MXPA06005799A - Inmunizacion contra la infeccion por chlamydia - Google Patents

Abstract

La presente invención proporcionaácidos nucleicos, proteínas y vectores para un método de inmunización, de un hospedero, incluyendo seres humanos, conácido nucleico, que incluye ADN, contra una enfermedad provocada por una infección por una cepa de Chlamydia, específicamente C. trachomatis. El método emplea un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido Mgp002 de una cepa de Chlamydia unida funcionalmente a un promotor para efectuar la expresión del producto génico en el hospedero. Las formas truncadas del gen Mgp002 de longitud total son inmunógenosútiles para proteger con Chlamydia. La invención proporciona además la proteína Mgp002 recombinanteútil para proteger contra una enfermedad provocada por la infección con Chlamydia.

Description

INMUNIZACIÓN CONTRA LA INFECCIÓN POR CHLAMYDIA CAMPO DE INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la inmunología y, en particular, con la inmunización de hospederos utilizando moléculas de ácido nucleico para proporcionar protección contra la infección por Chl amydi a .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inmunización con ácido nucleico es un procedimiento para generar inmunidad protectora contra enfermedades infecciosas (ref. 1 -a lo largo de esta solicitud, se citan diversas referencias entre paréntesis para describir de manera más completa el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. (La información bibliográfica total para cada cita se encuentra al final de la especificación, que precede inmediatamente a las reivindicaciones. La exposición de estas referencias se incorpora en la presente como referencia en la presente exposición.) A diferencia de las vacunas subunitarias basadas en proteínas o péptidos, la inmunización con ácido nucleico o ADN proporciona inmunidad protectora a través de la expresión de proteínas extrañas mediante células hospederas, permitiendo así la presentación de un antígeno al sistema inmunológico de una manera más análoga de la que se presenta durante la infección con virus o patógenos intracelulares (ref. 2) . Aunque se ha generado un interés considerable por esta técnica, una inmunidad exitosa se ha inducido de manera más consistente mediante la inmunización por ADN para enfermedades virales (ref. 3) . Los resultados han sido más variables con patógenos que no son virales, los cuales pueden reflejar diferencias en la naturaleza de los patógenos, en los antígenos inmunizantes seleccionados, y en las vías de inmunización (ref. 4) . El desarrollo adicional de la vacunación con ADN dependerá de la aclaración de los mecanismos inmunológicos subyacentes y la ampliación de su aplicación a otras enfermedades infecciosas para la cuales han fracasado las estrategias existentes del desarrollo de vacunas. El género Chl amydi a incluye cuatro especies, Chlamydi a tra choma ti s , C . pn eumonia e , C . psi t ta ci y C . Pecorum . Chlamydia tra choma tis es un patógeno bacteriano intracelular forzoso que normalmente permanece localizado en las superficies epiteliales mucosas del hospedero humano. Las Chl amydi a e son bacterias dimórficas con una célula de transmisión extracelular similar a esporas denominada el cuerpo elemental (EB, por sus siglas en inglés) y una célula replicativa intracelular denominada el cuerpo reticular (ref. 5) . C. tra choma t i s es uno de los patógenos más comunes transmitidos sexualmente y la causa principal de la ceguera preventiva a nivel mundial (ref. 6) . Desde una perspectiva de salud pública, las infecciones por Chl amydi a son de gran importancia debido a que son causas significativas de infertilidad, ceguera y son un cofactor prevalente que facilita la transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (ref. 7) . Existen serovar múltiples de C. tra ch oma ti s que provocan tracoma, infecciones genitales, respiratorias y oculares. Se cree que la inmunidad protectora hacia C. tra ch oma ti s se efectúa a través de la inmunidad suministrada por linfocitos T mediante las citoquinas liberadas por las respuestas hacia los linfocitos CD 4 similares a Thl y mediante anticuerpos locales en las secreciones mucosas y se cree que se dirigen principalmente hacia la mayor proteína membranosa exterior (MOMP, por sus siglas en inglés) la cual es cuantitativamente la proteína superficial dominante sobre la célula bacteriana de Chl amydi a y tiene una masa molecular de aproximadamente 40 kDa (ref. 11) . La función de CDd+linfocitos T parece ser secundaria. Los primeros esfuerzos por desarrollar una vacuna contra Chl amydi a se basaron en la inmunización parenteral con la célula bacteriana entera. Aunque este procedimiento tiene algún éxito en pruebas con seres humanos, éste se limitó debido a que la protección fue efímera, parcial y la vacunación puede agravar la enfermedad durante los episodios de infección posteriores posiblemente debido a las reacciones patológicas a ciertos antígenos de Chl amydi a (ref. 8) . Los esfuerzos más recientes en el diseño de vacunas contra Chl amydi a se han basado en un diseño subunitario que utiliza proteína MOMP o péptidos (ref 9) . Estas vacunas subunitarias en general también han fracasado, quizás debido a que los inmunógenos no inducen respuestas inmunitarias celulares y humorales protectoras recordadas por los epítopes naturales en el organismo (ref. 10) . En la Patente de los Estados Unidos No. 6,235,290 presentado el 11 de julio, 1997, cedida a la Universidad de Manitoba y la exposición de la misma se incorpora en la presente como referencia, se ha descrito la generación de una respuesta inmunitaria protectora utilizando una secuencia de ADN que codifica para la MOMP de C. tra choma ti s en un plásmido mediante la inmunización con AD . Recientemente se han secuenciado los genomes enteros de la cepa neumonitis de ratón (MoPn) tanto de Chlamydi a tra choma ti s (ref 14) como de C . muridi um (ref 15) . El gen mgp002 proveniente de Chl amydi a pn eumon í a se expuso en la publicación WO01/21803 del PCT publicada el 29 de marzo de 2001. Las infecciones por Chl amydi a se pueden tratar con antibióticos, tales como por ejemplo, derivados de tetraciclina, en especial doxiciclina, y el macrólido o azalides tales como por ejemplo, eritromicina y azitromicina ; sin embargo, las infecciones a menudo son asintomáticas , con severas complicaciones que normalmente se presentan como los primeros síntomas de una infección (ref 6) . La terapia quimioterapéutica o con antibióticos puede no ser una estrategia viable a largo plazo a medida que el uso cada vez mayor de antibióticos ha llevado al aumento de microorganismos resistentes a antibióticos. De esta forma, sigue habiendo la necesidad por terapias eficaces para prevenir y tratar las infecciones por Chl amydi a .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la inmunización con ácido nucleico, específicamente la inmunización con ADN, para generar en un hospedero una respuesta inmunitaria protectora al gen Mgp002 o una forma truncada del misdo de una cepa de Chlamydia . Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No: 4; (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de (a) a (d) ; y (f ) un polipéptido de (a), (b) , (c) o (d) que se haya modificado mediante una sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 75% idéntico en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido correspondiente de (a), (b), (c) o (d) . En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No: 4; (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de (a), (b), (c) o (d) que se haya modificado mediante la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 75% idéntico en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido correspondiente de (a), (b) , (c) o (d) en donde la molécula de ácido nucleico se acopla funcionalmente a una secuencia para la expresión de la molécula de ácido nucleico en un hospedero a la cual se administra la molécula de ácido nucleico. La secuencia para la expresión puede ser un promotor de citomegalovirus, y puede estar contenida en la región pro otora-mej oradora-casi-inmediat a mayor de un citomegalovirus humano. Otros promotores adecuados pueden ser un promotor viral u otros promotores mamíferos que sean capaces de estimular la expresión en una célula eucariota destinada. El vector puede ser un vector de plásmido y la secuencia de nucleótidos puede ser aquella de la SEQ ID No: 1, 3 , 5 ó 7.

La cepa de Chl amydi a puede ser una cepa o serovar de Chl amydi a incluyendo Chl amydi a tra choma ti s o Chl amydi a pn eumoni a e . El vector no replicante puede ser el plásmido pcDNA3.1 en el cual se inserta la secuencia de nucleótidos o un derivado o modificación del mismo. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica para la administración in vi vo a un hospedero para la generación en el hospedero de una respuesta inmunitaria protectora hacia el gen Mgp002 o un fragmento del mismo, de una cepa de Chl amydi a , que comprende un vector no replicante según se proporciona en la presente y un portador farmacéut icamente-aceptable del mismo. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado de una cepa de Chl amydi a seleccionada del grupo que consiste de: un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 1 ; un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 3 ; un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 7 ; un polinucleótido que es al menos 95% homólogo con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l, 3, 5, ó 7; y un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones severas de hibridación de 6xSSC que contiene formamida al 50% a 42°C con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l, 3, 5, o 7, en donde la administración del polinucleótido aislado, en una cantidad inmunogénicamente eficaz a un mamífero, induce una respuesta inmunitaria en el mamífero contra la infección por la cepa de Chl amydi a . En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una vacuna que comprende un vector que a su vez comprende una molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de cualquiera de (a) a (d); y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado mediante la sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e) ; en donde la molécula de ácido nucleico ya sea se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido en un mamífero o una célula bacteriana, en donde la vacuna proporciona una respuesta inmunitaria protectora contra la enfermedad provocada por Chl amydi a . En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y una molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) ; y (f ) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado mediante la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad; en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e) ; en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido en una célula mamífera.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para inmunizar a un hospedero contra la enfermedad provocada por la infección con una cepa de Chl amydi a , que comprende administrar al hospedero una cantidad eficaz de un vector no replicante según se proporciona en la presente. La molécula de ácido nucleico se puede administrar al hospedero, incluyendo un hospedero humano, de cualquier forma conveniente, tal como por ejemplo, intramuscular o intranasalmente. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (c) ; y (d) un polipéptido de cualquiera de (a) a (c) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (c) ; en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido. En este aspecto de la invención, se pueden emplear las diversas opciones y alternativas analizadas anteriormente. Aquellos con experiencia en la técnica entenderán fácilmente que la invención, habiendo proporcionado las secuencias polinucleotídicas que codifican para los polipéptidos de Chl amydi a , también proporciona polinucleótidos que codifican para los fragmentos derivados de estos polipéptidos. Además, se entiende que la invención proporciona los mutantes y derivados de estos polipéptidos y fragmentos derivados de los mismos, que resultan de la adición, supresión, o sustitución de aminoácidos no esenciales descritos en la presente. Aquellos con experiencia en la técnica también entenderían fácilmente que la invención, habiendo proporcionado las secuencias polinucleotídicas que codifican para polipéptidos de Chlamydi a , proporciona además los anticuerpos monoespecí fieos que se unen específicamente a estos polipéptidos . La presente invención tiene amplia aplicación e incluye casetes de expresión, vectores, y células transformadas o transfectadas con los polinucleótidos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción haciendo referencia a los dibujos en donde: La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de longitud total del gen Mgp002 (SEQ ID No: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida del producto génico Mgp002 de longitud total (SEQ ID No: 2) a partir de Chl amydi a m uri di um (cepa Nigg) así como la secuencia de nucleótidos suprimida de la secuencia de señal (que inicia en la flecha) (SEQ ID No:5) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No: 6) . La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos de longitud total del gen Mgp002 (SEQ ID No: 3) y la secuencia de aminoácidos deducida del producto génico Mgp002 de longitud total (SEQ ID No: 4) así como la secuencia de nucleótidos suprimida de la secuencia de señal (que inicia con la flecha) (SEQ ID No: 7) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No: 8) a partir de Chl amydi a tra choma ti s ( serovar D) .

