). Además de los efecfos en endolelio, OSM también induce la expresión de IL-6 y COX-2 en células musculares lisas vasculares (VSMC) así como también causando cambios de golpeteo en morfología celular (Bernard C. eí al (1999) Circ. Res. 85: 1 124-1 131 ). Los depósitos se encuentran usualmente en lesiones aíeroescleróíicas avanzadas donde los macrófagos son la célula inflamatoria predominante. Los macrófagos son una fuente principal de OSM y de manera interesanfe, esfa citoquina puede inducir la fosfatasa alcalina tipo ósea y deposición de calcio en culíivos VSMC (Shioi A. eí al {2002) Circ.Res. 91 :9-16). OSM íambién respecfivamente induce y suprime facíor de íejido (TF) y la secreción de inhibidor de trayecíoria TF (TFPI) de VSMCs, resultando en una actividad procoagulanfe polente en sobrenadaníes de cultivo VSMC (Mirshahi F. eí al (2002) Blood Coag . Fibrinol. 13:449-455). Además, OSM afecta el factor von-Willebrand, activador de plasminogen tipo tejido y secreción PAI-1 de células edoteliales en una manera que sugiere que "OSM podría jugar un papel clave en el desarrollo de otras lesiones ateroescleróticas" (Portau J eí al (1998) Blood Coag. Fibrinol. 9,609-615). Los niveles de plasma de fibribongen son un factor de riesgo vascular importante y OSM es un inductor potenfe de secreción de fibronogen en estudios con una estirpe de célula de hepatoma (Vasse. M eí al (1996) Haernosíasis 26, Suppl 4, 331 -339). Sin embargo, a alia concenfraciones (50 ng/ml) OSM también incrementó la expresión del recepíor LDL humano (Liu eí al (2003) Aterio. Thromb. Vasc. Biol.23:90-96). Finalmente, OSM promueve esterificación de colesterol en macrófagos de monocito J774, y pueden por lo tanto contribuir a este proceso durante desarrollo de célula Foam en lesiones ateroescleróticas (Maziere C eí al (1996) Biochem. Biophys Acta 1300, 30-34). De esta manera, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos de la invención en el írafamiento de enfermedades o desordenes del sistema cardiovascular. También se contempla el uso de. anticuerpos de la invención en el tratamiento de ateroesclerosis y enfermedades de origen celular endotelial. Se contempla además el uso de anticuerpos de la invención para fraíar pacieníes afligidos con VIH , particularmenle para fratar condiciones resultantes de infección con virus tal como sarcoma de Karposi. Los anticuerpos de la invención íambién pueden uíilizarse en enfermedades de regulación de ciclo celular por ejemplo, cáncer (íal como cáncer de prósíata), mieloma. Aunque la preseníe invención se ha descriío principalmeníe en relación al frafamienfo de enfermedades o desórdenes de humano, la preseníe invención puede íambién lener aplicaciones en el íratamienfo de enfermedades similares o desórdenes en mamíferos no humanos.

Tabla A La presente invención se describirá ahora a manera de ejemplo solamente. Las reivindicaciones anexas pueden incluir una generalización de uno o más de los siguieníes ejemplos.

Eiemplificación Ejemplos 1 a 6 se refieren a la producción y formación de anticuerpo 15E10. Ejemplo 7 se refiere a la producción y formación de anticuerpo 10D3. 1. Generación de Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales se producen por células de hibridoma generalmente de acuerdo con el método establecido en E Harlow and D Lañe, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. El resulíado de la fusión de células de mieloma de raíón con B-linfocifos de ralones inmunizados con el antígeno objetivo. La célula hibridoma se inmorfaliza por el patrón de fusión de mieloma mientras la capacidad para producir anticuerpos se proporciona por el linfocito B. Cuatro ratones SJL se inmunizan por inyección intraperiíoneal con OSM humano glicosilado (hOSM) producido en células CHO suspendidas en adyuvaníe RIBI (Sigma) . Los raíones se inyecían con hOSM solamenfe después de 2 semanas eníonces con hOSM neutralizado con anficuerpo monoclonal anti-sitio III (OM4/11 .17; OSM:Mab 1 : 1 .5 p:p) para activar la respuesía inmune hacia el Siíio II después de un adicional de 2 semanas de nuevo con el complejo OSM-MAb después de otras 2.5 semanas y finalmente con OSM solamente después de 5 semanas. Tres meses después de inmunización inicial, los bazos se remueven y linfocitos B se fusionan con células de mieloma de ratón derivadas de células P3X utilizando PEG1500 (Boehringer) para generar hibridomas. Las estirpes de célula de hibridoma individuales se clonan al limitar la dilución (E Harlow y D Lañe). Las cavidades conteniendo colonias únicas se identifican microscópicamente y los sobrenadantes se prueban para actividad. Las células de la mayoría de los clones acíivos se expanden para crioconservación , producción de aníicuerpo, ele. Selección de anticuerpo OSM inicial fue en la base de especificidad y potencia en neutralizar OSM glicosilado humano valorando en ELISA inhibición gp130 y el ensayo de célula KB (ver abajo) el último proporcionando una verificación de especificidad OSM . Después de identificación de anticuerpos de suficiente potencia y especificidad correcta, criterios de selección adicional se aplican : 1 . reactividad cruzada contra OSM de mono cinomólgo 2. mantenimiento de actividad contra OSM de humano en la presencia de suero AB de humano ag rupado 3. mantenimiento de actividad conlra una biblioteca OSM de neutrófilo de humano y contra OSM derivado de célula de fluido sinovial RA 1920 hibridomas se seleccionan en ELISA de inhibición gp130. 43 dieron más de 50% inhibición y los experimeníos de respuesía de dosis limitados se hacen en 15 de los cuales 6 se seleccionan para estudio adicional . Esíos se subclonan y clones maesíros se seleccionan. Dos anticuerpos, clon 1 5E 1 0 y clon 1 0D3 (ver ejemplo 7) se seleccionan en la base de potencia. Anticuerpo de murino 15E10 fue consistentemeníe más poteníe en ELISA de inhibición gp1 30 pero tuvo potencia similar a 1 0D3 en el ensayo de célula KB cuando OSM de humano fue el antígeno objetivo. Sin embargo , anficuerpo de murino 1 5E 1 0 fue mucho más poteníe que 1 0D3 coníra OSM de mono cinomólgo en ambos ensayos. 2. Clonación de Regiones Variables de Clon 15E1 0 ARN toíal se extrae del clon de células de hibridoma 15E 1 0 y el cADN de los dominios variables ligeros y pesados se produce por íranscripción inversa uíilizando cebadores específicos para la secuencia gu ía de murino y las regiones constaníes de anficuerpo de acuerdo con el isotipo predeterminado (lgG2a/?). El cADN de los dominios ligeros y pesados variables se clona entonces en el vector pCR2.1 para secuenciación. 2.1 Extracción de ARN ARN fotal se exírae de pastillas de 1 06 células de clon de hibridoma 1 5E 1 0 utilizando Sistema de Aislamiento de ARN Total SV de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 2.2 Transcripción Inversa ARN se transcribe de manera inversa para producir cADN de los dominios ligeros y pesados variables utilizando cebadores específicos para las secuencias guía de murino y regiones constantes lgG?2a/? de mu rino. La mezcla de cebadores utilizada se establece en Jones ST y Bendig M M Bio/technology 9:88-89 (1991 ). Los grupos de cebadores delanteros de secuencia gu ía VH y V de mu rino se preparan a 50µ M . Las soluciones de los cebadores inversos de región consíanfe K y ?2a de murino también se preparan a 50µM . 2.3 Transcripción Inversa (RT-PCR) La transcripción inversa del ARN codificando las regiones pesadas y ligeras variables se lleva a cabo en duplicados utilizando el sistema Access RT-PCR de Promega de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cebadores delanteros e inversos VH y V fueron como se describe arriba. 3. Clonación de Producto PCR de 2.3 3.1 Purificación de Gel Los productos de RT-PCR (2xVH y 2xVL) se cargan en solución de carga de gel en un gel de agarosa al 1 % preparativo conteniendo 0.01 % bromuro de etidio y corre en un regulador TAE a 100V por 1 hora y las bandas de región V se cortan. Una escala de ADN 100bp también corre en el gel para permitir identificación de las bandas VH y VL. Los fragmentos de ADN se extraen y purifican del gel utilizando el kil de extracción QIAquick ™Gel de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 3.2 Ligación Los fragmentos RT-PCR purificados (2xVH y 2xVL) se clonan en el vector pCR2.1 utilizando un kit de clonación TA de Invitrogen de acuerdo a las inslrucciones del fabricante. 3.3 Transformación Los plásmidos ligados se transforman en células TOP 10F' de acuerdo a insírucciones del kií de clonación TA. 50µl y 200µl de células transformadas se difunden en placas L-ágar conteniendo 100µg/ml ampicilina y revisten con 8µl de 50OmM solución IPTG y 16µl de 50mg/ml solución X-Gal en DMF. Las placas se incuban durante la noche a 37°C. 3.4 Secuenciación 5 colonias blancas se cultivan durante la noche a 37°C en 5ml medio LB complementado con 100µg/ml ampicilina. Los plásmidos pCR2.1 coníeniendo dominios VH y V 15E10 se exíraen y purifican utilizando el kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los dominios VH y V se secuencian utilizando cebadores T7, M 13 para y M 13 rev. Secuencia de aminoácidos de dominio VH 15E10 (consenso de 10 clones de 2 reacciones RT-PCR): SEQ.I .D. NO:7 Secuencia de aminoácidos de dominio V 15E10 (consenso de clones de 2 reacciones RT-PCR): SEQ. I.D.NO:8 4. Anticuerpo Quimérico Un anticuerpo quimérico consistiendo de regiones V de murino de origen de 3.4 injertado sobre regiones C tipo silvestre IgG1 /k de humano se diseña para conformar la clonación de las regiones V de murino correctas y también para utilizarse como una referencia cuando se prueban construcciones humanizadas. El anticuerpo quimérico se expresa en células CHO, purifica y prueba para afinidad en el sitio I I OSM en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB (ver abajo). Las regiones V de murino clonadas se amplifican por PCR para introducir sitios de resfricción requeridos para clonación en vecíores de expresión de mamífero RId y RIn. Siíios Hind I I I y Spe I se dieñan para esírucíurar el dominio VH y permifir la clonación en un vector RId modificado conteniendo la región C tipo silvesfre ?1 . Los siíios Hind I I I y BsiW I se diseñan para esíruclurar el dominio V y permitir la clonación en un vector Rln modificado conteniendo la región C K de humano. 4.1 Amplificación PCR cebador delantero VH: 5'-GAT GAA GCT TGC CAC CAT GGC TGT CCT AGG GCT ACT C-3' (SEQ. I .D.NO:22) El sitio de restricción Hind II I se subraya y secuencia Kozak en negritas. cebador inverso VH: 5'-GAT GGA CTA GTG TCC CTG TGC CCC AGA C-3' (SEQ. I .D. NO:23) El sitio de restricción Spe I se subraya. cebador delaníero VL: 5'-GAT GAA GCT TGC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT T-3' (SEQ.I.D.NO:24) El sitio de restricción Hind I I I se subraya y secuencia Kozak en negriías. cebador inverso VL: 5'-GAT GCG TAC GTT TGA TTT CCA ACT TTG TCC C-3' (SEQ . I . D . NO:25) El sitio de restricción BsiW I se subraya Reacción PCR: agua 66µl 10x regulador 10µl dNTP (2mM) 1 0µl cebador 1 (5µ M) 4µl cebador 2 (5µM) 4µl AmpliTaq polymerasa 2µl plásmido purificado 4µl vol toíal 1 00µl Cebador 1 : cebador delantero VH o VL Cebador 2: cebador inverso VH o VL Plásmido purificado: plásmido VH o V pCR2.1 purificado por Qiagen Minipreps (diluido 20Ox) Ciclo PCR: 1 -95°C por 4min 2- 95°C por 1 min 3- 55°C por 1 min 4- 72°C por 1 min 5- 72°C por 7min etapas 2 a 4: se repiten 30 veces 4.2 Clonación en Vectores de Expresión de Mamífero Los productos PCR se purifican utilizando el kií de Purificación MinEIute PCR de Qiagen de acuerdo a las insfrucciones del fabricante. 4.2.1 Digestiones de Restricción Producto PCR VH y vector de expresión de mamífero hC?lwt se diguieren Hind lll-Spe I : regulador 10x (NERegulador2) 5µl BSA lOOx (NEB) 0.5µl ADN 5µl Hind I I I (Promega) 2µl Spe I (NEB) 2µl agua 35.5µl vol íolal 50µl ADN : producío PCR VH purificado o vector RId hC?l wt (a 0.25mg/ml) Incubado a 2h a 37°C. El producto PCR VL y vector de expresión de mamífero Rl n hO? se digieren Hind MI-BsiW I : regulador 10x (NERegulador2) 5µl ADN 5µl Hind III (Promega) 2µl agua 38µl vol total 50µl ADN: producto PCR VL purificado de vector RIn hCi (a 0.25mg/ml) Incubado a 2h a 37°C. 2µl de BsiW I (NEB) se agrega e incuba 2h a 55°C. 4.2.2 Purificación de Gel Los productos de digestiones de resíricción se cargan en solución de carga de gel en un gel de agarosa al 1 % preparafivo conteniendo 0.01 % bromuro de etidio y corre en regulador TAE a 100V por 1 hora y el vecíor RId y Rln así como íambién bandas de fragmento PCR VH y V se cortan. Una escala ADN 100bp íambién corre en el gel para permifir la ideníificación de las bandas de vecíor, VH y VL. El ADN se exírae y purifica de gel utilizando kit de extracción QIAquick Gel de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 4.2.3 Ligación El fragmento PCR VH Hind lll-Spe I digerido se liga en el vector RId hC?l wt Hind lll-Spe I digerido. El fragmento PCR VL Hind I I I-BsiW I digerido se liga en el vector Rln hCi Hind l l l-BsiW I digerido. La ligación se lleva a cabo utilizando Sistema de Ligación de ADN Rápido LigaFast de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricante proporcionado: VH: vector: RId hC?l wt Hind lll-Spe I digerido inserción: fragmento PCR VH Hind lll-Spe I digerido VL: vector: Rln hCK Hind l l l-BsiW I digerido inserción: fragmento PCR V Hind l l l-BsiW I digerido 4.2.4 Transformación Los productos ligados se transforman en células competeníes DH5a: Frascos de 200µl D H5a se congelan en hielo. Alícuoías de 50µl se preparan en íubos de íransformación . 2µl de mezcla de ligación se agrega y mezcla genfilmenfe con una punía de pipeía seg uida por incubación por 30min en hielo. La mezcla se incuba por 45 seg a 42°C sin agiíación . Esío se transfiere a hielo por 2min. 450µl medio SOC se ag rega y los tubos se incuban por 1 h a 37°C en incubador agitador. 1 00µl de cultivo se difunde sobre placas L-ágar complementadas con 100µg/ml ampicilina e incuban durante la noche a 37°C. 4.2.5 Secuenciación Clones VH y V se cultivan durante la noche a 37°C en 5ml medio LB complementando con 1 00µg/ml ampicilina. Los plásmidos RId y RIn coníeniendo dominios VH y V respecíivameníe se exfraen y pu rifican utilizando el kit Q IAprep Spin Miniprep de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricaníe. La región VH se secuencia utilizando cebadores delanteros en el vector RId y secuencia de señal y cebador inverso en la región C?1 de humano. La región V se secuencia utilizando cebadores delaníeros en el vector RIn y secuencia de señal y cebador inverso en la región CK de humano.

