MXPA06009312A

MXPA06009312A - Ligandos de proteina para receptores nkg2d y ul16 y usos de los mismos

Info

Publication number: MXPA06009312A
Application number: MXPA/A/2006/009312A
Authority: MX
Inventors: Trowsdale John; Eagle Robert; Bacon Louise
Original assignee: Cambridge University Technical Services Limited
Priority date: 2004-02-17
Filing date: 2006-08-16
Publication date: 2007-04-10

Abstract

Se identifica un nuevo miembro de la familia de RAET1/ULBP de proteínas (RAET1G)y se caracteriza y muestra que se une a los receptores UL16 y NKG2D con alta afinidad. RAET1G exhibe expresión restringida en tejidos normales pero exhibe altos niveles de expresión en tumores y se puede empalmar de forma diferencial en células de cáncer para producir una proteína soluble. También se favorece la expresión de RAET1G en enfermedades inflamatorias tal como enfermedad celíaca. Se puede usar RAET1G como un nuevo marcador para condiciones de enfermedad que incluyen condiciones de cáncer y enfermedades inflamatorias.

Description

LIGANDOS DE PROTEINA PARA RECEPTORES NKG2D Y Ü 1& Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención Esta invención se refiere a ligandos de proteina que interactúan con el receptor NKG2D de superficie celular y el ligando viral UL16.

Antecedentes de la Invención El receptor NKG2D tipo leetina, tipo C, tiene varios ligandos definidos relacionados al MHC clase I tanto en ratón como en hombre. Los ligandos murinos incluyen la familia de trascriptos 1 anticipados de ácido retinoico (Rae-1) , el antígeno H60 de histocompatibilidad menor, y el recién identificado MULTI (Cerwenka et al., (2000) Immunity 12, 721-727; Diefenbach et al., (2000) Nat. Im unol . 1, 119-126; Carayannopoulos et al. (2002), J. Immunol 169, 4079-4083). Los ligandos humanos incluyen los genes MICA y MICB relacionados a la cadena de MHC clase I (Bauer et al. (1999) Science 285, 727-729 y la familia ULBP de proteínas de unión a UL16 (Cos an et al. (2001) Immunity 14, 123-133). Las proteínas de MIC tienen tres dominios a estructuralmente similares a aquellas de las moléculas clásicas de MHC clase I, pero no se unen a péptidos ni se asocian con microglobulina ß2. La familia de H60, ULBPl-3 y REF. : 175208 el Rae-1 sólo poseen dominios ala2 tipo MHC. Las proteínas ULBP humana y Rae-1 murina son distintas de los otros ligandos de NKG2D, puesto que se fijan por GPI a la membrana, en lugar de poseer una región de transmembrana (TM) . NKG2D existe como un homodímero en la superficie celular. Diversos ligandos se unen sólo a cinco "puntos críticos" conservados dentro del sitio de unión de NKG2D (McFarland et al. Immunity (2003) 19, 803-812; McFarland et al Structure (2003) 11, 411-422. NKG2D no se limita a células NK y también se expresa en células T CD8+ activadas, células T ?d, y macrófagos activados (Jamieson et al. (2002) Immunity 17, 19-29). La expresión de los ligandos de NKG2D está pobremente entendida. Frecuentemente se expresa MIC en tumores de origen epitelial (Groh et al. (1999) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 96, 6879-6884) y el favorecimiento de la expresión de los ligandos de NKG2D en tumores puede ser un mecanismo para reconocimiento inmunitario y eliminación de células malignas. Un estudio de la susceptibilidad tumoral a la citotoxicidad de células aniquiladoras naturales dependientes de NKG2D indica que la implicación de NKG2D en la citotoxicidad mediada por células aniquiladoras naturales correlación estrictamente con la expresión y la densidad superficial de MICA y ULBP en tumores celulares objetivo de diferentes histotipos (Pende et al. (2002) Cáncer Res., 62, 6178-6186) . En modelos de ratón, las células tumorales implantadas trasfectadas con ligandos de NKG2D implicó inmunidad antitumoral potente y rechazo de células tumorales in vivo (Diefenbach et al. (2000) Nat. Immunol . 1, 119-126; Cerwenka et al. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 11521- 11526; Diefenbach et al. (2001) Nature 413, 165-171; Girardi et al. (2001) Science 294, 605-609). Los ligandos de NKG2D también pueden tener un papel en la respuesta inmunitaria a patógenos, incluyendo citomegalovirus (Groh et al. (2001) Immunol . 2, 255-260) Mycobacterium tuberculosis (Das et al. (2001) Im unity 15, 83-93 y Escherichia coli (Tieng et al. (2002) Proc. Nati. Acac . Sci. 99, 2977-2982). La función de las células NK se daña en ratones diabéticos no obesos (NOD) por la expresión de los ligandos de NKG2D en las células NK (Ogasa ara et al., (2003) I munity 18, 41-51). En artritis reumatoide, se deteriora la interacción de receptor NKG2D con sus ligandos (Groh et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100, 9452-9457). La expresión de la glicoproteína larga única (UL) 16 por citomegalovirus humano (hCMV) puede ser un mecanismo por el cual el hCMV evada el reconocimiento inmunitario al interferir con la unión de NKG2D a sus ligandos (Cosman et al. (2001) Immunity 14, 123-133; Welte et al. (2003) Eur. J. I munol. 33, 194-203). No todas las proteínas de MIC y ULBP humanas se seleccionan como objetivo. MICB, ULBPl, y ULBP2 se unen por UL16 en tanto que no lo hacen MICA y ULBP3. De manera similar, diferentes ligandos murinos tienen afinidades variables para NKG2D (Carayannopoulos et al. (2002) J. Immunol. 169, 4079-4083; O'Callaghan et al. (2001) Immunity 15, 201-211; Carayannopoulos et al (2002) Eur. J. I unol . 32, 597-605) . Las proteínas MIC y ULBP se pueden expresar independientemente entre sí en células de diferentes linajes, que también es consistente con funciones no redundantes (Pende et al. (2002) Cáncer Res. 62, 6178-6186). Varios genes relacionados a ULBP (los "transcriptos tipo RAE1" (RAETl) se han identificado en una agrupación en el cromosoma 6p24.2-q25.3 (Radosavljevic et al. (2002) Genomics 79, 114-123). Esta agrupación incluye varios genes nuevos distintos de ULBPl-3, que incluyen RAET1E (US2003/0195337) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a la identificación y caracterización de un nuevo miembro de la familia RAETl/ULBP de proteínas, llamado "RAET1G" . El RAETlG se muestra en la presente que se une a los receptores UL16 y NKG2D con una afinidad significativamente mayor que cualquiera de la familia de ULBP de proteínas reportadas hasta la fecha. Un aspecto de la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 87 % de identidad de secuencia o al menos 87 % de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la figura 1 ó la figura 2. La secuencia de aminoácidos de la figura 1 (RAETGl) tiene el número de base de datos AA022238.1, Gl: 37728026 y se codifica por la secuencia del número de base de datos AY172579.1, -Gl : 37728025. La secuencia de aminoácidos de la figura 2 (RAETG2) tiene el número de base de datos AA022239.1, Gl: 37728028 y se codifica por la secuencia del número de base de datos AY172580.1, GI:37728027. El polipéptido puede comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos de al menos 90 % de identidad o similitud . de secuencia, al menos 95 % de identidad o similitud de secuencia, o al menos 98 % de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la figura 1. En algunas modalidades preferidas, el polipéptido puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de la figura 1 y/o de la figura 2. De manera preferente, el polipéptido tiene una o más funciones de RAETlG. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a UL16 (secuencia de codificación AY297445, AY297445.1, GI:31616608; secuencia de proteína AAP55721; AAP55721.1; Gl: 31616609 y/o NKG2D (secuencia de codificación AF461811, AF461811.1, Gl: 18182679; secuencia de proteína AAL65233, AAL65233.1, Gl : 18182680) , de manera preferente con alta afinidad (es decir, 360 nM o menos) . Un ácido nucleico aislado como se describe en la presente puede compartir más de aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la figura 3 ó la figura 4, más de aproximadamente 90 %, o más de aproximadamente 95 %. El ácido nucleico puede comprender o consistir de una secuencia mostrada en la figura 3 ó la figura 4, puede ser un mutante, variante, derivado o alelo de la secuencia mostrada. La secuencia puede diferir de aquella mostrada por un cambio que es uno o más de adición, inserción, supresión y sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia mostrada. Los cambios a una secuencia de ácido nucleico pueden dar por resultado un cambio de aminoácidos a nivel de proteína, o no, como se determina por el código genético. De esta manera, un ácido nucleico puede incluir una secuencia diferente de la secuencia mostrada en la figura 3 ó en la figura 4, codificada aún para un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos . La identidad de secuencia se describe en más detalle más adelante. Un ácido nucleico de la invención puede hibridizar con la secuencia mostrada en la figura 3 y/o la figura 4 bajo condiciones severas, o puede tener un complemento que hibridiza a la secuencia mostrada en la figura 3 y/o en la figura 4 bajo condiciones severas. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, para secuencias que son aproximadamente 80-90 % idénticas; las condiciones adecuadas incluyen hibridación durante la noche a 42°C en Na2HP0, 0.25M, pH 7.2, SDS al 6.5 %, sulfato de dextrano al 10 % y un lavado final a 55°C en 0.1 X SSC, 0.1 % SDS. Para secuencias que son mayores de aproximadamente 90 % idénticas, las condiciones adecuadas incluyen hibridación durante la noche a 65°C en Na2HP04, 0.25M, pH 7.2, SDS al 6.5 %, sulfato de dextrano al 10 % y un lavado final a 60°C en 0. IX SSC, 0.1 % SDS. De manera preferente, un ácido nucleico codifica para un polipéptido con actividad de RAETlG, como se describe anteriormente . La invención también incluye fragmentos de secuencias de ácido nucleico como se describe en la presente, por ejemplo, un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la figura 3 ó la figura 4. Los fragmentos adecuados pueden consistir de menos de 891 nucleótidos, por ejemplo de 10, 20, 30, 40 ó 50 nucleótidos a 800, 870, 880 u 891 nucleótidos. Este fragmento puede codificar para un polipéptido de RAETlG como se describe más adelante, o puede ser útil como una sonda o cebador de oligonucleótido.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido aislado de RAETlG codificado por una secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de la figura 3 ó . Un polipéptido puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 y/o figura 2 o puede ser una variante, alelo, derivado o mutante de la misma. Una variante, alelo, derivado o mutante de un polipéptido de RAETlG como se describe en la presente puede incluir un polipéptido modificado al variar la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo, por manipulación del ácido nucleico que codifica para la proteína o alterar la proteína misma. Estos derivados de la secuencia de aminoácidos naturales pueden comprender uno o más de inserción, adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos, que pueden estar sin alterar fundamentalmente la actividad cualitativa del polipéptido, por ejemplo, la unión del polipéptido al receptor UL16 y/o el receptor NKG2D. Una variante, alelo, derivado o mutante puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparte más de aproximadamente 87 % de identidad de secuencia con la secuencia de la figura 1, más de aproximadamente 90 % o más de aproximadamente 95 %. La secuencia puede compartir más de aproximadamente 87 % de similitud con la secuencia de aminoácidos de la figura 1 y/o la figura 2, o más de aproximadamente 90 % de similitud. De manera preferente, una variante, alelo, derivado o mutante de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de RAETlG retiene la afinidad de unión para el receptor ULl6 y/o el receptor NKG2D. La similitud de secuencia e identidad de secuencia se definen comúnmente con referencia al algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, Wl) . GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que aumenta al máximo el número correspondencias y reduce al mínimo el número de separaciones. En general, los parámetros por defecto se usan, con una penalidad de creación de separación = 12 y una penalidad de extensión de separación = 4. El uso de GAP puede ser preferido pero se pueden usar otros algoritmos, por ejemplo, BLAST (que usa el método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati.

