MXPA06003643A - Formulacion de la sal de compuestos glicirricicos en gel termo-reversible como vehiculo para su aplicacion local en el tracto genital de mujeres y varones con lesiones por infeccion del virus del papiloma humano y en el cancer de los mismos. - Google Patents

Abstract

Desarrollo de una nueva formulacion de compuestos glicirricicos como son glicirricina, acido glicirricinico o acido glicirrretinico en un gel termoreversible del tipo Pluronic-F127, como vehiculo a una concentracion del 25% , previa disolucion del compuesto en propilenglicol como disolvente y potenciador de la absorcion y una concentracion del compuesto de 10,20,100 y 200 mg/ml y la adicion de un conservador como el metilparabeno al 0.1% y finalmente se ajusta el pH en un rango de 3-7, prefiriendo el de 3-5 por ser el mas fisiologico a nivel vaginal. Para el manejo terapeutico de lesiones intraepiteliales escamosas de bajo y alto grado asociadas a infeccion persistente por Virus del Papiloma Humano de bajo y alto riesgo oncogenico, del area genital interna como el cervix y vagina y externa: valvula, pene, ano y recto; asi como en el cancer de estas regiones anatomicas en mujeres y varones.

Description

Formulación de la sal de compuestos glicirrícicos en gel termo-reversible como vehículo para su aplicación local en el tracto genital de mujeres y varones con lesiones por infección del Virus del Papiloma Humano y en el cáncer de los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN. La presente invención, según se expresa en el siguiente enunciado se refiere a el desarrollo de una nueva formulación de compuestos glicirricicos como son glicirricina, ácido glicirricinico o ácido glicirretínico con un gel termo-reversible del tipo Pluronic-F127 (polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene), previa disolución del compuesto en propilenglicol como disolvente y potenciador de la absorción y la adición del compuesto metilparabeno como conservador y posteriormente el ajuste del pH en un rango de 3-7 con ácidos orgánicos. Para su aplicación tópica en el tracto genital Inferior de mujeres y varones con lesiones intraepiteliales de bajo y alto grado asociados a Virus del Papiloma Humano y cáncer. OBJETO DE LA INVENCIÓN. El objetivo de la invención de está formulación es desarrollar una nueva composición farmacéutica de aplicación tópica para ser utilizada en el manejo terapéutico de lesiones intra-epiteliales escamosas de bajo y alto grado asociadas a Virus del Papiloma Humano (VPH) de bajo y alto riesgo oncogenico del área genital interna como es el cérvix y vagina y externa :vulva, periné, ano y recto; así como en el cáncer de estas regiones anatómicas en mujeres y tracto genital de varones. Esta formulación disminuye la carga viral de los tipos virales de bajo y alto riesgo del VPH al interferir en el ciclo viral en las lesiones intra-epiteliales modificando; su evolución y persistencia y causando incluso regresión de la masa tumoral. También presenta un efecto inmuno-modulador generando una respuesta inmune antiviral. Debido a que la formulación del compuesto con el gel termo-reversible permite una mayor eficacia por su estabilidad y mayor permeación, potencializa el efecto y proporciona mayor permanencia sobre el epitelio húmedo e incluso el compuesto mismo funciona como un promotor de la absorción. Lo que lleva a un mayor tiempo de residencia en la región y absorción. ANTECEDENTES. Los compuestos glicirricicos se extraen de la raíz de una leguminosa llamada Glycyrrhiza glabra, cuyo nombre común es regaliz y se ha utilizado desde la antigüedad en la medicina botánica de Japón, Rusia, España, India, Medio Oriente y China. Existen referencias escritas de su uso desde el año 2,100 a C. El ácido glicirricinico es un glicosano triterpenoide derivado de la beta-amirina, cuyo nombre químico es ácido (3beta-20ß)-20-carboxil-11 -oxo-30-norolean-12-en-3-il-2-O-ß-D-glucopiranuronosil-a-D-glucopiranosidurónico; su fórmula es C42-H62-016 y su peso molecular 822.94. El ácido glicirricinico se ha utilizado como antiinflamatorio, antiulceroso, antitrombótico, antialergénico, anticarcinogénico en hepatocarcinomas secundarios a hepatitis viral y como antiviral. Su efecto se debe a que inhibe las enzimas que metabolizan las prostaglandinas (PGE2 y PGE2a) a su forma inactiva; en la mucosa gastro duodenal actúa como antiulceroso, y posible agente terapéutico contra cepas de Helycobacter pylori; es antitrombótico, por inhibir a la trombina; como anticarcinogénico en hepatocarcinomas secundarios a Hepatitis C y su actividad antiviral se ha probado particularmente contra Coronavirus que se asocian al síndrome respiratorio agudo, Flavivirus causantes de la fiebre amarilla, dengue y encefalitis japonesa, virus del herpes simple, virus CHIKY y SFV y virus de la varicela.

