CONJUGADOS OBTENIDOS MEDIANTE AMINACION REDUCTORA DE POLISACÁRIDO CAPSULAR DE NEUMOCOCO DE SEROTIPO 5 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene en particular por objeto una forma aminada particular del polisacárido capsular del neumococo tipo los 5, los conjugados que incorporan esta forma, asi como los métodos de fabricación que permiten obtenerlo . El neumococo [Stxeptococcus pneumoníae) es una bacteria encapsulada gran-positiva, responsable de meningitis y enfermedades bacterianas. Ocasiona igualmente una gran parte de infecciones respiratorias tales como bronquitis, rinitis y otitis en complicaciones tanto en el adulto como en el niño. Los neumococos son divididos en serotipos de acuerdo con la estructura de los polisacáridos que forman la cápsula. La tipificación serológica del neumococo es realizada con la ayuda de una bacteria de antisuero, cada antisuero es especifico de un ¦ solo tipo de polisacárido capsular. Más de 90 serotipos diferentes, todos patógenos para el hombre han sido enlistados. Los serotipos 6B, 14, 18C, 19F y 23F son prevalecientes en jóvenes niños y son la causa de neumonías y otitis. Los serotipos 1 y 5 son encontrados más frecuentes en los países en vía de desarrollo que en los países industrializados . Las vacunas que protegen contra los principales
serotipos encontrados en clínica humana han sido desarrolladas o están en curso de desarrollo. Una vacuna que comprende los polisacáridos capsulares de 23 serotipos diferentes responsables del 90% de infecciones de neumococos (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F) es eficaz en el adulto y en el niño de más de dos años. Por el contrario el niño de menos de dos años, debido a la inmadurez de su sistema inmunitario, no responde a esta vacuna constituida de antígenos de polisacáridos T-independientes . Se ha superado este obstáculo al desarrollar vacunas que contienen polisacáridos capsulares de diferentes serotipos de neumococos acoplados (conjugados) a uno o varios portadores de proteínas (WO 98/51339) . Estos conjugados inducen el desarrollo de una inmunidad humoral protectora T-dependiente en el niño joven, se traduce por la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra los polisacáridos de diferentes ¦ tipos utilizados en estos conjugados. Los polisacáridos capsulares de diferentes serotipos de neumococo son todos formados de la repetición de "una unidad de base (unidad repetitiva) constituida de varios azucares;- Como ilustración se indica que la unidad de base del polisacárido del neumococo 5 esta constituida de 5 hexosas: glucosa, fucosamina N-acetilada, neumosamina N- acetilada (2-acetamido-2, 6-desoxitalosa) , ácido glucorónico y
un azúcar llamado Sug (2-acetamido-2, 6-desoxihexosa-4-ulosa) ligadas entre si para formar una estructura química en donde la fórmula condensada es la siguiente:
4)-0-D-G)cp-(1 ->4)~a-L-FucpNAc-(1 -»3)-p-D-Sugp-1 3 1 a-L-Pnep Ac-(1 ?·2)-ß-?-T????