Acad. USA 85, 2444-2448), o el algoritmo Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147, 195-197), o el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) supra, que emplea de general parámetros por defecto. En particular, se puede usar el algoritmo de psi-Blast (Nucí. Acids Res. (1997) 25, 3389-3402) . La identidad y similitud de secuencia también se pueden determinar usando el programa GenomequestMR (Gene-IT, Worcester MA EUA) . La similitud permite la "variación conservadora" , es decir, sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina. Las variantes particulares de la secuencia de aminoácidos pueden diferir de una secuencia conocida de polipéptido • como se describe en la presente por inserción, adición, sustitución o supresión de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, o más de 50 aminoácidos. La comparación de secuencia se hace sobre la longitud completa de la secuencia pertinente descrita en la presente, excepto cuando el contexto indica otra cosa. Un polipéptido de RAET1G puede incluir un fragmento de polipéptido que consiste de menos residuos de aminoácidos que el polipéptido de longitud completa, por ejemplo, la secuencia de longitud completa de la figura 1 y/o la figura 2. Este fragmento puede consistir de al menos 110 aminoácidos, de manera preferente al menos 160 aminoácidos, de manera más preferente al menos 200 aminoácidos, de manera más preferente al menos 250 aminoácidos, de manera más preferente al menos 297 aminoácidos. Este fragmento puede consistir de 297 aminoácidos o menos, 250 aminoácidos o menos, o 160 aminoácidos o menos, o 110 aminoácidos o menos.

De manera preferente, un polipéptido como se describe en la presente comprende los dominios l y a2 que corresponden a al menos los residuos 83 a 202 en la secuencia de la figura 1 ó la figura 2. El polipéptido también puede comprender un dominio transmembrana que corresponde a al menos los residuos 227-242 en la secuencia de la figura 1 ó la figura 2, y/o un dominio citoplásmico que corresponde a al menos los residuos 243-297 o menos en la secuencia de la figura 1 ó la figura 2. Un polipéptido como se describe en la presente puede comprender además un residuo de prolina en una posición que corresponde a la posición 163 de la secuencia de aminoácidos de la figura 1 ó la figura 2. Se describen residuos de aminoácidos en la presente solicitud con referencia a su posición en la secuencia de la figura 1. Se apreciará que los residuos equivalentes en otros polipéptidos de RAETlG pueden tener una diferente posición y número, debido a las diferencias en las secuencias de aminoácidos de cada polipéptido. Estas diferencias pueden presentarse, por ejemplo, a través de variaciones en la longitud del dominio N terminal. Los residuos equivalentes en los polipéptidos de RAETlG son fácilmente reconocibles por su contexto de secuencia completa y por sus posiciones con respecto a los dominios al y a2. Un polipéptido como se describe en la presente puede ser soluble o insoluble, por ejemplo un polipéptido se puede fijar a o estar dentro de una membrana. De manera preferente, un polipéptido tiene función de RAETlG y se une con alta afinidad a un receptor UL16 y/o un receptor NKG2D. La afinidad de un polipéptido de RAETlG para un receptor UL16 y/o NKG2D se puede determinar por cualquiera de una variedad de técnicas normales, incluyendo, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial. La alta afinidad de unión a un receptor es, en general, la unión de la afinidad sub-micromolar . La unión de moderada-baja afinidad es, en general, afinidad de micromolar a decenas de afinidad micromolar. Los polipéptidos de RAETlG como se describe en la presente se unen con una afinidad comparable o de manera preferente, una mayor afinidad que la afinidad de unión de otros ligandos de NKG2D, tal como ULBPl con una afinidad para NKG2D de 1.68 µM. Un polipéptido de RAETlG también puede comprender residuos adicionales de aminoácidos que son heterólogos a la secuencia de RAETlG. Por ejemplo, un polipéptido de RAETlG como se describe anteriormente se puede incluir como parte de una proteína de fusión, donde los residuos heterólogos de aminoácidos permiten que la proteína de función tenga una función además de la afinidad de unión para los receptores UL16 y/o NKG2D. Por ejemplo, la función adicional puede proporcionar una propiedad deseada, o puede permitir que un agente con una propiedad deseada se una a la proteina de fusión. En algunas modalidades, un polipéptido de RAETlG se puede unir químicamente a una porción funcional en un conjugado. Las porciones funciones que se pueden conjugar con un polipéptido de RAETlG incluyen polipéptidos, compuestos químicos no de peptidilo, células y partículas virales. Una porción funcional puede tener, por ejemplo, actividad citotóxica o una actividad de unión. La persona experta puede usar las técnicas descritas en la presente y otras bien conocidas en la técnica para producir grandes cantidades de polipéptidos y péptidos, por ejemplo por expresión a partir de la codificación de ácido nucleico. Un método para producir un polipéptido de RAETlG puede comprender; (a) provocar la expresión de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG para producir recombinantemente el polipéptido de RAETlG; y, (b) probar el polipéptido recombinantemente producido para la actividad de RAETlG. Las secuencias adecuadas de ácido nucleico incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG como se describe anteriormente. Se puede aislar y/o purificar un polipéptido (por ejemplo, usando un anticuerpo, a manera de ejemplo) después de la producción por expresión a partir de la codificación de ácido nucleico (para lo cual ver más adelante) . De esta manera, se puede proporcionar un polipéptido libre o sustancialmente libre de contaminantes con los cuales está naturalmente asociado (si es un polipéptido que se presenta de forma natural) . Se puede proporcionar un polipéptido libre o sustancialmente libre de otros polipéptidos . Se pueden generar polipéptidos de fusión para facilitar la purificación del polipéptido de RAETlG. Por ejemplo, se pueden incorporar seis residuos de histidina en ya sea el N-término o C-término de la proteína recombinante. Se puede usar un indicador de histidina para purificación de la proteína al usar columnas comercialmente disponibles que contienen un ion metálico, ya sea níquel o cobalto (Clontech, Palo Alto, CA. EUA) . El polipéptido recombinantemente producido se puede aislar y/o probar para la actividad de RAETlG por determinación de la afinidad de unión para el receptor UL16 y/o el receptor NKG2D por incubación del polipéptido de RAETlG con el receptor y cuantificación de la afinidad de unión usando resonancia de plasmón superficial . Un ácido nucleico aislado como se describe en la presente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG, puede estar comprendido en un vector.

Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias como es apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, "fago, o fagómido", como sea apropiado. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . eds . , John Wiley & Sons, 1992. Son bien conocidos los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospedadoras . Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células eucarióticas tal como de mamífero y levadura, y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñon de hámster neonato, células COS y muchas otras. Un hospedador bacteriano, preferido, común es E. coli. Los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan una célula hospedadora que contiene ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de RAETlG como se describe anteriormente. Las células hospedadoras, en particular células hospedadoras que son células de cáncer, pueden ser útiles en el tratamiento de una condición de cáncer, por ejemplo, por estimulación de una respuesta inmunitaria a las células de cáncer en el organismo hospedador. El ácido nucleico se puede integrar en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración se puede promover por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas normales . El ácido nucleico puede estar en un vector extra-cromosómico dentro de la célula. La introducción de ácido nucleico en una célula hospedadora, que se puede referir en general (particularmente para la introducción in vitro) , sin limitación, como "transformación", puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus.

Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófago. Los genes marcadores tal como genes de sensibilidad o resistencia a antibióticos se pueden usar en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, así como se conoce en la técnica. La introducción se puede seguir al provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, al cultivarse células hospedadoras (que pueden incluir células transformadas realmente aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) bajo condiciones para la expresión del gen, de modo que se produce el polipéptido codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido guía de señal, apropiado, se puede segregar de la célula en el medio de cultivo. Después de la producción por expresión, se puede aislar un polipéptido y/o purificar de la célula hospedadora y/o medio de cultivo, como pueda ser el caso, se prueba para la actividad de RAETlG que se usa de manera subsiguiente como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ver más adelante) .

En otras modalidades, la célula hospedadora que comprende el polipéptido expresado, por ejemplo en la superficie celular, se puede aislar y/o purificar y formular en una composición farmacéutica, por ejemplo para el tratamiento de un cáncer u otra condición mediada por RAETlG. Otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que se une de manera específica a un polipéptido de RAETlG. Se pueden obtener anticuerpos usando técnicas que son normales en la técnica. Los métodos para producir anticuerpos incluyen inmunizar un mamífero (por ejemplo ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o un fragmento de la misma. Se pueden obtener anticuerpos de los animales inmunizados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, y se detectan, de manera preferente usando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de transferencia Western o por inmunoprecipitación (Armitage et al., (1992) Nature 357, 80-82). El aislamiento de los anticuerpos y/o células que producen anticuerpos a partir de un animal, se puede lograr por un paso de sacrificar el animal . Como una alternativa o complemento a inmunizar un mamífero con un péptido, se puede obtener un anticuerpo específico para una proteína a partir de una biblioteca recombinantemente producida de dominios variables expresados de inmunoglobulina, por ejemplo, usando el bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso que exhibe dominios de unión funcional de inmunoglobulina, en sus superficies; ver por ejemplo WO92/01047. La biblioteca puede ser sencilla, que se construye de secuencias obtenidas a partir de un organismo que no se ha inmunizado con ninguna de las proteínas (o fragmentos), o puede ser una construida usando secuencias obtenidas a partir de un organismo que sea expuesto al antígeno de interés. Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención se pueden modificar de varias maneras . En realidad, el término "anticuerpo" se debe considerar como que cubre cualquier sustancia de unión que tiene un dominio de unión con la especificidad requerida. De tal manera, la invención cubre fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita a aquella de un anticuerpo que le permite unirse a un antígeno o epítope. Los anticuerpos que se unen de manera específica a un polipéptido de RAETlG pueden ser por ejemplo útiles en la determinación de si un individuo tiene una condición de enfermedad tal como cáncer . Se muestra en la presente que RAETlG exhibe expresión restringida en tejidos normales pero exhibe altos niveles de expresión en tumores, en particular tumores de origen epitelial . Por lo tanto RAETlG puede ser útil como un marcador de células tumorales en la diagnosis y ordenamiento de tumores . Los datos presentados en la presente muestran que la expresión de RAETlG se incrementa en el intestino delgado en enfermedad celíaca. La expresión de RAETlG también se puede incrementar en otras enfermedades inflamatorias del intestino, _tal como enfermedad de Crohn. Un método para identificar una condición de cáncer o enfermedad inflamatoria en un individuo puede comprender: determinar la expresión de un polipéptido de RAETlG en una muestra obtenida del individuo. La expresión incrementada del polipéptido de RAETlG en la muestra de prueba con relación a controles puede ser indicativa que el individuo tiene la condición o la enfermedad. La expresión de un polipéptido de RAETlG se puede determinar al determinar la presencia o cantidad de polipéptido de RAETlG en la muestra. Se muestra en la presente que las células de cáncer se empalman de manera diferencial a transcriptos de RA?TlG para producir un polipéptido truncado de RAETlG que carece de los dominios citoplasmático y transmembrana de RAETlG (es decir, un polipéptido soluble de RAETlG) .