La Figura 3 muestra una representación esquemática de una modalidad del protocolo de inmunización para el tratamiento de la infección por Chl amydi a con una molécula de ácido nucleico que codifica para un gen Mgp002 o la forma truncada del mismo. IM se refiere a inmunización intramuscular mientras que IN se refiere inmunización intranasal. La Figura 4, que comprende los paneles A y B, muestra los resultados de la inmunización con una molécula de ácido nucleico que codifica para un gen Mgp002 de longitud total (Panel A) y un gen Mgp002 suprimido de la secuencia de señal (Panel B), clonado en el plásmido pcDNA3.1, sobre la pérdida de peso corporal en ratones Balb/c inmunizados inoculados con Chl amydi a infecciosa. Leyenda: EB=cuerpos elementales hospedero-exterminados , PCACTmgp002=pcDNA3 con el gen Mgp002 de longitud total insertado, PCACTmgpO 02delta= gen Mgp002 suprimido de la secuencia de señal, sin tratamiento previo = sin inmunización, pAMycHis=vector vacío. La Figura 5, que comprende los paneles y B, muestra los resultados del aclaramiento mejorado de Chl amydi a de los pulmones de ratones Balb/c inmunizados con un gen Mgp002 de longitud total (Panel A) y un gen Mgp002 suprimido de la secuencia de señal (Panel B) e inoculados con Chl amydi a infecciosa. Leyenda: EB=cuerpos elementales hospedero-exterminados, PCACTmgp002=pcDNA3 con el gen Mgp002 de longitud total insertado, PCACTmgp002delta= gen Mgp002 suprimido de la secuencia de señal, sin tratamiento previo = sin inmunización, pAMycHis=vector vacío. La Figura 6, ilustra gráficamente la construcción de un plásmido, pET30b ( + ) mgpO 02+SP , para la expresión de la proteína Mgp002 recombinante que contiene un His-Tag® N-terminal. La Figura 7, ilustra gráficamente la protección a partir de la inoculación genital con serovar D de Chl amydi a tra choma ti s en ratones CH3 inmunizados con la proteína Mgp002 recombinante purificada con un adyuvante ISCOM. Los animales se inmunizaron subcutáneamente ya sea con la proteína Mgp002 (mg002) en solución salina (sin tratamiento previo) o cuerpos elementales (EB) de Chamydi a y luego se inocularon intravaginalmente con serovar D vivo de Chl amydi a tra choma ti s . Las unidades infecciosas de Chl amydi a se determinaron a partir de lavados en los días 3 y 5 después de la infección.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para ilustrar la presente invención, se construyó un plásmido de ADN que contuvo una molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Mgp002 proveniente de la cepa de neumonitis de ratón (MoPn) de C. tra choma ti s , que es un patógeno murino natural, que permite efectuar la experimentación en ratones. Se sabe que la infección primaria en el modelo de ratón induce fuerte inmunidad protectora contra reinfecciones. Para inmunización humana, se puede utilizar una molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Mgp002 o una forma truncada del mismo de Chl amydi a tra choma ti s . Se puede utilizar cualquier vector de plásmido adecuado, tal como por ejemplo pcDNA3.1, un vector de expresión eucariótica II-seleccionable (Invitrogen, San Diego, CA, EUA), que contiene una región pro otora-mej oradora casi-inmediata del citomegalovirus humano mayor o un derivado de la misma tal como por ejemplo, pCAMycHis. La molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Mgp002 o un fragmento del mismo, se puede insertar en el vector de cualquier forma conveniente. El gen se puede amplificar a partir de ADN genómico de Chl amydi a tra choma ti s mediante PCR utilizando cebadores adecuados y el producto de PCR clonado en el vector. La molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Mgp002 o el fragmento del mismo, el plásmido que porta el gen del mismo se puede transfectar, tal como por ejemplo mediante electroporación, en E . col i o cualquier hospedero adecuado para la replicación en el mismo. Los plásmidos se pueden extraer de E . col i de cualquier forma conveniente. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican para los polipéptidos de Chl amydi a , cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en las SEQ ID Nos : 2, 4, 6 y 8. El término "polinucleótido aislado" se define como un polinucleótido eliminado del entorno en el cual se presenta naturalmente. Por ejemplo, no se aisla una molécula de ADN que se presenta naturalmente en el genoma de una bacteria viviente o como parte de un banco de genes, aunque se aisla la misma molécula separada de la porción restante del genoma bacteriano, como resultado de, por ejemplo, un acontecimiento de clonación (amplificación) . Típicamente, una molécula aislada de ADN no tiene regiones de ADN (por ejemplo, regiones codificantes) con la cuales esté inmediatamente contigua en el extremo 5' o 3', en el genoma que se presenta naturalmente. Estos polinucleótidos aislados pueden formar parte de un vector o una composición y todavía se pueden definir como aislados de tal forma que un vector o composición no forme parte del entorno natural de este polinucleótido. El polinucleótido de la invención es ya sea ARN o ADN (DNAc, ADN genómico, o ADN sintético), o modificaciones, variantes, homólogos o fragmentos del mismo. El ADN es ya sea de doble cadena o de una sola cadena, y, si es de una sola cadena, es ya sea la cadena codificante o la cadena no codificante (anti-sentido) . Cualquiera de las secuencias que codifican para los polipéptidos de la invención según se muestran en la SEQ ID No: 1,3, 5 y 7 son (a) una secuencia codificante, (b) una secuencia de ribonucleótidos derivada de la transcripción de (a), o (c) una secuencia codificante que utiliza la redundancia o degeneración del código genético para codificar a los mismos polipéptidos. Por "polipéptido" o "proteína" se debe entender cualquier cadena de aminoácidos, sin tener en cuenta la longitud o modificación pos-traduccional (por ejemplo, glucosilación o fosforilación) . Ambos términos se utilizan indistintamente en la presente solicitud . Consistente con el primer aspecto de la invención, se proporcionan las secuencias de aminoácidos que son homologas con la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8. En el sentido en que se utiliza en la presente, "secuencia homologa de aminoácidos" es cualquier polipéptido que se codifica, en su totalidad o en parte, por una secuencia de ácido nucleico que se híbrida a 25-35°C por debajo de la temperatura de fusión crítica (Tm) , a cualquier porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7. Una secuencia homologa de aminoácidos es una que difiere de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos . Esta secuencia también abarca las variantes serotípicas (definidas posteriormente) así como también las secuencias que contienen supresiones o inserciones que retienen características inherentes del polipéptido tales como por ejemplo, la inmunogenicidad. De preferencia, esta secuencia es al menos 75%, de mayor preferencia 80%, y con la máxima preferencia del 90% al 95% idéntica a la SEQ ID No: 2,4, 6 u 8.

Las secuencias de aminoácidos homologas incluyen las secuencias que son idénticas o prácticamente idénticas a las SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8. Por "secuencia de aminoácidos prácticamente idéntica" se debe entender una secuencia que es al menos 90%, de preferencia 95%, de mayor preferencia 97%, y con la máxima preferencia 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia y que de preferencia difiere de la secuencia de referencia por una mayoría de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son las sustituciones entre los aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo, los aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas, tales como por ejemplo, asparigina, glutamina, serina, treonina, y tirosina; los aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como por ejemplo, lisina, arginina, e histidina; los aminoácidos que tienen cadenas laterales acidas, tales como por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico; y los aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y cisteína.

La homología se mide utilizando un software para análisis de secuencias tal como por ejemplo, el Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, üniversity of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705. Las secuencias de aminoácidos se alinean para aumentar al máximo la identidad. Los huecos se pueden introducir artificialmente en la secuencia hasta alcanzar la alineación adecuada. Una vez que se ha fijado la alineación óptima, el grado de homología se establece registrando todas las posiciones en las cuales los aminoácidos de ambas secuencias sean idénticas, con relación al número total de posiciones. Las secuencias polinucleotídicas homologas se definen de una manera similar. De preferencia, una secuencia homologa es una que sea al menos 45%, de mayor preferencia 60%, y con la máxima preferencia 85% idéntica a la secuencia codificante de la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7. Consistente con el primer aspecto de la invención, los polipéptidos que tienen una secuencia homologa con la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 incluyen las variantes alélicas que se presentan naturalmente, así como también los mutantes o cualesquiera otras variantes que no se presentan naturalmente y que conservan las características inherentes del polipéptido de la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alterna de un polipéptido que se caracteriza por tener una sustitución, supresión, o adición de uno o más aminoácidos que no altere la función biológica del polipéptido. Por "función biológica" se debe entender la función del polipéptido en las células en las cuales se presenta naturalmente, aun cuando la función no sea necesaria para el crecimiento o supervivencia de las células. Por ejemplo, la función biológica de una porina es permitir la entrada en las células de los compuestos presentes en el medio extracelular. La función biológica es distinta de la propiedad antigénica. Un polipéptido puede tener más de una función biológica. Diferentes variantes alélicas pueden tener propiedades antigénicas similares. Las variantes alélicas son muy comunes en la naturaleza. Por ejemplo, una especie bacteriana tal como por ejemplo, C. tra ch oma t i s normalmente se representa por una variedad de serovars que difieren entre sí por variaciones alélicas menores. De hecho, un polipéptido que cumple la misma función biológica en diferentes cepas puede tener una secuencia de aminoácidos (y una secuencia de polinucleótidos) que no sea idéntica en cada una de las cepas. A pesar de esta variación, se ha demostrado una respuesta inmunitaria dirigida en general contra muchas variantes alélicas . En los estudios del antígeno MOMP de Chl amydi a , la unión del anticuerpo de cepa cruzada más la neutralización de infectividad se presenta a pesar de la variación de la secuencia de aminoácidos de MOMP de cepa a cepa, indicando que la MOMP, cuando se utiliza como un inmunógeno, es tolerante a las variaciones de aminoácidos . Los polinucleótidos que codifican para polipéptidos homólogos o variantes alélicas se recuperan mediante la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ADN bacteriano genómico extraído mediante métodos convencionales. Esto implica el uso de cebadores de oligonucleótidos sintéticos que coinciden en la dirección 5' y la dirección 3' de los extremos 5' y 3' del dominio codificante. Los cebadores adecuados se diseñan de acuerdo con la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEQ ID No: 1,3, 5 ó 7. El procedimiento es como sigue: se selecciona un cebador que consiste de 10 a 40, de preferencia 15 a 25 nucleótidos. Es ventajoso seleccionar cebadores que contengan nucleótidos C y G en una proporción suficiente para asegurar una hibridación eficaz; es decir, una cantidad de los nucleótidos C y G de al menos 40%, de preferencia 50% del contenido total de nucleótidos . Una reacción PCR normal contiene típicamente de 0.5 a 5 unidades de Taq ADN polimerasa por 100 µL, de 20 a 200 µM de desoxinucleótido cada uno, de preferencia a concentraciones equivalentes, de 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre la concentración total de desoxinucleótidos, de 105 a 106 moléculas blanco, y aproximadamente 20 pmol de cada cebador. Se realizan aproximadamente de 25 a 50 ciclos de la PCR, con una temperatura de fijación de 15 a 5°C por debajo la Tm verdadera de los cebadores. Una temperatura de fijación más severa mejora la discriminación contra los cebadores fijados incorrectamente y reduce la incorporación de nucleótidos incorrectos en el extremo 3' de los cebadores. Es típica una temperatura de desnaturalización de 95°C a 97°C, aunque pueden ser adecuadas temperaturas superiores para la desnaturalización de blancos ricos en G+C . El número de ciclos realizados depende de la concentración de partida de las moléculas blanco, aunque típicamente no se recomiendan más de 40 ciclos ya que los productos anteriores no específicos tienden a acumularse . Un método alternativo para la recuperación de polinucleótidos que codifican para polipéptidos homólogos o las variantes alélicas se realiza mediante selección por hibridación de una biblioteca de ADN o ARN. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica. Los parámetros importantes para optimizar las condiciones de hibridación se reflejan en una fórmula utilizada para obtener la temperatura de fusión crítica superior a la cual dos cadenas de ADN complementarias se separan una de la otra. Para polinucleótidos de aproximadamente 600 nucleótidos o más, esta fórmula es como sigue: Tm 81.5 + 0.41 x (% G+C) + 16.6 log (concentración catiónica-iónica) - 0.63 x (% de formamida) -600 /número base. Bajo condiciones rigurosas adecuadas, la temperatura de hibridación (Th) es aproximadamente de 20 hasta 40°C, de 20 hasta 25°C, o, de preferencia de 30 hasta 40°C por debajo de la Tm calculada. Aquellos con experiencia en la técnica entenderán que se pueden determinar fácilmente la temperatura óptima y las condiciones salinas .

Para los polinucleótidos de la invención, las condiciones rigurosas se alcanzan para las incubaciones tanto de pre-hibridación como de hibridación (i) dentro de 4-16 horas a 42°C, en 6 x SSC que contiene formamida al 50%, o (ii) dentro de 4-16 horas a 65°C en solución acuosa 6 x SSC (NaCJ 1M, citrato de sodio 0.1M (pH 7.0)) . Típicamente, los experimentos de hibridación se realizan a una temperatura de 60 hasta 68°C, por ejemplo 65°C. A esta temperatura, las condiciones rigurosas de hibridación se pueden alcanzar en 6xS SC, de preferencia en 2xSSC o lxSSC, de mayor preferencia en 0.5xSSc, 0.3xSSC o 0.2xSSC (en ausencia de formamida) . lxSSC contiene NaCl 0.15M y citrato de sodio 0.015 M-. Aquellos con experiencia en la técnica entenderán que la secuencia de ácido nucleico de la solución de ensayo se hibridará con la secuencia de ácido nucleico blanco complementaria. Los homólogos útiles y fragmentos de los mismos que no se presentan naturalmente se diseñan utilizando métodos conocidos para identificar las regiones de un antígeno que probablemente toleren los cambios y/o supresiones de la secuencia de aminoácidos. Como un ejemplo, se comparan los polipéptidos homólogos de las diferentes especies; se identifican las secuencias conservadas. Las secuencias más divergentes probablemente son las que más toleran los cambios de secuencia. La homología entre las secuencias se puede analizar utilizando, como un ejemplo, el algoritmo para búsqueda de homología BLAST de Altschul et al. (ref 12) . Alternativamente, las secuencias se modifican de tal forma que se hagan más reactivas a los linfocitos T y/o B, con base en un análisis asistido por computadora de probables epítopes de linfocitos T o B. Todavía otra alternativa es transformar un residuo o secuencia de aminoácidos particular dentro del polipéptido in vi tro , luego seleccionar los polipéptidos mutantes por su capacidad para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a de acuerdo con el método señalado más adelante. Alguien con experiencia en la técnica entenderá fácilmente que el siguiente proceso de selección de esta invención, se determinará sin experimentación indebida si un homólogo particular o fragmento inmunogénico de la SEQ ID No. 2, 4, 6 u 8 puede ser útil en la prevención o tratamiento de la infección por Chl amydi a . El procedimiento de selección comprende los pasos: (i) inmunizar un animal, de preferencia un ratón, con el homólogo o fragmento de prueba; (ii) inocular al animal inmunizado con Chl amydi a infecciosa; y (iii) seleccionar aquellos homólogos o fragmentos que confieren protección contra Chl amydi a . Por "conferir protección" se debe entender que existe una reducción en la gravedad de cualquiera de los efectos de la infección por Chl amydi a , en comparación con un animal control que no se inmunizó con el homólogo o fragmento de prueba. Consistente con el primer aspecto de la invención, se proporcionan derivados polipeptídicos que son las secuencias de ácido nucleico parciales de la SEQ ID No. 1, 3, 5 ó 7, las secuencias parciales de las secuencias polipeptídicas homologas SEQ ID No. 2, 4, 6 u 8, los polipéptidos derivados de los polipéptidos de longitud total mediante la supresión interna, y las proteínas de fusión. Una práctica aceptada en el campo de la inmunología es utilizar fragmentos y variantes de inmunógenos proteínicos como vacunas, al igual que todo eso se requiere para inducir una respuesta inmunitaria hacia una proteína es una pequeña (por ejemplo, de 8 a 10 aminoácidos) región inmunogénica de la proteína. Diversos péptidos sintéticos cortos que corresponden a los antígenos expuestos superficiales de patógenos distintos de Chl amydi a han mostrado ser antígenos de vacuna eficaces contra sus patógeno respectivos, por ejemplo un péptido con 11 residuos del virus de tumor mamario murino (Casey & Davidson, Nucí. Acid Res. (1977) 4:1539), un péptido de 16 residuos del virus Semliki Forest (Snijders et al., 1991. J. Gen. Virol. 72:55 7-565), y dos péptidos superpuestos de 15 residuos cada uno del parvovirus canino (Langeveld et al., Vaccine 12 ( 15 ) : 1473-1480 , 1994) . Por consiguiente, será fácilmente evidente para alguien con experiencia en la técnica, después de haber leído la presente descripción, que las secuencias parciales de la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 o sus secuencias homologas de aminoácidos son inherentes a las secuencias de longitud total y se muestran por la presente invención. Estos fragmentos polipeptídicos de preferencia tienen al menos 12 aminoácidos de longitud. Ventajosamente, los mismos tienen al menos 20 aminoácidos, de preferencia al menos 50 aminoácidos, de mayor preferencia al menos 75 aminoácidos, y con la máxima preferencia al menos 100 aminoácidos de longitud.

