MXPA06009645A - Plantas que tienen elevado rendimiento, y metodo para prepararlas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para aumentar el rendimiento de las plantas, particularmente el rendimiento de las semillas, el cual consiste en introducir en una planta un acido nucleico que codifique un CDKD o una variante funcional de este. La invencion tambien proporciona las plantas transgenicas producidas por los metodos de la invencion y proporciona las construcciones utiles en los metodos de la invencion.

Description

PLANTAS QUE TIENEN ELEVADO RENDIMIENTO, Y MÉTODO PARA PREPARARLAS La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se refiere a un método para aumentar el rendimiento de las plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para aumentar el rendimiento de las plantas, particularmente el rendimiento de las semillas introduciendo en una planta un ácido nucleico que codifica una cinasa dependiente de ciclina de tipo D (CDKD) . La presente invención también se refiere a las plantas producidas por los métodos de acuerdo con la invención, cuyas plantas tienen rendimiento aumentado en relación con las plantas tipo nativas correspondientes. La invención también se refiere a las construcciones útiles en los métodos de la invención.

La población mundial cada vez más creciente y la disposición disminuida de tierra cultivable disponible para la agricultura fomentan la investigación hacia el mejoramiento de la eficiencia de la agricultura. Los medios de cultivos tradicionales y los mejoramientos hortícolas utilizan técnicas de reproducción selectivas para identificar las plantas que tienen características deseables. No obstante, estas técnicas de reproducción selectiva tienen algunas desventajas, a saber, que estas técnicas normalmente requieren de intensa mano de obra y dan como resultado plantas que muchas veces contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden producir el rasgo deseable que se quiere pasar de las plantas precursoras. Los avances en la biología molecular han permitido al hombre modificar el germen plasma de animales y plantas . La ingeniería genética de plantas supone la separación y manipulación del material genético (normalmente en forma de DNA ó RNA) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Esta tecnología tiene la capacidad de proporcionar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos económicos, agronómicos y hortícolas mejorados. Un rasgo de interés económico específico es el rendimiento. El rendimiento normalmente se define como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, la cantidad y tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de las semillas y más. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes y la tolerancia a la agresión son también factores importantes para determinar el rendimiento. Es posible aumentar el rendimiento de los cultivos haciendo óptimos los factores antes mencionados, lo cual se puede hacer modificando los mecanismos de crecimiento propios de una planta.

Los mecanismos de crecimiento propios de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de sucesos que se conocen en forma colectiva como el "ciclo celular". El avance a lo largo del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los principales componentes del ciclo celular están altamente conservados en levaduras, mamíferos y plantas. El ciclo celular normalmente se divide en las siguientes fases sucesivas: G0-G1-S-G2-M. La replicación o síntesis del DNA generalmente toma lugar durante la fase S ("S" es para la síntesis del DNA) y la segregación mitótica de los cromosomas sucede durante la fase M (la "M" es para la mitosis) , con fases de espacios intervinentes, Gl (durante las cuales las células crecen antes de la replicación del DNA) y G2 (un periodo después de la replicación del DNA durante la cual la célula se prepara para la división) . La división celular se completa después de la citocinesis, el último paso de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que están en la fase GO . En esta fase las células pueden ser estimuladas para volver a entrar en el ciclo celular . en la fase Gl . La "G" en las fases Gl, G2 y GO representa "gap". La terminación del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija durante la división celular reciba una copia completa del genoma precursor.

La división celular es regulada' por dos episodios principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del DNA y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos episodios clave es regulada por un punto de verificación representado por los complejos proteínicos específicos (involucrados en la replicación y división del DNA) . La expresión de los genes necesarios para la síntesis del DNA en el contorno Gl/S es regulada por la familia de factores de transcripción E2F en mamíferos y células vegetales (La Thangue, 1994; Muller y col., 2001; De Veylder y col., 2002) . La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un completo E2F/Rb que integra las señales y permite la activación de la transcripción de los genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por tanto, el progreso hacia el ciclo celular, es impulsado por la formación y activación de diferentes serina/treonina proteína cinasas heterodiméricas, generalmente conocidas como cinasas dependientes de ciclina (las CDK) . Una condición previa de la actividad de estas cinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo la sincronización de la activación dependiente en gran medida de la expresión de la ciclina. La unión de la ciclina induce cambios de conformación en el lóbulo N-terminal de la CDK que se asocia y contribuye a la localización y especificidad del complejo para el sustrato. Las CDK monoméricas se activan cuando estas se asocian con las ciclinas y de este modo tienen una actividad cinasa. Los niveles de la proteína ciclina varían en el ciclo celular y por tanto representan un factor primordial en la determinación de la sincronización de la activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular actúa como mediadora de la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (puntos de verificación) . Otros factores que regulan la actividad CDK incluyen inhibidores de la CDK (los CKI ó ICK, KIP, CIP, INK) , las cinasas activadoras de CDK (CAK) , la CDK fosfatasa (Cdc25) y las subunidades de la CDK (CKS) (Mironov y col., 1999, Reed 1996).

A la fecha, en las plantas han sido estudiadas dos clases principales de CDK, conocidas como las CDK tipo A y tipo B. Las CDK tipo A regulan las transiciones de Gl a S y de G2 a M, mientras que las CDK tipo B solo parecen controlar el punto de verificación G2 a M (Hemerly y col., 1995; Magyar y col., 1997; Porceddu y col., 2001). Además, se ha documentado la presencia de las CDK tipo C y cinasas activadoras de CDK (las CAK) (Magyar y col., 1997; Umeda y col., 1998; Joubés y col., 2001). Vandepoele y col., 2002, identificaron cuatro CAK mediante un método de notación basado en la homología. Estas CAK fueron las CAK tipo D (Arath; CDKD; 1, Arath; CDKD; 2 y Arath; CDKD; 3); y una CAK tipo F (Arath; CDKF; 1) .

Yamaguchi y col., (PNAS vol. 100 (13) 8019-8023, 2003) describen la sobreexpresión del cDNA de R2 de arroz (que codifica una CAK) en explantes de hojas de tabaco. Ellos documentaron que la expresión transitoria de R2 durante los primeros 7 días de cultivo activó la formación del callo en ausencia de citocinina. Yamaguchi y col., también examinaron el control de organogenesia in vitro a través de CDK.

Fabian-Marwedel y col., (The Plant Cell, vol. 14, 197-210, 2002) documentaron que el CAK del arroz, R2, regula el progreso de la fase S y la velocidad de crecimiento total en las células en suspensión.

La posibilidad de modificar el ciclo celular en una planta y con ello modificar las diferentes características de crecimiento de una planta, tendría aplicaciones en áreas como el mejoramiento de cultivos, reproducción de plantas, en la producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura, ingeniería forestal, la producción de algas para utilizarlas en bioreactores (para la producción biotecnológica de sustancias como farmacéuticos, anticuerpos o vacunas o para la bioconversión de residuos orgánicos) y otras áreas como estas.

Ahora se ha encontrado que la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifique CDKD produce plantas que tienen rendimiento aumentado en relación con las plantas tipo nativas correspondientes. Por tanto, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento en una planta, el método consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifica una CDKD.

El término "rendimiento aumentado" como se define en la presente se toma para entender un aumento de uno o más de lo siguiente, cada uno en relación con las plantas tipo nativas correspondientes: (i) biomasa aumentada (peso) de una o más partes de una planta, particularmente las partes superficiales (que se pueden cosechar) , biomasa de la raíz aumentada o biomasa aumentada de cualquiera de las demás partes que se pueden cosechar; (ii) rendimiento aumentado de las semillas, el cual puede resultar de un aumento en la biomasa de la semilla (peso de la semilla) y que puede ser un aumento en el peso de la semilla por planta o con base en una semilla individual, y cuyo aumento en el peso de la semilla puede ser debido a las dimensiones alteradas de la semilla, como puede ser. la longitud y/o ancho y/o área de la semilla; (iii) cantidad aumentada de semillas (contenidas en la cascarilla) ; (iv) tamaño aumentado de las semillas, el cual también puede influir en la composición de las semillas; (v) volumen aumentado de las semillas, el cual también puede influir en la composición de las semillas; (vi) índice de cosecha aumentado, el cual se expresa como la relación del rendimiento de las partes cosechables, como las semillas, sobre la biomasa total; y (vii) peso aumentado de mil granos (TKW) , el cual se extrapola a partir del número de semillas contenidas, contadas y su peso total. Un TKW aumentado puede resultar de un tamaño y/o densidad de semillas aumentado.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el aumento en el rendimiento comprende un aumento en el rendimiento a nivel de las semillas como se define en cualquiera de los incisos (ii) a (vii) anteriores .

