MXPA05009805A - Ligandos para proteinas de enlace tgf-beta y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y metodos que se relacionan con la asociacion especifica inesperada de: (i) la proteina esclerostina de enlace de TGF-beta con la proteina cordina antagonista de BMP para formar un complejo, y de (ii) la proteina esclerostina de enlace de TGF-beta con la proteina noggina antagonista de BMP para formar un complejo, cualquiera de cuyos complejos es incapaz de enlazarse con un miembro de la superfamilia de TGF-beta, tal como BMP. La invencion proporciona complejos aislados para utilizarse en ensayos de rastreo con el fin de identificar agentes que modulen la mineralizacion osea, y ofrece otras ventajas relacionadas.

Description

L GANDOS PARA PROTEÍNAS DE ENLACE DE TGF-BETA Y USOS DE LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a productos y métodos farmacéuticos, y más específicamente, a métodos y composiciones adecuadas para modular (aumentar o reducir) el contenido mineral de los huesos. Estas composiciones y métodos se pueden utilizar para tratar una amplia variedad de condiciones, incluyendo, por ejemplo, osteopenia, osteoporosis, fracturas y otros trastornos en donde una baja densidad mineral ósea sea una marca de la enfermedad . Descripción de la Técnica Relacionada Se presentan cambios a la masa ósea en distintas fases durante la vida de un individuo (por ejemplo, Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991 ). La primera fase se presenta tanto en hombres como en mujeres, y procede hasta la obtención de una masa ósea pico. Esta primera fase se logra a través del crecimiento lineal de las placas de crecimiento e n d o co n d r¡ a I es , y del crecimiento radial debido a un índice de aposición periosteal. La segunda fase empieza alrededor de los 30 años de edad para el hueso trabecular (los huesos planos, tales como las vértebras y la pelvis), y aproximadamente a los 40 años de edad para el hueso cortical (por ejemplo, los huesos largos que se encuentran en los miembros) y continúa hasta la ancianidad. Esta fase se caracteriza por una pérdida ósea lenta, y se presenta tanto en hombres como en mujeres. En las mujeres, también se presenta una tercera fase de pérdida ósea, más pro ablemente debido a las deficiencias de estrógeno post-menopáusicas. Durante esta fase solamente, las mujeres pueden perder un 10 por ciento adicional de masa ósea del hueso cortical, y un 25 por ciento adicional del compartimiento trabecular (ver Riggs, supra). La pérdida del contenido mineral óseo puede ser causada por una amplia variedad de condiciones, y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en los seres humanos, caracterizada por notorias reducciones en la masa ósea esquelética y en la densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo degradación de la microarquitectura del hueso y los aumentos correspondientes en la fragilidad y susceptibilidad de los huesos a las fracturas en los individuos afligidos. La osteoporosis en los seres humanos es precedida por osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor que una desviación estándar pero menor que 2.5 desviaciones estándares debajo del valor medio para el hueso adulto joven), una condición que se encuentra en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Otros 7 a 8 millones de pacientes en los Estados Unidos han sido diagnosticados con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral ósea mayor que 2.5 desviaciones estándares debajo de aquél del hueso adulto joven maduro). La osteoporosis es una de las enfermedades más costosas para el sistema del cuidado de la salud, costando decenas de miles de millones de dólares anualmente en los Estados Unidos. En adición a los costos relacionados con el cuidado de la salud, el cuidado residencial a largo plazo y los días laborales perdidos, se agregan a los costos financieros y sociales de esta enfermedad. En todo el mundo, aproximadamente 75 millones de personas están en riesgo de osteoporosis. La frecuencia de la osteoporosis en la población humana aumenta con la edad, y entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en las mujeres (quienes comprenden el 80 por ciento del grupo de pacientes con osteoporosis en los Estados Unidos). La mayor fragilidad y susceptibilidad a fracturas de los huesos esqueléticos en los ancianos, es agravada por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. En los Estados Unidos se reportan más de 1.5 millones de fracturas óseas relacionadas con la osteoporosis cada año. Entre las lesiones más comunes asociadas con la osteoporosis están caderas, muñecas, y vértebras fracturadas. Las fracturas de la cadera son en particular extremadamente incómodas y costosas para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con altos índices de mortalidad y patología. Aunque la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a una masa ósea reducida, ninguno de los tratamientos actualmente disponibles para los trastornos esqueléticos puede aumentar sustancialmente la densidad ósea de los adultos. Existe una fuerte percepción entre muchos médicos de que se necesitan fármacos que puedan aumentar la densidad ósea en los adultos, en particular en los huesos de la muñeca, de la columna vertebral, y de la cadera, que estén en riesgo de osteopenia y osteoporosis. Las estrategias actuales para la prevención de osteoporosis pueden ofrecer algún beneficio a los individuos, pero no pueden asegurar la resolución de la enfermedad. Estas estrategias incluyen una actividad física moderada (en particular actividades de carga de peso) con el establecimiento de la edad avanzada, incluyendo calcio adecuado en la dieta, y evitar el consumo de productos que contengan alcohol o tabaco. Para los pacientes que se presentan con osteopenia u osteoporosis clínica, los fármacos y estrategias terapéuticas actuales prevalecientes se dirigen a reducir una pérdida adicional de la masa ósea mediante la inhibición del proceso de absorción ósea, un componente natural del proceso de remodelación ósea que se presenta de una forma constitutiva. Por ejemplo, ahora se está recetando estrógeno para retardar la pérdida ósea. Sin embargo, existe alguna controversia sobre si existe algún beneficio a largo plazo para los pacientes, y si hay algún efecto en realidad en los pacientes mayores a 75 años de edad. Más aún, se cree que el uso de estrógeno aumenta el riesgo de cáncer de mama y endometrial. También se han sugerido la calcitonina, la osteocalcina con vitamina K, o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para las mujeres post-m e n o p á u s i c a s . Sin embargo, las altas dosis de calcio con frecuencia pueden tener efectos gastrointestinales secundarios desagradables, y se deben monitorear continuamente los niveles de calcio en suero y en orina (por ejemplo, Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1996). Otros planteamientos terapéuticos para la osteoporosis incluyen bisfosf onatos (por ejemplo, Fosamax R, ActonelMR, BonvivaMR, ZometaMR, olpadronato, neridronato, skelida, bonefos), hormona p a ra t i ro i d es , ca I ci I íti co s , ca I c¡ m i m é t i c os (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esferoides anabólicos, sales de lantanio y estroncio, y fluoruro de sodio. Sin embargo, estos terapéuticos con frecuencia están asociados con efectos secundarios indeseables (por ejemplo, la calcitonina y los esteroides pueden causar náusea y pueden provocar una reacción inmune; los bisfosfonatos y el fluoruro de sodio pueden inhibir la reparación de fracturas, inclusive cuando la densidad ósea aumente modestamente), que pueden precluir su uso eficaz (ver Khosla y Riggs, supra). Las estrategias terapéuticas limitadas actualmente practicadas para el tratamiento de una condición asociada con una mineralización ósea excesiva o insuficiente, tal como la osteoporosis u otros trastornos caracterizados por pérdida de mineralización ósea, involucra un fármaco que module (es decir, aumente o reduzca de una manera estadísticamente significativa) la masa ósea. En particular, ninguna estrategia actual estimula o mejora terapéuticamente el crecimiento de nueva masa ósea. La presente invención proporciona composiciones y métodos que se pueden utilizar para aumentar la mineralización ósea, y que, por consiguiente, se pueden utilizar para el tratamiento de una amplia variedad de condiciones en donde sea deseable aumentar la masa ósea. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un primer aspecto de la invención proporcionar un complejo aislado que comprende una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP en asociación específica, en donde: (i) la proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina que es capaz de enlazarse de una manera específica con un primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-5 y un polipéptido BMP-6, y (ii) la proteína antagonista de BMP se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido de cordina y un polipéptido de noggina, siendo esta proteína antagonista de BMP capaz de enlazarse de una manera específica con cuando menos un segundo polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-2, un polipéptido BMP-4, y un polipéptido BMP-7, y en donde el complejo es incapaz de enlazarse con el primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta. Por consiguiente, la invención proporciona, en ciertas modalidades, un complejo aislado que comprende una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta en asociación específica, en donde: (a) la primera proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un primer miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un primer ligando cognado; y (b) la segunda proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un segundo miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un segundo ligando cognado; en donde el complejo es incapaz de enlazarse con el primer ligando cognado. En otra modalidad, la invención proporciona un complejo aislado que comprende una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta en asociación específica, en donde: (a) la primera proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un primer miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un primer ligando cognado, y (b) la segunda proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un segundo miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un segundo ligando cognado; en donde el complejo es incapaz de enlazarse con cualquiera del primero y segundo ligandos cognados. En ciertas modalidades adicionales, la primera proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina, y el primer ligando cognado es cuando menos un polipéptido seleccionado a partir de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, y BMP-7, y en donde la segunda proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de cordina, y el segundo ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir de BMP-2, BMP-4, y BMP-7. En algunas otras modalidades adicionales, la primera proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina, y el primer ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir de BMP-5 y BMP-6, y en donde la segunda proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de noggina, y el segundo ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir de BMP-2, BMP-4, BMP-7, y GDF-5. En otras modalidades, la presente invención proporciona un método para identificar un agente que module el enlace entre una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP, el cual comprende los pasos de: (a) poner en contacto, en ausencia y en la presencia de un agente candidato, una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP bajo condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la asociación específica de la proteína de enlace de TGF-beta y la proteína antagonista de BMP, para formar un complejo de acuerdo con la reivindicación 1; y (b) determinar un nivel del complejo que esté presente, en donde una diferencia en el nivel de los complejos en la presencia del agente candidato en relación con el nivel en ausencia del agente candidato indica que el agente modula el enlace entre la proteína de enlace de TGF-beta y la proteína antagonista de BMP. En otra modalidad, se proporciona un método para identificar un agente que module el enlace entre una primera proteína de enlace de TGF-beta y una segunda proteína de enlace de TGF-beta, el cual comprende los pasos de: (a) poner en contacto, en ausencia y en la presencia de un agente candidato, una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la asociación específica de las primera y segunda proteínas de enlace de TGF-beta, para formar un complejo; y (b) determinar un nivel del complejo que esté presente, en donde una diferencia en el nivel de los complejos en la presencia del agente candidato en relación con el nivel en ausencia del agente candidato indica que el agente altera el enlace entre la primera proteína de enlace de TGF-beta y la segunda proteína de enlace de TGF-beta. En ciertas modalidades adicionales de los dos métodos recién descritos, el agente candidato reduce la asociación específica de las proteínas para formar un complejo, y en algunas otras modalidades adicionales, el agente candidato aumenta la asociación específica de las proteínas para formar un complejo, y en algunas otras modalidades adicionales, el agente candidato estabiliza la asociación específica de las proteínas para formar un complejo. En algunas otras modalidades adicionales, el agente candidato se selecciona a partir de una molécula orgánica, un producto natural, un péptido, un oligosacárido, un ácido nucleico, un lípido, un anticuerpo o un fragmento de enlace del mismo, y una célula. En algunas otras modalidades adicionales, el agente candidato se obtiene a partir de una biblioteca de compuestos, cuya biblioteca de acuerdo con todavía algunas otras modalidades, se selecciona a partir de una biblioteca de péptidos aleatorios, una biblioteca de productos naturales, una biblioteca de combinación, una biblioteca de oligosacáridos, y una biblioteca de exhibición de fagos. De conformidad con lo anterior, es un aspecto de la invención proporcionar un agente identificado de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriormente descritos. En algunas otras modalidades, se proporciona un método para modular la densidad ósea, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, un agente que module la interacción entre: (i) un polipéptido de esclerostina que es capaz de enlazarse de una manera específica con un primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-5 y un polipéptido BMP-6, y (ii) una proteína antagonista de BMP que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido de cordina y un polipéptido de noggina, siendo esta proteína antagonistas de BMP capaz de enlazarse de una manera específica con cuando menos un segundo polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-2, un polipéptido BMP-4, y un polipéptido BMP-7. En algunas modalidades adicionales, el agente comprende un mimético del polipéptido de cordina o del polipéptido de noggina. En ciertas otras modalidades adicionales, el agente modula la mineralización ósea. Estos y otros aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes después de una referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos. En adición, en la presente se estipulan diferentes referencias que describen con mayor detalle ciertos aspectos de esta invención, y por consiguiente, se incorporan como referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTES VISTAS DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración esquemática que compara la secuencia de aminoácidos de Dan Humano; Gremlin Humano; Cerberus Humano y Beer Humano. Las flechas indican la estructura base de cisteína. La Figura 2 muestra el enlace de los antagonistas de BMP cordina (Figura 2A), y noggina (Figura 2B) a la esclerostina humana recombinante, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). La Figura 3 muestra el enlace del antagonista de BMP noggina a la esclerostina en un ensayo de inmunoprecipitación. La Figura 4 muestra un enlace competitivo con la esclerostina por parte de BMP-6 y noggina. La Figura 5 muestra un enlace competitivo con la esclerostina por parte de BMP-6 y cordina. La Figura 6 muestra el enlace de la BMP-6 humana con la esclerostina humana y con la esclerostina de rata. La Figura 7 muestra los efectos de los anticuerpos anti-BMP-6 sobre el enlace de BMP-6 a la esclerostina. La Figura 8 muestra el rastreo de anticuerpos anti-esclerostina para la inhibición de la interacción del enlace de BMP-6 con esclerostina. La Figura 9 muestra la inhibición por parte de un anticuerpo policlonal anti-esclerostina del enlace de esclerostina por parte de noggina o cordina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se deriva de la sorprendente observación de las interacciones de enlace específico entre ciertas combinaciones emparejadas de miembros de la extensa familia de proteínas de enlace de TGF-beta unas con otras, en lugar de hacerlo con miembros de la superfamilia distinta de proteínas TGF-beta, para formar complejos de primera y segunda proteínas de enlace de TGF-beta en asociación específica. De acuerdo con lo anterior, y como se describe con mayor detalle más adelante, de conformidad con ciertos aspectos de la presente invención, se identifica por primera vez un complejo aislado que comprende una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP en asociación específica, en donde: (i) la proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina que es capaz de enlazarse de una manera específica con un primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir de un polipéptido BMP-5 y de un polipéptido BMP-6, y (ii) la proteína antagonista de BMP se selecciona a partir de un polipéptido de Cordina y un polipéptido de Noggina, siendo la proteína antagonista de BMP capaz de enlazarse de una manera específica con cuando menos un segundo polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir de un polipéptido BMP-2, un polipéptido BMP-4, y un polipéptido BMP-7, y en donde el complejo es incapaz de enlazarse con el primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta. La identificación de estas interacciones de enlace específico entre proteínas particulares proporciona pares de enlace que se pueden explotar útilmente, por ejemplo, para rastrear agentes que modulen (es decir, que aumenten o reduzcan de una manera estadísticamente significativa) la formación de complejos por parte de estas proteínas en asociación específica, cuyos agentes se pueden emplear para manipular los eventos fisiológicos mediados por la formación de estos complejos. En particular, las composiciones y métodos proporcionados por la presente invención son útiles en estrategias terapéuticas relacionadas con la influencia sobre la m i n e ra I i za c i ó n ósea, por ejemplo en osteoporosis y otros trastornos asociados con una mineralización ósea anormal, como se describen en la presente. Se debe entender que las moléculas de un interés particular de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas o péptidos (por ejemplo, anticuerpos, componentes de enlace recombinante, péptidos con una afinidad de enlace deseada), ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, moléculas de ácido nucleico quiméricas, y análogos de ácidos nucleicos tales como PNA); y compuestos orgánicos o inorgánicos. Entre las moléculas especialmente significativas a las que se hace referencia en la presente, están el Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF-beta), el cual incluye a cualquier miembro conocido o novedoso de la superfamilia de TGF-beta, que también incluye a las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs); los receptores de TGF-beta, lo cual debe entenderse que se refiere al receptor específico para un miembro particular de la superfamilia de TGF-beta (incluyendo a las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)); y las proteínas de enlace de TGF-beta, lo cual debe entenderse para referirse a una proteína con una afinidad de enlace específico para un miembro o subconjunto particular de miembros de la superfamilia de TGF-beta (incluyendo a las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)). Los ejemplos específicos de las proteínas de enlace de TGF-beta incluyen las proteínas codificadas por las SEQ ID NOs: 1 , 5, 7 , 9, 11 , 13, y 15. (Ver, por ejemplo, Balemans y colaboradores, 2002 Dev. Biol. 250:231 ; Schmitt y colaboradores, 1999 J. Orthopaed . Res. 17:269; Khalil, 1999 Microbes Infecí. 