MXPA06008165A - Metodo para detectar proteina patologica prp usando al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y un ligando diferente de un ligando de proteina. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para detectar PrP en una muestra biologica de humano o animal que puede contener PrP. El metodo inventivo se caracteriza en que usa una molecula que contiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y un ligando diferente de un ligando proteinico seleccionado de ligandos macrociclicos y glucosaminoglucanos.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR PROTEINA PATOLÓGICA PrP USANDO AL MENOS UNA CARGA POSITIVA Y/O AL MENOS UN ENLACE GLUCOSIDICO Y UN LIGANDO DIFERENTE DE UN LIGANDO DE PROTEINA Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de enfermedades prión, y e particular a un método para detectar las formas del prión asociado con estas enfermedades. Antecedentes de la Invención La proteína prión nativa o normal, denotada PrPc para la proteína prión celular, es una glicoproteína que se expresa ampliamente en células neuronales y linfoides de mamífero . Los cambios conformacionales en PrPc conducen a la aparición y a la propagación de la proteína patológica PrPsc que es resistente a proteinasa . Esta proteína patológica se llamará, en la presente solicitud, sin distinción, PrPsc ó PrPres. El término "PrP" denotará, en la presente solicitud, cualquier forma de PrP que pueda ser normal o no y que pueda ser resistente o no. La acumulación de PrPsc en órganos de mamífero es la causa de numerosas enfermedades, llamadas enfermedades prión o encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en ingles) y en particular escrapie en pequeños rumiantes, enfermedad de agotamiento crónico (CWD, por sus REF:174029 siglas en inglés) en el alce y en el antílope, encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en ingles) , y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD, por sus siglas en ingles) en humanos. El desarrollo de la enfermedad en el hospedador infectado se refleja por una acumulación de la proteína patológica PrPsc en el cerebro, que conduce a un deterioro irreversible de las células cerebrales . La aparición tardía, después de un periodo de incubación de 2 a 6 años, y el lento desarrollo de los síntomas en el ganado infectado con BSE ha retrasado considerablemente el desarrollo de modelos epidemiológicos. La BSE es transmisible a humanos por ingestión y ha conducido a la aparición de una nueva forma de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD) en humanos. La detección de la proteína patológica PrPsc es difícil en animales infectados asintomáticos antes del desarrollo de la enfermedad, y especialmente influidos fisiológicos, tal como sangre y orina, en animales enfermos. Actualmente se establece que la PrPsc presente en animales propuestos para alimento de humanos se transmite a humanos cuando se ingieren los tejidos infectados. Por lo tanto un objetivo principal de salud pública es evitar esta transmisión al detectar la presencia ole PrPsc en animales propuestos para consumo humano con la visión de removerlos de la cadena alimenticia; en donaciones sanguíneas y derivados sanguíneos propuestos para transfusión en humanos. En realidad, como se muestra por la presencia de la proteína patógena PrPec en la sangre y las células linfoides bastante bien antes de que se afecte el cerebro, y por lo tanto bastante bien la posibilidad de detectar signos neurológicos que provoquen una enfermedad prión clínicamente manifestada, se desconoce la fisiopatología en humanos. Puesto que no es posible llevar acabo infecciones experimentales como en las ovejas, la ausencia de una prueba para la detección en la sangre u otros fluidos biológicos no hace posible estudiar y por lo tanto prevenir la transmisión inter-humanos mediante donación sanguínea, o vislumbrar un tratamiento de los individuos infectados antes del comienzo de las lesiones cerebrales : en rebaños de animales antes de la etapa neurológica, haciendo de esta manera posible eliminar de manera temprana los animales infectados, antes de que arriben a los mataderos. La detección de la presencia de PrPsc en muestras biológicas en humanos o en animales por lo tanto está llegando a ser extremadamente importante, y varios equipos de investigación están desarrollando métodos de detección inmunológica (WO 02/086511) . Además, los métodos para formar en complejos, con PrPsc, los péptidos, moléculas pequeñas o inhibidores con una visión al tratamiento de la vCJD son el sujeto de la investigación activa. Sin embargo, los métodos de la técnica anterior constantemente se tropiezan contra la dificultad de identificar de manera confiable PrPsc cuando está en una pequeña cantidad en una muestra biológica. • Descripción Detallada e la Invención Los presentes inventores ahora , han demostrado, contra todas las expectaciones, que el uso de una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y de un ligando diferente de un ligando de proteína en una prueba para diagnosticar PrP en una muestra biológica que puede contener esta proteína, hace posible detectar esta proteína a diluciones y bajo condiciones donde no es detectable con los métodos actualmente usados,, el uso de estos dos componentes en combinación que no modifica la capacidad de PrP para unirse a una molécula de unión específica a PrP usado en la prueba de diagnóstico. De esta manera, un objeto de la presente invención es un método para detectar PrP, en particular PrPsc, en una muestra biológica de origen humano o animal que puede contener PrP, caracterizado porque usa una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y un ligando diferente de un ligando de proteína. También se refiere a los equipos de diagnósticos para detectar PrP, que comprende un ligando diferente de un ligando de proteína y una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico. La expresión "ligando diferente de un ligando de proteína" se propone que signifique un compuesto que es capaz de unirse a PrP y que no es de naturaleza proteínica. A manera de un ligando de proteína excluido de esta definición de ligando, se puede hacer mención de anticuerpos anti-PrP. La expresión "molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico" se propone que signifique una molécula que tiene al menos una carga positiva o una molécula que tiene una función comprendida en un enlace glucosidico, o también ambos. El método de la invención por lo tanto tiene la ventaja de permitir la detección de PrP en muestras biológicas donde está presente en una cantidad pequeña, en virtud del uso combinado de una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al . menos un enlace glucosidico y de un ligando diferente de un ligando de proteína como se define anteriormente . Las muestras biológicas en las cuales se lleva a cabo el método de detección de la invención son cualquier muestra de origen animal o humano que pueda contener PrP. A manera de ejemplo de estas muestras, se puede hacer mención del cerebro, tejidos del sistema nervioso central, o tejidos del sistema nervioso central, órganos tal como el bazo y el intestino y también fluidos biológicos tal como fluido cefaloespinal , orina y sangre. Los animales a los cuales puede relacionarse el método de la invención son animales que desarrollan enfermedades prión. A manera de ejemplo no limitante, se hará mención de miembros de la raza ovina y ganado vacuno. Por medio de la carga positiva contenida en las moléculas que tienen al menos una carga positiva y/o al menos- un enlace glucosidico, se prefieren cargas positivas provistas por funciones básicas, tal como funciones de guanidinio o amonio. Por medio del enlace glucosidico contenido en las moléculas que tienen al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico, se prefieren enlaces del tipo heterósido, tal como aquellos encontrados en macrólidos y aminoglicósidos . Las moléculas que tienen al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico que se prefieren para los propósitos de la invención son moléculas que tienen tanto al menos una carga positiva y al menos un enlace glucosidico, y también moléculas que tienen al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, de manera preferente en un sistema molecular hidrófilo no polimérico. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, las moléculas que tienen al menos una carga positiva y al menos un enlace glucosidico se eligen a partir de aminoglicósidos con un anillo de guanidinio, siendo particularmente preferida la estreptomicina . De acuerdo con otra modalidad particular de la invención, las moléculas que tienen al menos dos funciones de guanidinio y/o amonio se eligen a partir de polialilamina, trietilentetramina (TET) , bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de esper ina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina, estos últimos dos compuestos que también corresponden a la familia de moléculas que tienen al menos una carga positiva y al menos un enlace glucosidico.