La fórmula desarrollada que corresponde fórmula (I) tal como la siguiente:
en la cual Sug significa 2-acetamido-2, 6-desoxi-hexosa-4^ulosa; PneNAc significa 2-acetamido-2, 6-desoxitalosa, también denominada neumosamina N-acetilada;
FucNAc significa 2-acetamido-2 , 6-desoxigalactosa, también denominada fucosamina N-acetilada; GlcA significa ácido glucorónico; y Glc significa glucosa. Esta fórmula ha sido dada por Jannson P.E. et al.,
Carbohydrate Research (1985) 140(1): 101. No obstante no es imposible que un porcentaje reducido de unidades repetitivas de polisacárido presenten un grupo hidroxilo en lugar de la función cetona. Existen numerosos métodos que permiten acoplar un polisacárido a una proteina portadora. De entre ellos, los métodos que ponen en juego a titulo preliminar, una aminación reductora del polisacárido son de uso común. Por ejemplo, como se describe en EP 562 107, el polisacárido es en principio acoplado mediante aminación reductora a un separador bifuncional de tipo NH2-R-NH2; luego el polisacárido asi derivado y aminado es acoplado a un agente de enlace bifuncional, en particular capaz de reaccionar con una función amina. El polisacárido asi activado es en seguida conjugado a una proteina portadora. De acuerdo con otras variantes, se puede también acoplar directamente el polisacárido a la proteina mediante aminación reductora o bien aún omitir el separador. Como es bien conocido, una reacción de aminación reductora se efectúa en dos tiempos. En un primer tiempo, se forma un compuesto intermediario llamado base de Schiff de fórmula CH=NH+-R' , resultante de la interacción entre un grupo aldehido de una primera molécula (R-CHO) y un grupo amina primaria (R'-NH2) de una segunda molécula. La base de Schiff es enseguida reducida en un segundo tiempo bajo la
forma de un compuesto aminado R-CH2-NH-R' en presencia de una agente reductor. Se utiliza un agente reductor selectivo capaz de reducir la función imina de la base de Schiff de manera especifica, tal como un hidrógeno activado por un catalizador, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) una amina borano. Se utiliza de preferencia cianoborohidruro o piridina borano . En la medida en donde todos los polisacáridos poseen una función aldehido al final de la cadena (función aldehido terminal) , los métodos de conjugación que comprenden una aminación reductora del polisacárido son de aplicación muy general y cuando no existe ninguna otra función aldehido en la unidad repetitiva (función aldehido intr.a-cadena) , tales métodos permiten obtener conjugados en los cuales una molécula de polisacárido es acoplada a una molécula única de proteina portadora. De manera bastante clásica, un polisacárido es sometido a una aminación reductora, en presencia de un agente reductor selectivo de la base de Schiff, durante por lo menos 24 a 48 horas a un pH neutro o básico. Asi, US 4,761,283 describe la aminación reductora del polisacárido capsular de neumococo de tipo 6A (previamente fragmentado mediante hidrólisis ácida) por un mutante no tóxico de la toxina diftérica (mutante CRM 197), en presencia de cianoborohidruro de sodio. El pH del medio de
reacción es básico (pH = 8) y la duración de incubación es de 18 días a 37°. EP 477 508 describe la aminación reductora de polisacáridos de neumococo de tipo de 6A, 14, 19F y 23F mediante diaminometano o diaminoetano, en presencia de piridina borano que juega el papel de agente reductor de la base de Schiff. El pH del medio de reacción es de 9.2. La reacción se prosigue durante 48 horas. En EP 562 107 citado anteriormente en la presente, la aminación reductora del polisacárido se lleva a cabo a pH 8, durante 6 dias . En la medida en donde el polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 comprende una función cetona intra-cadena, se debería en teoría esperar que esta función cetona, además de la función aldehido terminal, sea amino-reducida durante la aminación reductora del polisacárido. De otra manera, cuando se somete en paralelo el polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 y un polisacárido capsular de otro serotipo o de otra especie que no comprende funciones aldehido- y cetona intra-cadena, las proporciones de aminación son equivalentes; lo que parece bien confirmar que solo la función aldehido terminal del polisacárido capsular del neumococo de tipo 5 es aminada y que solo esta función es modificada durante el curso de la reacción. De otra manera, en realidad, tal no es el caso.