Los clones con las secuencias VH y VL se identifican y los plásmidos se preparan para expresión en células CHO. 4.3 Expresión de Anticuerpo Quimérico en Células CHO Los plásmidos RId y RIn coníeniendo dominios VH y VL 15E10 respecfivamenfe se co-transfectan transitoriamenfe en células CHO y se expresan. El aníicuerpo quimérico producido se purifica de sobrenadaníe de cultivo celular por cromatografía de afinidad o Sepharose de rProteína A y su afinidad para OSM se evalúa en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB (ver abajo). 4.3.1 Purificación de Plásmído Células DH5a confeniendo plásmidos Rld-15E10VH y Rln-15E 10VL se culíivan en 5ml de medio LB complementado con 100µg/ml ampicilina por 8h a 37°C en un incubador agitador. 200ml de medio LB complemeníando con 100µg/ml ampicilina se inocula con 1 mi de cultivo de día e incuba durante la noche a 37°C en un incubador agiíador. Los plásmidos se exíraen y purifican utilizando el kit QIAfilter Plasmid Maxi de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La pastilla de etanol se resuspende en 200µl regulador TE y concentración de plásmido se mide por absorbencia a 260nm después de dilución 100 veces de solución de reserva. 4.3.2 Transfección Las células CHO se cultivan para confluencia en M EM de Dulbecco con medio Glutamax-1 (DMEM) complemeníando con Suero de Bovino Feíal Ulíra Bajo y 1 % Penicillin-Sfreptomicin en 4x1 75cm2 matraces de cultivo de tejido BD Falcon a 37°C. Para cada matraz, en un tubo Falcon de 50 mi , se agregan y mezclan los siguientes: 8ml Opíimem 1 con Glutamax-1 20µg Rld-1 51 0VH plásmido purificado 20µg Rln-151 0VL plásmido purificado 20µg Reactivo de Transfección TransFast bajo vórtice La mezcla se incuba por 1 0-1 5 min a íemperaíura ambiente (RT). Medio DM EM se remueve de matraz después la mezcla se coloca en vórtice y se agrega a matraz. La mezcla se incuba a 37°C por 1 h. 32ml Optimem se agrega al matraz e incuban a 37°C por 48-72h . 4.3.3 Purificación de anticuerpo quimérico Medio de todos los matraces de 1 72cm2 se agrupan y centrifugan a 1 500rpm por 3min en un MSE Mistral 2000 y sobrenadante pasa a través de un Sistema de Filtro de 500mL 0.22µm CA. El anticuerpo se purifica de sobrenadante clarificado en un Amersham Biosciences Akta Explorer utilizando software Unicorn sofíware. La columna uíilizada fue una 1 ml HiTrap rProíeina A Sepharose FF. La velocidad de flujo fue 1 ml/min. La columna se equilibra con 10CV de PBS de Dulbecco después se carga con sobrenadaníe clarificado a íravés de bomba A.

