MXPA06007413A - Promotor bidireccional artificial para la activacion de la expresion genetica - Google Patents

Abstract

Se describe un módulo bidireccional para la activación de la expresión genética y para la regulación de la transcripción en ambas direcciones. El módulo bidireccional estáconstituido por múltiples elementos de secuencia ADN cis regulatorio, estratégicamente configurados APRA producir un"Modulo de Activación de la Transcripción"que logra un elevado nivel de expresión a partir de un"Modulo de Iniciación de la Transcripción", El segundo mencionado funciona como un promotor inicial. El primero mencionado activa la transcripción simultáneamente en ambas direcciones a partir del segundo mencionado, y también responde a diversos estímulos externos inductores la transcripción en ambas direcciones. Puesto que es un módulo de transcripción bidireccional artificialmente diseñado, no tiene secuencia de ADN equivalente en el genoma de la planta. Esto reduce las posibilidades que los genes se inactiven por medio de mecanismos basados en la homología. Por consiguiente, un módulo promotor bidireccional comoéste, se puede emplear para desarrollar vectores eficaces para la ingeniería genética en plantas.

Description

ES, Fl, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PT, RO, SE, For two-letter codes and other abbreviations, refer to the "Guid- S?, SK, TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, anee Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the begin- GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazette. Published: — with intemational search report PROMOTOR BIDIRECCIONAL ARTIFICIAL PARA LA ACTIVACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA CAMPO DB A INVENCIÓN La presente invención comprende el diseño de un módulo de expresión bidireccional completamente artificial que también se puede denominar como un módulo bidireccional promotor. El módulo bidireccional comprende múltiples elementos de secuencia de ADN cis regulatorio, estratégicamente configurados para producir un "Módulo de Activación de la Transcripción" que logra un alto nivel de expresión a partir de un "Módulo de Iniciación de la Transcripción" . Este último mencionado funciona como un promotor mínimo. El primero mencionado activa la transcripción simultáneamente en ambas direcciones a partir del último mencionado, y también responde a diversos estímulos externos que inducen la transcripción en ambas direcciones . Puesto que este es un módulo de transcripción bidireccional artificialmente diseñado, no tiene una secuencia de ADN equivalente en el genoma vegetal. Esto reduce las posibilidades de que los genes se han inactivado mediante mecanismos basados en la homología. Un módulo promotor bidireccional como éste, se puede emplear; por consiguiente, se puede emplear para desarrollar vectores eficientes para la ingeniería genética en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Y TÉCNICA ANTERIOR El proceso de la expresión genética implica dos pasos constitutivos; es decir: la transcripción y traducción, y lleva a la formulación de una proteína o polipéptido o en algunos casos ARN con funciones específicas . El proceso de la transcripción es el paso regulatorio más importante en el proceso de expresión genética y de su regulación. La iniciación de la transcripción y de la modulación de la expresión genética en genes eucarióticos está dirigida mediante una variedad de elementos de secuencia de ADN colectivamente arreglados en una secuencia mayor llamada promotor. El promotor es la porción de la secuencia de ADN en el lado 5', es decir, antes del inicio de la región codificante de un gen. Éste contiene las señales para el mecanismo de la ARN polimerasa que inicia la transcripción y también modula el nivel de transcripción. Los promotores eucarióticos típicos están constituidos por dos partes, una llamada el promotor mínimo o central y la otra, llamada secuencias regulatorias secuencias arriba o elementos cis regulatorios [Odell, J. T, Nagy, F, & Cima. N. -H. Nature 313, 810-812 (1985) y Benfey, P. N & Cima, N. -H. Science 250, 959-966 (1990) ] . El promotor mínimo o promotor central es una tramo mínimo de la secuencia de ADN contigua que es suficiente para dirigir la iniciación aguda de la transcripción mediante ARN [Pol II machinery, Smale, S. T. , genes dev 15, 2503-2508 (2001) ] . Un promotor central típico abarca el sitio de iniciación de la transcripción con diversos motivos o (secuencia consenso de nucleótido) de secuencia, lo que incluye TATA Box, la secuencia iniciadora (Intr) , elementos de reconocimiento TFIIB (BRE) y otras motivos de promotor central [Jennifer, E. F. et al . , genes & dev 16: 2583-2592 (2002) ] . El promotor central proporciona el sitio de acción con la ARN polimerasa II, que es una enzima multisubunitaria con los factores iniciales o generales de la transcripción como, TFIIA, B, D, E, F y H. Estos factores se ensamblan en un complejo de preiniciación de la transcripción (pre initiation complex, PIC) que cataliza la síntesis del molde de ARN al molde de ADN. La activación del promotor central se lleva a cabo mediante la secuencia adicional de los elementos de secuencia de ADN regulatorio a la cual varias proteínas se unen y posteriormente interactúan con el complejo de iniciación de la transcripción para activar la expresión genética. Estos elementos regulatorios están constituidos por secuencias de ADN, que individualmente y/o en combinación, determinan el patrón de expresión espacio-temporal de un promotor [Benfey, P. N. , Ren, L. & C ma, N. -H. EMBO 9 : 1685-96 (1990) ] . Estos elementos regulatorios cortos se ubican en una distancia variante desde el punto de inicio de la transcripción, algunos elementos regulatorios (llamados elementos proximales) son adyacentes al promotor central, mientras que otros elementos se pueden posicionar varias kilobases secuencia arriba o secuencia abajo del promotor (intensificadores) . Ambos tipos de los elementos promotores modulan el nivel de transcripción desde el promotor central [ (Wasylyk, B. CRC, Critical Rev. Biochem, 23 : 77-120 (1988) , Johnson & McKnight Ann. Rev. Biochem. 