El uso de una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico, en particular de una molécula que tiene al menos dos funciones de guanidinio y/o amonio, de manera preferente estreptomicina, de manera más preferente en la forma de una sal, permite la precipitación de la PrP presente en la muestra biológica probada. Esta propiedad de precipitación se incrementa en la presencia de PrPsc, en particular después del tratamiento con proteinasa K (PrPres) . Esta precipitación es debida a la formación de agregados de PrP (también llamada PrP reticulada por la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico) obtenidos después del tratamiento con la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico. De esta manera, es posible detectar PrP, en particular PrPsc, por medio de un método caracterizado porque una muestra biológica derivada u obtenida de un organismo humano o animal se pone en contacto con una molécula que tiene al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, con la excepción de los antibióticos que corresponden a esta definición, tal como estreptomicina. Este método se puede implementar por medio de los pasos que consisten en: a) adicionar, a la muestra biológica derivada u obtenida de un organismo humano o animal, una molécula que tiene al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, con la excepción de los antibióticos, b) someter la solución a calentamiento (por ejemplo, entre 37 y 150°C) , y entonces a centrifugación, y separar el sedimento del sobrenadante, c) detectar la PrPsc después de la migración en un gel de electroforesis transferencia e inmunodetección, o después de la captura en un soporte sólido seguido por inmunodetección tipo ELISA. El método también puede comprender, como un" paso adicional, un paso que consiste de desnaturalización que consiste bajo las condiciones indicadas más adelante en la presente. El método también puede comprender, como un paso adicional, que precede de manera preferente al paso a), un paso que consiste de la adición de proteinasa K bajo las condiciones indicadas más adelante en la presente. De manera similar, el paso para detectar PrPsc se puede llevar a cabo bajo las condiciones indicadas más adelante en la presente. Debido a su capacidad para unirse a PrPsc, las moléculas que tienen al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, con la excepción de los antibióticos, son particularmente útiles para la precipitación, la detección y/o la diagnosis de PrPsc, aun durante la detección por in unohistoquimica, y también para la eliminación de PrPsc de un tejido o de un fluido biológico. La adición de un ligando diferente de un ligando de proteína, y en particular de un ligando macrocíclico o de un glucosa inoglucano, hace posible, diferente de los ligandos de proteína, amplificar la sensibilidad de detección de la proteína PrP y de capturar ' más efectivamente la PrP reticulada por la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico. Como resultado, se puede detectar PrP en muestras biológicas donde está presente sólo en cantidades pequeñas. La cantidad de molécula que tiene al menos una carga • positiva y/o al menos un enlace glucosidico, y también de ligando diferente de un ligando de proteína, se puede determinar fácilmente por aquellos expertos en la técnica de - acuerdo a las especificidades de la muestra. De esta manera, por ejemplo, la cantidad de molécula que tiene. al menos una carga positiva y/o un enlace glucosidico, tal como estreptomicina, puede estar entre 50 y 500 mg/ml, de manera preferente entre 100 y 300 mg/ml. Contra todas las expectaciones, la acción de una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o un enlace glucosidico en PrP, y entonces la formación en complejo del ligando diferente de un ligando de proteína con el agregado de PrP formado de esta manera, y viceversa, no daña de ninguna manera la detección de la PrP, por ejemplo usando un anticuerpo de detección anti-PrP. De acuerdo a una modalidad particular de la invención, la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico se adiciona a la muestra biológica para precipitar la PrP, antes de la adición del ligando diferente de un ligando de proteína. De manera preferente, a fin de promover la precipitación de la PrP, después de la adición de la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico, el medio de reacción se calienta de manera moderada a una temperatura de entre 25 y 45 °C, siendo preferida una temperatura de 37°C. Antes de que la muestra biológica que se va a probar se ponga en contacto con la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico, la muestra se puede pre-tratar con proteinasa K para permitir la digestión proteolítica de la PrP celular. La muestra tratada de esta manera ahora contiene, como proteína prión, sólo la proteína PrPs resistente (PrPres) el paso de tratamiento con proteinasa K es un paso discriminatorio para determinar enfermedades prión o contaminación de las muestras probadas con PrPsc en la ausencia de un anticuerpo o ligando específico para PrPsc ó para PrPres.

La cantidad de proteinasa K que se va a usar en el método de la invención se puede, determinar fácilmente por aquellos expertos en la técnica. De esta manera, por ejemplo, puede estar entre 80 y 160 µg/ml. De esta manera, de acuerdo a una modalidad preferida, el método para detectar PrP de la invención comprende el paso adicional de adicionar proteinasa K a la muestra. Este paso de digestión con proteinasa K se puede llevar a cabo ya sea antes de la reticulación de la PrP con la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico, o después de esta reticulación. De acuerdo con aun otra modalidad, el método de la invención comprende los pasos que consisten de-: a) adicionar proteinasa K a la muestra para digerir la PrP, b) adicionar, a la mezcla obtenida de esta manera, la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico para obtener agregados de PrP; c) adicionar un ligando diferente de un ligando de proteína; y d) revelar la presencia de PrPres. Los agregados de PrP formados en la presencia de la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y que contiene PrP se pueden separar del medio de reacción antes de su reacción con el ligando diferente de un ligando de proteína, ya sea que exista pretratamiento con proteinasa K o no. El método de separación se lleva a cabo por cualquier método para separar un precipitado conocido por aquellos expertos en la técnica. A manera de ejemplo, los agregados de PrP se separan del medio de reacción por centrifugación, y entonces se remueven del sobrenadante. Este paso de separación hace posible eliminar todos los productos que no se requieren para la reacción subsiguiente para detectar PrP, tal como la proteinasa K, donde es apropiado, las proteínas digeridas y la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico libre en solución. A fin de mejorar adicionalmente la sensibilidad del método de detección de la invención, antes de la reacción de los agregados de PrP con el ligando diferente de un ligando de proteína, también es posible llevar a cabo una desnaturalización de los agregados presentes en la muestra biológica que se va a probar. Este paso de desnaturalización se puede llevar a cabo por cualquier método para desnaturalizar agregados de proteína conocidos por aquellos expertos en la técnica. De manera preferente, la desnaturalización se lleva a cabo al adicionar guanidina-HCl .

De esta manera, el método para detectar PrP de acuerdo con la invención comprende de manera preferente al menos uno de los siguientes pasos, adicionales i) e ii), que consiste en: i) separar los agregados de PrP de la mezcla de reacción, y ii) desnaturalizar los agregados de PrP, estos pasos que se incluyen, donde es apropiado, entre el paso b) y el paso c) . De acuerdo a una modalidad preferida, el método de detección de la invención implementa los dos pasos i) e ii) de manera sucesiva, preferentemente entre el paso b) y el paso c) . La revelación de la presencia de PrP en una muestra biológica de acuerdo al método de la invención se puede llevar a cabo de acuerdo a los métodos convencionales para detectar los analitos en una muestra. Por ejemplo, puede llevarse a cabo por inmunodetección o no inmunodetección. El término "inmunodetección" se propone que signifique la demostración de una inmunorreacción con PrP, esta inmunorreacción que consiste de la unión entre la PrP que se va a detectar y una molécula de unión específica de PrP, o también de una reacción de' competición entre la PrP que puede estar contenida en la muestra que se va a probar y la PrP marcada. A manera de no inmunodetección, se puede hacer mención, por ejemplo de técnicas de tinción por gel de electroforesis bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La detección de PrP por inmunorreacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, después de la adición de una molécula de unión específico de PrP. El término "compañero de unión específico de PrP" se propone que signifique cualquier compañero capaz de unión a PrP. La visualización de la inmunorreacción entonces consistirá de la vieualización del complejo de PrP/compañero de unión específico de PrP. De acuerdo a una modalidad preferida, el método de la invención es tal que una molécula de unión específica a PrP para la inmunorreacción para la molécula de unión específica a PrP y la PrP se adiciona, donde es apropiado, en el paso d) . A manera de compañero de unión específico de PrP, se puede hacer mención, por ejemplo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, haptenos y aptámeros. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales o monoclonales, los anticuerpos obtenidos por recombinaciones genéticas y fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales se pueden obtener por inmunización de un animal con al menos un antígeno objetivo de interés, en el presente caso PrP, seguido por recuperación de los anticuerpos deseados en forma purificada, al muestrear el suero del animal, y a separar los anticuerpos de los otros constituyentes del suero, en particular por cromatografía de afinidad en una columna a la cual se une un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, en particular el PrP. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener por la técnica de hibridoma, el principio general de lo cual se recordará más adelante en la presente. Primero, un animal, en general un ratón (o células en cultivo en el caso de inmunizaciones in vi tro) se inmuniza con un antígeno objetivo de interés, en el presente caso PrP, los linfocitos B de los cuales entonces son capaces de producir anticuerpos contra el antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos entonces se fusionan con células de mieloma "inmortales" (células murinas en el ejemplo) para dar lugar a hibridomas . Usando la mezcla heterogénea de células obtenida de esta manera, entonces se lleva a cabo una selección de células capaces de producir un anticuerpo específico y de multiplicarse de manera indefinida. Cada hibridoma se multiplica en la forma de un clon, cada uno que de por resultado la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento con respecto al antígeno de interés se pueden probar, por ejemplo por ELISA, por inmunotransferencia unidimencional o bi-dimensional, por inmunofluorescencia, o usando un biosensor. Los anticuerpos monoclonales seleccionados de esta manera se purifica de manera subsiguiente, en particular de acuerdo a la técnica de cromatografía por afinidad descrita anteriormente. Por medio de anticuerpos apropiados para la invención, se puede hacer mención por ejemplo de los anticuerpos 8G8, 12F10 (SpiBio, Francia) y 3F4 (Immunok) . Los fragmentos de anticuerpos son tal que conservan la función de unión a PrP. El término "polipéptido" se propone que signifique una cadena de al menos dos aminoácidos. Los términos "aminoácidos" se propone que signifiquen de los aminoácidos primarios que codifican para proteínas, los aminoácidos derivados después de la acción enzimática, tal como trans-4-hidroxiprolina, y los aminoácidos que son naturales pero no están presentes en las proteínas, tal como norvalina, N-metil-L-leucina o estalina (Hunt S. en Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett GC, ed. , Chapman and Hall, Londres, 1985), aminoácidos protegidos con funciones químicas que se pueden usar en síntesis en soporte sólido o fase líquida, de aminoácidos no naturales.