Tomando como ejemplo el maíz, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: aumento en la cantidad de plantas por hectárea o acre, un aumento en la cantidad de espigas por planta, un aumento en la cantidad de filas, cantidad de granos por fila, peso de los granos, el peso de 1000 granos, longitud/diámetro de la espiga, entre otros. Tomando como ejemplo el arroz, un aumento en el rendimiento se puede manifestar por un aumento en uno o más de lo siguiente: el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, la cantidad de espiguillas por panícula, la cantidad de flores por panícula, el aumento en la velocidad de mejoramiento de las semillas, el aumento en el peso de 1000 granos, entre otros. Un aumento en el rendimiento también puede dar como resultado estructura modificada, o puede presentarse como resultado de la arquitectura modificada.

De acuerdo con una característica preferida, la eficacia de los métodos de la invención dan como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado que se manifiesta por al menos uno de lo siguiente: área aumentada sobre la superficie, aumento en el TKW, aumento en la cantidad de semillas contenidas, aumento en el peso de l s semillas y aumento en el índice de cosecha, cada uno en relación con plantas tipo nativas control o correspondientes .

La eficacia de los métodos de la invención produce ventajosamente rendimiento aumentado en cualquier planta.

El término planta" cuando se utiliza en la presente comprende plantas completas, predecesores y progenie de las plantas y partes de las plantas, como las semillas, retoños, tallos, hojas, raíces (incluidos los tubérculos) y células, tejidos y órganos de las plantas, en donde cada uno de los antes mencionados contiene el gen que interesa. El término "planta" también comprende embriones, regiones meristemáticas, garnetofitos, esporofitos, polen y microesporas, cada uno de los cuales también contiene el gen que interesa. El término planta, como se define en la presente, no incluye cultivos en suspensión y el tejido calloso.

Los métodos de la invención se pueden practicar en cualquier planta, especialmente todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen legumbres para pienso o forraje, plantas ornamentales, cultivos para alimentos, árboles o arbustos seleccionados de la lista que consiste en: Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis , Albizia amara , Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans , Astragalus cicer, Baikiaea plurij uga , Betula spp., Brassi ca spp-, Bruguiera gymnorrhiza , Burkea africana , Butea frondosa , Cadaba farinosa , Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica , Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens , Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia , Coffea arábica , Colophospermum mopane, Coronillia varia , Cotoneaster serótina , Cra taegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cya thea dealbata , Cydonia oblonga , Cryptomeria japónica , Cymbopogon spp., Cy.nt.frea dealba ta , Cydonia oblonga , Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, -Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Glircidía spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus , Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectu , Hyperthelia dissoluta, índigo incamata , Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesíi, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medícago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophonim africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix ca ar iens is , Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum satívum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, . Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata , Rhopalostylis sápida , Rhus natalensis , Ribes grossularia , Ribes spp., Robinia pseudoacacia , Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum , Sciadopitys verticillata , Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbria tus , Stiburus alopecuroídes , Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra , Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla , Vacciníum spp., Vicia spp., Vitis vinifera , Watsonia pyramidata , Zantedeschia aethiopica , Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, col, cánola, zanahoria, coliflor, apio, hojas verdes de colza, lino, berza, lenteja, colza oleaginosa, quingombó, cebolla, papa, arroz, soya, fresa, betabel, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la planta es una' planta de cultivo como soya, girasol, cánola, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa o tabaco. Además preferentemente, la planta es una planta monocotiledónea como la caña de azúcar. Más preferentemente, la planta es un cereal, como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avenas.

Los términos "CDK tipo D" ó "CDKD" se utilizan de manera indistinta en la presente y se refieren a cualquier secuencia de aminoácidos que, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético CDK, como el representado en la Figura 1, se agrupa alrededor o en un grupo que incluye los CDK tipo D, pero no otros tipos de CDK, como los CDK tipo A, B, C, E ó F. Cuando se menciona en la presente a un ácido nucleico que codifica un CDKD es a un ácido nucleico que codifica un aminoácido CDKD como se define en lo anterior.

Una persona experta en la técnica podría determinar fácilmente si alguna secuencia de aminoácidos específica entra dentro de la definición antes mencionada utilizando las técnicas y el software conocido para preparar un árbol filogenético como este, como puede ser un paquete GCG, EBI ó CLUSTAL, utilizando los parámetros predeterminados. Por la construcción de un árbol filogenético como este, las secuencias que se agrupan alrededor de o en el grupo CDK tipo D será considerado que entra dentro de la definición de un "CDK tipo T". Los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias serán útiles para efectuar los métodos de la invención.

Los CDK tipo D normalmente tienen la habilidad de fosforilar y activar las CDK y también se ha demostrado que fosforilan y activan la RNA polimerasa II. Las CDK tipo D también pueden presentar una o más y preferentemente todas las siguientes características: (i) un motivo NXTALRE, donde X es cualquier aminoácido; (ii) un dominio cinasa catalítico; y (iii) la habilidad para unirse a ciclina H.

Una CDKD puede distinguirse fácilmente de cualquier otra CDK puesto que el motivo NXTALRE es específico para este tipo de CDK (de acuerdo con el conocimiento actual) . Por el contrario, de acuerdo con el conocimiento actual, una CDK tipo A tendrá un motivo PSTAIRE, una CDK tipo B tendrá un motivo P(P/S)T (A/T) (L/M)RE; una CDK tipo C tendrá un motivo PITAIRE; una CDK tipo E tendrá un motivo SPTARE; y una CDK tipo F tendrá un motivo XSAXRE .

Un experto en la técnica puede evaluar fácilmente la actividad cinasa en, por ejemplo, sustratos purificados como CAK2 humano o en la R.NA polimerasa II carboxi terminal de Arabidopsis thaliana . La habilidad de una CDKD para unirse a ciclina H puede ser determinada fácilmente por la co-precipitación de los complejos CDKD-ciclina H a partir de la CDKD purificada y ciclina H, o utilizando un ensayo de dos híbridos.

En la Arabidopsis thaliana, las CDKD se codifican por 3 genes diferentes, CDKD; 1, CDKD; 2 y CDKD; 3, cada gen codifica una proteína que contiene el motivo NXTALRE, en donde X es cualquier aminoácido.

Ventajosamente, los métodos de la invención se pueden poner en práctica utilizando cualquier ácido nucleico que codifique una CDKD como se define en lo anterior. La introducción de un ácido nucleico que codifique CDKD en una planta proporciona la expresión modulada (preferentemente expresión aumentada) en una planta de tal ácido nucleico y/o actividad y/o niveles modulados (preferentemente aumentados) de un polipéptido CDKD en una planta. La actividad de una CDKD se puede aumentar incrementando los niveles del polipéptido. En otra versión, la actividad puede ser aumentada cuando no hay cambio en los niveles de un polipéptido CDKD, o incluso cuando exista una reducción en los niveles o concentraciones de un polipéptido CDKD. Esto puede suceder cuando se alteran las propiedades intrínsecas del polipéptido, por ejemplo, preparando versiones mutantes que sean más activas que el polipéptido tipo nativo.