58 : 799-839 (1989) , Fussler & Gussin, Method in Enzymology 273 : 3-29 (1996) ] . Los promotores por lo usual se posicionan 5' secuencia arriba en relación con sitio de inicio de la transcripción de la región codificante del gen correspondiente . Plantas genéricas han sido desarrollada tanto como para mejorar caracteres deseable (como por ejemplo, rendimiento, resistencia a enfermedad, fitoremediación, etc.) así como para emplearlos como fábricas de proteínas . A menudo, existe la necesidad para introducir múltiples genes para lograr los objetivos de la ingeniería genética. Por ejemplo, casi siempre se emplea un gen (por ejemplo, resistencia a un antibiótico como kanamicina) para permitir la selección de tejidos y células transgénicas, al mismo tiempo que se emplea un segundo gen (por ejemplo, un gen para intensificar el rendimiento o para impartir resistencia hacia una enfermedad, etc.) como un gen objetivo para mejorar la calidad de la planta transgénica. Por lo normal, cada gen de este tipo tiene que expresarse a partir de su propia secuencia promotora. Los promotores constitutivos usados más ampliamente en el desarrollo de las plantas transgénicas son el promotor del transcripto del virus del mosaico de la coliflor 35S, y los promotores de la nopalina y octapina sintasa, el promotor de la ubiquitina, etc. Sin embargo, la introducción de múltiples genes de interés en plantas empleando repetidamente el mismo promotor conduce a la inactivación genética. Con el fin de introducir múltiples genes a través de la ingeniería genética, se han desarrollado varias estrategias las cuales incluyen, la transformación secuencial empleando múltiples construcciones genéticas con distintos múltiples marcadores genéticos, la co-transformación con múltiples construcciones, cruzas genéticas entre plantas transformadas con distintas construcciones, etc. Una manera de reducir el tamaño del vector de transformación de la planta y el número de promotores necesarios al mismo tiempo que se logra la expresión de múltiples genes, será reducir las señales regulatorias de transcripción que puedan iniciar y regular la transcripción en ambas direcciones . El uso del promotor bidireccional, sin lugar a dudas, puede superar la limitación de la transformación secuencial y co-transformación con dos genes. [Xie et al . , Nature Biotechnology, 19 : 677-679 (2001) ] inventó un método para convertir un promotor unidireccional o polar de origen natural en un promotor bidireccional . Este promotor puede dirigir la expresión de dos genes o fusiones de genes a la vez. Se han reportado pocos tipos de promotores fuertes, como por ejemplo el promotor CaMV 35S, y se pueden convertir en promotores bidireccionales . No hay reportes previos sobre la construcción de un promotor completo y artificialmente diseñado que no tuviera algún tramo largo de homología con el ADN genómico nativo. Es muy importante desarrollar la capacidad de diseñar promotores artificiales sin homología de secuencia con el genoma, puesto que este tipo de promotores no se inactivará a causa de la homología, [Davies et al . , The Plant Journal 12, 791-804 (1997) ] . Los inventores de este trabajo han establecido previamente [(Patente de los EE. UU. Ser. No. 09/263692; documento EP 99301419. 0-2106, Sawant et al . , 2001, Theor. Appl . Genet . 102, 635-644) ] la técnica para diseñar promotores artificiales y sintéticos . Este promotor sintético anterior ha sido descrito con detalle en estas referencias, y se incorporan a esta descripción como referencia. La presente invención se basa, parcialmente, en el descubrimiento de que parte del promotor artificial en la siguiente SEQ ID NO. 1: GTCGACCATCATTTGAAAGGGCCTCGGTAATACCATTGTGGAAAAAGTTG GTAATACGGAAAAAGAAGATTCATCATCCAGAAAAGGTGTGGAAAAGTTG TGGATTGCGTGGAAAAAGTTCGATCTGACCATCTCTAGATCGTGGAAAAA GTTCACGTAAGCGCTTACGTACATATGTGGATTGTGGAAAAAGAAGACGG AGGCATCGGTGGAAAAAGAAGCTTGTACGCTGTACGCTGACGATAGATAG ATAC?CGTGC?CGCGTCC?CTTGACGCACAATTGACGCACAATGACGCCA CTTGACGCTACT SEQ ID NO. 1 se puede utilizar como una secuencia intensificadora o como un "Módulo de Activación de la Transcripción" (MAT) . Otra parte de la secuencia SEQ ID NO. 1, se puede empelar como un iniciador de la transcripción o como un "Módulo Iniciador de la Transcripción" (MIT) . La presente invención enseña que el MAT activa y también regula la expresión genética en ambas direcciones desde el MIT. La síntesis artificial de módulos de expresión de genes fuertes proporciona una herramienta para evitar el uso repetitivo de los llamados promotores fuertes, puesto que se puede diseñar una gran variedad de promotores artificiales. Aún más, desarrollar un promotor bidireccional fuerte con múltiples características específicas o inducibles a un tejido tendrá mayores aplicaciones en la mejora de rasgos agronómicos deseados en plantas. El diseño de vectores de expresión para la transformación empleando el llamado módulo de expresión bidireccional tendrá un gran valor para el desarrollo transgénico y en las industrias de la biotecnología. La técnica de diseñar promotores bidireccionales completamente mediante métodos computacionales, como los demostrados en 52-366 esta descripción, proporciona mucha flexibilidad en la ingeniería genética. La construcción de módulos de expresión de genes sintéticos es una alternativa importante en la dependencia de promotores naturales . Esto permite una inactivación genética por desvío y también provee la capacidad de regular y mejorar el nivel de expresión de proteínas o compuestos valiosos de interés económico en particular en plantas. [(Juanee, I. et al . , Plant Science 162 : 833 -842 (2002) , co bined three viral promoter sequences to genérate highly active promoters that allowed strong transgene expression in plants) ] . Los autores de la presente invención (Sawant S. et al . , Theor. Appl . Genet. 