Un método para identificar una condición de cáncer en un individuo puede comprender:' determinar la expresión de un polipéptido soluble de RAETlG en una muestra obtenida del individuo . La expresión incrementada del polipéptido soluble de RAETlG en la muestra de prueba con relación a controles puede ser indicativa que el individuo tiene la condición o enfermedad. La expresión de un polipéptido soluble de RAETlG se puede determinar al determinar la presencia o cantidad de polipéptido. soluble de RAETlG en la muestra. Los controles adecuados son bien conocidos por aquellas personas en la • técnica y pueden incluir, por ejemplo, una muestra obtenida de un individuo saludable. La muestra obtenida de un individuo saludable se puede tomar de un individuo diferente a aquél en el cual se identifica la condición, o puede ser la muestra tomada del mismo individuo en un diferente momento. Una condición de cáncer puede incluir, por ejemplo, condiciones de leucemia tal como leucemia de células T, o cáncer epitelial, que puede incluir un cáncer del riñon, hígado, pulmón, esófago, ovario (carcinoma seroso) , piel, carcinoma endo etroide del útero y/o carcinoma escamoso del útero . Una enfermedad inflamatoria puede incluir enfermedad celíaca o enfermedad de Crohn.

La presencia o cantidad del polipéptido de RAETlG se puede determinar directamente al poner en contacto la muestra con un anticuerpo como se describe en la presente. Un polipéptido soluble de RAETlG puede comprender o consistir de los aminoácidos 1-213 de la secuencia de RAETlG de longitud completa. La muestra puede ser una muestra de biopsia de tejido, por ejemplo de tejido sospechoso- de enfermedad o malignidad, o puede ser una muestra de fluido biológico, por ejemplo de sangre, suero o plasma. Una muestra biológica puede comprender células que se pueden concentrar y/o aislar de manera opcional antes de poner en contacto con el anticuerpo . Las reactividades de los anticuerpos en una muestra se pueden determinar por cualquier medio apropiado. La marcación con moléculas indicadoras individuales es una posibilidad. Las moléculas indicadoras pueden generar directa o indirectamente señales detectables, y de manera preferente medibles . El enlace de las moléculas indicadoras puede ser directo o indirecto, covalente, por ejemplo mediante un enlace peptídico, o no covalente. El enlace mediante un enlace peptídico puede ser como resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifica para el anticuerpo y la molécula indicadora. El modo de determinar la unión no es una característica de la presente invención y aquellos expertos en la técnica son capaces de elegir un modo adecuado de acuerdo a su preferencia y conocimiento general. Por ejemplo, están disponibles una variedad de técnicas convencionales para determinar y/o cuantificar la unión del anticuerpo al polipéptido de RAETlG, incluyendo por ejemplo HPLC o ELISA. Un anticuerpo como se describe en la presenté puede ser un componente de un equipo para detectar una condición de cáncer en un individuo, usando un método como se describe en la presente. En otras modalidades, la expresión de un polipéptido soluble de RAETlG se puede determinar indirectamente al determinar el nivel de ácido nucleico que codifica para RAETlG soluble en la muestra. Un método para identificar una condición de cáncer en un individuo puede comprender; determinar la presencia o cantidad de ácido nucleico que codifica para un polipéptido soluble de RAETlG en una muestra obtenida del individuo. El ácido nucleico que codifica para un polipéptido soluble de RAETlG puede incluir un ácido nucleico que codifica para secuencia de aminoácidos de la figura 1 de la secuencia de RAETlG. Un ácido nucleico adecuado puede comprender por ejemplo, o puede consistir de la secuencia de la figura 3, o ser un alelo o variante de la misma. La presencia o cantidad de un ácido nucleico, en particular un ARN, se puede determinar por cualquier técnica conveniente, incluyendo por ejemplo, RT-PCR o transferencia Northern. La invención también abarca el uso de un polipéptido de RAETlG como se describe en la presente en un método para obtener o identificar un modulador, por ejemplo un inhibidor, de RAETlG y/o su interacción con los receptores UL16 y/o NKG2D. _Un método para obtener y/o identificar un modulador de un polipéptido de RAETlG puede comprender; (a) poner en contacto un polipéptido de RAETlG y un compuesto de prueba; y (b) determinar la interacción del polipéptido de RAETlG con el compuesto de prueba. En otras modalidades, un método para obtener y/o identificar un modulador de un polipéptido de RAETlG puede comprender; (a) poner en contacto un polipéptido .de RAETlG y un polipéptido de UL16 o NKG2D en la presencia de un compuesto de prueba; y (b) determinar la interacción entre el polipéptido de UL16 o NKG2D y el polipéptido de RAETlG. La interacción o unión se puede determinar en la presencia y ausencia del compuesto de prueba. Una diferencia en la interacción o unión en la presencia del compuesto de prueba con relación a la ausencia del compuesto de prueba puede ser indicativa que el compuesto de prueba es un modulador de la actividad de RAETlG.