Los polinucleótidos de 30 a 600 nucleótidos que codifican para las secuencias parciales de las secuencias homologas para la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 se recuperan mediante la amplificación de la PCR utilizando los parámetros señalados anteriormente y utilizando cebadores que coincidan con las secuencias en la dirección 5' y la dirección 3' de los extremos 5' y 3' del fragmento que será amplificado. El polinucleótido molde para esta amplificación es ya sea el polinucleótido de longitud total homólogo con la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7 o un polinucleótido contenido en una mezcla de polinucleótidos tal como por ejemplo, una biblioteca de ADN o ARN. Como un método alternativo para la recuperación de las secuencias parciales, la hibridación por selección se lleva a cabo bajo las condiciones descritas anteriormente y utilizando la fórmula para calcular la Tm. Cuando serán recuperados fragmentos de 30 a 600 nucleótidos, la Tm calculada se corrigió mediante una resta (600/tamaño del polinucleótido en pares de bases) y las condiciones rigurosas se definen por una temperatura de hibridación que es de 5 hasta 10°C inferior a la Tm. Donde se obtendarán oligonucleótidos más cortos de 20-30 bases, la fórmula para calcular la Tm es como sigue: Tm=4 x (G+C) + 2 (A+T) . Por ejemplo, un fragmento de 18 nucleótidos de "50% de G+C podría tener una Tm aproximada de 54°C. Los péptidos cortos que son fragmentos de la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 o sus secuencias homologas, se obtienen directamente mediante síntesis química. Los epítopes que inducen una respuesta inmunitaria protectora dependiente de linfocitos T están presentes a lo largo de la longitud del polipéptido. Sin embargo, algunos epítopes se pueden enmascarar mediante las estructuras secundarias y terciarias del polipéptido. Para revelar estos epítopes enmascarados se crean grandes supresiones internas que eliminan muchas de las estructuras proteínicas originales y exponen los epítopes enmascarados. Estas supresiones internas algunas veces proporcionan la ventaja adicional de eliminar las regiones inmunodominantes de alta variabilidad entre las cepas. Los polinucleótidos que codifican para fragmentos polipeptídicos y los polipéptidos que tienen grandes supresiones internas se construyen utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen PCR estándar, PCR inversa, tratamiento con enzimas de restricción con moléculas clonadas de ADN. Los componentes para estos métodos e instrucciones para su utilización ya están disponibles fácilmente de diversas fuentes comerciales tales como por ejemplo, Stratagene. Una vez que se hayan construido los mutantes de supresión, los mismos se prueban por su capacidad para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a como se describió anteriormente. En el sentido en que se utiliza en la presente, un polipéptido de fusión es uno que contenga un polipéptido o un derivado polipeptídico de la invención, fusionado en el extremo N o C terminal hacia cualquier otro polipéptido (denominado en lo sucesivo como una cola peptídica) . Una forma simple para obtener este polipéptido de fusión es mediante la traducción de una fusión en-marco de las secuencias polinucleotídicas, es decir, un gen híbrido. El gen híbrido que codifica para el polipéptido de fusión se inserta en un vector de expresión que se utiliza para transformar o transfectar una célula hospedera. Alternativamente, la secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido o derivado polipeptídico se inserta en un vector de expresión en el cual el polinucleótido que codifica para la cola peptídica ya está presente. Estos vectores e instrucciones para su utilización están disponibles comercialmente, por ejemplo el sistema pMal-c2 o pMal-p2 de New England Biolabs, en donde la cola peptídica es una proteína de unión con maltosa, el sistema glutatión-S-transferasa de Pharmacia, o el sistema His-Tag disponible de Novagen. Éstos y otros sistemas de expresión proporcionan los medios convenientes para la purificación adicional de los polipéptidos y los derivados de la invención. Un ejemplo ventajoso de un polipéptido de fusión es uno en donde el polipéptido u homólogo o fragmento de la invención se fusiona a un polipéptido que tiene actividad adyuvante, tal como por ejemplo, la subunidad B de cualquier toxina de cólera o la toxina de E . col i lábil térmica. Otra fusión ventajosa es una en donde el polipéptido, homólogo o fragmento se fusiona a un epítope de linfocitos T o un epítope de linfocitos B fuerte. Este epítope puede ser uno conocido en la técnica (por ejemplo el antígeno núcleo del virus de la hepatitis B, D.R. Millich et al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a single synthetic T cel site", Nature. 1987. 329:547-549), o uno que se haya identificado en otro polipéptido de la invención con base en un análisis asistido por computadora de epítopes de linfocitos T o B probables. Consistente con este aspecto de la invención, es un polipéptido de fusión que comprende los epítopes de linfocitos T o B de la SEQ ID No: 2, 4, 6 u 8 o su homólogo o fragmento, en donde los epítopes se derivan de las variantes múltiples del polipéptido u homólogo o fragmento, cada variante difiere de otra en la ubicación y secuencia de su epítope dentro del polipéptido. Esta fusión es eficaz en la prevención y tratamiento de la infección por Chl amydi a debido a que optimiza la respuesta a linfocitos T y B con el polipéptido, homólogo o fragmento global . Para llevar a cabo la fusión, el polipéptido de la invención se fusiona al extremo N, o de preferencia, al extremo C terminal del polipéptido que tiene actividad adyuvante o el epítope de linfocitos T o B. Alternativamente, un fragmento polipeptídico de la invención se inserta internamente dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene actividad adyuvante. El epítope de linfocitos T o B también se puede insertar internamente dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención. Consistente con el primer aspecto, los polinucleótidos de la invención también codifican para polipéptidos precursores híbridos que contienen péptidos de señal heteróloga que maduran en los polipéptidos de la invención. Por "péptido de señal "heteróloga" se debe entender un péptido de señal que no se encuentra en los precursores que se presentan naturalmente de los polipéptidos de la invención. Las moléculas de polinucleótidos de acuerdo con la invención, incluyendo ARN, ADN, o modificaciones o combinaciones de los mismos, tienen diversas aplicaciones. Se utiliza una molécula de ADN, por ejemplo, (i) en un proceso para producir el polipéptido codificado en un sistema hospedero recombinante, (ii) en la construcción de vectores para la vacuna tales como por ejemplo, poxvirus, que se utilizan adicionalmente en los métodos y composiciones para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a , (iii) como un agente para vacuna (así como también una molécula de ARN) , en forma simple o formulado con un vehículo para suministro y, (iv) en la construcción de cepas atenuadas de Chl amydi a que pueden sobre-expresar un polinucleótido de la invención o expresarlo en una forma deformada, no tóxica . Por consiguiente, un segundo aspecto de la invención abarca (i) un cásete de expresión que contiene una molécula de ADN de la invención colocada bajo el control de o unida funcionalmente a los elementos requeridos para la expresión, también denominada una secuencia para control de expresión, en particular bajo el control de un promotor adecuado; (ii) un vector de expresión que contiene un cásete de expresión de la invención; (iii) una célula procariota o eucariota transformada o transfectada con un cásete de expresión y/o un vector de la invención, así como también (iv) un proceso para producir un polipéptido o derivado polipeptídico codificado por un polinucleótido de la invención, que implica cultivar una célula eucariota o eucariota transformada o transfectada con un cásete de expresión y/o un vector de la invención, bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN de la invención y, recuperar el polipéptido codificado o derivado polipeptídico del cultivo celular . Se -selecciona un sistema de expresión recombinante a partir de hospederos procariotas y eucariotas . Los hospederos eucariotas incluyen células de levadura (por ejemplo, Sa ccharon zyces cerevi siae o Pi chi a pa s tori s ) , células mamíferas (por ejemplo, células COSÍ, NIH3T3, o JEG3), células de artrópodos (por ejemplo, células de Spodop t era frugiperda (SF9)), y células vegetales. Un sistema de expresión preferido es un hospedero procariota tal como por ejemplo, E . col i . Las células bacterianas y eucariotas están disponibles varias fuentes diferentes entre las que se incluyen las fuentes comerciales para aquellos con experiencia en la técnica, por ejemplo, la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC; Rockville, Maryland) . Las fuentes comerciales de las células utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes también proporcionan las instrucciones para el uso de las células . La elección del sistema de expresión depende de las características deseadas para el polipéptido expresado. Por ejemplo, puede ser útil producir un polipéptido de la invención en una forma tratada con lípidos particular o cualquier otra forma. Alguien con experiencia en la técnica podría entender fácilmente que no todos los vectores y secuencias para control de expresión y hospederos se podría esperar que expresen igualmente bien los polinucleótidos de esta invención. Con los lineamientos descritos más adelante, sin embargo, se puede realizar una selección de vectores, las secuencias para control de expresión y los hospederos sin experimentación indebida y sin apartarse del alcance de esta invención. Para seleccionar un vector, el hospedero se debe seleccionar de manera que sea compatible con el vector el cual existe y posiblemente se replica en el mismo. Las consideraciones se realizan con respecto al número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias, la expresión de otras proteínas tales como por ejemplo, la resistencia a antibióticos. Para seleccionar una secuencia para control de expresión, se consideran diversas variables. Entre las variables importantes se encuentran la resistencia relativa de la secuencia (por ejemplo, la capacidad para conducir la expresión bajo diversas condiciones), la capacidad para controlar la función de la secuencia, la compatibilidad entre el polinucleótido que será expresado y la secuencia control (por ejemplo, se consideran las estructuras secundarias para evitar las estructuras horquilla que evitan una transcripción eficaz) . Para seleccionar al hospedero, se seleccionan hospederos unicelulares que sean compatibles con el vector seleccionado, tolerante de cualesquiera posibles efectos tóxicos del producto expresado, capaces de secretar el producto expresado eficazmente si esto es lo que se desea, para ser capaces de expresar el producto en la conformación deseada, para que se escale fácilmente, y para la facilidad de purificación final del producto . La elección del cásete de expresión depende del sistema del hospedero seleccionado, así como también, las características deseadas para el polipéptido expresado. Típicamente, un cásete de expresión incluye a un promotor que es funcional en el sistema del hospedero seleccionado y puede ^ ser constitutivo o inducible; un sitio de unión con ribosomas; un codón de inicio (ATG) si es necesario; una región que codifica para un péptido de señal, por ejemplo, un péptido de señal para lipidación; una molécula de ADN de la invención; un codón de paro; y opcionalmente una región terminal 3' (terminador de traducción y/o transcripción) . La región codificante del péptido señal está adyacente al polinucleótido de la invención y se coloca en el marco de lectura adecuado. La región codificante del péptido señal es homologa o heteróloga con la molécula de ADN que codifica para el polipéptido maduro y es compatible con el aparato de secreción del hospedero utilizado para la expresión. El marco de lectura abierta constituido por la molécula de ADN de la invención, solo o junto con el péptido de señal, se coloca bajo el control del promotor de tal forma que se presenten en el sistema del hospedero la transcripción y traducción. Los promotores y las regiones codificantes del péptido señal se conocen ampliamente y están disponibles para aquellos con experiencia en la técnica e incluyen, por ejemplo, el promotor de Sa lmonel l a typhimuri um ( y derivados) que es inducible mediante arabinosa (promotor araB) y es funcional en bacterias Gram-negativas tales como por ejemplo, E . col i (como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,028,530); el promotor del gen del bacteriófago T7 que codifica para la polimerasa de ARN, que es funcional en varias cepas de E . col i que expresan la polimerasa T7 (descrita en la patente de los Estados Unidos No. 4,952,496); el péptido de señal para la lipidación de OspA; el péptido de señal para la lipidación de RIpB (Takase et al., J. Bact. (1987) 169: 5692) .

