MXPA06010988A

MXPA06010988A - Capilares transparentes con filtro.

Info

Publication number: MXPA06010988A
Application number: MXPA06010988A
Authority: MX
Inventors: Matthew J Dejneka; Po Ki Yuen; Michael H Rasmussen
Original assignee: Corning Inc
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2007-03-21
Also published as: EP1735096A1; KR20060132009A; US20050214737A1; WO2005102528A1; JP2007530039A; CN1938093A

Abstract

Un reactor microfluidico 10 para atrapar una o mas particulas de tamano o escala de tamanos nominales predeterminados que han entrado a una entrada 12 de flujo; incluye una zona 14 transparente de reaccion que tambien sirve como una zona de deteccion in situ, donde la zona de deteccion esta arreglada de modo que sustancialmente corresponda a la forma de un detector optico 456; un filtro 16 poroso que tiene una pluralidad de perforaciones que son menores al tamano o escala de tamanos nominales de las particulas 200, esta arreglado a modo de atrapar a las particulas en la zona 14 de reaccion mientras un fluido 18 fluye desde la entrada 12 de flujo a traves de la zona 14 de reaccion y del filtro 16.

Description

CAPILARES TRANSPARENTES CON FILTRO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a dispositivos para prueba biológica de alto rendimiento, y particularmente a tubos capilares para dispositivos de prueba biológica de alto rendimiento con base en partículas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen las pruebas con base en partículas. Dentro de las pruebas con base en partículas, las reacciones biomoleculares tienen lugar ya sea en la superficie de perlas microscópicas llamadas microesferas o en barras microscópicas llamadas microbarras (los tamaños típicos están en las escalas del submicrón y del micrón). Con objeto de usar las pruebas con base en partículas para estudiar las reacciones biomoleculares, para cada reacción un número de moléculas son inmovilizadas o unidas primero a la superficie de las partículas. Estas moléculas unidas se llaman típicamente sondas. Una solución de muestra que contenga molécula(s) meta se aplica a cada platina o tubo y se mezcla con las partículas "tratadas". Una meta o un eluado que se presenta en la muestra reacciona con las moléculas sonda. En general, las moléculas meta o una molécula de referencia coexcitada con las metas en la muestra son etiquetadas con un compuesto ópticamente activo, cuya fluorescencia o luminiscencia aumenta durante la reacción entre las moléculas meta (o las moléculas de referencia) y las moléculas sonda, por ejemplo. Entonces puede realizarse un análisis cualitativo y/o cuantitativo de ia composición del fluido de muestra iluminando y escaneando ópticamente los contenidos de las platinas. En un formato de prueba múltiplex, las partículas son codificadas internamente con color, o bien son codificadas con color o patrón de reflexión diferente predefinidos, como en una tira de color de una barra de código de barras, o son sintetizadas con códigos de barra infrarrojos (IR) y espectroscópico de Raman sintetizados incorporados, de modo que puedan realizarse reacciones múltiples en un tubo o platina individuales. En este caso, hay dos fuentes de información para señalar la magnitud de la reacción biomolecular, el patrón predefinido en el interior de las partículas para identificar el tipo de reacción, y el color indicador en la superficie de las partículas. Las pruebas con base én partículas consisten típicamente de ciclos de lavado múltiples, diferentes fases de incubación, y análisis de datos. Entre otros métodos complejos, las pruebas se realizan típicamente ya sea en microcharolas con fondo de filtro, tales como las disponibles en Millipore Corporation, Bedford, MA, como parte de catálogo #MABVN-1210, o en tubos centrífugos. Cuando se usa la microcharola con fondo de filtro, los ciclos de lavado y las incubaciones se realizan en cada platina de la microcharola. El reactivo o la muestra (moléculas meta) se añade a cada platina que contiene las partículas y después de cada paso la solución es removida de las platinas vía el vacío usando un múltiple de filtración (p. ej., el # MAVM09601 del catálogo de Millipore Corporation, Bedford, MA). El lavado y la incubación se repiten hasta que la prueba esté completa. Si se usan tubos centrífugos, el lavado se realiza manualmente centrifugando primero las partículas en los tubos, seguido por la aspiración completa de la solución de los tubos, lo que se hace descendiendo suavemente una punta aspiradora (dispositivo de aspiración) en el fondo de cada tubo. Debe tenerse cuidado de no aspirar la pelotilla de la partícula. Después de la aspiración, el lavado y la incubación se repiten hasta completar la prueba. En un formato de prueba múltiplex, diferentes partículas de diferentes platinas o tubos son removidas y mezcladas n un único tubo o platina después de la primera fase de lavado e incubación. Luego se realizan los ciclos de lavado y las incubaciones adicionales para completar la prueba. En ambos enfoques, los ciclos de lavado y las incubaciones múltiples son una labor intensa y la pérdida de partícula es una afectación cuando se realizan pruebas con base en partículas. A la terminación de la prueba, para analizar el resultado, la mezcla de partículas se remueve de las platinas o de los tubos y es inyectada en un citómetro de flujo que alinea las partículas en una sola fila en la que los láseres iluminan los colores n la superficie de cada partícula. En el caso en el que hay un patrón predefinido en el interior de las partículas, se requiere un instrumento hecho a la medida (tal como un citómetro de flujo modificado) con un láser extra que ilumina el patrón dentro de las partículas para identificar el tipo de reacción. Luego, ópticos avanzados capturan las señales de color. Finalmente, un procedimiento de señal digital traslada las señales a datos cuantitativos en tiempo real para cada reacción. Alternativamente, ias partículas son aisladas y secadas a partir de la mezcla de partículas. Luego son escaneadas con un escáner y/o representadas con un microscopio óptico para el análisis de los datos. Claramente, ambas técnicas requieren manejo y transferencia adicionales de la mezcla de partículas. Esto puede conducir a la pérdida de partículas y por lo tanto puede requerirse un gran número de partículas. En la técnica de secado, es muy difícil prevenir que las partículas se apilen para formar una monocapa que afectará el análisis de los datos. En estas técnicas convencionales también se requiere un manejo complicado del fluido, lo cual no proporciona un método eficiente para preparar las partículas para la representación o el escaneo para el análisis de los datos. En el mercado hay disponibles ensambles con filtro de baja presión. Sin embargo, la principal desventaja de los productos existentes es que no son transparentes, lo que impide el análisis de los datos de las partículas a través del escaneo y la representación. También, los ensambles con filtro de baja presión están hechos de polímero, que puede no ser biocompatible y que pudiera no ser capaz de resistir el calor o los solventes. Por lo tanto, se desea una herramienta para realizar de manera conveniente las pruebas con base en partículas con una muestra mínima, una pérdida mínima de partículas o de manejo humano.