Los polipéptidos se pueden poner en contacto bajo condiciones en donde, en la ausencia del compuesto de prueba, los polipéptidos se interactúan o se unen entre sí. El polipéptido de RAETlG puede estar en el medio de reacción en una forma aislada o puede estar comprendido en una membrana celular. Los métodos para obtener o identificar moduladores de RAETlG como se describe en la presente pueden ser ensayos basados en célula in vivo, o ensayos basados en célula in vi tro . En los ensayos in vi tro, el polipéptido de RAETlG se puede aislar, fijar a un soporte sólido o estar comprendido en una membrana. Los tipos celulares adecuados para los ensayos in vivo incluyen células de mamífero tal como células CHO, HeLa y COS. El formato preciso de los métodos descritos en la presente se puede variar por aquellos expertos en la técnica usando habilidad y conocimiento rutinario. No es necesario usar el RAETlG de longitud completa, los polipéptidos de UL16 o NKG2D de longitud completa, para los ensayos in vi tro o in vivo de la invención. Los fragmentos de polipéptido como se describe en la presente que retienen la actividad de la proteína de longitud completa se pueden generar y usar de cualquier manera adecuada conocida por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede estudiar in vi tro al inmovilizar ya sea el polipéptido de RAETlG o uno o ambos del receptor UL16 y NKG2D a un soporte sólido, luego ponerlo en contacto con el otro. La afinidad de unión entonces se puede determinar por técnicas normales, tal como resonancia- de plasmón superficial . El polipéptido de RAETlG o el receptor se puede marcar con una marca detectable. Las marcas detectables adecuadas incluyen 35S-metionina que' se puede incorporar en péptidos y polipéptidos recombinantemente producidos . Los péptidos y polipéptidos recombinantemente producidos también se pueden expresar como una proteína de fusión que contiene un epítope que se puede marcar con un anticuerpo . Un método descrito en la presente se puede realizar in vivo, por ejemplo en una línea celular tal como una línea de células de levadura o de mamífero en la cual los polipéptidos o péptidos pertinentes se expresan de uno o más vectores introducidos en la célula. La capacidad de un compuesto de prueba para modular la interacción entre un polipéptido de RAETlG y un polipéptido de UL16 o NKG2D se puede determinar usando un llamado ensayo de dos híbridos. Por ejemplo, un polipéptido o péptido que contiene un fragmento de un polipéptido de RAETlG o un polipéptido de UL16 o NKG2D como pueda ser el caso, o uh análogo o variante peptidílica del mismo como se describe, se puede fusionar a un dominio de unión de ácido nucleico tal como aquél del factor de transcripción de levadura, GAL 4. El factor de transcripción de GAL 4 incluye dos dominios funcionales . Estos dominios son el dominio de unión a ADN (GAL4DBD) y el dominio de activación transcripcional de GAL4 (GAL4TAD) . Al fusionar un polipéptido o péptido a uno de estos dominios y otro polipéptido o péptido a la contraparte respectiva, un factor de transcripción de GAL 4 funcional se restaura sólo cuando interactúan dos polipéptidos o péptidos de interés. De esta manera, se puede medir la interacción de los polipéptidos o péptidos por el uso de un gen indicador enlazado probablemente a un sitio de unión de ADN de GAL 4 que es capaz de la activación de la transcripción del gen indicador. Este formato de ensayo se describe en Fields y Song, 1989, Nature 340; 245-246. Este tipo de formato de ensayo se puede usar tanto en células de mamífero como en levadura. Otras combinaciones de dominio de unión de ácido nucleico y el dominio de activación transcripcional están disponibles en la técnica y se pueden preferir, tal como el dominio de unión a ADN de LexA y el dominio de activación transcripcional VP60. En algunas modalidades, el polipéptido o péptido de RAETlG, UL16 o NKG2D se puede emplear como una fusión con (por ejemplo) el dominio de unión a ADN de LexA, y la contraparte (por ejemplo) el polipéptido o péptido de UL16, NKG2D o RAETlG, como una fusión con (por ejemplo) VP60, y comprende un tercer cásete de expresión, que puede estar en un vector separado de expresión, del cual se puede expresar un péptido o una biblioteca de péptidos de secuencia aleatoria y/o diversa. Una reducción en la expresión del gen indicador (por ejemplo en el caso de ß-galactosidasa, un debilitamiento del color azul) resulta de la presencia de un péptido que interrumpe la interacción RAETlG/receptor (a manera de ejemplo) , • interacción que se requiere para la activación transcripcional del gen de ß-galactosidasa. Donde una sustancia de prueba no es un peptidilo y no se puede expresar a partir de la codificación de ácido nucleico dentro de un tercer cásete de expresión, se puede emplear un sistema similar con la sustancia de prueba suministrada de manera exógena. Cuando se realiza un ensayo de dos híbridos para buscar sustancias que interfieran con la interacción entre los dos polipéptidos o péptidos, se puede preferir usar células de mamífero en lugar de células de levadura. Los mismos principios se aplican y son bien conocidos los métodos apropiados por aquellos expertos en la técnica. Los polipéptidos de RAETlG, UL16 y/o NKG2D pueden estar presentes en y/o dentro de una célula o diferentes células. Esto' se puede lograr, por ejemplo, al expresar los polipéptidos de uno o más vectores de expresión que se han introducido en la célula por transformación. Un polipéptido de UL16 adecuado puede incluir UL16 de Citomegalovirus Humano (HCMV) (Acc No. AY297445) o una variante, homólogo, mutante, alelo o derivado del mismo. Una variante, alelo, derivado, homólogo o mutante de UL16 puede consistir de una secuencia que tiene más de aproximadamente 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de UL16 de HCMV, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 90 %, o más de aproximadamente 95 %. Un receptor NKG2D adecuado puede incluir el receptor NKG2D humano (Acc No. AF481811) o una variante, homólogo, mutante, alelo o derivado del mismo. Una variante, alelo, derivado, homólogo o mutante de NKG2D puede consistir de una secuencia que tiene más de aproximadamente 70 % de identidad de secuencia con la secuencia del receptor NKG2D de células NK humanas, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 90 %, o más de aproximadamente 95 %. La cantidad de la sustancia o compuesto de prueba que se puede adicionar a un ensayo de la invención se determinará normalmente por ensayo y error dependiendo del tipo del compuesto usado. Típicamente, se puede usar desde aproximadamente 0.001 nM a 1 mM o más concentraciones de compuesto inhibidor putativo, por ejemplo desde 0.01 nM a 100 µM, por ejemplo de 0.1 a 50 µM, tal como aproximadamente 10 µM. Cuando se emplean ensayos basados en células, la sustancia o compuesto de prueba es deseablemente permeable en membrana a fin de tener acceso al polipéptido de RAETlG. Los compuestos de prueba pueden ser compuestos químicos naturales o sintéticos usados en programas de detección de fármacos. Los extractos - de plantas que contienen varios componentes caracterizados o no caracterizados también se pueden usar. La tecnología de bibliotecas de combinación (Schultz, (1996) Biotechnol. Prog. 12, 729-743) proporciona una manera eficiente para probar un número potencialmente enorme de diferentes sustancias para la capacidad para modular la actividad de un polipéptido. Una clase de compuestos de prueba se puede derivar de los polipéptidos de RAETlG, UL16 y/o NKG2D. Los fragmentos peptídicos permeables a membrana de 5 a 40 aminoácidos, por ejemplo, de 6 a 10 aminoácidos se pueden probar para su capacidad para modular esta interacción o actividad. También se pueden generar péptidos de manera completa o parcial por síntesis química de acuerdo a métodos de síntesis de péptidos, bien establecidos, de fase líquida normal o, de manera preferente, fase sólida, las descripciones generales de las cuales están ampliamente disponibles (ver, por ejemplo, en J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984) , en M. Bodanzsky y A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984) ; y Applied Biosystems 43OA Users Manual, ABI Inc., Foster City, California). Los péptidos se pueden preparar en solución, por el método de fase líquida o por cualquier combinación de química en fase sólida, fase líquida y solución, por ejemplo al completar primero la porción peptídica respectiva y luego, si se desea, y es apropiado, después de la remoción de cualquier grupo protector que esté presente, por introducción del residuo X por reacción del ácido carbónico o sulfónico respectivo o un derivado de activo del mismo. Las propiedades moduladoras de un péptido se pueden mejorar por la adición de uno de los siguientes grupos a la terminal C: clorometil-cetona, aldehido y ácido borónico. Estos grupos son análogos de estados de transición para serina, cisteína y treonina-proteasas . El término N de un fragmento peptídico se puede bloquear con carbobencilo o inhibe aminopeptidasas y mejora la estabilidad (Proteolytic Enzymes 2nd Ed, Edited by R. Beynon y J. Bond Oxford University Press 2001) . Otros compuestos moduladores candidatos se pueden basar en el modelado de la estructura tridimensional de un polipéptido o fragmento peptídico y al usar diseño racional de fármacos para proporcionar compuestos inhibidores potenciales con forma molecular, tamaño molecular y características de carga particulares. Esto se describe en más detalle más adelante. Los anticuerpos dirigidos al polipéptido de RAETlG pueden formar una clase adicional de compuestos moduladores putativos. Los anticuerpos candidatos se pueden caracterizar y sus regiones de unión determinar para proporcionar anticuerpos de cadena individual y fragmentos de los mismos que son responsables de la modulación de la interacción. Después de la identificación de un compuesto usando un método descrito anteriormente, el compuesto se puede aislar y/o sintetizar. Un agente identificado usando una o más detecciones primarias (por ejemplo, en un sistema libre de célula) como tiene la capacidad para interactuar con RAETlG y/o un receptor, tal como UL16 o NKG2D, y/o modular la actividad de RAETlG se puede valorar o investigar adicionalmente usando una o más detecciones secundarias. La actividad biológica, por ejemplo, se puede probar en un ensayo de citotoxicidad de células NK. Los compuestos que se encuentra que modula la actividad de RAET1G se pueden probar para la actividad en la inhibición de la citotoxicidad de las células NK. Después de la identificación de un compuesto como se describe anteriormente, un método puede comprender además modificar el compuesto para optimizar las propiedades farmacéuticas del mismo .

La modificación de un compuesto "guía" identificado como biológicamente activo es un planteamiento conocido al desarrollo de productos farmacéuticos y puede ser deseable donde el compuesto activo es difícil o costoso de sintetizar o donde es inadecuado para un método particular de administración, por ejemplo, los péptidos no son bien adecuados como agentes activos para composiciones orales puesto que tienden a ser degradados rápidamente por proteasas en el canal alimentario. La modificación de un compuesto activo conocido (por ejemplo, para producir un imitador) se puede usar para evitar detectar aleatoriamente un gran número de moléculas para una propiedad objetivo. La modificación de un compuesto "guía" para optimizar sus propiedades farmacéuticas comprende comúnmente varios pasos. Primeramente, se determinan las partes particulares del compuesto que son críticas y/o importantes en la determinación de la propiedad objetivo. En el caso de un péptido, esto se puede hacer al variar sistemáticamente los residuos de aminoácidos en el péptido, por ejemplo al sustituir cada residuo a su vez. Estas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto se conocen como su "farmacoforo" . Una vez que se ha encontrado el farmacoforo, su estructura se modela de acuerdo a sus propiedades físicas, or ejemplo, estereoquímica, unión, tamaño y/o carga, usando datos de una variedad de fuentes, por ejemplo técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y RMN. El análisis por computadora, la correlación por similitud (que modela la carga y/o volumen de un farmacoforo, en lugar de la unión entre átomos) y otras técnicas se pueden usar en este proceso de modelado. En una variante de este planteamiento, se modelan la estructura tridimensional del ligando y su compañero de unión. Esto puede ser especialmente útil donde el ligando y/o compañero de unión cambian la conformación en la unión, permitiendo que el modelo tome en cuenta esto en la optimización del compuesto guía. Entonces se selecciona una molécula de plantilla en la cual se pueden insertar grupos químicos que imitan al farmacoforo. La molécula de plantilla y los grupos químicos insertados en la misma se pueden seleccionar convenientemente de modo que el compuesto modificado sea fácil de sintetizar, sea igualmente farmacológicamente aceptable, y no se degrade in vivo, en tanto que retenga la actividad biológica del compuesto guía. Los compuestos modificados encontrados por este planteamiento entonces se pueden detectar para ver si tienen la propiedad objetivo, o a qué grado lo exhiben. Los compuestos modificados incluyen productos imitadores del compuesto guía. La optimización o modificación adicional entonces se puede llevar a cabo al arribar a uno o más compuestos finales para prueba in vivo o clínica. El compuesto de prueba se puede elaborar y/o usar en la preparación, es decir, elaboración o formulación de una composición tal como un medicamento, composición farmacéutica o fármaco. Esto se puede administrar a individuos, por ejemplo para cualquiera de los propósitos analizados en otra parte de la presente. Un método de la invención puede comprender formular el compuesto de prueba en una composición farmacéutica con un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable como se analiza más adelante en la presente. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una composición farmacéutica que comprende; i) identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de RAETlG usando un método descrito en la presente; y, ii) mezclar el compuesto identificado de este modo con un portador farmacéuticamente aceptable. La formulación de composiciones con portadores farmacéuticamente aceptables se describe más delante de forma adicional . Otro aspecto de la invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, por ejemplo, para el tratamiento de una condición que se media por RAETlG, que comprende; i) identificar un compuesto que es un agonista o antagonista de un polipéptido de RAETlG, ii) sintetizar el compuesto identificado, y; iii) incorporar el compuesto en una composición farmacéutica. El compuesto identificado se puede sintetizar usando metodologías convencionales de síntesis química. Los métodos para el desarrollo y optimización de rutas de síntesis son bien conocidos por aquellos expertos en este campo . El compuesto se puede modificar y/o optimizar como se describe anteriormente. La incorporación del compuesto en una composición farmacéutica puede incluir mezclar el compuesto sintetizado con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la presente invención proporciona un modulador, por ejemplo un inhibidor, de la actividad de RAETlG, o composición que comprende este modulador, que se aisla y/u obtiene por un método descrito en la presente. Los moduladores adecuados pueden incluir entidades químicas pequeñas, fragmentos peptídicos, anticuerpos o imitadores como se describe anteriormente. Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un modulador como se describe en la presente y un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un polipéptido de RAETlG o fragmento del mismo, o un ácido nucleico que codifica un para un polipéptido de RAETlG o fragmento del mismo, o un anticuerpo, célula o un modulador, como se describe anteriormente, para el uso en el tratamiento de un cuerpo humano o animal . Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un polipéptido de RAETlG o fragmento del mismo, ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG o fragmento del mismo, anticuerpo como se describe en la presente, célula hospedadora como se describe en la presente, o un modulador obtenido por un método descrito en la presente, en la elaboración de una composición para el tratamiento de un individuo con un trastorno mediado por RAETlG . Un trastorno mediado por. RAETlG puede incluir una infección patógena, una condición de cáncer o un trastorno inmunitario . Una infección patógena puede incluir una infección bacteriana, tal como una infección por Mycobacterium tuberculosis o Escherichia coli o una infección viral, tal como una infección de citomegalovirus humano. Una condición de cáncer puede incluir cáncer de pulmón, cáncer gastrointestinal, cáncer de intestino, cáncer de colon, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de hígado, cáncer de riñon, cáncer de vesícula, cáncer pancreático, cáncer de cerebro, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma,, linfoma o leucemia. Una condición del sistema inmunitario puede incluir ' enfermedades autoinmunitarias, tal como enfermedad celíaca, artritis reumatoide, lupus, escleroderma, síndrome de Sjógren y esclerosis múltiple, diabetes o enfermedades inflamatorias del intestino tal como síndrome inflamatorio del intestino, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. También puede ser útil para pacientes quienes se han sometido a cirugía de trasplante, para reducir o prevenir el rechazo. Si es una célula, polipéptido, anticuerpo, péptido, molécula de ácido nucleico, molécula pequeña u otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo a la invención que se va a dar a un individuo, la administración es. de manera preferente en una "cantidad profilácticamente efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" (como pueda ser el caso, aunque la profilaxis se puede considerar terapia) , esto es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y curso de tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y severidad de lo que- se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones de la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos . Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o secuencial dependiendo de la condición que se va a tratar. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención, y para el uso de acuerdo con la presente invención, pueden incluir, además del ingrediente . activo, un excipiente, portador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficiencia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo líquido. Una tableta puede incluir un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen en general un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceites minerales o aceite sintético. Se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárídos o glicoles tal como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene pH adecuado, isotonicidad adecuada y estabilidad adecuada. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, o Inyección Lactada de Ringer. Se pueden incluir, como se requiera, conservadores, estabilizadores r amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos . Los aspectos de la presente invención ahora se ilustrarán con referencia a las figuras anexas descritas más adelante y ejemplificación experimental, a manera de ejemplo y no de limitación. Los aspectos y modalidades adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Todos los documentos mencionados en esta especificación se incorporan de este modo en la presente como referencia. La Figura 1 es una secuencia de aminoácidos del polipéptido de RAETlG . La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de RAETlG . La Figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de longitud completa del polipéptido de RAETlG (nucleótido 69 a 1072 de secuencia de codificación (CDS) ) . La Figura 4 muestra la secuencia del ácido nucleico que codifica para el polipéptido de RAETlG alternativamente empalmado, que consiste de los residuos 1-214 de aminoácidos de la secuencia mostrada en la figura 1 (secuencia de codificación es nt 1-642) . La Figura 5 muestra el arreglo de genes expresados en la agrupación de RAETl en el cromosoma 6q24.2-q25.3. La Figura 6 muestra un árbol filogenético de ligandos de NKG2D murinos y humanos . Los ligandos murinos se identifican por un prefijo "m" . La Figura 7 muestra una alineación de secuencia de RAETlG, ULBP2, RAETlE, y ULBP3. Las regiones TM putativas están en letras negras y están subrayadas las secuencias de péptidos de señal. Los símbolos indican a-hélice propuesta (cilindros negros) , 3?o hélice (cilindros grises) y ß-hebra (flecha gris) . La Figura 8 muestra estructuras de exones de RAETlG y RAET1G2. La Figura 9 muestra expresiones en superficie celular de proteínas de RAETl en células COS-7. De izquierda a derecha: células transíectadas en falso; células transfectadas con ULBP2 , RAETlG y RAETlE. El panel superior está teñido con el control de isotipo FITC, el panel inferior con el anticuerpo anti-indicador. La Figura 10 muestra un histograma que denota las células transfectadas teñidas con anticuerpo anti-indicador; cél las solamente (línea negra sólida) , ULBP2 (línea gris sólida) , RAETlG (línea gris punteada) y RAETlE (línea negra punteada) . La Figura 11 muestra la unión de células Fc-NKG2D a RAETl expresado en superficie en células COS-7. De izquierda a derecha, células transfectadas en falso, . células transfectadas con ULBP2 , RAETlG y RAETlE . El panel superior está teñido con control de isotipo FITC, panel inferior con NKG2D-FC-anti-humano Fc-FITC . La Figura 12 muestra un histograma que denota células transfectadas teñidas con NKG2D; células únicamente (línea negra sólida) , ULBP2 (línea gris sólida) , RAETlG (línea gris punteada) y RAETlE (línea negra punteada) . La Figura 13 muestra el % de lisis específica de células COS-7 transfectadas con nuevas moléculas de RAETl a diferentes relaciones de efector : objetivo . Las células transfectadas se incubaron con ya sea linfocitos aniquiladores humanos CD3" CD56+ NKG2D+ (cuadrados negros) , o linfocitos aniquiladores humanos CD3" CD56+ NKG2D+ y anticuerpo monoclonal específico de NKG2D (círculos abiertos) . RAETlE, panel superior; RAETlG, panel intermedio; vector únicamente, panel de fondo.