El cásete de expresión típicamente forma parte de un vector de expresión, que se selecciona por su capacidad para replicarse en el sistema de expresión seleccionado. Se pueden seleccionar vectores de expresión (por ejemplo, plásmidos o vectores virales), por ejemplo, de aquellos descritos en Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985, Supp. 1987) . Los vectores de expresión adecuados se pueden adquirir de diversas fuentes comerciales. Los métodos para transformar /transfectar células hospederas con vectores de expresión son bien conocidos en la técnica y dependen del sistema del hospedero seleccionado. En el momento de la expresión, se produce un polipéptido recombinante de la invención (o un derivado polípeptídico ) y permanece en el compartimiento intracelular, se secreta/excreta en el medio extracelular o en el espacio periplásmico, o se incluye en la membrana celular. El polipéptido se recupera en una forma prácticamente purificada del extracto celular o del sobrenadante después de la centrifugación del cultivo celular recombinante. Típicamente, el polipéptido recombinante se purifica mediante purificación de afinidad con base en anticuerpos o mediante otros métodos bien conocidos que se pueden adaptar fácilmente por alguien con experiencia en la técnica, tales como por ejemplo, la fusión de polinucleótidos que codifica para el polipéptido o su derivado a un dominio de unión de afinidad pequeña. Los anticuerpos útiles para purificar mediante inmunoafinidad los polipéptidos de la invención se obtienen como se describirá más adelante . Un polinucleótido de la invención también puede ser útil como una vacuna. Existen dos vías principales, ya sea utilizando un vehículo para suministro viral o bacteriano o sintético (es decir, el vector de vacuna vivo o micropartículas) o administrando el gen en una forma libre, por ejemplo, insertado en un vector de ácido nucleico. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polinucleótido de la invención se evalúa como se describirá más adelante. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención proporciona (i) un vector de vacuna tal como por ejemplo, un poxvirus, que contiene una molécula de ADN de la invención, colocada bajo el control de los elementos requeridos para la expresión; (ii) una composición de materia que comprende un vector de vacuna de la invención, junto con un diluyente o portador; específicamente (iii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un vector de vacuna de la invención; (iv) un método para inducir una respuesta inmunitaria contra Chl amydi a en un mamífero (por ejemplo, un ser humano; alternativamente, el método se puede utilizar en aplicaciones veterinarias para el tratamiento o prevención de una infección de animales Chl amydi a , por ejemplo, gatos o aves), que implica administrar al mamífero una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de vacuna de la invención para producir una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica para Chl amydi a ; y particularmente, (v) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a (por ejemplo, C. tra choma tis , C . psi t ta ci , C . pneumonía, C. Pecorum ) que implica administrar una cantidad profiláctica o terapéutica de un vector de vacuna de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, un aspecto adicional de la invención abarca el uso de un vector de vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a .

En el sentido en que se utiliza en la presente, un vector de vacuna expresa uno o varios polipéptidos o derivados de la invención. El vector de vacuna puede expresar adicionalmente una citoquina, tal como por ejemplo, int erleuquina-2 (IL -2) o interleuquina-12 (IL-12), que refuerza la respuesta inmunitaria (efecto adyuvante) . Se debe entender que cada uno de los componentes que serán expresados se coloca bajo el control de los elementos requeridos para la expresión en una célula mamífera. Consistente con un aspecto adicional de la invención, se encuentra una composición que comprende varios vectores de vacuna, cada uno de los mismos es capaz de expresar un polipéptido o derivado de la invención. Una composición también puede comprender un vector de vacuna capaz de expresar un antígeno de Chl amydi a adicional, o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante, o derivado del mismo, opcionalmente junto con una citoquinaa tal como por ejemplo, IL-2 o IL-12. Los métodos de vacunación para el tratamiento o prevención de una infección en un mamífero comprenden el uso de un vector de vacuna de la invención que será administrado mediante cualquier vía convencional, particularmente a una superficie mucosa (por ejemplo, ocular, intranasal, oral, tracto gástrico, pulmonar, intestinal, rectal, vaginal, o urinario) o vía una ruta parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenoso, o intraperitoneal) . Las vías preferidas dependen de la elección del vector de vacuna. El tratamiento puede llevar a cabo en una sola dosis o se puede repetir a intervalos. La dosificación adecuada depende de diversos parámetros que se entienden por los expertos, tales como por ejemplo, el vector de vacuna mismo, la vía de administración o la condición del mamífero que será vacunado (peso, edad y lo semej ante ) . Los vectores de vacuna vivos disponibles en la técnica incluyen vectores virales tales como por ejemplo, adenovirus, poxvirus y alfavirus, así como también vectores bacterianos, por ejemplo, Shi gel l a , Salmonella , Vibri o chol era e , La ctoba cil l us , Bacille bilipe de Calmette-Guérin (BCG), y Strept o co ccus . Un ejemplo de un vector de adenovirus, así como también un método para construir un vector de adenovirus capaz de expresar una molécula de ADN de la invención, se describen en la patente de los Estados Unidos No. 4,920,209. Los vectores de Poxvirus incluyen vaccinia y el virus de varicela de canarios, descritos en patente de los Estados Unidos No. 4,722,848 y la patente de los Estados Unidos No. 5,364,773, respectivamente. Para una descripción de un vector del virus de vaccinia (varicela de canarios) véase Taylor et al, (ref 13) . Los vectores de varicela de canarios han limitado o no la replicación en células mamíferas. En general, la dosificación del vector viral de la vacuna, para uso terapéutico o profiláctico, puede estar entre aproximadamente lxlO4 y lxlO11, ventajosamente entre aproximadamente lxlO7 y IxlO10, de preferencia entre aproximadamente lxlO7 y lxlO9 unidades formadoras de placas por kilogramo. De preferencia, los vectores virales se administran parenteralmente; por ejemplo, en 3 dosis, 4 semanas separadamente. Se prefiere evitar la adición de un adyuvante químico a una composición que contiene un vector viral de la invención y con esto reducir al mínimo la respuesta inmunitaria al vector viral mismo. Los vectores de alfavirus pueden incluir vectores del virus Simliki Forest (ref 16), vectores del virus Sindbis (ref 17) o vectores del virus de Encefalitis Equina venezolana (ref 18) . Se pueden utilizar eficazmente ARN simple o ADN del plásmido para la inmunización así como también partículas recombinantes que puedan contener la replicación de alfavirus defectuosos . Se conocen las cepas mutantes de Vibri o chol era e no toxicogénicas que son útiles como una vacuna oral viva. La patente de los Estados Unidos No. 4,882,278, describe las cepas que tienen una cantidad sustancial de la secuencia codificante de cada uno de los dos alelos ctxA suprimidos de tal forma que se produzca la toxina de chol era e no funcional. Una dosis de vacuna eficaz de una cepa de Vibri o chol era e capaz de expresar un polipéptido o derivado polipeptídico codificado por una molécula de ADN de la invención contiene entre aproximadamente IxlO5 y IxlO9, de preferencia entre aproximadamente lxlO6 y lxlO8, las bacterias viables en un volumen adecuado para la vía de administración seleccionada. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vías mucosas; de mayor preferencia, estos vectores se administran intranasal u oralmente. Las ceptas de Sa lmon el l a typhim uri u , diseñadas por ingeniería genética para la expresión recombinante de antígenos heterólogos o no, y su utilización como vacunas orales se describen en la patente de los Estados Unidos 5,851,519 otorgada el 22 de diciembre de 1998. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vías mucosas; de mayor preferencia, estos vectores se administran intranasal u oralmente. Otras cepas bacterianas atenuadas utilizadas como los vectores de vacuna en el contexto de la presente invención se describen en la patente de los Estados Unidos 5,643,771 otorgada el 1 de julio de 1997. En vectores bacterianos, el polinucleótido de la invención se inserta en el genoma bacteriano o permanece en un estado libre como parte de un plásmido. Los vectores bacterianos se pueden utilizar para expresar el antígeno de la vacuna contra Chl amydi a o suministrar a la célula hospedera un vector de expresión tal como por ejemplo, el ADN del plásmido que se expresa posteriormente en la célula hospedera y produce una respuesta inmunitaria al antígeno de Chl amydi a . La composición que comprende un vector bacteriano de vacuna de la presente invención puede contener un adyuvante adicional. Se conocen por aquellos con experiencia en la técnica diversos adyuvantes. Los adyuvantes preferidos incluyen, de manera enunciativa, sales de aluminio (alum), tales como por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, formulaciones de emulsión solubles en aceite, adyuvantes de saponina tales como por ejemplo, ISCOMs, citoquinas, tales como por ejemplo, interleuquinas , interferones, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral. Las vacunas o composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir para prevenir una enfermedad) o terapéuticas (es decir para tratar una enfermedad después de la infección) . Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz del antígeno o fragmento inmunogénico del antígeno. Por cantidad inmunológicamente eficaz se debe entender que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea como una sola dosis o como parte de una serie de dosis, es eficaz para prevención o tratamiento. El término cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar, o prevenir una enfermedad o condición, o para exhibir un efecto terapéutico perceptible o un efecto preventivo. Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz será de 1 µg/kg a 100 µg/kg o 10 µg/kg a 50 µg/kg. Las composiciones y vacunas inmunogénicas se pueden administrar parenteralmente, mediante inyección subcutánea, inyección intradérmica o intramuscularmente. Alternativamente, las composiciones inmunogénicas formuladas de acuerdo con la presente invención, se pueden formular y suministrar de forma que evoquen una respuesta inmunitaria en las superficies mucosas. De esta forma, la composición inmunogénica se puede administrar a las superficies mucosas mediante, por ejemplo, las vías nasal u oral (intragástricas) . Alternativamente, pueden ser convenientes otros modos de administración incluyendo supositorios y formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores pueden incluir, por ejemplo, polialquilen glicoles o tríglicéridos . Estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan los ingredientes inmunogénicos activos en la variación de aproximadamente 10%, de preferencia entre aproximadamente 1 y 2%. Las formulaciones orales pueden incluir los portadores normalmente empleados, tales como por ejemplo, grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación sostenida y pueden contener entre aproximadamente 1 y 95% de los ingredientes activos, de preferencia entre aproximadamente 20 y 75%. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención proporciona (i) una composición de materia que comprende un polinucleótido de la invención, junto con un diluyente o portador; (ii) una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un polinucleótido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmunitaria contra Chl amydi a en un mamífero mediante la administración de una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polinucleótido de la invención para producir una respuesta inmunitaria protectora contra Chl amydi a ; y particularmente, (iv) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a (por ejemplo, C. tra choma ti s , C . psi t ta ci , C . pneumonia e o C. Pe corum ) , mediante la administración de una cantidad profiláctica o terapéutica de un polinucleótido de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, el cuarto aspecto de la invención abarca el uso de un polinucleótido de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a . Un uso preferido incluye el uso de una molécula de ADN colocada bajo las condiciones para la expresión en una célula mamífera, en especial en un plásmido que sea incapaz de replicarse en células mamíferas y para integrarse prácticamente en un genoma mamífero. El uso de los polinucleótidos de la invención incluye su administración a un mamífero como una vacuna, para fines terapéuticos o profilácticos. Estos polinucleótidos se utilizan en la forma de ADN como parte de un plásmido que sea incapaz de replicarse en una célula mamífera e incapaz de integrarse en el genoma mamífero. Típicamente, esta molécula de ADN se coloca bajo el control de un promotor adecuado para la expresión en una célula mamífera. El promotor funciona ya sea ubicuamente o en un tejido-específico. Los ejemplos de promotores no específicos de tejido incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV) anterior (descrito en la patente de los Estados Unidos No. 4,168,062) y el promotor del virus de sarcoma de Rous (descrito en Norton & Coffin, Molec. Cell Biol. (1985) 5:28 1). Un ejemplo de un promotor tejido-específico es el promotor desmin que dirige la expresión en células musculares (Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403) . El uso de promotores es bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica. Los vectores útiles se describen en muchas publicaciones, específicamente la WO 94/21797. Los polinucleótidos de la invención que se utilizan como vacunas codifican ya sea para un precursor o para una forma madura del polipéptido correspondiente. En la forma de precursor, el péptido de señal puede ser ya sea homólogo o heterólogo. En el último caso, se puede utilizar una secuencia líder eucariota. En el sentido en que se utiliza en la presente, una composición de la invención contiene uno o varios polinucleótidos opcionalmente con al menos un polinucleótido adicional que codifica para otro antígeno Chl amydi a , o un fragmento, derivado, mutante, o análogo del mismo. La composición también puede contener un polinucleótido adicional que codifica para una citoquina, tal como por ejemplo, interleuquina-2 (IL-2) o interleuquina-12 (IL-12) de tal forma que se mejore la respuesta inmunitaria. Estos polinucleótidos adicionales se colocan bajo el control adecuado para la expresión. Ventajosamente, las moléculas de ADN de la invención y/o las moléculas de ADN adicionales que se incluirán en la misma composición, están presentes en el mismo plásmido . Las técnicas estándar de biología molecular para preparar y purificar polinucleótidos se utilizan en la preparación de terapéuticos con los polinucleótidos de la invención. Para utilizarse como una vacuna, un polinucleótido de la invención se formula de acuerdo con diversos métodos señalados más adelante . Un método utiliza el polinucleótido en forma simple, libre de cualquier vehículo para suministro. Este polinucleótido simplemente se diluye en una solución fisiológicamente aceptable tal como por ejemplo, solución salina estéril o solución salina tampón estéril, con o sin un portador. Cuando está presente, el portador de preferencia es isotónico, hipotónico, o débilmente hipertónico, y tiene una resistencia iónica relativamente baja, tal como se proporciona por una solución de sacarosa, por ejemplo, una solución que contiene sacarosa al 20%. Un método alternativo utiliza el polinucleótido en asociación con agentes que ayuden en la captación celular. Los ejemplos de estos agentes son (i) productos químicos que modifiquen la permeabilidad celular, tales como por ejemplo, bupivacaína (véase, por ejemplo, la WO 94/16737), (ii) liposomas para encapsulación de polinucleótidos, o (iii) lípidos catiónicos o sílice, oro, o micropartículas de tungsteno que se asocian con los polinucleótidos . Los liposomas aniónicos y neutros son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), para una descripción detallada de los métodos para la elaboración de liposomas) y son útiles para suministrar una gran variedad de productos, incluyendo los polinucleótidos. Los lípidos catiónicos también se conocen en la técnica y comúnmente se utilizan para suministro de genes. Estos lípidos incluyen LipofectinMR también conocido como DOTMA (cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamonio) , DOTAP (1,2-bis (oleiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) , DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio ) , DOGS ( dioctadecilamidologlicil espermina) y derivados de colesterol tales como por ejemplo, DC-Chol (3 beta- (N- (N~N' -dimetil aminometan) -carbamoil ) colesterol) . Una descripción de estos lípidos catiónicos se puede encontrar en la EP 187,702, la WO 90/11092, la patente de los Estados Unidos No. 5,283,185, la WO 91/1 5501, la W095/26356, y la patente de los Estados Unidos No. 5,527,928. Los lípidos catiónicos para suministro de genes de preferencia se utilizan en asociación con un lípido neutro tal como por ejemplo, DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina), como se describe en la WO 90/11092 como un ejemplo. La formulación que contiene liposomas catiónicos puede contener opcionalmente otros compuestos que faciliten la transfección. Para el suministro de genes se utilizan micropartículas de oro o tungsteno, como se describe en la WO 91/00359, la WO 93/1 7706, y en Tang et al. (ref 19) . El polinucleótido recubierto con micropartículas se inyecta vía rutas intradérmicas o intraepidérmicas , utilizando un dispositivo para inyección sin aguja ("pistola de genes"), tal como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 4,945,050, la patente de los Estados Unidos No. 5,015,580, y la WO 94/24263. La cantidad de ADN que se utilizará en un recipiente de la vacuna depende, por ejemplo, de la resistencia del promotor utilizado en la construcción del ADN, la inmunogenicidad del producto génico expresado, la condición del mamífero destinado para la administración (por ejemplo, el peso, edad, y salud general del mamífero), el modo de administración, y el tipo de formulación. En general, una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz está entre aproximadamente 1 µg y 1 mg, de preferencia, entre aproximadamente 10 µg y 800 µg y, de mayor preferencia, entre aproximadamente 25 µg y 250 µg, se puede administrar a humanos adultos. La administración se puede alcanzar en una sola dosis o se puede repetir a intervalos. La vía de administración es cualquier ruta convencional utilizada en el campo de la vacunación. Como guía general, un polinucleótido de la invención se administra vía una superficie mucosa, por ejemplo, una superficie ocular, intranasal, del tracto pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal, y urinaria; o vía una ruta parenteral, por ejemplo, mediante una ruta intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intraepidérmica , o intramuscular. La elección de la vía de administración depende de la formulación que se seleccione. Un polinucleótido formulado en asociación con bupivacaína se administra ventajosamente en el interior de los músculos.