En efecto, se ha descubierto ahora que la estructura química de la unidad repetitiva del polisacárido de neumococo de tipo 5 es modificada después de aminación reductora de acuerdo con el método clásico. Esto ha sido demostrado por espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) y mediante cromatografía de intercambio de aniones de alto desempeño, acoplada a una detección amperométrica de campo pulsado (cromatografía HPAE-PAD) : La gran mayoría del residuo Sug desaparece en beneficio de tres nuevos compuestos: (i) la ß-quinovosamina N-acetilada resultante de la reducción de la función cetona del residuo Sug en función alcohol y (ii) un compuesto X resultante de una transformación más importante del residuo -Sug. El tercer compuesto no es ¦ otro que el isómero de la ß-D-qüinovosamina N-acetilada, es decir la ß-D-fucosamina N-acetilada, resultante igualmente de la reducción del residuo Sug y en donde se observa un ligero aumento. En espectrometría de RMN y tal como se muestra en la figura 1, el polisacárido de neumococo de tipo 5 en su forma natural simplemente fragmentada, presenta en la zona de resonancia de carbonos de grupos metilos en posición 6 (C6) de azucares, las tres señales de resonancia características de los grupos metilo de la pneumosamina N-acetilada (PneNac) , de la fucosamina N-acetilada (FucNAc) y del residuo Sug (figura 1 - espectro 1) . La fragmentación no modifica en nada
el espectro, sino que mejora su resolución. Después de la aminación clásica mediante diaminohexano, en presencia de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) , se nota que la señal de resonancia característica del grupo metilo del residuo Sug (en abreviatura "señal característica del residuo Sug") es sustancialmente disminuida y que esta disminución se acompaña de la aparición de dos nuevas señales de resonancias: una entre 17 y 18 ppm, característica de la quinovosamina N-acetilada (QuiNAc) y. la otra entre 13 y 14 ppm, que señala un compuesto nuevo, en donde la estructura no es conocida y que, por esta razón, es denominado compuesto X (figura 1 espectro 4) . En cromatografía de HPAEC-PAD, cuando ' se comparan los cromatogramas de los productos de hidrólisis mediante ácido trifluoroacético 2 N, durante 2 horas a 120° del polisacárido natural o despolimerizado y del polisacárido obtenido después de aminación reductora clásica, tal como se muestra en la figura 2 (curva en líneas continuas) , se comprueba la aparición de un primer pico (entre 5.50 y 6.10 minutos,, cuando la cromatografía es realizada en condiciones especificadas posteriormente en la presente) que corresponde a un compuesto resultante de la aminación reductora en donde la estructura no es identificada (compuesto X) así como un segundo pico (entre 6.90 y 7.40 minutos, cuando la cromatografía es realizada en las condiciones especificadas
posteriormente en la presente) característico de la quinovosamina. Por otra parte, la intensidad del pico correspondiente a la fucosamina es sustancialmente aumentada. Conviene notar que los cromatogramas comprendidos aquellos del polisacárido natural o despolimerizado, no comprenden pico correspondiente al residuo Sug. En efecto, para ser sometido a una cromatografía HPAEC-PAD, el polisacárido debe ser en primer lugar hidrolizado. Esta hidrólisis destruye el residuo Sug; también tiene por efecto convertirle la QuiNAc, el PneNAc y la FucNAC a quinovosamina (QuiN) , pneumosamina (PneN) y fucosamina (FucN) . Por otra parte, se ha descubierto igualmente que la transformación del compuesto Sug en compuesto X es nefasta para la inmunogenicidad del polisacárido, asimismo si esta transformación no es parcial - es decir no tiene lugar más que en ciertas unidades repetitivas del polisacárido y no en la totalidad. Por el contrario, la transformación en QuiNac o FucNAc no tiene ninguna influencia notable. Se aprecia así deseable buscar los medios que permitan...evitar la aparición del compuesto X. Esto se ha hecho posible al modificar el modo de operación clásico de la aminación reductora. De manera alternativa, se pueden también reducir previamente las funciones cetona (C=0) del polisacárido natural (no fragmentado) . Esto se puede aplicar al utilizar un agente reductor fuerte tal como NaBH4. Este
agente reductor no genera compuesto indeseable. No reduce más que las funciones cetona y aldehido. Pero como reduce estos últimos, es necesario fragmentar enseguida el polisacárido reducido con el fin de reintroducir grupos aldehido terminales. La reducción de las funciones cetona impide cualquier modificación ulterior cuando el polisacárido es sometido a continuación a una aminación reductora cualquiera. Esto es por lo que la invención tiene por objeto: (i) Un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 aminado al nivel del grupo aldehido terminal y que presenta