Además, las pruebas genéticas son otra área para la que está diseñada la presente invención. En un módulo de microchip con base de Plexiglás mecanizado con control numérico de computadora que comprende un calentador-enfriador hecho a la medida para el ciclado térmico, una serie de microcanales para transportar la de la sangre humana entera y los reactivos hacia a dentro y hacia afuera de un microchip de silicio de vidrio de doble propósito, se han demostrado dos pasos clave en los procedimientos de las pruebas genéticas: el aislamiento de las células y las reacciones de amplificación del ácido nucleico (Yuen et al., Genomic Research, 2001 , 11, 405-412). El aislamiento de las células y la reacción de la cadena de polimerasa (PCR, siglas en inglés) se realizaron dentro del microchip de silicio de vidrio de doble propósito que contenía una serie de filtros tipo vertedor a un tamaño de modalidad de 3.5 m, formados por una barrera de silicio grabada que atravesaba la cámara de flujo. Aunque se demostró que el módulo de microchip era una herramienta efectiva para integrar el aislamiento de las células y la PCR, se requieren pasos laboriosos para fabricar los microchips de silicio de vidrio, que deben ser fabricados en un ambiente de limpieza. También, cada componente del módulo de microchip debe ser fabricado por separado y luego ser ensamblados juntos antes del uso. Por lo tanto, sería valioso y atractivo un método alternativo para el módulo de microchip, que pueda resolver los defectos del módulo de microchip.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un reactor microfluídico para atrapar una o más partículas de tamaño o escala de tamaños nominales predeterminados que haya(n) entrado por una entrada de flujo, que incluye una zona de reacción transparente, ya que también sirve como una zona de detección in situ donde la zona de detección está arreglada de modo que corresponda en su forma a un detector óptico. Un filtro poroso que tiene una pluralidad de perforaciones que son menores que el tamaño o escala de tamaños nominales de las partículas, está arreglado de modo que atrapa las partículas en la zona de reacción mientras un fluido fluye desde la entrada del fluido hasta la zona de reacción y el filtro. En otro aspecto, la presente invención incluye la integración de una pluralidad de capilares más pequeños en un capilar mayor para formar un tubo capilar con filtro como el reactor microfluídico Otras modalidades y ventajas de la invención se establecerán en la descripción que sigue, y a partir de esa descripción serán en parte fácilmente aparentes para aquellos experimentados en la técnica, o reconocidas al practicar la invención como aquí se describe, incluyendo la siguiente descripción detallada, las reivindicaciones y los dibujos adjuntos. Debe entenderse tanto la descripción anterior como las siguientes modalidades de la descripción detallada que sigue, están diseñadas para proporcionar una visión o marco general para entender la naturaleza y el carácter de la invención como se reclama. Los dibujos adjuntos se ¡ncluyen para proporcionar una mejor comprensión de la invención, y se incorporan en, y constituyen parte de, esta especificación. Los dibujos ilustran varias modalidades de la invención, y junto con la descripción sirven para explicar los principios y operaciones de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una vista en perspectiva de una modalidad de la presente invención; la Figura 2 es una vista en sección transversal de otra modalidad del filtro 16 de la Figura 1 , de acuerdo con la invención; la Figura 3 es una vista lateral de un procedimiento para integrar el filtro 16 de la Figura 2 dentro de un tubo capilar para formar otra modalidad del reactor microfluídíco 10 de la Figura 1 , de acuerdo con la invención; la Figura 4 es un arreglo paralelo del arreglo en haz de los reactores microfluídicos 10 de la Figura 1, de acuerdo con la invención; la Figura 5 es un sistema vertical automatizado que usa el arreglo de haz de los reactores microfluídicos 10 de la Figura 4, de acuerdo con la invención; la Figura 6 es un sistema horizontal automatizado que usa el arreglo de haz de los reactores microfluídicos 10 de la Figura 4, de acuerdo con la invención; las Figuras 7-9 son