Cuando se utiliza un liposoma neutro o aniónico o un lípido catiónico, tal como por ejemplo, DOTMA o DC-Chol, la formulación se puede inyectar ventajosamente vía las rutas intravenosa, intranasal ( aerosolización) , intramuscular, intradérmica, e vías subcutánea. Un polinucleótido en una forma simple se puede administrar ventajosamente vía la ruta intramuscular, intradérmica, o subcutánea. Aunque no se requiere completamente, esta composición también puede contener un adyuvante. En ese caso, se prefiere un adyuvante sistémico que no requiera administración concomitante para exhibir un efecto adyuvante tal como por ejemplo, QS21, que se describe en la patente de los Estados unidos No. 5,057,546. La información de secuencias proporcionada en la presente solicitud permite el diseño de soluciones de ensayo y cebadores de nucleótidos específicos que se utilizan para fines de diagnóstico. Por consiguiente, un quinto aspecto de la invención proporciona una solución de ensayo o cebador de nucleótidos que tiene una secuencia encontrada o derivada por la degeneración del código genético a partir de una secuencia mostrada en la SEQ ID No: 1 ó 3.

El término "solución de ensayo", en el sentido en que se utiliza en la presente solicitud se refiere a moléculas de ADN (de preferencia de una sola cadena) o de ARN (o modificaciones o combinaciones del mismo) que se híbrida bajo condiciones rigurosas, como se definió anteriormente, a moléculas de ácido nucleico que tienen la SEQ ID No: l o a secuencias homologas con la SEQ ID No: 1 ó 3, o a una secuencia complementaria o anti-sentido. En general, las soluciones de ensayo son significativamente más cortas que las secuencias de longitud total. Estas soluciones de ensayo contienen entre aproximadamente 5 y 100, de preferencia entre aproximadamente 10 y 80, nucleótidos. En particular, las soluciones de ensayo tienen secuencias que son al menos 75%, de preferencia al menos 85%, de mayor preferencia 95% homologas con una porción de la SEQ ID No: 1 o que sean complementarias a estas secuencias . Las soluciones de ensayo pueden contener bases modificadas tales como por ejemplo, inosina, metil-5-desoxicitidina , desoxiuridina, dimetilamino-5 -desoxiuridina , o diamino-2 , 6-purina . Los residuos de azúcar o fosfato también se pueden modificar o se pueden sustituir. Por ejemplo, un residuo de desoxirribosa se puede reemplazar por una poliamida y los residuos de fosfato se pueden reemplazar por grupos éster tales como por ejemplo, difosfato, alquilo, arilfosfonato y esteres de fosforotioato . Además, el grupo 2' -hidróxilo en los ribonucleótidos se puede modificar al incluir estos grupos como grupos alquilo. Las soluciones de ensayo de la invención se utilizan en pruebas de diagnóstico, como soluciones de ensayo de captura o exposición. Estas soluciones de ensayo para captura se inmovilizan convencionalmente en un soporte sólido, directa o indirectamente, por medios covalentes o mediante adsorción pasiva. Una solución de ensayo para exposición se marca mediante un marcador de exposición seleccionado de: isótopos radiactivos, enzimas tales como por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, y enzimas capaces de hidrolizar un substrato cromogénico, fluorogénico, o luminiscente, los compuestos que son cromogénicos , fluorogénicos, o luminiscentes, análogos con base de nucleótido, y biotina . Las soluciones de ensayo de la invención se utilizan en cualquier técnica de hibridación convencional, tal como por ejemplo, transferencia puntutal, transferencia Southern (Southern J. Mol.

Biol. (1975) 98:503), transferencia northern (idéntica a la transferencia Southern con excepción de que se utiliza como blanco ARN), o la técnica del sandwich (Dunn et al., Cell (1977) 12:23) . La última técnica implica el uso de una solución de ensayo para captura específica y/o una solución de ensayo para detección específica con las secuencias de nucleótidos que difieren al menos parcialmente entre sí . Un cebador es una solución de ensayo comúnmente entre aproximadamente 10 y 40 nucleótidos que se utiliza para iniciar una polimerización enzimática de ADN en un proceso de amplificación (por ejemplo, PCR), en un proceso de alargamiento, o en un método de transcripción inversa. Los cebadores utilizados en los métodos para diagnóstico que implican PCR se marcan mediante métodos conocidos en la técnica . Como se describe en la presente, la invención también abarca (i) un reactivo que comprende una solución de ensayo de la invención para detectar y/o identificar la presencia de Chl amydi a en un material biológico; (ii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chl amydi a en un material biológico en el cual (a) se recupera o se deriva una muestra del material biológico, (b) se extrae del material y se desnaturaliza ADN o ARN, y (c) se expone a una solución de ensayo de la invención, por ejemplo, una solución de ensayo para captura, detección o ambas, bajo condiciones rigurosas de hibridación, esta hibridación se detecta; y (iii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico en el cual (a) se recupera o se deriva una muestra del material biológico, (b) el ADN se extrae del mismo, (c) el ADN extraído se ceba con al menos uno, y de preferencia dos, cebadores de la invención y se amplifica mediante reacción en cadena de polimerasa, y (d) se produce el fragmento de ADN amplificado. Es evidente que la exposición de las secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7, sus homólogos y secuencias parciales permiten sus secuencias de aminoácidos correspondientes. Por consiguiente, un sexto aspecto de la invención incorpora un polipéptido o derivado polipeptídico prácticamente purificado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de la invención . Un "polipéptido prácticamente purificado", en el sentido en que se utiliza en la presente, se define como un polipéptido que está separado del entorno en el cual se presenta naturalmente y/o que está libre de la mayoría de los polipéptidos que están presentes en el entorno en el se sintetizó. Por ejemplo, un polipéptido prácticamente purificado está libre de polipéptidos citoplásmicos. Aquellos con experiencia en la técnica podrían entender fácilmente que los polipéptidos de la invención se pueden purificar a partir de una fuente natural, es decir, una cepa de Chl amydia , o se pueden producir por medios recombinantes. Consistente con el sexto aspecto de la invención se encuentran los polipéptidos, homólogos o fragmentos que se modifican o tratan para reforzar su inmunogenicidad en un animal destinado, en el cual, el polipéptido, homólogo o fragmentos se destinan para conferir protección contra Chlamydi a . Estas modificaciones o tratamientos incluyen: sustituciones de aminoácidos con un derivado de aminoácido tal como por ejemplo, 3-metilhistidina, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina , etc., modificaciones o supresiones que se llevan a cabo después de la preparación del polipéptido, homólogo o fragmento, tales como por ejemplo, la modificación de los grupos laterales amino libre, carboxilo o hidróxilo de los aminoácidos . La identificación de polipéptidos homólogos o derivados del polipéptido codificados por los polinucleótidos de la invención que tienen antigenicidad específica se alcanza mediante selección por reactividad cruzada con un antisuero reforzado contra el polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7. El procedimiento es como sigue: un antisuero monoespecífico hiperinmune se refuerza contra un polipéptido purificado de referencia, un polipéptido de fusión (por ejemplo, un producto para expresión de MBP, GST, o sistemas de marca His, la descripción e instrucciones de uso del mismo están contenidas en los manuales del producto Invitrogen para pcDNA3.1 /Myc-His (+ ) A, B, y C y para la Purificación Proteínica del Sistema XpressMR) , o un péptido sintético que se pronostica será antigénico. Cuando un antisuero se refuerza contra un polipéptido de fusión, se emplean dos sistemas diferentes de fusión. La antigenicidad específica se puede determinar de acuerdo con diversos métodos, incluyendo transferencia Western, transferencia puntual, y ELISA, como se describirá más adelante.

En un ensayo de transferencia Western, el producto que será seleccionado, ya sea como una preparación purificada o un extracto total de E . coli , se somete a electroforesis SDS-page como se describe por Laemmli (Nature (1970) 227:680). Después de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa, el material se incuba adicionalmente con el antisuero monoespecífico hiperinmune diluido en la variación de diluciones entre aproximadamente 1:5 y 1:5000, de preferencia entre aproximadamente 1:100 y 1:500. La antigenicidad específica se muestra una vez que una banda correspondiente al producto exhiba reactividad en cualquiera de las diluciones en la variación anterior. En un ensayo ELISA, el producto que será seleccionado de preferencia se utiliza como el antígeno de recubrimiento. Se prefiere una preparación purificada, aunque también se puede utilizar un extracto de células enteras. En resumen, aproximadamente 100 µl de una preparación a aproximadamente 10 µl de proteína/ml se distribuyen en las cavidades de una placa para ELISA de policarbonato de 96 cavidades. La placa se incubó durante 2 horas a 37°C, luego durante la noche a 4 ° C . La placa se lavó con solución salina tampón con fosfato (PBS) que contuvo Tween 20 al 0.05% (tampón PBS/Tween) . Las cavidades se saturaron con 250 µl de PBS que contuvo albúmina de suero bovino (BSA) al 1% para prevenir la aglutinación de anticuerpos no específicos. Después de 1 hora de incubación a 37°C, la placa se lavó con el tampón PBS/Tween. El antisuero se diluyó consecutivamente en el tampón PBS/Tween que contuvo BSA al 0.5%. Se agregaron por cavidad 100 µl de las diluciones. La placa se incubó durante 90 minutos a 37°C, se lavó y se evaluó de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo, se agregó a las cavidades un conjugado de peroxidasa de cabra anti-conejo cuando aparecieron en los conejos los anticuerpos específicos. La incubación se llevó a cabo durante 90 minutos a 37°C y la placa se lavó. La reacción se desarrolló con el substrato adecuado y la reacción se midió mediante colorimetría (absorbancia medida espectrofotométricamente ) . Bajo las condiciones experimentales anteriores, se muestra una reacción positiva por los valores O.D. mayores que un suero control no inmune. En un ensayo de transferencia puntual, se prefiere un producto purificado, aunque también se puede utilizar un extracto de células enteras. En resumen, una solución del producto a aproximadamente 100 µg/ml se diluye consecutivamente dos veces en Tris-HCl 50 mM (pH 7.5). Se aplican 100 µl de cada dilución a una membrana de nitrocelulosa 0.45 µm, ajustada en un aparato para transferencia puntual de 96 cavidades (Biorad) . El tampón se elimina al aplicar vacío al sistema. Las cavidades se lavan mediante la adición de Tris-HCl 50 mM (pH 7.5) y la membrana se secó con aire. La membrana se satura en tampón de bloqueo (Tris-HCl 50 mM (pH 7.5) NaCl 0.15 M, 10 g/L de leche descremada) y se incubó con una dilución de antisuero entre aproximadamente 1:50 y 1:5000, de preferencia aproximadamente 1:500. La reacción se reveló de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo, se agregó a las cavidades un conjugado de peroxidasa de cabra anti-conejo cuando se utilizan anticuerpos de conejo. La incubación se lleva a cabo en 90 minutos a 37°C de minutos y la transferencia se lavó. La reacción se desarrolló con el substrato adecuado y se detuvo. La reacción se midió visualmente mediante la aparición de una mancha de color, por ejemplo, mediante colorimetría. Bajo las condiciones experimentales anteriores, se muestra una reacción positiva una vez que una mancha de color se asocia con una dilución de al menos aproximadamente 1:5, de preferencia de al menos aproximadamente 1:500. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polipéptido o derivado de la invención se puede evaluar como se describirá más adelante. ün séptimo aspecto de la invención proporciona (i) una composición de materia que comprende un polipéptido de la invención junto con un diluyente o portador; específicamente (ii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un polipéptido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmunitaria contra Chl amydi a en un mamífero, al administrar al mamífero una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido de la invención para producir una respuesta inmunitaria protectora contra Chl amydi a ; y particularmente, (iv) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydia (por ejemplo, C . tra choma ti s , C . psi t ta ci , C. pneumonia e . o C . pecorum ) , al administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, el séptimo aspecto de la invención abarca el uso de un polipéptido de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección por Chl amydi a . En el sentido en que se utiliza en la presente, las composiciones inmunogénicas de la invención se administran por rutas convencionales conocidas en el campo de la vacunación, en particular a una superficie mucosa (por ejemplo, el tracto ocular, intranasal, pulmonar, oral, gástrico, intestinal, rectal, vaginal, o urinario) o vía la ruta parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenoso, o intraperitoneal) . La elección de la ruta de administración depende en diversos parámetros, tales como por ejemplo, el adyuvante asociado con el polipéptido. Si se utiliza un adyuvante para mucosas, se prefiere la ruta intranasal u oral. Si se utiliza una formulación de lípidos o un compuesto de aluminio, se prefiere la vía parenteral, aunque se prefiere en mayor medida la ruta subcutánea o intramuscular. La elección también depende de la naturaleza del agente para vacuna. Por ejemplo, un polipéptido de la invención fusionado a CTB o LTB se administra mejor a una superficie mucosa. En el sentido en que se utiliza en la presente, la composición de la invención contiene uno o varios polipéptidos o derivados de la invención. La composición contiene opcionalmente al menos un antígeno adicional de Chl amydi a , o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante, o derivado de la misma. Para utilizarse en una composición de la invención, se formula un polipéptido o derivado del mismo en el interior o con liposomas, de preferencia liposomas neutros o aniónicos, microesferas, ISCOMS, partículas similares a virus (VLPs, por sus siglas en I inglés) o fantasmas bacterianos (EP 1158 966B1) para facilitar el suministro y/o mejorar la respuesta inmunitaria. Estos compuestos están disponibles fácilmente para alguien con experiencia en la técnica . El tratamiento se alcanza en una sola dosis o se repite según sea necesario por intervalos, como se puede determinar fácilmente por alguien con experiencia en la técnica. Por ejemplo, una dosis de cebado está seguida por tres dosis de refuerzo a intervalos semanales o mensuales. Una dosis adecuada depende de diversos parámetros incluyendo el recipiente (por ejemplo, adulto o infante), el antígeno de la vacuna particular, la vía y frecuencia de administración, la presencia/ausencia o tipo de adyuvante, y el efecto deseado (por ejemplo, la protección y/o tratamiento), como se puede determinar por alguien con experiencia en la técnica. En general, un antígeno de vacuna de la invención se administra por una ruta mucosa en una cantidad entre aproximadamente 10 µg y 500 µg, de preferencia entre aproximadamente 1 µg y 200 µg.- Para la ruta de administración parenteral, la dosis comúnmente no excede aproximadamente 1 mg, de preferencia aproximadamente 100 µg. Cuando se utilizan como agentes de vacuna, los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar secuencialmente como parte de un proceso de inmunización de de pasos múltiples. Por ejemplo, un mamífero se ceba inicialmente con un vector de vacuna de la invención tal como por ejemplo, un virus de varicela, por ejemplo, vía la ruta parenteral, y luego se refuerza dos veces con el polipéptido codificado por el vector de la vacuna, por ejemplo, vía la ruta mucosa. En otro ejemplo, los liposomas asociados con un polipéptido o derivado de la invención también se utilizan para cebado, con refuerzos que serán llevados a cabo mucosalmente utilizando un polipéptido soluble o derivado de la invención en la combinación con un adyuvante para mucosas (por ejemplo, LT) .