1 :1255; Miyazono y colaboradores, 1993 Growth Factors 8:11 ; von Bubnoff y colaboradores, 2001 Dev. Biol. 239:1 ; Koli y colaboradores, 2001 Microsc. Res. Tech. 52:354; Ebara y colaboradores, 2002 Spine 27(16 Suplemento 1 ):S10; Bodestam, 2002, Ligands & Signaling Components of the Transforming Growth Factor & Family, Helsinki University Biomedical Dissertations No. 17). De conformidad con lo anterior, por ejemplo, se debe entender que la inhibición del enlace de la proteína de enlace de TGF-beta a la familia de proteínas TGF-beta y a las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), se refiere a las moléculas que permiten la activación de TGF-beta o de las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), o que permiten el enlace de los miembros de la familia de TGF-beta, incluyendo a las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) con sus receptores respectivos, removiendo o impidiendo el enlace de TGF-beta con la proteína de enlace de TGF. Esta inhibición se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante moléculas que inhiban el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con miembros específicos de la superfamilia de TGF-beta. Vector se refiere a un ensamble que es capaz de dirigir la expresión de la proteína deseada. El vector debe incluir elementos promotores de transcripción, los cuales se enlazan operativamente con los genes de interés. El vector puede estar compuesto ya sea de ácidos d e s oxi r ri b o n u c I e i co s ("ADN"), ácidos ribonucleicos ( " A R N " ) , o una combinación de los dos (por ejemplo, una quimera de ADN-ARN). Opcionalmente, el vector puede incluir una secuencia de p o I i a d e n i I a c i ó n , uno o más sitios de restricción, así como uno o más marcadores s e I e ce i o n a b I e s , tales como fosfotransferasa de neomicina o fosfotransferasa de higromicina. Adicionalmente, dependiendo de la célula huésped seleccionada y del vector empleado, también se pueden incorporar otros elementos genéticos, tales como un origen de réplica, sitios de restricción de ácido nucleico adicionales, p o te n c i a d o re s , secuencias que confieran inducibilidad de transcripción, y marcadores seleccionables, en los vectores descritos en la presente. Una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifique una proteína de enlace de TGF que se haya separado del ADN genómico de una célula eucariótica, es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no esté integrada en el genoma de un organismo. La molécula de ácido nucleico aislada puede ser ADN genómico, ADNc, ARN, o puede estar compuesta cuando menos en parte de análogos de ácidos nucleicos, Un polipéptido aislado es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos, u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Dentro de ciertas modalidades, una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado se aparece nominalmente como una sola banda en el gel de SDS-PAGE con teñido con Azul Coomassie. "Aislada", al referirse a las moléculas orgánicas, significa que los compuestos son más del 90 por ciento puros empleando métodos que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, RMN, punto de fusión). Esclerosteosis es un término que fue aplicado por Hansen (1967) (Hansen, H. G., S k I e ro ste o s e . En : Opitz, H.; Schmid, F. , Handbuch der Kinderheilkunde. Berlín : Springer (pub. ) 6 1967. Páginas 351 -355), para un trastorno similar a la hyperostosis corticaüs generalisata de van Buchem, pero que difiere posiblemente en la apariencia radiológica de los cambios óseos y en la presencia de sindactilidad cutánea asimétrica de los dedos índice y medio en muchos casos. La mandíbula tiene una apariencia inusualmente cuadrada en esta condición. Los anticuerpos humanizados son proteínas re co m b i n a ntes en donde las regiones determinantes de complementariedad del donador (tal como murino, conejo) de los anticuerpos m o n o el o n a I es , se han transferido desde las cadenas variables pesada y ligera de la i n m u n o g i o b u I i n a del donador hasta un dominio variable del aceptor (tal como un ser humano). Como se utiliza en la presente, un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se enlaza con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal de proteína de enlace a n t i-T G F- be ta , se enlaza con un epítopo de la proteína de enlace de TGF-beta. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o genéticamente diseñada que actúe como un anticuerpo mediante su enlace con un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados consistentes en la región variable de cadena ligera y pesada, los fragmentos "Fv" consistentes en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, las moléculas de polipéptidos de una sola cadena recombinantes en donde las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico ("proteínas sFv"), y las unidades de reconocimiento mínimo consistentes en los residuos de aminoácidos que imitan a la región hipervariable. Fv es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y enlace de antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente (dímero VH-VL). Es en esta configuración en donde interactúan las tres regiones determinantes de co m I e m e n ta r i e d a d de cada dominio variable para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones determinantes de complementariedad confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, inclusive un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda solamente tres regiones determinantes de complementariedad específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y enlazar al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de enlace entero. Anticuerpo de una sola cadena ( " S C A " ) , se define como una molécula genéticamente diseñada que contiene a la región variable de la cadena ligera, a la región variable de la cadena pesada, enlazada por un enlazador polipeptídico adecuado, como una molécula de una sola cadena genéticamente fusionada. Estos anticuerpos de una sola cadena también son referidos como fragmentos de anticuerpos "Fv de una sola cadena" o "sFv". En términos generales, el poiipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que hace posible que el sFv forme la estructura deseada para el enlace del antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg and Moore eds., S pri n g e r-Ve rl a g , N.Y., páginas 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena del poiipéptido (VH-VL). Mediante la utilización de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena, y a crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos y construcciones de anticuerpos pequeñas similares se describen más completamente, por ejemplo, en las Patentes Números EP 404,097; WO 93/11161 , Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993); Muyldermaus, S., J. Biotechnol., 74:277-302 (2001 ); Davies, J . y colaboradores, B i ot e ch n o I ogy , 13:475-479 (1995); Nguyen, V. K. y colaboradores, Immunology, 109:93-101 (2003). Una marca detectable es una molécula o átomo que se puede conjugar con una fracción de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de las marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones p a ra m a g n é t i co s , enzimas, y otras fracciones marcadoras. Como se utiliza en la presente, un inmunoconjugado es una molécula que comprende un anticuerpo a n t i - p ro t e í n a de enlace de TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo, y una marca detectable. Un inmunoconjugado tiene aproximadamente la misma capacidad, o sólo una capacidad ligeramente reducida, para enlazarse con la proteína de enlace de TGF-beta después de la conjugación, así como antes de la conjugación. Como se utiliza en la presente, "modular" significa aumentar o reducir de una manera estadísticamente significativa. Abreviaturas: TGF-beta - "Factor de Crecimiento Transformante-beta"; TGF-bBP - "proteína de enlace de Factor de Crecimiento Transformante-beta" (una TGF-bBP representativa es designada como " e s el e ros ti n a " , "Beer", o "H. Beer"); BMP - "pro teína morfogenética ósea"; PCR- "reacción en cadena de la polimerasa"; RT-PCR - un proceso de reacción en cadena de la polimerasa en donde primero se transcribe el ARN en el ADN en el primer paso, utilizando transcriptasa inversa (RT); ADNc - cualquier ADN hecho mediante la copia de una secuencia de ARN en forma de ADN. Como se observa anteriormente, la presente invención proporciona complejos aislados que comprenden una proteína de enlace de TGF-beta en asociación específica con una proteína antagonista de BMP, y métodos y composiciones relacionadas, incluyendo aquéllas para aumentar el contenido mineral óseo en animales de sangre caliente. Dicho de una manera breve, las presentes invenciones se basan en el descubrimiento inesperado de que las proteínas antagonistas de BMP cordina y noggina, son cada una capaces de enlazarse de una manera específica con la esclerostina. Por lo tanto, como se describe con mayor detalle más adelante, este descubrimiento ha conducido al desarrollo de ensayos que se pueden utilizar para seleccionar moléculas que inhiben el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con la familia de proteínas TGF-beta y las proteínas m o rf o g e n é ti ca s óseas (BMPs), y métodos para utilizar estas moléculas con el fin de aumentar el contenido mineral óseo de los animales de sangre caliente (incluyendo, por ejemplo, los seres humanos). La superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF-beta) contiene una variedad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes (tanto al nivel secundario como terciario). Se sabe que esta familia de proteínas ejerce un amplio espectro de respuestas biológicas sobre una gran variedad de tipos de células. Muchas de ellas tienen funciones importantes durante el desarrollo embrionario en la formación del patrón y en la especificación del tejido; en los adultos están involucradas, por ejemplo, en el sanado de heridas y en la reparación de huesos y en la remodelación ósea, y en la modulación del sistema inmune. En adición a los tres TGF-beta, la superfamilia incluye a las Proteínas M o rf o g e n é t i ca s Óseas (BMPs), Activinas, Inhibinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDFs), y Factores Neurotróficos de Derivación Glial (GDNFs). La clasificación primaria se establece a través de las características generales de las secuencias que agrupan a una proteína específica en una sub-familia general. Es posible una estratificación adicional dentro de la sub-familia, debido a una conservación de secuencia más estricta entre los miembros del grupo más pequeño. En ciertos casos, tales como con DMP-5, DMP-6, y DMP-7, ésta puede ser tan alta como una homología de aminoácidos del 75 por ciento entre los miembros del grupo más pequeño. Este nivel de identidad hace posible que una sola secuencia representativa ilustre los elementos bioquímicos claves del subgrupo, que las separan de otros miembros de la familia más grande. TGF-beta señala mediante la inducción de la formación de complejos hetero-oligoméricos de los receptores tipo I y tipo II. Se ha determinado la estructura del cristal de TGF-beta2. El pliegue general del monómero de TGF-beta2 contiene una estructura tipo nudo estable y compacta de cisteína, formada por tres puentes de disulfuro. La dimerización, estabilizada mediante un puente de disulfuro, es antiparalela. Los miembros de la familia de TGF-beta inician su acción celular mediante su enlace con los receptores con una actividad de quinasa de s e r i n a/t re o n i n a intrínseca. Esta familia de receptores consiste en dos s u b-f a m i I i a s , denotadas por los receptores tipo I y tipo II. Cada miembro de la familia de TGF-beta se enlaza con una combinación característica de receptores tipo I y tipo II, ambos de los cuales se necesitan para la señalización. En el modelo actual para la activación de TGF-beta, el TGF-beta se enlaza primero con el receptor tipo II (TbR-ll), que se presenta en la membrana celular en una forma oligomérica con quinasa activada. Posteriormente, se recluta al receptor tipo I (TbR-l), el cual no puede enlazarse con el ligando en ausencia de TbR-ll, en el complejo. Entonces el TbR-ll fosforila a TbR-l predominantemente en un dominio rico en residuos de glicina y serina (dominio GS) en la región de yuxta-membrana, y de esta manera activa al TbR-l. Las Proteínas M o rf o g e n é t i ca s Óseas (BMPs) son Proteínas Reguladoras Claves en la Determinación de la Densidad Mineral Ósea en los Seres Humanos. Un avance importante en el entendimiento de la formación ósea, fue la identificación de las proteínas morf ogenéticas óseas (BMPs), también conocidas como proteínas osteogénicas (OPs), las cuales regulan la diferenciación de cartílago y hueso in vivo. Las BMPs/OPs inducen la diferenciación ósea endocondrial a través de una cascada de eventos que incluyen la formación de cartílago, hipertrofia y calcificación del cartílago, invasión vascular, diferenciación de o ste o b I as to s , y formación de hueso. Como se describe en lo anterior, las proteínas m o rf og e n é t i ca s óseas/proteínas osteogénicas (BMP 2-14, y proteínas osteogénicas 1 y 2, OP-1 y OP-2) son miembros de la superfamilia de TGF-beta. La sorprendente conservación de evolución entre los miembros de la subfamilia de BMP/OP sugiere que son críticas en el desarrollo y funcional normal de los animales. Más aún, la presencia de múltiples formas de BMPs/OPs presenta una cuestión importante acerca de la relevancia biológica de esta redundancia aparente. En adición a la condrogénesis y osteogénesis post-fetal, las BMPs/OPs tienen múltiples papeles en la esqueletogénesis (incluyendo el desarrollo de los tejidos craneofacial y dental), y en el desarrollo embrionario y en la organogénesis de los órganos p a re n q u i m a t o s o s , incluyendo el riñon. Ahora se entiende que la naturaleza se apoya en mecanismos moleculares comunes (y pocos) hechos a la medida para proporcionar el surgimiento de tejidos y órganos especializados. La superfamilia de BMP/OP es un ejemplo elegante de la parsimonia de la naturaleza en la programación de múltiples funciones especializadas que despliegan isoformas moleculares con una variación menor en los motivos de aminoácidos dentro de las regiones carboxi-terminales altamente conservadas. Las sub-familias de BMP y activina están sujetas a una regulación posterior a la traducción significativa. Existe un sistema de control extracelular intrincado, mediante el cual se sintetiza y se exporta un antagonista de alta afinidad, y subsecuentemente forma complejo de una manera selectiva con las proteínas morfogenéticas óseas o con las activinas, para alterar su actividad biológica (W.C. Smith (1999) TIG 15(1 ) 3-6). Se han identificado un número de estos antagonistas naturales, y, basándose en la divergencia de secuencias, parecen haber evolucionado de una manera independiente, debido a la falta de conservación de secuencia primaria. No ha habido un trabajo estructural hasta la fecha sobre esta clase de proteínas. Los estudios de estos antagonistas han realzado una preferencia distintiva para la interacción y neutralización de BMP-2 y BMP-4. Adicionalmente, el mecanismo de inhibición parece diferir para los diferentes antagonistas (S. Lemura y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95 9337-9342). Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,395,511 ; 5,489,445 y 6,495,736, proporcionan la es el e ro s t ¡ n a , también conocida como proteínas Beer, una clase novedosa de proteínas de enlace de TGF-beta que poseen un andamiaje de cisteína casi idéntico (disulfuro), al compararse con DAN Humano, Gremlin Humano, y Cerberus Humano, y SCGF (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,780,263), pero casi ninguna homología al nivel de los nucleótidos (para la información de antecedentes, ver en general Hsu, D.R., Economides, A.N. Wang, X., Eimon, P. M . , Harland, R.M., "The Xenopus Dorsalizing Factor Gremlin Identifies a Novel Family of Secreted Proteins that Antagonize BMP Activities," Molecular Cell 1 :673-683, 1998). Un ejemplo representativo de la clase novedosa de proteínas de enlace de TGF-beta se da a conocer en las SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11 , 13, y 15. También se debe entender que los miembros representativos de esta clase de proteínas de enlace incluyen variantes de la proteína de enlace de TGF-beta (por ejemplo, SEQ ID NOs:5 y 7). Como se utiliza en la presente, un "gen variante de proteína de enlace de TGF-beta", se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de las SEQ ID NOs:2, 10, 12, 14, ó 16. Estas variantes incluyen polimorfismos que se presentan naturalmente, o variantes alélicas de los genes de proteínas de enlace de TGF-beta, así como genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservadoras de estas secuencias de aminoácidos. Las formas variantes adicionales de un gen de proteína de enlace de TGF-beta son las moléculas de ácidos nucleicos que contienen inserciones o supresiones de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Los genes variantes de proteína de enlace de TGF-beta se pueden identificar mediante la determinación de si los genes se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tenga la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs:1, 5, 7, 9, 11, 13, y 15, bajo condiciones restringentes. En adición, los genes variantes de proteínas de enlace de TGF-beta deben codificar una proteína que tenga una estructura base de cisteína. Como una alternativa, los genes variantes de proteínas de enlace de TGF-beta se pueden identificar mediante comparación de secuencias. Como se utiliza en la presente, dos secuencias de aminoácidos tienen una "identidad de secuencias de aminoácidos del 100 por ciento", si los residuos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son iguales al quedar alineadas para una máxima correspondencia. De una manera similar, dos secuencias de nucleótidos tienen una "identidad de secuencias de nucleótidos del 100 por ciento", si los residuos de nucleótidos de las dos secuencias de nucleótidos son iguales al quedar alineadas para una máxima correspondencia. Se pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias empleando programas de software convencionales, tales como los incluidos en la suite de computación de b ¡ o i nf o rm át i ca LASERGENE, que es producida por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos mediante la determinación de la alineación óptima, son bien conocidos por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu y colaboradores (editores), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (editor), Guide to Human Genome Computing, 2a Edición (Academic Press, Inc. 1998)). Una proteína de enlace de TGF-beta variante debe tener cuando menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50 por ciento con las SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 12, 14 ó 16, y de preferencia una identidad mayor del 60 por ciento, del 65 por ciento, del 70 por ciento, del 75 por ciento, del 80 por ciento, del 85 por ciento, del 90 por ciento, ó del 95 por ciento. De una manera alternativa, se pueden identificar variantes de proteínas de enlace de TGF-beta al tener cuando menos una identidad de la secuencia de nucleótidos del 70 por ciento con las SEQ ID NOs:1 , 5, 9, 11 , 13 ó 15. Más aún, la presente invención contempla variantes de genes de proteínas de enlace de TGF-beta que tienen una identidad de más del 75 por ciento, del 80 por ciento, del 85 por ciento, del 90 por ciento, ó del 95 por ciento con la SEQ ID NO:1. Independientemente del método particular empleado para identificar un gen variante de proteína de enlace de TGF-beta o una proteína de enlace de TGF-beta variante, se puede caracterizar f uncionalmente una proteína de enlace de TGF-beta variante o un polipéptido codificado por un gen de proteína de enlace de TGF-beta variante, por ejemplo, por su capacidad para enlazarse a, y/o para inhibir, la señalización de un miembro seleccionado de la familia de proteínas TGF-beta, o por su capacidad para enlazarse de una manera específica con un anticuerpo anti-proteína de enlace de TGF-beta. La presente invención incluye fragmentos funcionales de genes de proteínas de enlace de TGF-beta. Dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un gen de proteína de enlace de TGF-beta, se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido de proteína de enlace de TGF-beta que: (1) posee la actividad funcional anteriormente mencionada, o (2) se enlaza específicamente con un anticuerpo anti-proteína de enlace de TGF-beta. Por ejemplo, un fragmento funcional de un gen de proteína de enlace de TGF-beta descrito en la presente, comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs:1 , 5, 7, 9, 11, 10 13, ó 15. La cordina (por ejemplo, Reddi y colaboradores, 2001 Arthritis Research 3:1 ; Oelgeschlager y colaboradores, 2000 Nature 405:757), las proteínas de nudo de cistina tales como noggina (por ejemplo, Groppe y colaboradores, 2002 15 Nature 420:636), y la familia distintiva DAN de proteínas (incluyendo DAN, Cerberus y Gremlin; por ejemplo, Hsu y colaboradores, 1998 Mol. Cell 1 :673), representan tres clasificaciones generales de proteínas antagonistas de BMP secretadas que actúan ext ra ce I u I a r m e n t e (por ejemplo, 20 Balemans y colaboradores, 2002 Dev. Biol. 250:231 ). La alineación de la secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana (Beer) con Cerberus, DAN, y Gremlin, mostró que, a pesar de una andamiaje de cisteína altamente similar entre las cuatro proteínas, la esclerostina exhibió de otra manera „<. poca homología con los miembros de la familia DAN (Figura 1; ver también la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511 ). Los ejemplos de los polipéptidos de noggina, cordina, y DMP, que se pueden utilizar de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se enlistan de acuerdo con los Números de Acceso de Genbank/NCBI en la Tabla 1. TABLA 1: Proteínas de Enlace de TGF-beta/Proteínas Antagonistas de BMP/BMPs Representativas Fuente Cordina Noggina BMP-5 BMP-6 Humana X _209529, NM_021073, N _001718 AF209928, M60314 AX235836, AF283325, AF209930, AF209929, BC002909, AX175126, AX175126, AX175123, AX140204, AX140203, AX140202, AX140201, AX140200, AX140199, AX140198, AX140197, AX140196, AX140195, AF136632S4, AF136634, AF136633, AF136632, AH009297, AF076612, Ratón AK077460, NM_007555, NM_007556, AK007577, L41145, AH003686, NM_009893, L02240 U73520, AX235833, U73519, AX175120, U73518, AX140205, U73517, AF096276, U73516, AF069501 U73515, Conejo AB073105 AF412307 Rata NW_042725, XM_236415 AY184240, XM_221307, XM_214455 AB073715, D86581, Pollo AF031230 S83278 Oveja AY150846 AF508310 Cabra Xenopus L35764, laevi's Caballo AF510665 Pez- NM_130973, cebra AF034606, AR063998, AR063997 18203652 214626 18202942 285271 25140444 1117817 1072455 1117819 18202071 1352511 2498235 1710365 2498234 3695029 18858413 3860047 6753418 4185744 16555891 4432769 2731578 4885523 11494125 5410599 16215740 5410601 15077351 7110675 7839323 15214085 7839322 15214097 7839321 15214098 7839320 15214099 4406186 15214132 1468951 15214133 3822218 15214136 3800772 15214137 2826739 18859109 603945 18859111 11494373 18859113 (Forma de 21105761 Empalme 21707595 Alternativo) 21907883 11494129 27374944 (Forma de Empalme Alternativo) 11494127 (Forma de Empalme Alternativo) Com osiciones de Anticuerpos, Fragmentos de los Mismos, y Otros Agentes de Enlace De conformidad con otro aspecto, la presente invención proporciona además agentes de enlace, tales como anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, que son capaces de detectar los complejos descritos en la presente, o que son capaces de modular la formación de los complejos descritos en la presente, y/o que son capaces de modular uno o más aspectos de la densidad ósea. Por ejemplo, en una modalidad ilustrativa, los agentes de enlace se enlazan a un complejo formado entre la Esclerostina (Beer) y cualquiera de Cordina o Noggina. Estos agentes de enlace se pueden utilizar, por ejemplo, en la detección de los complejos descritos en la presente, y por consiguiente, son útiles en la detección de compuestos adicionales que se enlacen con un complejo formado entre la Esclerostina (Beer) y la Noggina, o entre la Esclerostina (Beer) y la Cordina. De una manera alternativa, o en adición, los agentes de enlace de la presente invención se pueden dirigir, por ejemplo, a regiones de Esclerostina (Beer), Noggina, "y/o Cordina, identificadas como las responsables de las interacciones de enlace entre estas proteínas. Estos agentes de enlace se pueden utilizar de conformidad con lo anterior para alterar la formación de complejos entre Esclerostina (Beer) y Cordina, ó entre Esclerostina (Beer) y Noggina, y de esta manera pueden ser útiles para modular la densidad ósea. En una modalidad ilustrativa, el agente de enlace es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo. Los anticuerpos se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los expertos ordinarios en este campo. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos se pueden producir mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales, como se describe en la presente, o por medio de transfección de genes de anticuerpos en huéspedes de células bacterianas o de mamífero adecuadas, con el objeto de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, inicialmente se inyecta un inmunógeno que comprenda al polipéptido en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas, o cabras). En este paso, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunógeno sin modificación. De una manera alternativa, en particular para los polipéptidos relativamente cortos, se puede provocar una respuesta inmune superior si se une el polipéptido a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de limpete de orificio. El inmunógeno se inyecta en el animal huésped, de preferencia de acuerdo con un programa previamente determinado que incorpore una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Entonces se pueden purificar los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido a partir de estos antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad utilizando el polipéptido acoplado con un soporte sólido adecuado. El mamífero utilizado para provocar una respuesta inmune para el inmunogeno puede ser un mamífero con eliminación genética. En esta modalidad, se utilizan métodos de eliminación genética conocidos en este campo para reproducir animales que no expresen naturalmente la proteína correspondiente al inmunogeno. La tecnología de eliminación genética es bien conocida en la materia, y se da a conocer, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,252,132; 6,437,215; y 6,444,873. Los anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés, se pueden preparar, por ejemplo, empleando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 -19, 1976, y mejoras a la misma. Dicho de una manera breve, estos métodos involucran la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Estas líneas celulares se pueden producir, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describe en lo anterior. Luego se inmortalizan las células de bazo, por ejemplo, mediante su fusión con un componente de fusión celular de mieloma, de preferencia uno que sea singenéico con el animal inmunizado. Se pueden emplear una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante unos cuantos minutos, y luego se aplican en una baja densidad sobre un medio selectivo que soporte el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan las colonias individuales, y se prueban sus sobrenadantes de cultivo para determinar la actividad de enlace contra el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tengan una alta reactividad y especificidad. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar a partir de los sobrenadantes de las colonias de hibridoma en crecimiento. En adición, se pueden emplear diferentes técnicas para mejorar el rendimiento, tales como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón. Luego se pueden cosechar los anticuerpos monoclonales a partir del fluido de ascitas o de la sangre. Los contaminantes se pueden remover de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación, y extracción. Los polipéptidos de esta invención se pueden utilizar en el proceso de purificación, por ejemplo, en un paso de cromatografía por afinidad. Se han descrito un número de moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de enlace de antígeno derivado a partir de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus regiones determinantes de complementar i edad asociadas fusionadas a dominios constantes humanos (Winter y colaboradores, Nature 349:293-99, 1991 ; Lobuglio y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Se/. EUA 86:4220-24, 1989; Shaw y colaboradores, J. Immunol. 138:4534-38, 1987; y Brown y colaboradores, Cáncer Res. 47:3577-83, 1987), regiones determinantes de complementariedad de roedor injertadas en una FR de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-27, 1988; Verhoeyen y colaboradores, Science 239:1534-36, 1988; y Jones y colaboradores, Nature 321 :522 - 25, 1986), y regiones determinantes de complementariedad de roedor soportadas por FRs de roedor recombinantemente revestidas (Publicación de Patente Europea Número 519,596, publicada el 23 de diciembre de 1992). Estas moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica indeseada hacia las moléculas de anticuerpo de roedor anti-humano, lo cual limita la duración y la efectividad de las aplicaciones terapéuticas de estas fracciones en los receptores humanos. Por consiguiente, la invención contempla formas humanas y humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino). Estos anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de anticuerpos de enlace de antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada a partir de la i n m u n og I o b u I i n a no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en donde los residuos de una región determinante de com plementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos a partir de una región determinante de co m p I e m e n ta ri ed a d de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como ratón, rata, o conejo, que tenga la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. Por lo tanto, los residuos de estructura de Fv de la inmunoglobulina humana pueden ser reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo del receptor ni en la región determinante de complementariedad importada o en las secuencias de estructura. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente y optimizar el desempeño del anticuerpo. En general, los anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos o cuando menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de co m p I e m e n ta ri e d ad correspondan a aquéllas de una inmunogíobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR sean aquéllas de una secuencia en consenso de inmunogíobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunogíobulina (Fe), típicamente aquélla de una inmunogíobulina humana. (Reichmann y colaboradores, Nature 332, 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992); Holmes y colaboradores, J. Immunol., 158:2192-2201 (1997) y Vaswani y colaboradores, Annals Allergy, Asthma & Immunol., 81 :105-115 (1998)). La invención también proporciona métodos para mutar anticuerpos con el fin de optimizar su afinidad, selectividad, resistencia de enlace, y otras propiedades deseables. Un anticuerpo mutante se refiere a una variante de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo. En general, uno o más de los residuos de aminoácidos en el anticuerpo mutante es diferente de lo que está presente en el anticuerpo de referencia. Estos anticuerpos mutantes necesariamente tienen menos de una identidad o similitud de secuencias menor al 100 por ciento con la secuencia de aminoácidos de referencia. En general, los anticuerpos mutantes tienen una identidad o similitud de secuencia de aminoácidos de cuando menos el 75 por ciento con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo de referencia. De preferencia, los anticuerpos mutantes tienen una identidad o similitud de secuencia de aminoácidos de cuando menos el 80 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 85 por ciento, todavía de una manera más preferible de cuando menos el 90 por ciento, y muy referiblemente de cuando menos el 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo de referencia. Un método para mutar anticuerpos involucra la maduración por afinidad utilizando exhibición de fagos. Como se utilizan en la presente, los términos "FRs revestidas" y "FRs recombinantemente revestidas", se refieren al reemplazo selectivo de los residuos de FR a partir de, por ejemplo, una región V de cadena pesada o ligera de roedor, con residuos de FR humanos, con el objeto de proporcionar una molécula xenogenéica que comprenda un sitio de enlace de antígeno que retenga sustancialmente toda la estructura de pliegue de polipéptido de la FR nativa. Las técnicas de revestimiento se basan en el entendimiento de que se terminan las características de enlace de ligando de un sitio de enlace de antígeno primordialmente por la estructura y la disposición relativa de los conjuntos de CDR de cadena pesada y ligera dentro de la superficie de enlace de antígeno. Davies y colaboradores, Ann. Rev. Biochem . 59:439-73, 1990. Por consiguiente, se puede conservar la especificidad de enlace de antígeno en un anticuerpo humanizado solamente en donde se mantengan cuidadosamente las estructuras de la región determinante de co m p I e m e n ta r i e d ad , su interacción unas con otras, y su interacción con el resto de los dominios de la región V. Mediante la utilización de técnicas de revestimiento, se reemplazan selectivamente los residuos de FR exteriores (por ejemplo, accesibles al solvente) que son fácilmente encontrados por el sistema inmune, con residuos humanos, para proporcionar una molécula híbrida que comprenda una superficie revestida débilmente inmunogénica, o sustancialmente no inmunogénica. El proceso de revestimiento hace uso de los datos de secuencia variables para los dominios variables del anticuerpo humano compilados por Kabat y colaboradores, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Edición (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Oficina de Impresión del Gobierno de los Estados Unidos, 1987), en las actualizaciones a la base de datos Kabat, y en otras bases de datos de Estados Unidos y extranjeras accesibles (tanto de ácidos nucleicos como de proteínas). Las accesibilidades al solvente de los aminoácidos de la región V se pueden deducir a partir de la estructura tridimensional conocida para los fragmentos de anticuerpo humanos y de murino. Existen dos pasos generales en el revestimiento de un sitio de enlace de antígeno de murino. I n i c i a I m e n t e , se comparan las FRs de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés con las secuencias de FR correspondientes de los dominios variables humanos obtenidos a partir de las fuentes anteriormente identificadas. Luego se comparan las regiones V humanas más homologas, residuo por residuo, con los aminoácidos de murino correspondientes. Los residuos en la FR de murino que difieran de la contraparte humana, son reemplazados por los residuos presentes en la fracción humana empleando técnicas re co m b i n a n te s bien conocidas en este campo. El cambio de residuos solamente se lleva a cabo con fracciones que estén cuando menos parcialmente expuestas (accesibles al solvente), y se tiene cuidado en el reemplazo de los residuos de aminoácidos que puedan tener un efecto significativo sobre la estructura terciaria de los dominios de la región V, tales como pro lina, glicina, y los aminoácidos cargados. De esta manera, los sitios de enlace de antígeno de murino "revestidos" resultantes se diseñan para retener los residuos de la región determinante de complementariedad de murino, los residuos sustancialmente adyacentes a las regiones determinantes de complementariedad, los residuos identificados como enterrados o en su mayor parte enterrados (inaccesibles al solvente), los residuos que se crea que participan en los contactos no covalentes (por ejemplo, electrostáticos e h i d r of ó b i co s ) entre los dominios de cadena pesada y ligera, y los residuos de las regiones estructurales conservadas de las FRs que se crea que tienen influencia sobre las estructuras terciarias "canónicas" de los ciclos de las regiones determinantes de complementariedad. luego se utilizan estos criterios de diseño para preparar secuencias de nucleótidos re co m b i n a n te s que combinen las regiones determinantes de complementariedad de tanto la cadena pesada como ligera de un sitio de enlace de antígeno de murino en las FRs de apariencia humana que se puedan utilizar para transfectar células de mamífero para la expresión de los anticuerpos humanos recombinantes que exhiban la especificidad de antígeno de la molécula de anticuerpo de murino. La invención también contempla anticuerpos parcial o completamente humanos específicos para un polipéptido antigénico de interés. Estos anticuerpos se pueden preparar empleando métodos conocidos en la materia, tales como los descritos en Lonberg N. y colaboradores, Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995); Fischwild, D.M. y colaboradores, Nat. Biotechnol. , 14:826 (1996); Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,632,976 B1 a Tomizuka y colaboradores; y Tomizuka K. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 97:722-727 (2000) (que describe anticuerpos completamente humanos). También se contemplan fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos humanos preparados como se describe anteriormente. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden aplicar con uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados en este aspecto incluyen radionúclidos, inductores de diferenciación, fármacos, toxinas, y derivados de los mismos. Los radionúclidos preferidos incluyen 90Y, 23l, 25l, 131l, 186Re, 188Re, 2 1At, y 212Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato, y los análogos de pirimidina y purina. Los inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de difteria, toxina de cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella, y proteína antiviral de hierba carmín. Se puede acoplar un agente terapéutico (por ejemplo, co va I e n te m e n te enlazado) a un anticuerpo monoclonal adecuado, ya sea directamente o indirectamente (por ejemplo, por medio de un grupo enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo o uno que sea capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) sobre el otro. De una manera alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo por medio de un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un separador para distanciar un anticuerpo de un agente, con el objeto de evitar la interferencia con las capacidades de enlace. Un grupo enlazador también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente sobre un agente o un anticuerpo, y por lo tanto, aumentar la eficiencia del acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales sobre agentes, lo cual de otra manera no sería posible. Será evidente para los expertos en la técnica, que se pueden emplear una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como hetero-funcionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL), como el grupo enlazador. El acoplamiento se puede efectuar, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, o residuos de carbohidratos oxidados. Existen numerosas referencias que describen esta metodología, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,671 ,958 a Rodwell y colaboradores. Cuando un agente terapéutico es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable utilizar un grupo enlazador que se pueda disociar durante o sobre la i n t e rn a I i za c¡ ó n en una célula. Se han descrito un número de diferentes grupos enlazadores disociables. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente a partir de estos grupos enlazadores incluyen la disociación mediante reducción de un enlace de disulfuro (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,489,710 a Spitler), mediante irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,625,014 a Senter y colaboradores), mediante hidrólisis de las cadenas laterales de aminoácidos derivadas (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,638,045 a Kohn y colaboradores), mediante hidrólisis mediada por complemento de suero (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,671,958 a Rodwell y colaboradores), y mediante hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,569,789 a Blattler y colaboradores). Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una modalidad, se acoplan múltiples moléculas de un agente de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, se puede acoplar más de un tipo de agente con un anticuerpo. Independientemente de la modalidad particular, se pueden preparar inmunoconjugados con más de un agente en una variedad de formas. Por ejemplo, se puede acoplar más de un agente directamente a una molécula de anticuerpo, o se pueden utilizar enlazadores que proporcionen múltiples sitios para la unión. De una manera alternativa, se puede utilizar un portador. Un portador puede llevar a los agentes en una variedad de maneras, incluyendo enlace covalente, ya sea directamente o por medio de un grupo enlazador. Los portadores adecuados incluyen proteínas, tales como albúminas (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,507,234 a Kato y colaboradores), péptidos y polisacáridos , tales como a m i n od ext ra n o (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,699,784 a Shih y colaboradores). Un portador también puede llevar un agente mediante enlace no covalente, o mediante encapsulación, tal como dentro de una vesícula de liposoma (por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,429,008 y 4,873,088). Los portadores específicos para agentes de radionúclido incluyen moléculas pequeñas radio-halogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,735,792 da a conocer moléculas pequeñas radio-halogenadas representativas y su síntesis. Un quelado de radionúclido se puede formar a partir de compuestos quelantes que incluyan aquéllos que contengan átomos de nitrógeno y azufre como los átomos donadores para el enlace del radionúclido de metal o de óxido de metal. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,673,562 a Davison y colaboradores, da a conocer compuestos quelantes representativos y su síntesis. Ensayos para Seleccionar Moléculas que Aumenten la Densidad Ósea: Rastreo de Compuestos que Medien los Efectos Sobre la Densidad Ósea. Se puede probar esencialmente cualquier tipo de compuesto de acuerdo con los métodos descritos en la presente, empleando cualquier procedimiento de rastreo adecuado, tal como un ensayo de rastreo de alta producción. De conformidad con lo anterior, los ejemplos de los compuestos y técnicas de rastreo descritos más adelante se ofrecen para propósitos de ilustración solamente. Los compuestos de prueba ilustrativos para utilizarse en los métodos de rastreo descritos en la presente pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN natural o sintético, ARN, ADNg, ADN c, ARNm, ARNt, ARNi, etcétera), lectinas, azúcares, oligosacáridos, glicoproteínas, receptores, factores de crecimiento, citoquinas, moléculas pequeñas tales como fármacos candidatos (por ejemplo, a partir de una biblioteca de péptidos aleatorios, una biblioteca de productos naturales, una biblioteca de herencia, una biblioteca de combinación, una biblioteca de oligosacáridos, y una biblioteca de exhibición de fagos), metabolitos, sustratos enzimáticos, inhibidores de enzimas, co-factores de enzimas tales como vitaminas, lípidos, esteroides, metales, oxígeno y otros gases encontrados en los fluidos fisiológicos, células, constituyentes celulares, membranas celulares y estructuras asociadas, moléculas de adhesión celular, productos naturales encontrados en fuentes de plantas y animales, otros productos parcial o completamente sintéticos, y similares. Como se observó en lo anterior, de acuerdo con una modalidad ilustrativa de la presente invención, se proporcionan métodos para identificar un compuesto que module el enlace de Noggina ó Cordina a la Esclerostina (Beer). Estos métodos involucran proporcionar primero una composición que comprenda Esclerostina (Beer), y cualquiera de Noggina o Cordina, bajo condiciones en donde esta Esclerostina (Beer) se enlace con la Noggina o Cordina con una afinidad de enlace previamente determinada. Ei polipéptido de Noggina o Cordina utilizado de acuerdo con esta modalidad, puede comprender un polipéptido aislado que contenga la proteína entera de Noggina o Cordina, y de preferencia comprende cuando menos el dominio de Noggina o Cordina que se enlace con la Esclerostina (Beer). En adición, el polipéptido de Esclerostina (Beer) utilizado en esta modalidad, puede comprender un polipéptido aislado que contenga la proteína entera de Esclerostina (Beer), y de preferencia comprende cuando menos el dominio de Esclerostina (Beer) que se enlaza ya sea con Noggina o Cordina. En el contexto de los métodos de rastreo de la presente invención, la formación de un complejo entre Esclerostina (Beer) y cualquiera de Noggina o Cordina, se puede detectar o medir directa o indirectamente empleando cualquier método adecuado. Por ejemplo, uno o más de los polipéptidos dados a conocer en la presente, se pueden marcar con una marca adecuada, y se puede determinar la formación de un complejo mediante la detección de la marca. Las marcas adecuadas para utilizarse en la detección de un complejo entre ya sea Noggina o Cordina y la Esclerostina (Beer) pueden incluir, por ejemplo, un radioisótopo, una marca de epítopo (etiqueta), una marca de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina), una marca centrifuga, una enzima, un grupo fluorescente, un grupo quimiluminescente, y similares. Cuando no se emplean marcas, la formación del complejo se puede determinar, por ejemplo, empleando cualquier otra técnica conocida en la materia, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen reticulación, co-inmunoprecipitación y co -f ra cci o n a m i e n to por cromatografía, y el sistema de dos híbridos de levadura. La composición que comprende una de las composiciones anteriormente descritas ya sea de Noggina o bien de Cordina y Esclerostina (Beer), se pone en contacto con un compuesto de prueba con el objeto de determinar si el compuesto de prueba es capaz de modular el enlace entre la Esclerostina (Beer) y cualquiera de Noggina o Cordina. Mediante la comparación de la afinidad de enlace determinada en la presencia de un compuesto de prueba, por ejemplo, con la afinidad de enlace entre la Noggina o Cordina y la Esclerostina (Beer) en ausencia del compuesto de prueba, el método permite identificar compuestos de prueba capaces de modular la interacción entre estas proteínas. De conformidad con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un compuesto que module, y de preferencia inhiba, el enlace de cualquiera de Noggina o Cordina con la Esclerostina (Beer).