La columna se enjuaga con 20CV de PBS de Dulbecco, bomba A se enjuaga para desperdicio y un 10CV adicional de PBS de Dulbecco se pasa a través de la columna para asegurar despeje completo de sobrenadante. El aníicuerpo se eluye con 10CV de Regulador de Elución IgG ImmunoPure (Pierce) y recolecía en fracciones de 1 ml coníeniendo 100µl de 1 M Trizma-HCI pHd.O regulador de neufralización. La columna se reequilibra con 5CV de PBS de Dulbecco. El anticuerpo en fracciones de eluido se cuantifica al leer la absorbancia a 280nm contra una solución vacía conteniendo 10 volúmenes de Regulador de Elución IgG ImmunoPure + 1 volumen de 1 M Trizma-HCI pHd.O y fracciones con cantidades suficientes de anticuerpo puro se agrupan y almacenan en alícuotas de 100µl a -20°C. 4.4 Análisis de Anticuerpo Quimérico Los anticuerpos quiméricos 15E10 y 10D3 (ver abajo) purificados se analizan en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB para su potencia en neturalizar fanfo OSM humano como cinomolgo (hOSM y cOSM). Los procedimieníos para ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB se eslablecen abajo. Tabla 1 Valores IC50 (uG/ML) para Anticuerpos Quiméricos v de Murino 15E10 v 10D3 Ambos aníicuerpos quiméricos 15E10 y 10D3 neutralizan hOSM y cOSM en ELISA de inhibición gp130 (FIG.2) y ensayo de célula KB (FIG. 3). 15E10 quimérico tiene una afinidad más ata para OSM cinomólgo que 10D3 quimérico como se observa con el aníicuerpo de murino de origen. Ambos aníicuerpos quiméricos tienen perfiles de curva y valores IC50 similares a los anticuerpos de murino de origen (Tabla 1). La secuencia de aminoácidos y una secuencia cADN para OSM cinomólgo (cOSM) se establece como SEQ.I.D.NO:63 y 64 respectivamente; SEQ.I.D.N: 63: MGVPLTRRTLLSLILALLFPSMASMAAMGSCSKEYRMLLGQLQKQT DLMQDTSRLLDPYIRIQGLDIPKLREHCRESPGAFPSEETLRGLGR RGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQHLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQM ARPNVLGLRNNVYCMAQLLDNSDMTEPTKAGRGTPQPPTPTPTSD VPQRKLEGCSFLRGYHRFMHSVGRIFSKWGESPNRSRRHSPHQAL RKGVRRTRPSRKGNRLMPRGQLPR SEQ . l . D. NO: 64: ATGGGGGTACCGCTCACACGGAGGACGCTGCTCAGTCTGATCCTTG CACTCCTGTTTCCAAGCATGGCAAGCS 1 TGGCGGCTATGGGCAGCT GCTCGAAAGAGTACCGCATGCTCCTTGGCCAGCTCCAGAAGCAGAC AGATCTCATGCAGGACACCAGCAGGCTCCTGGACCCCTATATACGT ATCCAAGGCCTGGATATTCCTAAACTGAGAGAGCACTGCAGAGAGA GCCCTGGGGCCTTCCCCAGCGAGGAGACCCTGAGGGGGCTGGGC AGGCGGGGCTTCCTACAGACGCTCAATGCCACACTGGGCTGCGTC CTGCACAGACTGGCCGACTTAGAGCAGCATCTCCCCAAGGCCCAG GACTTGGAGAGGTCTGGGCTGAACATAGAGGACTTAGAGAAGCTGC AGATGGCGAGGCCGAATGTCCTCGGGCTCAGGAACAACGTCTACT GCATGGCCCAGCTGCTGGACAACTCAGACATGACTGAGCCCACGAA GGCCGGCCGGGGGACCCCTCAGCCGCCCACCCCCACCCCTACCTC AGATGTTTTTCAGCGCAAGCTGGAGGGCTGCAGTTTCCTGCGTGGC TACCATCGCTTCATGCACTCAGTGGGGCGGATCTTCAGCAAGTGGG GGGAGAGCCCGAACCGGAGCCGGAGACACAGCCCCCACCAGGCC CTGCGGAAGGGGGTGCGCAGGACGAGACCCTCCAGGAAAGGCAAT AGACTCATGCCCAGGGGACAGCTGCCCCGGTAG Esíos resullados confirman q ue las regiones variables 15E10 correctas se han clonado exitosameníe para producir un anticuerpo quimérico de unión de anfígeno capaz de unir fanío OSM de humano y cinomólgo sifio I I . Los dominios pesados y ligeros variables 15E 10 pueden ahora humanizarse. .1 .1 Investigación de la Base de Datos de Ratón 1 5 secuencias de raíón con la homología más alia para la secuencia de aminoácidos VH 1 5E1 0 y 1 0 secuencias de raíón con la homolog ía más alia para la secuencia de aminoácidos VL se ideníifican al buscar una base de dafos de péptido. La secuencia de aminoácidos VH 1 5E 1 0 se compara con todas las 15 secuencias de ratón de la búsqueda de base de datos y los siguientes residuos de esíructura se identifican como significativos: Posición 15E10 VH ratón ocurrencia 75 R K 15/15 105 T Q 14/15 La posición es de acuerdo al sistema de numeración de Kabaí eí al, supra. La secuencia de aminoácidos VL 15E10 se compara con las 10 secuencias de ratón de la búsqueda de base de datos y los siguientes residuos de estrucíura se identifican como significativos: Posición 15E10 VL ratón ocurrencia 9 T A 8/10 38 E Q 10/10 49 E Y 10/10 60 A V 10/10 .1.2 Búsqueda de la Base de Datos de Humano Las secuencias de esfructura de humano con la homología más alia a esiructuras VH y VL 15E10 se identifican utilizando EasyBlast en una base de daíos de péptido. Dos conjuntos de secuencias de humano se identifican para VH 15E10: Grupo A del cual la siguiente estructura se selecciona para humanización: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWI GYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SPSSGSYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSs (SEQ.I.D.NO:26) Las CDRs se subrayan. Y Grupo B para el cual la siguiente se selecciona para humanización: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEW VAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARDLGGPLYWYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ.I.D.NO:27) Las CDRs se subrayan Los siguientes residuos de estructura se identifican como potencialmente importantes para recuperar afinidad y pueden necesitarse para mutarse de nuevo: Posición (Kabat#) 15E10 VH Grupo A Grupo B 27 F G F 28 S S T 29 L I F 30 T S S 48 L I V 49 G G A 67 L V F 71 K V R 73 N T N 78 V F L 94 K R R 8 construcciones VH humanizadas con diferentes mutaciones de nuevo se diseñan, 4 en base a las estructuras de humano del grupo A (A1, A2, A3 y A4) y 4 en base a las estructuras de humano del grupo B (B1 , B2, B3 y B4). Un conjunto de secuencias de humano se identifican para VL 15E10 del cual lo siguienfe se selecciona para humanización: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSKYLAWYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQQRSNWPPT FGQGTKLEI (SEQ.I.D.NO:28) Las CDRs se subrayan. Los siguientes residuos se identifican como potencialmeníe imporíaníes para recuperar afinidad y pueden necesitar mutarse de nuevo: Posición (Kabat#) 15E10 VL Humano VL 49 E Y 71 Y F Dos consírucciones se diseñan, uno como un injerto recto (L1), el oíro con mutaciones de nuevo en ambos residuos (L2) Construcción VH Humanizada A1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQPPGKGLEWI GVIWRGGSTDYNAAFMSRVTISVDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA KSPNSNFYWYFD VWGQGTTS (SEQ.I.D.NO:29) Construcción VH Humanizada A2: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQPPGKGLEWI GVIWRGGSTDYNAAFMSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA KSPNSNFYWYFDVWGQGTTS (SEQ.I.D.NO.30) Construcción VH Humanizada A3: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQPPGKGLEWI GVIWRGGSTDYNAAFMSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA KSPNSNFYWYFDVWGQGTTS (SEQ.I.D.NO:31) Construcción VH Humanizada A4: QVQLiQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQPPGKGLEWI GVIWRGGSTDYNAAFMSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA KSPNSNFYWYFD VWGQGTTS (SEQ.I.D.NO:32) Construcción VH Humanizada B1: QVQL1VESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLE WVAVIWRGGSTDYNAAFMSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (SEQ.I.D.NO:33) Construcción VH Humanizada B2: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEW VAVIWRGGSTDYNAAFMSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (SEQ.I.D.NO:34) Construcción VH Humanizada B3: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEW VAVIWRGGSTDYNAAFMSRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (SEQ.I.D.NO:35) Construcción VH_ Humanizada B4: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEW VAVIWRGGSTDYNAAFMSRLTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (SEQ.I.D.NO:36) Construcción Vi Humanizada L1: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIY DTSNLASG IPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTF GQGTKLEIK (SEQ. I . D. NO:37) Construcción Vi Humanizada L2: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIE DTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTF GQGTKLEI K (SEQ. I .D. NO:38) .2 Humanización de 15E10 Construcciones VH y VL humanizadas se preparan de novo por formación de oligonucleótidos de recuperación incluyendo sitios de restricción para clonación en vectores de expresión de mamífero RId y Rln así como también una secuencia de señal de humano. Los sitios de resíricción Hind III y Spe I se introducen para estructura el dominio VH conteniendo la secuencia de señal de humano para clonar en RId conteniendo la región consíaníe íipo silvestre ?1 de humano. Sitios de restricción Hind III y BsiW I se introducen para estructurar el dominio V conteniendo la secuencia de señal de humano para clonar en Rln conteniendo la región constaníe kappa de humano. Secuencia de señal de humano: MGWSCII LFLVATATGVHS (SEQ. I .D.NO:39). Ocho consírucciones VH humanizadas y dos consírucciones VL humanizadas se diseñan. Esío resulíaría en 16 combinaciones de cadena diferentes. Ya que la formación oligo de regiones variables consume tiempo, se decide inicialmente para preparar solamente las construcciones por úlíimo y más muíadas de nuevo para el dominio VH (A1 , A4, B1 y B4) y producen aníicuerpos humanizados en combinación con las dos consírucciones V humanizadas. 1 0 oligonucleóíidos de 60 bases de largo con un mínimo de 18 bases de recubrimiento se diseñan para formación . .2.1 Formación de Oligonucleótido Las soluciones de g rupos de oligonucleótidos se preparan de 5µl de cada solución de reserva oligo a 1 00µM . La síntesis e los genes VH y VL humanizados por formación de oligonucleótidos de recubrimiento se lleva a cabo generalmenfe de acuerdo a Sfemmer WP eí al (1995) Gene 164(1 ) :49-53 uíilizando sofíware descriío en Ertl PF eí al (2003) Methods 31 : 199-206. .2.1 .1 Reacción PCR de Ensamble agua 41 .5µl 1 0xregulador PC R ProofStart 5µl dNTP (1 0mM) 1 .5µl grupo oligo 1 µl Polimerasa ADN ProofStarí 1 µl vol toíal 50µl Ciclo PCR de ensamble: 1 -94°C por 2min 2-94°C por 30seg 3-40°C por 2min 4-72°C por 10seg 5-94°C por 15seg 6-40°C por 30seg 7-72°C por 20seg + 3seg/ciclo etapas 4 a 7 se repiten 25 veces .2.1.2 PCR de Recuperación Cebadores 1 y 2 fueron los primeros oligonucleótidos, superior e inferior, utilizados en PCR de ensamble. PCR de recuperación permite la amplificación del gen V completo. Reacción PCR de recuperación: agua 42µl 10xregulador PCR ProofStart 4µl dNTP (10mM) 1.5µl cebador 1 (100µM) 0.5µl cebador 2 (100µM) 0.5µl reacción PCR de ensamble 1 µl Polimerasa ADN ProofStarí 0.5µl vol íoíal 50µl cebador 1 cebador 2 15E10-A1/A4 15E10-A4-U1 15E10-A4-L1 15E10-B1 15E10-B1-U1 15E10-B1-L1 15E10-B4 15E10-B1-U1 15E10-B4-L1 15E10-L1/L2 15E10-L1-U1 15E10-L1-L1 Recuperación ciclo PCR: 1-94°C por 2min 2-94°C por 45seg 3-60°C por 30seg 4-72°C por 2min 5-72°C por 4min etapas 2 a 4 se repiíen 25 veces. Los productos PCR de recuperación se purifican utilizando el kií de Purificación MinElute PCR de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. .2.2 Digestiones de Restricción Construcciones VH 15E 10 humanizadas A1 , A4, B1 y se digieren Hind l l l-Spe I y dos V 1 5E1 0 VL humanizados se digieren Hind-lll-BsiW I como se describe en 4.2.1 . .2.3 Purificación de Gel Los productos de d igesfión de reslricción se pu rifican como en 4.2.2. .2.4 Ligación Los fragmentos VH humanizados 1 5E 1 0 Hind l ll-Spe I digeridos se ligan en el vector RId hC?l wt Hind lll-Spe I digerido. Los fragmentos VL humanizados 15E10 Hind l ll-BsiW I digeridos se ligan en el vector Rln hCi Hind l l l-BsiW I digerido. La ligación se lleva a cabo utilizando el Sisíema de Ligación de ADN Rápido LigaFasí de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricaníe. .2.5 Transformación Como en 4.2.5 .2.6 Secuenciación Colonias de cada placa de reacción se culfivan durante la noche a 37°C en 5ml medio LB complementando con 100µg/ml ampicilina. Los plásmidos se extraen y purifican utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se secuencias utilizando cebadores descritos en 4.2.5. Los clones con las secuencias VH y VL humanizadas corregidas se identifican y los plásmidos se preparan para expresión en células CHO. 6. Expresión de Anticuerpos Humanizados en Células CHO Cuatro construcciones VH humanizadas (A1 , A4, B1 y B4) y dos construcciones VL humanizadas (L1 y L2) se preparan en vectores de expresión de mamífero RId hC?l wt y Rln hC?_ Ocho combinaciones de cadena ligera-cadena pesada de plásmido (A1 L1 , A1 L2, A4L2, B1 L2, B4L1 y B4I2) se co-transfecían fransiíoriamenfe en células CHO y expresan a escala pequeña para dar 8 diferenles aníicuerpos humanizados. Los aníícuerpos producidos en sobrenadaníe se analizan en ELISA de inhibición gp130 (ver abajo). 6.1 Purificación de Plásm ido Células DH5a confeniendo uno de los plásmidos de sección 6 se cultivan en 5ml de medio LB complementando con 1 00µg/ml ampicilina por 8h a 37°C en un incubador agitador. 200ml de medio LB complemenlando con 1 00µg/ml ampicilina se inocula con 1 mi de cultivo de día e incuba duraníe la noche a 37°C en un incubador agiíador. Los plásmidos se exíraen y purifican utilizando el kit QIAfilter Plasmid Maxi de Qiagen de acuerdo a las insírucciones del fabricaníe. La pastilla de eíanol se resuspende en 200µl regulador TE y conceníración de plásmido se mide por absorbencia a 260nm después de dilución de 1 00 veces de solución de reserva. 6.2 Transfección 9 cavidades de placas de 6 cavidades Corning Coslar 3506 se siembran con 1 06 células CHO y se cultivan durante la noche en M EM de Dulbecco con medio Glutamax-1 (DM EM) complemeníando con Suero de Bovino Feíal Ulíra Bajo y 1 % Penicilina-Síreplomicina a 37°C . Para cada cavidad , los siguientes se ag regan en un 5ml Bijou 1 ml Optimem 1 con GIuíamax-1 5µg plásmido llevando VH humanizado 5µg plásmido llevando V humanizado 30µg Reactivo de Transfección TransFasf bajo vórtice de manera que cada íransfección coníuvo una combinación diferente de cadenas ligeras y pesadas. La incubación tuvo lugar por 10-15min a temperaíura ambienfe. Medio DMEM se remueve de las cavidades después la mezcla de vóríice y se agrega a la cavidad apropiada. Incubación íuvo lugar a 37°C por 1 h. 2ml Opíimem se agrega por cavidad e incuba a 37°C por 48-72h. 6.3 Análisis de Anticuerpos Humanizados Medio de cada cavidad se recupera y cenfrifuga a 13000rpm por 1 min en centrífugo Eppendorf 5415R y sobrenadante se pasa a través de un filtro de jeringa de 0.2µm Pall Acrodisc 25mm. 8 anticuerpos humanizados (4 en base a las esírucíuras de humano del Grupo A, 4 en base a las esírucfuras de humano del Grupo B) y los aníicuerpos quiméricos 15E10 se analizan en ELISA de inhibición gp130 para su poíencia para neuíralizar íanío hOSM como cOSM (ver FIG.4). Tabla 2 Valores IC50 para anticuerpos humanizados B1L1, B1L2. B4L1 v B4L2 en ELISA de inhibición gp130 Valores IC50 se expresan en µg/ml NA: Inhibición es menor a 50% El nivel de mufaciones de nuevo se expresa en aníicuerpos humanizados íuvo un efecío direcío en afinidad para OSM de humano y cinomólgo en ELISA de inhibición gp130. El último anticuerpo muíado de nuevo (B1 L1 ) no íuvo afinidad detecíable para OMS de cinomólgo y solo los aníecedentes de arriba para OSM de humano. Por el otro lado, el anticuerpos más muíado de nuevo (B4L2) íuvo una afinidad para OSM de humano y cinomólgo al menos equivaleníe a aquel del aníicuerpo 15E10 quimérico. Los 2 aníicuerpos humanizados coníeniendo la cadena ligera muíadas de nuevo fuvieron afinidad más alfa que los 2 aníicuerpos humanizados coníeniendo la cadena ligera de injerío recia. Ninguno de los cuaíro anticuerpos humanizados basados en las estructuras del grupo A de humano tuvieron una señal inhibidora en ensayo ELISA gp130. De hecho ninguno de estos anticuerpos podría detecíarse en un ELISA para anticuerpo IgG1 humano completo (donde el anticuerpo de capíura es un policlonal originado coníra cadena pesada ? de humano en cabras y el aníicuerpo de defección es un policlonal originado coníra cadena ligera K de humano). Análisis adicional de sobrenadaníe coníeniendo esíos cuaíro aníicuerpos en ELISAs especifica de cadena pesada de IgG de humano y específica de cadena ligera dio una señal posiíiva en ambos ensayos. Ambas ELISAs uíilizaron un aníicuerpo de capíura originado coníra cadenas pesada y ligera de IgG de humano en cabras mientras el anticuerpo de detección se origina coníra cadena ? de IgG de humano para ELISA específica de cadena pesada y contra cadena K IgG de humano en ELISA específica de cadena ligera. Esíos resulíados sugieren que los anticuerpos humanizados donde la cadena pesada se diseña de las estrucíuras de humano de grupo A expresan íanto cadena pesada como ligera pero las dos cadenas no se combinan para producir un anticuerpo viable. La construcción VH más muíada de nuevo en base a las esfrucíuras de Grupo B de humano (B4) en combinación con la cadena ligera muíada de nuevo (L2) probó que es el aníicuerpo humanizado más poíenle. Tres anticuerpos humanizados comprendiendo VH de Grupo B (B2L2, B3L2 y B4L2) se producen, purifican y analizan para determinar el anticuerpo humanizado más adecuado para selección de candidatos. 6.4 Preparación de construcciones VH humanizadas de 6.3 Dos construcciones humanizadas B2 y B3 se preparan como en .2.1 a 5.2.6 6.5 Expresión de anticuerpos humanizados en células CHO Tres plásmidos coníeniendo VH humanizada (B2, B3 y B4) en combinación con el plásmido coníeniendo VL humanizada más muíada de nuevo (L2) de sección 6 se co-transfectan transiíoriamieníe en células CHO y se expresan. Los 3 aníicuerpos humanizados producidos se purifican de sobrenadanfe de cultivo celular por cromatografía de afinidad en rProteina A Sepharose y su afinidad para OSM se evalúa en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB utilizando anticuerpo quimérico 15E10 como referencia. Purificación de Plásmido se lleva a cabo como en 4.3.1 . Transfección se lleva a cabo como en 4.3.2. Purificación de anticuerpos humanizados se lleva a cabo como en 4.3.3. 6.6 Análisis de Anticuerpos Humanizados de sección 6.5 Anticuerpos humanizados purificados de la sección 6.5 se analizan en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB (ver abajo) para su potencia para neutralizar íanío OSM de humano como cinomólgo. Ensayos se conducen con OSM de humano de una variedad de fueníes incluyendo CHO producidas, CHO producidas + 25% suero AB de humano, neuírófilos y fluido sinovial de pacieníes RA. ELISA de inhibición gp130: datos de experimentos se ilusíran en Fig 5 a 10. ensayo de célula KB: dafos de experimeníos se ilusíran en Fig 1 1 a 16. Esíos resullados muesíran que los anticuerpos humanizados (B3L2 y B4L2) tienen poíencia equivaleníe a aníicuerpo quimérico 15E10 pero más alfa que el anticuerpo humanizado B2L2. Esto indica que la estraíegua de humanización, especialmenfe la elección de muíaciones de nuevo resulfo en recuperación completa de afinidad para antígeno. The secuencia de aminoácidos de la cadena VH de B4 es QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEW VAVIWRGGSTDYNAAFMSRLTISKDNSKMTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSPNSNFYWYFD VWGRGTLVTVSS (SEQ.l .D. NO: 21 ) y la cadena VL es SEQ.l .D.NO: 12. Un anticuerpo terapéuíico o fragmento de unión de antígeno del mismo comprendiendo una cadena VH de SEQ. l . D. NO: 21 y una cadena VL de SEQ. l.D.NO: 12 puede considerarse como un anticuerpo compeíeníe de la invención y por lo tanto forma una modalidad de la invención . 6.7 Comparación de Anticuerpo Humanizado B3L2 con Anticuerpos de Murino de Origen v Quiméricos El anticuerpo humanizado B3L2 se compara con los anticuerpos quiméricos 15E10 y de murino de origen en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB (ver abajo) utilizando OSM de humano y cinomólgo como aníígeno objefivo. Un aníicuerpo B3L2 humanizado llevando 2 muíaciones de punfo en la cadena pesada consíanfe (Ala reemplaza Leu en posición 235 y Gly en posición 237) se diseña, expresa en células CHO y purifica. Las mufaciones reducen la habilidad del aníicuerpo para generar funciones efecluoras especialmeníe recluíamienío de facíores complemenío. El candidafo de anticuerpo humanizado B3L2 con cadena pesada intacía se refiere como B3L2 wí (tipo silvesíre) mienfras el aníicuerpo B3L2 se llama B3L2 muí en las FIGSs. 17 a 19. Tabla 4 Valores IC50 para B3L2 humanizado tipo silvestre en comparación con anticuerpos quiméricos v de murino de origen en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB Valores IC50 eslán en µg/ml Esíos resultados confirman que el anticuerpo B3L2 íiene poíencia equivalente al anticuerpo de murino de origen 15E10. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada B3L2 humanizada se establece en SEQ.I.D.NO:11 y la cadena ligera B3L2 humanizada se esíablece en SEQ.I.D.NO:12.