representaciones de los pasos involucrados cuando se realiza un ensayo múltiplex con el tubo con filtro 10 de la Figura 1 , de acuerdo con la invención; las Figuras 10-12 son representaciones de ios pasos involucrados cuando se realiza el aislamiento de glóbulos blancos de la sangre con el tubo con filtro 10 de la Figura 1 , de acuerdo con la invención; y la Figura 13 es un esquema de un módulo de control de la temperatura para el tubo con filtro 10 de las Figuras 10-12 en una vista lateral, con el tubo con filtro 10, y una vista superior sin el tubo con filtro 10, de acuerdo con la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Ahora se hará referencia al detalle a las actuales modalidades preferidas de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se usarán los mismos números de referencia a través de los dibujos, para referirse a las mismas partes o a partes similares. En la Figura 1 se muestra una modalidad del reactor microfluídico de la presente invención, y se designe generalmente en todo con el número de referencia 10. De acuerdo con la invención, la presente invención para un método y aparato de reacción microfluídica incluye un primer elemento o paso para atrapar una o más partículas de tamaño o escala de tamaños nominales predeterminados que han entrado por una entrada 12 de flujo. Una zona 14 de transparente de reacción sirve como una zona de detección in situ, donde la zona de detección está arreglada de modo que corresponda sustancialmente en su forma a un detector óptico 456, como se representa en las Figuras 4, 5 y 6. Un filtro 16 poroso que tiene una pluralidad de perforaciones 160 que son menores al tamaño o escala de tamaños nominales de las partículas 200, está arreglado de modo que atrape a las partículas en la zona 14 de reacción mientras un fluido 18 fluye desde la entrada 12 del flujo a través de la zona 14 de reacción y el filtro 16. Como aquí se representa y se muestra en la Figura 1 , la zona 14 de reacción puede estar formada de un capilar transparente, hecho de vidrio, polímeros u otro material adecuado que pueda ser cubierto con una resistencia adecuada al solvente. Ambas superficies interior y exterior del tubo capilar pueden ser de cualesquiera formas adecuadas para proporcionar una superficie representable para un detector. Por ejemplo, puede proporcionarse un canal interno circular, cuadrado o rectangular a través de un tubo capilar para formar la zona 14 de reacción que está integrada con el filtro 16 poroso. Preferiblemente, la forma de la sección transversal del tubo capilar es o bien cuadrada o bien rectangular, tanto en el interior como en el exterior, para corresponder a la forma del detector 456 usado en las Figuras 4, 5 y 6. La ventaja de usar un tubo capilar cuadrado o rectangular en vez de un tubo capilar circular, es que las partículas pueden ser fácilmente escaneadas y representadas para el análisis de datos. Un tubo capilar rectangular con filtro, como se ve en la Figura 1 , también aumenta el área de la superficie para representar las partículas. El filtro poroso 16 se extiende lateralmente a través de la zona 14 de reacción. La entrada 12 del flujo define un eje 120 de flujo y el filtro 16 se interseca con el eje 120 de flujo de modo que se forma una cámara porosa de reacción al integrar el filtro con el capilar para proporcionar un tubo capilar con filtro o reactor microfluídico 10. Dentro del tubo capilar con filtro para proporcionar el reactor microfluídico 10, las pruebas basadas en partícula que involucran múltiples ciclos de lavado, diferentes fases de incubaciones y análisis de datos, pueden ser realizadas de manera conveniente con un mínimo de pérdida de partículas y de manejo humano. Los ejemplos de pruebas posibles con base en partículas incluyen hibridación de ADN, pruebas inmunes, actividad enzima/substrato, etc. Por simplicidad, en la Figura 1 se muestra un único tubo capilar rectangular con filtro. Dentro del tubo capilar con filtro hay dispuestas partículas 100 ó 200 miniatura de tamaño micro o nano como etiquetas 100 detectables de tamaño nano para ser usadas como un identificador para un eluado, muestra o blanco 300 o como portadores, substratos, o perlas 200 de soporte de tamaño micro para integrar un grupo funcional único o sonda 400.