Nuevamente, mediante la comparación de la afinidad de enlace determinada en la presencia de un compuesto de prueba, por ejemplo, con la afinidad de enlace entre cualquiera de Noggina o Cordina y la Esclerostina (Beer) en ausencia del compuesto de prueba, el método identifica si el compuesto de prueba es capaz de inhibir la interacción entre estas proteínas. De conformidad con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un compuesto que module, y de preferencia potencie, el enlace de cualquiera de Noggina o Cordina con la Esclerostina (Beer). De nuevo, mediante la comparación de la afinidad de enlace determinada en la presencia de un compuesto de prueba, por ejemplo, con la afinidad de enlace entre cualquiera de Noggina o Cordina y la Esclerostina (Beer) en ausencia del compuesto de prueba, el método identifica si el compuesto de prueba es capaz de potenciar la interacción entre estas proteínas. En otra modalidad, se compara el nivel de enlace de la Esclerostina (Beer) con cualquiera de Noggina o Cordina en la presencia de un compuesto de prueba, con el nivel de enlace de la Esclerostina (Beer) con cualquiera de Noggina o Cordina en ausencia de ese compuesto de prueba. En ciertas modalidades ilustrativas de la presente invención, el nivel de enlace en la presencia del compuesto de prueba se reduce, por ejemplo, por el 100 por ciento, el 90 por ciento, el 80 por ciento, el 75 por ciento, el 70 por ciento, ó el 50 por ciento o menos, comparándose con las células no expuestas al compuesto de prueba. En otra modalidad, se compara el nivel de enlace de la Esclerostina (Beer) con cualquiera de Noggina o Cordina en la presencia de un compuesto de prueba, con el nivel de enlace de la Esclerostina (Beer) con cualquiera de Noggina o Cordina en ausencia de este compuesto de prueba. En ciertas modalidades ilustrativas de la presente invención, el nivel de enlace en la presencia del compuesto de prueba aumenta, por ejemplo, por el 100 por ciento, el 90 por ciento, el 80 por ciento, el 75 por ciento, el 70 por ciento, ó el 50 por ciento o menos, comparándose con las células no expuestas al compuesto de prueba. De conformidad con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporcionan compuestos identificados mediante cualquiera de los métodos anteriores. En adición a los ensayos ilustrativos descritos anteriormente para rastrear los compuestos de prueba, se puede emplear cualquiera de una variedad de bibliotecas moleculares en conjunto con los métodos de rastreo de la presente invención. Las bibliotecas son colecciones intencionalmente creadas de diferentes moléculas que se preparan empleando, por ejemplo, métodos sintéticos orgánicos, métodos bioquímicos, y otros. En el último caso, las moléculas se pueden hacer in vitro o in vivo. Estas bibliotecas incluyen, por ejemplo, bibliotecas de péptidos aleatorios, bibliotecas sintetizadas por combinación, bibliotecas de exhibición de fagos, bibliotecas de productos naturales, bibliotecas de oligosacáridos, y bibliotecas de herencia (una colección de moléculas sintetizadas a través del tiempo y recopiladas). Un desarrollo significativo en el descubrimiento y diseño de drogas farmacéuticas, ha sido el desarrollo de la química de combinación para crear bibliotecas químicas de nuevos fármacos potenciales. Las bibliotecas químicas son colecciones intencionalmente creadas de diferentes moléculas, hechas, por ejemplo, mediante métodos sintéticos orgánicos o bioquímicamente. La química de combinación es una estrategia sintética en donde los miembros químicos de la biblioteca se hacen de acuerdo con una metodología sistemática mediante el ensamble de subunidades químicas. Cada molécula en la biblioteca, por lo tanto, está formada de una o más de estas subunidades. Las subunidades químicas pueden incluir aminoácidos que se presenten naturalmente o modificados, nucleótidos que se presenten naturalmente o modificados, sacáridos que se presenten naturalmente o modificados, u otras moléculas, ya sean orgánicas o inorgánicas. Típicamente, cada subunidad tiene cuando menos dos grupos reactivos, que permiten la construcción por pasos de moléculas más grandes haciendo reaccionar primero un grupo reactivo y luego otro grupo reactivo de cada subunidad para construir moléculas sucesivamente más complejas y potencialmente diversas. Mediante la creación de las condiciones sintéticas mediante las cuales se pongan igualmente a disposición un número fijo de bloques de construcción individuales, por ejemplo, los 20 aminoácidos que se presentan naturalmente, en cada paso de la síntesis, se puede ensamblar un arreglo o una biblioteca muy grande de compuestos, inclusive después de unos cuantos pasos de reacción de síntesis. Utilizando los aminoácidos como un ejemplo, en el primer paso sintético, el número de compuestos resultantes (N) es igual al número de bloques de construcción disponibles, designados como b. En el caso de los aminoácidos que se presentan naturalmente, b = 20. En el segundo paso de la síntesis, asumiendo que cada aminoácido tiene , una oportunidad igual para formar un dipéptido con cada otro aminoácido, el número de compuestos posibles N = b2 = 202 = 400. Para los pasos sucesivos de la síntesis, nuevamente asumiendo un ensamble aleatorio igualmente eficiente de los bloques de construcción hasta los compuestos resultantes del paso anterior, N = bx, en donde x es igual al número de pasos de ensamble sintéticos. Por consiguiente, se puede ver que, para el ensamble aleatorio de solamente un decapéptido, ei número de compuestos diferentes es de 2010 ó de 1.02 x 1013. Este número extremadamente grande de compuestos diferentes permite el ensamble y rastreo de un gran número de candidatos diversos para determinar su capacidad para modular la infección por VIH mediada por LDLR2. Se han construido bibliotecas de combinación biológicamente sintetizadas empleando técnicas de biología molecular en bacterias o en partículas de bacteriófagos. Por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,270,170 y 5,338,665 a Schatz, describen la construcción de un plásmido recombinante que codifica una proteína de fusión creada a través del uso de oligonucleótidos aleatorios insertados en un sitio de clonación del plásmido. Este sitio de clonación se coloca adentro de la región codificante de un gen que codifique una proteína de enlace de ADN, tal como el represor LAC, de tal modo que no se destruya la función de enlace específico de la proteína de enlace de ADN sobre la expresión del gen. El plásmido también contiene una secuencia de nucleótidos reconocida como un sitio de enlace por la proteína de enlace de ADN. Por consiguiente, después de la transformación de una célula bacteriana adecuada, y de la expresión de la proteína de fusión, la proteína se enlazará con el plásmido que la produjo. Luego se lisan las células bacterianas, y se ensayan las proteínas de fusión para determinar una actividad biológica dada. Más aún, cada proteína de fusión permanece asociada con el ácido nucleico que la codificó; por consiguiente, a través de la amplificación del ácido nucleico y la secuenciación de la porción del ácido nucleico de los complejos de proteína: plásmido que se seleccionen para una caracterización adicional, se puede determinar la estructura precisa del compuesto candidato. Las Patentes de Schatz se incorporan a la presente como referencia. De una manera similar, se ha construido bibliotecas de exhibición de bacteriófagos a través de la clonación de oligonucleótidos aleatorios dentro de una porción de un gen que codifique una o más de las proteínas de recubrimiento de fagos. Después del ensamble de las partículas de fagos, los polipéptidos aleatorios también dan hacia afuera para el rastreo. Como en el sistema previamente descrito, las partículas de fagos contienen el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, de tal manera que la información de la secuencia de nucleótidos que identifica al fármaco candidato se liga al fármaco mismo. Estas bibliotecas de expresión de fagos se describen, por ejemplo, en Sawyer y colaboradores, Protein Engineering 4:947-53, 1991 ; Akamatsu y colaboradores, J. Immunol. 151:4651 -59, 1993, y Dower y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,427,908. Estas patentes y publicaciones se incorporan a la presente como referencia. Otros planteamientos para crear bibliotecas de combinación m o le c u I a rm e n te diversas, emplean métodos sintéticos químicos para hacer uso de los bloques de construcción atípicos o no biológicos en el ensamble de los compuestos que se vayan a probar. Por lo tanto, Zuckermann y colaboradores, J. Med. Chem. 37:2678-85, 1994, describen la construcción de una biblioteca utilizando una variedad de glicinas N-(sustituidas) para la síntesis de compuestos tipo péptidos denominados "peptoides". Las sustituciones se seleccionaron para proporcionar una serie de sustituciones aromáticas, una serie de sustituciones laterales hidroxiladas, y un conjunto diverso de sustituciones, incluyendo estructuras ramificadas, de amino, y heterocíclicas. Esta publicación se incorpora a la presente como referencia. Otra estrategia involucra sintetizar químicamente las bibliotecas de combinación sobre soportes sólidos en una forma metódica y previamente determinada, de tal manera que la colocación de cada miembro de la biblioteca da información con respecto a la estructura sintética de ese compuesto. Los ejemplos de estos métodos se describen, por ejemplo, en Geysen, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,833,092, en donde los compuestos son picos de polietileno sintetizados o funcional izados diseñados para ajustarse en un plato de microtitulación de 96 pozos, de tal manera que la posición del pico da la información al investigador con respecto a la estructura del compuesto. De una manera similar, Hudson y colaboradores, Publicación del TCP Número WO94/05394, describen métodos para la construcción de bibliotecas de combinación de biopolímeros, tales como polipéptidos, oligonucleótidos, y oligosacáridos, sobre una placa en fase sólida espacialmente dirigible recubierta con una película polimérica funcional izada. En este sistema, los compuestos se sintetizan y se rastrean directamente sobre la placa. El conocimiento de la posición de un compuesto dado sobre la placa produce información con respecto a la naturaleza y el orden de los bloques de construcción que comprenden al compuesto. Se pueden emplear métodos similares para construir bibliotecas de combinación dirigibles, para la síntesis de compuestos diferentes de los biopolímeros. Todavía otro planteamiento ilustrativo ha sido el uso de grandes números de perlas derivadas muy pequeñas, las cuales se dividen en tantas porciones iguales como haya bloques de construcción diferentes. En el primer paso de la síntesis, cada una de estas porciones se hace reaccionar con un bloque de construcción diferente. Luego las perlas se mezclan completamente, y de nuevo se dividen en el mismo número de porciones iguales. En el segundo paso de la síntesis, cada porción, que contiene ahora teóricamente cantidades iguales de cada bloque de construcción enlazadas a una perla, se hace reaccionar con un bloque de construcción diferente. Nuevamente las perlas se mezclan y se separan, y se repite el proceso como se desee para producir un gran número de compuestos diferentes, conteniendo cada perla solamente un tipo de compuesto. Esta metodología, denominada como el método de "una perla-un compuesto", produce una mezcla de perlas, llevando cada perla potencialmente un compuesto diferente. Por consiguiente, en este método, las perlas mismas no se pueden considerar como "dirigibles" en el mismo sentido que en los soportes y arreglos en fase sólida descritos anteriormente, o como en las bibliotecas celulares o de fagos. Sin embargo, los compuestos exhibidos en la superficie de cada perla se pueden probar para determinar su capacidad para enlazarse con un compuesto específico, y, si esas (típicamente) pocas perlas son capaces de identificarse y separarse de las otras perlas, se puede recuperar y analizar una población presumiblemente pura de compuestos. Por supuesto, esta última posibilidad depende de la capacidad para cargar y extraer suficiente información con respecto a los compuestos sobre la superficie de cada perla, para ser susceptible a un análisis subsecuente significativo. Esta información puede estar simplemente en la forma de una cantidad adecuada del compuesto de interés para poder determinar su estructura. Por ejemplo, en el caso de un péptido, se debe sintetizar suficiente del péptido sobre la perla para poder llevar a cabo la secuenciación del péptido y obtener la secuencia de aminoácidos del péptido. Como se describió en lo anterior, la construcción de bibliotecas de combinación permite rastrear un gran número de compuestos de prueba para determinar su capacidad para modular el enlace de la Esclerostina (Beer) con cualquiera de Noggina o Cordina. Un método de rastreo común aplicado en la actualidad, consiste en recubrir un soporte sólido, tal como los pozos de un plato de microtitulación , con la molécula específica para la cual se busque un componente de enlace. Luego los compuestos miembros de la biblioteca se marcan, se aplican sobre el soporte sólido, y se les permite enlazarse a los miembros de la biblioteca. Después de un paso de lavado, se detectan entonces los complejos de los componentes de enlace mediante la detección de la marca unida a los miembros de la biblioteca enlazados. Este tipo de procedimiento es particularmente adecuado para las bibliotecas de combinación en donde los compuestos miembros se proporcionan en una solución o en un medio. Este método puede ser un poco laborioso, y con el objeto de lograr la alta producción requerida para rastrear tan grandes números de compuestos de prueba, como un primer paso, puede requerir del rastreo de reservas de los compuestos de prueba, seguido por uno o más pasos de re-rastreo con el objeto de identificar específicamente el compuesto de interés. La situación también se puede invertir, de tal manera que se permita que los miembros de la biblioteca recubran los pozos individuales, y se sondean con la molécula específica. En los casos en donde la biblioteca de combinación va a contener análogos de anticuerpos o péptidos dirigidos hacia un epítopo dado, los miembros de la biblioteca pueden contener una porción de un anticuerpo reconocido por un anticuerpo secundario capaz de ser detectado, por ejemplo, en un ensayo inmunológico enlazado con enzima (ELISA), o en virtud de marcarse directa o indirectamente, por ejemplo, con un radionúclido, un compuesto quimiluminescente, un flúor, una enzima, o un tinte. Tawfik y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 90:373-77, 1993, describen un método para rastrear una biblioteca de anticuerpos (en este caso, a partir de una biblioteca de hibridoma generada utilizando una imitación del intermediario en estado de transición de una reacción enzimática), para determinar la presencia de anticuerpos raros que tengan una actividad catalítica deseada. El compuesto de rastreo, en este caso el sustrato enzimático, se inmovilizó sobre platos de microtitulación de 96 pozos. Los sobrenadantes de cada clon se colocaron en pozos separados bajo condiciones que promovieran la reacción enzimática. Los productos de la reacción enzimática, todavía inmovilizados en el plato de microtitulación, se ensayaron mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos del producto. Nuevamente, este tipo de proceso de rastreo es muy laborioso y puede necesitar de un rastreo repetitivo de las reservas de los compuestos de prueba con el objeto de lograr una alta producción de bibliotecas grandes. En las bibliotecas celulares o de exhibición de fagos y en las bibliotecas sintéticas de "una perla-un compuesto" descritas anteriormente, los miembros de la biblioteca se pueden rastrear para determinar su capacidad para enlazarse con un componente de enlace específico (por ejemplo, un receptor), el cual se marca con un flúor detectable, tal como fluoresceína o f i co e ri t r i n a . Debido a que cada partícula (por ejemplo, una célula o una perla) exhibe solamente una especie del compuesto de prueba, las partículas fluorescentemente marcadas se pueden detectar y seleccionar utilizando un seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS). Entonces se puede volver a rastrear una población enriquecida de perlas o partículas positivas, si es necesario, y se analizan de manera individual. Esta estrategia se puede emplear utilizando células que exhiban los compuestos de prueba o las perlas sobre las que se sinteticen los compuestos de prueba. Algunos métodos de la presente invención utilizan arreglos para conducir el proceso de rastreo. El uso de arreglos hace posible aumentar mucho la producción de muestras. Estructuralmente, el arreglo de forma típicamente sobre un soporte sólido que incluye múltiples elementos o sitios. En los métodos de rastreo de la presente invención, cada elemento del arreglo incluye una senda de señal, tal como una línea de transmisión, a la cual se acopla electromagnéticamente o se une directamente una proteína objetiva o un ligando. En muchas pruebas de rastreo, la meta es rastrear un gran número de compuestos contra una proteína objetiva. Por consiguiente, en tales métodos, todas las proteínas objetivas localizadas dentro de cualquier elemento, así como todos los objetivos en diferentes elementos, son iguales. Cada elemento se pone en contacto con diferentes muestras, conteniendo cada muestra un compuesto diferente. De esta manera, es posible rastrear los diferentes compuestos de una biblioteca con un objetivo común. Sin embargo, en otros métodos, puede ser deseable que todos los objetivos de proteína en cualquier elemento particular sean iguales, pero que los objetivos de proteína en diferentes elementos varíen unos de otros. Esto permite probar el ligando o el grupo de ligandos que se vayan a rastrear, contra varios objetivos de proteína diferentes. De esta manera, por ejemplo, asumiendo que se utilicen 10 inhibidores de proteasa diferentes como objetivos, el arreglo de preferencia incluiría 10 filas o columnas de elementos, teniendo cada elemento una proteasa diferente. Independientemente de la identidad de los objetivos en los diferentes elementos del arreglo, se lanza una señal bajando por la senda de señal que corre hacia cada elemento, para monitorear el enlace en cada uno de los diferentes elementos. Se utilizan modulaciones en la señal lanzada para detectar el enlace entre el objetivo y un ligando de la muestra. Se puede utilizar un arreglo en conjunto con un dispositivo microfluidico para agregar de una manera controlable microcantidades de diferentes muestras a los diferentes arreglos. En la situación en donde todos los objetivos son idénticos, típicamente el dispositivo fluidico se utiliza para dosificar diferentes muestras a los diferentes arreglos; mientras que, cuando el objetivo de proteína en los diferentes elementos varía, el dispositivo fluidico dosifica la misma muestra a los diferentes elementos de los arreglos. Algunos métodos utilizan arreglos sintetizados sobre un soporte sólido como se describió en lo anterior. En ciertos métodos, es posible enfocar el proceso de rastreo hacia ligandos que tengan más probabilidades de tener una actividad biológica deseada, mediante la utilización de la secuencia de un ligando que se sepa que se enlaza con el objetivo de proteína de interés (una "secuencia líder"), para informar de la selección de las secuencias sintetizadas sobre el arreglo, para utilizarse en las siguientes rondas de rastreo. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,770,456, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Por consiguiente, se sintetiza una serie de ligandos relacionados con la secuencia líder, haciendo variaciones sistemáticas en una o más posiciones de la secuencia líder. La teoría es que pueden resultar alteraciones menores de una secuencia (por ejemplo, un péptido) que se sepa que se enlaza con una proteína objetiva, en una secuencia con una afinidad de enlace todavía más alta. El número de elementos en un arreglo varía ampliamente, basándose primordialmente en el tipo de aplicación de rastreo para el que se vaya a utilizar el arreglo. En las etapas iniciales del rastreo de una biblioteca, por ejemplo, se prefiere un gran número de elementos, de tal manera que se pueda rastrear rápidamente un gran número de compuestos. Los arreglos para estas aplicaciones pueden tener hasta 106 elementos. En otras instancias, hay hasta 103 elementos en el arreglo. En todavía otros métodos, puede haber solamente un elemento, tal como cuando se desea conducir estudios de más alta resolución con un compuesto que aparezca desde las rondas iniciales del rastreo como un buen candidato para un compuesto líder que tenga un valor terapéutico potencial. Por consiguiente, en general, el número de elementos en el arreglo puede ser de 1 , 10, 102, 103, 104, 105, ó 106, o cualquier número o intervalo entre los mismos. La densidad del objetivo de proteína o de los ligandos que formen el arreglo, también puede variar de una manera significativa. La densidad requerida varía dependiendo de diferentes factores, tales como el grado de sensibilidad de la señal, el número de ligandos en solución, y si los picos característicos para un complejo particular en estudio están bien definidos y se resuelven a partir de las señales de otros complejos. En la situación óptima, la sensibilidad del presente sistema y la capacidad para conducir análisis utilizando señales que se sepa que están correlacionadas con ciertos complejos, significa que un elemento puede contener un solo objetivo de proteína o ligando. Sin embargo, en otras situaciones, la densidad de los objetivos de proteína o de ligandos puede ser hasta de 100 objetivos/cm2. En todavía otros métodos, la densidad puede ser hasta de 108 objetivos/cm2, hasta 1012 objetivos/cm2, y hasta 1018 objetivos/cm2.