102: 635-644) proporcionan el único ejemplo para desarrollar un promotor artificial sintético diseñado para el elevado nivel de expresión en plantas. El promotor (patente de los EE.UU. Ser. No. 09/263692, Solicitud EP No. 99301419.0-2106) se desarrolló mediante métodos computacionales, y demostró expresarse en un alto nivel en una variedad plantas y, por consiguiente, se logró el propósito para el cual ha sido desarrollado. En forma previa a la invención, existen ciertas patentes representativas que se resumen más adelante, las cuales describen ciertos promotores bidireccionales . La patente de los EE.UU. No. 5,814,618 describe un promotor bidireccional que tiene múltiples secuencias operadoras tet. 52-366 Esta patente muestra que siete repeticiones de secuencias represoras/operadoras/inductoras tet de origen natural cuando se flanquean con dos promotores mínimos en presencia del inductor tetraciclina podrían conducir la expresión en dos genes en células eucarióticas. La patente de los EE.UU. No. 595,564 describe un heterólogo bidireccional, pero de nueva cuenta de construcción de origen natural para la expresión de transgenes en plantas. La patente de los EE.UU. No. 5,359,142 describe secuencias promotoras naturales, que se han manipulado para permitir variaciones en la mejora de la expresión genética. La patente de los EE.UU. No. 5,837,849 describe todavía otro elemento intensificador vegetal natural que intensifica el nivel de transcripción de un gen que se expresa en plantas. La patente de los EE.UU. No. 5,627,046 describe un promotor bidireccional de origen natural. La técnica para la obtención de un promotor bidireccional polar eucariótico se describe en la patente de los EE.UU. No. 6,388, 170. Los inventores de esta patente han empleado la técnica para convertir en bidireccional cierto grupo de promotores vegetales de origen natural, como por ejemplo, CaMV 35S, PCISV, OPR y SAG12.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Es un objetivo importante de la presente invención proporcionar un método para diseñar por medios 52-366 computacionales y para sintetizar artificialmente un módulo de ADN de activación de la transcripción bidireccional para modular el nivel de expresión de múltiples transgenes en plantas simultáneamente. Otro objetivo de la presente invención es diseñar artificialmente y sintetizar químicamente el "Módulo de Iniciación de la Transcripción" para activar o iniciar la transcripción, y emplearlo para la expresión de cualquier "Módulo de Iniciación de la Transcripción" . Aún en otro objetivo de la presente invención es proporcionar un "Módulo de Iniciación de la Transcripción" que determinaría la dirección y punto de iniciación de la transcripción en un promotor bidireccional . Otro objetivo de la presente invención es elaborar un "módulo de expresión bidireccional" total y artificialmente diseñado al colocar el llamado "módulo de activación de la transcripción" para modular la expresión de alguno o de ambos genes en una o en ambas direcciones . Otro objetivo de la presente invención es proporcionar promotores diseños por medios computacionales que no tengan un tramo largo de homología con el ADN genómico y, por consiguiente, que expresen establemente el gen en la población transgénica y no muestren inactividad. Otro objetivo de la presente invención es probar la validez funcional del rasgo de secuencia identificado por los 52-366 inventores para diseñar y desarrollar artificialmente un "módulo de expresión bidireccional" novedoso, totalmente basados en el análisis de secuencia nucleótida de base de datos de genes seleccionados por su potencial de expresarse en elevados niveles en plantas. Aún en otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector de transformación de planta empleando el llamado "módulo de expresión bidireccional" que expresa el gen marcador de selección como nptll (resistencia a la kanamicina) o hptll (resistencia a la hygromycin) o un gen útil en una dirección y un gen indicador como GUS A, GFP o un cualquier otro gen codificante de proteínas útil en otra dirección. Aún en otro objetivo de la presente invención es desarrollar plantas transgénicas y probar su utilidad en la mejora de los rasgos deseados importantes, desde el punto de vista agronómico, en plantas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una mejora sobre la invención anterior de los solicitantes citada anteriormente. De manera más particular, se refiere a un módulo de expresión genética bidireccional artificialmente sintetizado y estratégicamente diseñado que puede modular la expresión de uno o dos genes solos o juntos, en alguna o en 52-366 ambas direcciones . Este novedoso módulo de expresión bidireccional se han seleccionado como parte de la secuencia de ADN total reportada en la invención anterior que está constituida por secuencias de ADN químicamente sintetizadas y teóricamente diseñadas . La presente invención se basa en el descubrimiento de que parte de la secuencia de ADN, llamada "Módulo de activación de la transcripción" (MAT) mostrada como el siguiente SEQ ID NO. 1: GTCGACCATCATTTGAAAGGGCCTCGGTAATACCATTGTGGAAAAAGTTGG TAATACGGAAAAAGAAGATTCATCATCCAGAAA?GGTGTGGAAAAGTTGTGGATTGCGTGG AAAAAGTTCGATCTGACCATCTCTAGATCGTGGAAAA?GTTCACGTAAGCGCTTACGTACA TATGTGGATTGTGGA?A?AGAAGACGGAGGCATCGGTGGAAAAAGAAGCTTGTACGCTGTA CGCTGACGATAGATAGATACACGTGCACGCGTCCACTTGACGCACAATTGACGCACAATGA CGCCACTTGACGCTACT SEQ ID NO. 1 puede activar la transcripción en alguna o en ambas direcciones cuando se coloca un segundo componente de secuencia de ADN llamado "Módulo de Iniciación de la Transcripción" (MIT) y que muestra como SEQ ID NO. 2 TCACTATATATAGGAAGTTCATTTCGGAATGGACACGTGTTGTCATTTCTCAACAATTACC AACAACAACAAA<- ?AAC?AC?TTATAC^ AATG. 3 SEQ ID NO. 2 en alguna o en ambas direcciones. Por consiguiente, la primera parte, es decir, el "Módulo de Activación de la Transcripción" (MAT) puede modular la expresión de genes en ambas direcciones de sentido y antisentido simultáneamente, 52-366 si se coloca estratégicamente un "Módulo de Iniciación de la Transcripción" (TIM) . En consecuencia, el MIT es esencial para utilizar el MAT. El primero mencionado funciona como un promotor mínimo o promotor central y se hace referencia a él en los ejemplos determinados en este documento, como Pti - El "Módulo de Activación de la Transcripción" identificado en la presente invención se diseña por completo con base a las secuencias nucleótidas en una base de datos de genes seleccionados por el potencial a expresarse en elevado nivel en plantas. Este módulo de activación está constituido por múltiples elementos cis-regulatorios, que fueron identificados en la región 100 secuencia de arriba a 500 bp hacia la izquierda o en la dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción de genes vegetales muy expresables. Estos cis-elementos se configuraron por medios computacionales para diseñar un "Módulo de Activación de la Transcripción" artificial, que puede intensificar el nivel de expresión de genes en una orientación, de manera independiente en plantas transgénicas. Por consiguiente, el "Módulo de Activación de la Transcripción" funciona como una secuencia que intensifica la transcripción