El término "proteína" incluye haloproteínas y heteroproteínas tal como nucleoproteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas y glicoproteínas, tanto fibrosas como globulares . El término "ácido nucleico" se propone que signifique oligonucleótidos, ácidos desoxirribonucleótidos y ácidos ribonucleótidos, y derivados de los mismos. El término "oligonucleótidos, o denota una cadena de al menos 2 nucleótidos (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o ambos) , que pueden ser naturales o modificados. El término "nucleótido modificado" se propone que signifique, por ejemplo, un nucleótido que. comprende una base modificada y/o que comprende una modificación al nivel del enlace inte nucleótido y/o al nivel de la estructura. A manera de ejemplo de una base modificada, se puede hacer mención de inosina, metil-5-desoxicitidina, dimetilamino-5-desoxiuridina, diamino-2 , 6-purina y bromo-5-desoxiuridina. Para ilustrar un enlace internucleótido modificado, se puede hacer mención de enlaces de fosforotioato, N-alquilfosforamidato, alquilfosfonato y alquilfosfodiéster. Los alfa-oligonucleótidos tal como aquellos descritos en FR-A-2,607,507, los LNA tal como fosforotioato-LNA y 2 ' tio-LNA descritos en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, emisión 16, 18 de Agosto de 1998, páginas 2219-2222, y los PNA que son el sujeto del artículo por M. Egholm et al., J.

A . Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, son ejemplos de oligonucleótidos que consisten de nucleótidos cuya estructura está modificada. El término "hapteno" denota compuestos no inmunogénicos, es decir, compuestos incapaces por sí mismos de promover una reacción inmunitaria por producción de anticuerpos, pero capaces de ser reconocidos por anticuerpos retenidos por inmunización de animales bajo condiciones conocidas, en particular por inmunización con un conjugado hapteno-proteína. Estos compuestos tienen en general una' masa molecular de menos de 3000 Da, y más comúnmente menos de 2000 Da, y por ejemplo pueden ser péptidos glicosilados, metabolitos, vitaminas, hormonas, prostaglandinas, toxinas o varios productos medicinales, nucleósidos y nucleótidos. Los aptámeros son compañeros de captura que son de naturaleza proteínica y nucleica, y la función de los cuales es actuar como un anticuerpo y de unirse a ligandos de - proteína (Toulmé, J.J. y Giege, R., 1998, Medicine Science, 14(2) ,' 155-166) . Estos polipéptidos, proteínas, haptenos y aptámeros •tienen todos, la capacidad de unirse a PrP o al agregado de PrP. La visualización de la inmunorreacción entre la molécula de unión específica de PrP y la PrP que se lleva a cabo, en particular en el paso- d) , se puede realizar por cualquier medio de detección conocidos por aquellos expertos en la técnica, tal como medio directo o indirecto. En el caso de detección directa, es decir, sin la implicación de marcación, la inmunorreacción se observa, por ejemplo por resonancia de plasmón o por voltametría cíclica en un electrodo que tiene un polímero conductor. En el caso de detección indirecta, es decir, que comprende marcación, la marcación se lleva a cabo por medio de la molécula de unión específica a PrP, que entonces se marcará de antemano. La visualización de la presencia de PrP en una muestra biológica de acuerdo al método de la invención se puede llevar a cabo de acuerdo a un método de "competición". La PrP marcada de antemano entonces se adiciona, en particular en el paso d) , en lugar de la molécula de unión específica a PrP. En este caso, la señal de detección está a un máximo en la ausencia de PrP, y entonces disminuye gradualmente conforme se incrementa la concentración de la PrP que se busca, que no está marcada, debido a la reacción de competición. El término "marcación" se propone que signifique la unión de una marca capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitante de estas marcas consisten de: • enzimas que producen una señal que es detectable, por ejemplo, por calorimetría, fluorescencia o luminiscencia, tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, alfa-galactosidasa o glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, • cromóforos tal como compuestos o tintes luminiscentes , • moléculas radioactivas tal como 32P, 35S ó 125I, • moléculas fluorescentes tal como fluoresceína, rodamina, alexa o ficocianinas, y • partículas tal como partículas de oro, partículas magnéticas de látex o liposomas. También se pueden usar métodos indirectos, por ejemplo por medio de otro par de ligando/antiligando. Los pares ligando/antiligando son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se puede hacer mención por ejemplo de los siguientes pares: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/complemento de polinucleótido al mismo. En este caso, es el ligando que tiene el agente de unión. El antiligando puede ser detectable directamente por medio de las marcas descritas en el párrafo anterior, o pueden ser detectables por sí mismas por medio de un ligando/antiligando. Estos sistemas de detección indirecta pueden dar por resultado, bajo ciertas condiciones, una amplificación de la señal. Esta técnica de amplificación de señal es bien conocida por aquellos expertos en la técnica, y se puede hacer referencia en el artículo J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491, 1997. La marcación de proteínas es ampliamente conocida por aquellos expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, por Greg T. Hermanson en Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 EUA. De acuerdo al tipo de marcación usada, por ejemplo usando una enzima, aquellos expertos en la técnica adicionarán reactivos para visualizar la marcación. Estos reactivos son ampliamente conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen en particular en Principies and Practice of Immunoessays, 2nd Edition, Editado por C. Price, D.J. Ne an Stockton Press, 1997, 345 Park Avenue South, New York. La detección de PrP puede ser una detección en fase sólida, es decir, usando una fase sólida en la cual se inmoviliza una molécula de unión propuesto para capturar la proteína que se va a detectar. En el caso de la presente invención, es el ligando diferente de un ligando de proteína que sirve como un compañero de captura pre-inmovilizado en un soporte sólido. Un ejemplo de una detección en fase sólida bien conocida por aquellos expertos en la técnica es la detección tipo intercalación, tal como detección tipo ELISA. De esta manera, de acuerdo a una modalidad preferida de la invención, el ligando diferente de un ligando de proteína se une a. un soporte sólido. A manera de soporte sólido, se puede hacer mención, por ejemplo de cuentas, tal como cuentas magnéticas, y placas de microtitulación. El ligando diferente de un ligando de proteína se puede unir al soporte sólido de una manera conocida por aquellos expertos en la técnica, tal como por adsorción o unión covalente, la unión covalente que se prefiere. De esta manera, el soporte sólido se puede funcionalizar con una función capaz de formar un enlace con una función portada por el ligando. De acuerdo a una modalidad preferida, el soporte sólido se funcionaliza con un enlace de NHS (N-hidroxisuccinimida) o con una función de NH2. Esta función puede reaccionar con una función portada por el ligando. En esta modalidad, los ligandos que tienen una función capaz de reaccionar para formar un enlace con el enlace funcional del soporte sólido, en particular que tienen un enlace de NH2'ó COOH, son particularmente preferidos. Los ejemplos de ligandos diferentes de un ligando diferentes de un ligando de proteína incluyen, por ejemplo, ligandos macrocíclicos y glucosaminoglucanos .