A través del uso del arreglo y la tecnología microfluidica, es posible utilizar los métodos descritos en la presente en un proceso de rastreo de alta producción (HTS). En este planteamiento, se rastrean cientos de miles de compuestos para determinar su capacidad para enlazarse con un objetivo particular, o se rastrean de acuerdo con los niveles más altos de análisis descritos anteriormente. Por ejemplo, la invención descrita en la presente se puede m i n i a t u r i za r , de tal manera que se puedan hacer realidad plataformas de rastreo altamente paralelas; plataformas que son capaces de rastrear cientos o miles de compuestos de una manera simultánea, y al mismo tiempo determinan el efecto del enlace (por ejemplo, agonista o antagonista), afinidad, cinética, etcétera. Como se describió en lo anterior, la presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o aislar compuestos que sean capaces de aumentar la densidad ósea. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, los cuales comprenden los pasos de: (a) mezclar una molécula seleccionada con una proteína de enlace de TGF-beta y un miembro seleccionado de la familia de proteínas TGF-beta, (b) determinar si la molécula seleccionada estimula la señalización por parte de la familia de proteínas TGF-beta, o inhibe el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con la familia de proteínas TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, la molécula potencia la capacidad de TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de la diferenciación celular mesenquimal. Dentro de otros aspectos de la invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, los cuales comprenden los pasos de: (a) exponer una molécula seleccionada a células que expresen la proteína de enlace de TGF-beta, y (b) determinar si se reduce la actividad (o expresión) de la proteína de enlace de TGF-beta a partir de las células expuestas, y de lo mismo, determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. Dentro de una modalidad, las células se seleccionan a partir del grupo que consiste en el hueso humano normal espontáneamente transformado o no transformado a partir de biopsias de hueso, y osteoblastos de hueso parietal de rata. Estos métodos se pueden llevar a cabo en una amplia variedad de formatos de ensayo, incluyendo, por ejemplo, Inmuno-electroforesis a Contra-corriente (CIEP), Radioinmunoensayos, Ra d i o i n m u n o p re c i p i ta c i o n e s , Ensayos Inmuno-sorbentes Enlazados con Enzima (ELISA), Ensayos de Manchas de Puntos, Ensayos de Inhibición o Competición, y Ensayos de Emparedado (ver las Patentes de los Estados Unidos Números 4,376,110 y 4,486,530; ver también Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Las modalidades representativas de estos ensayos se proporcionan en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511. Dicho de una manera breve, primero se enlaza un miembro familiar de la superfamilia de TGF-beta ó una proteína de enlace de TGF-beta a una fase sólida, seguido por la adición de una molécula candidata. Entonces se agrega al ensayo el miembro familiar marcado de la superfamilia de TGF-beta o una proteína de enlace de TGF-beta, se lava la fase sólida, y se determina la cantidad de miembro de la superfamilia de TGF-beta o proteína de enlace de TGF-beta enlazada o marcada sobre el soporte sólido. Las moléculas que son adecuadas para utilizarse en el aumento del contenido mineral óseo, como se describe en la presente, son aquellas moléculas que reducen el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con un miembro o miembros de la superfamilia de TGF-beta de una manera estadísticamente significativa. Los ensayos adecuados para utilizarse con la presente invención no necesitan limitarse a las modalidades descritas en la presente y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511. En particular, se pueden alterar numerosos parámetros, tal como enlazando TGF-beta a una fase sólida, o mediante la eliminación de una fase sólida enteramente.