bidireccional . Otra característica de la presente invención se identifica desde la anterior invención, un "Módulo de Iniciación de la Transcripción" , que activa la transcripción de un gen colocado secuencia abajo al sitio de inicio de la 52-366 transcripción. Este llamado "Módulo de Iniciación de la Transcripción" se diseñó con base a los aspectos característicos de las secuencias nucleótidas en TATA Box, en el sitio de inicio de la transcripción, en regiones de iniciación de traducción y regiones líderes no traducidas en genes vegetales muy expresables en base de datos . La presente invención, para la primera vez, describe un "módulo de expresión bidireccional" total y artificialmente diseñado constituido por un "módulo de activación de la transcripción" y un "módulo de iniciación de la transcripción" con base al análisis computacional de conjunto de datos de genes vegetales muy expresables a partir de base de datos de la secuencia de ácido nucleico. Semejante secuencia artificialmente diseñada no tiene secuencia equivalente u homologa considerable en la planta. Por consiguiente, la secuencia artificialmente diseñada es más estable en la expresión, puesto que no se inactiva debido a la inactivación de genes basada en la homología [ (G. J". Davies, M. A. Sheikh, O. J. Ratcliffe, G. Coupland y I. J. Furner, The Plant Journal 12, 791-804 (1997) . ] . Los resultados mostrados, mediante este módulo de expresión bidireccional, prueban una función adicional y muy útil de los primeros aspectos identificados por los inventores . La invención demuestra el potencial de la biología computacional en el diseño y desarrollo de casetes de expresión 52-366 bidireccional de genes muy expresables para la expresión estrechamente ajustada, específica a algún tejido, constitutiva e inducible de múltiples transgenes simultáneamente en plantas transgénicas . Otro aspecto importante de la presente invención es la mejora simultánea en la expresión de genes ubicados en ambas direcciones del "módulo de activación de la transcripción" sintético artificialmente diseñado mediante una variedad de agentes celulares y ambientales, por ejemplo, la regulación de la expresión genética en respuesta al ácido salicílico, ácido indol acético, cloruro de sodio, etc., en tabaco transgénico queda demostrada como parte de la invención. Esta propiedad del módulo de expresión bidireccional muestra que el módulo de activación de la transcripción de la presente invención también funciona como un intensificador bidireccional químicamente inducible. En consecuencia, la presente invención proporciona un promotor bidireccional que comprende : a) un Módulo de Activación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 1 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseñada para intensificar el nivel de expresión de genes en plantas; b) un Módulo de Iniciación de la Transcripción que 52-366 comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada mostrada en SEQ ID NO. 2 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseña para funcionar como una secuencia mínima para iniciar la transcripción de un gen ubicado secuencia abajo. De preferencia, este módulo de iniciación de la transcripción se coloca en cualquier o en ambos lados del "módulo de activación de la transcripción" para expresar uno o más genes, uno a la vez o ambos simultáneamente para desarrollar plantas genéticamente diseñadas. En otra modalidad preferida, el módulo de iniciación de la transcripción se coloca a lo largo de la dirección 5 ' a 3 ' en cualquier o en ambos lados del módulo de activación de la transcripción. En otra modalidad preferida, el módulo de iniciación de la transcripción se coloca a lo largo de la dirección 5 ' a 3 ' en cualquier o en ambos lados del módulo de activación de la transcripción. De preferencia, uno o más genes se colocan secuencia abajo del módulo de activación de la transcripción para el propósito de su expresión desde uno o ambos lados del módulo de activación de la transcripción. En otro aspecto preferido de la presente invención, este módulo de activación de la transcripción comprende una secuencia de ADN que tiene SEQ ID NO. 1 de secuencias 52-366 distintivas estadísticamente identificadas como comúnmente presentes en genes vegetales muy expresados dentro de 100 a 500 posiciones nucleótidas secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción en plantas . En otro aspecto preferido de la presente invención, este módulo de iniciación de la transcripción comprende una secuencia de ADN que tiene SEQ ID NO. 2 de secuencias distintivas estadísticamente identificadas como presentes dentro de 100 nucleótidos secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción en promotores naturales en plantas . La presente invención también se refiere a plantas transgénicas desarrolladas después de la transformación estable con el promotor bidireccional descrito en lo anterior con el propósito de mejorar las características de interés de la planta para la agricultura o industria. La presente invención también se refiere a un vector de transformación de plantas que comprende un promotor bidireccional tal como el descrito en lo anterior, que exprese un marcador de selección, como por ejemplo, nptll, bar, hpt, etc., o cualquier otro gen de este tipo, desde una dirección, y un gen indicador, como por ejemplo, gusA, gfp, luc o cualquier otro gen cuyo producto se puede monitorear de manera conveniente, y el uso de este tipo de vectores para el desarrollo de plantas transgénicas. 52-366 En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a un promotor bidireccional que comprende: a) un Módulo de Activación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. l o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseñada para intensificar el nivel de expresión de genes en plantas; b) un Módulo de Iniciación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada mostrada en SEQ ID NO. 2 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseña para funcionar como una secuencia mínima para iniciar la transcripción de un gen ubicado secuencia abajo; c) este Módulo de Iniciación de la Transcripción se ubica en cualquier o en ambos lados del "módulo de activación de la transcripción" para expresar uno o dos genes, uno a la vez o ambos simultáneamente para desarrollar plantas geneticamente diseñadas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se describirá la presente invención con mayor detalle tomando como referencia los dibujos anexos, en donde: La Figura 1 muestra un número de construcciones genéticas de conformidad con la presente invención. 