Un derivado polipeptídico de la invención también se utiliza de acuerdo con el séptimo aspecto como un reactivo para diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos anti- Chlamydi a , por ejemplo, en una muestra sanguínea. Estos polipéptidos tienen entre aproximadamente 5 y 80, de preferencia entre aproximadamente 10 y 50 aminoácidos de longitud. Los mismos están marcados o sin marcar, dependiendo del método de diagnóstico. Los métodos de diagnóstico que implican este reactivo se describen más adelante. En el momento de la expresión de una molécula de ADN de la invención, se produce y se purifica un polipéptido o derivado polipeptídico utilizando técnicas de laboratorio conocidas. Como se describió anteriormente, el polipéptido o derivado polipeptídico se puede producirse como una proteína de fusión que contenga una cola fusionada que facilite la purificación. El producto de fusión se utiliza para inmunizar a un mamífero pequeño, por ejemplo, un ratón o un conejo, para reforzar a los anticuerpos contra el polipéptido o derivado polipeptídico (anticuerpos monoespecífieos ) . Por consiguiente, un octavo aspecto de la invención proporciona un anticuerpo monoespecífico que se une a un polipéptido o derivado polipeptídico de la invención . Por "anticuerpo no específico" se debe entender un anticuerpo que sea capaz de reaccionar con un polipéptido de Chl amydia único que se presentan naturalmente. Un anticuerpo de la invención es ya sea policlonal o monoclonal. Los anticuerpos monoespecífieos pueden ser recombinantes por ejemplo, quiméricos (por ejemplo, constituidos por una región variable de origen murino asociada con una región constante humana), humanizados (una estructura constante de inmunoglobulina humana junto con una región hipervariable de un animal, por ejemplo, de origen murino), y/o una sola cadena. Los anticuerpos tanto policlonales como monoespecífieos también pueden estar en la forma de fragmentos de inmunoglobulina, por ejemplo, fragmentos F(ab)2 o Fab. Los anticuerpos de la invención son de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG o IgA, y los anticuerpos policlonales son de un solo isotipo o una mezcla de isotipos. Los anticuerpos contra los polipéptidos, homólogos o fragmentos de la presente invención se generan mediante inmunización de un mamífero con una composición que comprende el polipéptido, homólogo o fragmento. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los métodos para producir anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos de la invención, que se refuerzan para un polipéptido o derivado polipeptídico de la invención, se producen e identifican utilizando análisis inmunológicos estándar, por ejemplo, un análisis de transferencia Western, un análisis de transferencia puntual, o ELISA. Los anticuerpos se utilizan en métodos de diagnóstico para detectar la presencia de un antígeno de Chl amydi a en una muestra, tal como por ejemplo, una muestra biológica. Los anticuerpos también se utilizan en cromatografía por afinidad para purificar un polipéptido o derivado polipeptídico de la invención. Como se analizará adicionalmente más adelante, estos anticuerpos se pueden utilizar en métodos de inmunización pasiva profiláctica y terapéutica. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención proporciona (i) un reactivo para detectar la presencia de Chl amydi a en una muestra biológica que contiene un anticuerpo, polipéptido, o derivado polipeptídico de la invención; y (ii) un método de diagnóstico para detectar la presencia de Ch l amydi a en una muestra biológica, al poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, un polipéptido, o un derivado polipeptídico de la invención, de modo que se forme este complejo inmunitario, y al detectar este complejo para indicar la presencia de Chl amydi a en la muestra o el organismo de del cual se deriva la muestra . Aquellos con experiencia en la técnica entenderán fácilmente que el complejo inmunitario se forma entre un componente de la muestra y el anticuerpo, polipéptido, o derivado polipeptídico, donde quiera que se utilice, y que cualquier material disgregado se elimina antes de detectar el complejo. Se debe entender que un reactivo polipeptídico es útil para detectar la presencia de anticuerpos an t i -Chl amydí a en una muestra, por ejemplo, una muestra sanguínea, mientras que un anticuerpo de la invención se utiliza para seleccionar una muestra, como un extracto gástrico o biopsia, para la presencia de polipéptidos de Chl amydi a . Para aplicaciones de diagnóstico, el reactivo (es decir, el anticuerpo, polipéptido, o derivado polipeptídico de la invención) está ya sea en un estado libre o inmovilizado en un soporte sólido, como por ejemplo, un tubo, una perla, o cualquier otro soporte convencional utilizado en el campo. La inmovilización se alcanza utilizando medios directos o indirectos. Los medios directos incluyen adsorción pasiva (aglutinación no covalente) o la aglutinación covalente entre el soporte y el reactivo. Por "medio indirecto" se debe entender que un compuesto antireactivo que interactúa con un reactivo se une primero al soporte sólido. Por ejemplo, si se utiliza un reactivo polipeptídico, un anticuerpo que se une al mismo puede servir como un anti-reactivo , con la condición de que se una a un epítope que no este incluido en el reconocimiento de anticuerpos en las muestras biológicas. Los medios indirectos también pueden emplear un sistema ligando-receptor, por ejemplo, cuando una molécula tal como por ejemplo, una vitamina se injerte sobre el reactivo polipeptídico y el receptor correspondiente se inmovilice en la fase sólida. Esto se ilustra por el sistema de biotina-estreptavidina . Alternativamente, se agrega químicamente al reactivo una cola peptídica o mediante ingeniería genética y el producto injertado o fusionado se inmoviliza mediante adsorción pasiva o la unión covalente de la cola peptídica .

Estos agentes de diagnóstico se pueden incluir en un equipo que también comprende las instrucciones de uso. El reactivo se marca con un medio de detección que permite la detección del reactivo cuando está unido a su blanco. El medio de detección puede ser un agente fluorescente tal como por ejemplo, isocianato de fluoresceína o isotiocianato de fluoresceína, o una enzima tal como por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o luciferasa o fosfatasa alcalina, o un elemento radiactivo tal como por ejemplo, 125I o 51Cr. Por consiguiente, otro aspecto de la invención proporciona un proceso para purificación, a partir de una muestra biológica, un polipéptido o derivado polipeptídico de la invención que implica llevar a cabo una cromatografía de afinidad con base en anticuerpos con la muestra biológica, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico de la invención . Para utilizarse en un proceso de purificación de la invención, el anticuerpo es ya sea policlonal o monoespecífico, y de preferencia es del tipo de IgG. Los IgG purificados se preparan a partir de un antisuero utilizando métodos estándar. Los soportes de cromatografía convencionales, así como también los métodos estándar anticuerpos injertados, se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, D., Lañe, E. Harlow, Eds. (1988) y se señalan más adelante. En resumen, una muestra biológica, tal como por ejemplo, un extracto de C. tra choma ti s de preferencia en una solución tampón, se aplica a un material sometido a cromatografía, de preferencia equilibrado con el tampón utilizado para diluir la muestra biológica de tal forma que el polipéptido o derivado polipeptídico de la invención (es decir, el antígeno) se permita que se adsorba sobre el material. El material para cromatografía, tal como por ejemplo, un gel o una resina acoplados a un anticuerpo de la invención, se encuentra ya sea en una forma de lote o una columna. Los componentes disgregados se eliminan mediante lavado y el antígeno luego se eluye con un tampón para elución adecuado, tal como por ejemplo, un tampón de glicina o un tampón que contenga el agente quimiotrópico , por ejemplo, guanidina HCl, o alta concentración de sal (por ejemplo, MgCl2 3M) . Las fracciones eluidas se recuperan y se detecta la presencia del antígeno, por ejemplo, al medir la absorbancia a 280nm.

Un aspecto adicional de la invención proporciona (i) una composición de materia que comprende un anticuerpo monoespecífico de la invención, junto con un diluyente o portador; (ii) una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo monoespecífico de la invención, y (iii) un método para tratar o prevenir un infección por Chl amydi a (por ejemplo, C . T ra ch oma ti s , C . psi t ta ci , C. pn e umoni a e o C . pe corum ) , al administrar una cantidad terapéutica o profiláctica de un anticuerpo monoespecífico de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, el décimo primer aspecto de la invención abarca el uso de un anticuerpo monoespecífico de la invención en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por Chl amydi a . El anticuerpo monoespecífico es ya sea policlonal o monoclonal, de preferencia del isotipo IgA (predominantemente) . En la inmunización pasiva, el anticuerpo se administra a una superficie mucosa de un mamífero, por ejemplo, la mucosa gástrica, por ejemplo, oral o intragástricamente, ventajosamente, en presencia de un tampón de bicarbonato. Alternativamente, se lleva a cabo la administración sistémica, que no requiere un tampón de bicarbonato. Un anticuerpo monoespecífico de la invención se administra como componente activo único o como una mezcla con al menos un anticuerpo monoespecífico que sea específico para un diferente polipéptido de Chl amydi a . La cantidad del anticuerpo y el régimen particular utilizado se determina fácilmente por alguien con experiencia en la técnica. Por ejemplo, la administración diaria entre aproximadamente 100 a 1,000 µg de los anticuerpos durante una semana. La eficacia terapéutica o profiláctica se evalúa utilizando los métodos estándar en la técnica, por ejemplo, al medir la inducción de una respuesta inmunitaria en las mucosas o la inducción de protección y/o inmunidad terapéutica, utilizando, por ejemplo, un modelo de ratón con Chl amydi a expuesto en la presente. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán fácilmente que la cepa de Chl amydi a utilizada en el modelo se puede reemplazar con otra cepa o serovar de Chl amydi a . Por ejemplo, la eficacia de las moléculas de ADN y los polipéptidos provenientes de C. tra choma ti s de preferencia se evalúa en un modelo de ratón utilizando la cepa de C. tra choma t i s . La protección se determina al comparar el grado de infección por Chl amydi a con el de un grupo control. La protección se muestra cuando la infección se reduce medíante la comparación con el grupo control. Se puede emplear análisis estadístico para demostrar las diferencias del grupo control. Esta evaluación se realiza para polinucleótidos, vectores de vacuna, polipéptidos y derivados, así como también para los anticuerpos de la invención. Los adyuvantes útiles en cualquiera de las composiciones de vacuna descritas anteriormente es como sigue . Los adyuvantes para administración parenteral incluyen compuestos de aluminio, tales como por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, e hidroxi fosfato de aluminio. El antígeno se precipita con, o se adsorbe sobre, el compuesto de aluminio de acuerdo con protocolos estándar. En la administración parenteral se utilizan otros adyuvantes, tales como por ejemplo, RIBI (InmunoChem, Hamilton, MT) . Los adyuvantes para la administración en mucosas incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo, la toxina del cólera (CT, por sus siglas en inglés), la toxina lábil térmica de E . col i (LT), la toxina A de Clos tridi um diffi cile y la toxina de pertusis (PT), o las combinaciones, subunidads, toxoides, o mutantes de los mismos tales como por ejemplo, una preparación purificada de una subunidad B de la toxina de cólera (CTB, por sus siglas en inglés) sin tratamiento previo. También son adecuados los fragmentos, homólogos, derivados, y fusiones a cualquiera de estas toxinas, con la condición de que conserven la actividad adyuvante. De preferencia, se utiliza un mutante que tenga toxicidad reducida. En la administración a mucosas también se pueden utilizar otros adyuvantes, tales como por ejemplo, un lípido A de monofosforilo bacteriano (MPLA, por sus siglas en inglés) de, por ejemplo, E . coli , Sa lmonella minneso ta , Salmon ella typhimuri um , o Shi gell a fl exn eri ; saponinas, o microesferas de glucólido poliláctido (PLGA, por sus siglas en inglés) . Los adyuvantes útiles para las administraciones en mucosas y parenterales incluyen polifosfazeno (WO 95/02415), DC-chol (3 b-(N-(N',N'-dimetil aminometan) carbamoil ) colesterol ; patente de los Estados Unidos No. 5,283,185 y WO 96/14831) y QS-21 (WO 88/09336) . Cualquier composición farmacéutica de la invención que contenga un polinucleótido, un polipéptido, un derivado polipeptídico, o un anticuerpo de la invención, se prepara de una manera convencional. En particular, se formula con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua o solución salina tal como por ejemplo solución salina tampón de fosfato. En general, un diluyente o el portador se selecciona sobre la base del modo y vía de administración, y la práctica farmacéutica estándar. Los datos presentados en la presente y descritos en detalle más adelante demuestran esa inmunización con ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico de Chl amydi a que codifica para el gen Mgp002 produce respuestas inmunitarias y produce inmunidad protectora significativa a la infección por inoculación pulmonar con C. tra choma ti s MoPn. Será claramente evidente para alguien con experiencia en la técnica, que diversas modalidades de la presente invención tienen muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, diagnóstico y tratamiento de infecciones por Chl amydi a . Un análisis no limitante adicional de estos usos se presenta más adelante.