Dentro de otros aspectos de la invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, los cuales comprenden los pasos de: (a) exponer una molécula seleccionada a células que expresen TGF-beta, y (b) determinar si se modula la actividad de TGF-beta a partir de las células expuestas, y de lo mismo, determinar si el compuesto es capaz de aumentar el contenido mineral óseo. De una manera similar a los métodos anteriormente descritos, se pueden utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar los cambios de la expresión de la proteína de enlace de TGF-beta debidos a un compuesto de prueba seleccionado. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, los cuales comprenden los pasos de: (a) mezclar una molécula seleccionada con una proteína de enlace de TGF-beta, (b) determinar si la molécula seleccionada aumenta la señalización de la familia de proteínas TGF-beta, o inhibe el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta a la familia de proteínas TGF-beta. Dentro de ciertas modalidades, la molécula potencia la capacidad de TGF-beta para funcionar como un regulador positivo de la diferenciación celular mesenquimal. De una manera similar a los métodos anteriormente descritos, se pueden utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar el estímulo de TGF-beta debido a un compuesto de prueba seleccionado. Un método representativo se proporciona más adelante en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511 (ver también Durham y colaboradores, Endo. 136:1374-1380). Dentro de todavía otros aspectos de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de aumentar el contenido mineral óseo, los cuales comprenden el paso de determinar si una molécula seleccionada inhibe el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta al hueso, o un análogo del mismo. Como se utiliza en la presente, se debe entender que hueso o un análogo del mismo se refiere a hid roxiapatita, o una superficie compuesta de una forma en polvo de hueso, hueso triturado, o hueso intacto. De una manera similar a los métodos anteriormente descritos, se pueden utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar la inhibición de la localización de la proteína de enlace de TGF-beta en la matriz ósea. Un método representativo se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511. Se debe observar que, aunque los métodos relacionados en la presente pueden referirse al análisis de una molécula de prueba individual, la presente invención no debe limitarse a lo mismo. En particular, la molécula seleccionada puede estar contenida dentro de una mezcla de compuestos. Por consiguiente, los métodos mencionados pueden comprender además el paso de aislar una molécula que inhiba el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta. Composiciones Farmacéuticas. En las modalidades adicionales, la presente invención se refiere a una formulación de una o más composiciones de p o I i n u el eó ti d o s , p o I i p é p t i d os , anticuerpos, a n t i- s e n t i d o , u otras composiciones dadas a conocer en la presente, en vehículos farmacéuticamente aceptables, para utilizarse en los ensayos descritos en la presente y/o en la administración de una composición a una célula o a un animal, ya sea solos o en combinación con una o más modalidades diferentes de terapia. Se entenderá que, si se desea, una composición como se da a conocer en la presente se puede administrar en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos, o diferentes agentes farmacéuticamente activos. De hecho, virtualmente no hay límite para otros componentes que también se puedan incluir, dado que los agentes adicionales no provoquen un efecto adverso significativo al contacto con las células objetivas o los tejidos huéspedes. Por lo tanto, las composiciones se pueden suministrar junto con otros diferentes agentes, según se requieran en el caso particular. Estas composiciones se pueden purificar de las células huéspedes o de otras fuentes biológicas, o de una manera alternativa, se pueden sintetizar química como se describe en la presente. De la misma manera, estas composiciones pueden comprender además composiciones de ARN ó ADN sustituidas o derivadas. Por consiguiente, en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las composiciones de polinucleótidos, po I i p é p t i d os , y/o anticuerpos descritas en la presente, en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable . Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por un experto ordinario en la materia, en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo típicamente variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier modo de administración apropiado, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, mucosa, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea, e intramuscular. Los vehículos para utilizarse dentro de estas composiciones farmacéuticas son b i o co m p a t i b I es , y también pueden ser biodegradables. En ciertas modalidades, la formulación de preferencia proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. En otras modalidades, sin embargo, se puede desear una velocidad más rápida de liberación inmediatamente después de su administración. La formulación de estas composiciones está bien dentro del nivel de la experiencia ordinaria en este campo, empleando técnicas conocidas. Los vehículos ilustrativos útiles en este aspecto incluyen m i c ro pa rt ícu I a s de poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano, y similares. Otros vehículos de liberación demorada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, los cuales comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, o p ci o n a I m e nte , una capa externa que comprenda un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,151 ,254, y las Solicitudes del TCP Números WO 94/20078, WO94/23701, y W O 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio del implante, de la velocidad y duración esperada de liberación, y de la naturaleza de la condición que se vaya a tratar o a prevenir. En otra modalidad ilustrativa, se emplean microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato-poliglicolato) como vehículos para las composiciones de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se dan a conocer, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,407,609 y 5,942,252. Los sistemas portadores de proteína de núcleo de hepatitis B modificados, tales como se describen en la Publicación Internacional Numero WO99/40934, y en las referencias citadas en la misma, también serán útiles para muchas aplicaciones. Otro sistema de vehículo/suministro ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de p a rt ícu I a s- p ro te í n a , tales como los que se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,928,647, los cuales son capaces de inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos restringidos a la clase I en un huésped. En otra modalidad ilustrativa, se emplean partículas de núcleo de fosfato de calcio como vehículos o como matrices de liberación controlada para las composiciones de esta invención. Las partículas de fosfato de calcio de ejemplo se dan a conocer, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Publicada Número WO00/46147. Las composiciones farmacéuticas de la invención con frecuencia comprenderán además uno o más reguladores del pH (por ejemplo, suero regulado neutro o suero regulado con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa, o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos , agentes quelantes tales como EDTA ó glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hagan a la formulación isotónica, hipotónica, o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes viscosantes, y/o conservadores. De una manera alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden formular como un liofilizado. El desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, la administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular, es bien conocido en este campo, algunos de los cuales se describen brevemente más adelante para propósitos generales de ilustración. En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente se pueden suministrar mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se pueden comprimir en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente p a re n t e ra I m e n t e , intravenosamente, intramuscularmente, o inclusive intraperitonealmente. Estos planteamientos son bien conocidos por el experto, algunos de los cuales se describen a d i c i o n a I m e n t e , por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,543,158; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,641,515, y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,399,363. En ciertas modalidades, las soluciones de los compuestos activos como base libre o como sales farmacológicamente aceptables, se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxi-propil-celulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones en general contendrán un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,466,468). En todos los casos, la forma debe ser estéril, y debe ser fluida hasta el grado en que exista un fácil paso por jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y/o mediante la utilización de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede facilitar mediante diferentes agentes antibacterianos y antif úngicos , por ejemplo parabenos, el o ro b u ta n o I , fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. Se puede provocar una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la utilización en las composiciones de agentes que demoren la absorción, por ejemplo m o n o e stea rato de aluminio y gelatina. En una modalidad, para la administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe ser adecuadamente regulada, si es necesario, y el diluyente líquido se hace primeramente isotónico con suficiente suero o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son en especial adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. En relación con esto, un medio acuoso estéril que se puede emplear será conocido por los expertos en este campo a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación se puede disolver en 1 mililitro de una solución isotónica de NaCI, y se puede agregar a 1,000 mililitros de fluido de h i p o d e r mó I i s i s , o se puede inyectar en el sitio de infusión propuesto (ver, por ejemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se presentará necesariamente alguna variación de la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. Más aún, para la administración a seres humanos, las pre araciones, por supuesto, de preferencia deberán satisfacer las normas de esterilidad, p i ro g e n i c¡ d a d , y de seguridad y pureza en general, requeridas por la Oficina de Normas Biológicas de la FDA. En otra modalidad de la invención, las composiciones dadas a conocer en la presente se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y las cuales se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o con ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y a partir de bases orgánicas, tales como isopropil-amina, trimetil-amina, histidina, procaína, y similares. Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal como sea terapéuticamente efectiva. Los vehículos pueden comprender además cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes ¡sotónicos y demoradores de absorción, reguladores del pH, soluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de estos medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y composiciones que no produzcan una reacción alérgica o indeseada similar cuando se administren a un ser humano. En ciertas modalidades, se utilizan liposomas, nanocápsulas, m i ero p a rt í c u I a s , partículas de lípido, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos huéspedes adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención se pueden formular para suministrarse ya sea encapsuladas en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o similar. De una manera alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden enlazar, ya sea de una manera covalente o no covalente, a la superficie de estos vehículos portadores. La formación y uso de preparaciones de liposomas y tipo liposomas como vehículos de fármacos potenciales, son generalmente conocidos por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21 , 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691 -95, 1998; Chandran y colaboradores, Indian J. Exp. Biol. 35(8):801 -09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233.61 , 1995; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,567,434; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,552,157; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,565,213; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,738,868, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,795,587, cada uno específicamente incorporado como referencia en su totalidad). Los liposomas se han utilizado con éxito con un número de tipos de células que normalmente son difíciles de transfectar mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de células T, cultivos de hepatocitos primarios, y células PC 12 (Renneisen y colaboradores, J. Biol. Chem. 265(27): 16337-42, 1990; Muller y colaboradores, DNA Cell Biol. 9(3):221-29, 1990). En adición, los liposomas están libres de las limitaciones de longitud del ADN que son típicas de los sistemas de suministro basados en virus. Los liposomas se han utilizado efectivamente para introducir genes, diferentes fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores a I oesté ri eos , y similares, en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece estar asociado con las respuestas autoinmunes o con una toxicidad inaceptable después de su suministro sisté m i co . En ciertas modalidades, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas como vesículas multilamelares ( LVs)). De una manera alternativa, en otras modalidades, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar en general a los compuestos de una manera estable y reproducible (ver, por ejemplo, Quintanar-Guerrero y colaboradores, Drug Dev. Ind. Pharm. 24( 12 ) : 1113 -28 , 1998). Con el fin de evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas r (de un tamaño de alrededor de 0.1 mieras) se pueden diseñar utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Estas partículas se pueden hacer como es descrito, por ejemplo, por Couvreur y colaboradores, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1 ):1-20, 1988; zur Muhlen y colaboradores, Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux y colaboradores, J. Controlled Reléase 50( 1 -3 ) : 31 -40 , 1998; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,145,684. Métodos de Tratamiento. La presente invención también proporciona métodos para aumentar el contenido mineral y la densidad mineral de los huesos. Dicho de una manera breve, numerosas condiciones dan como resultado la pérdida del contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan como resultado la falta de uso del hueso (por ejemplo, debido a fractura), terapéuticos que afectan la resorción ósea, o que aniquilan a las células formadoras de hueso, y el envejecimiento normal. A través del uso de las moléculas descritas en la presente, las cuales inhiben el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta, se pueden tratar o prevenir tales condiciones. Como se utiliza en la presente, se debe entender que el contenido mineral óseo se ha aumentado, si ha aumentado el contenido mineral óseo de una manera estadísticamente significativa (por ejemplo, más de una desviación estándar de la mitad) en un sitio seleccionado. Una amplia variedad de condiciones que dan como resultado la pérdida del contenido mineral óseo, se pueden tratar con las moléculas descritas en la presente. Los pacientes con estas condiciones se pueden identificar a través del diagnóstico clínico, utilizando técnicas bien conocidas (ver, por ejemplo, Harrison's Principies of Interna! Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Los ejemplos representativos de las enfermedades que se pueden tratar incluyen displasias, en donde hay un crecimiento anormal o desarrollo de hueso. Los ejemplos representativos de estas condiciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, enfermedad de Marfan, exotosis hereditarias múltiples, n e u rof i b ro m ato s i s , osteogénesis imperfecta, osteopetrosis , osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudo-artrosis, y osteomielitis piogénica. Otras condiciones que se pueden tratar o prevenir incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una condición que causa más de una desviación estándar del contenido mineral óseo o densidad debajo del contenido mineral esquelético pico en la juventud). Los ejemplos representativos de estas condiciones incluyen estados anémicos, condiciones causadas por esferoides, condiciones causadas por heparina, trastornos de médula ósea, escorbuto, mala nutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad de hígado crónica, senilidad, estado post-menopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o desuso, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria, y osteomalacia. Otras condiciones incluyen condiciones inflamatorias asociadas con pérdida ósea, tales como artritis reumatoide. Dentro de un aspecto de la presente invención, se puede aumentar el contenido mineral óseo o la densidad, mediante la administración a un animal de sangre caliente, de una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula que inhiba el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta. Los ejemplos de los animales de sangre caliente que se pueden tratar incluyen tanto vertebrados como mamíferos, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas, y ratones. Los ejemplos representativos de las moléculas terapéuticas incluyen ribozimas, genes de ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Dentro de otros aspectos de la presente invención, se proporcionan métodos para aumentar la densidad ósea, los cuales comprenden el paso de introducir en las células que lleguen al hueso, un vector que dirija la expresión de una molécula que inhiba el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con un miembro de la familia TGF-beta, y administrar las células que contengan al vector a un animal de sangre caliente. Dicho de una manera breve, las células que lleguen al hueso se pueden obtener directamente del hueso de los pacientes (por ejemplo, las células obtenidas de la médula ósea, tales como CD34 + , osteoblastos , osteocitos, y similares), de la sangre periférica, o de cultivos. Se introduce en las células un vector que dirija la expresión de una molécula que inhiba el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con un miembro de la familia TGF-beta. Los ejemplos representativos de los vectores adecuados incluyen vectores virales tales como vectores virales de herpes (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,288,641 ), vectores adenovirales (por ejemplo, WO 94/26914, WO 93/9191 ; Kolls y colaboradores, PNAS 91 ( 1 ) : 215 -219 , 1994; Kass-Eisler y colaboradores, PNAS 90(24): 11498-502, 1993; Guzman y colaboradores, Circulation 88 ( 6 ) : 2838-48 , 1993; Guzman y colaboradores, Cir. Res. 73(6 ): 1202- 1207, 1993; Zabner y colaboradores, Cell 75(2):207-216, 1993; Li y colaboradores, Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud y colaboradores, Eur. J. Neurosci. 5 ( 10 ) : 1287- 1291 , 1993; Vincent y colaboradores, Nat. Genet. 5(2) : 130-134, 1993; Jaffe y colaboradores, Nat. Genet. 1 (5):372-378, 1992; y Levrero y colaboradores, Gene 101 (2): 195-202, 1991 ), vectores virales adeno-asociados (WO 95/13365; Flotte y colaboradores, PNAS 90 (22 ) : 10613 - 10617 , 1993), vectores de baculovirus, vectores de parvovirus (Koering y colaboradores, Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), vectores de virus de varicela (Panicali y Paoletti, PNAS 79:4927-4931 , 1982; y Ozaki y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2):653-660 , 1993), y retrovirus (por ejemplo, Patente Europea Número EP 0,415,731 ; Publicaciones Internacionales Números WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,219,740; Publicaciones Internacionales Números WO 93/11230; WO 93/10218). De la misma manera, se pueden construir vectores virales que contengan una mezcla de diferentes elementos (por ejemplo, promotores, secuencias de envoltura, y similares) a partir de diferentes virus, o de fuentes no virales. Dentro de diferentes modalidades, se puede utilizar ya sea el vector viral mismo, o bien una partícula viral que contenga al vector viral, en los métodos y composiciones descritos más adelante. Dentro de otras modalidades de la invención, se pueden administrar moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen una molécula que inhiba el enlace de la proteína de enlace de TGF-beta con un miembro de la familia TGF-beta, mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, la administración de asialo-osom ucoide (ASOR) conjugado con complejos de poli-L-lisina/ADN (Cristano y colaboradores, PNAS 92122-92126, 1993), ADN enlazado con adenovirus muerto (Curie! y colaboradores, Hum. Gene Ther. 3(2): 147-154, 1992), introducción mediada por citofectina (DMRIE-DOPE, Vical, California), inyección directa de ADN (Acsadi y colaboradores, Nature 352:815-818, 1991 ); ligando de ADN (Wu y colaboradores, J. of Biol. Chem. 264:16985- 16987, 1989); lipofección (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sc¡. EUA 84:7413-7417, 1989); liposomas (Pickering y colaboradores, Circ. S9( 1 ): 13-21 , 1994; y Wang y colaboradores, PNAS 84:7851-7855, 1987); bombardeo de microproyectiles (Williams y colaboradores, PNAS 88:2726-2730, 1991 ); y suministro directo de ácidos nucleicos que codifiquen la proteína misma ya sea solos (Vile y Hart, Cáncer Res. 53:3860-3864, 1993), o utilizando complejos de PEG-ácido nucleico. Los ejemplos representativos de las moléculas que pueden ser expresadas por los vectores de la presente invención incluyen ribozimas y moléculas anti-sentido, cada una de las cuales se describen con mayor detalle anteriormente. La determinación del mayor contenido mineral óseo se puede hacer directamente a través del uso de rayos-X (por ejemplo, a b s o r p to m e tr ía de rayos-X de energía doble o "DEXA"), o mediante inferencia a través de marcadores de cambio óseo (fosfatasa alcalina específica de osteoblastos , osteocalcina, propéptido de procolágeno C tipo 1 (PICP), y fosfatasa alcalina total; (ver Comier, C, Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995), o marcadores de resorción ósea (piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas de ácido resistentes a tartrato en plasma, y galactosil-hidroxilisina; ver Comier, supra). La cantidad de masa ósea también se puede calcular a partir de los pesos corporales, o utilizando otros métodos (ver Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. and Reí. Res. 5:177-181 , 1984). Como será evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerán, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y severidad de la indicación que se esté tratando, de la respuesta deseada, de la condición del paciente, etcétera. Típicamente, las composiciones se pueden administrar mediante una variedad de técnicas, como se observa anteriormente. Los siguientes Ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de Ligandos para las Proteínas de Enlace de TGF-beta Previamente se han descrito secuencias de polipéptidos para los polipéptidos de enlace de TGF-beta conocidos como proteínas de esclerostina ó Beer, así como polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, y composiciones relacionadas y métodos para preparar proteínas de esclerostina ó Beer re co m b i n a n tes aisladas (por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,395,511 ; 6,489,445; 6,495,736). Las interacciones de enlace de la proteína esclerostina (Beer) con los miembros de la superfamilia de TGF-beta BMP-5 y BMP-6, se demostraron previamente, como se describe en lo anterior. Este ejemplo describe la demostración de la asociación específica en los complejos de proteína entre una proteína de enlace de TGF-beta (esclerostina), y cualquiera de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP; por ejemplo, Schmitt y colaboradores, 1999 J. Orthopaed. Res. 17:269), las proteínas antagonistas cordina (por ejemplo, SEQ ID NOs:19-20) y noggina (por ejemplo, SEQ ID NOs:17-18), utilizando resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, Lemura y colaboradores, 1998 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95:9337). La cordina (por ejemplo, Reddi y colaboradores, 2001 Arthritis Research 3:1; O e I g e s c h I ag e r y colaboradores, 2000 Nature 405:757), las proteínas de nudo de cistina tales como noggina (por ejemplo, Groppe y colaboradores, 2002 Nature 420:636), y la familia distintiva DAN de proteínas (incluyendo DAN, Cerberus y Gremlin; por ejemplo, Hsu y colaboradores, 1998 Mol. Cell 1:673), representan tres clasificaciones generales de proteínas antagonistas de BMP secretadas que actúan ext ra ce I u I a r m e n t e (por ejemplo, Balemans y colaboradores, 2002 Dev. Biol. 250:231 ). La alineación de la secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana (Beer) con Cerberus, DAN, y Gremlin, mostró que, a pesar de una andamiaje de cisteína altamente similar entre las cuatro proteínas, la esclerostina exhibía de otra manera poca homología con los miembros de la familia DAN (Figura 1; ver también la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511 ). Análisis de Resonancia de Plasmón Superficial (Biacore) de las Interacciones de Es c I e ros ti n a - B M P . Las proteínas BMP re co m b i n a n tes (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) se hidrataron hasta una concentración de 100 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato (pH de 7.3) con 1 miligramo/mililitro de albúmina de suero bovino de grado RIA (Sigma), y 1 miligramo/mililitro de carboxi-metil-dextrano (Fluka). El regulador de ejecución para el análisis Biacore fue HBS-EP CMD (HEPES 10 m M , NaCI 150 mM, EDTA 3 m M , polisorbato 20 al 0.005 por ciento, y 1 miligramo/mililitro de carboxi-metil-dextrano). Para el análisis cinético, se hicieron chips sensores CM5 (Biacore) con 200 y 400 unidades de respuesta de proteína de fusión de esclerostina humana-FLAG® purificada ("FLAG®-Beer", preparada como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511 ), como es recomendado por el fabricante del chip. Las proteínas BMP se diluyeron en regulador de ejecución, y se inyectaron sobre el chip sensor utilizando la instrumentación Biacore 3000. Los datos se procesaron utilizando el software Bia-evaluation (Biacore), corrigiendo primero el enlace del fondo en una célula de flujo no f u n ci o n a I iza d a , y analizando las curvas de enlace resultantes para los índices activado/desactivado. Para los experimentos de competición, las BMPs se mezclaron con anticuerpos de enlace de BMP, proteínas antagonistas de BMP (DAN, Noggina, Cordina, o gastrulación torcida), o proteínas de fusión-Fc receptoras de BMP (todas son proteínas re co m b i n a nte s , excepto la esclerostina de R&D Systems), o con regulador solamente, antes de la inyección sobre el chip sensor. Estas mezclas se inyectaron entonces sobre los chips sensores f u n c io n a I i za d o s con esclerostina (200 Unidades de Respuesta). Utilizando el software Bia-evaluation, se compararon las curvas de resonancia de plasmón superficial resultantes con aquéllas generadas por las BMPs inyectadas sin las proteínas competitivas, y con las BMPs inyectadas con las proteínas de control irrelevantes. Interacciones de Es c I e ro s ti n a- N o g g i n a y de Esclerostina-Cordina. El regulador de ejecución para el análisis Biacore fue HBS-EP CMD (HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato 20 al 0.005 por ciento, y 1 miligramo/mililitro de ca r b o x i- m e t i I -d ext ra n o ) . Para el análisis cinético, los chips sensores CM-5 (Biacore) se hicieron con 200 y 400 unidades de respuesta de esclerostina humana-Flag purificada, como es recomendado por el fabricante del chip. La proteína de fusión de Noggina-Fc, y la cordina, se diluyeron en el regulador de ejecución, y se inyectaron sobre el chip de escierostina utilizando la instrumentación Biacore. Los datos se procesaron utilizando e! software B i a-e v a I u ati o n , corrigiendo primero el enlace del fondo en una célula de flujo no funcionalizada, y analizando las curvas de enlace resultantes para los índices activado/desactivado. Se llevó a cabo un ensayo de resonancia de plasmón superficial para examinar el enlace de la escierostina con la noggina, enlazando una proteína de fusión de nogg¡na-Fc con un chip Biacore CM-5, que se funcionalizó con un anticuerpo Fe anti-humano. El enlace de la escierostina con la noggina en este formato tuvo una cinética similar a las que se ven cuando se enlazó la noggina con el chip Biacore CM-5 funcionalizado con escierostina. Rastreo de Inhibidores de las Interacciones de Esclerostina-??aa ina v de Esclerostina-Cordina. Utilizando Resonancia de Plasmón Superficial (BiacoreMR). El regulador de ejecución para el análisis BiacoreMR fue HBS-EP CMD (HEPES 10 mM, NaCI 150 m , EDTA 3 mM, polisorbato 20 al 0.005 por ciento, y 1 miligramo/mililitro de carboxi-m etil-dextrano). Para el análisis cinético, los chips sensores CM-5 (Biacore) se hicieron con 200 y 400 unidades de respuesta de escierostina humana-FLAG® purificada, como es recomendado por el fabricante. Se utilizó el comando "coinject" ( co i n y e c c ió n ) de Biacore para inyectar las cantidades saturantes de una primera proteína de interacción con esclerostina (BMP, Noggina, Cordina, o anticuerpo anti-esclerostina) antes de la inyección de una segunda proteína de interacción candidata. Con el fin de determinar si una proteína de interacción era competitiva con otra, se compararon las curvas de enlace de la proteína inyectada en segundo lugar (obtenida sustrayendo el enlace de la primera proteína de la curva de enlace combinada de ambas proteínas), con la curva de enlace de esa segunda proteína cuando se inyectó sola, en seguida de una inyección de regulador de ejecución. Si las curvas de enlace eran similares, las proteínas no se estaban enlazando competitivamente con el polipéptido de esclerostina inmovilizado en el chip. Si la curva de enlace de la segunda proteína se reducía mucho después del enlace de la primera proteína al chip, las proteínas se consideraban como competitivas. Inmunoprecipitación. Las perlas de agarosa anti-FLAG® M2 (Sigma, sT. Louis, MO) se lavaron tres veces con regulador IP (Tris 20 m M , pH de 7.6, NaCI 150 m M , EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1 por ciento, ß-mercaptoetanol 1.4 mM, glicerol al 10 por ciento) antes de la incubación durante 1 hora en la presencia o en ausencia de 4 microgramos de esclerostina-FLAG . La esclerostina-FLAG no enlazada se removió lavando con el regulador IP. Las perlas y los tubos se bloquearon para prevenir el enlace no específico mediante una incubación de 30 minutos con albúmina de suero bovino al 5 por ciento en suero regulado con fosfato. La proteína de fusión de noggina-Fc se rehidrató de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se diluyó en el regulador 1P, y se centrifugó en un microcentrífugo a 4°C durante 10 minutos para remover la proteína acumulada. Las soluciones de noggina se agregaron a las perlas con y sin esclerostina-FLAG, y se incubaron durante 2 horas hasta durante la noche a 4°C. Los inmunoprecipitados se lavaron cinco veces con el regulador IP antes de la adición del regulador de carga SDS-PAGE. Las muestras se analizaron sobre un gel de SDS-PAGE de Tris-glicina en un gradiente del 10 al 20 por ciento (Novex), se transfirieron a nitrocelulosa, y se desarrollaron las Western blots con anticuerpos anti-Fc humana. Res ultados . Utilizando la resonancia de plasmón superficial (SPR) con el polipéptido de esclerostina inmovilizado, se detectó el enlace con esclerostina de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, y BMP-7, teniendo cada interacción de enlace una constante de enlace (KD) en el intervalo nanomolar bajo ( < 10 - 15 n M ) , de acuerdo con las interacciones de enlace de BMP con la esclerostina ("Beer") como se determinó previamente (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,395,511 ). La Figura 6 muestra la demostración de resonancia de plasmón superficial del enlace de la BMP-6 humana con la proteína de fusión de esclerostina humana-FLAG® inmovilizada en el chip, y con la esclerostina de rata marcada con poli-histidina inmovilizada en el chip. En la Figura 7, se compararon las capacidades relativas de varios anticuerpos anti-BMP-6 monoclonales y policlonales para bloquear el enlace de BMP-6 a la esclerostina inmovilizada en el chip, empleando la resonancia de plasmón superficial. Se utilizó el ensayo de resonancia de plasmón superficial para el enlace de BMP-6 a la esclerostina inmovilizada, con el fin de rastrear los anticuerpos a n t i -es c I e ros t ¡ n a que eran capaces de bloquear el enlace de BMP-6 con la esclerostina. Primero se inyectó un anticuerpo candidato en el instrumento de resonancia de plasmón superficial bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir el enlace a la esclerostina inmovilizada en el chip. Subsecuentemente se inyectó la BMP-6, y se evaluó su capacidad para enlazarse a la esclerostina, como se muestra en la Figura 8. Cuando se llevó a cabo el ensayo de resonancia de plasmón superficial utilizando esclerostina humana recombinante inmovilizada en el chip (Beer), e inyecciones de concentraciones graduadas de cordina de murino recombinante o noggina de murino recombinante, se observó que cada una de las proteínas antagonistas de BMP (cordina y noggina) se enlazaba a la esclerostina, como se muestra en la Figura 2). La KD para el enlace de cordina-.esclerostina fue de 1.76 n M (Figura 2A); la KD para el enlace de noggina-esclerostina fue de 2.92 n M (Figura 2B). El enlace con la esclerostina, ya sea por la noggina (Figura 9A) o por la cordina (Figura 9B) fue inhibido en el ensayo de resonancia de plasmón superficial, inyectando primero un anticuerpo anti-esclerostina policlonal en el instrumento de resonancia de plasmón superficial, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir el enlace a la esclerostina inmovilizada en el chip. La confirmación del enlace de noggina a la esclerostina mediante una metodología independiente, se logró mediante inmunoprecipitación con perlas anti-FLAG®, que se cargaron previamente con esclerostina marcada con FLAG®, se lavaron, y luego se expusieron a la proteína de fusión de noggina-Fc. Como se muestra en la Figura 3, la proteína de fusión de noggina fue detectable mediante análisis de inmunomancha Western utilizando anti-Fc en las perlas precipitadas que se cargaron previamente con FLAG®-esclerostina, pero no se detectó noggina en las perlas precipitadas que se cargaron previamente de una manera simulada con regulador solamente. Con el fin de determinar si los antagonistas de BMP noggina y cordina compiten con BMP por el enlace con esclerostina, se llevaron a cabo ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando esclerostina inmovilizada en chip, exponiéndose los antagonistas de BMP-6 y BMP a esclerostina en secuencia (Figura 4A), o siguiendo un paso de mezcla previa (Figura 4B). Como se muestra en la Figura 4A, la saturación de la esclerostina inmovilizada con BMP-6 en fase fluida antes de la inyección de noggina, impidió el enlace de noggina con esclerostina, sugiriendo un enlace competitivo de BMP-6 y noggina con la esclerostina. La Figura 4B muestra que la noggina sola se enlazó con la esclerostina inmovilizada en el chip, mientras que la incubación previa de noggina con BMP-6 antes de la inyección dio como resultado poco enlace detectable de cualquier proteína a la esclerostina. Se obtuvieron resultados similares mediante una comparación del enlace relativo con la esclerostina de la cordina sola, o en secuencia en seguida de la inyección de BMP-6, como se muestra en la Figura 5A, en donde la inyección previa de cantidades saturadoras de BMP-6 precluyó el enlace con la esclerostina de la cordina subsecuentemente inyectada. La Figura 5B muestra los resultados de un experimento de mezcla previa. El análisis de i n m u no p re ci p ita c i ó n con esclerostina inmovilizada en perlas de la cordina de murino recombinante que se utilizó, como se obtuvo del proveedor (R&D Systems), indicó que se podían detectar un número de productos de degradación del polipéptido derivado de cordina, pero aparentemente no el polipéptido de cordina de longitud completa intacto (de aproximadamente 100 kDa), (mediante inmunomancha Western utilizando anticuerpos anti-cordina), como recuperable, específicamente los ligandos de esclerostina enlazados. Entre los polipéptidos derivados de cordina recuperados, estaba una especie que migró en la electroforesis en gel desnaturalizante con una masa de aproximadamente 25 kDa, así como un número de polipéptidos más pequeños y más grandes. Un análisis de inmunoprecipitación similar para caracterizar los polipéptidos de noggina que se enlazaban es ecíficamente a la esclerostina inmovilizada en perlas, indicó que se pudo recuperar noggina no degradada (por ejemplo, de longitud completa) como un ligando de esclerostina. En un ensayo basado en células de la actividad de BMP-6, medida mediante la determinación de la actividad de fosfatasa alcalina inducible en células C3H10T ó C3H10T1/2 (por ejemplo, Ahrens y colaboradores, 1993 DNA Cell Biol. 12(10):871), la cordina fue capaz de inducir el bloqueo de la fosfatasa por parte de BMP-6. Por separado, se detectó noggina en los inmunoprecipitados preparados mediante la reacción de un anticuerpo anti-esclerostina con lisados a partir de una línea celular de osteosarcoma que sobreexpresaba esclerostina.