52-366 La presente invención comprende el diseño artificial y la síntesis química de un "Módulo de ADN Activador de la Transcripción Bidireccional" que está constituido por múltiples elementos cis-regulatorios de la transcripción, los cuales fueron identificados en la región secuencia arriba (100-500) a partir del sitio de inicio de la transcripción de genes vegetales muy expresables . Las reivindicaciones detalladas relacionadas con el análisis computacional basado en el diseño de promotores vegetales muy expresantes se han presentado anteriormente en la solicitud de patente pendiente de los Estados Unidos Ser. No. 09/263692 o en la solicitud de patente EU. 99301419.0-2106. Estos llamados elementos de secuencia conservada cis-regulatoria se configuraron estratégicamente con bases a su porcentaje de ocurrencia, número de copia y posición más común de ocurrencia en el conjunto de datos de los genes vegetales muy expresados del módulo de activación de la transcripción completamente novedoso (SEQ ID NO. 1) . El MAT es una secuencia larga de 312 pares de base cuya función crítica es la activación o incremento de la transcripción. El llamado "módulo de activación de la transcripción" de la presente invención se empleó para diseñar un "módulo de expresión bidireccional" artificialmente sintetizado completamente novedoso que puede mejorar la transcripción en ambas direcciones de sentido y 52-366 antisentido cuando se coloca un "módulo de iniciación de la transcripción" en ambas direcciones del "módulo de activación de la transcripción" . El llamado "módulo de activación de la transcripción" empleando en la presente invención también se diseñó teóricamente y se sintetizó químicamente, el cual se diseñó de nueva cuenta con base a los aspectos característicos de las secuencias nucleótidas de la región próxima a TATA-Box en el conjunto de genes altamente expresados en plantas (SEQ ID NO. 2) . El MIT es una secuencia larga de 130 pares base y su función crítica es iniciar la transcripción de un gen cuando se coloca secuencia abajo de éste. Los inventores a menudo han empleado el llamado "módulo de iniciación de la transcripción" y el "módulo de iniciación de la transcripción" para elaborar un "módulo de expresión bidireccional" completamente sintético, el cual modula la expresión de genes a partir de ambas direcciones de sentido y antisentido. El SEQ ID NO. 1 es una secuencia larga de 312 pares base y el SEQ ID NO. 2 secuencia larga de 130 pares base. En la Figura 1 se muestran diversas construcciones genéticas que se emplean en los ejemplos. Los ejemplos demuestran la función bidireccional de la presente invención. La invención para la primera vez describe un "módulo de expresión 52-366 bidireccional" artificialmente diseñado constituido por el "módulo de activación de la transcripción" con base al análisis computacional del conjunto de datos de genes vegetales muy expresados a partir de base de datos de la secuencia de ácido nucleico. Semejante secuencia diseñada en forma artificial no tiene secuencia equivalente u homologa considerable en la planta. Por consiguiente, la secuencia diseñada en forma artificial es más estable en la expresión, puesto que no se inactiva debido a la inactivación de genes basada en la homología [ (G. J. Davies, M. A. Sheikh, O. J. Ratcliffe, G. Coupland y I. J. Fumer, The Plant Journal 12, 791-804 (1997) . ] . Los resultados mostrados, mediante este módulo de expresión bidireccional, prueban una función adicional y muy útil de los primeros aspectos identificados por los inventores . La invención demuestra el potencial de la biología computacional en el diseño y desarrollo de casetes de expresión bidireccional de genes muy expresables para la expresión estrechamente ajustada, específica a algún tejido, constitutiva e inducible a múltiples transgenes simultáneamente en plantas transgénicas de las dos secuencias anteriores. Sin embargo, tal como los expertos en esta área lo saben, las variaciones en la secuencia hasta el punto de 30% no puede afectar la función del MAT y TIM. Tal como también se ejemplifica en una solicitud de patente anterior (documentos US 09/263692 y EU 99301419.0-2106), existen diversas variaciones de la secuencia diseñada por medios computacionales por origen.

EJEMPLO 1 La expresión de un gen indicador (gusA) colocado en orientación sentido del "Módulo de Activación de la Transcripción" (MAT) en plantas transgénicas de tabaco. Tabla 1 Promotor con construcción genética Nombre de Actividad de (orientación) construcción y glucuronidasa designación de (R ü/minuto/mg planta de proteína) Plantas transgénicas de tabaco con MAT - Ptm gusA (sentido) 527-1 324 .2 527-2 10 .8 527-5 197 .5 527-11 129.7 527-16 257. 0 0 Planta de tabaco de control Se colocó el gen para la glucuronidasa {gusÁ) secuencia abajo del "Módulo de Iniciación de la Transcripción" (Ptim) artificialmente diseñado, este cásete después se colocó al lado derecho (dirección sentido) del "Módulo de Activación de la Transcripción" (MAT) artificialmente diseñado en la dirección 3' a 5'. En este caso, no se colocó el cásete genético al lado izquierdo (dirección antisentido) . En la Figura 1 se muestra la construcción genética. Ésta se elaboró para demostrar que MAT activa la transcripción al lado derecho, aún en ausencia de P?m o un gen al lado izquierdo. Se desarrollaron plantas transgénicas de tabaco empleando Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 que contenía un gen resistente a la kanamicina como un marcador de selección {npt II) y la construcción anterior TAM - - Pmec gusA clonada en el vector binario pBI 101 bien conocido y disponible en el mercado (Clontech, EE.UU.). Los resultados de la expresión de gusA en cinco plantas transgénicas se muestran en la Tabla 1. Como se observa, el MAT expresa el gen indicador gusA de manera muy eficaz en las hojas de las plantas transgénicas de tabaco. Como se esperaba, la actividad fluctuó de 10.8 en el caso de la planta # 527-2 a 324.2 en el caso de la planta # 527-1. Esta variación en el nivel de expresión ya se esperaba, y se sabe que se debe a la integración del transgen (gusA) en distintas posiciones en cromosomas del tabaco.