Estos ligandos tienen todos, la particularidad, diferente de los ligandos de proteína, de amplificar la sensibilidad de detección de la proteína PrP. De acuerdo a una modalidad de la invención, el ligando diferente de un ligando de proteínas se elige a partir de ligandos macrocíclicos y glucosaminoglucanos . Los glucosaminoglucanos son ampliamente conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Polysaccharides, M. Yalpani, Elsevier, Amsterdam, 1988. Por medio de glucosaminoglucanos apropiados .para los propósitos de la invención, se puede hacer mención por ejemplo de heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, ácido hialurónico y sulfato de queratina. El término "ligando macrocíclico" se propone que signifique un compuesto que consiste de una sucesión de anillos que forman un macrociclo. Los ligandos macrocíclicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. A manera, de ejemplo no limitante, se puede hacer mención de ciclofanos, metaciclofanos, ciclodextrinas, ciclo (ácidos tetra-cromotrópicos) , esferandos y ciclo[n]veratrilenos . Los ligandos macrocíclicos tienen la ventaja particular que hacen posible atrapar la proteína que se va a probar en forma libre o en la forma de un agregado, mediante un efecto de jaula. Los ligandos macrocíclicos se pueden preparar de acuerdo a las técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo como se describe en Comprehensive Supramolecular Chemistry, Pergamon, Oxford, 1996. Los ligandos macrocíclicos que se prefieren para el método de la invención se eligen a partir de metaciclofanos, calixarenos que son particularmente preferidos. Estos compuestos de calixarenos se pueden obtener de acuerdo a la metodología descrita en Arduini, A. et . al., 1996, Macro'cycle Synthesis, Eds. Harwood, L.M. & Moddy, C.J. Oxford University Press, Ocford y Da Silva et. al., 2001, J. Supramol . Chem., 1:135-138. De acuerdo a una modalidad preferida, el ligando macrocíclico. de la invención corresponde a la fórmula general (I) a continuación: en el cual R? representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR, R que es como se define más adelante, R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo R, COR, Pol o CH2Pol, en el cual Pol representa un grupo fosfato, sulfato, amina, amonio o ácido carboxílico, y R es como se define más adelante, R3 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR en el cual R es como se define más adelante; R4 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR, un grupo 0CH2R o un grupo OCOR, en el cual R es como se define más adelante, Y es un.átomo de carbono, nitrógeno o azufre, R5 y R6, cada uno independientemente, están ausentes o representan un átomo de hidrógeno, un grupo CH2 o un grupo R como se define más adelante, o también R5 y R6 representan conjuntamente un átomo de oxígeno o azufre, X representa un grupo CH2, o un átomo de oxígeno o azufre, m representa un número entero igual a 0 ó 1, R representa un átomo de hidrógeno o una cadena basada en hidrocarburo cíclico o no cíclico, ramificado o no ramificado, saturado ó no saturado, que puede estar sustituida o no con un grupo halógeno, y que tiene funciones polares o no polares, n es un número entero entre 3 y 15, los eustituyentes Rx a R5, R, X y Y, y el número entero pueden ser de naturaleza diferente de acuerdo a las unidades . De esta manera, el compuesto de la fórmula (I) está en la forma de una sucesión de n unidades caracterizada por la presencia de un anillo de benceno, y los sustituyentes de este anillo pueden ser variables de una unidad a la otra, dentro del límite de sus definiciones anteriores. Las cadenas basadas en hidrocarburo cíclico o no cíclico, ramificado o no ramificado, saturado . o no saturado que pueden estar sustituidos o no con un grupo halógeno, y que tienen funciones polares o no polares, son ampliamente conocidos por aquellos expertos en la técnica. A manera de ejemplos, se puede hacer mención de alquilos, alquenos, arilos y anillos saturados tal como ciclohexano. Un ejemplo de un grupo no polar es CF3 y los ejemplos de grupos polares son los sustituyentes Pol como se define anteriormente. Los compuestos de la fórmula (I) que son particularmente preferidos corresponden a la fórmula (la) a continuación: en la cual n es un número entero entre 4 y 8, cada grupo R2, tomado independientemente, es un grupo sulfato o un grupo fosfato, R7 representa un grupo (CH2)r- (CO)s- (NH2) o un grupo (CH2)t-C00H donde t es un número entero entre 0 y 6 y s es un número entero entre 0 y 6. Los compuestos de la fórmula (la) que son particularmente preferidos son aquellos para los cuales los dos grupos R2 son cada uno un grupo sulfato, n es 4, 6 u 8, y R7 es un átomo de hidrógeno, un grupo -CH2COOH, un grupo -CH2CONH2 o un grupo -CH2CH2NH2, que constituye una modalidad de la invención. De acuerdo a una modalidad preferida, el ligando macrocíclico corresponde a la fórmula general (la) en la cual n = 6, X = Y = sulfato y R7 es -CH2CH2NH2. Para la implementación del método para inmunodetectar PrP patógena de la invención, se puede hacer uso de equipos de diagnóstico que comprende un ligando diferente de un ligando de proteína, de manera preferente, un ligando macrocíclico, y una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico. De acuerdo a una modalidad preferida, el ligando diferente de un ligando de proteína presente en el equipo se une a un soporte sólido para llevar a cabo la detección de PrP patógena de acuerdo a un método de detección en fase sólida. La invención se entenderá más completamente a partir de los siguientes ejemplos dados a manera de ilustración no limitante, y también de las figuras 1 a 10, en las cuales: La figura 1 es una representación gráfica que da los valores OD obtenidos después de la detección, por el método dé la invención, de PrPres en muestras de suero de ratón, de suero ovino y de plasmas bovinos, que son positivos, (+) o negativos (-) , La figura 2 es una representación gráfica que da los valores OD obtenidos después de la detección, por el método de la invención, de PrPres en muestras de plasma bovino positivos (plasma +) o negativos (plasma -) usando dos diferentes anticuerpos reveladores, La figura -3 es una representación gráfica que da los valores OD obtenidos después de la detección, por el método de la invención, de PrPres en muestras de sueros humanos y plasmas de humano positivos con respecto a la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD +) o negativo (CJD -) usando dos diferentes anticuerpos reveladores, Las figuras 4A-4B son representaciones esquemáticas (figura 4A) de un gel de electroforesis (figura 4B) después de la transferencia Western, obtenido después de la migración de muestras cerebrales bovinas de BSE tratadas ya sea con sesquisulfato de estreptomicina (sendas 5-7 y 13-15) , o con estreptomicina (sendas 2-4 y 10-12), las sendas 1 y 9 que corresponden al control no tratado y la . senda 8 que corresponde a la senda del marcador de peso molecular, Las figuras 5A-5B son representaciones esquemáticas (figura 5A) de un gel de electroforesis (figura 5B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de muestras cerebrales bovinas de BSE tratadas con cantidades crecientes de trietilentetramina (sendas 2-6) , la senda 1 que corresponde al control no tratado y la senda 8 que corresponde a la senda de marcador de peso molecular. Las figuras 6A-6B son representaciones esquemáticas (figura 6A) de un gel de electroforesis (figura 6B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de muestras cerebrales bovinas de BSE tratadas con cantidades crecientes de bis-3-aminopropilamina (sendas 3-7) , la senda 2 que corresponde al control no tratado y la senda 1 que corresponde a la senda del marcador de peso molecular, Las figuras 7A-7B son representaciones esquemáticas (figura 7A) de un gel de electroforesis (figura 7B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de muestras cerebrales bovinas de BSE tratadas con estreptomicina y el calixareno p-sulfonato-3 , 7- (2- aminoetiloxi) calix-[6]areno (sendas 7 a 15), las sendas 1 a 3 que corresponden a las muestras de control sin la adición de estreptomicina o calixareno, y las sendas 4 a 6- que corresponden a las muestras en las cuales sólo se adicionó el calixareno, Las figuras 8A-8B son representaciones esquemáticas (figura 8A) de un gel de electroforesis (figura 8B) después de la transferencia Western, obtenido después de la migración de muestras de sangre humana normal (o negativas para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob) sobrecargadas con 1 % de homogenizado de bazo, positivas o negativas para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (respectivamente CJD+ o CJD- ) , tratadas con estreptomicina y heparina (sendas 1 a 5 para CJD+ y sendas 8 a 12 para CJD-) , la senda 6 que corresponde a la senda del marcador de peso molecular y la senda 7 que corresponde a la muestra de control positivo, Las figuras 9A-9B son representaciones esquemáticas (figura 9A) de un gel de electroforesis (figura 9B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de muestras de sangre humana normal sobrecargadas con 5 % de homogenizado de bazo, positivas o negativas para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (respectivamente CJD+ o CJD-) , tratadas con estreptomicina y heparina (sendas 1 a 5 para CJD+ y sendas 8 a 12 para CJD-), la senda 6 que corresponde a la senda del marcador de peso molecular y la senda 7 que corresponde a la muestra de control positivo, y Las figuras 10A-10B son representaciones esquemáticas (figura 10A) de un gel de electroforesis (figura 10B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de ' muestras de sangre humana normal sobrecargadas con 10 % de homogenizado de bazo, positivas o negativas para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (respectivamente CJD+ o CJD-),. tratadas con estreptomicina y heparina (sendas 1 a 5 para CJD+ y sendas 8 a 12 para CJD-) , la senda 6 que corresponde a la senda del marcador de peso molecular y la senda 7 que corresponde a la muestra de control positivo.

Ejemplo 1: Pretratamiento de las muestras 1. Muestras de órganos sólidos tal como extracto cerebral, no tratadas con estreptomicina Los órganos (cerebro, etc.) primero que todo se homogenizan en una solución de glucosa al 5 % (p/v) a fin de obtener una suspensión al 10 %. Se adicionan 5 µl de una solución de 2 mg/1 de proteinaza K (PK) , 1 µl de una solución de SDS al 10 % (dodecil-sulfato de sodio) y 6 µl de una solución al 2.5 % p/v de N-octil-ß-D-glicopiranósido en agua a 1.00 µl de la solución homogenizada descrita anteriormente. La mezcla se somete a vórtice y entonces se incuba a 37°C durante 60 minutos. Entonces se adicionan 500 µl de una mezcla de cloroformo:metanol (1:2) y la mezcla se somete a vórtice. Esto se sigue por un paso de centrifugación a 15000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. El sobrenadante entonces se remueve y el sedimento se re-suspende en 25 µl de una solución de clorhidrato de guanidina 6M. La suspensión se incuba a 37°C durante 30 minutos . Finalmente, se adicionan 400 µl de una solución de PBS (solución salina amortiguada con fosfato) y Tween 20 (0.05 % p/v) . 2. Muestras de órganos sólidos tal como extracto cerebral, tratadas con estreptomicina Los órganos (cerebro, bazo, etc.) primero que todo se homogenizan en una solución de glucosa al 5 % (p/v) a fin de obtener una suspensión al 10 %. Se adicionan 5 µl de una solución de 2 mg/1 de proteinaza K (PK) , y 20 µl de una solución al 2.5 % p/v de N-octil-ß-D-glicopiranósido en agua a 100 µl de la solución homogenizada descrita anteriormente. La mezcla se somete a vórtice y entonces se incuba a 37°C durante 30 minutos. Se adicionan 20 µl de una solución de sulfato de estreptomicina a una concentración de 1 g/ml, y la mezcla se agita y se vuelve a incubar a 37°C durante 1 hora. Entonces se adicionan 500 µl de una mezcla de cloroformo:metanol (1:2) y la mezcla se somete a vórtice; Esto se sigue por un paso de centrifugación a 10000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. El sobrenadante entonces se remueve y el sedimento se vuelve a suspender en 25 µl de una solución de clorhidrato de guanidina 6M. La suspensión se incuba a 37°C durante 30.. minutos . Finalmente, se adicionan 400 µl de una solución de PBS y Tween 20 (0.05 % p/v) . 3. Muestras de fluidos biológicos tal como suero y plasma, tratadas con estreptomicina Se adiciona una solución de proteinaza K a 100 µl de suero o plasma tal que la concentración final de la enzima es 80 µg/ml. La solución entonces se mezcla al someter a vórtice y se incuba a 37°C durante 30 minutos. Se adicionan 20 µl de una solución de sulfato de estreptomicina a una concentración de 1 g/ml, y la mezcla se agita y se vuelve a incubar a 37°C durante 1 hora.