El ácido nucleico que codifica una CDKD preferentemente se liga de manera operante a un promotor constitutivo para la sobreexpresión en una planta. El promotor constitutivo preferentemente es un promotor G0S2, además de preferencia un promotor G0S2 de arroz. Se debe señalar que la aplicabilidad de la presente invención no se limita al uso de una CDKD de Arabidopsis thaliana, ni a una CDK representada por la SEQ ID NO: 1, ni es la aplicabilidad de la invención limitada a la expresión de un ácido nucleico que codifica CDKD cuando es dirigida por un promotor GOS2.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, se prevé la expresión mejorada o aumentada del ácido nucleico de CDKD. Los métodos para obtener la expresión mejorada o aumentada de los genes o los productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por un promotor fuerte, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción.

El ácido nucleico que codifica una CDKD se puede obtener de cualquier origen. El ácido nucleico/gen que codifica una CDKD se puede separar de una fuente microbiana, como bacterias, hongos o levaduras, o de una planta, algas o de origen animal (incluido el humano) . Este ácido nucleico puede ser modificado de su forma natural en composición y/o un entorno genómico mediante la manipulación humana premeditada. El ácido nucleico preferentemente es un ácido nucleico homólogo, es decir, un ácido nucleico obtenido de una planta, bien sea de la misma especie de planta en la que se va a introducir o de una especie de planta diferente. El ácido nucleico puede ser obtenido de una especie dicotiledónea, preferentemente de la familia Brassicaceae, además preferentemente de Arabidopsis thaliana . Más preferentemente, el ácido nucleico que codifica CDKD se obtiene de Arabidopsis thaliana es un CDKD; 1, CDKD; 2 ó CDKD; 3. Más preferentemente, la CDKD es CDKD; 1 de Arabidopsis thaliana , particularmente la secuencia del ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos correspondiente como se representa por la SEQ ID NO: 2.

Ventajosamente, la eficacia de la presente invención no se limita al uso de un CDKD; 1 de Arabídopsís como se representa por la SEQ ID NO: 1. Los métodos de conformidad con la presente invención también se pueden practicar utilizando variantes funcionales de una CDKD como se define en lo anterior o utilizando variantes funcionales de los ácidos nucleicos que codifican la CDKD. Las variantes funcionales preferidas son variantes de la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1 o las variantes funcionales de la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2.

El término "variante funcional" como se define en la presente es una variante que entra en la definición de una CDKD como ya se definió. Preferentemente, la variante funcional también tiene la habilidad para fosforilar y activar las CDK y fosforilar y activar la RNA polimerasa II. Preferentemente, la variante funcional CDK tipo D también presenta una o más, y preferentemente todas las siguientes características: (i) un motivo NXTALRE, donde X es cualquier aminoácido; (ii) un dominio cinasa catalítica; y (iii) la habilidad para unirse a ciclina H. Una persona experta en la técnica también puede determinar fácilmente si una variante específica es funcional (en el sentido de si puede aumentar el rendimiento de la planta) simplemente sustituyendo la secuencia descrita en la sección de los ejemplos que se presenta más adelante, con la variante que se va a probar para la función.

Las secuencias de aminoácidos de ácido nucleico variantes, convenientes, útiles para practicar el método de acuerdo con la invención incluyen: (i) Porciones funcionales de un ácido nucleico que codifica CDKD; (ii) Secuencias que pueden hibridar a un ácido nucleico que codifica CDKD; (iii) Variantes de empalme alternativas de un ácido nucleico que codifica CDKD; (iv) Variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica CDKD; y (v) homólogos, derivados y fragmentos activos de un aminoácido de CDKD.

Cada una de las variantes antes mencionadas es una variante funcional, como se define en lo anterior.

Será evidente para un experto en la técnica que el uso de la secuencia de DNA que codifica CDKD de longitud completa no será una condición para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención. Los métodos de acuerdo con la invención pueden practicarse ventajosamente utilizando porciones funcionales de un DNA/ácido nucleico que codifique CDKD, preferentemente porciones funcionales en una secuencia de ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1. Una porción funcional de un ácido nucleico que codifica CDKD entra en la definición de una variante funcional como se describe en lo anterior. Una porción se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o más deleciones a un ácido nucleico que codifique CDKD, como puede ser la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, utilizando las técnicas bien conocidas en la materia.

Por tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de una planta, en particular el rendimiento de las semillas, que consiste en introducir en una planta una porción de un ácido nucleico que codifique CDKD.

Otra variante es la secuencia que puede hibridar a un ácido nucleico que codifique CDKD. Tales secuencias hibridantes son aquellas que entran en la definición de variantes funcionales como se define en lo anterior. Con particular preferencia son secuencias que pueden hibridar a un ácido nucleico que codifica CDKD en condiciones restrictivas, especialmente a un ácido nucleico que codifica CDKD como se representa por la SEQ ID NO: 1.

El término "hibridación" como se define en la presente es un proceso en donde las secuencias de nucleótidos complementarias prácticamente homologas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede presentarse completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas de la biología molecular que dependen de un proceso como este pueden ser la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los métodos que se basan en ésta) , la hibridación sustractiva, la extensión aleatoria de cebadores, la cartografía de la nucleasa SI, extensión de cebadores, transcripción inversa, síntesis del cDNA, presentación diferencial de los RNA y determinación de la secuencia del DNA. El proceso de hibridación también se puede presentar con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz como perlas magnéticas, perlas de Sepharose o cualquier otra resina. Las herramientas de la biología molecular que dependen de procesos como estos pueden ser la separación de mRNA poli (A+) . El proceso de hibridación además se puede presentar con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte sólido como una membrana de nitroc lulosa o nailon o inmovilizado por fotolitografía A, por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (este último se conoce como arreglos de ácido nucleico o micoarreglos o como chips de ácidos nucleicos) . Las herramientas de la biología molecular que dependen de un proceso como este incluyen el análisis de transferencia o absorción en gel de RNA y DNA, la hibridación de colonias, la hibridación en placa, la hibridación in situ y la hibridación de microarreglos o microalineamientos . Para permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan por calor o por medios químicos para fundir una hebra doble en dos hebras individuales y/o para eliminar orquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. Las condiciones restrictivas de la hibridación se afectan por condiciones como temperatura, concentración salina y composición del búfer de hibridación. La hibridación preferentemente ocurre en condiciones restrictivas. Las condiciones restrictivas son aquellas que: (1) emplean poca fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, búfer de fosfato de sodio 0.5 M, pH 7.2, EDTA 1 mM, pH 8.0 en 7% de SDS a 65°C ó 55°C, o (2) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con 0.1% de albúmina sérica de bovino, 0.1% de Ficoll, 0.1% de polivinilpolipirrolidona [sic] , búfer de fosfato de sodio 0.05 M a pH 6.5 con NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M a 42°C. Un ejemplo específico puede ser el uso de 50% de formamida, 5XSSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5X solución de Denhard, DNA de esperma de salmón sonicado (50 nm/mL) , 0.1% de SDS y 10% de sulfato de dextran a 55°C, con lavados a 55°C en 0.2XSSC y 0.1% SDS. Un experto puede determinar fácilmente y modificar las condiciones restrictivas adecuadamente para obtener una señal de hibridación clara y detectable.

Por tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de una planta, el cual consiste en introducir en una planta una secuencia que pueda hibridar, preferentemente en condiciones restrictivas, a un ácido nucleico que codifique CDKD.

Otra variante útil en los métodos de la invención es una variante por corte y empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica CDKD. Las variantes por corte y empalme convenientes son aquellas que entran en la definición de una variante funcional como se define en lo anterior. El término "variante por corte y empalme alternativa" cuando se utiliza en la presente comprende las variantes de un ácido nucleico en el que se han escindido, sustituido o adicionado intrones y/o exones seleccionados. Estas variantes serán aquellas en las que queda sin afectarse la actividad biológica de la proteína, lo cual se puede lograr conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Variantes de empalme como estas se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden sintetizar. Los métodos para preparar variantes de empalme como estas son bien conocidos en la materia. Las variantes de empalme de la SEQ ID NO: 1 son particularmente preferidas para utilizarlas en los métodos de acuerdo con la invención.