Eiemplo 7 - Anticuerpo 10D3 7.1. Generación de Anticuerpos Monoclonales Hibridoma 10D3 se genera como se deíalla en el Ejemplo 1 de arriba. 7.2 Clonación de Regiones Variables de Clon 10D3 ARN lotal se exírae de células de hibridoma de clon 10D3 y el cADN de dominios variables pesados y ligeros se producen por íranscripción inversa uíilizando cebadores específicos para la secuencia guía de murino y las regiones constantes de anticuerpo de acuerdo al isotipo pre-determinado (lgG1/?). El cADN de los dominios pesados y ligeros variables se clona entonces en el pCR2.1 para secuenciación. 7.2.1 Extracción de ARN ARN íolal se exírae de pastillas de 106 células de clon de hibridoma 10D3 utilizando el Sistema de Aislamiento de ARN Toíal SV de Promega de acuerdo a las insfrucciones del fabricante. 7.2.2 Transcripción Inversa ARN se transcribe inversa para producir cADN de los dominios pesados y ligeros variables uíilizando cebadores específicos para las secuencias guía de murino y regiones constantes lgG?2a/? de murino. La mezcla de cebadores utilizada se establece en Jones ST ad Bendig MM Bio/íechnology 9:88-89 (1991 ) Los grupos de cebadores delaníeros de secuencia guía VH y V de murino se preparan a 50µM. Soluciones de los cebadores inversos de región consíanle ?2a y K de murino íambién se preparan a 50µM. 7.2.3 Transcripción Inversa PCR (RT-PCR) Transcripción inversa de ARN codificando las regiones pesadas y ligeras variables se lleva a cabo por duplicado utilizando el Sistema Access RT-PCR de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricaníe. Cebadores delaníeros e inversos VH y VL son como se describen arriba. 7 Clonación de Producto PCR de 7.2.3 7.3.1 . Purificación de Gel Los productos de RT-PCR (2xVH y 2xVL) se cargan en sol ución de carga en un gel de agarosa al 1 % preparativo conteniendo 0.01 % bromu ro de etidio y corre en regulador TAE a 1 00V por 1 hora y Jas bandas de región V se corían . Una escala de ADN 100bp también corre en el gel para permitir la idenfificación de las bandas VH y VL.

Los fragmeníos de ADN se exíraen y purifican del gel uíilizando el kií de extracción de gel QIAquick™ de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 7.3.2 Ligación Fragmentos RT-PCR purificados (2xVH y 2xVL) se clonan en el vector pCR2.1 ufilizando el kií de clonación TA de I nviírogen de acuerdo a las insírucciones del fabricanle. 7.3.3 Transformación Los plásmidos ligados se íransforman en células TOP10F' células de acuerdo a las insírucciones del kif de clonación TA. 50µl y 200µl de células fransformadas se difunden en placas L-ágar conteniendo 1 00µg/ml ampicilina y revisten con 8µl de 500mM solución I PTG y 1 6µl de 50mg/ml solución X-Gal en DM F. Las placas se incuban durante la noche a 37°C . 7.3.4 Secuenciación 5 colonias blancas se cultivan durante la noche a 37°C en 5ml medio LB complemeníado con 100µg/ml ampicilina. Los plásmidos pCR2.1 coníeniendo dominios VH y V 10D3 se exíraen y purifican utilizando el kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los dominios VH y VL se secuencian utilizando cebadores T7, M13 para y M 13 rev. Secuencia de aminoácidos de dominio VH 10D3 (consenso de 10 clones de 2 reacciones RT-PCR): SEQ. I .D.NO:46 Secuencia de aminoácidos de dominio VL 10D3 (consenso de 10 clones de 2 reacciones RT-PCR): SEQ. I .D.NO:47 7.4. Anticuerpo Quimérico Un anticuerpo quimérico consistiendo de regiones V de murino de origen de- 7.3.4 injertado sobre regiones C tipo silvestre lgG1 /k de humano se diseña para conformar la clonación de las regiones V de murino correcías y íambién para uíilizarse como una referencia cuando se prueban construcciones humanizadas. El anticuerpo quimérico se expresa en células CHO, purifica y prueba para afinidad en el sitio I I OSM en ELISA de inhibición gp130 y ensayo de célula KB (ver abajo). Las regiones V de murino clonadas se amplifican por PCR para introducir siíios de resíricción requeridos para clonación en vecfores de expresión de mamífero RId y Rln. Siíios Hind III y Spe I se diseñan para estructurar el dominio VH y permitir la clonación en un vector RId modificado conteniendo la región C tipo silvestre ?1. Los siíios Hind III y BsiW I se diseñan para esírucíurar el dominio V y permiíir la clonación en un vecíor Rln modificado confeniendo la región C K de humano. 7.4.1 Amplificación PCR cebador delaníero VH: El siíio de resíricción Hind III se subraya y secuencia Kozac en negriías delaníero VH: 5'-GAT GAA GCT TGC CAC CAT GGG ATG GAG CTG GGT CTT T-31 (SEQ.I.D.NO:58) inverso VH: 5'-GAT GGA CTA GTG TGC CTT GGC CCC AAT A-31 (SEQ.I.D.NO:65) El siíio de reslricción Spe I se subraya, cebador delanlero VL: delantero VL: 5'-GAT GAA GCT TGC CAC CAT GGA TTT ACÁ GGT GCA GAT T-3' (SEQ.I.D.NO:59) El sitio de resíricción Hind III se subraya y secuencia Kozak en negriías. Inverso VL: 5'-GAT GCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TCC C-3' (SEQ.I.D.NO:60) El siíio de restricción BsiW I se subraya Reacción PCR: agua 66µl 10x regulador 10µl dNTP (2mM) 10µl cebador 1 (5µM) 4µl cebador 2 (5µM) 4µl AmpliTaq polymerasa 2µl plásmido pu rificado 4µl vol íotal 100µl Cebador 1 : cebador delantero VH o V Cebador 2: cebador inverso VH o VL Plásmido pu rificado: plásmido VH o VL pCR2.1 pu rificado por Qiagen Minipreps (diluido 20Ox) Ciclo PCR: 1 -95°C por 4min 2- 95°C por 1 min 3- 55°C por 1 min 5- 72°C por 7min etapas 2 a 4: se repiten 30 veces 7.4.2 Clonación en Vectores de Expresión de Mamífero Los productos PCR se purifican utilizando el kit de Purificación MinElute PCR de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 7.4.2.1 Digestiones de Restricción Producto PC R VH y vector de expresión de mamífero hC?l wt se diguieren Hind lll-Spe I : reg ulador 1 0x (N ERegulador2) 5µl BSA lOOx (N EB) 0.5µl ADN 5µl Hind I I I (Promega) 2µl Spe I (NEB) 2µl agua 35.5µl vol total 50µl ADN: producto PCR VH purificado o vector RId hC?lwt (a 0.25mg/ml) Incubado a 2h a 37°C. El producto PCR VL y vector de expresión de mamífero RIn ?C? se digieren Hind MI-BsiW I : regulador 10x (NERegulador2) 5µl ADN 5µl Hind I I I (Promega) 2µl agua 38µl vol íoíal 50µl ADN : producío PCR VL purificado de vecíor Rln hCi (a 0.25mg/ml) Incubado a 2h a 37°C. 2µl de BsiW I (NEB) se agrega e incuba 2h a 55°C. 7.4.2.2 Purificación de Gel Los producios de digestiones de restricción se cargan en solución de carga de gel en un gel de agarosa al 1 % preparativo coníeniendo 0.01 % bromuro de etidio y corre en regulador TAE a 100V por 1 hora y el vecíor RId y Rl n así como también bandas de fragmento PCR VH y V se cortan . U na escala ADN 100bp también corre en el gel para permitir la identificación de las bandas de vector, VH y VL. El ADN se extrae y purifica de gel utilizando kií de extracción QIAquick Gel de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 7.4.2.3 Ligación El fragmento PCR VH Hind lll-Spe I digerido se liga en el vecfor RId hC?l wí Hind lll-Spe I digerido. El fragmenío PCR VL Hind l ll-BsiW I digerido se liga en el vecfor Rln hCi Hind ll l-BsiW I digerido. La ligación se lleva a cabo uíilizando Sislema de Ligación de ADN Rápido LigaFasí de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricante proporcionado: VH: vector: RId hC?l wt Hind lll-Spe I digerido inserción: fragmenío PCR VH Hind lll-Spe I digerido VL: vector: Rln f?C? Hind lll-BsiW I digerido inserción: fragmento PCR VL Hind l l l-BsiW I digerido 7.4.2.4 Transformación Los producios ligados se íransforman en células competentes DH5a: Frascos de 200µl DH5a se congelan en hielo. Alícuotas de 50µl se preparan en tubos de transformación. 2µl de mezcla de ligación se agrega y mezcla genlilmeníe con una punía de pipeía seguida por incubación por 30min en hielo. La mezcla se incuba por 45 seg a 42°C sin agilación. Esto se transfiere a hielo por 2min. 450µl medio SOC se agrega y los tubos se incuban por 1 h a 37°C en incubador agiíador. 100µl de cultivo se difunde sobre placas L-ágar complementadas con 100µg/ml ampicilina e incuban durante la noche a 37°C. 7.4.2.5 Secuenciación Clones VH y VL se cultivan durante la noche a 37°C en 5ml medio LB complementando con 100µg/ml ampicilina. Los plásmidos RId y Rl n conleniendo dominios VH y VL respecíivamenfe se exíraen y purifican uíilizando el kií QIAprep Spin Miniprep de Qiagen de acuerdo a las insírucciones del fabricante. La región VH se secuencia ufilizando cebadores delaníeros en el vecíor RId y secuencia de señal y cebador inverso en la región C?1 de humano. La región V se secuencia utilizando cebadores delaníeros en el vecíor Rln y secuencia de señal y cebador inverso en la región CK de humano. Los clones con las secuencias VH y V se ideníifican y los plásmidos se preparan para expresión en células CHO. 7.4.3 Expresión de Anticuerpo Quimérico en Células CHO Los plásmidos RId y Rln coníeniendo dominios VH y VL 10D3 respecíivameníe se co-íransfecían fransiíoriameníe en células CHO y se expresan . El aníicuerpo quimérico producido se purifica de sobrenadaníe de culfivo celular por cromaíografía de afinidad o Sepharose de rProíeína A y su afinidad para OSM se evalúa en ELISA de inhibición gp1 30 y ensayo de célula KB (ver abajo) . 7.4.3.1 Purificación de Plásmido Células DH5a conteniendo plásmidos Rld-15E10VH y Rln- 1 5E 1 0V se cultivan en 5ml de medio LB complemenfado con 1 00µg/ml ampicilina por 8h a 37°C en un incubador agifador. 200ml de medio LB complementando con 1 00µg/ml ampicilina se inocula con 1 mi de cu ltivo de día e incuba du raníe la noche a 37°C en un incubador agifador. Los plásmidos se exíraen y purifican uíilizando el kií Q IAfilter Plasmid Maxi de Qiagen de acuerdo a las insírucciones del fabricaníe. La pasíilla de eíanol se resuspende en 200µl regulador TE y conceníración de plásmido se mide por absorbencia a 260nm después de dilución 1 00 veces de solución de reserva. 7.4.3.2 Transfección Las células CHO se culíivan para confluencia en M EM de Dulbecco con medio Gluíamax-1 (DM EM) complemeníando con Suero de Bovino Fefal Ulíra Bajo y 1 % Penicillin-Sfrepíomicin en 4x1 75cm maíraces de culíivo de fejido BD Falcon a 37°C. Para cada frasco, en un íubo Falcon de 50 mi, se agregan y mezclan lo siguiente: 8ml Optimem 1 con Glulamax-1 20µg Rld-151 0VH plásmido purificado 20µg Rln-151 0VL plásmido purificado 20µg Reacíivo de Transfección TransFasí bajo vórtice La mezcla se incuba por 1 0-15 min a íemperaíu ra ambiente (RT). Medio DM EM se remueve de matraz después la mezcla se coloca en vórtice y se ag rega a matraz. La mezcla se incuba a 37°C por 1 h . 32ml Optimem se agrega al matraz e incuban a 37°C por 48- 72h . 7.4.3.3 Purificación de Anticuerpo Quimérico Medio de todos los matraces de 172cm2 se agrupan y centrifugan a 1 500rpm por 3min en un MSE Mistral 2000 y sobrenadante pasa a través de un Sisíema de Filíro de 500mL 0.22µm CA. El aníicuerpo se purifica de sobrenadaníe clarificado en un Amersham Biosciences Akía Explorer uíilizando sofíware U nicorn software. La columna utilizada fue una 1 ml HiTrap rProleina A Sepharose FF. La velocidad de flujo fue 1 ml/min . La columna se equilibra con 1 0CV de PBS de Dulbecco después se carga con sobrenadaníe clarificado a íravés de bomba A.