La actividad antiviral del ácido glicirricinico se atribuye a que interactúa con la estructura proteica de la cápside e interfiere con el ciclo viral, inhibiendo la repiicación de los ADN y ARN virales. En el caso del Herpes simplex, inactiva al virus de manera irreversible y promueve la activación del interferón. La característica de estos virus es que tienen la propiedad de infectar el epitelio y mucosas. Las dosis terapéuticas del AG que se usan son variables y generalmente se determinaron en función de las concentraciones de este en plasma y del tiempo de su eliminación del organismo mediante diferentes ensayos clínicos. Se considera que las dosis aceptables son: Por vía intravenosa de 20 a 50 mg/kg de peso cada 24 horas de Neo-Minophage C (SNMC), e ingerido de 1 a 10 mg. diarios. Otra dosis recomendada es 200-800 mg en infusión equivalente a 5-15 g de extracto seco en 150 ml de agua tres veces al día después de los alimentos; hasta por -6 semanas, y la raíz es usada como saborizante en una dosis diaria equivalente a 100 mg del ácido. Se propone que la dosis máxima segura es de 1 ,500 mg/kg de peso con un tiempo de acumulación en el organismo de 2 a 4 meses. El tiempo máximo reportado de exposición al compuesto es de 16 años. Los cánceres representan la segunda causa de mortalidad general, y el cáncer cervicouterino ocupa la primera causa de muerte por cáncer en mujeres principalmente en países como México que se encuentran en vías de desarrollo o subdesarrollados; por lo que representa una importante causa de muerte en estos países y un problema de salud pública. Este tipo de cáncer se encuentra asociado en el 99.7% de los casos a infecciones persistentes por Virus del Papiloma Humano del tipo de alto riesgo oncogénico, que se transmite por diferentes mecanismos, siendo el más frecuente la vía sexual. Inicia como una lesión precursora llamada lesión escamosa intraepitelial de bajo grado o neoplasia intraepitelial cervical grado I, esta lesión puede revertir y desaparecer o, persistir y progresar a una lesión escamosa intraepitelial de alto grado o neoplasia intraepitelial cervical de grado 2-3. Esta lesión también puede tener regresión aunque es menos frecuente, por lo que persiste y progresa a un carcinoma in situ y microinvasor y finalmente termina en un cáncer invasor. Este mecanismo de desarrollo del cáncer cervicouterino se presenta en otras regiones del tracto genital inferior de mujeres y varones aunque en frecuencias variables. Existen otras lesiones que son causadas por infecciones por Virus del Papiloma Humano de bajo riesgo oncogénico, como son los condilomas planos, acuminados, verrucosos que se desarrollan en cualquier parte del tracto genital e incluso otras regiones anatómicas como el cuello o los brazos. Para el manejo de este tipo de lesiones y las anteriormente descritas, previamente se han propuesto compuestos como el imiquimod con efecto inmunomodulador, pero por sus efectos secundarios no ha sido bien tolerado ni aceptado. Otra formulación comercial previamente conocida contiene el ácido glicirricinico como principio activo y fue diseñado inicialmente para su uso en el manejo de la infección por el virus del herpes simple en cavidad oral y región genital externa, posteriormente se aplicó en infección por virus del papiloma humano; sin embargo el vehículo con el cuál se aplica es diferente al que presentamos aquí, por lo que no invalida la presente invención, en la que desarrollamos una diferente formulación de compuestos glicirrizicos en la forma de gel termoreversible, que por sus propiedades pueda ser autoaplicado en una cavidad con característica específicas como la vagina o región anal o sobre el epitelio de genitales externos: vulva, periné, periano, pene y escroto, para el manejo de lesiones precancerosas y cáncer de esas regiones anatómicas Propiedades que hacen del Pluronic F-127 el vehículo de elección para formular el Ácido Glicirricínico y su justificación en cuanto a su uso farmacéutico. El PF-127 es un gel termoreversible, esta característica le ha permitido ser usado como acarreador de moléculas activas por varias vías de administración como son la oral, tópica, intranasal, vaginal, rectal, ocular, intramuscular e incluso como piel artificial también ha sido reportado. Los copolímeros de bloque de superficie activa polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene (POE-POP-POE, Pluronics®) son ampliamente utilizados como agentes solubilizantes y humectantes. Algunos Pluronics® poseen propiedades especiales que los hacen particularmente útiles para su uso en formulaciones tópicas; estas incluyen su baja toxicidad y su capacidad de formar geles transparentes en medio acuoso . El PF-127 es de interés particular, debido a que soluciones concentradas de >20% w/w de el copolímero son transformadas de soluciones transparentes de baja viscosidad a geles sólidos a temperatura corporal. Esto sugiere que cuando se colocan estos geles en la piel o inyectados en una cavidad del cuerpo, la preparación formará una barrera artificial sólida y por tanto un depósito de liberación sostenida del fármaco. Estas características se tomaron en consideración para elegir el PF-127 como vehículo para la nueva formulación del ácido glicirricínico. Sin embargo para un técnico con conocimientos medios en la materia, no es obvia la obtención de la formulación de la presente invención, ya que no se trata de la unión simple de dos elementos ya conocidos, si no que se tuvo que trabajar para obtener este producto en la nueva formulación con el gel termoreversible lo cuál representa un elemento inesperado y no obvio. La nueva formulación se ha probado sobre lesiones de bajo y alto grado y cáncer del epitelio escamoso en el tracto genital inferior, a dosis de 10, 100, 250 y 500 mg por día, con el efecto comprobado sobre estas lesiones relacionadas con VPH y cáncer; en varones y mujeres sin mostrar efectos colaterales. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