Por tanto, la invención también propone un método para aumentar el rendimiento de una planta, el cual consiste en introducir en una planta una variante por corte y empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica CDKD.

Otra variante útil en los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica CDKD. Las variantes alélicas adecuadas son aquellas que entran en la definición de una variante funcional como se define en lo anterior. Las variantes alélicas existen en la naturaleza y comprendido dentro de los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas comprenden Polimorfismos de un Solo Nucleótido (los SNP) , así como Polimorfismos por Inserción/Deleción Pequeña (los INDEL) . El tamaño de los INDEL normalmente es menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman una serie más grande de variantes de secuencias en cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos. Las variantes alélicas de SEQ ID NO: 1 son particularmente preferidas para utilizarlas en los métodos de conformidad con la invención.

Por tanto, la invención también proporciona un método para aumentar el rendimiento de una planta, el cual consiste en introducir en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica CDKD.

Como una ventaja más, los métodos de acuerdo con la invención también se pueden practicar utilizando fragmentos homólogos, derivados o activos de una CDKD. Los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos homólogos, derivados o activos de un aminoácido, como puede ser el representado por la SEQ ID NO: 2, se pueden detectar fácilmente utilizando técnicas de rutina bien conocidas para los expertos en la materia. Estos ácidos nucleicos convenientes para utilizarlos en los métodos de la invención se pueden determinar fácilmente como se describe en lo anterior.

"Homólogo" de una proteína comprende los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tengan sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la proteína no modificada pertinente y que tienen actividad biológica y funcional semejante a la proteína no modificada de la cual estos proceden. Para producir estos homólogos, los aminoácidos de la proteína pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan propiedades semejantes (por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, tendencia a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras en forma de lámina ß) . Las tablas de la sustitución conservativa son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company) .

Los homólogos útiles en los métodos de conformidad con la invención tienen, en orden de preferencia incrementado al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos que se representa por la SEQ ID NO: 2. Las CDK muestran alrededor de 65% de identidad entre sí y muestran menos de 40% de identidad con otras CDK. Por tanto, un homólogo que tenga por lo menos 50% de identidad con la CDK representada por la SEQ ID' NO: 2 no comprenderá ninguna otra CDK que no sea una CDK tipo D.

También comprendidas por el término "homólogos" están dos formas especiales de homología, las cuales incluyen las secuencias ortólogas y secuencias parálogas que comprenden conceptos evolutivos que se utilizan para describir relaciones ancestrales de los genes. El término "parálogo" se refiere a duplicaciones génicas dentro del genoma de una especie que da origen a genes parálogos. El término "ortólogos" se refiere a los genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral.

Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar fácilmente haciendo una búsqueda que se conoce como búsqueda blast recíproca. Esto se puede hacer mediante una primera herramienta que consiste en buscar la secuencia en cuestión (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ó la SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, como puede ser la base de datos del NCBI disponible para el público la cual se puede encontrar en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos del arroz, la secuencia en cuestión sería buscada contra, por ejemplo, los 28,469 clones de cDNA de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponible en el NCBI . Es posible utilizar la base de datos Blasón cuando se comienza de nucleótidos o TBLASTX cuando se comienza de la proteína, con valores predeterminados normales (expectativa 10, alineación 50) . Es posible filtrar los resultados de BLAST. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados entonces se regresan a la herramienta BLAST (segunda búsqueda-) • contra la secuencia que interesa (SEQ ID NO: 1 ó 2) . Los resultados de la primera y segunda búsquedas en BLAST entonces se comparan. En el caso de familias grandes, se utiliza ClustaW seguido por un árbol de unión de los alrededores para ayudar a visualizar el agrupamiento.

Un homólogo puede estar en forma de una "variante por sustitución" de una proteína, es decir, donde por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácidos ha sido retirado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de residuos individuales, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales que se imponen en el polipéptido; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos, y las deleciones abarcarán desde cerca de 1 a 20 residuos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones conservativas de aminoácidos .

Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante por inserción" de una proteína, es decir, donde uno o más residuos de aminoácidos se introducen en un lugar predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden consistir en fusiones amino terminales y/o carboxilo terminales así como inserciones intrasecuencias de un solo o múltiples aminoácidos. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de las proteínas de fusión o péptidos amino o carboxilo terminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción como se utiliza en el sistema de levadura con dos tipos de híbridos, las proteínas de la capa del fago, la (histidina) 6-etiqueta, la glutation-S-trasnferasa-etiqueta, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, el epítope Tag-100, el epítope c-myc, el epítope FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina) , el epítope HA, el epítope de la proteína C y el epítope VSV.

Los homólogos en la forma de "variantes por deleción" de una proteína se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Las variantes de aminoácidos de una proteína puede prepararse fácilmente utilizando las técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la materia, como pueden ser las síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones del DNA recombinante. Los métodos para a manipulación de las secuencias de DNA para producir variantes por sustitución, inserción o deleción de una proteína son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las técnicas para preparar mutaciones por sustitución en lugares predeterminados del DNA son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen mutagenesia M13, mutagenesia T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH) , mutagenesia dirigida al sitio Quic Change (Stratagene, San Diego, CA) , mutagenesia dirigida al sitio, teniendo como intermediaria la PCR u otros protocolos de mutagenesia dirigidas al sitio.

Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender las sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos como se encuentran en la naturaleza o que no se encuentran en la naturaleza, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. "Derivados" de una proteína comprende los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden contener residuos de aminoácidos que en forma natural pueden ser alterados, glucosilados, acilados o que no se encuentran en forma natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede contener uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual se obtiene, por ejemplo, una molécula indicadora u otro ligando, unidos en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, como puede ser una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos que no se encuentran en el estado natural en relación con la secuencia de aminoácidos de una proteína natural.

"Fragmentos activos" de una proteína CDKD comprende suficientes residuos de aminoácidos para agruparse alrededor o en el grupo CDK tipo D tras la construcción de un árbol filogenético, como puede ser el que se muestra en la Figura 1. Cuando se utilizan fragmentos en un árbol filogenético como éste, los iguales deben ser comparados con semejantes, entendiéndose que los fragmentos correspondientes de las otras CDK deben ser utilizados para preparar el árbol.

Los métodos para la búsqueda e identificación de los homólogos de las CDKD están dentro de las habilidades de una persona experta en la materia. Los métodos para la alineación de las secuencias para la comparación también son conocidos en la materia, tales métodos pueden ser GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que lleven al máximo la cantidad de apareamiento y lleve al mínimo el número de huecos. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de las secuencias y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para hacer el análisis BLAST está a la disposición al público a través del National Centre for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información de Biotecnología) . Los homólogos convenientes para utilizarlos en los métodos de la invención, es decir, aquellos que tengan por lo menos 50% de identidad de las secuencias respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, pueden ser identificados tomando las secuencias de la proteína CDK de longitud completa y alineándolas utilizando el software ClustalX1.81 utilizando parámetros predeterminados. Después, a partir de esta alineación es posible calcular una matriz de distancia utilizando el software BOXSHADE, una vez más utilizando los parámetros predeterminados. Ambos programas están a la disposición al público.

Por tanto, la invención también propone un método para aumentar el rendimiento de una planta, el cual consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique un homólogo, derivado o fragmento activo de una CDKD, como puede ser una CDKD representada por la SEQ ID NO: 2, cuyo homólogo, derivado o fragmento activo tiene un orden creciente de preferencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de las secuencias respecto a una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.

La invención también propone las construcciones y vectores genéticos para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por tanto, se proporciona una construcción génica que contiene: (i) un ácido nucleico que codifica CDKD, preferentemente como se representa por la SEQ ID NO: 1 ó una variante funcional de ésta (como ya se definió) ; (ii) una o más secuencias control capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; y como una opción (iii) una secuencia de terminación de la transcripción .

