MXPA06001000A - Metodo para preparar polimeros funcionalizados a partir de alcoholes polimericos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona, entre otras cosas, metodos para preparar polimeros funcionalizados y otros, a partir de alcoholes polimericos tales como poli(etilenglicoles). Ademas, tambien se proporcionan composiciones polimericas, conjugados, reactivos polimericos.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR POLÍMEROS FUNCIONALIZADOS A PARTIR DE ALCOHOLES POLIMÉRICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Entre otras cosas, esta invención se refiere a polímeros solubles en agua y no peptídicos, funcionalizados, y en particular, a métodos para elaborar, purificar y utilizar tales polímeros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La unión covalente del polímero hidrofílico, poli (etilenglicol) , abreviado "PEG", a moléculas y superficies es de considerable utilidad en áreas tales como biotecnología y medicina.. El PEG es un polímero que posee muchas propiedades benéficas. Por ejemplo, el PEG es soluble en agua y en muchos solventes orgánicos, no es tónico ni inmunogénico, y cuando se une a una superficie, el PEG proporciona un revestimiento de protección, biocompatible . Las aplicaciones o usos comunes de PEG incluyen (i) unión covalente a proteínas, por ejemplo, para prolongar la vida media del plasma y reducir la separación a través del riñon, (ii) unión covalente a moléculas pequeñas para mejorar la solubilidad del agua y facilidad de formulación, y reducir la velocidad de separación del riñon, (iii) unión a las superficies tales como en reemplazos arteriales, dispositivos de contacto sanguíneo, y biosensores, (iv) como un portador soluble para síntesis de biopolímeros, y (v) como un reactivo en la preparación de hidrogeles . En muchos sino en todos los usos notados anteriormente, es necesario activar primero el PEG, convirtiendo su término hidroxilo a un grupo funcional capaz de reaccionar fácilmente con un grupo funcional encontrado dentro de una molécula o superficie objetivo deseada, tal como un grupo funcional encontrado sobre la superficie de una proteina. Por proteínas, los aminoácidos reactivos típicos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina, el grupo amino N-terminal y el ácido carboxilico C-terminal . El PEG usado como un material iniciador para la mayoría de reacciones de activación de PEG, es típicamente un PEG de extremo tapado. Un PEG de extremo tapado es uno, en donde uno o más de los grupos hidroxilo, típicamente localizados en un término del polímero, se convierten en un grupo no reactivo, tal como un grupo metoxi, etoxi o benciloxi. El más comúnmente usado es metoxiPEG, abreviado como mPEG. Los PEGs de extremo tapado tales como los mPEG se prefieren de manera general, puesto que tales PEGs de extremo tapado son típicamente más resistentes para reticulación y agregación. Las estructuras de dos alcoholes PEG de extremo tapado más comúnmente empleadas, mPEG y monobencil PEG (conocidos de otro modo como bPEG) , 5 se muestran abajo, mPEG bPEG I 10 en donde n típicamente varía desde ¡ aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2,000. Aunque el uso de mPEG se prefiere en muchos sentidos, existen también serías desventajas asociadas con I el uso de mPEG como material iniciador. El mPEG 15 comercialmente disponible es a menudo contaminado con diol de PEG (HO- (CH2CH2) n-OH) , en donde los valores de no son típicamente como se declaran anteriormente. Aunque algunos fabricantes producen mPEG de bajo diol, algunas de las impurezas de diol están siempre presentes, y el contenido 20 puede variar tan alto como 10-15%, o en algunos casos, aún mayor. El diol de PEG se origina a partir de la presencia de cantidades de rastros de contaminación de agua durante la polimerización catalizada con base de óxido de etileno para formar mPEG. Debido a una concentración inferior de 25 iniciador de metóxido en la preparación de PEGs de alto I peso molecular, por ejemplo, excediendo 20 kilodaltons ( ) o tanto, la contaminación del agua y por lo tanto, la formación de diol, pueden presentar un problema más serio. Para PEG de alto peso molecular, la contaminación de diol puede alcanzar o aún exceder el 30%. Además, debido a que la cadena de diol puede crecer en cada extremo, el diol de contaminación típicamente tiene un peso molecular promedio superior que el mPEG deseado. Una característica de la química de PEGilación es que, en muchos casos, el diol y el PEG di-activado o difuncional correspondiente que resulta del diol de PEG, no se eliminan. En tales casos, el producto conjugado contendrá una cierta cantidad de producto reticulado, y adicionalmente, posee una polidispersidad incrementada debido al diol de polímero y contaminantes derivados de diol. Esto es altamente indeseable para un producto farmacéutico, puesto que la presencia y cantidades de tales contaminantes pueden ser altamente variables, esto conduce a capacidad irreproducible del producto. Se han empleado diferentes procedimientos a la fecha, en un intento por superar estos problemas. En un procedimiento para reducir la cantidad de impurezas de diol en materiales iniciadores de mPEG, los alcoholes de PEG monofuncional han sido manufacturados por polimerización de óxido de etileno bajo condiciones estrictamente anhidras usando un iniciador de alcohol en la forma de una sal de sodio o de potasio (Odian, Principies of Polymerization, 3era. Edición, Wiley, 1991; F. E. Bailey, Jr. & J. V. Koleske, en Poly (ethylene oxide),. Academic Press, New York, 1976) . Aunque resulta en mPEGs que tienen algún contenido de diol reducido, este procedimiento no se presta el mismo para síntesis de escala comercial, debido a la sensibilidad de los procesos a la humedad y problemas asociados en el control de peso molecular y polidispersidad del producto. Sin embargo, el proceso es preferentemente complicado y costoso de operar, especialmente para la manufactura de las cantidades relativamente pequeñas de reactivos poliméricos de peso molecular superior, necesarios para muchas aplicaciones farmacéuticas. Además, la reactividad explosiva del monómero requiere precauciones de seguridad adicionales, que se agregan al costo de manufacturación. En otro procedimiento a tratar con la contaminación de diol, el PEG de benciloxi crudo que contiene impurezas de diol es metilado y después hidrogenado para remover el grupo bencilo (Véase Patente Estadounidense No. 6,448,369). Como un resultado, el diol de PEG presente en la composición es convertido al dimetiléter inerte. Sin embargo, este proceso puede ser desventajoso en varios sentidos. Primero, este procedimiento se agrega al número total de etapas sintéticas que se deben llevar a cabo para preparar un reactivo o producto PEG activado final. Segundo, aunque inerte, este procedimiento todavía conduce a la formación de una impureza en la composición de PEG activado. Alternativamente, un producto de PEG activado puede ser purificado para remover material difuncxonal, sin embargo, tales purificaciones son típicamente extremadamente laboriosas y requieren tiempo prolongado, así como también dificultades para realizarlas. Por ejemplo, la cromatografía a base de gradiente, un procedimiento de separaciones frecuentemente empleado, requiere el análisis de fracciones de eluados múltiples, utiliza un gran volumen de solvente, y es escasamente adecuado para procesos a escala comercial. Sin embargo, las técnicas de separación basadas en gradientes, raramente logran niveles aceptables de pureza, particularmente cuando se separan especies poliméricas de peso molecular superior. En suma, los presentes métodos para preparar PEGs activados, particularmente PEG monofuncionales activados, son insatisfactorios en muchos sentidos. Para la mayor parte, los métodos actualmente confían en el uso de material iniciador de mPEG relativamente costoso, el cual a menudo contiene grandes cantidades de diol de PEG contaminante, indeseable. Los procedimientos sintéticos actuales para evitar la formación de diol son complicados, requieren etapas de reacción adicional múltiples, y pueden todavía resultar en la formación de cantidades detectables de diol de PEG o subproductos derivados de diol-PEG. Finalmente, existen procedimientos de separación, métodos cromatográficos particulares son insatisfactorios por las razones discutidas anteriormente. Los solicitantes . han realizado una necesidad continua en la técnica de nuevos métodos para preparar PEGs activados que (i) no confian en materiales iniciadores de polímeros monofuncionales costosos, (ii) no requieren etapas de reacción incómodas adicionales múltiples, y (iii) superan los problemas asociados con la presencia de diol de PEG proporcionando reactivos de polímeros de alta pureza que tienen un contenido de diol bajo. En respuesta a estas y otras necesidades, los Solicitantes han entre otras cosas, desarrollado nuevos métodos para formar PEGs de activación, los cuales superan muchas de las desventajas indicadas anteriormente .

SUMARIO DE IA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona un método para formar un polímero funcionalizado, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un polímero soluble en agua y no pe tídico que comprende dos grupos hidroxilo (es decir, un polímero soluble en agua y no peptídico que tiene dos grupos hidroxilo) ; (b) hacer reaccionar el polímero soluble en agua y no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo, en una o más etapas de reacción, con uno o más reactivos de funcionalización para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una mezcla que comprende (i) polímero soluble en agua y no peptidico insustituido a partir de la etapa (a) , (ii) un polímero monosustituido que comprende un grupo único Y, y (iii) un polímero disustituido que comprende dos grupos Y, bajo condiciones efectivas para formar ya sea no más de aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido; y (c) purificar la mezcla de la etapa (b) para proporcionar un polímero monosustituido sustancialmente libre de las especies de polímeros insustituidos y disustituidos . Polímeros funcionalizados, así como también polímeros monosustituidos, preparados de conformidad con este método, representan aspectos adicionales de la invención. El método opcionalmente comprende la etapa adicional de alquilar el polímero no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo previo a la etapa (b) , o alquilar la mezcla formada en la etapa (b) previo a o subsecuente a la etapa de purificación (c) . Esta etapa opcionalmente puede ser usada para convertir los grupos hidroxilo sin reaccionar a grupos alcoxi . En otro aspecto, la invención proporciona un método para formar un polimero funcionalizado alquilado, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar un polimero soluble e agua y no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo; (b) alquilar el polimero soluble en agua y no peptidico para formar una mezcla que comprende (i) polimero soluble en agua y no peptidico no alquilado de la etapa (a) , (ii) un polimero monoalquilado que comprende un grupo alcoxi único, y (iii) un polimero dialquilado que comprende dos grupos alcoxi, bajo condiciones efectivas para formar al menos aproximadamente 25 por ciento en mol de polimero dialquilado; (c) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (b) , en o más etapas de reacción, con uno o más reactivos funcionalizados para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una mezcla que comprende (i) polimero no alquilado que comprende dos grupos Y, un polimero monoalquilado que comprende un grupo Y único, y un polimero dialquilado que comprende grupos no Y, (d) purificar la mezcla de la etapa (c) para proporcionar un polimero monoalquilado sustancialmente libre de las especies de polímeros no alquilados y dialquilados. Polímeros funcionalizados alquilados, así como también polímeros monoalquilados sustancialmente libres de las especies de polímeros no alquilados y dialquilados, preparados de conformidad con este método, representan aspectos adicionales de la invención.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para formar un polímero funcionalizado, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un polímero que comprende una fórmula HO-POLI-OH, en donde POLI es un polímero soluble en agua y no peptídico; (b) opcionalmente, convertir HO-POLI-OH a una mezcla que comprende HO-POLI-OH, HO-POLI-Z y Z-POLI-Z, en donde Z es un grupo saliente, bajo condiciones efectivas para formar no más de aproximadamente 45 por ciento de Z-POLI-Z; (c) hacer reaccionar HO-POLI-OH de la etapa (a) o la mezcla de la etapa (b) con un reactivo de funcionalización que comprende la estructura X~L0,i-Y, en donde X es un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónica, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo o grupo saliente está unido, L0,i es un enlazador opcional, y Y es un grupo ionizable, para formar una mezcla que comprende HO-POLI-OH, HO-POLI-L0, i-Y, y Y-Lo, í-POLI-Lo, i~Y, bajo condiciones efectivas para formar preferiblemente no más de aproximadamente 25 por ciento de Y-L0, í-POLI-Lo, í-Y; (d) opcionalmente, alquilar la mezcla de la etapa (b) o etapa (c) ; y (e) purificar la mezcla de la etapa (c) o etapa (d) por cromatografía de intercambio iónico para proporcionar polímeros sustancialmente puros que comprenden un grupo -L0,j.-Y único. Polímeros funcionalizados, así como también polímeros sustancialmente puros que comprenden un grupo -L0,i-Y único, preparados de conformidad con este método, representan aspectos adicionales de la invención. En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un método para separar una mezcla de especies de polímeros por cromatografía de intercambio iónico, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar una mezcla de polímeros soluble en agua y no peptídicos, dicha mezcla comprende un polímero neutral ausente, un grupo funcional ionizable, un polímero monofuncional que comprende un grupo funcional ionizable único, y un polímero difuncional que comprende dos grupos funcionales ionizables; (b) pasar la mezcla a través de una primera columna de intercambio iónico para proporcionar un eluado, en donde dicha etapa de pasar la mezcla se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todos los polímeros difuncionales sobre la primera columna; (c) pasar el eluado a través de una segunda de intercambio iónico bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero monofuncional sobre dicha segunda columna; (e) lavar la segunda columna con agua o una solución de sal que tiene baja fuerza iónica para remover sustancialmente solamente polímero neutral ausente, un grupo funcional ionizable · en una solución de lavado; y (f) pasar una solución que tiene suficiente fuerza iónica a través de la segunda columna para desorber el polímero monofuncxonal. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un aparato de cromatografía de intercambio iónico, que comprende: un suministro de solución de una mezcla de polímero soluble en agua y no peptídico que comprende grupos funcionales ionizables ausentes de polímeros neutrales, un polímero monofuncxonal que comprende un grupo funcional ionizable único, y un polímero difuncional que comprende dos grupos funcionales ionizables; una primera columna de intercambio iónico que comprende una primera entrada, una primera salida, y un primer medio de intercambio iónico, dicha primera entrada está en comunicación fluida con dicho suministro; una segunda columna de intercambio iónico que comprende una segunda entrada, una segunda salida, y un segundo medio de intercambio iónico, dicha segunda entrada está en comunicación fluida con dicha primera salida; y al menos un recipiente de recuperación de producto en comunicación fluida con dicha segunda salida, adaptado para recibir eluente que sale de dicha segunda columna de intercambio iónico. El primero y segundo medio de intercambio iónico pueden ser ya sea el mismo o diferente, y el aparato incluye sustancias en donde el primero y segundo medio de intercambio iónico son los mismos y ejemplos en donde el primero y segundo medio de intercambio iónico son diferentes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Habiendo asi descrito la invención en términos generales, se hará referencia ahora a los dibujos acompañantes, en' donde: La figura 1 ilustra gráficamente las estadísticas de sustitución de un diol de PEG en una reacción de sustitución nucleofilica. Este trazo demuestra las concentraciones relativas de producto diol, mono y disustituido en una mezcla de reacción en cualquier punto durante tal reacción; La figura 2 ilustra una modalidad del sistema de cromatografía de intercambio iónico de la invención, en el cual se emplean dos columnas; La figura 3 ilustra una modalidad de columna múltiple del sistema de cromatografía de intercambio iónico de la invención; La figura 4a es un cromatograma de una mezcla de productos previa a la separación cromatográfica como se describe en el Ejemplo 1. El Pico 1 es diácido de PEG, el Pico 2 es ácido m-PEG y el Pico 3 es m-PEG-m (es decir, dimetoxi PEG) ; La figura 4b es un cromatograma del eluado de la primera columna (precolumna) en el sistema de cromatografía de intercambio iónico descrito en el Ejemplo 1. El Pico 1 es ácido mPEG y el Pico 2 es mPEG-m; La figura 4c es un cromatograma de ácido mPEG puro del eluado de la segunda columna (columna principal) en el sistema de cromatografía de intercambio iónico descrito en el Ejemplo 1; y La figura 4d es un cromatograma de una mezcla de productos del eluado de la primera columna (precolumna) en el sistema de cromatografía de intercambio iónico descrito en el Ejemplo 1, en donde el Pico 1 es diácido PEG y el Pico 2 es ácido mPEG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA. INVENCIÓN Antes de describir la presente invención en detalle, se entiende que esta invención no está limitada a polímeros particulares, técnicas sintéticas, agentes activos, y los similares como tales, pueden variar. Se entiende también que la terminología usada en este documento es para describir únicamente modalidades particulares, y no está propuesta para ser limitante. Se debe notar que, como se usa en esta especificación, las formas singulares "un", ""una", y "lo", incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. De este modo, por ejemplo, referencia a un "polímero", incluye un polímero único así como también dos o más de los mismos o diferentes conjugados, referencia a un "excipiente" incluye un excipiente único, asi como también dos o más de los mismos o diferentes excipientes y similares .