EJEMPLOS La exposición anterior en general describe la presente invención. Se podrá obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen únicamente para fines de ilustración y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. Los cambios en la forma y sustitución de equivalentes contemplados como circunstancias pueden ser sugerencias o ser adecuados. Aunque en la presente se han empleado términos específicos, se pretende que estos términos estén en un sentido descriptivo y no para fines de limitación.

Ej emplo 1 : Este Ejemplo ilustra la preparación de un vector de plásmido para inmunización. El aislado de neumonitis de ratón de C. tra choma ti s (MoPn) se desarrolló en células HeLa 229 en Eagle MEM que contuvo suero fetal de bovino al 10% y L-glutamina 2 mM . Los MoPn EB se recolectaron y se purificaron mediante un paso de centrifugación por densidad de gradientes a 43,000g durante 60 min a 4°C. Los EB purificados se lavaron dos veces con PBS, se centifugaron a 30,000g durante 30min, se volvieron a suspender en tampón de ácido glutámico con sacarosa fosfato (SPG) y se congelaron a -70°C hasta utilizarse.

La molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Mgp002 se clonó en el plásmido de expresión eucariota pCAMycHis en trama con las marcas Myc-His presentes en el vector. Este vector se construyó a partir de pcDNA3.1 (-) Myc-His C (Invitrogen, San Diego) y el plásmido VR1012 (Vical) . Los detalles de la construcción se exponen en la publicación del PCT WO 00/55326 publicada el 21 de septiembre de 2000. En resumen, el plásmido pcDNA3.1 (-) Myc-His C (Invitrogen) se restringió con Spe I y Bam Hl para eliminar el promotor del CMV y se aisló el fragmento restante del vector. El promotor del CMV y el intron A proveniente del plásmido VR-1012 (Vical) se aislaron en un fragmento Spe I /Bam Hl . Los fragmentos se ligaron para producir el plásmido pCA/Myc-His. El gen Mgp002 de longitud total se amplificó a partir del ADN genómico de MoPn mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) con un cebador 5' (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACC ATG GGA TTA TCT CGC CTA ATT 3'-SEQ ID No: 9) que incluyó un sitio No tl (subrayado), un codón de inicio (negrita) , y la secuencia ? terminal del producto génico maduro Mgp002 de MoPn y un cebador inverso 3' (5' GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC 3' - SEQ ID No: 10) que incluye un sitio Kpn I (subrayado) . El cebador inverso es complementario para el extremo 3' del gen Mgp002, aunque no contiene un codón de paro. En cambio, se insertó un nucleótido adicional, conduciendo a una fusión del gen en-marco con las marcas Myc y His de pCAMycHis. El producto de la PCR se aisló después de la electroforesis en gel de agarosa, restringido con Kpn I y No tl y se ligaron en los sitios Kpn I y Notl del vector pCAMycHis. La mezcla de la ligación se transformó en E . col i DHlOb bajo la selección de ampicilina. Para verificar la amplificación y clonación correcta, se secuenció el ADN de la inserción total. El plásmido resultante se denominó pCACTMgp002. El producto de la PCR, tuvo la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID No: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID No: 2) que representa el gen Mgp002 de longitud total. El gen gp002 suprimido de la secuencia de señal también se amplificó a partir del ADN genómico de MoPn mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) con un cebador directo 5' ATAAGAATGCGGCCGCCACC ATGTGCGACTTCCCCCCCAGT 3' -SEQ ID No: 11 y el cebador inverso mgp002 5' GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC 3' SEQ ID 7 No:12, como se describió anteriormente. El plásmido resultante, clonado en pCAMycHis se identificó como pCACTMgp002delta . La secuencia de señal supuesta suprimida se muestra en la Figura 1 subrayada y el gen Mgp002 suprimido de la secuencia de señal tuvo la secuencia de ácido nucleico indicada para iniciar con la flecha de la Figura 1 (SEQ ID No:5) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID No: 6) . De manera similar, el gen Mgp002, proveniente de la secuencia de ácido nucleico serovar D de Chl amydi a tra choma ti s mostrada en la Fig. 2 (SEQ ID No:3) y la secuencia de la proteína deducida (SEQ ID No: 4) para el gen Mgp002 de longitud total, o el gen suprimido de la secuencia de señal mostrado en la Figura 2 en la flecha para la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No:7) y secuencia de la proteína deducida (SEQ ID No : 8 ) . Alguien con experiencia en la técnica puede apreciar que cualquier otra secuencia proveniente de cualquier otra serovar, se puede obtener utilizando técnicas similares como se señaló anteriormente.

Ejemplo 2 : Este Ejemplo muestra los resultados de los estudios de inmunización que utilizan el vector de ácido nucleico. Para investigar si las respuestas inmunitarias producidas por la inmunización con ácido nucleico fueron significativas funcionalmente, se evaluó la eficacia protectora in vi vo como se describió anteriormente (ref 20) . En resumen, ratones Balb/c hembra (de 4 a 5 semanas de edad) se adquirieron de charles River Canadá (St. Constant, Canadá), los ratones se inmunizaron intramuscular e intranasalmente con el ADN del plásmido, preparado como se describió en el Ejemplo 1, en tres ocasiones, a 0, 2 y 4 semanas véase la Fig. 3. Para cada inmunización, se inyectó un total de 200 µg de ADN en 200 µl en los dos músculos cuadríceps (100 µg de ADN/sitio de inyección) utilizando una aguja de calibre 27. Al mismo tiempo, se suministraron 50 µg de ADN en 50 µl sobre los orificios nasales de los ratones con una micropipeta. Posteriormente los ratones inhalaron la gota. Los ratones se inocularon intranasalmente con 2xl03 UFI de C. tra choma ti s MoPn EB 14 días después de la última inmunización, como se describe. En resumen, después de anestesiar con éter se suministraron 25 µl de SPG que contuvieron un inoculo de 2x 103 UFI de MoPn sobre los orificios nasales de los ratones con una micropipeta. Posteriormente, los ratones inhalaron la gota. Diariamente se midió el peso corporal durante 10 días después de la infección por inoculación como una medida de morbilidad inducida por Chl amydi a véase la Fig. 4. Los ratones inyectados con solución salina (sin tratamiento previo) o con el vector en blanco (pCAMycHis) se utilizaron como controles negativos. Después de la infección en el día 3, los ratones inmunizados con el producto génico Mgp002 o la forma truncada, perdieron significativamente menos masa corporal que el grupo control negativo (Fig 4) . En el día 10 después de la infección, los ratones se sacrificaron y sus pulmones se aislaron y se homogeneizaron asépticamente con una trituradora en tampón de SPG. Las suspensiones del tejido se centrifugaron a 500g durante 10 min a 4°C, se eliminaron el tejido grueso y los restos. Los sobrenadantes, se congelaron a -70°C hasta la prueba de cultivo de tejidos durante el desarrollo cuantitativo del organismo.

Para una medición más directa de la eficacia de la vacunación con ADN, se evaluó la capacidad para limitar el desarrollo in vi vo de Chl amydi a después de una infección pulmonar subletal. En este sistema de modelo de infección, el día 10 después de la inoculación es el tiempo de crecimiento máximo y se seleccionó para la comparación de títulos pulmonares entre los diversos grupos de ratones. Los ratones inmunizados con el ADN del producto génico Mgp002 de longitud total tuvo un título pulmonar (UFI por campo 200x) significativamente inferior (p < 0.001) que los grupos control negativos (pCAMycHis solo y los grupos de solución salina sin tratamiento previo) como se muestra en la Fig. 5. Sorprendentemente los ratones inmunizados con la forma truncada del gen Mgp002 (Fig. 5 panel B) mostraron incluso menos de las UFI que el gen de longitud total. Estos datos demuestran que la inmunización con ácido nucleico con Mgp002 e incluso la forma truncada del gen produce respuestas inmunitarias protectoras a la infección por inoculación en el pulmón con C. tra choma ti s MoPn. Estos datos también demuestran que las secuencias protectoras en el gen Mgp002 residen en la forma truncada del gen.

Ejem lo 3 : Este ejemplo ilustra la preparación de un vector de ácido nucleico para la expresión del Mgp002 recombinante en E . col i . Los procedimientos requeridos para la amplificación por la PCR, las modificaciones de ADN por endo y exonucleasas para generar los fines deseados para la clonación de ADN, ligación, y la transformación bacteriana son bien conocidos en la técnica. Las técnicas de clonación molecular estándar utilizadas existentes son bien conocidas en la técnica y se describen por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbo, New York y por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience ; 1987. El ADN genómico de Chl amydi a se preparó a partir de la cepa neumonitis de ratón de Chl amydi a tra choma t i s de (MoPn, también conocida como Chl amydi a m uri da rum ) después del paso de las bacterias en células McCoy. Para expresión, la secuencia codificante de mgp002 con su péptido de señal natural (codificado por los primeros 18 cebadoros) se amplificó a partir del ADN total recolectado de células McCoy infectadas con MoPn de C. tra ch oma ti s utilizando el cebador directo MoPn mgp002-F/+SP (5'- GAATTCGGATCCGATGGGATTATCTCGCCTA-3' ) SEQ ID No: 13, y el cebador inverso MoPn mgp002-R (5'-ATTAAGAATGCGGCCGCTTTATCACTCCACTATTCT-3 ' ) SEQ ID No: 14 y Advantage-HF2 Polymerase Mix (Clontech) . El cebador directo introdujo la secuencia que codifica para un sitio de restricción Bamñl (cursivas) . El cebador inverso introdujo el sitio de restricción No tl (cursivas) y un codón de doble paro (subrayado en la cadena complementaria) . El producto de la PCR resultante se restringió secuencialmente con Bamñ l y No tl y se insertó en el plásmido pET30b(+) , que también se había cortado con BamHI y No tl . El nuevo plásmido se designó pET30b ( + ) mgpO 02+SP . En esta construcción, mgp002+SP se expresa con un His-Tag® N-terminal, que se origina de una secuencia codificante en la dirección 5' dentro del vector pET30b( + ) . La Figura 6 ilustra una representación gráfica de los pasos de clonación descritos anteriormente. Se pueden utilizar procedimientos similares para la preparación del Mgp?02 proveniente de serovar D de Chl amydi a tra choma ti s o cualquier otra cepa serovar. La secuencia de aminoácidos tiene la misma secuencia como se ilustra en la Figura 1 (SEQ ID No:2) excepto para la adición de la marca His N terminal para facilitar la purificación. Para la expresión de la proteína Mgp002 recombinante, se utilizó un cultivo durante la noche (85 ml) de E . coli BL21 (DE3) que alberga el vector de expresión pET30b (+) mgp002+SP#l para inocular matraces que contuvieon 500 ml de caldo Luria-Bertani cada uno a 37°C hasta que se alcanzó ?595 de 0.8. La expresión de mgp002 como una proteína marcada His se indujo mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 M, y el cultivo se incubó durante unas 4h adicionales. La proteína recombinante sobre-expresada luego se analizó sobre SDS-page teñido con Coomassie-Blue y mediante inmuno-tinción con un anticuerpo monoclonal de marca Anti-His para verificar la expresión utilizando condiciones estándar.