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando la tecnología del DNA recombinante bien conocida para los expertos en la materia. Las construcciones génicas pueden ser insertadas en vectores, los cuales pueden estar a la disposición en el comercio, convenientes para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen que interesa en las células transformadas .

Las plantas se transforman con un vector que contenga la secuencia que interesa (es decir, un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una variante funcional de esta (como ya se definió) ) . La secuencia que interesa se liga de manera operante a una o más secuencias control (por lo menos a un promotor) . Los términos "elemento regulador", "secuencia control" y "promotor" todas se utilizan de manera indistinta en la presente y deben tomarse en un contexto amplio para referirse a las secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales se ligan. Comprendidas por los términos antes mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción obtenidas de un gen genómico eucariótico clásico (incluida la caja TATA que se necesita para la iniciación de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteren la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulos externos, o en una forma específica de un tejido. Asimismo incluida dentro del término está una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariótico clásico,- en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de la caja -10. El término "elemento regulador" también comprende una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o intensifica la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado de manera operante" cuando se utiliza en la presente se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el 'gen que interesa, de modo que la secuencia promotora pueda indicar la transcripción del gen que interesa.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica una CDKD o una variante funcional de ésta se liga de manera operante a un promotor constitutivo. El término "promotor constitutivo" como se define en la presente se refiere a un promotor que se expresa principalmente en por lo menos un tejido u órgano y principalmente en cualquier etapa del ciclo vital de una planta. Preferentemente, el promotor constitutivo se expresa principalmente a través de la planta. Preferentemente, el promotor constitutivo es el promotor GOS2 del arroz.

Los ejemplos de otros promotores constitutivos adecuados para utilizarlos en los métodos de la invención se enlistan en la Tabla A siguiente.

Tabla A: Ejemplos de los promotores constitutivos para utilizarlos en la práctica de la invención Como una opción también es posible utilizar una o más secuencias terminadoras en la construcción que se puede introducir en una planta. El término "terminador" comprende una secuencia control que es una secuencia de DNA en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción. Los expertos en la materia tendrán conocimiento de las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser convenientes para utilizarlas en la práctica de la invención. Estas secuencias serán conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por un experto en la materia.

Las construcciones genéticas de la invención además pueden incluir una secuencia origen de replicación que se necesita para el mantenimiento y/o la replicación o reproducción en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando es necesario mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo molécula plásmido o cósmido) . Los orígenes de replicación preferidos pueden ser, pero no se limitan a, el fl-ori y colEl.

La construcción genética puede opcionalmente contener un gen marcador selectivo. Cuando se utiliza en la presente el término "gen marcador selectivo" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células las cuales son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden ser seleccionados de los marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas. Las células que contienen el DNA recombinante de este modo podrán sobrevivir en presencia de concentraciones de antibióticos o herbicidas que matarán las células no transformadas. Los ejemplos de los genes marcadores selectivos pueden ser el gen bar que proporciona resistencia al herbicida Basta; el gen npt que confiere resistencia al antibiótico canamicina; el gen hpt que confiere resistencia a higromicina. Los marcadores visuales, como la Proteína Fluorescente Verde (GFP, Haseloff y col., 1997), ß-glucuronidasa (GUS) ó luciferasa también se pueden utilizar como marcadores selectivos. Otros ejemplos de genes marcadores selectivos convenientes incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr) , el gen de resistencia a tetraciclina (Ter) , el gen bacteriano de resistencia a canamicina (Kanr) , el gen de resistencia a fosfitotricina, el gen de neomicin transferasa (nptll), el gen de resistencia a higromicina, y el gen de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) , entre otros .

La presente invención también comprende plantas que pueden obtenerse por los métodos de acuerdo con la invención. La presente invención, por tanto, proporciona las plantas que pueden obtenerse por el método de conformidad con la presente invención, cuyas plantas tienen rendimiento aumentado y cuyas plantas tienen alterada la actividad y/o los niveles de la proteína CDKD y/o alterada la expresión de un ácido nucleico que codifique una proteína CDKD en relación con las plantas tipo nativas correspondientes.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento aumentado, el cual consiste en la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica CDKD o una variante funcional de éste (como ya se definió) .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento aumentado, cuyo método consiste en: (i) introducir en una planta o una célula de planta un ácido nucleico que codifica CDKD o una variante funcional de éste (co o ya se definió) ; (ii) cultivar la célula de la planta en las condiciones que favorezcan la regeneración y crecimiento de la planta madura.

El ácido nucleico puede ser introducido directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta) . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico preferentemente se introduce en una planta por transformación .

El término "transformación" cuando se menciona en la presente comprende la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula hospedera, independientemente del método que se utilice para la transferencia. El' tejido de la planta capaz de realizar la propagación clonal subsecuente, bien sea por organogenesia o embriogenesia, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y se puede regenerar una planta completa a partir de éste. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para las especies específicas que se transformen. Los ejemplos de las dianas de tejidos incluyen los discos de las hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, mega gametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo meristemo apical, yemas auxiliares y meristemos de raíz) , y tejido meristemo inducido (por ejemplo meristemo cotiledón y meristemo hipocótilo) . El polinucleótido puede ser introducido de manera transitoria o estable en una célula hospedera y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. En otra versión, éste puede ser integrado en el genoma hospedero. La célula de la planta transformada resultante entonces se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida para los expertos en la materia.

La transformación de las especies de plantas ahora es una técnica prácticamente de rutina. Como una ventaja, cualquiera de los diferentes métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gen que interesa en una célula progenitora conveniente. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, sustancias químicas que aumentan la captación del DNA libre, inyección de DNA directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, la transformación utilizando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden ser elegidos a partir del método de calcio/polietilen glicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. y col., junio de 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación para los protoplastos (Shillito R. D. y col., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de plantas (Crossway A. y col., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185) ; bombardeo de partículas recubiertas con DNA o RNA (Klein T. M. y col., 1987, Nature 327, 70) infección con (no para integración) virus y similares. Las plantas de arroz transgénico que expresan un ácido nucleico que codifica CDKD se producen preferentemente por transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación del arroz, como se describe en cualquiera de lo siguiente: la solicitud de Patente Europea Publicada EP 1198985A1, Aldemita and Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Híei y col. Plant J. 6 (2) 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan como referencia en la presente en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishída y col. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14 (6): 745-50) o Frame y col. (Plant Physio. 2002 Mayo; 129(1): 13-22), cuyas descripciones se incorporan para referencia en la presente en su totalidad.

Por lo regular después de la transformación se seleccionan células o agrupamientos de células de las plantas por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por los genes que se pueden expresar en las plantas, co-transferidos con el gen que interesa, luego de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Luego de la transferencia y regeneración del DNA es posible evaluar las plantas putativas transformadas, por ejemplo utilizando el análisis Southern, para la presencia del gen que interesa, la cantidad de copias y/o la organización genómica. Además o de otro modo, es posible analizar los niveles de expresión del DNA recién introducido utilizando el análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas para los expertos en la materia.

Las plantas transformadas, obtenidas pueden ser propagadas por diversos medios, como puede ser por propagación clonal o las técnicas de reproducción tradicionales. Por ejemplo, una primera generación (o Tl) de planta transformada puede ser reproducida para obtener transformantes homocigoto de segunda generación (o T2) , y las plantas T2 además pueden ser propagadas por las técnicas de reproducción tradicionales.

Los organismos transformados, obtenidos, pueden tener diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras o híbridos de células transformadas y células no transformadas; los transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para que contengan el cásete de expresión) ; insertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un material de raíz transformado injertado en una yema no transformada) .

La presente invención evidentemente se amplía a cualquier célula de planta o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente, y a todas las partes de las plantas y propágulos de estas. La presente invención se amplía además para comprender la progenie de una célula, tejido, órgano o planta completa con transformación o transfección primaria que haya sido producida por cualquiera de los métodos antes mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente la(s) misma (s) característica (s) genotípica y/o fenotípica que las producidas en el precursor por los métodos de conformidad con la invención. La invención también incluye células hospederas que contienen un ácido nucleico que codifica CDKD aislado. Las células hospederas preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas. La invención también se amplía a las partes cosechables de una planta como puede ser, pero no se limita a, las semillas, hojas frutos, flores, rizomas, tubérculos y bulbos.