EJEMPLO 2 La expresión de un segundo gen indicador (gfp) colocado en la orientación sentido del "Módulo de Activación de la Transcripción" en plantas transgénicas de tabaco. 52-366 Tabla 2 Promotor con construcción genética Nombre de Actividad de (orientación) construcción y glucuronidasa designación de (RFU/minuto/mg planta de proteína) Plantas transgénicas de tabaco con MAT ~ Ptim g£p (sentido) 528-12 881. 0 528-13 258 .0 528-15 203. 0 528-20 272 .8 528-32 165.5 0 Planta de tabaco de control Se eligió un gen indicador distinto al tomado en el Ejemplo 1, en este caso para mostrar que el alto nivel de expresión del lado derecho de MAT fue un fenómeno general y que no estuvo restringido a gusA. En este caso, se colocó el gen de la Proteína de Fluorescencia Verde (Green Fluorescence Protein, gfp) secuencia abajo swk módulo de iniciación de la transcripción artificialmente diseñado (Ptam) / Y este cásete después se colocó al lado derecho (dirección sentido) del "Módulo de Activación de la Transcripción" (MAT) artificialmente diseñado en la dirección 3' a 5'. En este caso, no se colocó el cásete genético al lado izquierdo (dirección antisentido) de MAT para activar la transcripción al lado derecho en ausencia de un gen en el lado izquierdo. 52-366 Se desarrollaron plantas transgénicas de tabaco empleando Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 con un marcador de selección adecuado {npt II) y la construcción anterior TAM --Ptím fp en el vector binario pBI 101. En la Figura 1 se muestra la construcción genética. Los resultados de la expresión de gfp en cinco plantas transgénicas se muestran en la Tabla 1. Como se observa, el MAT expresa el gen indicador gfp de manera muy eficaz en las hojas de las plantas transgénicas de tabaco. Como se esperaba, la actividad fluctuó de 165.5 en el caso de la planta # 528.32 a 881.0 en el caso de la planta # 528-12. Esta variación en el nivel de expresión ya se esperaba, y se sabe que se debe a la integración del transgen (gfp) en distintas posiciones en cromosomas del tabaco.

EJEMPLO 3 Expresión de gusA y gfp colocados en orientaciones opuestas del "Módulo de Activación de la Transcripción" para demostrar la función bidireccional del "Módulo de Activación de la Transcripción" en plantas transgénicas de tabaco. 52-366 Tabla 3 Promotor con construcción Nombre de Actividad de Proteína de genética (orientación) construcción glucuronidasa fluorescencia y designación (R U/minuto/mg verde de planta de proteína) (RFU/minuto/mg de proteína) Plantas transgénicas de tabaco con MAT - Ptist gfp (sentido) + Ptím - gas A (antisentido) 1301-1 92 .8 560. 0 1301-2 165.5 412 .7 1301-3 170 .7 862 .2 1301-4 75.3 340.0 1301-5 229.7 257. 0 En este caso, se mostró que la expresión de los dos genes indicadores en los Ejemplos 1 y 2 se activa cuando éstos se colocan en dos lados opuestos del MAT del módulo bidireccional artificialmente diseñado. Ambos genes se expresan simultáneamente en las hojas del tabaco transgénico. Se colocó el gen indicador gfp junto con el Ptim artificialmente diseñado en la dirección sentido (lado derecho del MAT) , mientras que gusA se colocó junto con tim en dirección antisentido (lado izquierdo del MAT) . Se desarrollaron plantas transgénicas de tabaco empleando Agrobacterium tumefaciens, como en los dos ejemplos anteriores, y se seleccionaron con base a la resistencia a la 52-366 kanamicina. Los resultados muestran que los dos genes indicadores se expresaron simultáneamente en las dos direcciones en todas las plantas. El nivel de expresión de ambos genes mostró variación tal como se esperaba, se debió a las distintas posiciones de la integración del transgen en el genoma. El ejemplo establece la naturaleza bidireccional del módulo TAM viz. , SEQ ID NO. 1, cuando se emplea en el formato Ptún (antisentido) -TAM-Pt?,, (sentido) , tal como se muestra en la Figura 1.

EJEMPLO 4 La mejora simultánea de la expresión de genes colocados en las dos direcciones en respuesta a la inducción de la transcripción mediante ácido salicílico en plantas transgénicas de tabaco. 52-366 Tabla 4 Promotor con construcción Nombre de % de mejora en la actividad, genética (orientación) construcción y 14 horas después del designación de tratamiento de la hoja con planta 100 µM ácido salicílico Plantas transgénicas de Glucuronidasa Proteína de tabaco con MAT - Ptim gfp fluorescencia (sentido) + Ptim - gusA verde (antisentido) 1301-1 160 171 1301-2 370 240 1301-3 5740 820 1301-4 410 1301-5 78850 311C Este ejemplo ilustra que el Módulo de Activación de la Transcripción (MAT) artificialmente diseñado no sólo activa la expresión genética en ambas direcciones, tal como se muestra en el Ejemplo 3, sino que también mostró una mejora adicional en la expresión en respuesta a estímulo externo, tal como se muestra en el Ejemplo 4. En este ejemplo, se empleó ácido salicílico como un estímulo externo. Los resultados en la Tabla 4 establecen que el MAT es capaz de mejorar varias veces mediante el ácido salicílico simultáneamente en ambas direcciones. Por ejemplo, se intensificó la actividad de la glucuronidasa (gusA) aproximadamente 57 veces en la planta transgénica # 1301-3. De manera simultánea, en la misma planta, la proteína de 52-366 fluorescencia verde (gfp) también se intensificó 8 veces . El primer aspecto mencionado fue en la dirección antisentido, mientras que el último aspecto mencionado fue en la dirección sentido, tal como también se muestra en la construcción genética en la Figura 1. De modo semejante, en la planta # 1301-5, se observó un incremento de aproximadamente 788 veces para gusA (dirección antisentido) , mientras que se observó un incremento de aproximadamente 31 veces para gfp (dirección sentido) . Los resultados establecen que MAT respondió al ácido salicílico en ambas direcciones. Sin embargo, el grado de mejoramiento podría ser distinto en las dos direcciones.