Después de la centrifugación a 15000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se descarta. El sedimento residual se vuelve a suspender en 25 µl de una solución 6M de clorhidrato de guanidina en agua por medio de vórtice. La suspensión entonces se incuba a 37°C durante 30 minutos. Entonces se adicionan 400 µl de una solución de PBS con 0.05 % (p/v) de amortiguador de Tween 20, y la mezcla se somete a vórtice. 4. Muestra de 'fibrillas de PrPsc digeridas, purificadas (PrPres) (SAF) , preparadas del sistema nervioso Los órganos (cerebro, etc.) primero que todo se homogenizan en una solución de glucosa al 5 % (p/v) a fin de obtener una suspensión al 10 %, y se filtran. La PK se usa en una proporción de 25 µg por 100 mg de tejido. Después de homogeniz ción con el vórtice, el tubo se coloca en una incubadora a 37°C durante 1 hora. La acción de la PK se detiene por homogenización con Pefabloc® a 10 mM. La preparación para la ultracentrifugación comprende homogenización de 1000 µl de material molido digerido con 600 µl de Sarkosyl al 30 %. La mezcla se deja a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos antes que se transfiera en un cojín de sacarosa (400 µl de sacarosa al 10 %) en tubos de ultracentrifugación (Beckman, Quick Seal, 2.2 mi) . El tubo se rellena con agua ultrapura, y entonces se sella térmicamente y se coloca en el rotor de ultracentrifugación. Esta ultracentrifugación dura 2 horas a 100000 rpm y 20°C. Entonces se succionan 2/3 del sobrenadante, incluyendo la fracción de lípido. El sedimento se seca al voltear hacia arriba en papel absorbente. El sedimento entonces se toma con 100 ó 200 µl de PBS para uso inmediato, o de amortiguador de desnaturalización para congelación. En este último caso, los sedimentos se calientan a 100°C durante 10 minutos. Después del enfriamiento, los tubos se centrifugan durante 5 minutos a 12000 rpm a 20°C. Los sobrenadantes se congelan a -80°C. Estas muestras sirven como normas de Prpres purificadas "positivas".

Ejemplo 2: Preparación del ligando de calixareno p-sulfonato-3 , 7- (2-amino-etiloxi) calix-fdl-areno (llamado C6S) 1. Preparación Este ligando de adyuvante macrocíclico C6S tiene la siguiente fórmula general: Este ligando se prepara de acuerdo al método descrito en Eric Da Silva y Anthony W. Coleman, Synthesis and complexation properties towards amino acids of mono-substituted p-sulphonato-calix-[n]-arene, Tetrahedron 59 (2003) 7357-7364. Este ligando entonces se puede acoplar a un soporte sólido (cuenta o placa) que tiene una superficie activada como se indica más adelante en la presente. 2. Injerto de ligando C6S en las placas Las "placas activadas de NHS" de 96 cavidades son de la compañía Covalab (Lyon, Francia) . Se disuelven 100 µl de una solución de ligando a varias concentraciones en amortiguador de fosfato 50 M, pH 8.2. Las cavidades se lavan 3 veces (3 x 200 µl) con agua MilliQ después de la incubación durante dos horas a 37 °C. Las placas se secan a temperatura ambiente antes que se usen.

Esquema de injerto : 3. Injerto en cuentas: Se toman en alícuota en tubos de 1 mi, 4 mi de una solución de cuentas activadas de NHS (2 x 109 cuentas/mi; Dynabeads® M 270 Amine, compañía Dynals, Noruega) . Las cuentas se centrifugan y precipitan por magnetización. El sobrenadante se remueve y las cuentas se lavan 3 veces con 1 mi de agua. El sedimento de las cuentas se toma de varios volúmenes de solución de calixareno en un amortiguador de fosfato de 50 mM, pH 8.2 y se adicionan 600 µl, 120 µl, 60 µl y 12 µl de una solución de ligando a 50 mg/ml (amortiguador de fosfato 50 mM, pH 8.2). Las cuentas se agitan a temperatura ambiente durante 24 horas. Las cuentas se lavan 3 veces con agua MilliQ 18O a fin de remover el ligando que no ha reaccionado. Las cuentas se conservan en 1 mi de agua a fin de. reconstituir la concentración inicial de 2 x 109 cuentas/mi. La solución de cuentas está lista para el uso. Estas cuentas se definen como "cuentas C6S" a todo lo largo del texto .

Esquema para injerto de C6S en las cuentas: Ejemplo 3: Detección de PrPres 1. Muestras usadas Las muestras positivas de cerebro, suero y plasma bovino se derivan de animales que se han confirmado que sufren de una enfermedad prión de TSE (encefalitis espongiforme transmisible) por métodos de referencia convencionales, incluyendo una búsqueda, por transferencia Western, para PrPres en el tejido cerebral, como se describe por Madec et al, 2000, Microbiol pathogenesis, 28: 353-362. Los controles negativos corresponden a muestras de cerebros, suero y plasma de animales para las cuales se ha excluido la posibilidad de que sufran de enfermedades prión por los mismos análisis. El anticoagulante usado para las muestras de plasma es EDTA. Estas muestras se proporcionan por la AFSSA (Agence Fran?aise de Sécurité Sanitaire des Aliments) [agencia francesa para seguridad de productos alimenticios] , Lyon, Francia. 2. Detección de PrPres de acuerdo a un método tipo ELISA Antes del uso, las cavidades de las placas obtenidas de acuerdo al ejemplo 2, punto 2 anterior se p-saturan por tratamiento con una mezcla de leche descremada (5 %) y PBS/Tween 20 (0.05 % p/v) a 37°C durante 60 minutos. Las cavidades entonces se lavan 3 veces con 800 µl de PBS/Tween 20 (0.05 % p/v) por cavidad. El amortiguador residual se remueve al voltear hacia arriba las placas . 100 µl de cada muestra de fluido biológico preparada de acuerdo al ejemplo 1, punto 3 anterior, se distribuyen a las cavidades y la placa se incuba a 37°C durante 100 minutos con agitación mecánica a 400 rpm. Después de esta primera incubación, cada cavidad se volvió a lavar tres veces con 800 µl de la mezcla de PBS/Tween 20 (0.05 % p/v) y las placas entonces se secan. El anticuerpo revelador anti-PrP, marcado con peroxidasa y diluido a 0.05 µg/ml en la mezcla de PBS/Tween 20- (0.05 % p/v), se adiciona en una proporción de 100 µl por cavidad y la placa se incuba nuevamente a 37°C durante 60 minutos . El anticuerpo usado reconoce la región definida por los aminoácidos 145-154 de PrP humana y las regiones homologas de PrP de animal (anticuerpo AC23) . La placa entonces se enjuaga tres veces con 800 µl de una solución de PBS/Tween.20 (0.05 % p/v) (PW41, Sanofi Pasteur) y el amortiguador residual se remueve al voltear hacia arriba la placa. La revelación se lleva a cabo al adicionar, a cada cavidad, 100 µl de una solución reveladora preparada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (equipo bioMérieux) . La placa se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. La reacción se detiene al adicionar 50 µl de la solución de ácido sulfúrico (1.8N). La señal obtenida se lee usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm (Espectrofotómetr'o PR2100, Biorad) . 3. Detección de PrPres en el cerebro de acuerdo a la técnica de transferencia Western El protocolo usado corresponde al protocolo de referencia usado para la diagnosis de certidumbre de enfermedades prión en animales y descrito por Madec et al, 2000, Microbiol pathogenesis , 28: 353-362. 4. Resultados Los resultados se dan en la tabla 1 a continuación: Tabla 1: Representación de la especificidad de detección, por el método tipo ELISA descrito anteriormente, de PrPres en el suero y el plasma de ganado vacuno, por comparación con el protocolo de referencia tipo transferencia Western llevado a cabo en el cerebro de los mismos animales. Tabla 1 Estos resultados muestran claramente que el método de la invención hace posible detectar PrP en fluidos biológicos, debido al acuerdo entre las dos pruebas (método de la invención y transferencia Western de referencia) . Además , el método de la invención también es aplicable en fluidos fisiológicos tal como sueros y plasmas.