EJEMPLO 2 Ensayos de Células M es e n u i m a I es Se pueden inducir una pequeña población de células mesenquimales/estromales pluripotentes, denominadas como células osteoprogenitoras inducibles, para diferenciarse en células osteoblásticas (Pittenger, MF y colaboradores, Science, 284:143 (1999)). Estas células osteoprogenitoras inducibles desarrollan y expresan ciertos marcadores fenotípicos de una manera definida en secuencia (Pockwinse, S. y colaboradores, 1992 J. Cell Biochem . 49:310; Lien, JB. y colaboradores, 1999 en Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 4a Edición, MJ Favus (editor), Lippincott, Filadelfia, página 14). Las células osteoprogenitoras expresan colágeno tipo I, mientras que los pre-osteoblastos y los osteoblastos comprometidos, expresan muchos de los marcadores fenotípicos que se identifican típicamente con una célula del linaje del osteoblasto. Estos marcadores incluyen colágeno tipo I, fosfatasa alcalina, receptor de hormona paratiroides (PTHr), y osteopontina. En la etapa terminal de la diferenciación de osteoblastos, los osteocitos están rodeados por depósitos de mineral, así como por proteínas de matriz, tales como CDCD44 y osteocalcina. Por consiguiente, el desarrollo, crecimiento, y diferenciación de las células precursoras osteoblásticas en osteoblastos maduros, se presentan de una manera definida dependiente del tiempo (Pockwinse y colaboradores, 1992 J. Cel! Biochem. 49:310). Las células mesenquimales humanas primarias, los osteoblastos humanos primarios y los medios correspondientes, están disponibles en Biowhittaker ( W a I k e rs vi 11 e , MD). Las células mesenquimales de ratón C3H10T1/2 están disponibles en la American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC Depósito No. CCL-226). A medida que los osteoblastos inmaduros se diferencian y llegan a ser capaces de tener mineralización, expresan los marcadores asociados con el fenotipo del osteoblasto (colágeno tipo I y receptor de hormona paratiroides (PTHr)). Estos marcadores se utilizan para aseverar si se presentó la diferenciación. Las células mesenquimales humanas y los osteoblastos humanos primarios se aplican a un medio de crecimiento regular que contiene suero fetal del becerro al 2 por ciento en una densidad de 10,000 células/cm2. Los reactivos de prueba se agregan solos o en combinación al día siguiente. Los cultivos se continúan durante 24 a 120 horas, después de lo cual, se cosechan las células para el aislamiento del ARN. Las células hMSC no tratadas expresarán fuertemente el colágeno tipo I, con niveles negligibles de PTHr y SOST. Estos resultados indican que las células hMSC no tratadas están en una etapa temprana del linaje del osteoblasto, pero están comprometidas en la o s te o b I asto g é n e s is . El tratamiento de estas células con DEX, proteínas morfogenéticas óseas, IGF-1 (IGF-1 a 50 nanogramos/mililitro), o cultivo a largo plazo de medio inductor de osteoblastos , avanzará la etapa de diferenciación, e inducirá la expresión de PTHr. Con el fin de determinar el efecto de un agente identificado en la presente sobre las células m e s e n q u i m a I es humanas, las células hMSC se aplican a platos de cultivo de tejido de 96 pozos en una densidad de 10,000 células/cm2 en un medio inductor de osteoblastos. El agente se prepara en un vehículo apropiado, y se agrega un volumen igual de medio acondicionado Sf9 (control) a los cultivos de células hMSC en diferentes tiempos después de su aplicación (1 día, 8 días, 15 días, ó 21 días). Los efectos del agente sobre la diferenciación osteoblástica se evalúan midiendo la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP, determinada en capas celulares utilizando el regulador DEAA (Pierce) que contiene NP-40 al 0.5 por ciento, y fosfato de p- n itrof e n i I o 10 mM), síntesis de colágeno tipo I (Prolagen C ELISA), y depósito de calcio para la m i n e ra I i za ci ó n (ensayo colorimétrico de los lisados en ácido de las capas celulares, Sigma). Con el fin de determinar los efectos de un agente identificado en la presente sobre las células m es e n q u i m a I es de ratón C3H10T1/2, las células C3H10T1/2 (ATCC Depósito No. CCL-226) se aplican a platos de 96 pozos en una densidad de 25,000 células por pozo, en un medio de crecimiento completo (DMEM con alto contenido de glucosa y glutamina complementada con suero fetal de becerro al 10 por ciento, enicilina/estreptomicina al 1 por ciento, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, piruvato de sodio 1 mM, ß-mercaptoetanol 55 µ?, y HEPES 20 mM, pH de 7.3). Las células C3H10T1/2 se pueden utilizar en un ensayo de corto plazo (72 horas), para determinar los efectos de un agente sobre la actividad de la fosfatasa alcalina inducida por BMP. El agente se prepara en un vehículo apropiado, y se incuba previamente un volumen igual de medio acondicionado Sf9 (control) con 500 n a n o g ra m o s/m i I i I i t ro de BMP-6 durante 1 hora antes de agregarse a las células. Para una comparación, se llevan a cabo incubaciones similares con anticuerpo anti-BMP-6 y noggina. Las células se cosechan 72 horas después para la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina. A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque se han descrito en la presente las modalidades específicas de la invención para propósitos de ilustración, se pueden hacer diferentes modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo aislado que comprende una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP en asociación específica, en donde: (i) la proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina que es capaz de enlazarse de una manera específica con un primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-5 y un polipéptido BMP-6, y (ii) la proteína antagonista de BMP se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido de cordina y un polipéptido de noggina, siendo esta proteína antagonista de BMP capaz de enlazarse de una manera específica con cuando menos un segundo polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-2, un polipéptido BMP-4, y un polipéptido BMP-7, y en donde el complejo es incapaz de enlazarse con el primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta.