(i) un espectro RMN de carbono (13C) desprovisto de señal de resonancia entre 13 y 14 ppm, limites incluidos; (ii) un cromatograma HPAEC-PAD, sustancialmente desprovisto de pico entre los picos de fucosamina y pneumosamina, el cromatograma es obtenido mediante elusión a partir de una columna Carbopac™ PA10, en una solución de sosa 18 mM, a un flujo de 1 ml/minuto, durante 15 minutos, de monosacáridos resultantes de la hidrólisis del polisacárido o (iii) los dos. (ii) Un conjugado en el cual el polisacárido de acuerdo . con la invención es acoplado a un polipéptido portador (P) . (iii) Un primer método de fabricación de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 aminado, según el cual se somete el polisacárido a una aminación reductora en presencia de un agente selector selectivo de una base de
Schiff, a un pH de 4 a 6.5, de preferencia de 5 a 6, por una duración que no excede de 4 horas. (iv) Un segundo método de fabricación de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 aminado, según el cual (i) se hace reaccionar el polisacárido con un agente capaz de reducir una función cetona, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido obtenido en (i) y (iii) se somete el polisacárido ' reducido y fragmentado a una aminación reductora . En lo que sigue del texto, se denomina
"polisacárido aminado" un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 que es aminado al nivel del grupo aldehido terminal; es decir resultante de la reacción de la función aldehido terminal con una función amina . La aminación reductora de un polisácarido puede ser realizada al hacer reaccionar la función aldehido terminal de un polisacárido con compuestos muy diversos, pero evidentemente todos caracterizados porque poseen una función amina primaria. Estos compuestos pueden ser polipéptidos o compuestos químicos. Estos polipéptidos y estos compuestos químicos serán evocados de manera más detallada en lo que sigue de la descripción. Cuando se trata de un polipéptido, el producto de la . aminación reductora es en efecto un conj ugado polisacárido-polxpéptido . Para uso en los métodos de acuerdo con la
invención, un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 es previamente, de manera ventajosa, purificado a partir de un cultivo bacteriano, por ejemplo según el método de Gotschlich et al, J. Exp. Med. (1969) 129:1349. El polisacárido puede ser utilizado tal cual (se habla entonces de forma natural) o bien fragmentado. En efecto, el tamaño del polisacárido no es absolutamente critico. En su forma natural, el polisacárido contiene aproximadamente 300 unidades repetitivas. Un polisacárido fragmentado puede estar constituido de por lo menos 4 unidades repetitivas, en general de 25 a 100 unidades repetitivas. Si es necesario, se puede determinar el tamaño de un polisacárido de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo mediante determinación de su KD mediante gel de filtración o por la medida de su masa molecular mediante SEC-triple detección (cromatografía de exclusión-difusión acoplada a una triple detección: refractometría, viscosimetría, difusión de la luz) . Un polisacárido puede ser fragmentado de acuerdo con diversos métodos bien conocidos por el experimentado en la técnica, por ejemplo mediante hidrólisis ácida o básica controlada o despolimerización por- radicales oxidante, tal como se describe en EP 562 107. En el primer método de acuerdo con la invención, se utiliza de preferencia un polisacárido fragmentado; en el
segundo un polisacárido natural. Con el fin de caracterizar la presente invención, la espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) puede ser aplicada de acuerdo con protocolos completamente convencionales; en particular los datos pueden ser obtenidos a partir de cualquier tipo de aparato destinado para este efecto. La espectrometría de RMN de carbono ya ha sido extensamente utilizada para estudiar las unidades repetitivas de un cierto número de polisacáridos capsulares, en particular aquellos de neumococo. Como ejemplo, se citan C. Jones et al, Carbohyd. Res. (2000) 325: 192. El experimentado en la técnica en el dominio de análisis espectral dispone asi de suficiente información para aplicar el mismo al análisis del polisacárido de tipo 5 mediante expectrometria RMN de carbono. No obstante, como ejemplo, se indica un protocolo de preparación de muestras que es particularmente apropiado para medida ulterior en un espectrofotómetro Bruker DRX5000 con una sonda de medida de ancho de banda (ancho espectral: 27500 Hz) . 12 a 17 miligramos de un liofilisado de un polisacário de tipo 5 son disueltos en 0.5 mililitros de agua deuterada (D20) . Esta muestra es colocada en un tubo de 5 mi especialmente concebido para el análisis de RMN. Luego los espectros son registrados a 70° (343 K) . Al final de la caracterización, la cromatografía