La Figura 14a-14d muestra gráficas BIACore en análisis cinético. Los paneles a y b muestran la unión de RAETlG y RAETlE a NKG2D-FC respectivamente, a las diluciones como se muestra. Los paneles c y d, muestran la unión de RAETlG y RAETlE a UL16-FC La Tabla 1 muestra los datos de unión cinética para proteínas RAET1/ULBP humanas que se unen a NKG2D y UL16. La Tabla 2 muestra una compilación de los datos publicados para ligandos NKG2D murinos y humanos . La Tabla 3 muestra la composición de los microarreglos de tejido. El número de muestras donadoras se muestra en paréntesis. La Tabla 4 muestra la distribución de la tinción de RAETlG en tejidos tumorales.

Parte experimental Materiales y Métodos Clonación molecular de la familia de ULBP El extremo 5' de RAETlG se predijo por alineación de las secuencias de EST, AW510737, BE711112, BF513861 y el ADN genómico (contig NT_023451.10) . La secuencia prevista correspondió con dos clones IMAGE 3070730 y 2911855. El clon IMAGE 3070730 tuvo un extremo 3' truncado y tenía ausente el codón finalizador. El extremo 3' correcto se predijo de EST AA583860 y se confirmó por PCR. El péptido de señal se predijo con la señal PVl.l y la región transmembrana prevista -se detectó con TMpred (K. Hofmann & W. Stoffel (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166). Las estructuras de los exones se analizaron con el programa GCG (paquete Wisconsin) versión 10.3. La alineación se basó en las secuencias globales de aminoácidos o en los dominios locales de RAETlL (NM_130900.1) , RAETlE (AY176317), RAETlG (AY172579), ULBPl (NM_0225218.1) , ULBP2 (NM_025217.2 ) , ULBP3 (NM_024518.1) , MICA (BC016929), MICB (NM_005922.1 ) y MULTl (AK020784) y se llevó a cabo usando ClustalW (Higgins D et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) y PileUp. El árbol UPGMA (método de grupo de pares no ponderados con media aritmética) se construyó por el programa MEGA versión 2.1 (Kumar, S. et al (2001) . Bioinformatics, 17, 1244-5) . La consistencia de las ramificaciones se valoró por secuencia inicial basada en 1000 muestras por corrida. Se obtuvieron los siguientes clones de la colección de clones I.M.A. G.E, HGMP, Hinxton, Cambs, RU: RAETlG: IMAGE No. 3070730, 2911855, RAETlE: 3464637, ULBP2 : 4747126 (Genbank accesos BF513861, AW 510737, BE545401, BG675590) . Se realizó la secuenciación de ADN usando el secuenciador BigDye y ABI 377, el análisis usando el programa Sequence Navigator. Las construcciones de receptor de longitud completa se clonaron como fusiones de epítope indicadoras en el vector p3XFLAG-CMV™-9 (Sigma) . La clonación topo de los fragmentos de PCR se realizó usando el equipo de clonación Topo (Invitrogen) y las instrucciones del fabricante.

RT-PCR Los cebadores de PCR usados para determinar la distribución de tejido: 1G Directo 5 'AGCCCCGCGTTCCTTCTA Invertido 5 'TGTATACAAGGCAAGAGGGGC 1E Directo 5 'TATCCCTGACTTCTAGCCCT Invertido 5 'GCCACTCACCATTTTGCCAC GAPDH Directo 5 'ACCACAGTCCATGCCATCAC Invertido 5 'TCCACCACCCTGTTGCTGTA Se elaboraron ARN de línea celular como se describe anteriormente (Allcock et al., (2003) Eur. J. Immunol . 33, 567-577). Los tamaños esperados de los productos fueron: 935pb para RAETlG, 835pb para RAET1G2 y 810pb para RAETlE. Se usó GAPDH como una reacción de control para cada ADNc .

Transfecciones y Citometría de Flujo Se realizaron transfecciones transitorias en células CV-1 y células MDCK usando lipofectamina 2000 (Invitrogen) y el protocolo normal de fabricante. Las líneas de células que se expresan de forma estable de las células MDCK y CVl se derivaron subsiguientemente por selección de las células resistentes a G418 , al complementar el medio de crecimiento celular con 1 mg/ml de G418 (Gibco ) . Se realizó la citometría de fluj o en una máquina Becton FACScalibur . La detección de los receptores de longitud completa fue mediante un anticuerpo monoclonal conjugado a FITC al epitope FLAG101 ( Sigma) . La detección de la unión de NKG2D fue mediante la fusión Fe humana, usando un anticuerpo policlonal conjugado con FITC , anti-IgG humana (Dako ) .

Ensayo de citotoxicidad de células. NK Se aislaron linfocitos aniquiladores naturales (NK, por sus siglas en inglés ) humanos a partir de la sangre periférica usando aislamiento Ficoll normal de células mononucleares seguido por tinción con anticuerpos monoclonales anti-CD3-FITC y anti-CD56-CyChrome (Becton Dickinson RU) . Se analizaron las células teñidas en un clasificador celular MoFlo (Cytomation) y se aisló la población de linfocitos CD3" CD56X Estas células se incubaron en el medio REMI 1640 que contiene penicilina y estreptomicina, suero AB humano al 10 % y 100 U/ml de interleucina-2 recembinante durante tres días a 37°C, CC^ al 5 % . El análisis citométrico de flujo demostró que esta población policlonal de células NK fue uniformemente CD3" CD56+ NKG2D+. La capacidad de las nuevas moléculas RAETl humanas para inducir lisis mediada por células aniquiladoras naturales se valoró por un ensayo de citotoxicidad, no reactivo, in vitro (Sheehy et al., (2001) J. Imunological Methods 249, 99-110)'. Se establecieron cuatro cavidades de células objetivo, marcadas, únicas, para determinar la liberación espontánea y cada célula objetivo marcada se valoró en duplicado en un intervalo de relaciones de efector a objetivo. Para el bloqueo de anticuerpo monoclonal, se incubaron los efectores de células NK a temperatura ambiente durante 30 minutos en la presencia de un anticuerpo monoclonal específico de NKG2D antes de la adición de las células objetivo marcadas. El por ciento de lisis específica para cada relación de efector a célula objetivo entonces se calculó usando por ciento de lisis específica - 100 - % de supervivencia.