I. Definiciones Describiendo y reivindicando la presente invención, la siguiente terminología será usada de conformidad con las definiciones descritas abajo. "PEG", "polietilenglicol" y "poli (etilenglicol) ", son usados por significar cualquier poli (óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, PEGs para uso en la presente invención, comprenderán una de las siguientes estructuras:"- O (CH2CH2CO) „" ó "-CH2CH20 (CH2CH20) n-CH2CH2~, " en donde n es 3 hasta 3000, y los grupos terminales y arquitectura del PEG total puede variar. "PEG" significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, mayor del 50% de subunidades que son -CH2CH20-. Un PEG comúnmente empleado es PEG de extremo tapado. Cuando PEG se define como "-0 (CH2CH20) n-" el grupo de extremo tapado es generalmente un grupo que contiene carbono, típicamente comprendido de 1-20 carbonos y es preferiblemente alquilo (por · ejemplo, metilo, etilo o bencilo) , aunque formas saturadas e insaturadas del mismo, así como también arilo, ñeteroarilo, ciclo, heterociclo y formas sustituidas de cualquiera de los mencionados anteriormente, están también contemplados . Cuando PEG es definido como -CH2CH20 (C¾CH20) n-CH2CH2-, " el grupo de extremo tapado es generalmente un grupo que contiene carbono, típicamente comprendido de 1-20 átomos de carbono y un átomo de oxígeno que está covalentemente unido al grupo y está disponible para enlazar covalentemente a un término del PEG. En este caso, el grupo es típicamente, alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi o benciloxi) y con respecto al grupo que contiene carbono, puede opcionalmente ser saturado o insaturado, así como también arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y formas sustituidas de cualquiera de los mencionados anteriormente. El otro término ("extremo no tapado) es típicamente un hidroxilo, amino o grupo activado que puede ser sometido a modificación química adicional cuando el PEG es definido como "-CH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2-''. Además, el grupo de extremo tapado puede también ser un silano. Formas PEG específicas para uso en la invención incluyen PEGs que tienen una variedad de pesos, estructuras o geometrías moleculares (por ejemplo, PEGs ramificados, lineales, bifurcados, multifuncionales y similares) , a ser descritas en mayor detalle abajo. El grupo de extremo tapado puede también comprender ventajosamente una etiqueta detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de extremo tapado que comprende una etiqueta detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o la porción . (por ejemplo, agente activo), a la cual el polímero está acoplado es de interés, puede ser determinada por cualquier detector adecuado. Tales etiquetas incluyen, sin limitación, porciones fluorescentes, quimioluminiscentes, usadas en etiguetación de enzima, porciones colorimétricas (por ejemplo, tintes), iones metálicos, radioactivas, y similares. Los polímeros de la invención son típicamente polidispersos (es decir, el número de peso molecular promedio y el peso molecular promedio en peso de los polímeros no son iguales) , poseen valores de baja polidispersidad —expresados como una relación de peso molecular promedio en peso (PM) a un número en peso molecular promedio (Mn) , (PM/Mn) — de generalmente menos de aproximadamente 1.2, preferiblemente menos de aproximadamente 1.15, más preferiblemente menos de aproximadamente 1.10, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 1.05, aún todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 1.03, y más preferiblemente menos de aproximadamente 1.025. Como se usa en este documento, el término "grupo funcional ionizable" y variaciones de los mismo, es un grupo funcional que puede ganar o perder un protón por interacción con otras especies ionizables de grupos funcionales en medio acuoso u otro polar. Grupos funcionales ionizables incluyen, pero no se limitan a, amina, ácidos carboxilicos, hidratos de aldehidos, hidratos de cetonas, amidas, hidrazinas, tioles, fenoles, oximas, ditiopiridinas y vinilpiridinas . Como se usa en este documento, el término "ácido carboxilico" es una porción que tiene un grupo O funcional -C-OH [también representado como un "-C00H" ó -C(0)OH], asi como también porciones que se derivan de un ácido carboxilico, tales derivados incluyen, por e emplo, ácidos carboxilicos protegidos. De este modo, a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo, el término ácido carboxilico incluye no solamente la forma de ácido, sino ésteres correspondientes y formas protegidas también. Se hace referencia nuevamente a Greene et al., "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS" 3era. Edición, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999. "Ácido carboxilico activado" significa un derivado funcional de un ácido carboxilico que es más reactivo que el ácido carboxilico original, en particular, con respecto a sustitución de acilo nucleof lico . Ácidos carboxilicos activados incluyen pero no se limitan a haluros ácidos (tales como cloruros ácidos), anhídridos, amidas y ásteres . El término "reactivo" o "activado", cuando se usa en conjunto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto es contrario a aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción altamente imprácticas para reaccionar (es decir., un grupo "no reactivo" o "inerte") . Los términos "protegido" o "grupo que protege" o "grupo protector", se refieren a la presencia de una porción (es decir, el grupo protector) , que previene o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo a ser protegido, así como también las condiciones de reacción a ser empleadas y la presencia de grupo protectores o reactivos adicionales en la molécula, si los hay. Grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene et al., supra. Como se usa en este documento, el término "grupo funcional" o cualquier síntoma del mismo, significa abarcar formas protegidas del mismo. El término "espaciador" o "porción espadadora" es usado en este documento, para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente usados para enlazar porciones de interconexión tales como un término de una porción de polímero soluble en agua y un grupo funcional. Las porciones espadadoras de la invención pueden ser hidroliticamente estables o pueden incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. "Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que varia típicamente desde aproximadamente 1 hasta 20 átomos de longitud. Tales cadenas de hidrocarburos son preferiblemente, pero no necesariamente, saturadas y pueden ser cadenas ramificadas o rectas, aunque típicamente se prefiere la cadena recta. Grupos alquilo ejemplares incluyen etilo, propilo, butilo, pentilo, l-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se usa en este documento, "alquilo" incluye cicloalquilo, en donde son referenciados tres o más átomos de carbono. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena recta o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, iso-butilo, tere-butilo. "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, que incluye, compuestos espiro cíclicos, fusionados o de puentes, preferiblemente elaborados de 3 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente 3 hasta aproximadamente 8. "Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando se presentan en una molécula, son típicamente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula. El término "sustituido"" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a una porción, (por e emplo, un grupo alquilo) , sustituido con uno o más sustituyentes no interferentes, tales como, pero no limitados a: cicloalquilo C3-CB, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior (por ejemplo, fenilo 0-2 sustituido); fenilo sustituido; y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos no interferentes como un sustituyente . Para sustituciones en un anillo fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para) . "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo Ci-C2o (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, benciloxi, etc.), preferiblemente Ci-C8. "Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono en el núcleo. Arilo incluye anillos de arilo múltiples que puede estar fusionados, como en naftilo o no fusionados como en bifenilo. Anillos de arilo pueden también estar fusionados o no fusionados con uno o más anillos hidrocarburos cíclicos, heteroarilo o heterocíclicos . Como se usa en este documento, "arilo" incluye heteroarilo. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene desde uno hasta cuatro heteroatomos, preferiblemente N, 0 u S, o una combinación de los mismos. Anillos de heteroarilo pueden también estar fusionados con uno o más anillos hidrocarburos cíclicos, heterocíclicos, arilo o heteroarilo . "Electrófilo" se refiere a un ión o átomo o colección de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrofílico, es decir, un centro que está buscando electrón o capaz de reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" se refiere a un ión o átomo o colección de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleofílico, es decir, un centro que está buscando un centro electrofílico o capaz de reaccionar con un electrófilo . Un enlace "fisiológicamente desdobable" o "hidrolizable" o "degradable", es un enlace relativamente débil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizable) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace para hidrolizar en agua, dependerá no solamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes adjuntos a estos átomos centrales. Enlaces débiles o hidroliticamente inestables apropiados incluyen, pero no se limitan a, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acétales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, ortoésteres y oligonucleótidos . Un "enlace enzimáticamente desdobable" significa un enlace que es sometidos a degradación por una o más enzimas . Un enlace o unión "hidrolíticamente estable", se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, este es sustancialmente estable en agua, es decir, no se somete a hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en cualquier extensión apreciable sobre un periodo prolongado de tiempo. Ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen pero no se limitan a los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas) , éteres, amidas, uretanos, y similares. De manera general, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una proporción de hidrólisis de menos de aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las proporciones de hidrólisis de enlaces químicos representativos, se pueden encontrar en la mayoría de los libros de texto de química estándar. "Multifuncional" o "multisubstituido" en el contexto de un polímero de la invención, significa un polímero que tiene 2 ó más grupos funcionales contenidos en este, en donde los grupos funcionales pueden ser los mismos o diferentes. Polímeros multifuncionales de la invención típicamente contendrán desde aproximadamente 2-100 grupos funcionales, o desde 2-50 grupos funcionales, o desde 2-25 grupos funcionales, o desde 2-15 grupos funcionales, o desde 3 hasta 10 grupos funcionales, o contendrán 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro de la estructura de polímero. Un polímero "difuncional" o "disustituido" significa un polímero que tiene dos grupos funcionales contenidos en este, ya sea el mismo (es decir, homodifuncional) o diferente (es decir, heterodifuncional) . Un polímero "monofuncional" o "monosustituido" significa un polímero que tiene un grupo funcional contenido en este (por ejemplo, un polímero a base de mPEG) . Un reactivo básico o acídico descrito en este documento incluye formas de sales neutrales, cargadas y cualesquiera correspondientes de las mismas. El término "paciente" se refiere a un organismo viviente que sufre de o propenso a una condición que puede ser prevenida o tratada por administración de un conjugado, e incluye tanto humanos como animales . "Opcional" u "opcionalmente", significa que la circunstancia subsecuentemente descrita puede o no puede ocurrir, de manera que la descripción incluye casos en donde ocurren circunstancias y casos en donde no ocurren. A menos que se indique de otro modo, el peso molecular es expresado en este documento como peso , ,. ¦ YNiMi molecular promedio (Mn) , el cual es definido como en donde Ni es el número de moléculas poliméricas (o el número de moles de aquellas moléculas) que tienen peso molecular Mi. Cada uno de los términos "fármaco", "molécula biológicamente activa", "porción biológicamente activa", "agente activo", y "agente biológicamente activo", cuando se usan en este documento, significan cualquier sustancia la cual puede afectar cualquiera de las propiedades físicas o bioquímicas de un organismo biológico, que incluye pero no se limita a virus, bacterias, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se usa en este documento, moléculas biológicamente activas incluyen cualquier sustancia propuesta para diagnóstico, alivio de curación, tratamiento, o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o para otros me oramientos físicos o bienestar mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, tintes, lípidos, nucleósidos, oligonucleósidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y miscelios. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuadas para uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, fungicidas, agentes anti-virales, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumorales, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esferoidales y similares. Como se usa en este documento, ,??? peptídico", se refiere a una estructura de polímero sustancialmente libre de enlaces peptídicos. Sin embargo, la estructura de polímero puede incluir un número menor de enlaces peptídicos espaciados a lo largo de la longitud de la estructura, tal como, por ejemplo, no más de aproximadamente 1 enlace peptídico por aproximadamente 50 unidades monoméricas. El término "conjugado" está propuesto para referirse a la entidad formada como un resultado de la unión covalente de una molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa, a una molécula polimérica reactiva, preferiblemente poli (etilen glicol) . "Eluado" se refiere a una solución que ha pasado a través de una columna de cromatografía (es decir, una corriente de efluente) . "Eluente" se refiere a la fase móvil utilizada durante una separación cromatográfica. "Pre-columna" y "primera-columna"', son usados intercambiablemente en este documento y se refieren a una cromatografía en columna única, así como también a dos o más columnas conectadas en serie, que sirven como la "pre-columna" o "primera columna". Además, los términos "columna principal" y "segunda columna", son usados intercambiablemente en este documento y se refieren a una cromatografía en columna única, así como también a dos o más columnas conectadas en serie, que sirven como la "columna principal" o "segunda columna".

II. Método para Preparar Polímeros Funcionalizados Usando Material iniciador de Poliol Polimérico En un aspecto, la presente invención proporciona un método para formar reactivos poliméricos funcionalizados, particularmente, reactivos poliméricos monofuncionales, usando materiales iniciadores de poliol polimérico, tales como di idroxi PEG, en lugar de materiales iniciadores mPEG costosos, difíciles de purificar conocidos en la técnica. El método de la invención involucra hacer reaccionar el material iniciador de poliol polimérico con un reactivo de funcionalización que comprende un grupo funcional, -Y. El reactivo de funcionalización es capaz de reaccionar, en una o más etapas, con el poliol para formar una pluralidad de polímeros sustituidos, cada uno que comprende un número variante de grupos -Y. La reacción se lleva a cabo típicamente bajo condiciones efectivas para producir una mezcla de un polímero insustituido (es decir, el poliol polimérico original) , un polímero monosustituido (es decir, un polímero que tiene un grupo Y único), y uno o más polímeros multisustituidos (por ejemplo, un polímero disustituido que tiene dos grupos Y) , caracterizados por una diferencia relativamente amplia en el contenido del producto monosustituido y el (los) producto (s) multisustituidos. La mezcla de productos poliméricos es sometida a una etapa de purificación para separar los componentes de la mezcla y proporcionar un polímero monosustituido sustancialmente libre de las especies de polímero insustituidas y multisustituidas. Realizar el proceso de purificación/separación mientras el polímero monosustituido deseado y las especies de polímeros multisustituidas están presentes en diferentes concentraciones, hace la separación más fácil y es posible la formación de reactivos poliméricos monofuncionales altamente puros. En esencia, controlar la extensión a la cual la reacción de funcionalización se permite proceder, se usa como un medio para mejorar y simplificar la separación de las especies poliméricas formadas en la reacción. El procedimiento de la presente invención es particularmente bien adecuado para uso con reactivos de funcionalización que logran grupos funcionales ionizables al polímero y procesos de separación adaptados para la separación basada en diferencias en cargas . Para propósitos de ilustrar una o más ventajas de la invención, se considera el uso de un material iniciador dihidroxi PEG. El comienzo de una reacción de dihidroxi PEG con un reactivo de funcionalización que comprende una amina protegida o ácido carboxílico protegido, resultará en la formación de una especie de polímero monosustituido (por ejemplo, un polímero que tiene un grupo amino libre o protegido único o ácido carboxílico libre o protegido) y especies de polímero disustituidas (por ejemplo, un polímero que tiene dos grupos amina protegidos o ácido carboxílico protegidos) . Como el número de moles de polímeros mono y disustituidos incrementa, el número de moles del material iniciador de diol PEG original disminuirá concomitantemente . El rendimiento teórico de especies de polímeros monosustituidas y disustituidas expresado como un % de sustitución (es decir, por ciento en mole) se muestra en la Figura 1. Como se muestra, el producto monosustituido alcanza un máximo teórico de 50% y después declina conforme el porcentaje del producto disustituido continuamente declina. La cantidad de material iniciador diol PEG insustituida declina continuamente conforme la reacción procede . En una o más modalidades de la presente invención, la reacción se deja proceder hasta que se forma una cierta cantidad predeterminada de especies de polímeros monosustituidos y disustituidos. Esta cantidad predeterminada se selecciona basada en la disparidad en la concentración del producto monosustituido y el producto disustituido. Detener la reacción en un punto caracterizado por una gran diferencia en la concentración del producto monosustituido y el producto disustituido (por ejemplo, cuando la mezcla de reacción comprende 25.5% de producto monosustituido y solamente 2.25% de producto disustituido), es más fácil la separación o purificación de la mezcla de polímero. Como se indicó anteriormente, esto es particularmente cierto cuando se utilizan grupos xonizables que permiten la separación de la mezcla de polímero basada en diferencias en cargas. Una vez que la reacción de funcionalización termina (por ejemplo, enfriamiento o agotamiento de reactivo) en el punto deseado, la separación de la mezcla puede tomar lugar y el polímero monosustituido purificado puede entonces ser usado, opcionalmente después de la funcionalización adicional, por cualquiera de un número de propósitos (por ejemplo, para formar un conjugado con un agente biológicamente activo) . La funcionalización adicional se puede llevar a cabo sometiendo el polímero monosustituido purificado a etapas de reacción adicionales para formar otros reactivos poliméricos activos útiles, tales como la formación de ásteres activos a partir de polímeros terminados en ácido carboxílico o la formación de maleimidas a partir de polímeros terminados en amina. Ejemplos de grupos funcionales adecuados que pueden ser formados en el polímero purificado final incluyen hidroxilo, éster activo (por ejemplo, N-hidroxisuccinimidil éster y 1-benzotriazolil éster) , carbonato activo (por ejemplo, N-hidroxisuccinimidil carbonato, 1-benzotriazolil carbonato, y p-nitrofenil carbonato) , acetal, aldehido que tiene una longitud de carbono de 1 a 25 carbonos (por ejemplo, acetaldehido, propionaldehído y butiraldehído) , hidrato de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácidos alcanoicos que tienen una longitud de carbono (que incluye el carbono carbonilo) de 1 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono (por ejemplo, ácido carboxílico, carboximetilo, ácido propanoico y ácido butanoico) , haluro ácido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato. Grupos funcionales ejemplares se discuten en las siguientes referencias: N-succinimidilcarbonato (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (véase por ejemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Véase por ejemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionato y succinimidil butanoato (véase, por ejemplo, Olson et al. in Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997; Véase también, Patente Estadounidense No. 5,672,662), succinimidil succinato (Véase, por ejemplo, Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys . 7:175 (1984) y Joppich et al., Makromol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,670,417), benzotriazol carbonato (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,650, 234), glicidil éter (véase, por ejemplo, Pitha et al., Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (véase por ejemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), p-nitrofenil carbonato (véase, por ejemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech.., 11:141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (véase, por ejemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente Estadounidense No. 5,824,784, Patente Estadounidense No. 5,252,714), maleimida (véase, por ejemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (véase, por ejemplo, Woghiren, et al. Bioconj . Chem. 4:314 (1993)), acrilol (véase, por ejemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,900,461). Si se desea un polímero de extremo tapado monofuncional, el método de la invención puede también incluir una etapa de alquilación, la cual puede ocurrir ya sea antes o después que el material iniciador de poliol de polímero se hace reaccionar con el agente de funcional!zación. Preferiblemente, la etapa de alquilación opcional ocurre después de la reacción de funcionalización de manera que la etapa de funcionalización permanece en la etapa de control en el proceso, que determina las concentraciones relativas del producto de polímero monosustituido comparadas con las especies de polímeros disustituidos u otros multisustituidos . Si la etapa de alquilacion se realiza antes de la reacción con el reactivo de funcionalización, entonces la etapa de alquilacion comienza la reacción de control que determina la disparidad deseada en el contenido de polímero monosustituido contra el contenido de polímero disustituido. Alternativamente, la etapa de alquilacion se puede evitar utilizando una mezcla polimérica de un diol polimérico y su forma monoalquilada (por ejemplo, mPEG) , si tales mezclas que tienen un balance apropiado de los dos componentes son fácilmente disponibles . Como se discute en mayor detalle abajo, el grupo funcional, Y, es preferiblemente un grupo funcional ionizable. Grupos funcionales ionizables ejemplares incluyen grupos amina y ácido carboxílico. Ejemplos de otros grupos funcionales adecuados incluyen hidrato de aldehido, hidrato de cetona, amida, hidrazina, hidrazida, tiol, fenol, oxima, otros ácidos alcanoicos que tienen una longitud de carbón (que incluye el carbono carbonilo) de 1 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono (por ejemplo, carboximetilo, ácido propanoico y ácido butanoico) , ditiopiridina y vinilpiridina.

A. Materiales iniciadores de Folióles Se puede usar un poliol polimérico en la presente invención y puede comprender cualquier polímero soluble en agua y no peptidico que tiene al menos, dos grupos hidroxilo covalentemente unidos a este. Preferiblemente, el diol polimérico es un diol (es decir, un polímero que tiene dos grupos hidroxilo unidos a este) ; sin embargo, los polioles que contienen más de 2 grupos hidroxilo pueden ser utilizados, tales como los polioles que comprenden aproximadamente 3-100 grupos hidroxilo, o desde 3-50 grupos hidroxilo, o desde 3-25 grupos hidroxilo, o desde 3-15 grupos hidroxilo, o desde 3 hasta 10 grupos hidroxilo, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 grupos hidroxilo unidos al polímero. Aunque los grupos hidroxilo están preferiblemente unidos a los términos del polímero, los grupos hidroxilo pueden también estar unidos al polímero como cadenas laterales en la forma pendiente. El polímero no debe ser biocompatible y tóxico, significando que el polímero es capaz de coexistir con tejidos u organismos vivientes sin causar peligro. Cuando se refiere al poliol polimérico, se entiende que el polímero puede ser cualquiera de un número de polímeros solubles en agua y no peptídicos, tales como aquellos descritos en este documento como adecuados para uso en la presente invención. Preferiblemente, poli (etilenglicol) (es decir, PEG) , es el poliol polimérico. El término PEG incluye poli (etilenglicol) en cualquiera de un número de geometrías o formas, que incluyen formas lineales, formas ramificadas o de ramas múltiples (por ejemplo, PEG bifurcados o PEG unidos a un núcleo poliol) , PEG pendiente o PEG con enlaces degradables en este, a ser más completamente descritos abajo. Moléculas PEG ramificadas o multi-brazos, tales como aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 5,932,462, pueden ser usadas como el polímero PEG. Hablando de manera general, un polímero ramificado o multi-brazos posee dos o más "brazos" de polímero que se extienden desde un punto de rama central (por ejemplo, C en la Fórmula II abajo) . Por ejemplo, un polímero PEG ramificado ejemplar tiene la estructura: PEG^ Fórmula I en donde PEGi y EG2 son polímeros PEG en cualquiera de las formas o geometrías descritas en este documento, y los cuales puede ser los mismos o diferentes, y 1/ es un enlace íiidrolíticamente estable. Un PEG ramificado ejemplar de Fórmula I tiene la estructura: polia p R"— C I polib — Q Fórmula II en donde: polia y polib son estructuras PEG, tal como metoxi poli (etilenglicol) ; " es una porción no reactiva, tal como H, metilo o una estructura PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una modalidad preferida, el polímero PEG ramificado es lisina disustituida de metoxi poli(etilen glicol) . La estructura PEG ramificada de Fórmula II puede estar unida a una tercera cadena de oligómero o polímero como se muestra abajo: Fórmula III en donde PEG3 es una tercera cadena de oligómero o polímero PEG, la cual puede ser la misma o diferente de PEGi y PEG2. El polímero PEG puede alternativamente comprender un PEG bifurcado. Hablando de manera general, un polímero que tiene una estructura bifurcada es caracterizado por tener una cadena de polímero unida a dos o más grupos funcionales vía enlaces covalentes que se extienden desde un punto ramificado hidrolíticamente estable en el polímero. Un ejemplo de PEG bifurcado está representado por PEG-L-CHI2, en donde L es un grupo enlazado y Y es un grupo funcional. Cada grupo Y está enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. La Patente Estadounidense No. 6,362,254 describe varias estructuras PEG bifurcadas capaz de usarse en la presente invención. La cadena de átomos que enlazan los grupos Y funcionales al átomo de carbono ramificado sirve como un grupo atador y puede comprender, por ejemplo, una cadena de alquilo, enlace de éter, enlace de éster, enlace de amida o combinaciones de los mismos . Como se notó anteriormente, el polímero PEG puede comprender una molécula PEG pendiente que tiene grupos reactivos, tales como hidroxilo, covalen emente unido a lo largo de la longitud de la estructura PEG en lugar del extremo de la cadena PEG. Los grupos reactivos pendientes pueden estar unidos a la estructura PEG directamente o a través de una porción de enlace, tal como un grupo alquileno . Además a las formas descritas anteriormente de PEG, el polímero puede también estar preparado con uno o más enlaces degradables o hidrolíticamente estables en la estructura del polímero, que incluye cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, PEG puede ser preparado con enlaces de éster en la estructura del polímero que se someten a hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en desdoblamiento del polímero en fragmentos de peso molecular bajo: -PEG-C02-PEG- +H20 *- -PEG-C02H + HO-PEG- Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como un enlace degradable dentro de una estructura de polímero, incluyen enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(l):582-3 (1997)); enlaces de éster de fosfato formados, por ejemplo, al hacer reaccionar un alcohol con un grupo de fosfato; enlaces de hidrazona los cuales son típicamente formados por reacción de una hidrazina y un aldehido; enlaces de acetal que están típicamente formados por reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de orto éster que son, por ejemplo, formados por reacción entre un formiato y un alcohol; y enlaces de oligonucleótido formados por ejemplo, mediante un grupo de fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que el término poli(etilen glícol) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG. Cualquiera de una variedad de otros polioles poliméricos que comprenden otras cadenas de polímeros solubles en agua no peptídicas pueden también ser usadas en la presente invención. El poliol polimérico puede ser lineal, o puede estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente (por ejemplo, ramificadas, bifurcadas y similares) . Ejemplos de polímeros adecuados incluye, pero no se limitan a, otro poli (alquilen glicoles) , copolímeros de etilen glicol y propilen glicol, poli (alcohol olefinico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxial uilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (ácido a-hidroxi) , poli (ácido acrilico) , poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,629,384 y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos . Diferentes polímeros pueden ser incorporados en la misma estructura de polímero. Por ejemplo, uno o más de las moléculas PEG en las estructuras ramificadas muestran en las Fórmulas I-III que pueden ser reemplazadas con un tipo de polímero diferente. Cualquier combinación de polímeros no peptídicos, solubles en agua es abarcada dentro de la presente invención. El peso molecular del poliol polimérico variará dependiendo de la aplicación deseada, la configuración de la estructura del polímero, el grado de ramificación y similares. Generalmente, los polímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 Da hasta aproximadamente 180,000 Da son útiles en la presente invención, preferiblemente aproximadamente 500 Da hasta aproximadamente 60,000 Da, y más preferiblemente aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 40,000 Da. Modalidades de polímero ejemplar tienen un peso molecular de aproximadamente 1,000 Da, 2,000 Da, 3,000 Da, 4,000 Da, 5,000 Da, 7,500 Da, 10,000 Da, 15,000 Da, 20,000 Da, 25,000 Da, 30,000 Da, 35,000 Da y 40,000 Da. El poliol polimérico es típicamente disuelto en agua o un solvente orgánico antes de la reacción de funcionalización discutida a bajo. Puede ser utilizado cualquier solvente orgánico compatible con polímeros del tipo usado en la presente invención, tales como tolueno, xileno, benceno, diclorometano, cloroformo, acetonitrilo, tetrahidrofurano o acetona. Pueden ser usadas mezclas de los solventes anteriores u otros solventes similares conocidos en la técnica.