Aún cuando se muestra una línea que representa el fuerte aglutinamiento ya sea de la perla 200 de soporte a la sonda 400 o de ia etiqueta 100 de tamaño nano al blanco 300, debe apreciarse que no se requiere que se forme ningún enlace químico real, sino en vez de ello puede estar presente una adsorción física para formar el aglutinamiento, en la forma de un grupo funcional, por ejemplo. Sin embargo, el grupo funcional puede ser parte de la sonda 400, del blanco 300, de la perla de soporte 200, de la etiqueta 100 de tamaño nano, o de la línea que representa su aglutinamiento. En vez de microperlas, las partículas 200 podrían también ser células, tales como células sanguíneas u otras moléculas biológicas por analizar. En este caso, el tubo capilar con filtro puede ser usado para aislar los glóbulos blancos sanguíneos de la sangre humana entera, donde los glóbulos rojos pasarán a través del filtro durante el aislamiento (Yuen et al., Genomic Research, 2001 , 11 , 405-412). Luego, puede realizarse una reacción de cadena de polimerasa (PCR) con los glóbulos blancos dentro del tubo capilar con filtro. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención está en el campo de la prueba genética para realizar el aislamiento de células y las reacciones de amplificación del ácido nucleico, como un tipo de análisis posible. Con referencia a las Figuras 10-13, las partículas, en forma de glóbulos blancos 200", son primero aislados a partir de un pequeño volumen de sangre humana entera (p. ej., menos de algunos microlitros) en el capilar con filtro 10 que contiene una serie de filtros de tamaño de representación de micrón (p. ej., de 3.5 µm) o aberturas 160 para filtrar hacia afuera los glóbulos rojos 100' más pequeños. Subsecuentemente, un blanco genómico es amplificado directamente por PCR en el ADN liberado de los glóbulos blancos aislados en la sección del filtro o en la zona 14 de reacción del capilar 10, para realizar los análisis biológicos. Esto puede lograrse primerizando primero el capilar con filtro con salina de regulador de fosfato para asegurar que no haya aire remanente dentro del capilar con filtro. Luego se inyecta un pequeño volumen de sangre humana entera dentro del capilar con filtro 10. Directamente enseguida de ia inyección de la sangre entera, se inyecta a través del capilar con filtro la mezcla de prueba PCR que contiene el blanco genético, para completar el procedimiento de aislamiento de las células. Finalmente, el capilar con filtro pasa por el ciclado térmico dentro de un módulo de control de temperatura, como con el elemento calentador 137 aplicado a la zona 14 de reacción, con cada extremo del capilar con filtro 10 sellado con un par de empaques de hule 750 para prevenir la evaporación de la mezcla de prueba PCR durante el ciclado térmico. Finalmente, el producto PCR puede ser recuperado para la detección. Las partículas 100 ó 200 son dopadas de manera uniforme o se les da un patrón espacial con diversas combinaciones de los elementos A, B, C o D de tierras raras (TR), por ejemplo, en un huésped de vidrio o cerámica para proporcionar los códigos 0, 1 , 2, 4 u 8 por ejemplo, para formar las partículas finales 200', 201 y 201 en la Figura 7 para los códigos 0, 1 y 2, respectivamente. Una barra espacialmente en tiras o con otra forma de patrón se ve como la partícula 200 marcada con 1 en la Figura 4. Los vidrios dopados de tierra rara son preferibles para las perlas portadoras, debido a sus bandas de emisión estrechas, sus altas eficiencias cuánticas, su no interferencia con las etiquetas fluorescentes comunes, y su inercia a la mayoría de los solventes orgánicos y acuosos. Las partículas 100 ó 200 pueden usarse como perlas portadoras para aglutinar con la sonda 400 o con el blanco 300, respectivamente, para la posterior detección óptica de la fluorescencia. Por lo tanto, la partícula 100 puede ser usada como una etiqueta meta de TR y la partícula 200 puede ser usada como un portador de la sonda de TR. La partícula 100 también puede usarse como una etiqueta meta de TR con una sonda convencional. Además, una etiqueta meta convencional, tal como una etiqueta de tinte molecular fluorescente, puede usarse con la partícula 200 como un portador de la probeta de TR, tal como las partículas finales 200', 201 y 202 en la Figura 7. El filtro poroso puede estar hecho de vidrio, polímeros, metal o cualquier otro material, en tanto el material sea poroso para permitir que los fluidos fluyan al través, pero que capture a las partículas. La pluralidad de perforaciones puede ser de cualquier forma, tal como rectangular, hexagonal, circular, cuadrada, etc., ya sea en un patrón o en forma