Ejemplo 4: Aplicación del método de la invención a varias especies 1. Muestras Además de las muestras usadas en el ejemplo 3 anterior, se usaron muestras positivas de cerebro, suero y plasma ovino derivadas de animales que se confirmaron que sufren de la enfermedad prión escrapie por medio de una búsqueda, por transferencia Western, para PrPres en el tejido cerebral, y también plasmas en los miembros de la raza ovina infectados con una cepa de BSE que se origina de las cepas bovinas (contadas como bovinas positivas) . Se tomaron muestras de suero murino de ratones C57BL6 que se han incubado de antemano, por inyección intraperitoneal, con 100 µl de una suspensión de cerebro de una oveja que sufre de una cepa de escrapie C506M3 adaptada a ratón, a 10 % de una solución de glucosa al 5 % y diluido a 1/200. La sangre se recolectó del seno orbital 15 días después de la inoculación. También se proporcionaron estas muestras por la AFSSA (Agence Fran?aise de Sécurité Sanitaire des Aliments) [agencia francesa para seguridad en productos alimenticios], Lyon, Francia. 2. Detección de PrPres en fluidos biológicos de acuerdo a un método tipo ELISA El protocolo descrito en el ejemplo 3, punto 2 anterior, se repitió. 3. Resultados Los resultados se reportan en la figura 1 qué dan los valores OD obtenidos en suero de ratón positivo o negativo (+. o -) , muestras de plasma bovino y de suero ovino. Esta figura demuestra que, sorprendentemente, cualesquiera de las especies consideradas, el valor de densidad óptica para las muestras derivadas de animales que sufren de enfermedad prión es significativamente positiva en comparación con las muestras derivadas de animales de control . El método de la invención por lo tanto es aplicable a varias especies.

Ejemplo 5: Uso de varios anticuerpos en el método de la invención 1. Muestras Se usaron muestras bovinas como se describe en el - ejemplo 3. 2. Detección de PrPres en fluidos biológicos de acuerdo a un método tipo ELISA El protocolo descrito en el ejemplo 3, punto 2 anterior, se repitió, usando como anticuerpo revelador ya sea el anticuerpo AC23 como se describe anteriormente, o el anticuerpo 8D11G12 (bioMérieux, Francia) . 3. Resultados Los resultados se reportan en la figura 2 que da los valores de OD obtenidos en las muestras de plasma bovino positivas o negativas (+ o -) . Esta figura demuestra que el método de la invención se puede llevar a cabo con varios anticuerpos anti-PrP.

Ejemplo 6: Detección de PrPres en órganos sólidos 1. Muestras Las muestras usadas corresponden: i) a muestras cerebrales derivadas de ganado vacuno positivo o negativo que se confirmó que sufre o no sufre de una enfermedad prión por los métodos convencionales de referencia, que incluye la búsqueda, por transferencia Western, para PrPres en el tejido cerebral, y ii) a cerebros y bazos tomados de ratones ya inoculados I/C con una cepa adaptada a ratón de escrapie y que muestra síntomas específicos para la enfermedad. Estas muestras se proporcionaron por la AFSSA (Agence Fran?aise de Sécurité Sanitaire des Aliments) [agencia francesa para seguridad en productos alimenticios], Lyon, Francia. Se trataron como se indica en el ejemplo 1, punto 2 anterior. 2. Detección de PrPres en órganos sólidos de acuerdo a un método tipo ELISA El protocolo descrito en el ejemplo 3, punto 2 anterior, se repitió. 3. Resultados Los resultados en las mismas muestras de órgano sólido por el método de transferencia de referencia Western se compararon con aquellos obtenidos por el método de la invención. Los resultados demuestran que el uso del método de la invención que combina tanto el uso de estreptomicina durante la preparación de los cerebros y el uso de un calixareno de acuerdo con un método tipo ELISA permitió la detección de PrPres en todas las muestras positivas. Este uso del método de la invención también permite la detección de PrPres en los cerebros y bazos tomados de ratones inoculados con una cepa adaptada a ratón de escrapie.

Ejemplo 7: Detección de PrPres en plasma y suero humano • 1. Muestras Las muestras usadas corresponden a muestras de plasma y suero tomadas de pacientes positivos y negativos confirmados como que sufren o que no sufren de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob por los métodos convencionales de referencia 2. Detección de PrPres en suero y plasma de acuerdo a un método tipo ELISA El protocolo descrito en el ejemplo 3, punto 2 anterior, se repitió usando, como anticuerpo revelador, ya sea el anticuerpo AC23 como se describe anteriormente, o el anticuerpo 8D11G12 (bioMérieux, Francia) . 3. Resultados Los resultados se indican en la figura 3, que es una representación gráfica que da los valores OD obtenidos después de la detección, por medio del método de la invención, de PrPres en muestras de suero y plasma humanas positivas con respecto a la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (CJD+) o negativas (CJD-), usando dos diferentes anticuerpos reveladores . La figura 3 demuestra que, de manera sorprendente, el método de la invención permite la detección de PrPres de manera específica, en el suero y plasma de pacientes que sufren de CJD. Por lo tanto el método de la invención también es aplicable a humanos.

Ejemplo 8: Uso de varias moléculas que tienen al menos una carga positiva v/o al menos un enlace glucosidico 1. Preparación de las muestras La muestra que se va a probar se preparó a partir de homogenado de cerebro bovino positivo a BSE como sigue: - 1 µg de proteinasa K se adicionó a 100 µl de un homogenado al 10 % de cerebro bovino positivo a BSE suspendido en una solución de glucosa al 5 %, y entonces que se incubó a 37°C durante una hora; - entonces se adicionaron 100 µl de amortiguador Laemmli, la mezcla se sometió a vórtice, se calentó a 100°C durante 5 minutos, y se centrífugo a 12000 rpm durante 5 minutos, y los sobrenadantes se recuperaron. Se usaron volúmenes de 5, 6, 8, 10 ó 50 µl de esta suspensión, que corresponden a 250, 300, 400, 500 ó 2500 µg de tejido cerebral para los experimentos descritos más adelante, con o sin adición de molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico. 2. Transferencia Western Después de la migración en un gel de electroforesis de poliacrilamida al 15 % unidimensional en la presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) como se describe por Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685, las proteínas se transfieren por electroforesis sobre membranas de nitrocelulosa y se inmunotransíieren a temperatura ambiente durante 60 minutos con un anticuerpo monoclonal (Spi-Bio, Francia) que reconoce un epítope específico para la proteína prion que consiste de los aminoácidos 146-160. El anticuerpo de detección secundario (1/5000) es un anticuerpo de cabra dirigido contra cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de ratón, conjugado a peroxidasa de rábano (IgG H+L) . Las transferencias entonces se lavan y las señales se detectan por quimioluminescencia ya sea con un equipo ECL (Amersham) en películas (Biomex light, Kodak) o con un super Signal Ultra (Pierce) y visualización en un Fluor S. Multimager (BioRad) . 3. Detección de PrPres usando sescruisulfato de dihidroestreptomicina Esta molécula es una molécula que tiene dos funciones guanidino y una función amonio.