Producción de proteínas recombinantes Se produjeron versiones recombinantes solubles del dominio extracelular de los ULBP y RAETlE/G como fusiones N-terminales de 6-Histidina. Estos se produjeron como cuerpos de inclusión en BLR de E. coli (DE3) usando el vector pT7His . derivado de pGMT7 (Vales-Gómez et al., (1999) EMBO J. 18, 4250-4260) y la proteína insoluble se extrajo con clorhidrato de GUANIDINA 6M. La purificación y replegado in situ se realizaron usando resina Ni-NTA (Qiagen) por dilución secuencial a PBS antes de la elución usando PBS más 250 mM de imidazol . Se produj o la proteína de fusión NKG2D-FC a partir de células 293T usando transfección con fosfato de calcio . La fusión fue C-terminal a los dominios charnela de IgGl-CH2-CH2 humanos , en pCDNA3 . 0 . Se produj o la fusión UL16-Fc en Signalplgplus ( Sigma) como una fusión N-terminal a IgGl CH2- CH3 humana . Las proteínas recombinantes se purificaron usando la proteína A Sepharose111 (Pharmacia) . En todos los casos , se transfirieron las proteínas eluidas a PBS al pasar a través de una matriz de filtración de gel grueso ( columna PD10 , Pharmacia) . Los análisis por SDS-PAGE y transferencia western verificaron la integridad de las fusiones Fe expresadas . El MW y la pureza de la proteína marcada con His se confirmaron por SDS-PAGE en geles de acrilamida al 12 % en base al protocolo de Laemmli . Se llevó a cabo la transferencia western como una transferencia env húmedo a la membrana Immobilon-P (Millipore) . La detección fue usando el anticuerpo conjugado de HRP anti-Fc humano (Dako ) .

Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) Se llevó a cabo la (SPR, por sus siglas en inglés) en una máquina BIAcore2000. El amortiguador de corrida, los chips sensores y los reactivos de acoplamiento superficial fueron de BIAcore. Se acopló IgG anti-Hu ano (Dako ) a una superficie de CM5 usando la química de NHS/EDC . Esta superficie entonces se usó para la unión de NKG2D y UL16 mediante la fusión Fe. Se unieron 1.5 µg de ' la fusión NKG2D o UL16-FC o un control de fusión Fe nulo al anti-Igg seguido por inyección de muestra a 20 µl/min. La regeneración superficial fue usando 5 µl de HCl 10 mM. Se aplicó una serie de dilución de cada ULBP sobre NKG2D, UL16 y control de Fe y se determinó el nivel de unión. Se usaron dos lotes separados de NKG2D, UL16 y las proteínas ULBP/RAETl para cada determinación y datos equivalentes se obtuvieron para cada lote. Se realizó el análisis cinético usando el programa BIAEvaluation 3.1. Las velocidades separadas y los ajustes globales combinados se realizaron para cada serie de dilución de ligando de NKG2D.

Producción de anticuerpo El anticuerpo policlonal a RAETlG se formuló en conejo usando dos péptidos que corresponden a parte del dominio citoplásmico de la proteína. Los péptidos fueron: (i) CNNGAARYSEPLQVSIS; y (ii ) CSHGHHPQSLQPPPHPP . Se elaboraron los péptidos y se acoplaron a Ovalbúmina por los Polipéptidos de Southampton, (University of Southampton, RU) . El antisuero se formuló usando una combinación de ambos péptidos, acoplados de manera separada a ovalbúmina, en conejo por Harían Seralabs (Place, RU) . El anticuerpo policlonal se purificó por el método de precipitación de ácido caprílico/sulfato de amonio. Se usó RAETlG recombinante marcado con 6-His para inmunizar ratones a fin de obtener ' anticuerpos monoclonales. Se obtuvieron clones de hibridoma a partir de las fusiones del bazo de ratón después del transcurso del tiempo de inmunización. Estos clones se detectaron inicialmente por ELISA para la actividad. Entonces se detectaron por transferencia en ranura para la capacidad para detectar el inmunógeno por transferencia western. Se han obtenido buenos anti-sueros a RAETlG del primer paso de clonación que sa una buena respuesta por -ELISA y asciende una banda de 50 kDa por transferencia western (peso molecular esperado de RAETlG) de lisados de las líneas celulares K562 (eritroleucemia) y HT1080 (fibrosarcoma) . Esto indica especificidad de los anticuerpos .

Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica se emprendió en dos microarreglos de tejido de cera de parafina [Kononen J. wet al., Nat Med 1998; 4:844-847]. El primero se preparó usando selección guiada de tejido [Simón R. et al. Biotechniques 2004; 36: 98-105] transfiriendo núcleos con un diámetro de 2 x 0.6 mm de cada tejido donador fijado en formalina eri el arreglo receptor. Este microarreglo de tejido predominantemente normal contuvo un total de 342 núcleos de 172 muestras donadoras como se lista en la Tabla 3. Todas las muestras se obtuvieron de Medical Solutions pie con aprobación ética obtenida del Research Ethics Committe. Para evaluar la distribución en tejido del anticuerpo de RAETlG en tumores, también se i munotiñeron secciones de microarreglo de tejido fijado en paraformaldehído, comercial (Petagen Inc, código A201 (1) ) que contiene núcleos de 1 mm de 35 muestras de cáncer epitelial (Tabla 3). Para evaluar la distribución en tejido del anticuerpo de RAETlG en el intestino delgado, también se inmunotiñeron secciones de microarreglo comercial de tejido fijado en paraformaldehído (Petagen Inc, código A201 (1) ) que contiene núcleos de 1 mm de 10 muestras de intestino delgado y colon. La inmunohistoquímica automatizada se emprendió usando un sistema Ventana Medical Systems Discovery1111. Se desenceraron secciones, se pre-trataron con acondicionador celular suave 1 (Tris-borato/EDTA, pH8.0) luego se incubaron en el anticuerpo de copnejo anti-RAETlG a 10 µg/ml durante 20 minutos a 37°C. Para la detección, un bloque de avidina/biotina prosiguió a la aplicación de anticuerpo de cabra anti-conejo biotinilado (DakoCytomation) diluido 1/100 durante 8 minutos a 37°C. El anticuerpo biotinilado entonces se detectó usando un equipo de estreptavidina/biotina/peroxidasa (Ventana, DAB MAP1111) . El protocolo se terminó por contrateñido automatizado con hematoxilina seguido por limpieza por deshidratación manual y montaje en montaje resinoso. Dentro de cada corrida inmunohistoquímica, se incluyeron controles . Se usaron anticuerpos anti-lisozima y anti-vimentina como controles positivos para verificar la conservación antigénica de los núcleos de tejido. Estos controles proporcionaron tinción positiva en todos los núcleos de tejido. Para establecer si cualquier tinción presente en el tejido fue debido a interacción no específica de los reactivos de detección, también se procesaron portaobjetos sin el anticuerpo de RAETlG . Se capturaron automáticamente imágenes de los núcleos de los microarreglos de tejido teñido usando un sistema automatizado de captura de imágenes Ariol SL-50 (Applied Imaging Inc) usando un objetivo x20.

Resultados RAETlG tiene una región TM El análisis inicial de la agrupación de ULBP/RAET demandó seis genes expresados que codifican para moléculas enlazadas a GPI (Radosavljevic et al., (2002) Genomics 79, 114-123). Se emprendió el análisis detallado de estas secuencias y se identificaron regiones TM potenciales en RAETlE y RAETlG . El análisis adicional de los genes que codifican para RAETlE, RAETlG y ULBP2 , (RAETlE, RAETlG y RAETlH, respectivamente) reveló una estructura conservada de exones, donde el exón 1 codificó para el péptido de señal y el inicio de la proteína, los exones 2 y 3 abarcaron los dominios al y a2 , y el exón 4 codificó para una secuencia hidrófoba. En los ULBP, este exón codificó para la región de fijación de GPI, y 3' UTR, pero tanto en RAETlG como en RAETlE, la secuencia fue compatible con un TM, así como una región citoplásmica corta (CYT) . El exón 5 en RAETlG codificó para el resto del dominio citóplásmico putativo. Estuvo poco notorio el exón equivalente en RAETlH . Para poner en claro las secuencias de los productos génicos expresados, se secuenciaron completamente clones que corresponden a RAETlE y RAETlG (Radosavljevic et al. (2002) Genomics 79, 114-123) . Se confirmó que RAETlG fue muy similar a ULBP2 sobre los primeros 4 exones . Una comparación de la secuencia de aminoácidos con aquellas de los ligandos NKG2D murinos y humanos existentes mostró que RAETlG estuvo muy cercanamente relacionado a ULBP2 (85 % de similitud total. El nivel más alto de identidad de aminoácidos (aa) estuvo en los dominios al y a2. La secuencia traducida restante codificó para una TM y una CYT de lOOaa (Figura 7) . De manera similar, el análisis de la secuencia de RAETlE mostró que codifica para dos dominios a entonces una TM hidrófoba seguida por un dominio citoplásmico de 20 aminoácidos. RAETlE fue el miembro más divergente de la agrupación, que comparte < 43 % de identidad con los otros ligandos, en tanto que los ULBP 1-3 compartieron ~ 55-60 % de identidad entres si. Las secuencias conservadas de aminoácidos se alinearon a los elementos estructurales clave de los dominios al y a2 al realizar una alineación ClustalW usando el servidor Bioinformático Europeo (EBI, Hinxton, RU) , y comparación subsiguiente a la estructura de cristal conocida de ULBP3. Las características estructurales clave de ULBP3 se resaltan en la alineación de secuencia de proteína (figura 7) . Al igual que RAETlG, el ligando NKG2D murino, MULTI tuvo también una CYT larga. No se encontró similitud significativa de secuencia entre las regiones citoplásmicas de las dos proteínas . El dominio citoplásmico de RAETlG no mostró homología a ninguna proteína o dominio que se buscó por BLAST o a trasvés de Prosite. Se buscó porciones de señalización conocidas en las regiones de CYT de RAETlE y RAETlG. No se identificaron Porciones Inhibitorias de Inmuno-Tirosina (ITIM) o Porciones de Activación de Inmuno-Tirosina (ITAM) clásicas. Hubo una región PxPxxP de alto contenido de prolina en el dominio citoplásmico de RAETlG, que correspondió a la porción de unión a SH3-cinasa de consenso (Kay et al., (2000) FASEB J. 14, 231-241). En la dirección 3' de esto hubo dos pares de residuos hidrófobos similares a aquellos atribuidos a la selección vasolateral de objetivos de MICA (Suemizu et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 2971-2976) . La figura 6 muestra un árbol filogenético de ligandos murinos y humanos . NKG2D humano y de ratón fueron aproximadamente 60 % idénticos, sin embargo, sus ligandos son sustancialmente diferentes mostrando 25-35 % de identidad. Por lo tanto, a pesar de mostrar algunas características similares, tal como anclas de GPI o regiones TM, la duplicación y variación sustancial se ha presentado después de la evolución entre el ratón y el hombre.

Empalme alternativo de RAETlG La secuencia del clon IMAGE 2911855 fue co-lineal con RAETlG excepto por una supresión de 100 pb, al inicio del exón 4. Este arreglo es compatible con el empalme alternativo en este límite, con un segundo empalme potencial que inicia desplazado 3' por 100 pb. La traducción de esta forma suprimida de RAETlG mostró que el empalme alternativo provocó un desplazamiento de cuadro, y la terminación prematura de la secuencia de proteína. Esta proteína truncada se predice que es soluble, puesto que el desplazamiento de cuadro provoca terminación antes de la región TM. Esta forma de -empalme se llama RAET1G2, y su finalización de secuencia alternativa se muestra por debajo de aquella de RAETlG en la Figura 7. En la Figura 8 se muestran estructuras de exones de RAETlG y RAET1G2.