La presente invención también comprende el uso de ácidos nucleicos que codifican las CDKD y el uso de los polipéptidos CDKD.

Un uso como este desde luego se refiere al uso de una CDKD en el incremento del rendimiento de una planta, en particular en el aumento del rendimiento de semillas.

El rendimiento de las semillas puede incluir uno o más de lo siguiente: aumento en el contenido de las semillas, aumento en el peso de las semillas, aumento en el índice de cosecha y TKW aumentado, entre otros. La CDKD puede ser un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste como se describe en lo anterior; o la CDKD puede ser un aminoácido como se representa por la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de ésta como se describe en lo anterior.

Los ácidos nucleicos que codifican las CDKD y los polipéptidos CDKD también pueden encontrar uso en los programas de mejoramiento. La CDKD puede ser un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste como se define en lo anterior; o la CDKD puede ser un aminoácido como se representa por la SEQ ID NO: 2 una variante funcional de éste como se define en lo anterior. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica la CDKD o una variante funcional de éste puede ser en un cromosoma (o una parte de éste) , preferentemente junto con uno o más miembros relacionados de la familia. En un ejemplo de un programa de mejoramiento como este, se identifica un marcador de DNA que pueda estar genéticamente ligado a un ácido nucleico que codifique una proteína CDKD o una variante funcional de ésta. Este marcador del DNA entonces puede utilizarse en programas de mejoramiento para seleccionar plantas que tengan mayor rendimiento.

Las variantes alélícas de una CDKD también se pueden utilizar en programas de mejoramiento convencionales, como puede ser en el mejoramiento ayudado por un marcador. Estos programas de mejoramiento en ocasiones requieren de la introducción de variaciones alélicas en las plantas por tratamiento mutagénico de una planta. Un método mutagénico adecuado es mutagenesia EMS. La identificación de las variaciones alélicas entonces toma lugar, por ejemplo, por PCR. Esto es seguido por un paso de selección para seleccionar las variantes alélicas superiores de la secuencia pertinente en la que se de el rendimiento aumentado de la planta. La selección normalmente se lleva a cabo vigilando el rendimiento de las plantas que contienen las variaciones alélicas diferentes de la secuencia pertinente, por ejemplo, diferentes variaciones alélicas de la SEQ ID NO: 1. La vigilancia del rendimiento se puede hacer en un invernadero o en el campo. Otros pasos optativos pueden ser el cruzamiento de plantas, en las que se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría utilizarse, por ejemplo, para preparar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Los ácidos nucleicos que codifican las CDKD y los polipéptidos CDKD también pueden encontrar uso como reguladores del crecimiento. La CDKD puede ser un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una variante funcional de éste como se define en lo anterior; o la CDKD puede ser un aminoácido como se representa por la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de éste como se define en lo anterior. Puesto que estas CDKD son útiles en el incremento del rendimiento de las plantas, las CDKD también serían útiles reguladores de crecimiento, como herbicidas o estimuladores del crecimiento. La presente invención, por tanto, proporciona una composición que contiene una CDKD, junto con un portador conveniente, diluyente o excipiente, para uso como regulador de crecimiento.

Los métodos de conformidad con la invención también se pueden practicar sin introducir un ácido nucleico que codifique una CDKD en una planta. Esto se puede lograr introduciendo una modificación genética (preferentemente en el locus de un gen que codifica CDKD) . El locus de un gen como se define en la presente se toma para . entender una región genómica, la cual incluye el gen que interesa y 10 KB corriente arriba o debajo de la región codificante.

La modificación genética se puede introducir, por ejemplo, mediante uno (o más) de los siguientes métodos: activación TDNA, tilling, mutagenesia dirigida al sitio, recombinación homologa o, como ya se discutió en lo anterior, introduciendo y expresando en una planta (célula) un ácido nucleico que codifique CDKD.

El etiquetado de la activación de T-DNA (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353) consiste en la inserción de T-DNA que contiene normalmente un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón) , en la región genómica del gen que interesa o 10 KB corriente arriba o debajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen elegido. Normalmente la regulación de la expresión del gen elegido por su promotor natural se rompe y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor normalmente se incrusta en un T-DNA. Este T-DNA se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, por infección de Agrobacterium y da origen a la sobreexpresión de los genes cerca del T-DNA insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes por la sobreexpresión de los genes cercanos al promotor introducido. El promotor que va a ser introducido puede ser cualquier promotor que pueda dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, los promotores constitutivos, preferidos para el tejido, preferidos por el tipo de célula e inducibles son todos convenientes para utilizarlos en la activación de T-DNA.

La modificación genética también se puede introducir en el locus de un ácido nucleico/gen que codifica CDKD utlizando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes) . Esta es una técnica de mutagenesia útil para obtener y/o identificar, y finalmente separar variantes sometidos a mutagenesia de un ácido nucleico que codifica CDKD con la habilidad de presentar actividad biológica CDKD. El procedimiento TILLING combina mutagenesia de alta densidad con los métodos de tamizaje de alto rendimiento. Los pasos normalmente seguidos en el proceso TILLING son: (a) mutagenesia EMS (Redei y Koncz, 1992; Feldmann y col., 1994; Lightner y Caspar, 1998); (b) preparación del DNA y combinación de los individuos; (c) amplificación por PCR de una región que interese; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, donde se detecta la presencia de un heteroduplex en una combinación como un pico adicional en el cromatograma; (f) la identificación de individuos mutantes; y (g) la secuenciación de un producto de la PCR mutante. Los métodos para el procedimiento TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum Nat Biotechnol. Abril de 2000; 18(4): 455-7, revisado por Stemple 2004 (TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics. Nat Rev Genet. Feb 2004; 5(2) : 145-50.) ) Se puede utilizar la mutagenesia dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican CDKD. Se dispone de algunos métodos para obtener la mutagenesia dirigida al sitio, siendo los más comunes los métodos basados en la PCR (Current protocols in molecular biology. Wiley Eds. http: //www.4ulr . com/products/currentprotocols/index.html) .

La activación TDNA, el procedimiento TILLING y la mutagenesia dirigida al sitio son ejemplos de técnicas que permiten la obtención de alelos novedosos y variantes de CDKD.

La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición elegida, definida. La recombinación homologa es una técnica normalizada que se utiliza habitualmente en ciencias biológicas para organismos inferiores como levaduras y el musgo fiscomitrela. Los métodos para la recombinación homologa en plantas han sido descritos no solo para plantas modelo (Offringa y col., Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cells alter ?grrojbacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J. 1990 Oct; 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, Iida S. Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat. Biotechnol. 2002 Iida y Terada: A tale of two integrations, transgene and T-DNA: gene targeting by homologous recombination in rice. Curr. Opin Biotechnol. Abril 2004; 15(2): 132-8). El ácido nucleico que va a ser elegido (puede ser un ácido nucleico que codifica CDKD o una variante de éste como se describe en lo anterior) no necesita ser elegido para el locus de un gen que codifica CDKD, sino puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser elegido puede ser un alelo mejorado que se utilice para sustituir el gen endógeno o puede ser introducido además del gen endógeno.

Los métodos de conformidad con la presente invención dan como resultado plantas que tienen mayor rendimiento, como se describe en lo anterior. Estos efectos ventajosos del rendimiento también se pueden combinar con otras características ventajosas desde el punto de vista económico, como puede ser otros rasgos mejoradores del rendimiento, tolerancia a diferentes agresiones, rasgos que modifiquen las diferentes características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas .

Descripción de las figuras La presente invención ahora se describirá haciendo referencia a las siguientes figuras, en las cuales: La Figura 1 es un árbol que muestra las diferentes CDK de las plantas. Las secuencias de las proteínas CDK de longitud completa fueron alineadas utilizando el software "ClustalXl.81" con sus parámetros predeterminados. A partir de esta alineación se calculó un árbol que reúne a los cercanos. Utilizando el programa "ClustalXl.81" con sus parámetros predeterminados. El árbol fue dibujado utilizando el programa "drawgram" del paquete "Phylip3.5" con sus parámetros predeterminados.

La Figura 2 muestra un vector binario para la expresión en Oryza sativa del gen CDKD; 1 de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor G0S2.

La Figura 3 detalla los ejemplos de las secuencias útiles para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos La presente invención ahora será descrita haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son solo para demostración.

Manipulación del DNA: a menos que se indique de otro modo, las técnicas de DNA recombinantes se efectúan de acuerdo con los protocolos normalizados descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales normalizados y los métodos para el trabajo molecular en plantas molecular están descritos en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicad por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU) .

Ejemplo 1 : Clonación génica El gen CDKD1; 1 de Arabidopsis fue amplificado por PCR utilizando como modelo una biblioteca de cDNA de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU) . Después de a transcripción inversa del RNA extraído de las plántulas, los cDNAs fueron clonados en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio de los insertos del banco fue de 1.5 kb, y la cantidad original de clones fue de 1.59 x 107 ufe. El título original se determinó de 9.6 x 105 ufc/mL, después de la primera amplificación de 6 x 1011 ufc/mL. Después de la extracción de los plásmidos, 200 ng de modelo fueron utilizados en una mezcla de 50 µL de PCR. Para la amplificación por PCR se utilizaron cebadores prm2676 (codón de inicio, efector en negritas, sitio AttBl en itálicas: 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA - ATGGAACAGCCGAAGAAAG 3') y el prm3677 (codón de terminación, complementario, inverso en negritas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT CCTATAGGAACTCGAGATCAAGTT 3'), los cuales incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. Se hizo la PCR utilizando Hifi Taq DNA polimerasa en condiciones normales. El fragmento de la PCR de 1256 pb fue amplificad y purificado también utilizando los métodos normalizados. Luego se hizo el primer paso del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante el cual el fragmento de la PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p2777. El plásmido pDONR201 fue adquirido a Invitrogen, como parte de la técnica Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción del vector El clon de entrada p2777 posteriormente se utilizó en una reacción LR con p06040, un vector destino utilizado para la transformación de Oryza sativa . Este vector contenía dentro de los límites de T-DNA: un marcador selectivo de plantas; un marcador que podía ser filtrado; y un cásete Gateway propuesto para la recombinación LR in vivo con la secuencia que interesa ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GQS2 de arroz para la expresión constitutiva fue ubicado corriente arriba del cásete Gateway.

Después del paso de recombinación LR, el vector de expresión resultante como se muestra en la Figura 2 (CDKD1; 1::G0S2 - regulación ascendente) fue transformado en AgrOjbacteriuiO y posteriormente en plantas Oryza sativa . Las plantas de arroz transformadas se dejaron crecer y luego fueron examinadas en cuanto a los parámetros descritos en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación y resultados Se obtuvieron aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz TO independientes. Los transformantes primarios fueron transferidos de las cámaras de cultivo de tejidos a un invernadero para el crecimiento y cosecha de la semilla Tl. Se conservaron tres productos, de los cuales la progenie Tl segregó 3:1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos productos, aproximadamente 10 plántulas Tl que contenían el transgen (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas Tl carentes del transgen (nulicigotos) , fueron elegidos para supervisar la expresión visual del marcador.

Análisis estadístico: prueba t y prueba F Se utilizó el programa ANOVA (análisis de variantes) factor 2 como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de las plantas. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos _ de todas las plantas de todos los productos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para comprobar un efecto del gen sobre todos los productos de la transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto génico global. El umbral para la significación de un efecto génico global real se estableció en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor de la prueba F significativo señala un efecto génico, entendiéndose que no solo es la presencia o posición del gen el que está causando las diferencias en el fenotipo.

Para comprobar un efecto de los genes dentro de un episodio, es decir, para un efecto específico de la línea, se hizo una prueba t en cada episodio utilizando series de datos de las plantas transgénicas y las plantas nulas equivalentes. "Plantas nulas" ó "segregantes nulos" son las plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas, pero de las cuales se ha segregado el transgen. Las plantas nulas también se pueden describir como transformantes homocigotos negativos. El umbral para la significación de la prueba t fue establecido en un nivel de probabilidad de 10%. Dentro de una población de 5 productos de la transformación, algunos productos pueden estar por debajo o por encima de este umbral de la prueba t. Esto se basa en la hipótesis de que un gen puede tener solo un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la presencia de este efecto dependiente de la posición no es poco común. Esta clase de efecto génico también se conoce como un efecto de línea del gen. El valor p se obtuvo comparando el valor t con la distribución t o, de otra forma, comparando el valor F con la distribución F. El valor p entonces representa la probabilidad de que la hipótesis nula (siendo la hipótesis nula "no hay efecto del transgen"), sea correcta. 4.1 Mediciones del crecimiento vegetativo: Las plantas Tl seleccionadas (aproximadamente 10 con el transgen y aproximadamente 10 sin el transgen) fueron transferidas a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta de código de barras única para vincular de manera inequívoca los datos del fenotipo con la planta correspondiente. Las plantas Tl elegidas fueron crecidas en tierra en macetas de 10 cm de diámetro con las siguientes condiciones ambientales. Fotoperiodo = 11.5 h, intensidad de la luz diurna = 30,000 lux o más, temperatura durante el día = 28 °C o mayor, temperatura durante la noche = 22 °C, humedad relativa = 60-70%. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes fueron crecidos lado a lado en posiciones aleatorias. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez cada planta fue pasada varias veces a través de una cámara digital para procesamiento de imágenes y se tomó la imagen. En cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) se tomaron de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

Los parámetros que se describen más adelante fueron obtenidos en una forma automatizada de todas las imágenes digitales de todas las plantas, utilizando un software de análisis de imágenes. 4.1.1 Área de la planta sobre la superficie Se determinó de área de la planta sobre la superficie contando la cantidad total de píxeles de las partes de la planta sobre la superficie con discriminación del fondo. Este valor fue promediado para las imágenes tomadas en el mismo punto de tiempo, desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor físico de la superficie expresado en mm2 por calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta sobre la superficie medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta sobre el suelo. Las tres mejores líneas de la evaluación Tl fueron luego evaluadas en la ronda para T2. Los resultados de la evaluación para T2 se muestran en la Tabla 1 siguiente. Como se muestra, una de las líneas muestra un aumento estadísticamente significativo en el área sobre la superficie (con valor p de la prueba t de 0.0107) en comparación con los nulicigotos correspondientes.

Tabla 1 Cada fila corresponde a un episodio o producto, para el cual se determinó el área sobre la superficie para los transgénicos (TR) y las líneas nulas (nulo) , expresado en unidades . Se da la diferencia numérica entre las plantas positivas y las plantas negativas (dif) así como el porcentaje de la diferencia entre estas plantas (% dif) .

El valor p representa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de plantas . La última fila presenta los números promedio de todos los episodios; ahí , el valor p representa el valor p obtenido de la prueba F. 4.2 Mediciones de los parámetros relacionados con las semillas Las panículas primarias maduras fueron cosechadas, se metieron en bolsas, se etiquetaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en el horno a 37 °C. Las panículas fueron luego trilladas y todas las semillas fueron recolectadas y contadas. Las cascarillas que contenían semillas fueron separadas de las vacías utilizando un dispositivo soplador de aire. Las cascarillas vacías fueron desechadas y la fracción restante fue contada otra vez. Las cascarillas que contenían semillas fueron pesadas en una balanza analítica. Este procedimiento dio como resultado la determinación de los parámetros relacionados con las semillas que se describen más adelante. 4.2.1 Número de semillas contenidas Se determinó la cantidad de semillas contenidas contando la cantidad de cascarillas que contenían semillas y que quedaron después del paso de separación. De nuevo, tres de las mejores plantas de la evaluación Tl se tomaron para la ronda T2. Los resultados de la evaluación T2 se muestra en la Tabla 2 siguiente. Como se muestra, dos de las líneas mostraron un aumento significativo en la cantidad de semillas contenidas de las plantas transgénicas en relación con la cantidad de semillas contenidas de las plantas no transgénicas equivalentes. También hubo un efecto génico general según se concluyó por el valor p significativo de la prueba F de 0.