Ejemplo 4 : Este ej emplo ilustra la purificación de la proteína Mgp002 recombinante marcada His proveniente de E. Coli utilizando cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ( IMAC, por sus siglas en inglés ) . E l cult ivo de célul a s ba ct eri ana s que expre s a el Mgp 0 02 re combinant e del Ej empl o 3 s e centri fugó para formar granulos de células y se mezcló con solución salina tampón de fosfato (PBS; tampón de fosfato 10 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM) que contuvo 0.5% v/v de Tritón X-100, a una proporción de aproximadamente Ig peso /mL en húmedo (típicamente 20-30 g/30 mL ) . Los tubos que contenían la mezcla se enfriaron en hielo y se sometieron a ultrasonido con un Branson Sonifier a 20-30% de salida de potencia durante intervalos de tres a un minuto, con períodos de enfriamiento intermedios de 1-2 minutos . La solución resultante se transfirió a tubos para centrifugación Beckman de 40 mL y se centrifugaron en un dispositivo para centrifugación Beckman Avanti J30Í a 10,000 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se decantó, y los granulos centrifugados se volvieron a suspender en un volumen igual del mismo tampón que contuvo clorhidrato de guanidina 6 M. La mezcla se sometió a ultrasonido y se centrifugó como se describe, y el sobrenadante, que contuvo la proteína mgp002 solubilizada, se mantuvo como el material de alimentación. La columna utilizada para la purificación IMAC fue el tipo Amersham XK 50/20 tipo, con un radio de 2.5 centímetros. Se condensó con un flujo rápido de sefarosa quelante de Amersham Pharmacia a una altura de 10 cm, para un volumen de columna (CV) de 200 mL . Si se utilizó previamente, la columna se regeneró y se desinfectó de acuerdo con las instrucciones del fabricante; después del paso de 7 CV de agua desionisada, la columna se cargó con 1 CV de NiCl2 0.1 M, y se equilibró con 4 CV PBS, pH 6.8. La columna se equilibró con 4 CV del tampón que contenía guanidina descrito anteriormente, a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Se cargaron 500 mL de la alimentación de muestra en 25 mL/min., siguidos por un paso de lavado 3 CV con PBS que contuvo imidazol 50 M . La elución de la proteína mgp002 se efectuó a través de la columna 3 CV de PBS que contuvo imidazol 300 mM . La fracción de elución se retuvo para diafiltración. Por último, la elución se concentró aproximadamente 6 veces con un dispositivo para filtración de flujo tangencial Pall Minum, utilizando un filtro de corte de peso molecular nominal de 10 kDa. Para asegurar la solubilidad del producto, el concentrado se diafiltró en el mismo aparato con aproximadamente diez volúmenes de tampón que contuvo Tris-HCl 10 mM, pH 8.5, NaCl 150 mM, L-arginina 0.8 M, y 10 mM ditiotreitol. Esto produjo una proteína Mgp002 recombinante purificada adecuada para la formulación en una composición inmunogénica o vacuna con o sin un adyuvante.

Ejemplo 5 : Este ejemplo ilustra la protección contra la inoculación genital con Serovar D de Chl amydi a tra choma ti s en ratones CH3 inmunizados. La proteína Mgp002 recombinante purificada dosis) del Ejemplo 4 se formuló con un adyuvante ISCOM ISCOMATRIX (IMX) dosis de 2.5ug/inmunización . La protección se midió al determinar la carga bacteriana en lavados genitales después de la inoculación intravaginal con Serovar D de Chlamyidia tra choma tis . En resumen, ratones hembra CH3 se inmunizaron con cada uno de los antígenos de prueba en IMX dos veces. Luego se indujo en los animales un estado similar a estral utilizando progesterona (depo provera) y luego se inocularon intravaginalmente con serovar D de Chlamydia tra choma ti s . Los lavados y torundas se extrajeron en los puntos de tiempo después de la infección y se evaluaron en el cultivo para las unidades formadoras de inclusión (UFI) . Un cultivo positivo proveniente de cualquier punto de tiempo indicó que el animal en cuestión se consideró infectado. Se evaluaron cinco puntos de tiempo para determinar cuál nivel de infección se presentó. El protocolo de inmunización se muestra en la siguiente Tabla 1. TABLA 1 : PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN En los días 3, 5, 7,11 y 14 la cavidad vaginal se lavó con 2x50 µl de tampón SPG seguido por una torunda. Los lavados y la torunda se agregaron a un tubo que contuvo 400 µl de SPG y se colocó en hielo donde los mismos ya sea se congelaron para una prueba posterior o se probaron inmediatamente. En el Día 34, a los ratones de todos grupos se les extrajo sangre y las muestra de suero se enviaron a Ausra Raudonikiene/Kiristin Boehlke (Bid 17, rm 124), en donde las muestras se sometieron a centrifugación y el suero se eliminó y se congelaron hasta la prueba. Figura 7 muestra que la inmunización con la proteína Mgp002 fue capaz de reducir drásticamente la carga bacteriana en el tracto genital en el lapso de tiempo del día 3 y menos en el día 5. Estos resultados demuestran que las formas recombinantes de mgp002 pueden proporcionar protección a través de las reducciones en la carga bacteriana después de la inoculación. Los cuerpos elementales (EB) fueron un control positivo y también fueron capaces de reducir la carga bacteriana en el tracto genital. Estos resultados fueron significativos estadísticamente (Wilcoxon p<0.05) en comparación con los grupos control que sólo consiguieron adyuvante y placebo.

Ejemplo 6 : Este ejemplo ilustra la protección contra una inoculación pulmonar con Chl amydi a tra ch oma ti s MoPn en ratones Balb/c inmunizados con Mgp002. La inoculación pulmonar se realizó como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. La proteína Mgp002 utilzada para inmunizar a los ratones fue la misma que se describió en el Ejemplo 4. En resumen, los ratones se inmunizaron tres veces intramuscularmente (i.m) (véase la Figura 3) con la proteína Mgp002 recombinante purificada (25 ug/dosis) del Ejemplo 4 formulada con la dosis adyuvante de DC-Chol de 200ug/inmunización . Los ratones se inocularon intranasalmente (i.n) con 2xl03 UFI de C. tra choma ti s MoPn EB 14 días después de la última inmunización, como se describió en el Ejemplo 2. En el día 10 después de la infección, los ratones se sacrificaron y sus pulmones se aislaron y ho ogeneizaron asépticamente con una trituradora en tampón de SPG. Las suspensiones del tejido se centrifugaron a 500g durante 4 min a 4°C para eliminar los tejidos grueso y los restos. Los sobrenadantes, se congelaron a -70°C hasta la prueba para cultivo de tejidos para el desarrollo cuantitativo del organismo. La Figura 8 demuestra que los ratones inmunizados con la proteína recombinante Mgp002 formulada con otro adyuvante, DC-Chol, también mostraron una reducción significativa en la carga de Chl amydi a en los pulmones en comparación con los ratones sin inmunizar. Estos resultados fueron significativos estadísticamente en p<0.05.

SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN En el sumario de esta exposición, la presente invención proporciona un método para la inmunización de un hospedero con ácido nucleico, que incluye ADN, incluyendo seres humanos, contra una enfermedad provocada por la infección con una cepa de Chl amydi a , específicamente C. tra choma ti s , empleando un vector de ácido nucleico, específicamente un vector de plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una forma de longitud total o truncada del producto génico de Mgp002 de una cepa de Chl amydi a y un promotor para llevar a cabo la expresión del gen Mgp002 y la forma truncada en el hospedero. La forma tanto de longitud total como truncada del gen Mgp002 provocó una respuesta inmunitaria protectora en el hospedero, contra la inoculación de Chl amydi a viva. La forma truncada incluso provocó una mayor respuesta protectora que la forma de longitud total. Son posibles modificaciones dentro del alcance de esta invención.

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Claims (38)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2 (b) SEQ ID No: 4 (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de (a), (b), (c) o (d) que se haya modificado mediante sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 75% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (a), (b) , (c) o (d) .
2. 2. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 1; (b) SEQ ID No: 3; (c) SEQ ID No: 5; (d) SEQ ID No: 7; (e) una secuencia que comprende al menos 38 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de (a) a (d) ; y (f) una secuencia que codifica para un polipéptido que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad y que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los polipéptidos codificados por la SEQ ID No: 1, 3, 5, o 7.
3. 3. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a cualquiera de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
4. 4. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, la proteína de fusión comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 y un polipéptido adicional.
5. 5. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 en donde el polipéptido adicional es un péptido de señal heteróloga.
6. 6. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 en donde el polipéptido adicional tiene actividad adyuvante.
7. 7. Una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, unida funcionalmente a una o más secuencias para control de expresión .
8. 8. Una vacuna que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de cualquiera de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos; en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e) ; en donde la molécula de ácido nucleico ya sea se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido en un mamífero o una célula bacteriana; en donde la vacuna proporciona una respuesta inmunitaria protectora contra una enfermedad provocada por Chl amydi a .
9. 9. La vacuna según la reivindicación 8 en donde la vacuna comprende opcionalmente un ácido nucleico adicional que codifica para un polipéptido adicional que mejora la respuesta inmunitaria al polipéptido seleccionado de cualquiera de (a) a (f ) .
10. 10. Una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad; en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e); en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido en una célula mamífera.
11. 11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10 que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; y (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) .
12. 12. La composición farmacéutica según la reivindicación 10 que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2 (b) SEQ ID No. 4 (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un polipéptido de cualquiera de (a) a (d) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) o (d) .
13. 13. La vacuna según la reivindicación 8 que comprende un vector de vacuna en donde el vector de vacuna comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; y (d) SEQ ID No: 8.
14. 14. La vacuna según la reivindicación 8 que comprende un vector de vacuna en donde el vector de vacuna comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SÉQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; y (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) .
15. 15. La vacuna según la reivindicación 8 que comprende un vector de vacuna en donde el vector de vacuna comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; y (e) un polipéptido de cualquiera de (a) a (d) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (d) .
16. 16. Un método para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No: 4; (c) SEQ No: 6; (d) SEQ ID No. 8; (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e); en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza funcionalmente a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido.
17. 17. El método según la reivindicación 17 para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a , que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No 2; (b) SEQ ID No 4; (c) SEQ ID No 6; y (d) SEQ ID No
18. 18. El método según la reivindicación 17 para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a , que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No: 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No. 8; y (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) .
19. 19. El método según la reivindicación 17 para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a , que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No: 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No. 8; y (e) un polipéptido de cualquiera de (a) a (d) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) o (d) .
20. 20. Un hospedero unicelular transformado con la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.
21. 21. Una solución de ensayo de ácido nucleico de 5 a 100 nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID No: 1, 3, 5 ó 7, o con un homólogo o la secuencia complementaria o anti-sentido de la molécula de ácido nucleico.
22. 22. Un cebador de 10 a 40 nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas para las moléculas de ácido nucleico de la SEQ ID No: 1 ó 3, o para un homólogo o secuencia complementaria o antisentido de la molécula de ácido nucleico.
23. 23. Un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 7.
24. 24. Un método para producir un polipéptido según la reivindicación 7 que comprende el paso de cultivar un hospedero unicelular según la reivindicación 21.
25. 25. Un anticuerpo contra el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 24.
26. 26. Una vacuna que comprende al menos un primer polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable, que comprende opcionalmente un segundo polipéptido que mejora la respuesta inmunitaria hacia el primer polipéptido.
27. 27. La vacuna según la reivindicación 27 en donde el segundo polipéptido comprende un adicional polipéptido adicional de Chl amydi a .
28. 28. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
29. 29. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna según la reivindicación 27 ó 28 y un portador farmacéuticamente aceptable.
30. 30. Un polinucleótido aislado de una cepa de Chl amydi a seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; (c) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5; (d) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7; (e) un polinucleótido que es al menos 95% homólogo con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, o 7; y (f) un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación de 6xSSC que contiene 50% de formamida a 42°C con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, o 7; en donde la administración del polinucleótido aislado, en una cantidad inmunogénicamente eficaz a un mamífero, induce una respuesta inmunitaria en el mamífero contra la infección por la cepa de Chlamydi a .
31. 31. Una molécula polipeptídica aislada y purificada que comprende un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2 (b) SEQ ID No: 4 (c) SEQ ID No: 6, (d) SEQ ID No: (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 12 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de (a), (b), (c) o (d) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad; en donde el polipéptido modificado es al menos 75% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (a), (b), (c) o (d) .
32. 32. Una molécula polipeptídica según la reivindicación 31 que comprende además un péptido de señal heteróloga.
33. 33. Una vacuna que comprende un polipéptido seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2 (b) SEQ ID No. 4 (c) SEQ ID No: 6 (d) SEQ ID No: 8 (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de cualquiera de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido según cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos, en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente según cualquiera de (a) a (e) ; en donde la molécula de ácido nucleico está unida funcionalmente ya sea a una o más secuencias control para la expresión del polipéptido en un mamífero o a una célula bacteriana, en donde la vacuna proporciona una respuesta inmunitaria protectora contra una enfermedad provocada por Chl amydi a .
34. 34. Una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y un polipéptido seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad; en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e) .
35. 35. La vacuna según la reivindicación 33 comprenden además un adyuvante.
36. 36. La vacuna según la reivindicación 35 en donde el adyuvante es un adyuvante ISCOM.
37. 37. La composición farmacéutica según la reivindicación 34 que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para utilizarse en una vacuna y una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) SEQ ID No. 4; (c) SEQ ID No: 6; (d) SEQ ID No: 8; y (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) .
38. 38. Un método para prevenir o tratar una infección por Chl amydi a que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de un polipéptido seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No 2; (b) SEQ ID No 4; (c) SEQ ID No 6; (d) SEQ ID No. 8; (e) un fragmento inmunogénico que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos provenientes del polipéptido de (a) a (d) ; y (f) un polipéptido de cualquiera de (a) a (e) que se haya modificado por la sustitución conservadora de aminoácidos sin pérdida de inmunogenicidad; en donde el polipéptido modificado es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de cualquiera de (a) a (e) .