Patrones de expresión de RAET1G/1G2 y RAETlE Se diseñaron cebadores específicos de PCR para establecer los perfiles de expresión de RAET1G/1G2 y RAETlE. Varias líneas de células tumorales contuvieron ARNm para RAETlE o RAETlG y los genes se expresaron independientemente entre si, en células de diferentes linajes. Esto es en contraste a MICA y MICB donde la expresión parece estar restringida a células de origen epitelial y no es claro si se expresan independientemente entre si (Bahram et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91, 6259-6263; Groh et al., (1998) Science 279, 1737-1740) . La línea HSB-2 deriva de leucemia de células T expresó un trascripto truncado de RAETlG. Este producto de ADNc se clonó usando clonación Topo y, cuando se secuenció, fue idéntica a la forma de empalme RAET1G2 en el clon IMAGE 2911855. La expresión de una variante de empalme que codifica para una proteína ' soluble es potencialmente importante dado el papel propuesto de los ligandos NKG2D solubles en el daño de el reconocimiento por células NK y T de tumores (Groh et al., (2002) Nature 419, 734-738). Un intervalo limitado de tejidos humanos normales probados, no mostró expresión de RAETlE, o la forma de empalme RAET1G2. RAETlG se expresó fuertemente en colon, pero no en otros tejidos detectados. También se ha identificado un RAETlG con correspondencia de EST de una biblioteca de ADNc de laringe.

Expresión de ARNm de RAETlG y proteína Usando RT-PCR en un panel de 20 tejidos humanos normales, se detectó ARNm de RAETlG sólo en colon, consistente con la expresión restringida de este gen en tejidos humanos normales. A fin de investigar la expresión de la proteína RAETlG, se formuló un anticuerpo policlonal contra péptidos de su CYT. Este reactivo se mostró que es específico por análisis de transferencia western de los lisados celulares. Los lisados de células K562, Raji, y CVl transfectadas con ya sea RAETlE o RAETlG se sondearon. Se obtuvieron bandas que corresponden al peso molecular previsto de 50 kDa (glicosilado) para K562 y el transfectante RAETlG pero no para las otras líneas celulares. Esto correlaciona con los datos de RT-PCR de las líneas celulares descritas anteriormente. Por lo tanto, el trascripto de RAETlG de longitud completa es capaz de ser traducido a una proteína madura, incluyendo su CYT inusualmente larga.

Distribución de RAETlG en tejidos normales por inmunohistoquímica Se demostró la unión del anticuerpo de RAETlG en una población restringida de tipos normales de células epiteliales. En riñon, la fuerte tinción puntual de una minoría de túbulos renales se observó en una de cinco muestras donadoras junto con tinción citoplásmica uniforme más débil de varios túbulos diferentes . Esta última tinción no fue específica como también se observó en el control, que omitió el anticuerpo de prueba, y en otras muestras renales. La tinción citoplásmica uniforme de intensidad moderada se presentó en varias células de forro de folículos en todas las muestras de tiroides en tanto que se observó en colon una fuerte tinción puntual en dos de las cinco muestras únicamente, indicando que la expresión de RAETlG puede variar entre los individuos. En la pituitaria anterior, se observó una fuerte tinción citoplásmica uniforme de las células endocrinas en las cuatro muestras en las cuales se representó completamente esta región. La muestra de pituitaria restante se compuso predominantemente de tejido de pares intermedios. Este tejido estaba sin teñir pero las células endocrinas dispersadas de la pituitaria anterior mostraron una intensa tinción citoplásmica. En tiroides, colon y pituitaria, no se observó tinción en la preparación de control donde se omitió el anticuerpo de prueba indicando que fue específica la tinción. Estos datos confieren que la distribución de ARNm que indica expresión muy restringida de la molécula en fisiología normal .

Expresión de RAETlG en tumores Se observa en las muestras de tumor (Tabla 4) una distribución más extensa de tinción epitelial . Esta tinción se consideró como específica puesto que no hay evidencia de tinción equivalente en muestras procesadas con omisión del anticuerpo de prueba. Los tumores que demuestran expresión de RAETlG incluyeron adenocarcinoma de colon, pulmón, recto y estómago; carcinoma de células escamosas de pulmón, esófago, piel y útero, carcinoma endometrioide de útero, carcinoma folicular de tiroide, hepatoma y colangiocarcinoma del hígado, carcinoma de células renales, y carcinoma mucinoso y ceroso de ovario. En algunos de estos tumores todas las muestras mostraron evidencia de tinción en tanto que en otros sólo se tiñeron algunas de las muestras. El número, intensidad y distribución de la tinción también varío a través de las muestras positivas. La distribución de la tinción dentro de las muestras de tumor fue de interés particular. En muestras de carninoma escamoso, se observó un patrón de tinción citoplásmica uniforme. Este tipo de tinción también se observó en una muestra de hepatoma y en carcinoma ceroso del ovario. En los tumores restantes positivamente teñidos, localizados, se registró tinción celular predominantemente puntiforme. En adenocarcinoma de colon y recto, hepatoma (una muestra) , colangoicarcinoma del hígado, carcinoma mucinoso del ovario, carcinoma de células renales, carcinoma folicular de tiroides y carcinoma endometrioide del útero, esta tinción fue apical o presente en el margen de las células tumorales. En adenocarcinoma de pulmón y estómago, esta tinción se asoció con los límites de las vesículas citoplásmicas en tanto que en desechos celulares de adenocarcinoma rectal o proteína segregada, presente en el lumen de las glándulas tumorales también se tino. En una muestra de carcinoma escamoso uterino, sólo se observó tinción intersticial.

Expresión de RAETlG en enfermedad celíaca La enfermedad celíaca es una condición autoinmunitaria, relativamente común, causada por respuestas inmunitarias mediadas por T contra el propio epitelio intestinal de los pacientes . NKG2D se ha enlazado recientemente a atrofia vilosa en enfermedad cardiaca (Hue et al, 2004) , con los linfocitos intraintestinales que se muestra que son capaces de aniquilar las células epiteliales mediante NKG2D. Usando el suero policlonal a RAETlG se investigó su expresión en células epiteliales del intestino delgado de controles normales en comparación directa a aguellos de pacientes con enfermedad celíaca. Se observó alguna tinción puntiforme de bajo nivel en muestras saludables de intestino delgado que muestran aparentemente una distribución intracelular de RAETlG. Se observó una tinción mucho más fuerte a todo lo largo del citoplasma de la célula, y posiblemente en la superficie celular, en las muestras de individuos con enfermedad celíaca. Esto indica que RAETlG se favorece en su expresión en las células del . intestino delgado en individuos con enfermedad celíaca y proporciona indicación de un papel para las interacciones de RAET1G/NKG2D en atrofia vellosa en pacientes con enfermedad celíaca activa. Por lo tanto, RAETlG no puede ser simplemente un marcador de tejidos enfermos en enfermedad celíaca sino puede ser una causa directa del daño del tejido.

RAETlE y RAETlG expresados en NKG2D unido a superficie celular Se clonaron ADNc de longitud completa para RAETlE, RAETlG y ULBP2 como proteínas de fusión marcadas con indicador N-terminales . Estas buscaron la superficie celular en transfecciones transitorias de células CV-1 y detección con anticuerpos anti-indicador en citometría de flujo (Figura 9 y Figura 10) . NKG2D, expresado como una proteína de fusión Fe soluble, recombinante, se unió a células COS-7 transfectadas transitoriamente con ULBP2 , RAETlG y RAETlE por citometría de flujo (Figura 11 y Figura 12) .

RAETlE y RAETlG son capaces de inducir citotoxicidad de células NK mediante NKG2D RAETlE y RAETlG expresados en células COS-7 activaron la citotoxicidad por células NK. El anticuerpo de NKG2D bloquea completamente esta actividad. Los datos de aniquilación, relativos, para los dos ligandos y las células no transfectadas- se muestran en la Figura 13.