B. Reacción de Funcionalización Las etapas o etapa de reacción usadas para hacer reaccionar un reactivo de funcionalización con el poliol polimérico pueden variar dependiendo de un número de factores, que incluyen el tipo de grupo funcional involucrado, el tipo y configuración del polímero, y sucesivamente. La naturaleza exacta de la secuencia de reacción no es critica a la presente invención y cualquier método conocido de polímeros de funcionalización del tipo usado en la presente invención puede ser utilizado sin apartarse de la invención. Como se notó anteriormente, en una modalidad,- la reacción de funcionalización es únicamente dejada para proceder bajo condiciones efectivas para producir una mezcla del producto caracterizada por una diferencia amplia en las concentraciones del producto monosustituido y el di-u otros productos multisustituidos . Preferiblemente, la reacción es también conducida bajo condiciones efectivas para producir un contenido relativamente bajo de producto multisustituido . Para lograr la disparidad de contenido deseado, la reacción entre el material iniciador de poliol y el reactivo de funcionalización puede ser detenida o enfriada rápidamente en el tiempo apropiado usando cualquier método conocido en la técnica, tal como por parámetros de procesos rápidamente cargados (por ejemplo, temperatura o grado de mezclado) o por control cuidadoso de la cantidad de reactivos, con ello controlando la reacción en una base estequiométrica. El tiempo apropiado para detener o enfriar rápidamente la reacción puede ser determinado obteniendo muestras periódicas de la mezcla de reacción y determinar la cantidad de especies presentes (por ejemplo, por métodos cromatográficos, métodos de RMN y sucesivamente) o midiendo un parámetro (por ejemplo, pH) conocido por tener correlación con la cantidad de especies presentes- De forma alternativa, si una deficiencia significante del reactivo de funcionalización es cargada, la reacción únicamente procederá a conversión parcial del diol. En este ejemplo, la reacción puede ser dejada para proseguir con la terminación. En tal caso, conocer la estequiometria de los reactivos permite la estimación de los componentes composicionales finales cuando se hace referencia a la Figura 1. La reacción es generalmente realizada bajo condiciones efectivas para formar no más de aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido. Las reacciones permitidas para continuar pasando este punto resultan en polímeros disustituidos estando presentes en una cantidad mayor que el polímero monosustituido, con el resultado que la separación llega a ser ineficiente en aumento. Mientras no más de aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido es típicamente dejado para formar, a menudo se prefiere que el porcentaje de la formación de polímero disustituido sea abarcado en uno o más de los intervalos siguientes: no más de aproximadamente 40 por ciento; no más de aproximadamente 35 por ciento; no más de aproximadamente 30 por ciento; no más de aproximadamente 25 por ciento; no más de aproximadamente 20 por ciento; no más de aproximadamente 15 por ciento; no más de aproximadamente 12 por ciento, y no más de aproximadamente 10 por ciento. En ciertas modalidades, no se formó más de aproximadamente 8 por ciento, preferiblemente no más de aproximadamente 5 por ciento, más preferiblemente no más de aproximadamente 2 por ciento y más preferiblemente no más de aproximadamente 1 por ciento del polímero disustituido. En ciertas modalidades, la reacción de funcionalización resulta en una relación de polímero monosustituido hasta polímero disustituido de aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 40:1, preferiblemente aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 20:1, y más preferiblemente aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 18:1. Típicamente, la mezcla de polímero funcionalizado final comprenderá aproximadamente 8 por ciento hasta aproximadamente 50 por ciento del polímero monosustituido, preferiblemente aproximadamente 8 hasta aproximadamente 45 por ciento, y más preferiblemente aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 por ciento. La mezcla de polímero funcionalizado final típicamente comprenderá aproximadamente 1 hasta aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido, preferiblemente aproximadamente 1 hasta aproximadamente 12 por ciento, y más preferiblemente aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 por ciento. De manera general, la mezcla de polímero funcionalizado final comprenderá aproximadamente 10 hasta aproximadamente 91 por ciento del poliol polimérico insustituido original, preferiblemente 43 hasta aproximadamente 91 por ciento, más preferiblemente aproximadamente 65 hasta aproximadamente 91 por ciento . La reacción de funcionalización típicamente comprende una reacción de sustitución nucleofílica o una reacción de adición nucleofílica (por ejemplo, una reacción de adición Michael) , en donde el nucleófilo puede estar presente en el polímero o el reactivo de funcionalización. Por ejemplo, la reacción puede involucrar la reacción de un grupo hidroxilo del poliol polimérico, o un anión del mismo, como un nucleófilo con un grupo electrofílico adecuado. De forma alternativa, los grupos hidroxilo del poliol polimérico pueden ser convertidos en buenos grupos salientes, tales como ésteres de sulfonato, y se hacen reaccionar con un reactivo de funcionalización que contiene un grupo nucleofílico . El reactivo de funcionalización, típicamente comprenderá un grupo reactivo, X, que es ya sea un grupo electrofílico reactivo con un grupo hidroxilo o anión del mismo en el poliol polimérico o, si alguno o todos los grupos hidroxilo del poliol se han convertido a buenos grupos salientes, un grupo nucleofílico. El reactivo de funcionalización también comprenderá el grupo funcional, Y, que se presente sea covalentemente unido al polímero. Opcionalraente, el reactivo de funcionalización además comprenderá una porción espacial enlazada al grupo reactivo, X, con el grupo funcional, Y. Porciones especiales ejemplares incluyen -C(0)-, -C (0) -NH-, -NH-C(O)- H-, -0-C(0)-NH-, -C(S)-, -C¾-, -CH2-C¾-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -CH2-0-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2~CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2- , -CH2-CH2-CH2-C¾-0-, -C(O) -NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C (O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-C (0) -NH-, -C (0) - H-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C (0) -NH-C¾-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-, -C (0) -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C¾-C (O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-, -C (O) -O-CH2- , -CH2-C(0)-O-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -0-CH2-, -C (0) -0-CH2-CH2-, -NH-C (0) -CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C (0) -CH2-, -NH-C (O) -CH2-CH2-, -CH2-NH-C (0) -CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C (0) -CH2-CH2-, C (0) -NH-CH2- , -C (0) -NH-CH2-C¾-, -0-C (O) -NH-CH2-, -0-C(0)-NH-C¾-CH2-, -NH-CH2-, - H-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2- CH2-NH-CH2- , -C(0)-CH2-, -C(0) -CH2-CH2- , -CH2-C (0) -CH2-, -CH2-CH2-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-CH2-, -C¾-CH2-C (0) -, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -C¾-CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2-NH-C (0) -CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (0) - H-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-CH2-, -0-C (O) -NH- [CH2] h~ (OCH2CH2)-j-, grupo cicloalquilo bivalente, -0-, -S-, un aminoácido, -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en donde R6 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, ( ) es cero a seis, y (j) es cero a 20. Otras porciones espaciadoras especificas tienen las siguientes estructuras: -0-C(0)-NH-(CH2)i_5-NH-C(0)-, - H-C (0) -NH- (CH2) 1-6-NH-C (O) y -0-C (0) -NH- (C¾) 1-6-NH-C (0) -, en donde los valores de subíndice después de cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)i-6 significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las porciones espaciadoras anteriores pueden además incluir una cadena de oligómero de óxido de etileno que comprende hasta 20 unidades de monómeros de óxido de etileno [es decir, - (CH2CH20) 1-20] · Esto es, la cadena de oligómero de óxido de etileno puede originarse antes o después de la porción espaciadora, y opcionalmente entre cualquiera de dos átomos de una porción espaciadora comprendida de dos o más átomos. También, la cadena de oligómero no es considerada parte de la porción espaciadora si el oligómero es adyacente a un segmento polimérico y solamente representa una extensión del segmento polimérico. En una o más modalidades, el reactivo de funcionalización tiene la siguiente estructura: X-(CRiR2)m-Y FórmulaIV en donde: X es un grupo reactivo con un grupo hidroxilo o anión del mismo, o un buen grupo saliente, en una reacción de adición nucleofilica o sustitución nucleofilica; ¾ y R2 son cada uno H o alquilo independientemente seleccionados; m es 0-10 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10), preferiblemente 1-3; y Y es un grupo funcional, opcionalmente en forma protegida, y preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de tales como hidrato de aldehido, hidrato de cetona, amida, amina, hidrazina, hidrazida, tiol, ácido carboxilico, ditiopiridina, vinilpiridina, fenol y oxima. El grupo reactivo X es preferiblemente un buen grupo saliente, tal como halógeno (por ejemplo, bromo o cloro) o éster de sulfonato (por ejemplo, p-tolilsulfonilo, metilsulfonilo, trifluorosulfonilo o trifluoroetilsulfonilo) , o un grupo vinilo sustituido o insustituido . El grupo o grupos sustituyentes unidos a los átomos de carbono del grupo vinilo son típicamente alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido o halógeno.

En una o más modalidades, X es halógeno, m es 0, y Y es p-tolilsulfonilo, metilsulfonilo, trifluorosulfonilo o trifluoroetilsulfonilo. Otros reactivos de funcionalización ejemplares de fórmula IV incluyen X'-( CRiCR2 ) m-C(0)-0-Rp, C¾=CY' - (CRiCR2) m-C (0) -O-Rp, X' - ( CRiCR2 ) m- Z , CH2=CY' - ( CRiCR2 ) m-Z , X' - ( CRiCR2 ) m~CN y C¾=CY' - ( CRiCR2 ) ra-CN, en donde Xr es Br o Cl, Z es un orto éster, Yr es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi o alcoxi sustituido y Rp es alquilo o alquilo sustituido. Si el grupo funcional, Y, del reactivo de funcionalización es la forma protegida, el método de la invención además comprende desproteger el grupo funcional. Por ejemplo, si el grupo Y es un ácido carboxilico protegido (por ejemplo, un otro éster o un alquil éster) , la etapa de desprotección comprende hidrólisis del grupo protector para formar el ácido carboxilico. Un grupo de ácido carboxilico ejemplar protegido tiene la estructura -C(0)-0-Rp, en donde Rp es un grupo alquilo o alquilo sustituido. Ácidos carboxilicos protegidos incluyen: ásteres, tales como éster de metilo, éster de metoximetilo, éster de metiltiometilo, éster de tetrahidropiranilo, éster de benciloximetilo, éster de feniacilo, éster de n-ftalimidometilo, éster 2,2,2-tricloroetilo, éster de 2-haloetilo, éster 2- (p-toluensulfinil) etilo, éster de t-butilo, éster de cinamilo, éster de bencilo, éster de trifenilmetilo, éster bis (o-nitrofenil) metilo, éster 9-antrilmetilo, éster 2- (9,10-dioxo) antrilmetilo, éster de piperonilo, éster de trimetilsililo, éster de t-butildimetilsililo y éster de S-t-butilo; tioésteres, tales como metiltiol, etiltiol, feniltiol, p-snitrofeniltiol, benciltiol y t-butiltiol; amidatos tales como O-alquil-N-alquilo, O-aril-N-alquilo, O-alquil-N-arilo, O-aril-N-arilo, 2-sustituida-l, 3-oxazolinas, 2-sustituida-l, 3- (4H) -dihidrooxazinas; tioamidas, tales como S-alquil-N-alquilo, S-aril-N-alquilo, S-alquil-N-arilo, S-aril-N-arilo, 2-sustituida-l, 3-tiazolinas, 2-sustituida-l , 3- (4H) -1, 3-dih.idrotiazinas; amidas e hidrazidas tales como ?,?-dimetilamida, N-7-nitroindoilamida, hidrazida, N-fenilhidrazida, ?,?' -diisopropilhidrazida . Si el grupo Y es una amina protegida (por ejemplo, grupo carbonitrilo) , la etapa de desprotección puede comprender reducir el grupo carbonitrilo para formar la amina. De forma alternativa, se pude considerar que el grupo carbonitrilo como un ácido carboxilico protegido y la desprotección, podría involucrar hidrólisis. Las aminas protegidas incluyen: carbamatos tales como 9-fluorenilmetilo, 9- (2-sulfo) fluorenilmetilo, 9- (2, 7-dibromo) fluorenilmetilo, 17-tetrabenzo {a,c,g,x\ fluorenilmetilo, 2-cloro-3-indenilmetilo, benz [f] inden-3-ilmetilo, 2, 7-di-t-butil- [9- (10, 10-dioxo-lO, 10, 10, 10-tetrahidrotioxantil) ]metilo, 1,1-dioxobenz [b] tiofen-2-ilmetilo, 2, 2, 2-tricloroetilo, 2-trimetilsilietilo, 2-feniletilo, 1- (1-adamantil) -1-metiletilo, 2-cloroetilo, 1, l-dimetil-2-haloetilo, 1,1-dimetil-2,2-dibromoetilo, 1, l-dimetil-2, 2, 2-tricloroetilo, 1-metil-l- (4-bifenilil) etilo, 1- (3, 5-di- t-butilfenil) -1-metiletilo, 2- (2' y 4' -piridil) etilo, 2,2-bis(4f-nitrofenil) etilo, N- (2-pivaloilamino) -1, 1-dimetiletilo, 2- [ (2nitrofenil)ditio]-l-feniletilo, 2- (?,?-diciclohexilcarboxamido) etilo, t-butilo, 1-adamantilo, 2-adamantilo, vinilo, alilo, cinnamilo, 2-3' -piridil-prop-2-enilo, 8-quinolilo, N-hidroxipiperidinilo, alquilditio, p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, 2,4-diclorobencilo, 4-metilsulfinilbencilo, 9-antrilmetilo, difenilmetilo, 2-metiltioetilo, 3-metilsulfoniletilo, 2- (p-toluensulfonil) etilo, [2- (1, 3-ditianil) ]metilo, 4-metiltiofenilo, 2, 4-dimetiltiofenilo, 2-fosfonioetilo, 1-metil-1- (trifenilfosfonio) etilo, 1, l-dimetil-2-cianoetilo, 2-dansiletilo, 2- (4-nitrofenil) etilo, 4-fenilacetoxibencilo, 4-azidobencilo, 4-azidometoxibencil, ??-cloro-p-aciloxibencilo, p- (dihidroxiboril) bencilo, 5-bencisoxazolilmetilo, 2- (trifluorometil) -6-cromonilmetilo, ís-nitrofenilo, 2, 5-dimetoxibencilo, 1-metil-l- (3, 5-dimetoxifenil) etilo, -metilnitropiperonilo, o-nitrobencilo, y 3, 4-dimetoxi-6-nitrobencilo; derivados tipo urea tales como derivado de fenotiazinil- (10) -carbonilo, Nf -p-toluensulfonilaminocarbonilo, N' -fenilaminotiocarbonilo; amidas tales como N-formilo, N-cloroacetilo, N-tricloroacetilo, N-trifluoroacetilo, N-fenilacetilo, ?-3-fenilpropionilo, ?-4-pentenoilo, N-picolinoilo, ?-3-piridilcarboxamido, derivado de N-benzoilfenilalanilo, N-p-fenilbenzoilo, N-o-nitrofenilacetilo, N-o-nitrofenoxiacetilo, N-3- [o-nitrofenil) propionilo, N-2-metil-2- (o-nitrofenoxi) ropionilo, N-3-metil-3-nitrobutirilo, N-o-nitrocinnamoilo, N-o-nitrobenzoilo, N-3- (4-t-hutil-2, 6-dinitrofenil) 2, 2-dimetilpropionilo, N-o- (benzoiloximetil) benzoilo, N-2-metil-2- (o-fenilazofenoxi) propionilo, ?-4-clorobutirilo, N-acetoacetilo, N-3- (p-hidroxifenil) propionilo, (N' -ditiobenciloxicarbonilamino) acetilo, derivado de N-acetilmetionina, y 4, 5-difenil-3-oxazolin-2-ona; derivados de imida cíclicos tales como N-ftaloilo, N-tetracloroftaloilo, ?-4-nitroftaloilo, N-ditiasuccinoilo, N-2, 3-difenilmaleoilo, N-2, 5-dimetilpirrolilo, N-2, 5-bis (triisopropilsiloxi) pirrolilo, N-2, 5-bis (triisopropilsiloxi) pirrolilo, aducto de N-l, 1,4,4-tetrametildisiliazaciclopenano, N-l, 1, 3, 3-tetrametil-l, 3-disilaisoindolilo, 1 , 3-dimetil-l , 3, 5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 1, 3-dibencil-l, 3, 5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 3, 5-dinitro-4-piridonilo 1-sustituido, 1,3,5-dioxazinilo. Estos y otros grupos protectores se describen en detalle en Greene et al., supra. Como se notó anteriormente, en una o más modalidades, los grupos hidroxilo del poliol, o algunas fracciones de los mismos, se convierten a "un buen grupo saliente antes de reaccionar con el reactivo de funcionalización. Por ejemplo, los grupos hidroxilo pueden ser convertidos a un grupo saliente de estructura -Z, en donde Z es halógeno o un éster de sulfonato, haciendo reaccionar el poliol con un reactivo que tiene, por ejemplo, la estructura Xf-S02-R3, en donde R3 es alquilo o alquilo sustituido y X' es Br o Cl . Grupos R3 preferidos incluyen p-tolilo, metilo, trifluorometilo y trifluoroetilo . En esta modalidad, la conversión de los grupos hidroxilo para buenos grupos salientes puede servir como la etapa de control usada para producir la disparidad deseada en concentraciones entre el producto de polímero monosustituido y las especies de polímero multisustituido . Por ejemplo, la reacción para convertir los grupos hidroxilo a buenos grupos salientes, se puede realizar bajo condiciones efectivas para formar no más de aproximadamente 25 por ciento del polímero disustituido (es decir, las especies de polímero que tienen dos grupos hidroxilo convertidos a grupos salientes) y típicamente no más de aproximadamente 12 por ciento del polímero disustituido. En ciertas modalidades , se formó no más de aproximadamente 8 por ciento, preferiblemente no más de aproximadamente 5 por ciento, más preferiblemente no más de aproximadamente 2 por ciento y más preferiblemente no más de aproximadamente 1 por ciento del polímero disustituido. La reacción que convierte grupos hidroxilo a grupos salientes típicamente resulta en una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido de aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 40:1, preferiblemente aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 20:1, más preferiblemente aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 18:1.