Se adicionaron concentraciones crecientes (0, 2.5, 5 y 10 mg) de sesquisulfato de dihidroestreptomicina, o de estreptomicina a manera de comparación, a un volumen constante de PrPsc (50 µl) en la muestra preparada en el punto 1 anterior. Después de la incubación a 37°C durante una hora, se llevó a cabo la centrifugación a 12000 rpm durante 5 minutos y se recuperó el sobrenadante (sobrenadante de inicio) . Los sedimentos también se recuperaron y se adicionaron a esto 50 µl de una solución p/v de urea 8M y de amortiguador Laemmli. Después de la agitación vigorosa con un vórtice, se calentaron a 100°C durante 5 minutos y se centrifugaron a 12000 rpm durante 5 minutos. Finalmente, se recuperaron los sobrenadantes (sobrenadante de sedimento) . Los sobrenadantes de inicio y también los sobrenadantes de sedimento se migraron en SDS-PAGE como se indica en el punto 2 anterior. Los resultados de esta prueba se indican en la figura 4, dando una representación gráfica del gel de electroforesis obtenida después de la migración y donde las varias sendas 1 a 15 corresponden a las condiciones de tratamiento dadas en la tabla 2 a continuación, con o sin las moléculas basadas en estreptomicina. Tabla 2 Senda Condiciones de tratamiento Sobrenadante relacionado 12 10 mg de estreptomicina Sobrenadante de sedimento 13 2.5 mg de sesquisulfato de Sobrenadante de dihidroestreptomicina sedimento 14 5 mg de sesquisulfato de Sobrenadante de dihidroestreptomicina sedimento 15 10 ' mg de sesquisulfato de Sobrenadante de dihidroestreptomicina sedimento Como se indica en la figura 4, en la ausencia de las moléculas probadas, todas las bandas de PrPsc se identifican como que están en el sobrenadante y en la presencia de estreptomicina o sesquisulfato de dihidroestreptomicina, el material de PrPsc se encuentra en el sedimento. Los resultados muestran que el sesquisulfato de dihidroestreptomicina, al igual que la estreptomicina, adicionado al medio, induce reticulación de PrP que permite precipitación completa de la misma con una centrífuga simple (no necesita ultracentrifugación) . Los agregados obtenidos de esta manera pueden permitir la detección de PrP, donde es apropiado después de la reacción con un ligando diferente de un ligando de proteína, de acuerdo al método de la invención. 4. Detección de PrPsc usando trietilentetramina o TET Esta molécula es una molécula que tiene cuatro funciones de amonio. Para este experimento, se adicionaron concentraciones crecientes de TET (105, 210, 420, 630 y 840 µg) a volúmenes constantes (5 µl) de PrPsc obtenido de 250 µg de cerebro de un animal bovino que sufre de BSE, preparado de acuerdo al punto 1 anterior. La mezcla se centrifugó inmediatamente a 12000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se usó para inmunodetección por transferencia Western. Los resultados se indican en la figura 5, que da una representación gráfica del gel de electroforesis obtenido después de la migración, donde las varias sendas 1 a 7 corresponden a las condiciones del tratamiento dadas en la tabla 3 más adelante, con o sin TET.

Tabla 3 Los resultados en la figura 5 muestran que el incremento en la cantidad de trietilentetramina en el medio a través de la adición de 105, 210, 420, .630 y 840 µg inducen espontáneamente un incremento en la masa molecular aparente de la proteína prión en comparación a un control- sin molécula. De esta manera, la detección de la proteína prion es proporcional a la cantidad de trietilentetramina adicionada. Estos resultados confirman que TET produce los mismos efectos como estreptomicina, en PrP, bajo las condiciones probadas, es decir, una reticulación de PrP proporcional a la dosis de TET, objetada por el incremento en el peso molecular aparente de las bandas que han migrado en el gel de acrilamida. 5. Detección de PrPs usando bis-4-aminopropilamina Esta molécula es una molécula que tiene tres funciones de amonio. El procedimiento descrito en el punto 3 anterior se repitió, con excepción que se adicionaron cantidades crecientes, de bis-3-aminopropilamina (130, 260, 520, 780 y 1040 µg) a volúmenes constantes (5 µl) de PrPsc en lá muestra preparada en el punto 1 anterior, y la mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Los resultados se indican en la figura 6, que da una representación gráfica del gel de electroforesis obtenido después de la migración del sobrenadante de sedimento, y donde las varias sendas 1 a 7 corresponden a las condiciones de tratamiento dadas en la tabla 4 más adelante, con o sin bis-3-aminopropilamina Tabla 4 Los resultados indicados en la figura 6 muestran que el incremento en la cantidad de bis-3-aminopropilamina en el medio a través de la adición de 130, 260, 520, 780 y 1040 µg induce un incremento en la masa molecular aparente de las 3 bandas de proteína prión en comparación a un control sin la molécula. Bajo estas condiciones, la proteína prión precipita bajo las condiciones de centrifugación mencionadas en los puntos anteriores, que también corrobora efectos similares a aquellos producidos por estreptomicina. 6. Conclusión Los resultados muestran que las moléculas probadas adicionadas al medio inducen a reticulación de PrP, que permite precipitación completa de la misma con una centrífuga simple. Los agregados obtenidos de esta manera pueden permitir la detección de PrP, donde es apropiado después de la reacción como un ligando diferente de un ligando de proteína de acuerdo al método de la invención. Ejemplo 9: Detección de PrPres en cerebro bovino por transferencia Western, por tratamiento de la muestra con calixareno C6S v con estreptomicina Las muestras usadas corresponden a - muestras cerebrales derivadas de animales bovinos positivos que se confirmaron que sufren de una enfermedad prión por los métodos de referencia convencionales, incluyendo la búsqueda, por transferencia Western, para PrPres en el tejido cerebral. Los órganos primero que todo se homogeneizan en una solución de glucosa al 5 % (p/v) a fin de obtener una suspensión al 10 %. Se adiciona 1 µl de una solución 0.1M de calixareno C6S a 100 µl de la solución homogeneizada descrita anteriormente, y la mezcla entonces se somete a vórtice y se incuba durante una hora a 37°C. Se adicional 7 µl de una solución de 2 mg/1 de proteinasa K (PK) y la mezcla se somete al vórtice y entonces se incuba a 37°C durante 30 minutos. Se adicional 20 µl de una solución que contiene una concentración creciente de sulfato de estreptomicina (5 %, 10 % y 20 %) , y la mezcla se agita y entonces se vuelve a incubar a 37°C durante 1 hora. Después de haber adicionado 100 µl de amortiguador Laemmli desnaturalizante, la mezcla se calienta a 100°C durante 5 minutos y se centrífuga a 12000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se descartan y los sedimentos se recuperan. Se adicionan a esto 50 µl de una solución al 50 % v/v de urea 8M y amortiguador de Laemmli. Después de sometimiento vigoroso a vórtice, la mezcla se calienta a 100°C durante 5 minutos y se centrífuga a 12000 rpm durante 5 minutos, y los sobrenadantes entonces se recuperan para migrarlos en SDS-PAGE como se describe por Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685. Después de la migración, las proteínas se transfieren por electroforesis en membranas de nitrocelulosa y se inmunotransfieren a temperatura ambiente durante 60 minutos con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope especifico que consiste en los aminoácidos 126-160 (Spi-Bio, Francia) . El anticuerpo secundario (1/5000) es un anticuerpo de cabra dirigido contra las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón, conjugados a peroxidasa de rábano (IgG H+L) . Las transferencias entonces se lavan y las señales se detectan por quimioluminiscencia ya sea con un equipo ECL (Amersham) en películas (Biomex light, Kodak) , o con un super Signal Ultra (Pierce) y visualización en un Fluor S. Multimager (BioRad) . Los resultados se dan en la figura 7, en la cual las sendas 1 a 3 corresponden a las muestras de control no tratadas con el calixareno y estreptomicina, las sendas 4 a 6 corresponden a las muestras tratadas con el calixareno solo (tratamiento de acuerdo al procedimiento anterior, pero sin el paso del tratamiento con estreptomicina) y las sendas 7 a 15 corresponden a las muestras tratadas con calixareno, y entonces con estreptomicina en una proporción de 5 % (sendas 7 a 9), 10 % (sendas 10 a 12) y 20 % (sendas 13 a 15). Los resultados demuestran que la detección de PrPres se mejora al usar conjuntamente calixareno y estreptomicina, y que la sensibilidad de este método se incrementa con la cantidad de estreptomicina usada. Ejemplo 10: Detección de PrPres en un fluido biológico por transferencia Western, por tratamiento de la muestra con heparina y con estreptomicina 1. Muestras 1.1: Preparación de extractos de bazo para la producción de una norma positiva y negativa Los extractos de bazo se prepararon a partir de muestras de autopsia de bazo de un paciente quien ha muerto de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob de un nuevo tipo variante, y de un paciente que no sufre de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) . Las muestras de bazo se homogeneizaron primero que todo en un amortiguador de lisis (NP-40 al 0.5 % (Nonidet P-40) + DOC al 0.5 % (desoxicolato de sodio)) a fin de obtener una suspensión al 10 %. Los homogenados obtenidos de esta manera entonces se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos a fin de remover los desechos celulares. Los sobrenadantes se conservaron para la sobrecarga de las muestras sanguíneas. 1.2: Tratamiento de muestras sanguíneas Una mezcla de varias sangres, tomadas de pacientes que no sufren de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (donadores normales) , y puestas en contacto con un glucosaminoglucano, en este caso heparina en la forma de la sal de litio de la misma, se prepara. 1.3: Producción y tratamiento de muestras sobrecargadas con la norma positiva y negativa 1.3.1: Sobrecarga La mezcla de sangre, pretratada con heparina, se distribuyó en varias alícuotas para sobrecargar cada alícuota con una concentración diferente de homogenado de bazo positivo o negativo para CJD (1 %, 5 % y 10 %) (v/v), de acuerdo a las cantidades indicadas en la tabla 5 a continuación.