aleatoria. Normalmente, el tamaño del filtro se diseña lo suficientemente pequeño para bloquear el flujo de la partícula 200 de mayor micro tamaño. Pero en otras aplicaciones, el filtro se puede hacer aún más pequeño para capturar la partícula 100 de menor nano tamaño. En lugar de ser rectangular como se muestra en la Figura 1 , el tubo capilar que forma la zona 14 de reacción puede ser circular para acomodar un filtro poroso circular. Con referencia a la Figura 2, se muestra una sección transversal de un posible filtro 16 poroso. Como aquí se representa y se muestra en la Figura 2, el filtro 16 poroso incluye una parte de una fibra microestructurada. La fibra microestructurada (p. ej., la Fibra de Cristal Fotónico de Corning con perforaciones de 20 µm) puede ser un sistema de drenado o de filtración que use cualesquiera otros tipos de microestructuras con un tamaño de perforación menor al tamaño de las partículas 200 de la Figura 1. Se usó un diámetro exterior de 525 µm como el diámetro de la fibra de cristal fotónico que tenía perforaciones con un diámetro máximo de la perforación de 20 µm, separados por un paso o espaciado de 21.4 µm para proporcionar una fracción nula de llenado o de diámetro en relación al volumen sobre el paso D/P de cerca de 0.94. El procedimiento para hacer las fibras de cristal fotónico se conoce por la inserción y el apilamiento de capilares más pequeños dentro de un tubo o manga. El paso no necesita ser regular en tanto que cada una de las perforaciones sea menor que la dimensión más pequeña de la partícula. Con referencia a la Figura 3, se muestra como un procedimiento de ejemplo un procedimiento de fundido y colapsado para fabricar un tubo capilar con filtro individual para el reactor microfluídico 10. El filtro 16 que tiene la sección transversal que se muestra en la Figura 2, es fundido dentro de un tubo capilar 140 a través de calentamiento, para proporcionar una sección del tubo capilar como la zona de reacción 14. Una pieza corta de fibra microestructurada, tal como la de la Figura 2, que es preferiblemente lo más corta posible (p. ej., < 3 mm) para reducir ia caída de presión durante la filtración, se coloca primero dentro de un tubo capilar individual. El diámetro exterior del tubo capilar circular es de cerca de 2.65 mm, con un diámetro interior de cerca de 0.54 mm. Sin embargo, las dimensiones del tubo capilar y de la fibra microestructurada pueden variar dependiendo de la aplicación. Luego, se aplica el vacío 302 a ambos extremos del tubo capilar. Enseguida, se aplica calor 304 a la superficie exterior del tubo capiiar, en ia ubicación de la fibra microestructurada. El calentamiento localizado puede realizarse usando un anillo o un que mador de forma similar para calentar el capilar de manera pareja desde todas las direcciones en las que se ubica la fibra microestructurada. Debido a la presencia de vacío, el tubo capilar se colapsará donde es calentado hasta que toque y se fusione con la superficie exterior de la fibra microestructurada. La pieza de fibra microestructurada puede ser más larga o más corta que la región colapsada. Otro método de producción es el insertar una pieza más larga de fibra microestructurada que se extendería desde uno o desde ambos extremos del tubo capilar. La fibra podría ser trazada en una o más ubicaciones, permitiendo que sea rota fácil y limpiamente después del procedimiento de colapso, dejando sólo una pieza corta fundida dentro del tubo. La presión en el interior de la fibra microestructurada podría ser puesta bajo el mismo vacío que el interior del tubo, o su presión podría ser variada. Los prototipos se fabricaron usando la Fibra de Cristal Fotónico de Corning con un diámetro exterior de 525 µm, perforaciones de 20 µm y paso de 21.4 µm, como filtro 16 fundido en el interior de un tubo capilar con un diámetro exterior de 2.65 mm y un diámetro interior de 540 µm. El tubo capilar fue colapsado usando una flama de metano/oxígeno de un puerto 12, anillo quemador de 0.79 cm y un vacío de 38 cm de mercurio, produciendo una región de colapso de 3-4 mm donde el tubo se funde con la fibra. La periferia del tubo capilar con filtro integrado puede dejarse circular o ser cortada o dársele forma de otra manera para formar un rectángulo o un cuadrado para apilar más fácilmente y/o representar más fácilmente. El prototipo del filtro capilar integrado fue probado con perlas de vidrio de 10-30 µm disponibles en Polysciences, Inc., Warrington, PA, como parte de catálogo # 07668, como partículas. El resultado indicó que es viable realizar numerosos ciclos de lavado e incubaciones con pérdida mínima de las perlas de vidrio. También, inyectando una