EJEMPLO 5 La mejora simultánea de la expresión de genes colocados en las dos direcciones en respuesta a la inducción de la iniciación de la transcripción mediante NaCl e IAA. 2-366 Tabla 5 Promotor con construcción Nombre de % de mejora <en la actividad. genética (orientación) construcción y 14 horas después del designación iie tratamiento de la hoja con planta 400 mM NaCl Plantas transgénicas de Glucuronidasa Proteína de tabaco con MAT - Ptim gfp fluorescencia (sentido) + Ptim - gusA verde (antisentido) 1301-1 298 755 1301-2 169 769 1301-3 971 1200 1301-4 794 1071 1301-5 348 1025 Este ejemplo ilustra que el "módulo de expresión bidireccional" diseñado, al igual que en el Ejemplo 5a, muestra un incremento adicional en la respuesta al tratamiento con NaCl (cloruro de sodio) . El resultado en la Tabla 5 muestra que el MAT en la línea transgénica 1301-3 muestra un incremento de 10 veces en la actividad GUS en la dirección antisentido y un incremento de 12 veces en GFP en la dirección sentido. El distinto nivel de expresión de gusA y GFP en distintas líneas transgénicas fluctúa, lo cual se debe a la posición de la integración del transgen en el genoma. En la Figura 1 se muestra la construcción genética. Las plantas transgénicas fueron las mismas descritas en la Tabla 4. 52-366 EJEMPLO 6 Mej ora de la expresión de los genes colocados en dos direcciones en respuesta a la inducción de la transcripción mediante ácido indol acético (índole Acetic Acid, IAA) en plantas transgénicas de tabaco . Tabla 6 Promotor con construcción Nombre de % de mejora en la actividad, genética (orientación) construcción y 14 horas después del designación de tratamiento de la hoja con 50 planta µM IAA Plantas transgénicas de Glucuronidasa Proteína de tabaco con MAT - Ptim gfp fluorescencia (sentido) + ^ - grusA verde (antisentido) 1301-1 378 301.06 1301-2 521 500 1301-3 517 608 1301-4 672 2170 1301-5 425 782 El ejemplo muestra el incremento en la actividad de gusA y gfp con el tratamiento con AAI (ácido indol acético) en hoj as de tabaco transgénico . La actividad de la glucuronidasa (gusA) se intensificó aproximadamente 7 veces en la planta transgénica 130-14 . En la misma planta, gfp se intensificó 22 veces . En la planta 1301-5 (dirección antisentido) , hubo un incremento de 4 veces en la actividad de gus y hubo un incremento en la actividad de gfp 8 veces 52-366 (dirección sentido) . Los resultados mostrados en los ejemplos 4, 5 y 6 muestran el comportamiento químicamente inducible del "Módulo de Activación de la Transcripción" sintético que modula la expresión en ambas direcciones .

EJEMPLO 7 Desarrollo de plantas de tabaco mej oradas desde el punto de vista agronómico, mediante la expresión, y proteína insecticida del intensificador bidireccional Tabla 7 Promotor con construcción genética Designación % de mortalidad (orientación) de planta de larvas de Helicovexpa. Plantas transgénicas de tabaco con 1301-1 100/100 MAT - Ptim crylAc (sentido) + P^ nptll (antisentido) 1301-2 100/100 1301-3 90/100 1301-4 89/100 1301-5 95/100 Este ejemplo establece que el módulo de activación de la transcripción artificialmente diseñado se puede emplear para desarrollar un vector para la transformación de plantas y para el desarrollo de plantas transgénicas mejoradas para un mejor desempeño agrícola. En este ejemplo, se colocó un gen marcador de selección bien conocido para la resistencia a 52-366 la kanamicina (nptll) junto con Vti a-1 lado izquierdo (hebra antisentido) del MAT para permitir la selección de las plantas transgénicas con la base de resistencia a la kanamicina. Se colocó un gen crylAc muy valioso, desde el punto de vista agronómico, llamado como el gen de la proteína cristalina, (originalmente clonado de una bacteria de suelo, Bacillus thuringiensis) junto con Pt?m en el lado derecho (dirección sentido) del MAT. La crylAc codifica para una proteína muy tóxica a la larva de insectos lepidópteros Helicoverpa sp. , etc . Se seleccionaron plantas transgénicas por su resistencia a la kanamicina. Todas las cinco plantas transgénicas seleccionadas mostraron la expresión de la proteína de insecto crylAc en el rango de 0.07 a 0.16% de la proteína de hoja soluble total estimado por ELISA. Todas las cinco plantas fueron tóxicas a la larva y hubo una mortalidad de 89 a 100% de la primera larva Instar alimentada en las hojas de las plantas transgénicas de tabaco. Los resultados establecen que se puede emplear el MAT de secuencia completa y artificialmente diseñado en combinación con Ptim para desarrollar un promotor bidireccional, basándose en los vectores que se pueden emplear para el desarrollo de plantas transgénicas de alto valor para la industria. Los resultados se obtuvieron en el momento que se desarrollaron líneas de algodón transgénico. Se obtuvieron líneas de algodón Coker tóxico para los insectos que expresaron las d-endotoxinas a 52-366 partir de un módulo bidireccional . Éstas fueron altamente resistentes a los daños originados por plagas de insectos lepidópteros, entre las que se incluyen, dos principales larvas Bollworms, llamados Helicoverpa sp. y Spodoptera sp.