La columna se enjuaga con 20CV de PBS de Dulbecco, bomba A se enjuaga para desperdicio y un 1 0CV adicional de PBS de Dulbecco se pasa a íravés de la columna para asegurar despeje complefo de sobrenadaníe. El aníicuerpo se eluye con 10CV de Regulador de Elución IgG I mmu noPure (Pierce) y recolecía en fracciones de 1 ml confeniendo 10Oµl de 1 M Trizma-HCI pHd.O regulador de neuíralización. La columna se reequilibra con 5CV de PBS de Dulbecco. El aníicuerpo en fracciones de eluido se cuanfifica al leer la absorbancia a 280nm coníra una solución vacía coníeniendo 1 0 volúmenes de Regu lador de Elución IgG ImmunoPure + 1 volumen de 1 M Trizma-HCi pH8.0 y fracciones con canfidades suficientes de anticuerpo puro se agrupan y almacenan en alícuotas de 100µl a -20°C. 7.4.4 Análisis de Anticuerpo Quimérico El anficuerpo quimérico 1 0D3 se analizan en ELISA de inhibición gp 1 30 y ensayo de célula KB (ver abajo) para su poíencia para neutralizar tanto OSM humano como cinomolgo Los procedimientos para ELISA de inhibición gp1 30 y ensayo de célula KB se establecen abajo. Los anticuerpos quiméricos 1 0D3 neutralizan OSM en ELISA de inhibición gp 130 y ensayo de célula KB. Estos resultados confirman que las regiones variables correctas se han clonado exitosameníe para producir un aníicuerpo quimérico de aníígeno capaz de unir tanto sitio I I de OSM de cinomólgo o humano. Los dominios pesados y ligeros variables 10D3 pueden ahora humanizarse. Las regiones variables de murino se clonan y secuencian después se injerían en regiones consfaníes ?1 /k humano para producir un aníicuerpo quimérico. El anficuerpo quimérico 10D3 mosíró pofencia contra OSM cinomólgo y humano equivalente a aquel del anticuerpo de muríno de origen en gp130 ELISA y ensayos de célula KB (ver abajo). El aníicuerpo de murino se humaniza ufilizando la estrategia de "mejor ajuste". Para el dominio pesado variable, una secuencia con 65% identidad se selecciona y CDRs de muririo injertados sobre las estrucíuras de humano. Un número de construcciones se diseñan con varias mutaciones de nuevo en las estructuras para recuperar afinidad. Estas construcciones son: Construcción Muíaciones de nuevo A T28I B T28I , R71 V, T73K C T28I, V67A, M69L, R71 V, T73K D T28I , M48I , G44K, V67A, M69L, R71 V, T73K Para el dominio ligero variable, una secuencia con 60.0% identidad se selecciona y CDRs de murino injertadas sobre las estrucíuras de humano. Un número de consírucciones se diseñan con varias muíaciones de nuevo en las eslrucíuras para recuperar afinidad. Estas construcciones son: Construcción Mutaciones de nuevo LA ninguno (injerto recto) LB L46R, L47W LC Y36F, Q38K LD Y36F, Q38K, L46R, L47W LE Y36F, Q38K, L46R, L47W, F71 Y Solamenfe las consírucciones por úlfimo y más muíadas de n uevo (A, D , LA, LE) se sinfeíizan al formar los oligos de recubrimienío. Cuaíro aníicuerpos h umanizados (ALA, ALE, DLA, DLE) se expresan en escala pequeña en células CHO y el sobrenadaníe se analiza para afinidad de aníicuerpo en gp 130 ELISA. Solameníe aníicuerpos humanizados ALE y DLE mosíraron inhibición en gp 1 30 ELISA pero la inhibición por ALE no fue suficiente debido a la baja concentración de anficuerpo en el sobrenadante de manera que DEL se selecciona. La producción de anticuerpo humanizado DEL se escala en células CHO y el aníicuerpo se purifica y analiza en gp 1 30 ELISA y ensayo de célula KB utilizando anticuerpo q uimérico 1 0D3 como confrol. Los valores I C50 (gp 1 30 ELISA) (µg/ml): hOSM cOSM quimera 0.032 0.246 DLE 0.021 0.059 Aníicuerpo humanizado 10D3 DLE es al menos ían poíeníe si no más poíeníe q ue el aníicuerpo q uimérico confra OSM de humano y OSM de cinomólgo en gp 130 ELISA.

Los aníicuerpos quiméricos humanizados 10D3 DLE y 10D3 se analizan en el ensayo de célula KB. 10D3 DLE dio valores IC50 de 0.205µg/mi coníra OSM de humano y 0.07µg/ml confra OSM de cinomólgo. En conclusión, aníicuerpo siíio II OSM aníi-humano 10D3 se ha humanizado exifosameníe y muesíra polencia equivaleníe a aquella del anticuerpo de murino de origen. Materiales Sistema de Aislamiento de ARN Total SV: Promega Z3100 Sisíema Access RT-PCR Sysíem: Promega A1250 Kií de Exíracción de Gel QIAquick: Qiagen 28704 Solución de carga de gel: Sigma G7654 Agarosa: Invitrogen 15510-019 Bromuro de etidio: Sigma E1510 Regulador TAE: en casa Escala de ADN 100bp: New England BioLabs N3231 S Kií de clonación TA: Inviírogen 45-0046 Células TOP10P: Invitrogen 44-0300 L-agar + 100µg/ml ampicilina: en casa X-Gal , 50mg/ml en DMF: Promega V394A AmpliTaq ADN Polimerasa: Applied Biosystems 10x regulador PCR: Applied Biosystems E-Gel 1 .2% agarosa: I nvitrogen G501801 medio LB + 100µg/ml ampicilina: en casa kit QIAprep Spin Miniprep kit: Qiagen 27106 kií de purificación MinElufe PCR Purificaíion: Qiagen 28004 NERegulador2 10x conc: New England Biolabs B7002S BSA Purificado 100x conc: New England Biolabs B9001 S BsiW I: New England Biolabs R0553L Hind I II: Promega R604A Spe I : New England Biolabs R0133S Sisíema de Ligación de ADN rápido LigaFasí: Promega M8225 Células químicamente competeníes DH5a Eficiencia MAX: Invitrogen 18258-012 medio SOC: en casa KIT Q IAfilter Plasmid Maxi: Qiagen 12263 MEM de Dulbecco con Glufamax-1 : Inviírogen 31966-021 Opíimem 1 con Glufamax-1 : Inviírogen 51985-026 Reactivo de Transfección TransFasí: Promega E2431 1 mi HiTrap rProíeina A Sepharosa FF: Amersham Biosciences 17-5079-01 PBS de Dulbecco: Sigma D8537 Regulador de Elución de IgG ImmunoPure: Pierce 21009 1 M Trizma-HCI pH8.0: Sigma T2694 Polimerasa ADN ProofSíarí: Qiagen 1016816 Regulador PCR ProofSíarí: Qiagen 1016961 Eiemplo 8. ELISA de inhibición gp130 OSM se une secuencialmeníe a gp130 y ya sea el receptor OSM o receptor LI F. El ensayo descriío abajo permiíe la medición de OSM (por ejemplo, hOSM) unido a gp130 en una placa ELISA.

Además, el ensayo permiíe la medición de inhibición de OSM unión al receptor gp130 por anticuerpos originados confra OSM siíio II. 8.1 Materiales 1. Nunc Inmunoplaca 1 F96 Maxisorp (Life Technologies, 4- 39454A) 2. gp130-Fc Humano 100µg/ml (R&D Sysíems, 671-GP-100) 3. PBS 4. BSA (Sigma A7030) 5. OSM recombinaníe de humano 10µg/ml (R&D Sysíems, no glicosilado) 6. OSM anfi humano bioíinilado 50µg/ml (R&D Sysíems, BAF295) 7. Sírepíavidin HRP (Amersham RPN4401) 8. 3,3'5,5'-fetramefileno benzidina (TMB) (Sigma) 9. Ácido sulfúrico 10. Tween 20 (Sigma P7949) 8.2 Preparación de reactivos 1. Preparación de placas: Diluir el gp130-Fc de humano con 1 µg/ml en PBS. Agregar 50µl/cavidad, cubrir e incubar duranfe la noche a 4°C. 2. Regulador de enjuague: a 1 L PBS agregar 500µl Tween 20 (0.05%) 3. Regulador de bloqueo: a 500ml PBS agregar 5g BSA (1 %) 8.3 Método 1 . Enjuagar la placa utilizando el procedomienío de enjuague de placa esíándar y secar lapa . 2. Agregar 200µl/cavidad regulador de bloqueo e incubar por 1 hora a RT. 3. Enjuagar como en la eíapa 1 . 4. Agregar 50µl/cavidad estándar OSM o muestra. Cubrir y agitar por 2 horas a RT. (OSM se diluye a 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1 .563 y 0 ng/ml en regulador de bloqueo o medio de cultivo de tejido dependiendo de la muestra) 5. Enjuagar como en la etapa 1 . 6. Agregar 50µl/cavidad OSM anti humano biotinilado diluido con 30ng/ml en regulador de bloqueo. Cubrir y agitar por 1 hora a RT 7. Enjuagar como en etapa 1 . 8. Agregar 50µl/cavidad strepíavidin HRPdiluida 1/4000 para bloquer el regulador. Cubrir y agitar por 30 min, a RT. 9. Enjuagar como en etapa 1 . 1 0. Agregar 1 00µl/cavidad subsíraío TMB. Cubrir y agitar por 30 minutos a temperalura ambieníe. 1 1 . Agregar 50µl/cavidad 1 M H2S04. 12. Leer OD 450pm. 8.4 Uso de ensayo para análisis de inhibición mediada por anticuerpo de unión gp130-OSM 1 ) Mezclar 25 ng/ml OSM con varias conceníraciones de anticuerpo anti-OSM o varias diluciones de antisueros conteniendo anticuerpos OSM . I ncubar por 1 hr a RT. 2) Agregar 50µl/ cavidad de la mezcla de aníicuerpo-OSM a una placa de 96 cavidades conleniendo gp 1 30 unido, preparado como arriba. 3) Proceder con el ensayo como se describe arriba. 9. Ensayo KB Introducción Células KB (una estirpe de célula epitelial h umano) expresan mARN para gp1 30 junto con receptores LI F y OS M (Mosley, J . Biol Chem. , 271 (50) 32635- 32643). Tanlo OSM como LI F inducen la liberación de I L-6 de células KB . Esta estirpe de célula se ha utilizado para identificar anticuerpos monoclonales modulando la interacción entre OSM y gp 1 30. 9.1 Método Las células KB se obtienen de ECACC (No. de Acceso 94050408) y manlienen en DMEM + 10% FCS inacfivado por calor, complemeníado con gluíamina ("medio KB ") . Las células se desarrollan como una monocapa y se dividen dos veces por semana.

El medio de disociación de célula no enzimática Sigma o Versene se utiliza para separar las células. 1 . Agregar 2x1 04 células/ 1 00µl/ cavidad/ placa de 96 cavidades e incubar durante la noche (37°C, 5% C02). 2. Elaborar los estándares OSM en medio de cultivo 3. Elaborar 1 ng/ml OSM + anticuerpo / diluciones de suero. Incubar por 1 h a RT. 4. Remover cuidadosamente medios de la placa de célula KB y agregar esíándares OSM y mezclas de OSM-anlicuerpo.

. Incubar por ~16-18h a 37°C 6. Remover el medio de cultivo y ensayar por IL-6. Nota: • Medio de culíivo puede maníenerse congelado hasía que esíá lisio para análisis. . Medio de cultivo debe diluirse -20 veces para ensayo. En selección de hibridomas, la proporción del medio de clonación a medio KB debe ser constante, y los estándares OSM deben hacerse en esta mezcla. • Estimulación de células KB con -100 ng/ml OSM da salida IL-6 máxima, pero 1 ng/ml es suficiente para actividad neutralizaníe de aníicuerpo.

. Ensayo de Competición Esíe ensayo permiíe la medición de inhibición de unión del aníicuerpo humanizado íeniendo una cadena pesada de SEQ.l.D.NO: 1 1 y una cadena ligera teniendo una cadena ligera de SEQ.l .D.NO: 12 (para el propósito de esle ejemplo denoíado como 15E10-B3L2) a hOSM glicosilado soluble por un aníicuerpo no humano candidalo que se une específicamente a Sitio I I de hOSM. Ilustración esquemática del ensayo de esíe ejemplo se esíablece en FIG. 20. La placa se revisíe con aníicuerpo monoclonal aníi-silio I II (referido en la preseníe como OM4-1 1.31 ). Para la curva esíándar: 15E10-B3L2 purificado esfándar serialmente diluido de 1 µg/ml se incuba con OSM gumano glicosilado soluble a 50 ng/ml. El anticuerpo se une a OSM a íravés del siíio II y el complejo se capíura en la placa por el anticuerpo primario sitio I I I . Para el ensayo de compresión: el anticuerpo candidato serialmente diluido de 1 µg/ml se incua con OSM humano glicosilado soluble a 50ng/ml y 15E10-B3L2 a 150ng/ml. La presencia de 15E10-B3L2 compuesío se deíecía por un aníicuerpo secundario de cadena gamma anli-humano.