Figura 1. En el gráfico observamos el efecto in vitro del ácido glicirricinico en cultivos de diferentes líneas celulares derivadas de cáncer cérvico uterino asociados a VPH: HeLa contiene VPH tipo 18, CaSki contiene VPH tipo 16; SiHa contiene VPH tipo 16 y C33 sin VPH. En todas observamos inhibición del crecimiento celular y citotoxicidad a las 72 hr. de haber sido tratadas, con una concentración de entre los 5000µg y los 10,000µg. En la fig. 2 y 3 ilustramos el caso de un varón con diagnóstico de balanitis e infección por Virus del Papiloma Humano de alto riesgo corroborado por prueba de captura de híbridos y condiloma en región púbica. Antes y después de la aplicación local de 100mg/por día durante 7 días del compuesto en la nueva formulación. Observamos el efecto sobre la lesión la cuál reepitelizó y la prueba de captura de híbridos se negativizó. En las fig. 4 y 5 ilustramos el caso de una paciente con el diagnostico de cáncer cervicouterino invasor en estadio clínico I IB, prueba de captura de híbridos positiva y carga viral elevada. Fue tratada con el compuesto de nueva formulación con una dosis diaria de 500 mg durante un tiempo de 45 días, las fig. 6 y 7 ilustran el resultado final de la lesión al termino del tratamiento, donde observamos disminución del volumen tumoral y reepitelización de la zona de lesión. En la fig. 8, representamos el efecto de la nueva formulación sobre la carga viral aplicado a un grupo de 4 pacientes: una con antecedente de Neoplasia Intra-epitelial Cervical grado 1 (NIC-1), dos con NIC-1 y una con NIC-3 con diagnostico cito-histo-colposcópico y todas con prueba de captura de híbridos para HPV de alto riesgo positiva: 23.14, 241, 1336.49 y 2306.26µg/ml respectivamente. Se les aplicó 250 mg del AG en gel durante 7 días y a los 15 días post-tratamiento se realiza la captura de híbridos obteniendo resultados negativos : 0.16, 0.18, 0.12 y 0.72µg/ml respectivamente y las citologías se reportaron como negativas. Aunque preliminares, los resultados de estos casos nos abren la expectativa de uso de esta formulación para el tratamiento de las NIC asociadas a infección por VPH, y de esta forma poder interferir en la persistencia y evolución de estas infecciones y lesiones. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN. Ácido glicirricínico formulado en gel Pluronic F-127. Preparación de los geles. Los geles fueron preparados usando el método descrito por Schmolka, de manera general consiste en lo siguiente: Se preparó una solución de Pluronic F-127 (PF-127) en el rango de concentraciones del 20-30% y es cuando se observa el fenómeno de gelación térmica reversa, lo cual significa que a temperaturas bajas es un líquido y a medida que la temperatura se incrementa la viscosidad de la solución también lo hace generándose un gel y específicamente se prefiere de este rango el de 25% sin que sea limitativo. La cantidad correspondiente de PF-127 se añadió lentamente en agua fría con agitación mecánica suave. La solución de PF-127 se dejo toda la noche a baja temperatura, en un rango de entre 2°C a 6°C pero preferentemente a los 4°C para la completa hidratación del polímero. Una vez que el polímero se disolvió perfectamente, el ácido glicirricínico (AG) se disolvió previamente en Propilenglicol (PG) y a esta misma solución se le adicionó un conservador el cuál puede ser el Propil-parabeno al 0.1% o el mismo Propilenglicol pero a una concentración de 30-50% entre otros prefiriendo el Metil-Parabeno al 0.1%. Una vez garantizada la completa disolución del AG y del conservador en el Propilenglicol se incorporo a el volumen requerido de gel para preparar la formulación correspondiente. Finalmente se ajusta el pH en un rango de 3-7, prefiriendo de 3-5 el cuál es un pH más fisiológico a nivel vaginal, con ácidos orgánicos como pueden ser el ácido acético o ácido cítrico entre otros que no son tóxicos ni irritantes para el humano. Las formulaciones fueron elaboradas bajo condiciones de esterilidad, por ejemplo vertidas en frascos de vidrio previamente esterilizados en autoclave y envasados en campana de flujo laminar. Es importante mencionar que se utilizó agua destilada de calidad Mili-Q (Millipore * Corp., Bedford, USA) para preparar todas las soluciones requeridas, además de ser pasadas por filtros de tamaño de poro de 0.2µ para evitar contaminación por microorganismos. La formulación I y II (tabla I) se prepararon a una concentración de 10 y 20 mg/ml de Ácido Glicirricínico respectivamente. Estas formulaciones presentaron el fenómeno de gelación térmica reversa, es decir son fluidas a temperaturas bajas y se solidifican formando un gel a medida que se incrementó la temperatura, es decir a la temperatura corporal. Las formulaciones lll y IV se prepararon a una concentración de 100 y 200 mg/ml de Ácido Glicirricínico respectivamente. Es importante mencionar que dichas formulaciones ya no tienen la capacidad de gelificarse debido al elevado contenido de PG en las mismas, por lo que la consistencia es más fluida, sin embargo es necesario adicionar esa proporción de PG con la finalidad de solubilizar el AG y aún así es necesario calentar entre 60°C y 120°C con una temperatura promedio de 65-75°C con agitación constante para garantizar la completa disolución del AG. En todas las formulaciones se utilizó Metil-Parabeno al 0.1% como conservador.