C. Etapa de Alquilación Opcional Si se desea un polímero de extremo tapado monofuncional, el proceso de la invención puede incluir una etapa de alquilación, ya sea antes o después de la reacción de funcionalización descrita anteriormente.

Preferiblemente, la etapa de alquilación ocurre después de la reacción de funcionalización, de manera que la reacción de alquilación se puede dejar proseguir a terminación sin la necesidad de controlar la reacción estequiométricamente, como se describe más completamente abajo. Típicamente, la etapa de alquilación ocurrirá antes de cualquier etapa de desprotección si se necesita.

Si la etapa de alquilación se conduce previa a la reacción de funcionalización, entonces la reacción de alquilación comienza a controlar la etapa de reacción que determina la proporción del polímero monosustituido a los productos del polímero disustituido. En esta modalidad, el material iniciador del poliol es sometido a una etapa de alquilación,- formando así una mezcla que comprende un polímero no alquilado, un polímero monoalquilado que comprende un grupo alcoxi único, y un polímero dialquilado que comprende dos grupos alcoxi, bajo condiciones efectivas para formar al menos aproximadamente 25 por ciento en mol del polímero dialquilado. Esta mezcla de polímero entonces se hace reaccionar con un reactivo de funcionalización como se describe anteriormente, para formar una mezcla que comprende un polímero no alquilado que comprende dos grupos Y, un polímero monoalquilado que comprende un grupo Y único, y un polímero dialquilado que comprende grupos no Y. Esta mezcla de polímero puede entonces ser purificada para proporcionar un polímero monoalquilado, monofuncional, sustancialmente libre de las especies de polímeros no alquiladas y dialquiladas. En ciertas modalidades, la reacción de alquilación se deja proceder hasta que al menos aproximadamente 25 por ciento en mol del polímero dialquilado se produce, preferiblemente al menos 65 por ciento en mol, más preferiblemente, al menos aproximadamente 50 por ciento mol, y todavía más preferiblemente, al menos aproximadamente 90 por ciento mol . La etapa de alquilación convierte grupos hidroxilo a grupos alcoxi de fórmula -OR' , en donde R' es un grupo alquilo o alquilo sustituido, tal como alquilo Ci-C2o alquilo C1-C20 sustituido, alquilen-arilo Cx-C2o, Y alquilen-arilo C1-C20. Los grupos R' preferidos incluyen, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, y bencilo. Preferiblemente, la reacción de alquilación comprende tratar el poliol polimérico (si ocurre la etapa de alquilación previa a la funcionalización) o la mezcla polimérica (si la etapa de alquilación ocurre después de la funcionalización) , con cualquiera de los agentes de alquilación conocidos en la técnica, tales como dialquilsulfato, alquilsufonatos (tales como alquil p-toluensulfonato, alquil metansulfonato, alquil trifluorometilsulfonato y alquil trifluoroetilsulfonato) , diazoalcano, haluro de alquilo, dialquil acetal de ?,?'-dimetilformamida, 3-alquil-l-p-toliltriaceno, idróxido de trimetilanilinio, fluoroborato de trialquiloxonio, hexafluorofosfonato de trimetilsulfonio, o tricloroacetimidato de alquilo.

D. Esquemas de Reacción Ejemplares Para ilustrar además ciertas modalidades de varios aspectos de la invención, se proporcionan abajo esquemas de reacción ejemplares. Estos esquemas significan ser representativos; detalles para las siguientes transformaciones y purificaciones particulares, se proporcionan en la sección de Ejemplos. Los esquemas proporcionados abajo pueden extenderse a cualquiera de los polímeros, reactivos de funcionalización, grupos salientes, grupos protectores y modos de purificación, descritos en este documento. El Esquema de Reacción I, demuestra el uso de diol de PEG como un material iniciador (preferiblemente mPEG) , para preparar un mPEG funcional!zado . La introducción de un grupo ionizable, en este caso un carboxilo, proporciona el material PEG adecuado para una separación cromatográfica de intercambio iónico, como se describe en detalle en este documento, para proporcionar mPEG monofuneional que está esencialmente libre de diol e impurezas derivadas de diol. Hablando de manera general, los polímeros monofuncionalizados purificados de la invención, sean de extremo tapado o no, contienen menos de 0.3% en peso, de un polímero difuncional. El material monofuncionalizado mPEG purificado, dependiente de la naturaleza del grupo funcional, es de una pureza adecuada para conjugación a una proteina, molécula pequeña, superficie o similares, o para cualquier otra aplicación farmacéutica, o puede ser además funcionalizado para preparar un reactivo de polímero deseado. (v) Ácido Cromatográficamente Purificado (CP) Esquema de Reacción I En el Esquema de Reacción I, el diol de PEG se usa como un material iniciador. En I(i), el diol de PEG es funcionalizado usando un agente de funcionalización ejemplar, éster metílico del ácido bromo-acético. El reactivo de funcionalización se hace reaccionar con la forma aniónica del diol de PEG para desplazar el halógeno y formar el éster metílico de metileno correspondiente. Como se ilustra en el Esquema de Reacción I(i), uno de los grupos hidroxilo de PEG se convierte al éster metílico de metileno correspondiente. Aunque se muestra como un esquema de reacción simple en el cual solamente un término del polímero es funcionalizado, como se ha descrito en mayor detalle en este documento, el producto de la reacción de funcionalización es realmente una mezcla de material iniciador de diol PEG insustituido, el producto de PEG-OH mono-sustituido deseado, y el éster de PEG disustituido. El progreso de la reacción puede ser monxtoreado para asegurar que la reacción se detenga o apague en el tiempo deseado, aunque usando una cantidad conocida de materiales iniciadores y una cantidad limitada de reactivo de funcionalización detendrá la reacción automáticamente como un resultado del agotamiento del reactivo de funcionalización. Nuevamente, la experimentación de rutina proporcionará la cantidad de reactivo de funcionalización que resulta en las cantidades deseadas de productos. Con referencia a la Figura 1, se puede observar que la formación de 25% de producto monosustituido corresponde a aproximadamente 72% de diol de PEG sin reaccionar y aproximadamente 3% de producto disustituido. Después de la formación de 50% de producto de PEG monosustituido (la cantidad máxima de producto monosustituido que puede ser formada a partir del material de partida de diol) , la mezcla de producto crudo contiene 25% de cada PEG de diol y producto disustituido de PEG. La Figura 1 también demuestra que como la cantidad de producto PEG disustituido en la mezcla de reacción excede 25% , la cantidad de producto monosustituido concomitantemente disminuye. De este modo, la reacción termina (por ejemplo, como un resultado de la supresión del reactivo de funcionalización) o es apagada después de la formación de 25% o menos producto disustituido. El progreso de la reacción puede ser monitoreado usando cualquiera de un número de técnicas analíticas, tales como ¾ RMN o CL¾R. Regresando al Esquema de Reacción I, en I (ii) , la hidrólisis en la mezcla PEG de I (i) , es decir, aquella presente en el material de partida de diol de PEG y el producto monosustituido, son metilados con un grupo protector, por ejemplo, tosilato u otro grupo protector adecuado, seguido por conversión del grupo funcional, en este caso un éster de metilo a un grupo ionizable, -COOH, designado de manera general como Y. El uso de metilo como un grupo de alquilación es preferido cuando se desean materiales funcionales de mPEG. En este punto, la mezcla de reacción contiene dimetoxi PEG neutral (resultante de la etapa de alquilación) , mPEG monofuncional, C¾0 (CH2CH20) n-CH2C0OH (también referido como "ácido carboximetil mPEG") , y PEG difuncional, HOOCCH2 (OCH2CH2) nOCH2COOH, también referido como "bis-carboximetil PEG") . La mezcla es entonces purificada para remover PEG neutral, el cual es nominalmente dimetoxi PEG, pero potencialmente con impurezas neutrales tales como diol de PEG o mPEG-OH y PEG difuncional. Mientras cualquiera de un número de técnicas de purificación adecuadas se puede emplear, se prefiere de manera general, la cromatografía, y en particular, la cromatografía de intercambio iónico. La separación de diol de PEG (opcionalmente en forma alquilada, típicamente referida en este documento como PEG neutral) y PEG disustituido (también referido en este documento como PEG difuncional) del material monofuncional deseado, se hace preferiblemente en una forma secuencial . En el Esquema de Reacción I, el ácido purificado es entonces reducido al alcohol correspondiente para proporcionar mPEG-OH que es extremadamente puro, es decir, el cual en algunos casos, contiene menos de 1% de diol. Aunque el hidruro de aluminio y litio se muestran como el agente reductor, cualquier agente reductor adecuado se puede usar. Ejemplos incluyen brorohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, H2/paladio, trietilboro idruro de litio, HI, metales de alquilo, en amoniaco liquido y zin con ácido o base. En algunos casos, la cantidad de diol o material difuncional presente en el material purificado está por debajo de los limites de detección actuales. Aunque el Esquema de Reacción I ilustra la reducción del ácido carboxilico al alcohol correspondiente para proporcionar mPEG-OH de pureza ultra alta, esta transformación significa ser ilustrativa, y cualquiera de un número de transformaciones subsecuente alternativas del ácido del polímero de puede llevar a cabo. El Esquema de Reacción I puede también ser referido cuando se considera este aspecto de la invención más generalmente. Sin embargo, descripciones detalladas de las variables y ejemplos de las mismas se pueden extender a muchos aspectos de la invención a la cual se aplican. Por ejemplo, cualquier polímero no peptídico soluble en agua puede ser usado en lugar de PEG. Tal polímero está representado de manera general como HO-POLI-OH, en donde POLI es la porción de polímero no peptídico soluble en agua de la molécula. Aunque no se muestra en el Esquema de Reacción I, el método puede incluir opcionalmente una etapa en donde los grupos hidroxilo en el diol de polímero son convertidos a un mejor grupo saliente, Z. Los grupos salientes incluyen halógenos tales como yoduro, cloruro y bromuro, así como también ésteres de sulfonato, -N2+. Los grupos salientes preferidos son grupos que son mejores grupos salientes que -OH. Como se describe previamente para metilación de PEG en la Figura 1, la conversión a un mejor grupo saliente produce una mezcla de productos, de polímero monosustituido, material iniciador de diol de polímero insustituido, sin reaccionar, que tiene un grupo único Z, HO-POLI-Z; y polímero disustituido que comprende dos grupos Z, Z-POLI-Z. Nuevamente, tales transformaciones se llevan a cabo típicamente bajo condiciones efectivas para formar no más de aproximadamente 25% del polímero disustituido. En una etapa subsecuente, el diol de polímero (o la mezcla producida en una etapa de procedimiento opcional para convertir hidroxilos a grupos salientes) , se hace reaccionar en una o más etapas de reacción, con un agente de funcionalización. El reactivo de funcionalización funciona con el polímero en una reacción de substituciónn ucleofílica o adición nucleofílica. El reactivo de funcionalización es empleado para introducción en el polímero de un grupo funcional, más preferiblemente un grupo ionizable, o un precursor de un grupo ionizable, o un grupo ionizable en una forma protegida. En una o más modalidades particulares, el reactivo de funcionalización comprende la estructura X-L-Y, en donde X es un grupo que permite al reactivo de funcionalización reaccionar con el polímero en una reacción de adición o sustitución nucleofilica. Preferiblemente, X es un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónica, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo está unido, o es desplazado por un hidroxilo. L es un enlazador opcional que está interpuesto entre X y Y. L0 indica la ausencia de un enlazador y ¾. indica la presencia de un enlazador, y L abarca ambos. Preferiblemente, L es hidroliticamente estable, y es elaborado de átomos inertes o no reactivos o grupos de átomos de cada una de las porciones descritas anteriormente con respecto a la porción espadadora descrita anteriormente que puede ser un L. En una o más modalidades, L tiene una estructura -{CRiR2)m, en donde ¾ en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y R2 en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y m varia desde 0-15. Por ejemplo, m puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. En una o más modalidades, Ri y R2 son cada uno independientemente H o alquilo, y m varia desde 0-10.

Típicamente, el grupo alquilo es alquilo inferior de cadena recta o alquilo inferior de cadena ramificada, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, pentilo, etc., con la cadena recta siendo generalmente preferida. Un sustituyente de alquilo particularmente preferido es metilo. En una o más modalidades del mismo, ¾ y R2 son cada uno independientemente H o alquilo inferior. En aún una o más modalidades adicionales, ¾ y R2 son cada uno H, y m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10. Además, L puede ser - (CRiR2)m- en donde Ri en el carbono próximo a Y es alquilo, y en todos los casos, Ri y 2 son H. En una modalidad particular precedente, Rl es metilo o etilo o propilo. Alternativamente, L es -(CRiR2)m- en donde Ri en el carbono beta a Y es alquilo, preferiblemente metilo o etilo o propilo de isopropilo, y en todos los casos, Ri y R2 son H. Aunque cualquiera de las porciones espadadoras ejemplares descritas anteriormente puede ser una porción L, porciones L preferidas en algunas modalidades, poseen una estructura seleccionada de -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH (C¾)-, -CH2-CH(CH2CH3)-, -CH(CH3) CH2-, -CH2-CH (C¾) -CH2-, -CH2-C¾-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH (C¾) -, -CH2-CH2-CH (C¾) -CH2-, -CH2-CH(CH3)-CH2-CH2-, -CH (C¾) -CH2-CH2-CH2- · -0-C¾-, -CH2-0-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-C¾-0-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-0- . Prereriblemente, Y es un grupo funcional ionizable. Los grupos funcionales ionizables son particularmente bien adecuados para las purificaciones cromatográficas de la invención, y pueden ser explotados como un medio para separar especies de polímeros insustituidas, monosustituidas y disustituidas contenidas en una mezcla. Cantidades relativas de las varias especies de polímeros son llevadas a cabo idealmente a través de las varias transformaciones, con ello, formando una mezcla que comprende un polímero neutral de fórmula H0-P0LI-0H, un polímero monosustituido de fórmula HO-POLI-L-Y, y un polímero disustituido de fórmula Y-L-POLI-L-Y, en donde idealmente, no está presente más de aproximadamente 25% de las especies de polímeros disustituidos con relación a otras especies de polímeros . Opcionalmente, el método puede además comprender alquilar la mezcla de polímero producido ya seas en la primera o segunda etapa para convertir los grupos hidroxilo restantes a grupos alcoxilo. Después de esto, la mezcla del polímero resultante puede ser purificada, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico, para proporcionar un grupo L-Y único que comprende un polímero monosustituido sustancialmente puro, y en el caso en donde una alquilación se ha conducido, para proporcionar un polímero metoxi terminado monosustituido sustancialmente puro. El esquema de Reacción II proporciona otra modalidad representativa del método de la invención. En el Esquema de Reacción II, el PEG diol es primero metilado para proporcionar una mezcla de polímero como se describió previamente (II (i) ) . La mezcla de polímero alquilada entonces se hace reaccionar con un reactivo de funcionalización, en el primer caso 1- (3-bromo-propil) -4-metil-2, 6, 7-trioxa-biciclo [2.2.2] octano (II(ii)). Como puede observarse, el reactivo de funcionali ación posee un grupo, en este caso, Br~, que se desplaza por el anión contador de hidróxido. El Br~ es un ejemplo de la variable X. El reactivo de funcional!zación también contiene Y, en este caso un ácido carboxílico protegido. Específicamente, Y es un orto éster, 4-metil-2, 6, 7-trioxabiciclo [2.2.2] octano, pero puede ser cualquier grupo protector carboxilo. La porción enlazada, L, en el reactivo de funcionalización, es - (C¾) r~ ¦ El grupo protector es entonces removido, en este ejemplo por hidrólisis, para producir un ácido carboxílico PEG (II(iii)). Como se describe previamente, aunque se muestra como el ácido mPEG, el ácido mPEG está realmente presente en una mezcla que comprende PEG neutral, PEG dimetoxi, el ácido mPEG monofuncional deseado, así como el material funcional, HOOC-CH2CH2- (OCH2CH2)n-0-CH2CH2COOH. El ácido carboxílico PEG monofuncional es entonces purificado, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico. El Esquema de Reacción II pude también ser modificado para conducir la etapa de al uilación siguiendo la introducción del orto éster (es decir, después de la reacción con el reactivo de funcionalización) . (iv) Ácido CP. (separado del dicarbosílico PEG y PEG ¿¡metílica) Esquema de Reacción II En el Esquema de Reacción II ilustrativo anterior, se usa una reacción de adición tipo Michael para poner a funcionar un diol PEG por introducción de un grupo carbonitrilo . Generalmente se expresa, el reactivo de funcionalización en el método de la invención en este caso es un reactivo tipo Michael. En (III (iii) ) , es un carbonitrilo. En este caso, el reactivo de funcionalización contiene un grupo funcional, Y, en donde Y es un nitrilo, y es parte de un reactivo tipo Michael. El nitrilo es un precursor para un grupo ionizable. En el Esquema de Reacción III, X es -C¾, y el similar, L, en la mezcla del producto de nitrilo de polímero es -CH2CH2-. El nitrilo es entonces reducido a una amina usando un agente reductor, por ejemplo, H2 sobre un catalizador de metal tal como catalizadores que contienen rodio, níquel, paladio o platino. El Esquema de Reacción II demuestra un diol como el precursor para la reacción de adición Michael, sin embargo, si se desea, el diol PEG puede primero ser alquilado o alternativamente, puede ser subsecuentemente alquilado para la adición Michael. La mezcla amina del polímero es entnces purificada, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico. La introducción de un grupo ionizable tal como una amina hace este procedimiento particularmente adecuado para una separación a base de intercambio iónico para producir esencialmente monoamina, especies de polímero disustituidas y neutrales ausentes.

Esquema de Reacción ?? Otros reactivos tipo Michael puede ser sustituidos por el carbonitrilo como se muestra en el Esquema de Reacción III. Por ejemplo, los siguientes reactivos pueden ser usados como reactivos Tipo Michael, X" X"" o H2C=C—C=N y H2C=C—C—NH2 en donde X' ' es halo o alquilo y X' ' ' es H, halo, o alquilo . La amina CP muestra en el Esquema de Reacción III, que puede ser usada para preparar una variedad de derivados heterobifuncionales además por de funcionalización ya sea por el amino terminal o el grupo -OH terminal. Sin embargo, usado un material cromatográfreamente purificado tal como la amina CP, cualquiera como el polímero heterobifuncional preparado de este será esencialmente libre de contaminantes poliméricos tal como las especies poliméricas disustituidas y neutrales descritas en este documento. Un esquema de reacción representativa tal se proporciona como Esquema de Reacción IV debajo. En el Esquema de Reacción IV, la amina CP del Esquema de Reacción III se convierte en una maleimida por transformación del grupo amino. Este procedimiento sintético es ventajoso puesto que los polímeros terminados en maleimida son particularmente útiles por conjugación a porciones que contienen tiol, tal como las cisternas en proteínas. Sin embargo, el polímero terminado en maleimida amino heterobifuncional pueden entonces ser además transformado, si se desea, por funcionalización adicional en el término hidroxilo .