Tabla 5 1.3.2: Digestión con proteinasa K Después de la sobrecarga, las muestras se digirieron con proteinasa K (PK) de acuerdo a un intervalo de concentración final de entre 0 y 300 µg/ml (0-50-100-200 y 300 µg/ml en 250 µl de muestra) . Después del tratamiento en vórtice, las muestras se incubaron en una incubadora durante 30 minutos a 37°C. 1.3.3: Incubación con estreptomicina Entonces se adicionaron 25 µl de estreptomicina (Gibco) a 1 g/ml (en agua destilada) a la mezcla (concentración final de 200 mg/ml) y entonces, después de la homogenización con un vórtice, las muestras se incubaron durante 60 minutos en una incubadora a 37°C. 1.3.4: Preparación para la transferencia Western Al final de la incubación, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 15000 rpm y los sobrenadantes se removieron. El sedimento se volvió a disolver en 50 µl de un amortiguador desnaturalizante de SDS y después del calentamiento durante 10 minutos a 100°C, las muestras nuevamente se centrifugaron durante 5 minutos a 12000 rpm.

Los sobrenadantes se tomaron para análisis por transferencia Western. 2. Detección de PrPres en la sangre sobrecargada de acuerdo a la técnica de transferencia Western 2.1: Migración de transferencia electroforética Se cargaron 15 µl de cada sobrenadante en un gel de bistrisacrilamida al 12 % (NuPage, Invitrogen) . La migración se llevó a cabo a 200 voltios durante 45 minutos y las proteínas entonces se transfieren sobre una membrana PVDF que se ha rehidratado usando el sistema semi-seco (electrodos de grafito) durante 1 hora a 21 voltios, 110 iliamperios y 2 vatios . 2.2: Inmunovisualización La membrana entonces se trató de acuerdo a los siguientes pasos : - saturación de la membrana en PBS-Tween al 0.05 % (PBST) + 5 % de leche - incubación durante la noche a +(2-8)°C - enjuague de la membrana en PBST adición del anticuerpo primario: 3F4 (Proteogenix, 9620.103), usado a 0.2 µg/ml en PBST - incubación durante 1 hora a temperatura ambiente (AT) - lavados en PBST adición del segundo anticuerpo: anti-ratón acoplado a peroxidasa (Jackson, 115-035-062), usado diluido a 1/20000 en PBST - incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente - lavados en PBST - lavados en PBS, pH 7.2 - impregnación con un sustrato auto-radiográfico (Super Signal, Pierce) - revelado fotográfico 3. Resultados Los resultados se dan en las figuras 8 a 10, la figura 8 que corresponde a la representación esquemática (figura 8A) del gel de electroforesis (figura 8B) después de la transferencia Western, obtenido después de la migración de las muestras normales sobrecargadas con 1 % de homogenado de bazo CJD+ o CJD-, la figura 9 que corresponde a la representación esquemática (figura 9A) del gel de electroforesis (figura 9B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de las muestras normales sobrecargadas con 5 % de homogenado de bazo CJD+ o CJD-, y la figura 10 que corresponde, a la representación esquemática (figura 10A) del gel de electroforesis (figura 10B) después de la transferencia Western, obtenida después de la migración de las muestras normales sobrecargadas con 10 % de homogenado de bazo CJD+ o CJD- . En estos geles, las muestras en las sendas 1 a 5 y sendas 8 a 12 tienen las características indicadas en la tabla 6 posterior, la senda 6 corresponde a la senda del marcador de peso molecular y la senda 7 corresponde a la muestra de control positivo obtenida de un extracto de cerebro de un paciente quien ha muerto de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, preparada de acuerdo a la técnica de referencia usada rutinariamente para la diagnosis de certidumbre de CJD (Madec et al., 2000, Microbiol. Pathogenesis, 28:353-362).

Tabla 7 Los resultados demuestran una banda resistente a proteinasa K en la muestra de sangre sobrecargada con homogenado de bazo positivo para CJD, cualquiera que sea la densidad de sobrecarga. En realidad, esta banda permanece visible para cualquier concentración de proteinasa K para la muestra positiva, en tanto que desaparece cuando la concentración de PK es mayor que 100 µg/ml para la muestra negativa (sobrecargada con bazo CJD(-)) De esta manera, la realización de la prueba con el uso combinado de heparina y de estreptomicina confirma la sensibilidad y la especificidad de detección de PrPres de origen linfoide (bazo) en muestras sanguíneas.

Esto corresponde bien a la situación fisiopatológica en la cual se lleva a cabo una prueba para detección de PrPres en la sangre de individuos contaminados con el prion patógeno (PrPsc) , tomada antes de la fase de neuroinvasión y/o las primeras manifestaciones clínicas de la enfermedad. Este es el contexto en el cual una detección de donaciones sanguíneas de individuos contaminados, quienes son portadores normales y/o en la fase sub-clínica, encuentra su uso en salud pública. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta . claro a partir de la presente descripción de la invención'.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propi edad l o contenido en las s iguientes reivindi caciones :

1. Método para detectar PrP en una muestra biológica de origen humano o animal que- puede contener PrP, caracterizado porque usa una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico y un ligando diferente de un ligando de proteína elegido de ligandos macrocíclicos y glucosaminoglucanos .

2. Método para detectar PrP de conformidad ' con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico se adiciona a la muestra biológica para precipitar la PrP, antes de la adición del ligando diferente de un ligando de proteína.

3. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque comprende el paso adicional de adicionar proteinasa K a la muestra.

4. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende. los pasos que consisten en: a) adicionar proteinasa K a la muestra para digerir la PrPc, b) adicionar, a la mezcla obtenida de esta manera, la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico para obtener agregados de PrP, c) adicionar un ligando diferente de un ligando de proteína, y d) revelar la presencia de PrPres.

5. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende al menos uno de los siguientes pasos adicionales i) e ii), que consisten en: i) separar los agregados de PrP de la mezcla de reacción, y ii) desnaturalizar los agregados de PrP,' estos pasos que se incluyen, donde es apropiado, entre el paso b) y el paso c) .

6. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque una molécula de unión específica a PrP para una inmuno-reacción entre la molécula de unión específica de PrP y la PrP se adiciona, donde es apropiado en el paso d) .

7. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ligando diferente de un ligando de proteína se une a un soporte sólido.

8. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico es una molécula que tiene al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, de manera preferente estreptomicina, de manera más preferente en la forma de una sal .

9. Método para detectar PrP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el ligando diferente de un ligando de proteína es un ligando macrocíclico .

10. Método para detectar PrP de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ligando macrocíclico se elige de los metaciclofanos , de manera preferente de los calixarenos.

11. Método para detectar PrP de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ligando macrocíclico corresponde a la fórmula general (I) a continuación: en la cual R. representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR, R que es como se define más adelante, R2 representa un átomo de hidrógeno, o un grupo R, COR, Pol o CH2Pol, en el cual Pol representa un grupo fosfato, sulfato, amina, amonio o ácido carboxílico, y R es como se define más adelante, R3 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR en el cual R es como se define más adelante, R4 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR, un grupo 0CH2R o un grupo OCOR, en el cual R es como se define más adelante, Y es un átomo de carbono, nitrógeno o azufre, Rs y R6 , cada uno independientemente, están ausentes o representan un átomo de hidrógeno, un grupo CH2 o un grupo R como se define más adelante, o también R5 y R6 representan conjuntamente un átomo de oxígeno o de azufre, X representa un grupo CH2, o • un átomo de oxígeno o de azufre, m representa un número entero- igual a 0 ó 1, R representa un átomo de hidrógeno o una cadena basada en hidrocarburo cíclico o no cíclico, ramificado o no ramificado, saturado o insaturado que puede estar sustituido o no con un grupo halógeno, y que tiene funciones polares o no polares, n es un número entero entre 3 y 15, los sustituyentes Rx a R5, R, X y Y, y el número entero m pueden ser de naturaleza diferente de acuerdo a las unidades.

12. Método para detectar PrP de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el ligando macrocíclico corresponde a la fórmula general (la) a continuación: en la cual n es un número entero entre 4 y 8, cada grupo R2, tomado independientemente, es un grupo sulfato o un grupo fosfato, R7 representa un grupo (CH2) t- (CO) s- (NH2) o un grupo (CH2)t-COOH donde t es un número entero entre 0 y 6 y s es un número entero entre 0 y 6.

13. Método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ligando es un calixareno de la fórmula (la) en la cual los dos grupos R2 son cada uno un grupo sulfato, n es 4, 6 u 8, y R7 es un átomo de hidrógeno, un grupo -CH2COOH, un grupo -CH2CONH2 o un grupo -CH2CH2NH2.

14. Método para detectar PrP de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ligando macrocíclico corresponde a la fórmula general (la) en la cual n = 6 , X = Y = sulfato y R7 es -CH2CH2NH2.

15. Método para detectar PrP, en particular PrPsc, caracterizado porque comprende el paso que consiste en poner una muestra biológica, derivada u obtenida de un organismo animal o humano, en contacto con una molécula que tiene al menos dos funciones guanidinio y/o amonio, con la excepción de los antibióticos .

16. Equipo de diagnóstico para detectar PrP, caracterizado porque comprende un ligando diferente de un ligando de proteína elegido de ligandos macrocíclicos y glucosaminoglucanos, y una molécula que tiene al menos una carga positiva y/o al menos un enlace glucosidico.

17. Equipo ' de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando diferente de un ligando de proteína está unido a un soporte sólido.