Método: 1 Revestimiento Una Inmunoplaca Maxisorp Nunc se reviste con 50 µl por cavidad de aníicuerpo sitio II I OSM anfi-humano (OM4-1 1.31 , en casa) a 4 µg/ml en PBS. La placa se incuba durante la noche a 4°C. 2 Bloqueo La placa se enjuaga 3 veces con PBS + 0.05% Tween (PBST). 100 µl de 1 % BSA (Sigma A7030) en PBS se agrega a cada cavidad. La placa se incuba a temperatura ambiente por 2h con agilación . 3 Pre-incubación Esíándar 1 5E1 0B3L2: Una solución de aníicuerpo 1 5E1 0-B3L2 a 1 µg/ml en 50 ng/ml OSM de humano en regulador de bloqueo se prepara y 67 µl se agregan a 2 cavidades en fila A de una placa de 96 cavidades no absorbeníe. El aníicuerpo se diluye serialmeníe 1 :3 en 50 µl de 50 ng/ml de OSM humano en regulador de bloque de fila B a G . Aníicuerpo compeíeníe: U na solución de aníicuerpo compeíenfe a 1 µg/ml en 1 50 ng/ml 15E 1 0-B3L2+50ng/ml hOSM en reg ulador de bloque se prepara y 100µl se agregan a 2 cavidades en fila A de una placa de 96 cavidades absorbenle. El aníicuerpo se diluye serialmeníe 1 : 1 en 50µl de 1 50 ng/ml 1 5E 1 0-B3L2+50 ng/ml OSM humano en regulador de bloque de fila B a G . Dos cavidades se incuban con diluyeníe si anficuerpo compeíeníe. La placa de pre-incubación se incuba a femperafura ambieníe por 1 h bajo condiciones estáticas. 4 Incubación La placa revestida se enj uaga 3 veces con PBST. 45µ de cada estándar y muestra se íransfiere de la placa de preincubación a cavidades equivalentes en la placa revestida. PBS se agrega a cavidades vacías. La placa se incuba a femperaíura ambieníe por 2h bajo agifación. 5 Aníicuerpo Secundario La placa se enj uaga 3 veces con PBST. 50 µl de peroxidasa de cadena ? aníi-humano de cabra (Sigma A6029) diluido 2000 veces en regulador de bloque se agrega a cada cavidad . La placa se incuba a íemperatura ambiente por 1 h bajo agitación. 6 Subsíraío La placa se enjuaga 3 veces con PBST Subsfraío OPD (Sigma P91 87) se prepara en agua de acuerdo a las insírucciones del fabricanfe. 50 µl se agrega a cada cavidad La placa se incuba a femperaíura ambieníe. 7 Deíención Una vez que la coloración se ha desarrollado lo suficieníe, la reacción cromogén ica se defiene por la adición de 1 0 µl de 3M H2S04 por cavidad . La placa se lee en 490 nm en un lector de placa utilizado cavidades vacías como 0 absorbencia. La cu rva estándar de absorbencia a 490nm contra concentración 1 5E 1 0 se diagrama. Conceníración 1 5E10 complejada en las muesíras conteniendo anticuerpo compeíeníe se lee fuera de la curva esíándar % inhibición se calcula como: 1 00-[(1 5E 1 0 conc en muesfra en ng/ml ?- 1 50 ng/ml)x1 00] La curva de % inhibición coníra concentración de anticuerpo competeníe se diagrama y el % de inhibición de 15E10 a equimolaridad de anticuerpo competeníe (150ng/ml de anticuerpo competente) se lee fuera de la curva. Eiemplo 10.1: 10D3 como anticuerpo competente Anticuerpo E9 clon 10D3 de Murino a 267 µg/ml (reserva) se utiliza como el compeíidor de 15E10. 10D3 tiene CDRs de cadena pesada y ligera como se esíablece en la Tabla A anterior. Resultados: % de inhibición de 15E10 por el competidor 10D3 en equimolaridad (0.15 µg/ml): 62.3%. Véase Fig.21.

Eiemplo 11 - Identificación de anticuerpos que unen OSM y son específicos para el Sitio II o Sitio III de OSM Para la función biológica, OSM tiene que interacíuar tanto con gp130 como LIFR o OSMRß. La iníeracción inicial de OSM con gp130 incluye OSM siíio II, mientras que la interacción de OSM con el OSMRß o LIFR se présenla por medio del sifio III. Prosigue que los aníicuerpos que íienen como objetivo cualquiera de las secuencias de OSM de siíio II o sitio III, o epítopos lo suficieníemeníe cercanos a esíos siíios de fal forma que la unión de aníicuerpo podría obsfaculizar esíos siíios, podría neufralizar I a acíividad de OSM . Un ensayo para medirla unión OSM-gp130 se esíablece en el Ejemplo 8. Una curva eslándar típica (a 1 µ/ml, gp1 30) se establece en la Fig. 22. Al cambiar las condiciones del ensayo (a 4 µg/ml), la sensibilidad podría mejorarse mayormente según se ilusíra en la Fig. 22b. Además, a pesar de que la información anterior se generó utilizando OSM no glicosilado, OSM glicosilado también se une a gp1 30 en este ensayo. Véase Fig. 22c. Un anticuerpo anti-OSM neutralizante comercialmeníe disponible (Mab 295, R&D Sysíems) se utilizó en este ensayo para ver si esíe podría bloquear la inferacción de OSM-gp130. Sorprendentemente, éste potenció la señal de OSM, según se ilusíra en la Fig. 23. Cuando Mab 295 (30 µg/ml) se agrega a OSM aproximadameníe dobla la lecfura de OD del ELISA en comparación con OSM solo para las concentraciones de OSM > 1 0 ng/ml. Si gp1 30 se omite de la placa, entonces la señal generada por OSM + Mab295 se reduce al anterior.

Los inventores postulan la siguieníe iníerpreíación; Mab295 no se une a o bloquea OSM sitio II. En concentraciones bajas en OSM, las moléculas de anticuerpo de MAB295 solamenle unen una OSM, que sin embargo, se encueníra libre también de unirse a gp130, ya que el sitio II se encueníra disponible. En conceníraciones más alfas, las moléculas de anticuerpo unen dos moléculas OSM, cualquiera de las cuales se encuentra disponible para unirse a gp130, de esta manera dando posiblemente 2 moléculas OSM unidas para cada molécula gp130, una unión directameníe a gp1 30, y la ofra congelada como una consecuencia de la naíuraleza bivalente del anticuerpo. Se aníicipa que cualquier aníicuerpo OSM de no siíio I I podría íener esíe efecío, pero ya que Mab295 es un anticuerpo neuíralizaníe (véase Fig. 24), debe unirse a, o bloquear la OSM sitio I I I . De esta manera, el uso del ensayo ELISA OSM gp130 del Ejemplo 8 y. el ensayo de célula KB del ejemplo 9 permiíe la identificación de anficuerpos OSM neuíralizaníes como específicos de sitio I I o sitio I I I . Más particularmente, un anticuerpo de Sitio III neutralizará OSM en el ensayo KB pero no neutralizará la unión OSM-gp130 en el ensayo ELISA. Un anticuerpo de Sitio I I neuíralizará OSM tanto en el ensayo ELISA como KB. El ensayo ELISA OSM gp130 se uíilizó como una pantalla de hibridoma primaria para detecíar los anficuerpos generados en el Ejemplo 1 que inhibieron la inleracción de gp130-OSM. Además, los hibridomas también se seleccionaron para la detección de la acíividad de unión de OSM. Los sobrenadaníes de hibridoma mosírando la unión alia en OSM, pero que no inhibieron la unión OSM-gp130 en el ensayo ELISA del Ejemplo 8 se probaron en el ensayo de célula KB del Ejemplo 9 para la neulralización OSM. Esto identificó un número de anticuerpos OSM específicos de sitio I I I . Un tal anticuerpo se refiere como OM4-1 1 .31 . Cuando los anticuerpos específicos OSM de sitio I I I se utilizaron en el ELISA gp1 30-OSM, aumeníaron mayormenie la señal OSM según se muesíra en la Fig. 25. El aníicuerpo de sitio I I , 1 B5 (1 µg/ml) completamente inhibe la unión OSM-gp130. Sin embargo, el anficuerpo OSM de sitio I I I , OMR- 1 1 .3.1 origina una potenciación dependiente de dosis difásica de la unión de OSM . En la concentración más alta OM4-1 1 .3.1 utilizada la señal es aproximadamente lo doble de la señal única de OSM, pero a medida que las concenlraciones de aníicuerpo se reducen, la señal aumenía, presuntamente como un resultado de la formación de complejos de anticuerpo-OSM que pueden unirse a gp130, hasfa que se alcanza un valor máximo. El IgG de control de isotipo para OM4-1 1 .31 no tuvo efecfo en la unión de OSM-gp130. La Fig. 25 demueslra la gran sensibilidad de este ELISA en la discriminación de los anticuerpos específicos de sitio I I vs. no sitio I I , ya que el formador inhibe, pero el último mejora la unión de OSM.

Eiemplo 11.1 - Efecto de los anticuerpos anti-OSM específicos de Sitio II v Sitio III en ensayo ELISA OSM-gp130 Cuando los anticuerpos específicos OSM de sitio I I y sitio I I I se mezclan juntos, los aníicuerpos siíio I I tienen un efecto dominante en el ELISA OSM gp1 30 del ejemplo 8, según se muestra en la Fig. 26. La señal única OSM se mejora mayormente por el anticuerpo OSM específico de sitio I I I OM4-1 1 .1 7. Mientras que esta mejora no se afecta por la adición de un IgG de control, la adición del aníicuerpo OSM específico de sitio I I , OM4-5.3, mayormeníe reduce la señal. Se cree que la señal deíectable pequeña en la columna extrema derecha de la Fig. 26 se debe al tiempo de incubación sub-óptimo para el complejo OSM Sitio I I I y mAb sitio II aníes de la adición a la placa gp 130.

El ELISA OSM gp130 permite el monitoreo de la emergencia de los anficuerpos OSM específicos de siíio I I en aníisuero de ratones inmunizados con OSM humano (véase ejemplo 1 ), según se ilustra en la Fig. 27a, 27b y 27c. Después del primer empuje, se generaron anticuerpos predominantemeníe no siíio II, pero los aníicuerpos específicos de siíio I I comenzaron a emerger después del segundo empuje, y después del tercer empuje, la dominancia de los anticuerpos de sitio I I se observa claramente en las conceníraciones de suero más altas.

Eiemplo 1 1.2 - Sinergia entre anticuerpos específicos de sitio II y sitio III OSM para la neutralización de OSM Ya que el sitio I I y sitio I I I de OSM son esenciales para la función de OSM, una combinación de anticuerpos que tienen como objetivo ambos sitios pueden operar sinergísticamente en la neutralización de OSM. El sitio I I I de OSM se utiliza no solamente para la interacción con OSMRß y LI FR sino también en la unión de una segunda molécula OSM a gp130 y esto podría contribuir a la potencia aumentada por los anticuerpos específicos de sitio I I I , en comparación con aquellos contra el sitio I I . La Figura 28a y 28b ilustra el ensayo KB en el cual la combinación de un anticuerpo específico de sitio I I y específico de siíio III aumenía mayormeníe la potencia de la neutralización de OSM cuando se compara con cualquier anticuerpo solo. Las concentraciones de los anticuerpos utilizados en las combinaciones se muesíran en la íabla de abajo.

Una comparación de los aníicuerpos específicos de siíio I I y siíio I I I más activos mostró que los últimos fueron más potentes en la neutralización de OSM. Sin embargo, la reactividad cruzada de los anticuerpos de sitio I I y siíio I I I con OSM de oíra especie se enconíró que era difereníe, ya que iodos los aníicuerpos de sitio I I poteníes neutralizaron OSM de mono cinomólgo (en ensayos de célula KB y ELISA OSM gp1 30), mientras que los aníicuerpos de siíio I I I no (solamente en el ensayo KB). El bloqueo de la interacción de OSM tanfo con gp130 como OSMRß o LIFR presuntamente se encuentra debajo de los efecíos sinergísticos de los anticuerpos de sitio I I y sitio I I I en la neuíralización de OSM. Sin embargo, íambién es posible que la unión de un anticuerpo podría facilitar la unión de otro anticuerpo dirigido en un sitio diferente.

Eiemplo 1 1.3 - Optimización de la neutralización de OSM por combinación de los anticuerpos OSM específicos de sitio II y sitio III Ya que la combinación de los anticuerpos OSM de sitio II y sitio I I I mayormente aumentó la poíencia de neuíralización, puede coníemplarse una estrategia para el desarrollo de concentraciones óptimas, en base a las afinidades de unión de los diferentes aníicuerpos. El ejemplo 1 1 .3 es íeórico. Inicialmente la afinidad de los anticuerpos específicos de sitio II y sitio I I I para OSM, previamente unidos por los anticuerpos específicos de sitio I I o sitio I I I respectivamente, podría medirse utilizando la tecnología de resonancia de plasmón. Si las constanfes de unión (Kd) son significativamente diferentes de la unión de los anticuerpos únicos a OSM, entonces se está presentando una interacción cooperativa en la unión de anficuerpos de siíio I I y sifio I I I . En base a los daíos de eslos esíudios de unión de aníicuerpos, las conceníraciones de los aníicuerpos de siíio I I y siíio I I I podrían prepararse variando de 1 0 veces más que los valores Kd a 10 veces menos que la Kd, uíilizando lo doble de diluciones. Además, las combinaciones de ambos aníicuerpos podrían prepararse de tal forma que cada concentración del anticuerpo de sitio I I se combina con cada concentración de anticuerpo de sitio I I I ; permitiendo la exploración de la unión igual de los anticuerpos de siíio II o sitio III a OSM, y la dominancia en la unión de anticuerpo de sitio I I y sitio I I I . Todas las diluciones y combinaciones de aníicuerpo podrían probarse para la neuíralización de OSM en un ensayo de célula KB. Los daíos de este ensayo podrían permitir la selección de la combinación de anticuerpo que fue más potente en la neutralización de OSM.