Esquema de Reacción IV En el Esquema de Reacción IV, la amina CO se convierte a la maleimida por reacción con éster metílico del ácido N-metoxicarbonilmaleimida-2, 5-dioxo-2, 5-dihidro-pirrol-l-carboxílico . Derivados del polímero maleimidilo adicionales que pueden ser preparado de los materiales iniciadores cromatográficamente purificados descritos en este documento, así como métodos que pueden usar los materiales iniciadores cromatográficamente purificados descritos en este documento, se describen en la Patente Estadounidense NO. 6,602,498. Este procedimiento de reacción puede ser empleado con cualquier amina de polimero cromatográficamente purificada por los métodos descritos en este documento. Nuevamente, como con todos los esquemas de reacción ilustrados en este documento, el esquema debajo es aplicable a cualquiera de los polímeros descritos en este documento, reactivos de funcionalización y polímeros monofuncionales purificados. En el Esquema de Reacción IV (así como cada uno de los Esquemas de Reacción I, II, III y V) , (n) es un número entero positivo, típicamente en al menos uno de los intervalos siguientes: de 2 hasta 3,000; de 10 hasta 2,000; y de 100 hasta 1000. Además, cada hidrógeno de los grupos hidroxilo mostrados en el Esquema de Reacción IV pueden opcionalmente ser un radical orgánico, típicamente un alquilo (tal como alquilo inferior) que incluye bencilo. El polímero terminado en amina en el Esquema de Reacción IV es un útil material iniciador para formar el reactivo que porta un grupo maleimídico terminal (como se muestra en el Esquema de Reacción IV) que puede ser usado, por ejemplo, en una reacción de conjugación con una proteina biológicamente activa. El Esquema de Reacción V representa aún otra modalidad particular del método de la invención. Generalmente, los hidroxilos en un diol de polimero (o en un alcohol polimérico de extremo tapado) son primero transformados a un grupo residual mejor. Un grupo residual e emplarmente mostrado aquí es mesilato o metansulfonilo, aunque cualquier grupo residual adecuado puede ser usado. En la primera etapa de este procedimiento, la conversión es preferiblemente llevada hasta aproximadamente 20% asi como para reducir la cantidad final de amina difuncional formada. Nuevamente, aunque una especie de polimero monofuncional!zado único se muestra en V(i) , el polimero monofuncionalizado está realmente presente en una mezcla de reacción que contiene material iniciador sin reaccionar y di-mesilato de polimero. El mesilato de polimero, HO-POLI-Ms pueden entonces hacerse reaccionar con una variedad de diferentes agentes de funcionalización. En este procedimiento, los reactivos de funcionalización reaccionan con el polimero vía una reacción de sustitución nucleofilica, tal que se desplaza el grupo -O s en el polimero. En la reacción V(ii-a) , el reactivo de funcionalización puede ser descrito generalmente como X-L-Y, en donde X es -NH2. En la reacción V(ii-b), el reactivo de funcionalización es amoniaco, el cual puede actuar para desplazar -OMs. La tercera reacción V(ii-c) ilustra un reactivo de funcionalización que tiene un enlace de cuatro carbonos en lugar de enlace de tras carbonos como en V(ii-a) . Cada una de estas mezclas de reacciones son particularmente adecúas para purificación por cromatografía de intercambio iónico como se describe por este documento, para proporcionar polímeros monosustituidos, monofuncionalizados esencialmente puros. Estos polímeros pueden ser usados directamente, por ejemplo, para preparar agentes de funcionalización activos, hidrcgeles o cualquiera de otras aplicaciones adecuadas, o pueden ser de funcionalización adicionalmente como se describe anteriormente .

Esquema de Reacción V E. Etapa de Purificación Los procesos de funcionalización a un material iniciador poliol o diol de polímero resultan en una mezcla de productos, que incluyen un polímero monodisustituidos y una o más especies de polímero multisustituidos (por ejemplo, polímero disustituido) . Así, para hacer el método de invención de la utilidad muy práctica, la mezcla del producto de polímero es purificada para separar el polímero monosustituido del polímero di- o multi-sustituido, así como cualquier diol, poliol de polímero sin reaccionar que sobra u otras especies de polímero neutral. Cualquiera de un número de técnicas de purificación puede ser usada. En una modalidad preferida de la invención, en particular en donde la mezcla del polímero que contiene especies del polímero que tiene grupos funcionales ionizables, la cromatografía de intercambio iónico se emplea para separar varios constituyentes poliméricos de la mezcla del producto basado en ya sea diferencias en la carga. En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico que supera los problemas asociados con otro comúnmente empleado, por ejemplo, gradiente, métodos de intercambio iónico usados para separar polímeros. Este proceso se refiere a una cromatografía de elución de polímero de gradiente, y difiere del método de la invención en muchos respectos . La cromatografía a base de gradiente involucra cambiar la fuerza iónica de la fase o eluente móvil conducir las moléculas diferencialmente cargadas en una columna de intercambio iónico a intervalos diferentes. Generalmente, en una cromatografía de gradiente, un gradiente es aplicado es aplicado a cambios de un solvente de fuerza de elución pobre o baja a un solvente de fuerza de elución buena o alta, basada en la afinidad relativa de la columna contra la fase móvil para un polímero particular . En una separación de gradiente típica, una muestra es aplicada a una columna y es empleado un solvente de fuerza de elución baja, así como no permite cualquier separación que ocurre inicialmente . Más bien, los componentes mezclados se colectan en la superficie de la columna, en una etapa de concentración. El gradiente es entonces desarrollado y la fuerza iónica del solventes es gradualmente incrementada hasta condiciones de solvente de fuerza de elución alta o "buena" se son alcanzadas tal que los componentes de la muestra son su separación y son para migrar. Se separan sustancias de carga vía materiales en columna que lleva una carga opuesta. Especies con una carga alta se enlazan a una columna de intercambio iónico más fuertemente, mientras las especies cargadas menos favorablemente eluyen más rápidamente. La fuerza del eluyente es típicamente alterado cambiando el pH, amortiguador y/o concentración de sal (fuerza iónica) . Las técnicas que cuentan en la separación del gradiente son tediosas, consumen tiempo, usan grandes volúmenes de solvente y requieren análisis de fracciones múltiples. Así, los métodos de tipo de gradiente son poco adecuados para procesos a escala comercial. Sin embargo, las técnicas de separación a base de gradiente también raramente logran niveles de pureza altos de cualquier polímero dado (por ejemplo, en referencia para el número de varias especies de polímero presentes y la polidispersidad del producto del polímero purificado) , particularmente se separan las especies de polímero de peso molecular alto. Los procesos de separación de intercambio iónico de la invención proporcionan mezclas de polímero de separación y purificación superior que contienen aniones o cationes multivalentes . Más específicamente, el método es bien sustituido para mezclas de polímero que contiene sustancias cargadas y sin caga que difieren en la carga, por ejemplo, polímero que son sin carga, sencillamente cargados, doblemente cargados, triplemente cargados y sucesivamente (que es, para decir, dos o más especies que tienen grupos ionizables que bajo ciertas condiciones de pH, llevan diferentes cargas) . Un ejemplo es una mezcla de polímero que contiene un polímero neutral (es decir, un diol o poliol de polímero o un polímero mono- o adia-alquilado ausente en el grupo funcional ionizable) , un polímero monosustituido que tiene un grupo ionizable sencillo, tal como un grupo de amina o ácido carboxílico, y polímero di- o multi-sustituido que tiene dos o más grupos funcionales ionizables. La separación se lleva a cabo confiado en diferentes cargas, y en ciertas modalidades, diferencia en peso molecular. En lugar de eluir que tienen cargas diferentes de una columna sencilla (o un número de separaciones cromatográficas en columna sencilla) cambiando la fuerza iónica de lo eluido en una etapa, forma de gradiente, el presente método involucra el uso de columnas discretas y eluidos discretos. Generalmente, un solvente que tiene una concentración estática o constante como se mantiene en una columna usada. Es decir, el solvente es mantenido introducido en la columna es de una composición no gradiente, constante. La fuerza iónica y/o pH del solvente es ajustado para ajustar las especies de polímero son eluidos de la columna. Específicamente, el método de la invención involucra el uso de más de una columna de intercambio iónico para lograr polímeros mono-sustituidos ultra altamente purificados, por ejemplo, típicamente contiene al menos 0.3% en peso de impurezas de polímero dide funcionalización o multi-de funcionalización. La(s) primera (s) column (s) o pre-columna (s) son medidas para adsorbes sustancialmente todo, y más preferiblemente, todos, de los polímeros disustituidos y otras especies de polímeros multisustituidos que están presentes en una mezcla de polímero. Típicamente, la determinación de un tamaño apropiado para la(s) primer (as) columna (s) o pre-columna (s) involucrada (s) en la etapa de capacidad de la columna de estabilización. La capacidad de la columna es experimentalmente determinada y típicamente involucra pasar una solución que contiene un exceso de cantidad de solución estándar de un tipo de especies de polímero [por ejemplo, una solución de HO ( 0) CH20- (CH2C¾0) n-CH2C(0) 0H o H2N-CH2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2CH2-NH2] conocida por adsorber la fase fija. Este estándar se agrega como saturado a la columna, frecuentemente se verifica detectando las especies de polímero en el eluado recuperado de la columna. Después de esto, cualquier especie no adsorbente se lava fuera de la columna, típicamente pasando agua destilada a través de la columna. Después, todas las especies de polímeros adsorbidas en la columna se eluyen (generalmente por medio de pasar una solución salina) , se extraen con solventes orgánicos y entonces se pesan después de remover el solvente. Esta cantidad corresponde a la capacidad de columna. Para la magnitud que dos o más columnas se proporcionan en series, la capacidad de columna total del sistema es equivalente a las capacidades de columna agregada de las columnas individuales. Que tiene capacidad de columna establecida, únicamente columna (s) suficientemente ajustadas a tamaño para adsorber sustancialmente todas las especies de polímero di- o multisustituido (por ejemplo, polímero disustituido, especies de polímero que comprende dos grupos -Lo,i_Yf o polímero difuncional) deseables para ser removidos de una mezcla, será usada en una etapa de purificación inicial. Una' columna es ajustada a tamaño suficientemente en este respecto cuando tiene una capacidad de columna mayor que la cantidad de las especies de polímero di- o multisustituido para ser retenido de una mezcla. Como previamente se discute, la cantidad de las especies de polímero en cualquier mezcla puede ser determinada analizando una muestra de la mezcla, por tener referencia a la FIG. 1, o cualquier otro método conocido. Así, la capacidad de columna de pre-columna (s) usadas en una primera etapa de elución puede ser uno o más de al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100% y al menos un 110% incremento de la cantidad total de las especies de polímero en la mezcla a ser purificada. Por ejemplo, con respecto a una primer etapa en un método para purificación de una mezcla que contiene 5 g de polímero disustituido, una primera columna de intercambio iónico que tiene capacidad para adsorber 10 g del polímero disustituido puede ser usada (con ello representando 100% de incremento del la cantidad total de las especies de polímero difuncional para ser adsorbido en la primera columna) . Además, una mezcla que contiene 25 g de polímero disustituido, una primera columna de intercambio iónico que tiene capacidad para adsorber 35 g del polímero disustituido puede ser usado (con ello representando un 40% de incremento de la cantidad total de las especies de polímero para ser adsorbidos en la primera columna) . Con respecto a la(s) segunda (s) columna (s) o columna (s) principal (es ) usada (s) en la etapa de purificación, es suficiente tener una capacidad de columna sustancialmente equivalente para la cantidad de polímeros monofuncionales dentro de las especies de polímero para ser retenidas de la mezcla (por ejemplo, polímero monosustituído, especies de polímero que comprende uno de los grupos -L0,i-Y, o polímero monofuncional) . Columna (s) principal (es) o segunda (s) que tienen mayores capacidades de columna pueden también ser usadas para prevenir cualquier pérdida de polímero (s) funcional (es) . Habiendo columnas apropiadamente identificadas, la purificación puede tomar lugar. De forma ventajosa, la mezcla de polímero equilibrada con el medio de fase sólido en la precolumna como los flujos de mezcla a través de la columna para permitir que el material se enlace fuertemente (por ejemplo, aquellas especies que portan el número mayor de las cargas a la cual la columna se dirige) para ser retenido. Relaciones lentas para agregar la mezcla correspondiente para una magnitud incrementada de equilibrio . En una o más modalidades, una pluralidad de "precolumnas" (por ejemplo, 2, 3, o 4 precolumnas ) conectadas en serie se usan para remover las especies de polímero multisustituido, la pluralidad de precolumnas son ajustadas a tamaño para adsorber colectivamente todos los polímeros disustituidos y otras especies de polímero multisustituido. Típicamente, alguna cantidad de especies de polímero monosustituido será adsorbida también, pero a una magnitud menor puesto que únicamente una especie ionizada es asociada con las especies de polímero monosustituido. De forma ventajosa, el método de purificación no requiere el uso de una etapa de destilación para soluciones concentradas tal como el eluado. Además, el método de purificación descrito en este documento es adecuado para purificar no únicamente polímeros de peso molecular pequeño relativo (por ejemplo 2,000 Da), pero pueden ser usados para purificar polímeros de peso molecular que tienen pesos moleculares altos también. Asi, el método de purificación es adecuado para purificar pesos moleculares en los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 Da hasta aproximadamente 180,000 Da; de aproximadamente 3,000 Da hasta aproximadamente 120,000 Da; de aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da; de aproximadamente 8,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da; de aproximadamente 10,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da; de aproximadamente 12,000 Da hasta aproximadamente 80,000; y de aproximadamente 15, 000 Da hasta aproximadamente 80, 000 Da. Además, el equipo usado en los procesos de purificación no cuenta en gradientes, con ello reducir la necesidad para obtener muchas fracciones eluidas muy diluidas, las cuales, a su vez, requiere una multitud de recipientes de colección. Además, el presente método usa sustancialmente menos volúmenes de eluyente comparado a métodos de la técnica anterior, típicamente en el orden de menor que aproximadamente 50% de eluyente, preferiblemente menor que aproximadamente 75% de eluyentes, más preferiblemente menos que aproximadamente 85% de eluyente, aún más preferible menos que aproximadamente 90% de eluyente, con cantidades de eluyente de menor que aproximadamente 95% relativo a métodos de la técnica anterior son más preferidos. De forma consecuente, los métodos descritos en este documento requieren únicamente un recipiente de colección sencillo, y no requiere de una etapa de destilación para concentrar lo eluido para mejorar la extracción de productos purificados. Además, los aparatos descritos en este documento no requieren más que un recipiente de colección sencillo y no requiere un medio para destilación. Lo eluido de la primera columna, la cual contiene el polímero monosustituido y el polímero neutral, es entonces pasado a través de la segunda columna de intercambio iónico (o principal) o columnas conectadas en serie. El polímero monosustituido es absorbido en la segunda columna (s) (o principal), la cual es ajustada en tamaño para retener preferiblemente todo el polímero monosustituido. El polímero neutral pasa a través de todas las columnas y pueden ser colectadas y posiblemente recicladas para usarlas nuevamente en el método de la invención. Es generalmente preferido para lavar cada columna con una solución que tiene fuerza iónica baja (por ejemplo, agua desionizada) para remover cualquier resto de polímero neutral de este . Las soluciones que tienen la fuerza iónica baja requerida para cualquier sistema particular se conocen por aquellos que tiene experiencia ordinaria en la técnica. Además, las soluciones que tienen la fuerza iónica baja requerida pueden ser determinadas a través de experimentación de rutina pasando una solución candidata (típicamente, aunque no necesariamente, una solución salina muy débil o solución amortiguada) aunque la(s) columna (s) conocidas por tener especies de polímero tanto neutrales como cargados contenidas en este documento, colectando la solución candidata que ha pasado a través de la(s) columna (s) , y entonces probar la solución colectada por la presencia de cualquier especie de polímero cargado. Una solución candidata que ha pasado a través de las column (s) con o sin sustancialmente sin contenido de especies de polímero cargado (por ejemplo, menos que 1%) representa una solución que tiene una fuerza iónica baja para el sistema particular . La recuperación de especies de polímero cargados (si son especies de polímero cargados individualmente o especies de polímero di o múltiplemente cargados) adsorbidos en las columnas de intercambio iónico requiere típicamente desorción. La desorción típicamente involucra pasar solución salina que tiene fuerza iónica alta a través de la(s) columna (s), con ello desorber las especies de polímero cargadas. Por ejemplo, la(s) segunda (s) columna (s) (o principal) contienen polímero monosustituido puede ser lavado con una solución salina que tiene fuerza iónica alta, tal como una solución de NaCl, para remover y colectar un producto de polímero monosustituido sustancialmente puro. Se conocen soluciones salinas que tiene la fuerza iónica alta requerida para cualquier sistema particular por aquellos que tienen experiencia ordinaria en la técnica. Además, soluciones que tiene la fuerza iónica alta requerida pueden ser determinadas a través de experimentación de rutina pasando una solución candidata a través de la(s) columna (s) que tienen una cantidad conocida de especies de polímero cargados adsorbidos en este documento, colectar la solución candidata que se ha pasado a través de la(s) columna ( s) , y entonces probar la solución colectada para la presencia de especies de polímero cargado. Una solución candidata que pasa a través de la(s) columna (s) con al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, todavía más preferible al menos aproximadamente 95%, y al menos preferiblemente al menos aproximadamente 99% de la cantidad conocida de especies de polímero cargado contenidas en este documento representa una solución que tiene una fuerza iónica alta para aquel sistema particular. Este procedimiento puede ser usado para identificar una solución que tiene fuerza iónica suficiente así que la solución será polímero difuncional desorbido a través de la primera columna o precolumna.