solución en el extremo opuesto, el extremo filtrado, del tubo capilar, es posible recuperar las pérdidas de vidrio con pérdida mínima. Esto es importante cuando se realiza una prueba múltiplex en la que perlas diferentes deben ser tratadas primero por separado y luego son recuperadas y combinadas en un tubo único para posteriores lavados e incubaciones, como se ve en las Figuras 7-9. Ventajosamente, el filtro de "fibra de cristal fotónico" proporciona filtrado de alta eficiencia con presión de retorno muy baja para un desempeño alto. Además, al apilar progresivamente filtros más pequeños en serie, pueden aislarse varios tamaños de perlas para pruebas altamente multiplexadas. Con referencia a las Figuras 7-9, pueden realizarse por separado diferentes químicas y diferentes inmovilizaciones de la sonda, primero con diferentes sabores de partículas o perlas 200 de tierra rara con distintas fluorescencias, cuando se realiza una prueba múltiplex con el capilar con filtro 10. Después de terminar el paso de inmovilización de la Figura 7, las partículas son recuperadas y combinadas en un capilar con filtro 10 limpio y sin usar de la Figura 8, inyectando una solución de lavado en el extremo opuesto de cada capilar con filtro 10. Luego, puede inyectarse una solución 120 con diferentes blancos en el capilar con filtro 10 que contiene las partículas combinadas 201 , 200' y 202 en la Figura 9. Al final de la prueba, las partículas pueden ser lavadas y representadas, una partícula a la vez o la secuencia completa a la vez. Con referencia a la Figura 4, se muestra una representación simplificada de apilamiento o atado de otro tipo de tres tubos capilares con filtro individuales, que sirven cada uno como un reactor microfluídico 10 separado, actuando en una forma multiplexada. Se pueden atar juntos más tubos, pero, para simplicidad del dibujo, sólo se muestran tres. En lugar de usar el mismo reactor microfluídico 10 para las biopruebas de todas las diferentes microperlas o partículas 200, si el sistema de detección óptica no permite la detección de un arreglo así de perlas múltiples, entonces las perlas 200 pueden ser separadas en el reactor microfluídíco 10 individual en un arreglo de haz como se muestra en la Figura 4. El uso de más de un tubo capilar con filtro integrado puede proporcionar un dispositivo de de alto rendimiento de prueba basada en partículas, de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Preferiblemente, la altura interior 40 de los tubos capilares con filtro cuadrados o rectangulares debería ser menor a dos veces la altura de las partículas, de tal modo que pueda formarse solamente una monocapa de partículas en el interior de los tubos capilares cuando los tubos se atan juntos. En este caso, puede usarse una interfaz de entrada en forma de embudo para inyectar las partículas dentro dei tubo, como se ve en ias Figuras 7-9. Ei filtro en ei interior de cada tubo capilar tiene la capacidad de aislar las partículas sin ningún manejo o transferencia adicional de fluido dentro de cada uno de los tubos capilares, pero también puede adaptarse a un formato de alto rendimiento. Al eliminar así el manejo y la transferencia del fluido, las enseñanzas de la presente invención resuelven el problema asociado con la pérdida y el apilamiento de partículas, y por lo tanto se reduce el número de partículas requeridas y aumenta la calidad de los resultados representados. También la cantidad de mezcla de prueba requerida puede ser reducida de manera significativa, lo que proporciona potencialmente un gran ahorro en el costo con la reducción en el consumo de la muestra y las partículas. Con la capacidad de adaptarse a un formato de alto rendimiento, la presente invención ha traspasado la barrera del bajo rendimiento. Con referencia a las Figuras 7-9, opcionalmente puede usarse una interfaz 700 de inyección con el tubo con filtro 10, de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. La interfaz 700 de inyección puede ser una parte separada o una parte integral del tubo con filtro 10, para ayudar a proporcionar la entrada del flujo. La interfaz 700 de inyección tiene preferiblemente la forma de un embudo y puede usarse para inyectar las partículas 200 de la Figura 1 dentro de cada uno de los tubos con filtro 10, formulados por separado para formar las partículas 200', 201 y 202 que tienen diferentes químicas e inmovilizaciones. Como en la Figura 1 , el capilar con filtro 10 tiene una altura interior menor a dos veces ia altura de ias partículas 200 y preferiblemente es menor a 60 µm cuando la partícula es de cerca de 30 µm, por ejemplo. La interfaz 700 puede estar hecha de vidrio, polímero o metal.