E jem pío 12 - Habilidad d el anticuerpo espe cífico de OSM de anti s itio II para inhibir I a estimulad ion de OSM de fibrc iblastos sinoviales RA Previamente, hemos mosírado que los aníicuerpos de OSM específicos de siíio II y sitio III pueden inhibir la estimulación de OSM de las células KB. Sin embargo, estas células son epiteliales, se íransforman y pueden no ser represenlafivos de las células enconíradas en el sinovio reumaíoide. Por lo íanío, invesíigamos la eficacia de los anticuerpos de OSM específicos de sitio I I para inhibir la estimulación de OSM de los fibroblastos sinoviales RA. Los fibroblastos se cultivaron en placas de 96 cavidades a 2 x 1 04 células/cavidad y se cultivaron en 1 0% de FCS en DMEM hasta casi confluente, reemplazando el medio 3 veces a la semana. El medio de cultivo se cambió así al medio de cultivo fresco conteniendo, ya sea no OSM, 1 ng/ml de OSM, o 1 ng/ml OSM que se había pre-incubado por 1 h con varias concentraciones de aníicuerpo aníi-OSM en el medio. Después de 48 h, los sobrenadaníes de culíivo se removieron y se almacenaron a -20°C hasía el análisis de las concentraciones IL-6 por ELISA. La Figura 29 ilustra los datos represeníaíivos de las 4 cepas de fibroblasío sinovial RA. El anticuerpo de OSM originó la inhibición completa de secreción IL-6 estimulada por OSM, a pesar de que la potencia del anticuerpo mostró alguna variación entre las diferentes cepas.

Eiemplo 13 - Efecto de la glicoslación de OSM en la potencia de la neutralización por anticuerpos anti-OSM Los anticuerpos anti-OSM se elevaron al inmunizar los ratones con OSM no glicosilado utilizando los métodos previameníe descriíos. La selección de esíos aníicuerpos condujo a la identificación de un aníicuerpo neuíralizante poteníe (OM4-5.3) que interfirió con la unión OSM de gp 130, según se muestra en la Fig . 30. Se anticipó que OM5-5.3 podría tener potencia similar contra OSM glicosilado (célula CHO glicosilada). Sin embargo, cuando se midió la habilidad de un sub-clon de este aníicuerpo (OM4-5.3.1 ) para inhibir la unión de OSM glicosilado (hOMS glicosilado por una . célula CHO) a gp1 30, se observó una pérdida de potencia marcada, según se muestra en la Fig . 31 a. Además ésta pérdida de potencia contra OSM glicosilado en comparación con OSM no glicosilado también se observó en otros anticuerpos específicos de siíio I I derivados de la inmunización de un raíón con OSM no glicosilado según se muesíra en la Fig. 31 b. Además, los anticuerpos de sitio I I I derivados de las inmunización con OSM no glicosilado también mostraron un aproximado 1 0 veces de reducción de potencia contra OSM glicosilado en comparación con OSM no glicosilado en un ensayo de célula KB - véase Tabla 1 de abajo. Tabla 1 Ya que la inmunización con OSM no glicosilado dio como resultado los aníicuerpos que fueron más potentes contra OSM no glicosilado en lugar de la forma glicosilada, consideramos que la inmunización con OSM glicosilado puede producir anticuerpos de potencia más alta contra esta forma de OSM. Esío a su vez produjo ser el caso. Las Figuras 32a y 32b ilusíran la acfividad coníra OSM glicosilado y no glicosilado en el ELISA OSM gp1 30 de dos aníicuerpos de OSM específicos de sitio I I (15E1 0 y 5H2) derivados de la inmunización de OSM glicosilado.

Eiemplo 14 - Correlación entre niveles de OSM de fluido sinovial y suero en pacientes RA Uno de los mayores sitios de producción de OSM en pacientes RA se encuenfra en las arficulaciones aríríticas, ya que los niveles altos en OSM pueden medirse en fluido sinovial. En contrasíe, los niveles de suero OSM en pacientes RA son muy bajos, y solamente ha sido posible medir estos exacíameníe con el desarrollo de un ELISA de alta sensibilidad según se describe en el ejemplo 16 de abajo. Investigamos la posible relación entre las conceníraciones de OSM en aríiculaciones aríríticas y la circulación al medir las muestras de suero y fluido sinovial en par de los pacientes RA. Los niveles de OSM en sueros y fluidos sinoviales según se mide por el ensayo ELISA establecido abajo (captura de anticuerpo OM4-1 1 .31 de OSM) se muesfran en la íabla de abajo, y la Figura 33 ilusíra la relación enfre las dos mediciones. Las muesíras se congelaron siguiendo el muesfreo y se descongelaron justo antes de estas mediciones. El coeficiente de correlación para estos dos parámetros, según se deíermina por la regresión lineal es 0.9447.

La buena correlación eníre los niveles de OSM de sueros y SF sugiere que los sitios de producción de OSM diferentes a las articulaciones artríticas tienen relativameníe poca influencia en los niveles de OSM circulantes, o que estos siíios modulan la producción de OSM en manera que se correlaciona con la producción en la aríiculación. En cualquier caso, los inveníores especulan que la correlación puede permiíir la predicción de los niveles de OSM de articulación de la medición de OSM de suero y podrían encontrar la utilidad en la fijación de dosis de un anticuerpo de OSM neutralizaníe para el íraíamiento de pacieníes RA.

Eiemplo 15 - Medición de OSM en fluido sinovial (SF) y suero de los pacientes OA Ya que la degradación de caríílago es una caracíerística de osteoartriíis y OSM , paríicularmente en sinergia con I L-1 y otras citoquinas pueden inducir a la ruptura del cartílago, medimos los niveles de OSM en los fluidos sinoviales y sueros de pacieníes OA. Las células se removieron de las muesíras de SF por centrifugación. Los sobrenadantes se írafaron por 1 h con 0.1 U/m de hialuronidasa (Fluka, 53725) por 1 ha a íemperalura ambiente después de lo cual se centrifugaron a 4000 rpm por 1 0 minutos. Los sobrenadantes se removieron, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. Las conceníraciones de OSM en OA SFs se analizaron utilizando el ensayo ELISA del Ejemplo 1 6 en dos experimentos mostrados en la Figura 34a y b y 35. A pesar de que 1 3 de los 46 OA SFs no tenían OSM detecíable, varios coníuvieron OSM a niveles relaíivamente altos (>200 pg/ml) y las concentraciones de OSM de > 1000 pg/ml se detecfaron en fres muesíras.

Eiemplo 15.1 - Concentraciones OSM en sueros OA Las concenlraciones altas de OSM en fluido sinovial OA fueron sorprendentes, ya que los reportes previos sugieren que los niveles de OSM en fluido sinovial OA tienden a ser inferiores que RA SF (véase Manicourt DH eí al. (2000) Artritis Rheum. 43(2):281 -88). También medimos los niveles de OSM en sueros de pacientes OA en un ensayo clínico en varios diferentes puntos de tiempo durante un período de 12 meses utilizando el ensayo ELISA del ejemplo 16 de abajo. La Figura 36 ilustra que las concentraciones de OSM de suero fueron ya sea bajas o no detectables en estos pacientes. Sin embargo, se hizo la no correlación entre los niveles OSM en sueros y el fluido sinovial en pacientes OA a medidas que las muestras no se emparejaron.

Eiemplo 16 - ELISA sensible para detectar OSM en muestras biológicas a bajas concentraciones Hemos desarrollado un ELISA sensible para la medición de OSM en muestras biológicas uíilizando el aníicuerpo de capíura específico de OSM de siíio III OM4-1 1 .31. Este ELISA permite la detección de OSM debajo de <2 pg/ml según se muestra en la Figura 37 y se ha utilizado para el análisis de las muestras de suero y fluido sinovial. El protocolo para utilizar este ELISA con muesíras de suero de fluidos sinoviales se da abajo. Protocolo ELISA de OSM MATERIALES Y REACTIVOS 1 1 . Nunc Inmmunoplaíe F96 maxisorp (Life Technologies 4- 39454A) 12. OSM anii-humano monoclonal OSM (OM4-1 1 .31 GSK) 13. hOSM glicosilado @ 420 ug/ml (célula CHO glicosilada) 14. 50 µg/ml de OSM anfi-humano de cabra biotintada (R&D Sysíems BAF295) 1 5. HRP Sírepíavidina (Amersham RPN4401 ) 16. PBS (SIGMA D8537 1 L) 17. BSA (SIGMA A7888 500g) 18. 0.5% de Solución roja de fenol (SIGMA P0290 1 00 mi) 19. TMB (SIGMA T-8665 1 L) 20. Confrol de suero macho normal AB agrupado (SIGMA H4522) Grupo #043K0500 21 . Ácido Sulfúrico @ 1 M 22. Tabletas PBS (SIGMA P441 7 1 00 tabs.) 23. Tween 20 (Sigma P7949) 24. Selladores de placa PREPARACIÓN DE REACTIVOS Preparación de placas- diluir el OSM anti-humano monoclonal a 4 µg/ml en PBS Agregar 50 µl/cavidad, cubrir con banda de sellado e incubar durante la noche a 4°C. Regulador de Lavado- a 5L de agua desmineralizada agregar 25 tabletas PBS + 2.5 mi de Tween 20 (0.05%) Regulador de Bloqueo-A 500 mi de PBS agregar 1 0 g de BSA (2%) . (agregar 800 ul de fenol rojo, y 5M de NaOH hasta que el pH es neutral). Control de suero de sangre AB Girar los 100 mi en centrífuga Sorvall @ 16K, 30 mins (utilizó tubos 4xOakridge balanceados a 0.02 g). Pasar el sobrenadante a través de la gasa estéril (todavía nublado pero no particulados) . Alicuoíar y congelar. En el día del ensayo, descongelar el suero AB, microfugar 13K por min, y diluir 1 -»4 en PBS. (El suero será opaco pero es fino de utilizar) Preparación de Estándares Para el análisis de suero elaborar los estándares en suero AB diluido 1 ?4 PBS.

Para el análisis de SFs elaboran los estándares en 1 % de BSA en PBS. Si se desea sensibilidad máxima: Utilizar esíándares a 1 12, 56, 28, 14, 7, 3.5, 1 .75 y 0 pg/ml de OSM. MÉTODO 5. Lavar la placa 4x con regulador de lavado y cubrir en seco. 6. Agregar 200 µl/cavidad de regulador de bloqueo, sellar placa y agiíar 2 hrs. @ TA, o esíáfico duraníe la noche @+4. 7. Lavar como en la etapa 1 . 8. Agregar 50 µl/cavidad de estándar o muestra. Cubrir y agitar 2 hrs. a temperaíura ambieníe. (El esíándar se diluye en 25% de suero AB agrupado si las muesíras de suero son para analizarse). 5. Lavar como en la etapa 1 6. Agregar 50 µl/cavidad de OSM anti-humano bioíiníado diluido a 50 ng/ml en regulador de bloqueo con 1 % de suero de cabra. Cubrir y agilar 1 hora a íemperatura ambiente. 7. Lavar como en la etapa 1 . 8. Agregar 50 µl/cavidad de streptavidina HRP 1 /4000 en regulador de bloqueo. Cubrir y agiíar 30 mins. a TA. 9. Lavar como en la elapa 1 . 1 0. Agregar 1 00 ul de sustrato TMB. Cubrir y agitar 40 mins. @ TA 1 1 . Para detener el ensayo agregar 50 µl/cavidad 1 M de H2S04. 12. Leer inmediatamente @ 450 nm después de agitar la placa.