Puesto que las especies de polímero diferentemente cargados se ha separado por adsorción en columnas separadas, no ha necesidad para usar un gradiente de solución salina para recuperar cada especie de polímero separadamente. En cambio, una solución salina que tiene una fuerza iónica constante puede ser usada para eluir el producto deseado de cada columna. Si se desea, las especies de polímero multisustituido absorbido en la(s) precolumna (s) pueden también ser colectadas pasando una solución salina a través de la precolumna para conducir la desorción del polímero. Típicamente, la(s) precolumna (s) son ajustadas de tamaño así como para asegurar la absorción de todo el polímero multisustituido en la corriente de alimentación, significa que algún polímero monosustituido también será absorbido en la precolumna. Así, la pureza del producto multisustituido eluado es típicamente inferior comparado al producto monosustituido eluado de una o más columnas adicionales . Preferiblemente, el producto eluado de la(s) precolumna (s) contienen no más de aproximadamente 70 por ciento en peso del polímero monosustituido, más preferiblemente no más de aproximadamente 50 por ciento en peso, y más preferiblemente no más de aproximadamente 30 por ciento en peso. Si el producto eluado de la(s) precolumna ( s ) contienen múltiples especies de polímero multicargados (por ejemplo, doblemente cargados y triplemente cargados), entonces un segundo pasa a través del sistema de intercambio iónico pueden ser usados para separa adicionalmente la mezcla de polímero reteniendo las especies altamente cargadas en las precolumnas (por ejemplo, especies triplemente cargadas) y que retienen las especies menos favorablemente cargadas (por ejemplo, doblemente cargadas) en la segunda columna. La determinación analítica, usando una columna CIAR que responde a peso tanto carga como peso molecular, puede ser usada para determinar cuanto de cada especie está presente en una muestra, ambos antes son corridos a través de una columna y después. Por "sustancialmente puro" significa que el polímero monosustituido contiene menos que aproximadamente 5 por ciento en peso de impurezas de polímero, tal como polímero multisustituido o polímero insustituido (es decir neutral) , preferiblemente menos que aproximadamente 3 por ciento en peso, más preferiblemente menos que aproximadamente 2 por ciento en peso, y más preferiblemente menos que aproximadamente 1 por ciento en peso. Una composición preferida comprenderá monometoxi end-caped poli (etilen glicol) ("mPEG-OH") , en donde la composición tiene un contenido de poli (etilen glicol) diol de menos que 0.3 % en peso. Si se desea para reducir el intervalo de peso molecular (es decir, polidispersidad) del producto de polímero monosustituido, una serie de dos o más columnas (por ejemplo, columnas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) después de la precolumna pueden ser usadas para atenuar el intervalo de peso molecular del polímero monosustituido absorbido en cada columna. El polímero monosustituido de peso molécula menor será absorbido primero, significa el peso molecular promedio del material de polímero absorbido en cada columna sucesiva se incrementará. Así, incrementando el número de columnas, una puede no únicamente separa el polímero monosustituido de las especies altamente cargadas, pero también polidispersidad baja. En ciertas modalidades, la polidispersidad del polímero monosustituido es reducida por al menos aproximadamente 0.01 preferiblemente al menos aproximadamente 0.02, más preferiblemente al menos aproximadamente 0.03, y más preferiblemente al menos alrededor de 0.05. En una modalidad alternativa, si el polímero monosustituido de peso molecular bajo es el producto deseado, uno puede simplemente disminuir a la segunda o columna principal tal que todo el polímero monosustituido no puede ser adsorbido de este. Puesto que las especies de peso molecular bajo será selectivamente enlazado al primero, el polímero monosustituido de peso molecular bajo deseado será absorbido en la columna. Además o alternativamente, uno puede usar varias columnas y colectar el polímero monofuncxonal de peso molecular bajo de la primera columna en las series de columnas después de la precolumna. Si la mezcla de polímero original que es sometida a funcionalización contiene una cantidad relativamente pequeña de poliol, tal como en el caso de un material iniciador de polímero que comprende un mPEG impuro (por ejemplo, un mPEG contaminado con al menos aproximadamente 20% en peso de PEG diol) , después la mezcla de polímero resultante que requiere purificación no puede contener polímero neutral o únicamente una cantidad insignificante de polímero neutral si la reacción de funcionalización es dejada proceder para completarse. En este caso, el sistema de purificación de intercambio iónico puede comprender únicamente una columna sencilla ajustada a tamaño para absorber todas las especies de polímero multifuncional (es decir, precolumna) . El eluado de la precolumna entonces contendrá únicamente el producto monofuncxonal deseado. Después de la purificación, si se desea, el polímero sustancialmente puro puede ser además modificado para convertir el grupo funcional ionizable a un segundo grupo funcional, tal como hidroxilo, éster activo, carbonato activo, otro éster, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, hidrato de cetona, alquenilo, acrilato, metacrilato, nitrilo, amida primaria o secundaria, imida, acrilamida, , sulfona activa, amina, hidrazina, tiol, ácido carboxilicc, isocianato, isotiocianato, maleimida, succinimida sustituida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, amidato, 1, 3-oxazolina 2-sustituido, 1,3- (4H) -dihidrooxazinas 2-sustituido, 1, 3-tiazolina 2-sustituido, 1, 3- (4H) -hidrotiazinas 2-sustituido, hidroxilamina, yodoacetamida, epóxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato. Durante el proceso de intercambio iónico, el eluado de cada columna puede ser monitoreado usando técnicas conocidas en la técnica, tal como midiendo la conductividad del elutato, analizar el eluado por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía líquida de alta resolución, o cromatografía de capa delgada o detectando la presencia de PEG en el eluado tratando una gota de eluado con una gota de ácido poliacrílico al 1% (Aldrich, Mn 250,000) en HC1 1N ("prueba ???") . Presencia de PEG es indicada por la apariencia inmediata de un precipitado blanco de complejo PEO/PAA.. Esta prueba es muy específica para la estructura de poliéter de PEG y no influenciado por modificaciones de grupo final del polímero, peso molecular o la presencia de iones inorgánicos en la solución analizada. Monitores de corrientes de eluado es particularmente importante durante la etapa de lavado para determinar cuando sustancialmente todo el polímero neutral ha sido removido de las columnas . Como se entenderá en la técnica, la columna de intercambio iónico utilizada en la presente invención puede ser cualquier columna de intercambio iónico convencionalmente usada para separar una mezcla basada en carga (Ion Exchange Chromatography. Principies and Method. Pharmacia Biotech 1994; "Chromatography: a laboratory handbook of chromatographic and electrophoretic techniques." Hefman, E (Ed. ) , Van Noostrand Rheinhold Co., New York, 1975) . Cada columna comprende un medio de intercambio iónico y una fase móvil, o eluyentes, que pasa a través del medio de intercambio iónico. Las columnas de intercambio iónico adecuadas para uso en la presente invención incluyen medio de intercambio iónico POROS® hecho por Applied Biosystems y medio de intercambio iónico SEPHAROSE® hecho por Pharmacia. El medio de intercambio iónico, el cual es típicamente una resina polimérica (por ejemplo, dextrano, agarosa, celulosa, copolimero de estireno-divinilbenceno) que contiene grupos cargados, se seleccionan a base de un números de factores, que incluye la carga y valor pKa del grupo funcional ionizable presente en los polímeros a ser separados. Típicamente, el medio de intercambio iónico se selecciona para proporcionar una diferencia suficiente en valor pKa entre el grupo funcional ionizable y el medio de intercambio iónico para favorablemente conducir la absorción del polímero, preferiblemente una diferencia de la menos 4-5 unidades. Como será entendido, el medio de intercambio iónico comprenderá grupos negativamente cargados (es decir, un intercambio catiónico) si el grupo funcional ionizable es positivamente cargado y comprenderá grupos positivamente cargados (es decir, un intercambio aniónico) si el grupo funcional ionizable es negativamente cargado. Grupos negativamente cargados ejemplares gue pueden ser usados incluyen carboximetilo (CM) , sulfopropilo (SP) y sulfonato de metilo (S) . Grupos positivamente cargados ejemplares incluyen trietilamoniometilo (TMAE) , dietilaminoetilo (DEAE) , aminometilo cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q) . Típicamente, el medio en cada columna será el mismo, pero diferente medio debe ser usado en cada columna sin apartarse de la presente invención. Una modalidad de la columna dos del sistema de intercambio iónico de la invención se muestra en la Figura 2. Como se muestra, el sistema de intercambio iónico 10 comprende un tanque o recipiente de alimentación 12 que contiene un suministro de la solución de la mezcla de polímero crudo para ser separado. Típicamente, la mezcla del polímero será disuelta en agua desionizada o una solución acuosa neutral que tiene fuerza iónica muy baja. Como se noto anteriormente, la mezcla de polímero a menudo incluirá especies de polímero neutral o insustituido, tal como un polímero que tiene la estructura HO-POLI-OH o R'O-POLI-OR' , un polímero monosustituido de fórmula HO-POLI-L-Y o R' 0-POLI-L-Y, y un polímero disustituido de fórmula Y-L-POLI-L-Y en donde Y, R' , L y POLI son como se definen anteriormente . El tanque de alimentación 12 está en comunicación fluida con una primera columna o precolumna de intercambio iónico 16 ajustada para atrapar especies altamente cargadas (es decir, un polímero disustituido) . La salida de la precolumna 16 está en comunicación fluida con la entrada de la segunda o principal columna de intercambio iónico 18, la cual es apropiadamente ajustada para retener todas las especies de polímero monocargados . La salida de cada columna está en comunicación fluida con uno o más productos recuperados o recibidos en el recipiente 20, cada recipiente adaptado para recibir lo eluado de uno o más columnas. Las soluciones salinas y soluciones neutrales usadas para lavar las columnas y/o recuperar las especies de polímero absorbidas pueden ser alojados en uno o más recipientes de solvente 22, el cual está en comunicación fluida con la entrada de una o más columnas. La figura 3 ilustra una modalidad que comprende una precolumna 16 y una pluralidad de las columnas segunda o principal 18 que puede ser usada para reducir el intervalo de peso molecular del producto de polímero monosustituido deseado como se explica anteriormente.

F. Productos Ejemplares Como previamente se discutió, los métodos descritos en este documento pueden ser usados en la preparación de reactivos poliméricos sustancialmente puros . Ejemplos de tales productos que existen como composiciones sustancialmente puras con pocas o sin especies de poli (etilenglicol) diol incluyen lo siguiente: mPEG-NH2; CH2CH2o-CH2GH2-C-0-l N CH30-f-CH2CH20)-CH2CH2C-S— } O / — > mPEG-0-CH2CH2- -C-N =0 O Cn Cn en donde (n) es un entero positivo, típicamente cae dentro de al menos uno de los siguientes intervalos: de 2 hasta 3,000; de 10 hasta 2,000; de 100 hasta 1,000 y cada mPEG es CH3- (OCH2CH2) n-/ en donde (n) es como previamente se definió . El grupo funcional correspondiente con porción espacial opcional (por ejemplo, L0,1-Y) son evidentes de las estructuras poliméricas ejemplares anteriores.

III. Ejemplos Se entenderá que mientras la invención se ha descrito en unión con ciertas modalidades especificas preferidas del mismo, la descripción anterior asi como los ejemplos que siguen, pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del ámbito de la invención serán aparente por aquellos expertos en la técnica a la cual la invención pertenece. Todos los reactivos PEG referidos en los ejemplos añadidos son comercialmente disponibles a menos que se indique de otra manera, por ejemplo de Nektar Therapeutics, Huntsville, AL. Todos los datos 1HKMN se generan por un espectrómetro RMN de 300 ó 400 MHz fabricado por Bruker. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) se realizó usando el sistema CLAR Agilent 1100 (Agilent) , infiltración de gel o columna de intercambio iónico, amortiguador de fosfato acuoso como una fase móvil y detector (RI) de índice refractivo.

Ej emplo 1 Ácido butanoico-mPEG (20, 000 Da) A. Ester 4-bromobutirato de 3-metil-3-hidroximetiloxetano (PM = 251.12) Se disolvió 3-metil-3-hidroximetiloxetano (10.2 g, 0.1 mol) [Sigma-Aldrich Corporation de St. Louis, MO] en diclorometano anhidro (200 mi) y se agregó piridina (9.8 mi, 0.12 mol). La solución se enfrió a 0°C y se agregó por goteo durante 20 minutos cloruro de 4-bromobutirilo (18.5 g, 0.1 mol) [Sigma-Aldrich Corporation de St. louis, MO] disuelto en diclorometano anhidro (50 mi) . La mezcla se agitó durante la noche bajo una atmósfera de argón. Después, la mezcla de reacción se lavó con agua y se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente entonces se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 23.6 g. RMN (d6-DMSO) : 1.26 ppm (s, 3H) , 2.07 ppm (m, 2H) , 2.51 ppm (t, 2H) , 3.56 ppm (t, 2H) , 4.14 ppm (s, 2H) , 4.24 ppm (d, 2H) , 4.38 ppm (d, 2H) .

B. 1- (3-Bromopropil) -4-metil-2, 6, 7-trioxabiciclo[2,2,2]octano (PM = 251.12) (Ester OBO del ácido 4-bromobutanoico) Se disolvió éster 4-bromobutira o de 3-metil-3-hidroximetiloxetano crudo (20.1 g, 0.08 mol) en diclorometano anhidro (100 mi) , la solución se enfrió a 0°C y se agregó dietil eterato trifluoruro de boro (2.5 mi, 0.022 moles) . La mezcla se agitó por 4 horas a 0°C. Se agregó trietilamina (12 mi) , la mezcla se agitó por 15 minutos, y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en éter de etilo (180 mi) y la solución se filtró para remover las impurezas sólidas. Después, el éter se destiló completamente y el producto se destiló bajo presión reducida (kugelrohr, 110-115°C, 0.05 mm Hg) . Rendimiento 15.0 g. RMN" (d6-DMSO) : 0.74 ppm (s, 3H) , 1.68 ppm (m, 2H) , 1.88 ppm (m, 2H) , 3.52 ppm (t, 2H) , 3.81 ppm (s, 6H) .

C. Ácido butanoico-PEG(20, 000 Da) Una solución de PEG comercxalmente disponible (Mn 20,300 Da, polidispersidad 1.040) (50.0 g, 0.005 equivalentes) en tolueno (300 mi) se secó de forma azeotrópica destilando completamente 50 mi de tolueno. Se agregaron 1.0 M de solución de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (5.0 mi, 0.005 moles) y 1- (3-bromopropil) -4-metil-2, 6, 7-trioxabiciclo [2, 2, 2] octano (0.65 g, 0.0025 moles) y la mezcla se agitó durante la noche a 70°C bajo una atmósfera de argón. Después, se agregaron 1.0 M de solución de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (18.0 mi, 0.018 moles) y p-toluensulfonato de metilo (4.4 g, 0.0239 moles) y la mezcla se agitó durante la noche a 45°C bajo una atmósfera de argón. El solvente se destiló completamente bajo presión reducida y el residuo se disolvió en agua destilada (450 mi) . El pH de la solución se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se agitó por 15 minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se reajustó a 12 con 1M de solución de hidróxido de sodio y la solución se agitó por 2 horas manteniendo el pH a 12 por adición periódica de 1M de hidróxido de sodio. El pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5% y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se agregó éter de etilo. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 44.7 g. RMN (d6-DMSO) : 1.72 ppm (q, C¾-CH2-COO-) 2.24 ppm (t, -CH2-COO-), 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) .

D. Purificación El producto de (C) anterior se determinó por ser una mezcla de especies de polímero. Como se muestra en la Figura 4a, un cromatograma CLAR reveló que el producto de la mezcla de polímero de C incluye ácido dibutanoico-PEG(20,000 Da) (26.1%), ácido butanoico-mPEG (20, 000 Da) (50.4%) ? éter de dimetilo PEG(20,000 Da) (23.5%). Una purificación se llevó a cabo de conformidad con la invención para obtener ácido butanoico-mPEG (20, 000) . La mezcla anterior de productos de C se disolvió en agua destilada (4470 mi) y la solución resultante se pasó a través de una primera columna cromatográfica (precolumna) llenada con 300 mi de gel de intercambio niónica: Flu o Rápido DEAE SEPHAROSE® (Pharmacia) . Esta cantidad de gel de intercambio aniónico fue únicamente capaz de retener aproximadamente 35% de ácido PEG presentes en la 'mezcla de polímero de la etapa C. La capacidad de columna fue previamente determinada en experimentos de laboratorio a escala pequeña. Como se muestra en la Figura 4B, el cromatograma de intercambio aniónico reveló que lo eluado conteniendo únicamente ácido butanoico-mPEG (20, 000 Da) y éter de dimetilo PEG(20,000 mPEG) . Se absorbieron ácido dibutanoico-PEG (20, 000 Da) y una porción de ácido butanoico mPEG(20,000) por el gel en la precolumna. Después lo eluado colectado de la precolumna se aplicó a una segunda columna (columna principal) que contiene 1000 mi de gel de Flujo Rápido DEAE SEPHAROSE®. La cantidad de gel de intercambio aniónico en la columna fue suficiente para retener todo el ácido butanoico-mPEG (20, 000 Da) presente en lo eluado de la primera columna. La capacidad de columna fue previamente determinada en experimentos de laboratorio a escala pequeña. Un cromatograma de intercambio aniónico mostró que lo eluado de la segunda o columna principal contendiendo únicamente éter de dimetilo PEG(20,000 Da). Como se muestra en la Figura 4c, la cromatografía de intercambio aniónico mostró que el único polímero adsorbido en la segunda columna fue ácido butanoico-mPEG (20, 000 Da), el cual se eluyó usando una solución de NaCl al 5% (1500 mi) . El pH de lo eluado de la segunda o columna principal se ajustó a 3 por adición de ácido fosfórico al 5% y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, el agente secante removido, y se agregó la solución seca a éter de etilo para precipitar el producto purificado. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 14.4 g, RMN (d6-DMSO) : 1.72 ppm (q, CH2-CH2-COO-) 2.24 ppm (t, -CH2-COO-) , 3.24 ppm (s, -0C¾) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . Cromatografía de intercambio aniónico : ácido butanoico-mPEG(20,000 Da) al 100% (sin otras especies de polímero detectadas). Cromatografía de infiltración de gel: Mn = 20,700 Da, polidispersidad 1.010. La figura 4d ilustra que el producto eluido de la primera columna (precolumna) conteniendo tanto algo de ácido butanoico-mPEG (20, 000) como el ácido dibutanoico-PEG(20, 000 Da) .

E emplo 2 mPEG (20, 000 Da) -Amina Una solución de PEG . (Mn = 20,300 Da) (50.0 g, 0.005 equivalentes) comercialmente disponible en tolueno (300 mi) se secó de forma azeotrópica destilando completamente 50 mi de tolueno. Se agregaron diclorometano (60 mi), trietilamina (1.40 mi, 0.0100 moles) y cloruro de metansulfonilo (0.35 mi, 0.00452 moles, 90.4% de cantidad estequiométrica) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. La mezcla se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El residuo se disolvió en tolueno anhidro (250 mi) y se agregó metóxido de sodio (solución al 25% en metanol, 23.0 mi). La mezcla se agitó durante la noche a 70°C bajo una atmósfera de argón, se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en 500 mi de agua destilada. Se agregó NaCl (40 g) y el pH de la solución se ajustó a 7.2 con ácido fosfórico al 5%. El producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 43.3 g, el análisis RMN mostró que 79% de los grupos PEG-OH se convirtieron a grupos PEG-OCH3. Se disolvió el PEG(20, 000 Da) (20.0 g) parcialmente metilado obtenido en tolueno (150 mi) y la solución se secó de forma azeotrópica destilando completamente 50 mi de tolueno. Se agregaron diclorometano (25 mi), trietilamina (0.60 mi), y cloruro de metansulfonilo (0.30 mi) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. La mezcla se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto entonces se disolvió en diclorometano (30 mi) y se agregó 500 mi de alcohol isopropilico . El producto precipitado se filtro completamente y se secó bajo presión reducida dando 19.5 g del producto. El análisis RMN mostró que el producto contiene 79% de grupos PEG-0C¾ y 21% de grupos PEG-metansulfonato. El producto entonces se disolvió en 350 mi de hidróxido de amonio (30%) y la solución se agitó por 70 horas a temperatura ambiente. La mezcla resultante de productos metoxi-PEG-amina se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. El producto se disolvió nuevamente en diclorometano (30 mi) y se precipitó con 500 mi de alcohol isopropilico. Rendimiento 15.2 g.

El análisis de proporciones relativas de especies de polímero por cromatografía de intercambio catiónico: PEG (20, 000 Da) -diamina al 47%, mPEG (20, 000 Da) -amina al 30.4%, éter de dimetilo-PEG (20, 000 Da) al 64.9%. La mezcla anterior se disolvió en agua destilada (1500 mi) y la solución resultante se pasó a través de una primera columna cromatográfica (precolumna) llenada con 40 mi de resina POROS® 50 HS de intercambio catiónico (Applied Biosystems) . Esta cantidad de gel de intercambio catiónico es únicamente capaz de retener aproximadamente 10% de aminas de PEG presentes en la mezcla de polímero. La capacidad de columna fue previamente determinada en experimentos de laboratorio a escala pequeña. La cromatografía de intercambio catiónico mostró que lo eluado de la precolumna contiene únicamente mPEG(20,000 Da) -amina y éter de dimetilo PEG(20,000 Da). Se adsorbió PEG (20, 000 Da) -diamina y parte de mPEG(20,000 Da) -amina por la resina en la precolumna. Después, lo eluado de la precolumna se aplicó a la segunda columna (columna principal) que contiene 300 mi de resina POROS® 50 HS . La cantidad de gel de intercambio catiónico es suficiente para retener todo el mPEG (20,000 Da) -amina presente en lo eluado de la primera columna. La capacidad de columna fue previamente determinada en experimentos de laboratorio a escala pequeña. La cromatografía de intercambio catiónico mostró que lo eluado de la segunda columna (o principal) conteniendo únicamente éter de dimetilo PEG (20, 000), saliendo solamente el polímero monofuncionalizado deseado en la segunda columna (o principal) . La mPEG (20, 000 Da) -amina, adsorbida en la segunda columna (o principal) , entonces se eluyó usando una solución de NaCl al 5% (600 mi) . El pH de lo eluado de la segunda columna (o principal) se ajustó a 11 con 0.5 M de hidróxido de sodio y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se agregó a éter de etilo. El producto precipitado se aisló por filtración y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 3.1 g. RMN(d6-DMSO) : 2.64 ppm (t, -CH2-N¾) , 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . El análisis por cromatografía de intercambio catiónico reveló que el producto secó, colectado contiene 100% de m-PEG(20,000 Da) -amina, libre de cantidades detectables de polímero neutral o difuncionalizado .