Tabla 1. Composición de los geles de PF-127 gel formulado.

Pruebas de solubilidad. Previo a la preparación de los geles fue necesario determinar la solubilidad del AG en solución acuosa - debido a que los geles son preparados en agua- encontrándose un valor de solubilidad bajo: 1.1 mg/ml Lo cual significa que la cantidad que se puede disolver en agua es muy pequeña. El AG resulto ser muy soluble a pH mayores a 9.0, de ahí que fue necesario el probar la solubilidad del AG en diferentes solventes orgánicos polares y no polares: Alcohol metílico, alcohol etílico, alcohol ¡sopropílico, éter, acetona, diclorometano, cloroformo, hexano, etc. Encontrándose que fue insoluble en todos ellos, este hecho es importante porque también puso las bases para implementar el método analítico por HTPLC (High Performance Thin Layer Chromatography) para la cuantificación del ácido glicirricínico. Finalmente fue necesario probar la solubilidad en otras sustancias que comúnmente son utilizadas en la industria farmacéutica como vehículos. Las sustancias que se probaron como co-solventes para solubilizar al AG fueron: Glicerina. Transcutol y Propilenglicol.

En Glicerina y Transcutol el AG fue insoluble, sin embargo en el Propilenglicol el AG se disolvió adecuadamente: 89.6 mg/ml Siendo este uno de los principales motivos por los que se eligió como parte del vehículo para formular el AG en gel de PF-127. Además se ha demostrado que el PG es un promotor de penetración -sustancia química que incrementa la partición y difusión- de activos de uso farmacéutico o cosmético hacia y a través de la barrera de permeabilidad de la piel. Esta es una propiedad que puede ser utilizada para favorecer en un momento dado el paso de AG a través de la mucosa vaginal. Método analítico. También es importante mencionar que se tiene ya prácticamente el método analítico para la cuantificación del AG y este será HPTLC en placas fase reversa, mostrándose la siguiente respuesta analítica por parte del AG. Se tiene ya el intervalo de concentraciones en el que la respuesta analítica es lineal y esto servirá para la cuantificación del AG en las pruebas in vitro consistiendo en pruebas de permeación a través de mucosa de vagina de cerdo.