Claims (73)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo terapéufico que une específicamente OSM, particularmente hOSM, y modula la interacción entre OSM y gp130.
2. 2. El anticuerpo según la reivindicación 1 comprendiendo un CDRH3 de SEQ.l.D.NO: 3.
3. 3. El anticuerpo según la reivindicación 2 comprendiendo además; CDRH1 de SEQ.l.D.NO: 1 CDRH2 de SEQ.l.D.NO: 2 CDRL1 de SEQ.l.D.NO: 4 CDRL2 de SEQ.l.D.NO: 5 CDRL3 de SEQ.l.D.NO: 6
4. 4. El anticuerpo según la reivindicación 1 comprendiendo un CDRH3 de SEQ.I.D.NO:42.
5. 5. El anticuerpo según la reivindicación 4 comprendiendo además; CDRH1 de SEQ.l.D.NO: 40 CDRH2 de SEQ.l.D.NO: 41 CDRL1 de SEQ.l.D.NO: 43 CDRL2 de SEQ.l.D.NO: 44 CDRL3 de SEQ.l.D.NO: 45.
6. 6. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracíerizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo consistiendo de; intacío, quimérico, humanizado, biespecífico, heferoconjugado.
7. 7. El anticuerpo según la reivindicación 6, ' caracterizado porque el anticuerpo es un aníicuerpo infacío.
8. 8. El aníicuerpo según la reivindicación 7, caracíerizado porque el aníicuerpo iníacío es murino, rafa, conejo, primate o humano.
9. 9. El anticuerpo según la reivindicación 8, caracíerizado porque el anticuerpo intaclo es humano.
10. 10. El anficuerpo según la reivindicación 6, caracíerizado porque el anticuerpo es quimérico o humanizado.
11. 1 1 . El anficuerpo según la reivindicación 8, caracíerizado porque el anticuerpo es humanizado.
12. 12. Un anticuerpo h umanizado según la reivindicación 2, caracíerizado porque los residuos 28, 29, 30, 71 y 94 de la región de esíructura de cadena pesada variable aceptadora de humano y posiciones 49 y 71 de la esírucíura de cadena ligera variable acepíadora humana se subsliíuyen por los residuos correspondientes en la estrucíura de anticuerpo donador del cual se deriva CDRH3.
13. 13. El aníicuerpo según la reivindicación 12, caracferizado porq ue la esíructura de cadena pesada de humano comprende los siguientes residuos (o un substiíufo conservador de los mismos): Posición Residuos 28 S 29 L 30 T 71 K 94 K y la cadena ligera de humano comprende los siguientes residuos (o substituto conservador de los mismos) Posición Residuos 49 E 71 Y
14. 14. Un anticuerpo terapéutico humanizado que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 comprendiendo un dominio VH de SEQ.l.D.NO: 9 y un dominio VL de SEQ.l.D.NO: 10.
15. 15. Un anticuerpo terapéutico humanizado que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 comprendiendo una cadena pesada de SEQ.l.D.NO: 11 y una cadena ligera de SEQ.l.D.NO: 12.
16. 16. Un anticuerpo terapéutico humanizado que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 comprendiendo un dominio VH de SEQ.l.D.NO: 48 y un dominio V de SEQ.l.D.NO: 49
17. 17. Un anticuerpo terapéufico humanizado que une específicamente hOSM y modula la interacción entre hOSM y gp130 comprendiendo una cadena pesada de SEQ.l.D.NO: 50 y una cadena ligera de SEQ.l.D.NO: 51.
18. 18. Un anticuerpo terapéutico según cualquier reivindicación precedente comprendiendo además una región constanfe de cadena pesada de humano seleccionada del grupo consistiendo de; lgA1, lgA2, IgD, Ig E, lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, Ig M .
19. 19. Un anticuerpo ferapéutico según la reivindicación 18, caracíerizado porque la región constaníe es de un isofipo IgG por ejemplo, lgG 1 o lgG4.
20. 20. U n anticuerpo terapéuíico según la reivindicación 19, caracterizado porque la región constaníe es lgG 1 .
21. 21 . U n anticuerpo terapéuíico según la reivindicación 20, caracterizado porque la región constaníe se muía para volver al aníicuerpo no lííico.
22. 22. El anficuerpo ferapéutico según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicho aníicuerpo modula la iníeracción enfre Sifio II de hOSM y gp130.
23. 23. Un anficuerpo terapéufico según la reivindicación 22, caracterizado porque dicho aníicuerpo inhibe dicha iníeracción.
24. 24. El anticuerpo según la reivindicación 23, caracterizado porque dicho anticuerpo bloquea dicha iníeracción.
25. 25. Un fragmento de unión de antígeno del anticuerpo terapéutico de cualquier reivindicación precedenfe.
26. 26. U n fragmento segú n la reivindicación 25, caracterizado porque dicho fragmenlo se selecciona del grupo consistiendo de; Fab, Fab', Fd, F(ab)2, ScFv.
27. 27. Una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno del mismo según cualquier reivindicación precedente.
28. 28. Un método para traíar un paciente humano afligido con una enfermedad o desorden en respuesta a modulación de la interacción entre hOSM y gp130, dicho méíodo comprendiendo la eíapa de adminislrar a dicho pacienle una caníidad íerapéuíicamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
29. 29. Un método para tralar un paciente humano afligido con un desorden o enfermedad inflamatoria crónica dicho método comprendiendo la etapa de administrar a dicho pacieníe una cantidad terapéuficamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
30. 30. Un método para traíar un pacieníe humano afligido con un desorden o enfermedad artrítica dicho método comprendiendo la etapa de adminisírar a dicho pacienle una canfidad terapéuticamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
31. 31 . Un método según la reivindicación 30, caracterizado porque dicho paciente está afligido con artritis reumatoide y/o osíeoartriíis.
32. 32. Un método para tralar un paciente humano afligido con una enfermedad de pulmón inflamatoria tal como asma o COPD, dicho método comprendiendo la elapa de adminisírar a dicho pacieníe una canlidad terapéuticamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
33. 33. Un método para tratar un paciente humano afligido con psoriasis, dicho método comprendiendo la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
34. 34. Un método para tratar un paciente humano afligido con un desorden o enfermedad cardiovascular tal como aterosclerosis tal método comprendiendo la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamenfe efectiva de la composición según la reivindicación 27.
35. 35. Un método para íratar un paciente humano afligido con sarcoma Karposi tal método comprendiendo la etapa de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición según la reivindicación 27.
36. 36. Uso de un anticuerpo terapéuíico o fragmento de unión de antígenq según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 en la fabricación de un medicamento para el traíamienío de una enfermedad en respuesta a modulación de la interacción entre hOSM y gp130 tal como artriíis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, asma, COPD.
37. 37. Un medicamento comprendiendo el anticuerpo terapéutico o fragmento de unión de antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
38. 38. A vector (por ejemplo, plásmido) codificando la cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo ferapéuíico o fragmento de unión de antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, por ejemplo dicho vecíor comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46.
39. 39. Un polinucleótido codificando el dominio VH de SEQ. l .D.NO: 9 dicho polinucleófido comprendiendo (o consisíiendo esencialmeníe de) SEQ. I.D.NO:17.
40. 40. Un polinucleótido codificando el dominio VL de SEQ.l.D.NO: 10, dicho polinucleótido comprendiendo (o consistiendo esencialmeníe de) SEQ.l.D.NO: 18.
41. 41. Un polinucleótido codificando la cadena pesada de SEQ.l.D.NO: 11 , dicho polinucleótido comprendiendo (o consistiendo esencialmente de) SEQ.l.D.NO: 19.
42. 42. Un polinucleóíido codificando la cadena ligera de SEQ.l.D.NO: 12, dicho polinucleófido comprendiendo (o consisfiendo esencialmeníe de) SEQ.l.D.NO: 20.
43. 43. Un polinucleófido codificando el dominio VH de SEQ.l.D.NO: 48 dicho polinucleótido comprendiendo (o consistiendo esencialmente de) SEQ.I.D.NO:54.
44. 44. Un polinucleótido codificando el dominio VL de SEQ.l.D.NO: 49, dicho polinucleótido comprendiendo (o consistiendo esencialmente de) SEQ.l.D.NO: 55.
45. 45. Un polinucleótido codificando la cadena pesada de SEQ.l.D.NO: 50, dicho polinucleótido comprendiendo (o consistiendo esencialmente de) SEQ.l.D.NO: 56.
46. 46. Un polinucleótido codificando la cadena ligera de SEQ.l.D.NO: 51 , dicho polinucleótido comprendiendo (o consisíiendo esencialmente de) SEQ.l.D.NO: 57.
47. 47. Una célula huésped recombinante establemente transfectada o transformada comprendiendo el vecfor según la reivindicación 38.
48. 48. Una célula huésped recombinanfe establemenfe fransformada o íransfectada comprendiendo un primer vecfor comprendiendo un polinucleóíido de SEQ.l .D.NO: 17 y un segundo vecfor comprendiendo un polinucleótido de SEQ. l. D.NO: 18.
49. 49. Una célula huésped recombinante establemeníe transformada o transfectada comprendiendo un primer vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ.l .D.NO: 19 y un segundo vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ. l. D. NO: 20.
50. 50. Una célula huésped recombinaníe establemente transformada o transfectada comprendiendo un primer vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ.l .D.NO: 54 y un segundo vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ. l.D.NO: 55.
51. 51 . Una célula huésped recombinante establemeníe transformada o transfectada comprendiendo un primer vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ.l .D.NO: 56 y un segundo vector comprendiendo un polinucleótido de SEQ. l. D.NO: 57.
52. 52. La célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51 , caracterizada porque dicha célula huésped es célula vertebrada.
53. 53. La célula huésped según la reivindicación 52, caracíerizada porque dicha célula es mamífera.
54. 54. La célula huésped según la reivindicación 53, caracterizada porque dicha célula es CHO o NSO.
55. 55. Un proceso para la fabricación de un anticuerpo terapéutico o comprendiendo la etapa de cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51.
56. 56. U n anticuerpo o fragmento de unión de antígeno que inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo terapéutico según la reivindicación 1 5 con OSM , particularmeníe hOSM, más paríicularmenfe Siíio II de hOSM en un ensayo a base de ELISA con la condición de que el aníicuerpo compefente no comprende un CDRH3 de SEQ. I . D. NO:42.
57. 57. Una composición farmacéutica comprendiendo el anticuerpo competenle según la reivindicación 56.
58. 58. Un método para tratar un paciente humano afligido con una enfermedad o desorden en respuesta a modulación de la interacción entre hOSM y gp130 (íal como enfermedad artrítica por ejemplo, artritis reumatoide y/o osteoaríritis) íal méíodo comprende la eíapa de administrar a dicho paciente una caníidad lerapéuticamente efectiva de la composición según la reivindicación 57.
59. 59. Uso de un anticuerpo terapéutico que une específicamente la estructura de proteína de hOSM glicosilado (tal como el anticuerpo según la reivindicación 15 o 17) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o desorden seleccionada del grupo consistiendo de; una enfermedad artrítica tal como arfriíis reumatoide, artritis de inicio juvenil, artritis psoriática, espondilitis anquilosis, psoriasis íal como enfermedad de placa crónica, enfermedad de pulmón inflamatorio tal como CO PD o asma severo, MS, demencia tal como enfermedad de Alzheimer, dolor, tal como dolor inflamatorio o neuroático, ateroesclerosis, enfermedades de regulación de ciclo celular tal como cáncer (por ejemplo, próstata), mieloma.
60. 60. Una composición farmacéutica comprendiendo un primer anticuerpo terapéulico que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Siíio II de hOSM y gp 130 y un segundo aníicuerpo terapéutico que une específicamente hOSM y modula la interacción entre Sitio II I de hOSM y OSMRß y/o LIFR.
61. 61 . U na composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo terapéutico biespecífico que une hOSM y modula la interacción entre tanfo (a) Sitio II de hOSM y gp130 como (b) Sitio I II de hOSM y OSM Rß y/o LIFR.
62. 62. Una composición farmacéutica comprendiendo al menos un primer antagonista que une hOSM y modula la interacción entre tanto (a) Sitio II de hOSM y gp1 30 como (b) Sitio I I I de hOSM y OSMRß y/o LIFR.
63. 63. U na composición farmacéutica comprendiendo al menos un primer antagonista (por ejemplo, un antagonisía proteinoso íal como un anficuerpo) que une gp130 y/o OSMRß y/o LI FR y modula la iníeracción (por ejemplo, inhibe o bloquea) la interacción entre (a) gp1 30 y hOSM y (b) OSMRß y/o LI FR y hOSM.
64. 64. U n método para seleccionar un anticuerpo que une de manera putativa OSM , particularmeníe hOSM (por ejemplo, un aníicuerpo que se ha originado coníra OSM/hOSM), íal método comprende; (a) incubar dicho anticuerpo con OSM glicosilado, particularmenfe hOSM glicosilado bajo condiciones permisivas para unión ; (b) medir la afinidad de unión de dicho anticuerpo; (c) seleccionar dicho anticuerpo si dicho anticuerpo tiene una afinidad de unión mayor a 1 uM , típicamente mayor a 100nM; (d) proporcionar un polinucleótido codificando dicho anticuerpo de la etapa (c) y transformar o transfectar una célula h uésped mamífera con un vector comprendiendo dicho polinucleótido; (e) culíivar dicha célula huésped de la etapa (d) bajo condiciones permisivas para secreción de dicho anticuerpo en el medio de cultivo; (f) purificar opcionalmente el medio de cultivo de la eíapa (e) ; (g) incorporar el anticuerpo de la etapa (e) o (f) en una composición farmacéutica.
65. 65. Un método para seleccionar un anticuerpo que une de manera putafiva OSM, particularmeníe hOSM (por ejemplo, un anticuerpo que se ha originado contra OSM/hOSM), tal método comprende; (a) incubar dicho anticuerpo con OSM glicosilado, particularmente hOSM glicosilado bajo condiciones permisivas para unión; (b) medir la afinidad de unión de dicho anticuerpo; (c) seleccionar dicho anticuerpo si dicho anticuerpo tiene una afinidad de unión mayor a 1 uM, típicamente mayor a 100 nM.
66. 66. El método según cualquiera de las reivindicaciones 64 o 65, caracterizado porque OSM se ha glicosilado por célula huésped mamífera tal como CHO.
67. 67. El método según la reivindicación 64 o 65, caracterizado porque hOSM es hOSM glicosilado nativo.
68. 68. El método según la reivindicación 67, caracterizado porque el hOSM se ha aislado del fluido sinovial de un humano, paríicularmeníe un humano afligido con una enfermedad artrífica íal como RA.
69. 69. Un anticuerpo identificado por el método según cualquiera de las reivindicaciones 65 a 68.
70. 70. Una composición farmacéutica comprendiendo el anficuerpo según la reivindicación 69 y un vehículo farmacéuticameníe ineríe.
71. 71 . Un aníicuerpo íerapéuíico según la reivindicación 1 que además de ser capaz de unir hOSM íambién es capas de unir cOSM.
72. 72. Un méíodo para delectar hOSM en una muestra biológica, particularmente fluido sinovial humano o suero humano tal método comprende utilizar un anticuerpo Sitio II I como un aníicuerpo de capíura en un ensayo a base de ELISA.
73. 73. El método según la reivindicación 72, caracterizado porque el ensayo a base de ELISA es esencialmenfe el ejemplo 16.