Ej emplo 3 Sal de sodio del ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da) Una solución de PEG (Mn = 20,300 Da, polidispersidad 1.040) (50.0 g, 0.005 equivalentes) comercialmente disponible en tolueno (300 mi) se secó de forma azeotrópica destilando completamente 50 mi de tolueno. Se agregaron diclorometano (60 mi), trietilamina (1.30 mi, 0.0093 moles) y cloruro de metansulfonilo (0.30 mi, 0.00388 moles, 11.5% de cantidad estequiometrica) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. La mezcla se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El residuo se disolvió en tolueno anhidro (250 mi) y se agregó metóxido de sodio (solución al 25% en metanol, 21.0 mi) . La mezcla se agitó durante la noche a 70°C bajo una atmósfera de argón. La mezcla entonces se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en 500 mi de agua destilada, se agregó NaCl (40 g) y el pH de la solución se ajustó a 7.2 con ácido fosfórico al 5%. El producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 44.1 g. El análisis RMN mostró que 66% de grupos PEG-OH se convirtieron a grupos PEG-OCH3. El PEG(20,000 Da) (40.0 g) parcialmente metilado obtenido anteriormente, se disolvió en tolueno (150 mi) y la solución se secó de forma azeotrópica destilando completamente 50 mi de tolueno. Después, se agregó una solución 1.0M de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (8.2 mi, 0.0082 moles, exceso 6.0 veces) a la mezcla de reacción anterior. Entonces se agregó bromoacetato de etilo (1.13 mi, 0.0102 moles, exceso 7.5 veces) y la mezcla se agitó durante la noche a 50°C bajo una atmósfera de argón. El solvente se destiló completamente bajo presión reducida y el residuo se disolvió en agua destilada (500 mi) . El pH de la solución se ajustó a 12.10 con 1M de hidróxido de sodio y la solución se agitó durante la noche, manteniendo el pH a 12.10 por adición periódica de 1M de hidróxido de sodio. El pH se ajustó a 1.0 con 1M de ácido clorhídrico y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó con sulfato de sodio anhidro, concentrado y se agregó a éter de etilo. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 34.7 g. RMN (d6-DNSO) : 3.21 ppm (s, -OC¾) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.01 ppm (s, -CH2-C00-) . .Análisis de cromatografía de intercambio aniónico: ácido dicarboxílico-PEG (20, 000 Da) (11.5%), ácido carboxílico-mPEG(20,000 Da) (45.0%), éter de dimetilo PEG(20,000) (43.5%). El análisis RMN mostró que el producto contiene 66% de grupos PEG-OC¾ y 34% de grupos de ácido carboxílico-PEG. La mezcla anterior se disolvió en agua destilada (3500 mi) y la solución resultante se aluyó a través de la primera columna cromatográfica (precolumna) empaquetada con 200 mi de gel de intercambio aniónico: Flujo Rápido DE¾E SEPHñROSE® (Pharmacia) . El análisis cromatográfico de intercambio aniónico reveló que lo eluado contiene únicamente ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da) y éter de dimetilo PEG(20,000 Da). Todo el ácido dicarboxilico-PEG (20, 000 Da) y parte del ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da) se adsorbieron (retenidos) por el gel en la precolumna. Después, la solución se aplicó a la segunda columna (columna principal) que contiene 800 mi de gel Flujo Rápido DEAE SEPHi¾ROSE®. La cromatografía de intercambio aniónico reveló que lo eluado de la columna contiene únicamente éter de dimetilo PEG(20,000 Da). El ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da), adsorbido (retenido) en la columna, se eluyó usando una solución de NaCl al 5% (1100 mi) . El pH de lo eluado entonces se ajustó a 7 y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro a éter de etilo para precipitar el polímero de ácido monocarboxilico purificado. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 13.2 g. RMN (d6-DMS0) : 3.21 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.01 ppm (s, -CH2-COO-) .

La cromatografía de intercambio aniónico reveló el producto recuperado por ser 100% de ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da), sin cualquier cantidad detectable de éter de dimetilo PEGÍ20,000 Da) o ácido dicarboxilico-PEG (20, 000 Da) .

Ejemplo 4 mPEG-20,000 Da libre de diol Se disolvieron ácido carboxilico-mPEG (20, 000 Da), sal de sodio (10.0 g, 0.00050 moles) en 150 mi de tolueno y el solvente se destiló completamente para remover rastros de agua. El producto secó se disolvió en tetrahidrofurano anhidro (100 mi) a 40-45°C y se agregó hidruro de aluminio y litio (1.0M de solución en tetrahidrofurano, 1.5 mi, 0.0015 moles) . La mezcla se agitó a 45°C durante la noche bajo atmósfera de argón. Se agregó acetato de etilo (0.5 mi), la mezcla se agitó 30 minutos, después la mezcla se enfrió a aproximadamente 30°C y se agregó agua (0.06 mi) y la mezcla se agitó 10 minutos. Después se agregó hidróxido de sodio (solución al 15% en agua, 0.06 mi), la mezcla se agitó 10 minutos, y finalmente se agregó agua (0.18 mi), la mezcla se agitó por 15 minutos, y después se filtró para remover la sal de aluminio precipitado. Se agregó alcohol isopropilico (500 mi) a lo filtrado, y el producto precipitado se filtró completamente bajo presión reducida. Rendimiento 8.7 g. RMN (d6-DMSO) : 3.21 ppm (s, 3H, -0C¾) i 3.51 ppm (s, estructura PEG) ; 4.57 ppm (t, 1H, -OH). El análisis CL7AR mostró que el producto es mPEG-20,000 Da 100% puro libre de diol. La cromatografía de infiltración de gel : Mn = 20,800 Da, polidispersidad 1.018.

Ejemplo 5 PEG (10, 000 Da) -g-hidroxi-cú-propilamina Una mezcla de PEG de peso molecular 10, 000 Da (20.0 g; 0.00400 equivalentes), agua destilada (20.0 g) e hidróxido de potasio (0.4 g) se enfrió a 0-5°C en un baño de hielo. Se agregó lentamente acrilonitrilo (0.5 g; 0.00942 moles), y la solución se agitó por 2 horas a 0-5°C. Se agregó NaCl (2 g) y el pH de la solución se ajustó a 7.0 con ácido fosfórico. Después, el producto de reacción se extrajo con diclorometano y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida dando 18.7 g del producto sólido blanco. El análisis RMN mostró que el producto contiene 75% de grupos PEG-OH y 25% de grupos PEG-0CH2CH2CN. El producto se disolvió en 150 mi de alcohol etílico y se agregó catalizador de paladio (10% en peso de carbono activado; 2 g) . La mezcla se hidrogenó a 65°C bajo 800 psi de hidrógeno. La mezcla entonces se filtró y el solvente se removió bajo vacío dando 16.4 g del producto blanco. El análisis RMN mostró que el producto contiene 77% de grupos PEG-OH y 23% de grupos PEG-0CH2CH2CH2NH2. El análisis por cromatografía de intercambio catiónico : PEG(10,000 Da) -dipropilamina 5.3%, PEG(10, 000 Da) -oí- idroxi-oi-propilamina 35.4%, y PEG(10,000 Da) 59.3%. La mezcla anterior se disolvió en agua destilada (1500 mi) y la solución resultante se filtró a través de una primera columna cromatográfica (precolumna) llenada con 30 mi de resina de intercambio catiónico POROS® 50 HS (Applied Biosystems) . El análisis cromatográfico de intercambio catiónico mostró que lo filtrado contiene únicamente PEG(10, 000 Da)-a-hidroxi^-propilamina y PEG(10, 000 Da). Todo del PEG(10,000 Da) -dipropilamina y parte de PEG(10,000 Da) -a-hidroxi-co-propilamina se adsorbieron (retenidos) por la resina en la precolumna. Después, la solución se aplicó a la segunda columna (columna principal) que contiene 250 mi de resina POROS® 50 HS. La cromatografía de intercambio catiónico mostró que lo eluado de la columna contiene únicamente PEG(10,000 Da). El PEG(10,000 Da) -cx-hidroxi-M-propilamina, adsorbido en la columna, entonces se eluyó usando solución de NaCl al 5% (350 mi) . El pH de lo eluado se ajustó a 11 con 0.5 M de hidróxido de sodio y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se agregó a éter de etilo. El producto precipitado se filtró completamente bajo presión reducida. Rendimiento 4.6 g. RMN (d6-DMSO) : 1.76 ppm (m, -CH2CH2NH2) , 2.80 ppm (t, -CH2-NH2)', 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.58 ppm (t, -OH) . Cromatografía de intercambio catiónico: PEG (10, 000 Da) -a-hidroxi-co-propilamina al 100%.

Ej emplo 6 PEG (10, 000 Da) -g-hidroxi-a-propilmaleimida Se disolvió PEG (10, 000 Da)- tx-hidroxi- ?-propilamina del Ejemplo 5 (4.0 g, 0.0004 moles) en una solución acuosa saturada de NaHC03 (30 mi) y la mezcla se enfrió a 0°C. Se agregó N-metoxicarbonilmaleimida (0.3 g) con agitación vigorosa. Después del agitado por 10 minutos, se agregó agua (10 mi) y la mezcla se agitó unos 50 minutos adicionales. El pH de ajustó a 3.0 con 0.5 N de ácido sulfúrico y se agregó aproximadamente 15% en peso de NaCl . El producto de reacción se extrajo con diclorometano, el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro, y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida a sequedad. El producto crudo se disolvió en 6 mi de diclorometano y se precipitó con 100 mi de alcohol isopropilico dando 3.6 g de polvo blanco después se secó bajo presión reducida. RMN (ds-DMSO) 1.88 ppm (m, -CH2CH2-maleimida, 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.58 (t, -OH), 7.03 ppm (s, CH=CH maleimida) .