Es por ello que la formulación de la presente invención se prueba que es viable e inventiva ya que no existe antecedente alguno que tenga una formulación del ácido glicirricinico como principio activo en un gel termoreversible y propilenglicol como la que hemos descrito y para los usos terapéuticos que le hemos dado. Como son el manejo de las infecciones persistentes por el VPH, lesiones intraepiteliales escamosas de bajo y alto grado de cérvix uterino, lesión intraepitelial vaginal de bajo y alto grado, lesión intraepitelial vulvar de bajo y alto grado, lesión intraepitelial perianal y anal de bajo y alto grado. Asi como en los cánceres microinvasores de los mismos. Y las lesiones intraepiteliales de bajo y alto grado en el tracto genital de varones. Su uso será de tipo profiláctico para las lesiones intraepiteliales escamosas del tracto genital inferior cuando se aplique en el manejo de infecciones persistentes por Virus del Papiloma Humano de tipo oncogenico.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES Habiendo descrito de manera suficiente y clara mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas: 1.-Formulación de la sal de compuestos glicirrizicos con un gel termoreversible, como vehículo para su aplicación local en el tracto genital de mujeres y varones con lesiones por infección del Virus del Papiloma Humano y cáncer de los mismos caracterizado por que consta de las concentraciones 20-30% del gel y el compuesto activo se encuentra en las concentraciones de 10, 20, 100 y 200 mg/ml..
2. 2. -Formulación de la sal de compuestos glicirrizicos, como el ácido glicirricinico; con un gel termoreversible como vehículo para su aplicación local en el tracto genital de mujeres y varones, con lesiones por infección del Virus del Papiloma Humano y cáncer de los mismos y de acuerdo a la reivindicación 1 donde se "prefieren la concentración del 25% del gel termoreversible en las mismas concentraciones de 10,20,100 y 200 mg. del compuesto.
3. 3.-Proceso para elaborar la formulación de las reivindicaciones 1 y 2 que consta de los siguientes pasos: a) El gel termoreversible se disuelve lentamente en agua a baja temperatura en un rango de entre 2°C a 6°C, pero preferentemente a 4°C toda la noche para la completa hidratación del polímero y quede a la concentración preferente del 25%. b) El compuesto ácido glicirricinico se disuelve en propilenglicol. c) A la mezcla anterior de ácido glicirricinico + propilenglicol se le adicionó un conservador como el metilparabeno al 0.1%. d) Con la mezcla descrita en el inciso c y el gel disuelto, se incorporan el volumen requerido del gel a la mezcla del compuesto: 85:15 / 85:15 / 35:65 / 35:65 para obtener las concentraciones finales de 10, 20, 100 y 200 mg/ ml. e) Obtenida la concentración final se ajusta el pH en un rango de 3-7 con ácidos orgánicos como el ácido acético y ácido cítrico.
4. 4.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 3 donde para lograr preparar la formulación a las concentraciones de 100 y 200 mg/ml. se requiere calentar la mezcla, para garantizar la completa disolución del compuesto, con agitación constante en un rango de temperatura de 60°C a los 120°C prefiriendo los 65-75°C.
5. 5.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 3 donde la etapa final de formular el compuesto se ajusta el pH prefiriendo el rango de pH de 3-5 por ser el más fisiológico en cavidad vaginal.
6. 6.-Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 ,2 y 3 para elaborar un medicamento de uso terapéutico en infecciones persistentes por VPH, lesiones intraepiteliales escamosas de bajo y alto grado de cérvix uterino, lesión intraepitelial vaginal de bajo y alto grado, lesión intra-epitelial vulvar de bajo y alto grado, lesión intraepitelial perianal y anal de bajo y alto grado. Asi como en los cánceres micro-invasores de los mismos.
7. 7.-Uso de acuerdo a lá reivindicación 6 donde la formulación farmacéutica es de aplicación tópica en tracto genital inferior femenino y de varones.
8. 8. -Uso de acuerdo a la reivindicación 6, para el manejo de las lesiones anteriormente descritas se utilizará la nueva formulación durante un periodo de 7 a 15 días como promedio e incluso hasta 30-45 días dependiendo del grado de lesión, en monodosis por día y auto-aplicación con el dispositivo previamente diseñado para tal fin.
9. 9. -Uso de acuerdo a la reivindicación 6 de la formulación desarrollada para la profilaxis de lesiones intraepiteliales escamosas del tracto genital inferior en pacientes con infecciones persistentes por VPH de tipo oncogénico.