HPAEC-PAD se debe efectuar en condiciones bien precisas con respecto al tipo de columna, soluciones de elusión y el flujo de elusión. Se proporciona posteriormente en la presente un modo de operación completo. Es conveniente al principio hidrolizar los polisacáridos aminados a polisacáridos . Para hacer esto, se tratan 5 a 20 de polisacárido aminado en solución en agua desionizada a una concentración de 10 - 40 µg/ml, mediante 500 µ? de ácido trifluoroacético 2 N durante 2 horas a 120 °C en una matraz cerrado herméticamente. Los hidrolizados son secados bajo un flujo de nitrógeno a 40°C con el fin de eliminar el ácido trifluoroacético . Los residuos son luego disueltos 400 µ? de agua desionizada. La cromatografía es aplicada en una columna analítica CarboPa™ PA10 (4 x 250 mm) comercializada por Dionex. Esta columna está constituida de un soporte a base poliestireno y de divinil bencen sulfonato que tiene un grado de reticulación de 55% recubierto de microbolas de látex injertadas con grupos amonio cuaternario. El grado de reticulación del látex (microbolas de látex) es de 5%; el diámetro de las microbolas es de 400 nm. Se inyectan 5 µg de hidrolizado a la columna. Luego se somete la columna a un flujo de una solución de sosa 18 mM durante 15 minutos a un flujo de 1 mi/minuto, con el fin de
eluir los monosacáridos y oligosacáridos no cargados, tales como hexosas y hexosaminas . Para concluir el cromatograraa, se puede enseguida aumentar gradualmente la molaridad de la solución de sosa hasta 100 mM y finalmente eluir los monosacáridos y oligosacáridos ácidos restantes con la ayuda de una solución de sosa 100 mM/acetato de sodio 300 mM. En toda la duración de la elusión, el flujo es de 1 ml/minuto y la temperatura es de 30 °C. En estas condiciones, la distancia entre los picos de fucosamina y de pneumosamina es de aproximadamente 2 ¦ minutos. Cuando los picos de fucosamina y de pneumosamina aparecen a 4.75 y 6.7.5 minutos respectivamente, el pico X se debe aparecer, sorteado entre 5.50 y 6.10 (5.80 minutos) . Los productos obtenidos para cada uno de los dos métodos de acuerdo con la invención responden los dos a la definición del producto de acuerdo con la invención; pero diferente en lo que concierne al porcentaje de compuesto Sug y de quinovosamina N-acetilada. Cuando se aplica el primer método de acuerdo con la invención (que especifica condiciones de aminación reductora optimizada) se obtiene un polisacárido aminado que presenta: (i) Un espectro de RMN de carbono que comprende una señal de resonancia entre 11.5 y 12.5 ppm, limites incluidos, característico del compuesto Sug y una señal de resonancia situada entre 17 y 18 ppm, límites incluidos, característico
de la quinovosamina N-acetilada, en donde la intensidad es menor en comparación con la señal situada entre 17 y 18 ppm, limites incluidos, en el espectro de RMN (13C) de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 obtenido después de aminación reductoxa, en presencia de cianoborohidruro de sodio, a pH 8, durante 48 horas o (ii) Un cromatograma HPAEC-PAD que comprende un pico eluido inmediatamente después de la pneumosamina, característico de la quinovosamina, en donde la intensidad es menor en comparación con el pico equivalente en el cromatograma HPAEC-PAD de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 obtenido después de aminación reductora, en presencia de cianoborohidruro de sodio, a pH 8, durante 48 horas o (iii) Los dos. No es posible cuantificar en absoluto el porcentaje de residuos Sug que han sido modificados después de aminación reductora, en una molécula de polisacárido tomada separadamente o en un conjunto de moléculas. Por el contrario, es posible de indicar que la proporción de modificación de residuos Sug es disminuida de por lo menos 65% - cuando no es de por lo menos 70 o 75% - cuando el polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 es obtenido en forma aminada mediante el primer método de acuerdo con la invención, en comparación con un polisacárido capsular de