Tabla 2 Cada fila corresponde a un evento o producto, para el cual se determinó la cantidad de semillas contenidas para los transgénicos (TR) y las líneas nulas (nulo) , expresadas en unidades . La diferencia numérica entre las plantas positivas y las plantas negativas se da (dif) así como el porcentaje de la diferencia entre estas plantas (% dif) . El valor p representa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de planta . La última fila presenta los números promedio de todos los episodios; ahi , el valor p representa el valor p obtenido de la prueba F. 4.2.2 Rendimiento total de las semillas por planta El rendimiento total de las semillas se midió pesando toda la cascarilla contenida de semillas cosechada de una planta. De nuevo, tres de las mejores plantas de la evaluación Tl se to aron para la ronda T2. Los resultados de la evaluación T2 se muestran en la Tabla 3 siguiente. Como se muestra, dos de las líneas mostraron un aumento significativo en el peso de las semillas para las plantas transgénicas en relación con el peso de las semillas de las plantas no transgénicas equivalentes. También hubo un efecto génico general como se concluyó por el valor p significativo de la prueba F de 0.

Tabla 3 Cada fila corresponde a un episodio, para el cual se determinó el peso total de las semillas para los transgénicos (TR) y las líneas nulas (nulo) , expresado en unidades . La diferencia numérica entre las plantas positivas y las plantas negativas se da (dif) así como el porcentaj e de la diferencia entre estas plantas (% dif) . El valor p representa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de planta . La última fila presenta los números promedio de todos los episodios; ahí , el valor p representa el valor p obtenido de la prueba F. 4.2.3 índice de cosecha de las plantas El índice de cosecha en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de las semillas y el área sobre la superficie (mm2) , multiplicado por un factor 106. Tres de las mejores plantas de la evaluación Tl se tomaron para la ronda T2 y los resultados de la evaluación T2 se muestran en la Tabla 4 siguiente. Como se muestra, una línea mostró un índice de cosecha aumentado para las plantas transgénicas en relación con el índice de cosecha de las plantas no transgénicas equivalentes, con un valor p a partir de la prueba t de 0.

También fue evidente un efecto génico general con un valor p de la prueba F de 0.

Tabla 4 Cada fila corresponde a un episodio, para el cual se determinó el índice de cosecha para los transgénicos (TR) y las líneas nulas (nulo) , expresado en unidades . Se da la diferencia numérica entre las plantas positivas y las plantas negativas (dif) así como el porcentaje de la diferencia entre estas plantas (% dif) . El valor p representa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de planta . La última fila presenta los números promedio para todos los episodios; ahí , el valor p representa el valor p obtenido de la prueba F. 4.2.4 Peso de 1000 granos (TKW) Este parámetro se extrapola a partir del número de semillas contenidas, contadas, y su peso total. Tres de las mejores plantas de la evaluación Tl se tomaron para la ronda T2 y los resultados de la evaluación de T2 se muestran en la Tabla 5 siguiente. Como se muestra, una línea mostró un aumento en el TKW para las plantas transgénicas en relación con las plantas no transgénicas equivalentes, con un valor p obtenido de la prueba t de 0.0455.

Tabla 5 Cada fila corresponde a un episodio, para el cual se determinó TKW para los transgénicos (TR) y las líneas nulas (nulo) , expresado en unidades . Se da la diferencia numérica entre las plantas positivas y las plantas nega tivas (dif) así como el porcentaje de la diferencia entre estas plantas (% dif) . El valor p representa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de planta . La úl tima fila presenta los números promedio para todos los episodios ; ahí , el valor p representa el valor p obtenido de la prueba F.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para aumentar el rendimiento de las plantas en relación con plantas tipo nativas correspondientes, que consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique una Cinasa Dependiente de Ciclina tipo D (CDKD) . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el rendimiento aumentado es rendimiento de semillas aumentado. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el rendimiento aumentado se selecciona del grupo que consiste en: (i) biomasa aumentada de una o más partes de una planta; (ii) biomasa aumentada de las semillas; (iii) cantidad aumentada de las semillas (contenidas) ; (iv) tamaño aumentado de las semillas; (v) volumen aumentado de las semillas; (vi) índice de cosecha aumentado; y (vii) peso aumentado de mil granos (TKW) . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido nucleico codifica una CDKD o una variante funcional de ésta, y en donde el ácido nucleico se obtiene de una planta. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica una CDKD se representa por la SEQ ID NO: 1 o es una variante funcional de ésta y en donde el polipéptido CDKD se representa por la SEQ ID NO: 2 o es una variante funcional de ésta, cuya variante funcional se elige del grupo que consiste en: (i) Porciones de un ácido nucleico representado por la secuencia SEQ ID NO: 1; (ii) Secuencias que pueden hibridar a un ácido nucleico representado por la secuencia SEQ ID NO: 1; (iii) Variantes de empalme alternativas de un ácido nucleico representado por la secuencia SEQ ID NO: 1 ; (iv) Variantes alélicas de un ácido nucleico representado por la secuencia SEQ ID NO: 1; y (v) homólogos, derivados y fragmentos activos de un aminoácido representado por la secuencia SEQ ID NO: 2. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia del ácido nucleico que codifica una CDKD se sobreexpresa en una planta. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la expresión del ácido nucleico que codifica una CDKD es dirigida por un promotor constitutivo. Un método para la producción de una ~ planta transgénica que tiene rendimiento aumentado, cuyo método consiste en: (i) introducir en una planta o una célula de planta un ácido nucleico que codifique CDKD o una variante funcional de éste; (ii) cultivar la célula de la planta en condiciones que favorezcan la regeneración y el crecimiento de una planta madura. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el rendimiento aumentado es rendimiento aumentado de las semillas. Un método para aumentar el rendimiento de una planta, especialmente el rendimiento de las semillas, que consiste en introducir una modificación genética en una planta en el locus de un gen que codifica un polipéptido CDKD o una variante funcional de éste. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la modificación genética se efectúa mediante uno de lo siguiente: mutagenesia dirigida al sitio, recombinación homologa, TILLING y activación de T-DNA. Plantas que pueden obtenerse por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11. Una construcción que contiene: (i) un ácido nucleico que codifica CDKD, o una variante funcional de éste; (ii) una o más secuencias control que pueden impulsar la expresión de la secuencia del ácido nucleico de (i) ; y como una opción (iii) una secuencia terminadora de la transcripción. 14. La construcción de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia control es un promotor constitutivo. 15. Una planta transformada con una construcción de conformidad con la reivindicación 13 ó 14. 16. Una planta transgénica que tiene rendimiento aumentado, caracterizada porque la planta contiene un ácido nucleico aislado que codifica una CDKD o una variante funcional de ésta. 17. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 12, 15 ó 16, caracterizada porque la planta es una planta monocotiledónea, como caña de azúcar o en donde la planta es un cereal, como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avenas. 18. Las plantas cosechables de una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 15 a 17. 19. "El uso de un ácido nucleico aislado que codifica una CDKD o una variante funcional de ésta para el rendimiento aumentado, especialmente el rendimiento de las semillas. El uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el rendimiento de las semillas incluye uno o más de lo siguiente: cantidad aumentada de las semillas contenidas, peso aumentado de las semillas, índice de cosecha aumentado y TKW aumentado. El uso de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque la CDKD es un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de ésta, o en donde la CDKD es un aminoácido como se representa por SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de ésta.