Ejemplo 7 Ester N-hidroxisuccinimidilo del ácido propiónico- mPEG(20,000 Da) libre de diácido Se enfrió una mezcla de metoxi-PEG (o M-PEG-OH) de peso molecular 20,000 Da que contiene 6% en peso de PEG-diol que tiene peso molecular aproximadamente 40, 000 Da (HO-PEG-OH) (25.0 g) , agua destilada (25.0 mi) e hidróxido de potasio (0.5 g) a 0-5°C en una baño de hielo. Se agregó lentamente acetonitrilo (3.4 g) , y la solución se agitó por 2.5 horas a 0-5°C. El pH de la solución se ajustó a 7.0 por adición de ácido fosfórico. El producto se extrajo con diclorometano (200, 70 y 50 mi) . La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se agregó a éter de etilo frío. El producto precipitado se removió por filtración y se secó bajo vacío dando 23.5 g de mPEG(20,000 Da)-nitrilo. RMN (d6-DMSO) : 2.74 ppm (t, -CH2CN) , 3.21 ppm (s, -0CH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . Una mezcla de mPEG nitrilo de la etapa anterior (23.5 g) y ácido clorhídrico concentrado (117.5 g) se agitó a temperatura ambiente por 36 horas. La solución se diluyó con un litro de agua y se extrajo con diclorometano (200, 150 y 100 mi) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron dos veces con agua, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y concentraron a sequedad por evaporación rotatoria. Rendimiento de mPEG amida 21.5 g. RMN (ds-DMSO) : 2.26 ppm (t, -CH2C0NH2) , 3.21 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . Se disolvió mPEG amida de la etapa anterior (16.0 g) en 1150 mi de agua destilada, se agregó 100 g de hidróxido de potasio, y la solución se agitó por 22 horas a temperatura ambiente. Se agregó cloruro de sodio (150 g) , y la solución se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con ácido fosfórico al 5%, agua (dos veces), y se secaron sobre sulfato de sodio. La solución se concentró y el producto se precipitó por la adición a éter de etilo. El producto, ácido propiónico mPEG(20,000 Da) amplio, se colectó por filtración y se secó sobre vacio. Rendimiento de ácido 14.0 g. RMN (de-DMSO) : 2.43 ppm (t, -CH2COOH) , 3.21 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . La cromatografía de intercambio aniónico mostró que el producto contenido ácido propiónico-PEG (40, 000 Da) (6%), ácido propiónico-mPEG (20, 000 Da) (91%) y mPEG(20, 000 Da) (3%) . La mezcla anterior se disolvió en agua destilada (2,000 mi) y la solución resultante se filtró a través de la primera columna cromatográfica (precolumna) llenada con 50 mi de gel de intercambio aniónico: Flujo Rápido DE¾E SEPHñROSE® (Pharmacia) . El análisis cromatográfico de intercambio aniónico mostró que lo filtrado contiene únicamente ácido propiónico-mPEG(20, 000 Da) y PEG(20, 000 Da). Todo el ácido dipropiónico-PEG (40, 000 Da) y parte del ácido propiónico-mPEG(20,000 Da) se adsorbieron (retenidos) por el gel. Después la solución se aplicó en la segunda columna (columna principal) que contiene 600 mi de gel de Flujo Rápido DE¾E SEPHAROSE®. La cromatografía de intercambio aniónico mostró que lo eluado de la columna contiene únicamente PEG(20,000 Da). El ácido propiónico-mPEG (20, 000 Da), adsorbido en la columna, se eluyó usando una solución de NaCl al 5% (1100 mi) . El pH de lo eluado se ajustó a 7 y el producto se extrajo con diclorometano . El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se agregó a éter de etilo. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 12.0 g, RMN (d6-DMS0) : 2.43 ppm (t, -CH2COOH) , 3.21 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . La cromatografía de intercambio aniónico: ácido propiónico-mPEG (20, 000 Da) al 100%. No se detectó ácido dipropiónico-PEG (40, 000 Da). Se disolvió ácido propiónico-mPEG(20,000 Da) libre de diácido (4.0 g, 0.20 mmol) en diclorometano (20 mi) y se agregó N-hidroxisuccinimida (0.21 mmol) . La solución se enfrió a 0°C, se agregó por goteo una solución de diciclohexilcarbodiimida (0.20 mmol) en 4 mi de diclorometano, y la solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y se precipitó por adición a éter de etilo. Rendimiento del producto final: 3.8 g. RM (d5-DMS0) : 2.81 ppm (s, NHS) , 2.92 ppm (t, -CH2-COO-) , 3.21 ppm (s, -OC¾) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención llegarán a ser importantes a un experto en la técnica a las cuales esta invención pertenece que tiene el beneficio de las enseñanzas presentadas en la descripción anterior. Por lo tanto, se entenderá que la invención no se limita a las modalidades especificas descritas y que las modificaciones y otras modalidades se han pensado para ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque términos específicos se emplean en este documento, se usan en un sentido genérico y descriptivo únicamente y no para propósitos de limitación.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para formar un polímero funcionalizado, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un polímero soluble en agua y no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo; b) hacer reaccionar el polímero soluble en agua y no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo, en una o más etapas de reacción, con uno o más reactivos de funcionalización para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una mezcla que comprende (i) polímero soluble en agua y no peptidico insustituido a partir de la etapa (a), (ii) un polímero monosustituido que comprende un grupo único ?, y (iii) un polímero disustituido que comprende dos grupos Y, bajo condiciones efectivas para formar ya sea no más de aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido; y (c) purificar la mezcla de la etapa (b) para proporcionar un polímero monosustituido sustancialmente libre de las especies de polímeros insustituidos y disustituidos . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero soluble en agua y no peptídico es lineal o ramificado. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero soluble en agua y no peptídico se selecciona del grupo que consiste de poli (alquilen glicol) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (ácido cx-hidroxi) , poli (ácido acrílico) , poli (alcohol vinílico) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. 4. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero soluble en agua y no peptídico es un diol . 5. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero soluble en agua y no peptídico es poli(etilen glicol). 6. El Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque cada uno de los grupos hidroxilo se localizan como un término del polímero. 7. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero soluble en agua y no peptidico se proporciona en (a) un solvente seleccionado del grupo que consiste de un solvente orgánico, agua, una mezcla de agua y agua miscible en solvente, y una mezcla de agua y un solvente orgánico miscible. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicho solvente orgánico se selecciona del grupo que consiste de hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos clorados, amidas, ésteres, éteres, cetonas y organonitrilos . 9. El Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el solvente orgánico se selecciona del grupo que consiste de tolueno, xileno, benceno, diclorometano, cloroformo, acetonitrilo, dimetoxietano, tetrahidrofurano, dioxano, dimetilformamida,' acetona y mezcla de los mismos. 10. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular del polímero es de aproximadamente 100 Da hasta aproximadamente 100,000 Da. 11. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular del polímero es de aproximadamente 500 Da hasta aproximadamente 60,000 Da. 12. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular del polímero es de aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 40,000 Da. 13. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para formar no más que aproximadamente 12 por ciento del polímero disustituido. 14. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para formar no más que aproximadamente 8 por ciento del polímero disustituido. 15. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para formar no más que aproximadamente 5 por ciento del polímero disustituido. 16. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para formar no más que a roximadamente 2 por ciento del polímero disustituido . 17. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para formar no más que aproximadamente 1 por ciento del polímero disustituido. 18. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se conduce bajo condiciones efectivas para formar una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 40:1. 19. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se conduce bajo condiciones efectivas para formar una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 20:1. 20. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha reacción se conduce bajo condiciones efectivas para formar una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 18:1. 21. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Y es un grupo funcional protegido, y la etapa (b) además comprende, después de dicha etapa de reacción, desprotección de dicho grupos funcional protegido. 22. El Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Y es un ácido carboxílico protegido y dicha desprotección comprende hidrolizar el ácido carboxílico protegido con ello formar un ácido carboxílico. 23. El Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho ácido carboxilico protegido se selecciona del grupo que consiste de ésteres, tioésteres, amidas, amidatos, tioamidas e hidrazidas . 24. El Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho ácido carboxilico protegido es un orto éster. 25. El Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Y es una amina protegida . 26. El Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque Y es un carbonitrilo o amida primaria y dicha etapa de desprotección comprende reducir el carbonitrilo p amida primaria para con ello formar una amina. 27. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha etapa de reacción comprende una sustitución necleofilica o una reacción de adición nucleofilica . 28. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste de hidrato de aldehido, hidrato de cetona, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxilico, amida primaria, amida secundaria, amidato, 1, 3-oxazolina 2-sustituida, 1, 3- (4H) -dihidrooxazinas 2-sustituidas, 1,3-tiazolina 2-sustituida, 1, 3- (4H) -dihidrotiazinas 2-sustituidas, ditiopiridina, vinilpiridina, hidroxilamina y oxima. 29. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno de uno o más reactivos de funcionalización tiene la estructura X- (CRiR2)m-Y, en donde X es un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónico, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo está unido, en una sustitución nucleofilica o reacción de adición nucleofilica, ¾_ y R2 son cada uno independientemente ya sea H o alquilo, y m rangos de aproximadamente 0 hasta 10. 30. El Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque uno de uno o más reactivos de funcionalización tiene la estructura X- (CRiR2)m-Y, en donde X es un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónico, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo está unido, en una sustitución nucleofilica o reacción de adición nucleofilica, Ri y R2 son cada uno independientemente ya sea H o alquilo, y m rangos de aproximadamente 0 hasta 10, y Y tiene la estructura -C(0)-0-Rp, en donde Rp es un grupo alquilo o alquilo sustituido. 30. El Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque X se selecciona del grupo que consiste de un grupo saliente, un grupo vinilo sustituido, o un grupo vinilo insustituido. 31. El Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque X es un halógeno o éster de sulfonato. 33. El Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de alquilación del polimero no peptidico que comprende dos grupos hidroxilo antes de la etapa (b) , o alquilación de la mezcla formada en la etapa (b) antes a o subsecuente a la etapa de purificación (c) . 34. El Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque dicha etapa de alquilación comprende tratar la mezcla con un agente de alquilación seleccionado del grupo que consiste de alquilsulfato, alquilsulfonato, diazoalcano, alquilhaluro , dialquilacetal de ?,?-dimetilformamida, 3-alquil-l-p-toliltriaceno, hidróxido de trimetilanilina, fluoroborato de trialquiloxonio, hexafluorofosfato de trimetilsulfonio y tricloroacetamidato de alquilo. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque dicha alquilación es efectiva para convertir grupos hidroxilo en dicha mezcla a -ORr , en donde B/ es un radical orgánico que tiene de 1-20 átomos de carbono. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque R' se selecciona del grupo que consiste de metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y bencilo . 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende antes a la etapa (b) , convertir una porción de dichos hidroxilos de polímero a un grupo saliente, Y, con ello formar una primera mezcla que comprende el polímero soluble en agua y no peptídico de la etapa (a) , un polímero monosustituido que comprende un grupo Y sencillo, y un polímero disustituido que comprende dos grupos Y, bajo condiciones efectivas para formar no más que aproximadamente 45 por ciento del polímero disustituido. 38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Y es un grupo funcional ionizable y dicha etapa de purificación comprende purificar la mezcla por cromatografía intercambio iónico. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque dicha etapa de purificación comprende: pasar la mezcla formada en la etapa (b) a través de una primera columna de intercambio iónico para proporcionar un eluado, en donde el paso de la mezcla se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero disustituido en la primera columna; pasar lo eluado a través de una segunda columna de intercambio iónico bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero monosustituido en dicha segunda columna; lavar la segunda columna con agua o una solución que tiene baja fuerza iónica para remover el polímero insustituido; y pasar una solución que tiene alta fuera iónica a través de la segunda columna para desorber el polímero monosustituido . 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicha condición en dicha etapa de elución comprende una columna eficientemente ajustada para adsorber sustancialmente todo el polímero disustituido. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dichas condiciones en dicha etapa de purificación comprende uno o más columnas principales suficientemente ajustadas para adsorber sustancialmente todo el polímero monosustituido. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicha segunda columna de intercambio iónico se conecta en serie por uno o más columnas de intercambio iónico adicionales, y dicha etapa de lavado además comprende lavar la segunda y uno o más columnas de intercambio iónico y dicha etapa de pasar lo eluado además comprende pasar la solución que tiene alta fuerza iónica a través de dicha segunda y una o más columnas adicionales. 43. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque dicha etapa de purificación comprende las etapas de: pasar la mezcla formada en la etapa (b) a través de una primera columna de intercambio iónico para proporcionar lo eluado, en donde dicha etapa de pasar la mezcla se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero disustituido en la primer columna; pasar dicho eluado a través de una segunda columna de intercambio iónico conectada en serie a uno o más columnas de intercambio iónico adicionales bajo condiciones efectivas para adsorber una fracción del polímero monosustituido en dicha segunda columna; lavar la segunda columna y una o más columnas de intercambio iónico adicional con una solución que tiene baja fuerza iónico para remover el polímero insustituido; y pasar una solución que tiene alta fuerza iónica a través de la segunda y una o más columnas de intercambio iónico adicional para adsorber el polímero monosustituido. 44. Un método para formar un polímero funcionalizado alquilado, caracterizado dicho método comprende : (a) proporcionar un polímero soluble en agua y no peptídico que comprende dos grupos hidroxilo; (b) alquilar el polímero soluble en agua y no peptídico para formar una mezcla que comprende (i) polímero no alquilado,- soluble en agua y no peptídico de la etapa (a) , (ii) un polímero monoalquilado que comprende un grupo alcoxi sencillo, y (iii) un polímero dialquilado que comprende dos grupos alcoxi, bajo condiciones efectivas para formar al menos aproximadamente 25 mol por ciento del polímero dialquilado; (c) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (b) , en una o más etapas de reacción, con uno o más reactivos de funcionalización para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una mezcla que comprende (i) polímero no alquilado que comprende dos grupos Y, un polímero monoalquilado que comprende un grupo Y sencillo, y un polímero dialquilado que no comprende grupos Y; y (d) purificar la mezcla de la etapa (c) para proporcionar un polímero monoalquilado sustancialmente libre de especies no alquiladas o dialquiladas. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque una de dicho uno o más reactivos funcionalizados adicionalmente comprenden -X, un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónica, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo está unido . 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha etapa de alquilación se conduce bajo condiciones efectivas para formar una cantidad de polímero dialquilado que es al menos aproximadamente 40 mol por ciento del polímero dialquilado. 47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha etapa de alquilación se conduce bajo condiciones efectivas para formar una cantidad de polímero dialquilado que es al menos aproximadamente 65 mol por ciento del polímero dialquilado. 48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha etapa de alquilación se conduce bajo condiciones efectivas para formar una cantidad del polímero dialquilado que es al menos aproximadamente 90 por ciento del polímero alquilado. 49. Un método para formar un polímero funcionalizado, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un polímero que comprende una fórmula HO-POLI-OH, en donde POLI es un polímero soluble en agua y no peptídico; (b) opcionalmente, convertir HO-POLI-OH a una mezcla que comprende HO-POLI-OH, HO-POLI-Z y Z-POLI-Z, en donde Z es un grupo saliente, bajo condiciones efectivas para formar no más de aproximadamente 45 por ciento de Z-POLI-Z; (c) hacer reaccionar HO-POLI-OH de la etapa (a) o la mezcla de la etapa (b) con un reactivo de funcionalización que comprende la estructura X-L0,i-Y, en donde X es un grupo que reacciona con un hidroxilo, opcionalmente en forma aniónica, o con un átomo de carbono al cual el hidroxilo o grupo saliente está, unido, Lo,i es un enlazador opcional, y Y es un grupo ionizable, para formar una mezcla que comprende HO-POLI-OH, HO-POLI-L0, i~Y, y Y-L0, í-POLI-Lo, i~Y, bajo condiciones efectivas para formar preferiblemente no más de aproximadamente 25 por ciento de Y-LCÍ-POLI-LCI-Y; (d) opcionalmente, alquilar la mezcla de la etapa (b) o etapa (c) ; y (e) después de la desprotección del grupo funcional Y, si es necesario, purificar la mezcla de la etapa (c) o etapa (d) por cromatografía de intercambio iónico para proporcionar polímeros sustancialmente puros que comprenden un grupo -Lo,i~Y único. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque X es un halógeno o éster de sulfonato. 51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la etapa de purificación comprende las etapas de: pasar la mezcla de la etapa (c) o etapa (d) a través de una primera columna de intercambio iónico para proporcionar un eluado, en donde dicha etapa de pasar la mezcla se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todas las especies de polímeros que comprenden dos grupos -Lo,i~Y sobre la primera columna; pasar el eluado a través de una segunda columna de cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todas las especies de polímeros que tienen un grupo -Lo,i~Y único sobre dicha segunda columna; lavar la segunda columna con una solución que tiene baja fuerza iónica para remover solamente especies de polímeros que contienen grupos no Y; y pasar una solución que tiene alta fuerza iónica a través de la segunda columna para desorber las especies de polímeros que tienen un grupo -Lo,i-Y único. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el enlazador opcional, -L0,i, está presente y es hidrolíticamente estable. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el enlazador opcional, -L0,i, está presente y tiene la estructura -(CRiR2)m-/ en donde ¾ y ? son cada uno independientemente H o alquilo, y ra varia desde 0-10. 54. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque Y es una amina o ácido carboxilico. 55. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque dicha etapa de alquilación comprende tratar la mezcla con un agente de alquilación seleccionado del grupo que consiste de dialquilsulfato, alquilsulfonato, diazoalcano, haluro de alquilo, N, ' -dimetilformamida, dialquilacetal, 3-alquil-l-p-toliltriazina, hidróxido de trimetilanilinio, fluoroborato de trialquiloxonio, hexafluorofosfato de trimetilsulfonio y tricloroacetimidato de alquilo. 56. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la etapa de alquilación es efectiva para convertir grupos hidroxilo en dicha mezcla a -OR' , en donde R' se selecciona del grupo que consiste de alquilo Ci-C2o, alquilo Ci-C2o sustituido, alquilen-arilo C1-C20 y alquilen-arilo C1-C20 sustituido. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque R' se selecciona del grupo que consiste de metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y bencilo. 58. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque X es un nucleófilo efectivo para desplazar Z. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque Z es un grupo saliente seleccionado del grupo que consiste de halógeno y ésteres de sulfonato. 60. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque X se selecciona del grupo que consiste de grupos salientes, grupos vinilo sustituido y grupos vinilo insustituidos, m es 1-3 y Y es un ácido carboxilico protegido. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el grupo de ácido carboxilico protegido se selecciona del grupo que consiste de nitrilo, amida, éster de alquilo y orto éster. 62. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque X se selecciona del grupo que consiste de grupos salientes, grupos vinilo sustituidos y grupos vinilo insustituidos, m es 1-3, y Y es un carbonitrilo . 63. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque X es un halógeno, m es 0, y Y es p-tolilsulfonilo, metilsulfonilo, trifluorometilsulfonilo o trifluoroetilsulfonilo . 64. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el reactivo de funcionalización se selecciona del grupo que consiste de X'-(CR2CR2)j,-C(0)-0-Rp, CH2=CY'-C(0)-0-Rp, X' - (CRiCR2)a-Z, CH2=CY' - (CRxCRa -Z, X' - (CRxCRz) m=CN y C¾=CY' -C=N, en donde X' es halógeno, o éster de sulfonato, Z es un orto éster; Y' es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi o alcoxi sustituido y Rp es alquilo o alquilo sustituido. 65. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque dicha conversión comprende hacer reaccionar HO-POLI-OH con X' -SO2-R3 en donde R3 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, y X' es Br Cl . 66. El Método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque R3 es p-tolilo, metilo, trifluorometilo, o trifluoroetilo . 67. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque además comprende, después de dicha etapa de purificación, transformar Y del polímero sustancialmente puro a una porción reactiva diferente . 68. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque dicha porción reactiva comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, éster activo, carbonato activo, otro éster, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, hidrato de cetona, oxima, alquenilo, acrilato, metacrilato, nitrilo, amida primaria o secundaria, imida, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxilico, isocianato, isotiocianato, maleiinida, succinimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, amidato, 1,3-oxazolina 2-sustituida, 1 , 3- ( 4H) -dihidrooxazinas 2-sustituida, 1, 3-tiazolina 2-sustituida, 1,3-(4H)-hidrotiazinas 2-sustituida, hidroxilamina, yodoacetamida, epóxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato. 69. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque Y es un grupo funcional protegido y dicho método además comprende desproteger el grupo funcional previo a dicha purificación. 70. Un método para separar una mezcla de especies de polímeros por cromatografía de intercambio iónico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una mezcla de polímeros solubles en agua y no peptídicos, dicha mezcla comprende un polímero neutral ausente en un grupo funcional ionizable, un polímero monofuncional que comprende un grupo funcional ionizable único, y un polímero difuncional, que comprende dos grupos funcionales ionizables; (b) pasar la mezcla a través de una primera columna de intercambio, para proporcionar un eluado, en donde dicha etapa de pasar la mezcla se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero difuncional sobre la primera columna; (c) pasar el eluado a través de una segunda columna de intercambio iónico bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el polímero monofuncional sobre dicha segunda columna; (e) lavar la segunda columna con agua o una solución iónica baja para remover el polímero neutral ausente de un grupo funcional ionizable en una solución de lavado; y (f) pasar la solución que tiene alta fuerza iónica a través de la segunda columna para desorber el polímero monofuncional . 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque dicha segunda columna de intercambio iónico se conecta en serie a una o más columnas de intercambio iónico adicionales, y dicha etapa de lavado además comprende lavar dicha segunda columna y una o más columnas de intercambio iónico adicionales y dicha etapa de pasar el eluado además comprende eluir polímero ¦ monofuncional adsorbido de dicha segunda columna y una o más columnas adicionales. 72. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque además comprende pasar una solución que tiene suficiente fuerza iónica de la primera columna, para desorber el polímero difuncional. 73. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la primera columna es de un tamaño suficiente para adsorber sustancialmente todo el polímero difuncional y una fracción del polímero monofuncional . 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la fracción del polímero monofuncional adsorbido en la primera columna es menos de aproximadamente 70 por ciento. 75. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque además comprende monitorear la solución de lavado a partir de la segunda y una o más columnas adicionales durante dicha etapa de lavado, para determinar que sustancialmente todo el polímero neutral se ha removido. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la etapa de monitoreo .comprende analizar la solución de lavado por un método seleccionado del grupo que consiste de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de capa delgada y análisis infrarrojo. 77. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque dichas especies de polímeros son PEG y la etapa de monitoreo comprende tratar una muestra de dicha solución de lavado con 1% de ácido poliacrílico (Mn 250, 000) en HC1 1N para determinar la presencia del polímero. 78. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la etapa de lavado se lleva a cabo con agua destilada. 79. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la mezcla de polímero en la etapa (a) se proporciona en una solución acuosa que tiene baja fuerza iónica, para permitir la adsorción del polímero funcionalizado en el gel de intercambio iónico. 80. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el polímero neutral ausente en un grupo funcional ionizable tiene la estructura, HO-POLI-OH o R'O-POLI-OR' ; el polímero monofuncional tiene la estructura, HO-POLI-Lo,i-Y o R' 0-POLI-Lo,i-Y; y el polímero difuncxonal tiene la estructura, y-Lo,i~POLI-Lo,i-Y, en donde L es un enlazador opcional, Y es un grupo funcional y R se selecciona del grupo que consiste de alquilo Ci-C20r alquilo Ci-C2o sustituido, alquilen-arilo C1-C20 y alquilen-arilo C1-C20 sustituido. 81. El método de conformidad con la reivindicación 64 , caracterizado porque la mezcla en la etapa (a) comprende CH3O-POLI-OCH3, en combinación con H3CO-POLI-L0,i-Y, y Y-L0(1-POLI-L0,i-Y, en donde L es un enlazador opcional y Y es un grupo funcional. 82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la mezcla comprende no más de aproximadamente 40% en peso de H0-P0LI-0H y Y-Lo^- OLI-Lci-Y en combinación. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82 , caracterizado porque la mezcla comprende no más de aproximadamente 10% en peso de HO-POLI-OH y Y-Lo,i_POLI-L0,i-Y en combinación. 84. Un polímero monosustituido, caracterizado porque se prepara por el método de conformidad con la reivindicación 1. 85. Un polímero monosustituido, caracterizado porque se prepara por el método de conformidad con la reivindicación 39. 86. Un polímero monosustituido, caracterizado porque se prepara por el método de conformidad con la reivindicación 44. 87. Un aparato de cromatografía de intercambio iónico, caracterizado porque comprende: un suministro de una solución de una mezcla de polímero soluble en agua y no peptídico, que comprende grupos funcionales ionizables ausentes de polímero neutral, un polímero monofuncional que comprende un grupo funcional ionizable único, y un polímero difuncional que comprende dos grupos funcionales ionizables ; una primera columna de intercambio iónico que comprende una primera entra, una primera salida, y un primer medio de intercambio iónico, dicha primera entrada está en comunicación fluida condicho suministro; una segunda columna de intercambio iónico que comprende una segunda entrada, una segunda salida y dicho segundo medio de intercambio iónico, dicha segunda entrada está en comunicación fluida con dicha primera salida; y al menos un recipiente de recuperación de producto en comunicación fluida con dicha segunda salida, adaptado para recibir eluente que sale de dicha segunda columna de cromatografía de intercambio iónico. 88. El aparato de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque dicha primera columna de intercambio iónico es de un tamaño suficiente para adsorber sustancialmente todo el polímero difuncional. 89. El aparato de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque además comprende un recipiente de recuperación de producto en comunicación fluida con la primera salida, adaptado para recibir el eluente que sale de dicha primera columna de intercambio lonxco . 90. El aparato de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque además comprende un suministro de solución de sal en comunicación fluida con al menos una de dichas primera y segunda entradas. 91. El aparato de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque además comprende un suministro de solución neutral en comunicación fluida con al menos una de dichas primera y segunda entradas. 92. El aparato de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque además comprende una o más columnas de intercambio iónico adicionales conectadas en serie, y en comunicación fluida con dicha segunda salida. 93. Un compuesto caracterizado porque tiene la siguiente estructura: ,? (CH)n'—N¾ R40A V ;n en donde (n) es desde 2 hasta 3,000, R4 es H o un radical orgánico, y (?' ) es 3 hasta 10. 94. El compuesto de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque (n) es desde 10 hasta 2,000. 95. El compuesto de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque R4 es alquilo. 96. El compuesto de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque alquilo es metilo o bencilo . 97. El compuesto de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque (n' ) es 3. 98. Un compuesto caracterizado porque tiene la siguiente estructura: en donde (n) es desde 2 hasta 3,000, R4 es H o un radical orgánico, y (n' ) es 3 hasta 10. 99. El compuesto de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque (n) es desde 10 hasta 2,000. 100. El compuesto de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque R es alquilo. 101. El compuesto de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque alquilo es metilo o bencilo . 102. El compuesto de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque (?' ) es 3. 103. Una composición que comprende un poli (etilenglicol) de extremo tapado monometoxi ("mPEG-OH") , caracterizada porque la composición tiene un contenido de diol de poli (etilenglicol ) de menos de 0.3%. 104. La composición de conformidad con la reivindicación 103. caracterizada porque tiene una polidispersidad de menos de aproximadamente 1.025. 105. Un método para formar una composición purificada de mPEG monosustituido, caracterizado porque comprende un grupo funcional único, Y, a partir de una mezcla de mPEG y diol de PEG, que comprende las etapas de: (a) hacer reaccionar el mPEG y diol de PEG, en una o más etapas de reacción, con uno o más reactivos de funcionalización, para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una composición que comprende (i) mPEG monosustituido que comprende un grupo Y único, y (ii) disustituir PEG, bajo condiciones efectivas para convertir sustancialmente todos los grupos hidroxilo en la mezcla a grupos Y; y (b) purificar la composición de la etapa (a) para proporcionar la composición purificada del mPEG monosustituido que comprende un grupo Y único, sustancialmente libre del PEG disustituido. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la concentración del diol de PEG en la mezcla de mPEG y diol de PEG, es desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 40%. 107. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la etapa de purificación comprende pasar la composición de la etapa (a) a través de una columna de intercambio iónico para proporcionar un eluado, en donde dicha etapa de paso se lleva a cabo bajo condiciones efectivas para adsorber sustancialmente todo el PEG disustituido sobre la columna. 108. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque mPEG se recupera del eluado. 109. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque Y es un ácido carboxilico . 110. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque Y es una amina. 111. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque además comprende la etapa de convertir el grupo Y de un mPEG monosustituido que comprende un grupo Y único, a un grupo hidroxilo o un grupo que contiene hidroxilo. 112. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque además comprende la etapa de remover el grupo Y del mPEG monosustituido que comprende un grupo Y único a un grupo hidroxilo. RESOMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos para preparar polímeros de funcionalización y otros, a partir de alcoholes poliméricos tales como poli (etilenglicoles) . Además, también se proporcionan composiciones poliméricas, conjugados, reactivos poliméricos .