Preferiblemente, la boca más ancha de la ¡nterfaz 700 en forma de embudo se ensancha, por ejemplo, de cerca de 0.05 mm a cerca de 5 mm para formar una entrada en forma de embudo. La interfaz 700 también incluye una manga 710 hecha de polímero, metal o cualquier otro soporte adecuado. La manga 710 tiene un polímero en el interior de una cubierta u otro material similar de modo que se forme un sello hermético al agua entre la interfaz 700 y el capilar con filtro 10 cuando el capilar con filtro 10 es conectado en la interfaz 700.

Puede usarse un sistema automatizado de dispensado del fluido, tal como el sistema que se ve en la Figura 5, para inyectar la solución 120 de partículas dentro del capilar con filtro 10. Si ias partículas 200 son apiladas en el interior de la ¡nterfaz 700, la solución 120 de partículas puede ser bombeada hacia arriba y hacia abajo para aflojar las partículas 200, hasta que las partículas 200 sean forzadas al interior del capilar con filtro 10 para formar una monocapa. Con referencia a la Figura 5, se muestra un sistema de alto rendimiento usando los tubos capilares con filtro en haz de la Figura 4. Puede resultar un sistema de alto rendimiento, arreglando los tubos capilares con filtro 10 cuadrados o rectangulares en paralelo y en una monocapa, de modo que el escaneo y la representación puedan ser realizadas convenientemente una capa a la vez. Preferiblemente, la altura interior de los tubos capilares con filtro, cuadrados o rectangulares, debería ser menor a dos veces la altura de las partículas, de modo que pueda formarse una monocapa de partículas en el interior de los tubos capilares. Así, todas las partículas de la monocapa pueden ser escaneadas y representadas simultáneamente. Sin ningún sistema complicado de manipulación fluídica, la presente invención puede ser adaptada al actual formato de microplaca. Los tubos capilares con filtro rectangulares se sujetan en un sujetador 502 reutilizable, que tiene la misma huella que las microplacas 504 estándar, para realizar la prueba. Puede usarse un sistema 506 robótico de manejo fluídico convencional, que tiene brazos robóticos para moverse en las direcciones X, Y y Z, para realizar los ciclos 509 de lavado múltiple y las incubaciones. El sujetador 502 reutilizable que tiene la misma huella que las microplacas 504 estándar, p. ej., formato de placa de platina 96, 384 y 1536, sujeta juntos a la pluralidad de tubos capilares con filtro 10, de modo que el sistema robótico existente de manejo fluídico inyecta el reactivo 508 y la muestra desde la platina 504 dentro de la entrada de flujo de los tubos capilares con filtro 10 individuales. El sujetador 502 permitirá un intercambio o reemplazo fácil y conveniente de los tubos capilares con filtro individuales, si alguno se rompe o necesita ser modificado para otra química de superficie.