Interacciones de unión de la familia de ULBP con NKG2D y UL16 Se analizaron versiones solubles recombinantes de ULBPl, ULBP2, ULBP3 , RAETlE y RAETlG para la unión a NKG2D por Resonancia de Plasmón Superficial usando una máquina' BIACore 2000. De manera similar, también se midió la unión de ULBPl, RAETlE y RAETlG recombinante a UL16. Unas series de dilución de cada proteína de ULBP se pasó sobre NKG2D-FC, UL16-Fc o control de fusión Fe unido a una superficie de anti-IgG humana. La unión mínima se vio a la superficie de control de Fe. Los ejemplos de curvas usadas para los análisis de ajuste global cinéticos se muestran en la Figura 14, y en la Tabla 1 se muestran los parámetros cinéticos. La Tabla 2 muestra los parámetros anteriormente determinados por otros para ligandos murinos (Radaev et al., (2002) J. Immunol. 169, 6279-6285; O'Callaghan et al., (2001) Immunity 15, 201-211; Carayannopoulos et al. (2002) Eur. J. Im unol . 32, 597-605; Carayannopoulos et al. (2002) J. Immunol . 169, 4079-4083) . Los datos presentados en la Tabla 1 se derivaron de al menos dos experimentos repetidos y al menos dos expresiones separadas tanto de las proteínas de fusión Fe y marcadas con his . Se vio muy poca variabilidad de lote a lote y todos lo datos cinéticos y de afinidad en la Tabla 1 se han reproducido . El intervalo de afinidades dentro del complemento y ligandos humanos y murinos es comparable y se ajusta a un patrón similar. Los ligandos murinos Raela-d enlazados a GPI tiene una afinidad significativamente menor que los ligandos con dominios transmembrana, H60 y MULTI (Tabla 2) . De manera similar, los tres ULBP humanos anclados a GPI tienen menores afinidades para NKG2D que lo que tienen MICA y las moléculas de RAETlE y RAETlG fijadas a TM. RAETlE y RAETlG tienen mayores afinidades para NKG2D que los otros ligandos NKG2D humanos, a 39 nM y 356 nM respectivamente. UL16 se unió con afinidad variable, pero alta, a los tres ligandos humanos probados,, sin embargo RAETlG tuvo una afinidad significativamente mayor para UL16 que cualquiera de RAETlE o ULBPl, y una velocidad más rápida, la KD de 75.6 mM en comparación a 504 nM y 243 nM, respectivamente . En tanto que se comparte similitud de secuencia, los genes de ULBP/RAETl exhiben gran diversidad de afinidad para su receptor compartido. Se asume que ULBP2 y RAETlG tienen 93 % de similitud de secuencia en sus dominios a aun ellos se unen a NKG2D con afinidades diferentes de 20 veces. Una diferencia notable entre los dos es una sustitución de alanina a prolina en RAETlG en comparación a ULBP2 en la posición 136, al inicio de la hélice en los dominios a2. La presencia de MIC soluble en los sueros de los pacientes con tumores de MIC+ se ha enlazado a una reducción en NKG2D de superficie en linfocitos y puede ser una ruta para "una evasión inmunitaria al deteriorar la sensibilidad de células NK y T que tienen NKG2D (Pende D. et al. (2002) Cáncer Res. 62 6178-86) . SE propone que MICA se pierde en la superficie celular de los tumores a través de la escisión por metaloproteasas (Salih et al., (2002) J. Immunol . 169, 4098-4102) y esto puede ser el caso para el ligando RAETlG que contiene TM. La forma de empalme soluble de RAETlG detectada en la línea de leucemia de células Ti, HSB-2 puede jugar un papel similar. El patrón de expresión de los genes de ULBP/RAET presentado aquí y en los estudios anteriores (Cosman et al., (2001) Immunity 14, 123-133; Pende et al., (2002) Cáncer Res. 62, 6178-6186) muestra que se pueden expresar múltiplex ligandos para NKG2D en una célula objetivo. Los ligandos también son claramente capaces de expresión independiente. Los datos son consistentes con diferentes ligandos de NKG2D expresados en diferentes tejidos. En general los productos de MIC se expresan en células epiteliales . Se puede expresar ULBP/RAETl en células epiteliales pero también se expresan en líneas celulares de origen no epitelial, proporcionado un fundamento para los papeles distintos de MICA/B, por ejemplo en respuestas inmunitarias a malignidades linfoides y virus que infectan linfocitos . Se mostró que las afinidades de las proteínas humanas de ULBP/RAETl para NKG2D fueron notablemente diversas, pero forman dos grupos. En línea con los datos murinos, las proteínas fijadas a GPI tienen afinidades modestas a bajas para NKG2D, en tanto que los ligandos que poseen dominios de CYT, tal como RAETlG, tienen alta afinidad. La alta afinidad accionada por velocidades rápidas puede ser importante donde se necesita señalización anticipada de la infección, donde es vital para su remoción la asociación rápida con el receptor asociado para tratar con células infectadas . Se puede dirigir el RAETlG a la superficie vasolateral, donde su rápida velocidad y alta afinidad pueden hacerlo un buen indicador de línea frontal del reto bacteriano. En una capa de células polarizadas, tal como superficies epiteliales en el intestino, las diferencias en la fijación o anclaje de los ligandos de NKG2D permite la distribución diferencial en la misma célula, diferentes rutas posibles de señalización, y por lo tanto disponibilidad diferencial a linfocitos. La distribución de ligandos en una célula puede cambiar la estimulación o reto bacteriano, la transformación o el acoplamiento de los linfocitos. La distribución relativa de los ligandos de NKG2D en tejidos distintos y dominios celulares distintos puede ser fundamental para el entendimiento del reconocimiento inmunitario mediado por NKG2D. Se mostró que RAETlG es un objetivo de UL16, una molécula que se propone que promueve la evasión inmunitaria viral al bloquear el reconocimiento de NKG2D. Tanto ULBP como RAETlG se unen a UL16 con mayor afinidad que para NKG2D, con velocidades muy rápidas . RAETlG es el agente de unión de mayor afinidad de UL16 con una velocidad de asociación 10 veces más rápida para UL16 que para NKG2D. Esto proporcionará Una capacidad mejorada para unirse a proteínas virales a bajas concentraciones. La velocidad muy rápida y la alta afinidad de RAETlG para UL16 indican su potencial como una molécula de reconocimiento de patógenos . La extremidad única de CYT llevada por esta molécula proporciona el potencial de transmitir señales dentro de la célula para modulas otras moléculas comprendidas en las respuestas a patógenos . Este es el primer ligando de NKG2D descrito con evidencia de su propia capacidad de señalización Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Microarreglo de tejido interno Tejidos normales: Corteza suprarrenal (5), médula suprarrenal (2), aorta (5), vejiga (3), mama (5), músculo cardiaco (5), cerebelo (5) , cerebro (5) , colon (5) , tubo de falopio (5) , ilio (5) , corteza renal (4) , médula renal (4) , hígado (4) , pulmón (5), nodulos linfáticos (5), esófago (4), ovario (3), páncreas (5), paratiroides (1), nervios periférico (5), pituitaria (5), placenta (5), próstata (5), piel (4), médula espinal (5), bazo (5), estómago (3), músculo estriado (5), testículos (4), tiroides (5), amígdala (5), uréter (3), útero, endometrio (5) , útero, miometrio (5) Tumores Mama (4) , adenocarcinoma de colon (5) , riñon (4) , próstata (5) .

Microarreglo de tejido de cáncer Carcinoma (2) de células ductales de mama, adenocarcinoma de colon (2), carcinoma de células renales (2), colangiocarcinoma hepático (2), hepatoma de hígado (2), adenocarcinoma de pulmón (1), carcinoma escamoso de pulmón (2) , carcinoma basaloide de esófago (1) , carcinoma de células escamosas de esófago (1) , carcinoma mucinoso de ovario (2) , carcinoma seroso de ovario (2), adenocarcinoma rectal (2), carcinoma de células escamosas de piel (1) , adenocarcinoma de estómago (1) , carcinoma de células de sortija de estómago (3), carcinoma folicular de glándula tiroides (2), carcinoma papiliar de glándula tiroides (2), carcinoma de endometrio de útero (2), carcinoma de células escamosas de útero (2). Tabla 3 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiendo descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 87 % de similitud de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o la figura 2.
2. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 1.
3. Ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 2.
4. Ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido se une a un receptor UL16 y/o NKG2D.
5. Ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la figura 3 o la figura 4.
6. Ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado hibridiza con la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 3 o la figura 4 o el complemento de la misma bajo condiciones severas.
7. Polipéptido aislado, caracterizado porque se codifica por el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
8. Polipéptido aislado que es un fragmento del polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porgue consiste de al menos 110 aminoácidos y que es capaz de unirse a un receptor UL16 y/o NKG2D.
9. Polipéptido aislado de conformidad con la . reivindicación 7 o "la reivindicación 8, conjugado a una porción funcional, caracterizado porque la porción funcional es un polipéptido, un compuesto químico no de peptidilo, una célula o una partícula viral .
10. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la porción funcional ' tiene actividad citotóxica o actividad de unión.
11. Vector, recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
12. Célula hospedadora, caracterizada porque comprende un ácido nucleico heterólogo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector de conformidad con la reivindicación 11.
13. Célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula eucariótica.
14. Método para producir un polipéptido de RAETlG, caracterizado porque comprende: (a) provocar la expresión del ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un sistema adecuado de expresión para producir recombinantemente el polipéptido de RAETlG; y (b) probar el polipéptido recombinantemente producido para la actividad de RAETlG.
15. Anticuerpo aislado, caracterizado porque se une de manera específica a un polipéptido de RAETlG de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
16. Método para identificar una condición de enfermedad en un individuo, caracterizado porque comprende: determinar la presencia o cantidad del polipéptido de RAETlG en una muestra obtenida del individuo.
17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la condición es una condición de cáncer.
18. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la condición es una enfermedad inflamatoria .
19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es una enfermedad celíaca.
20. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque el polipéptido de RAETlG es soluble.
21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido soluble de RAETlG consiste de la secuencia de aminoácidos de la figura 1.
22. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque el polipéptido de RAETlG consiste de la secuencia de aminoácidos de la figura 2.
23. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque la presencia o cantidad del polipéptido se determina al poner en contacto la muestra con un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 15.
24. Método para identificar una condición de enfermedad en un individuo, caracterizado porque comprende: determinar la presencia o cantidad de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de RAETlG en una muestra obtenida del individuo .
25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la condición es una condición de cáncer.
26. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la condición es una enfermedad inflamatoria .
27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es enfermedad celíaca.
28. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un polipéptido soluble de RAETlG. 5
29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la figura 4.
30. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque el ácido 0 nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la figura - - - 3.
31. Método de conformidad con la reivindicación 17 o 25, caracterizado porque la muestra comprende células epiteliales y/o epitelialmente derivadas . 5
32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células epiteliales o epitelialmente derivadas son de riñon, hígado, pulmón, esófago, ovario, piel y/o útero.
33. Método para obtener y/o identificar un 0 modulador de un polipéptido de RAETlG, método que está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un polipéptido de RAETlG y un compuesto de prueba; y (b) determinar la interacción del polipéptido de RAETlG con el compuesto de prueba. 5
34. Método para obtener y/o identificar un compuesto que modula la interacción de RAETlG con UL16 y/o NKG2D, método caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un polipéptido de RAETlG y un polipéptido de UL16 o NKG2D en la presencia de un compuesto de prueba; y (b) determinar la interacción entre el polipéptido de UL16 o NKG2D y el polipéptido de RAETlG antes y después de la adición del compuesto de prueba.
35. Método de conformidad con la reivindicación 33 o la reivindicación 34, caracterizado porque comprende identificar el compuesto de prueba como un modulador de la actividad de RAETlG.
36. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado porque comprende aislar y/o purificar un compuesto de prueba.
37. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, caracterizado porque comprende sintetizar y/o elaborar el compuesto de prueba.
38. Método de conformidad con las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado porque comprende modificar el compuesto de prueba para optimizar las propiedades farmacéuticas del mismo .
39. Método de conformidad con las reivindicaciones 33 a 38, caracterizado porque comprende formular el compuesto de prueba en una composición farmacéutica con un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.
40. Método para producir una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende formular un polipéptido de RAETlG de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o un fragmento del mismo, o ácido nucleico de acuerdo con, cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento del mismo, o un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 15 en una composición farmacéutica con un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.
41. Modulador de actividad de RAETlG, caracterizado porque se obtiene por uno de los métodos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38.
42. Modulador de actividad de RAETlG de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende un fragmento peptídico de un polipéptido de RAETlG.
43. Polipéptido de RAETlG de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o un fragmento del mismo, o ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento del mismo, un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o un modulador de conformidad con cualquiera de la reivindicación 26 o reivindicación 42 caracterizado porque es para el uso en el tratamiento de un cuerpo humano o animal.
44. Uso de un polipéptido de RAETlG de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o fragmento del mismo o ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento del mismo, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 15 o un modulador de acuerdo con cualguiera de la reivindicación 41 o la reivindicación 42 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con una condición mediada por RAETlG.
45. Uso según la reivindicación 44, en donde la condición se selecciona del grupo que consiste de una infección patógena, una condición de cáncer y un trastorno inmunitario .
46. Método para tratar un individuo que tiene una condición mediada por RAETlG, el método está caracterizado porque comprende administrar un polipéptido de RAETlG de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o fragmento del mismo, o ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento del mismo, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 15 o un modulador de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 41 o la reivindicación 42, al individuo.
47. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la condición se selecciona del grupo que consiste de una infección patógena, una condición de cáncer, un trastorno inmunitario.