Conclusión Para probar la validez y aspectos del "Módulo de Expresión Bidireccional" diseñada los inventores elaboraron varias construcciones genéticas empleando glucuronidasa A de genes indicadores (gusA o GUS) , Proteína de fluorescencia verde (gfp) , d-endotoxina (cry) , etc., las cuales se colocaron en ambas direcciones sentido y antisentido (Figura 1) del módulo de expresión y se emplearon en los Ejemplos. Los patrones de expresión de los genes indicadores son similares y equiparables en ambas direcciones sentido y antisentido, cuando se toman simultáneamente (Ejemplos 1 y 2) o dos simultáneamente (Ejemplos 3, 4, 5, 6, 7) con el grado esperado de variación en el nivel de expresión dentro de las distintas líneas que portan la misma construcción. Esta variación en el nivel de expresión ya se esperaba y se sabe que se debe a la integración de transgenes en distintas posiciones en los cromosomas de la planta objetivo. Otro aspecto importante que los inventores han mostrado, es el comportamiento químicamente inducible del "Módulo de Activación de la Transcripción" diseñado que no sólo mejora la expresión genética en ambas direcciones, tal como se muestra en los ejemplos (4, 5 y 6) , sino también muestra una mejora adicional en la expresión en la respuesta al tratamiento con ácido salicílico (Ejemplo 4) u otro entorno ambiental (Ejemplo 5) . Los resultados indican la mejora varias veces con el ácido salicílico en ambas direcciones de manera simultánea. Se observaron resultados similares en el caso del NaCl (Ejemplo 5) e IAA (Ejemplo 6) , lo que demuestra el comportamiento químicamente inducible del módulo de activación de la transcripción. Los inventores además han utilizado la expresión bidireccional para desarrollar un módulo de vector de expresión genética para plantas . Este vector está constituido por un promotor bidireccional, que expresa un marcador de selección como (nptll) de resistencia a la kanamicina en una dirección y una d-endotoxina insecticida que codifica el gen crylAc en la otra dirección (Ejemplo 7) . El Ejemplo claramente prueba la utilidad experimental de este vector desarrollado en el desarrollo de plantas transgénicas mejoradas, desde el punto de vista agronómico . Los resultados muestran, mediante el módulo de expresión diseñado en tabaco transgénico, establecer la validez funcional de los rasgos y del aparato utilizado por los inventores para el desarrollo de este novedoso "módulo de expresión genética bidireccional" . Esto demuestra claramente la aplicación potencial de la biología computacional, que se puede utilizar en el diseño de casetes de expresión bidireccional artificial para la expresión de transgenes regulada, específica a algún tejido, constitutiva e inducible en plantas. Estos claramente tiene grandes aplicaciones en la biotecnología.

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Claims (2)

REIVINDICACIONES : 1. Un promotor bidireccional que comprende : a) un Módulo de Activación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 1 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseñada para intensificar el nivel de expresión de genes en plantas; b) un Módulo de Iniciación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada mostrada en SEQ ID NO. 2 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseña para funcionar como una secuencia mínima para iniciar la transcripción de un gen ubicado secuencia abajo. 2. Un promotor bidireccional según la reivindicación 1, en donde el Módulo de Iniciación de la Transcripción se ubica ya sea en cualquier o en ambos lados del "Módulo de Activación de la Transcripción" para expresar uno o dos genes, uno a la vez o ambos simultáneamente para desarrollar plantas genéticamente diseñadas. 3. Un promotor bidireccional según la reivindicación 1, en donde el Módulo de Iniciación de la Transcripción se ubica a lo largo de la dirección 5 ' y 3 ' en cualquier o en ambos lados del Módulo de Activación de la Transcripción. 52-366 4. Un promotor bidireccional según la reivindicación 2, en donde el Módulo de Iniciación de la Transcripción se coloca a lo largo de la dirección 5 ' y 3 ' en cualquier o en ambos lados del Módulo de Activación de la Transcripción. 5. Un promotor bidireccional según la reivindicación 3 , en done uno o más genes de interés se colocan secuencia abajo del Módulo de Activación de la Transcripción para el propósito de su expresión desde uno o ambos lados del Módulo de Activación de la Transcripción. 6. Un promotor bidireccional según la reivindicación 1, en donde el Módulo de Activación de la Transcripción comprende una secuencia de ADN que tiene SEQ ID NO. 1 de secuencias distintivas estadísticamente identificadas como se presentan comúnmente en genes vegetales altamente expresados dentro de 100 a 500 posiciones nucleótidas secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción en plantas . 7. Un promotor bidireccional según la reivindicación 1, en donde el Módulo de Iniciación de la
1. Transcripción comprende una secuencia de ADN que tiene SEQ ID NO. 2 de secuencias distintivas estadísticamente identificadas como presentes dentro de 100 nucleótidos secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción en promotores naturales en plantas. 52-366 8. Plantas transgénicas desarrolladas después de la transformación estable con el promotor bidireccional reivindicada en la reivindicación 1 para el propósito de mejorar las características de la planta de interés para la agricultura o la industria. 9. Un vector de transformación de plantas que comprende un promotor bidireccional reivindicado en la reivindicación 1, que exprese un marcador de selección, como por ejemplo, nptll, bar, hpt, etc . , o cualquier otro gen de este tipo, desde una dirección, y un gen indicador, como por ejemplo, gusA, gfp, luc o cualquier otro gen cuyo producto se puede monitorear de manera conveniente y el uso de este tipo de vectores para el desarrollo de plantas transgénicas. 10. Un promotor bidireccional que comprende: a) un Módulo de Activación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. l o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseñada para intensificar el nivel de expresión de genes en plantas; b) un Módulo de Iniciación de la Transcripción que comprende una secuencia nucleótida artificial químicamente sintetizada y estratégicamente diseñada mostrada en SEQ ID NO. 2 o que es hasta 70% homologa a ésta, y está diseña para funcionar como una secuencia mínima para iniciar la 52-366 transcripción de un gen ubicado secuencia abajo; c) este Módulo de Iniciación de la Transcripción se ubica en cualquier o en ambos lados del "Módulo de Activación de la Transcripción" para expresar uno o dos genes, uno a la vez o ambos simultáneamente para desarrollar plantas genéticamente diseñadas.
2. 2-366