Cada uno de los tubos capilares con filtro 10 es llenado con una perla 200 de soporte del portador como la partícula que preferiblemente es codificada con al menos un dopante fluorescente de tierra rara en un huésped de vidrio. Enseguida pueden realizarse numerosos ciclos de lavado 509 e incubaciones con pérdida mínima de las perlas de vidrio. Se forma una muestra disponiendo los diferentes tipos de sondas contenidas en la platina con un reactivo 508. La muestra que contiene los diferentes tipos de sondas para unir a la perla es vaciada en cada tubo para formar una mezcla de partículas. Todas las sondas en una solución en cada tubo son filtradas hacía afuera en un recipiente 510 de desperdicios. Los diferentes blancos etiquetados para aglutinar con la sonda unida en cada tubo son vaciados en cada tubo. Todos los blancos etiquetados no aglutinados en cada tubo se filtran hacia afuera. Como se ve en la Figura 4, los blancos no aglutinados o de otra forma libres asociados con sus etiquetas 100 marcadas con 3, 4 y 8, son suspendidos en la solución que fluye hacia afuera del filtro poroso. En el intermedio de cada uno de los pasos, lavado 509, secado, e incubación, pueden añadirse opcionalmente para purificar la muestra que se va a probar. A la terminación de la prueba, la mezcla de partículas puede ser inyectada directamente en un citómetro para realizar el análisis de datos. Alternativamente, la luz que brilla en la dirección hacia el papel (dirección Z) puede representar o detectar de otra forma las perlas con las sondas unidas individualmente aglutinadas con los blancos etiquetados. Los tubos se dejan alineados en paralelo, uno junto al otro, en un arreglo plano para ajustar la cabeza óptica de representación del detector en la dirección de! papel (dirección Z). En lugar de arreglar los tubos capilares con filtro en una posición vertical (Y) para la detección, una monocapa de ios tubos capilares con filtro puede yacer horizontalmente para ajustar también la cabeza óptica de representación del detector apuntando ya sea en la parte superior o en el fondo de la monocapa horizontal de tubos capilares con filtro. Con referencia a la Figura 6, se representa una vista lateral de un sistema de prueba de alto rendimiento con base en partículas para una colocación horizontal durante el escaneo y la representación de los datos. A la terminación de la prueba de la Figura 5, el sujetador que porta los tubos capilares con filtro rectangulares puede ser vuelto a los lados y los tubos 10 son cargados en un contenedor de carga del sistema automatizado de la Figura 6. La primera capa de tubos capilares con filtro rectangulares es empujada hacia arriba por un primer pistón (Paso 1 ) y un segundo pistón empuja a los tubos hacia adelante (Paso 2) hacia una banda transportadora que porta al tubo (Paso 3) hacia un sistema de análisis de datos (Paso 4). Finalmente, los tubos capilares con filtro analizados son vaciados en un contenedor de descarga para su almacenamiento (Paso 5). Opcionalmente, pueden inyectarse reactivos en los tubos capilares con filtro desde una posición horizontal mientras los filtros capilares están en la banda transportadora, si los reactivos no fluyen hacia atrás. De otra forma, o se aplicó presión de atrás, o los tubos capilares con filtro fueron ligeramente inclinados hacia abajo. Por lo tanto, puede adaptarse una interfaz para cada tubo capilar con filtro para la carga o descarga fáciles y convenientes de los reactivos y las muestras. En una configuración alterna del sistema de prueba de alto rendimiento con base en partículas, todo el sistema sería girado 90° (i.e., la Figura 6 sería la vista superior del sistema, representando la Figura 5 y el plano 456 de representación de la Figura 4, en lugar de la vista lateral, a ambos lados opuestos, un plano 456' de representación que puede ser para la parte superior o para el fondo del tubo capilar con filtro en la Figura 4). En otras palabras, los tubos capilares con filtro estarán alineados arriba y parados en una posición vertical, y la banda transportadora moverá los tubos capilares con filtro hacia el sistema de análisis de datos que está en una posición horizontal, perpendicular a los tubos capilares con filtro. Luego, si se desea, los reactivos pueden inyectarse con facilidad en los tubos capilares con filtro desde la parte superior o desde el fondo. En suma, la presente invención es un dispositivo de prueba biológica de alto rendimiento con base en partículas, para permitir que las pruebas con base en partículas se desarrollen con muestra mínima, pérdida mínima de partículas o de manejo humano, y permite que las partículas sean representadas o escaneadas a la terminación de la prueba sin ningún manejo o transferencia adicionales de fluidos. También, el análisis de datos puede realizarse dentro del dispositivo sin manejo y transferencia adicionales de fluidos. A diferencia de las tecnologías actuales que requieren sistemas complicados de manejo de fluidos para manipular las partículas, la presente invención aisla las partículas dentro del mismo dispositivo para formar una monocapa para el fácil escaneo y/o representación, y puede adaptarse a un formato de alto rendimiento. Para aquellos experimentados en la técnica será aparente que pueden hacerse diversas modificaciones y variaciones a la presente invención, sin apartarse del espíritu y de la competencia de la invención. Por lo tanto se pretende que la presente invención cubra las modificaciones y variaciones de la invención, siempre que entren en la competencia de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un reactor microfluídico para atrapar una o más partículas de tamaño o escala de tamaños nominales predeterminados, que comprende: una entrada de flujo; un capilar transparente para proporcionar una zona in situ para el análisis; y un filtro poroso integrado con el capilar transparente, teniendo el filtro una pluralidad de perforaciones definidas en el mismo, siendo las perforaciones más pequeñas que el tamaño o la escala de tamaños nominales y arregladas de modo que atrapen a las partículas en la zona de análisis mientras un fluido fluye desde la entrada de flujo a través de la zona de análisis y el filtro.

2. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el filtro se extiende lateralmente a través de la zona de análisis.

3. El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la entrada de flujo define un eje del flujo y el filtro se interseca con el eje del flujo a modo de formar una cámara porosa de reacción.

4. El aparato de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las perforaciones de la cámara porosa de reacción son sustancialmente hexagonales.

5. El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las perforaciones están definidas entre las paredes de una pluralidad de pequeños capilares, menores que el capilar transparente.

6. El aparato de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la pluralidad de pequeños capilares son sustancialmente paralelos.

7. El aparato de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el capilar transparente comprende al menos un tubo rectangular para formar una superficie plana.

8. El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el capilar transparente está hecho de vidrio.

9. El aparato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el capilar transparente está hecho de un polímero.

10. El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el capilar transparente está cubierto con una resistencia al solvente.