2. Un complejo aislado que comprende una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta en asociación específica, en donde: (a) la primera proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un primer miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un primer ligando cognado; y (b) la segunda proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un segundo miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un segundo ligando cognado; en donde el complejo es incapaz de enlazarse con el primer ligando cognado.

3. Un complejo aislado que comprende una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta en asociación específica, en donde: (a) la primera proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un primer miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un primer ligando cognado, y (b) la segunda proteína de enlace de TGF-beta es capaz de enlazarse con un segundo miembro de la superfamilia de TGF-beta que es un segundo ligando cognado; en donde el complejo es incapaz de enlazarse con cualquiera del primero y segundo ligandos cognados.

4. El complejo de la reivindicación 3, en donde la primera proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esclerostina, y el primer ligando cognado es cuando menos un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, y BMP-7, y en donde la segunda proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de cordina, y el segundo ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en BMP-2, BMP-4, y BMP-7. 5. El complejo de la reivindicación 3, en donde la primera proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de esc I e ro s t i n a , y el primer ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en BMP-5 y BMP-6, y en donde la segunda proteína de enlace de TGF-beta comprende un polipéptido de noggina, y el segundo ligando cognado es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en BMP-2, BMP-4, BMP-7, y GDF-

5.

6. Un método para identificar un agente que module el enlace entre una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP, el cual comprende los asos de: (a) poner en contacto, en ausencia y en la presencia de un agente candidato, una proteína de enlace de TGF-beta y una proteína antagonista de BMP bajo condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la asociación específica de la proteína de enlace de TGF-beta y la proteína antagonista de BMP, para formar un complejo de acuerdo con la reivindicación 1; y (b) determinar un nivel del complejo que esté presente, en donde una diferencia en el nivel de los complejos en la presencia del agente candidato en relación con el nivel en ausencia del agente candidato indica que el agente modula el enlace entre la proteína de enlace de TGF-beta y la proteína antagonista de BMP.

7. Un método para identificar un agente que module el enlace entre una primera proteína de enlace de TGF-beta y una segunda proteína de enlace de TGF-beta, el cual comprende los pasos de: (a) poner en contacto, en ausencia y en la presencia de un agente candidato, una primera y una segunda proteína de enlace de TGF-beta, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la asociación específica de las primera y segunda proteínas de enlace de TGF-beta, para formar un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5; y (b) determinar un nivel del complejo que esté presente, en donde una diferencia en el nivel de los complejos en la presencia del agente candidato en relación con el nivel en ausencia del agente candidato indica que el agente modula el enlace entre la primera proteína de enlace de TGF-beta y la segunda proteína de enlace de TGF-beta.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el agente candidato reduce la asociación específica de las proteínas para formar un complejo.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el agente candidato aumenta la asociación específica de las proteínas para formar un complejo.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el agente candidato estabiliza la asociación específica de las proteínas para formar un complejo.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el agente candidato se selecciona a partir del grupo que consiste en una molécula orgánica, un producto natural, un péptido, o oligosacárido, un ácido nucleico, un lípido, un anticuerpo o fragmento de enlace del mismo, y una célula.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el agente candidato se obtiene a partir de una biblioteca de compuestos.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la biblioteca se selecciona a partir del grupo que consiste en una biblioteca de péptidos aleatorios, una biblioteca de productos naturales, una biblioteca de combinación, una biblioteca de oligosacáridos, y una biblioteca de exhibición de fagos.

14. Un agente identificado de acuerdo con el método ya sea de la reivindicación 6 o bien de la reivindicación 7.

15. Un método para modular la densidad ósea, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, un agente que module la interacción entre: (i) un polipéptido de esclerostina que es capaz de enlazarse de una manera específica con un primer polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-5 y un polipéptido BMP-6, y (¡i) una proteína antagonista de BMP que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido de cordina y un polipéptido de noggina, siendo esta pro teína antagonistas de BMP capaz de enlazarse de una manera específica con cuando menos un segundo polipéptido miembro de la superfamilia de TGF-beta, que se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido BMP-2, un polipéptido BMP-4, y un polipéptido BMP-7.

16. El método de la rei indicación 15, en donde el agente comprende un mimético del poli éptido de cordina o del polipéptido de noggina.

17. El método de la reivindicación 15, en donde el agente modula la mineralización ósea.