neumococo de tipo 5 aminado de acuerdo con el método clásico. Después de aminación reductora según el primer método de acuerdo con la invención, lo esencial de las modificaciones que persisten, portadas sobre la transformación de ciertos residuos Sug del polisacárido a quinovosamina N-acetilada; el compuesto X no es formado de manera sustancial, como lo atestigua el espectro de RMN de carbono y el cromatograma HPAEC-PAD (figura 1 - 2 espectro y figura 2 - curva de lineas discontinuas) . En efecto, el espectro no presenta señal de resonancia comprendida entre 13 y 14 ppm, limites incluidos, característica del compuesto X y el cromatograma presenta simplemente un pico ancho de intensidad muy reducida entre el pico de fucosamina y de pneumosamina (entre 5.50 y 6.10 minutos) . Mediante el primer método de acuerdo con la invención, es asimismo posible obtener un polisacárido aminado que presenta (i) un espectro de RMN de carbono francamente desprovisto de señal de resonancia entre 17 y 18 ppm; (ii) un cromatograma HPAEC-PAD desprovisto de pico de quivosamina (entre 6.90 y 7.40 minutos), el pico observado con el polisacárido aminado de acuerdo con un método de aminación clásico es reducido hasta no ser más que un simple parapeto del pico precedente (pico de pneumosamima) o (iii) los dos. El segundo método de acuerdo con la invención
requiere previamente la reducción de grupos cetona del polisacárido natural. En estas condiciones, se comprende fácilmente que los residuos Sug sean esencialmnte transformados a quinovosanima y fucosamina N-acetiladas . En el caso en donde se habla de "polisacárido reducido". La aminación reductora de acuerdo con un modo de operación clásico del polisacárido reducido y fragmentado no tiene ninguna influencia notable sobre la estructura de las unidades repetitivas. Esto se muestra bien en la figura 2 -curva de lineas discontinuas. Asi, cuando se aplica el segundo método de acuerdo con la invención, se obtiene un polisacárido que presenta. (i) ün espectro de RMN de carbono desprovisto de señal de resonancia entre 11.5 y 12.5 ppm, limites incluidos, característico del compuesto Sug, que comprende una señal de resonancia situada entre 17 y 18 ppm, límites incluidos, característico de la quinovosamina N-acetilada, en donde la intensidad es aumentada en comparación con la señal de resonancia situada en 17 yl8 ppm, límites incluidos, en el espectro de RMN (13C) de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 obtenido después de aminación reductora, en presencia de cianoborohidruro de sodio, a pH 8, durante 48 horas o (ii) un cromatograma HPAEC-PAD que comprende un pico situado inmediatamente después del pico de pneumosamina,
característico de la quinovosamina, en donde la intensidad es aumentada en comparación con el pico equivalente en el cromatograma HPAEC-PAD de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5, obtenido después de aminación reductora, en presencia de cianoborohidruro de sodio, a pH 8 durante 48 horas o (iii) Los dos. En otros términos, un polisacárido aminado de acuerdo con la invención, aminado al nivel del grupo aldehido terminal, está esencialmente constituido de unidades repetitivas de fórmula (ii)
en la cual A es de manera independiente y aleatoria C=0 o CHOH. Por ^polisacárido aminado esencialmenet constituido", se entiende un polisacárido aminado al nivel del grupo aldehido terminal, en el cual el porcentaje de
unidades repetitivas de fórmula (II) es de por lo menos 85%, de preferencia de por lo menos 90%, de manera completamente preferida de por lo menos 95%. En función del método utilizado para fabricar polisacáridos aminados de acuerdo con la invención, la proporción de unidades repetitivas de fórmula (II) , en la cual A es C=0 (fórmula II') puede variar considerablemente y en consecuencia es asimismo de la proporción de unidades repetitivas de fórmula (II) en la cual A es CHOH (fórmula II") . El segundo método de acuerdo con la invención genera un polisacárido aminado en el cual las unidades repetitivas responden a la fórmula (II") puesto .que en la RMN, la señal de resonancia . que corresponde al residuo Sug desaparece a beneficio de la señal de resonancia correspondiente a la quinovosamina N-acetilada. El polisacárido contiene por lo menos 95% de unidades repetitivas de fórmula (II") . Por el contrario, al utilizar el primer método de acuerdo con la invención, se produce un polisacárido aminado en el cual la proporción de unidades de fórmula (II' ) /unidades de fórmula (II") está bien definida. En efecto, en RMN, la señal de resonancia que corresponde al residuo Sug es visible asi como aquella correspondiente a la quinovosamina N-acetilada. El polisacárido contiene de 85 a
95% de unidades repetitivas de fórmula (II' ) . Como se señala anteriormente, un polisacárido de acuerdo con la invención puede ser aminado con la ayuda de diversos compuestos. Cuando el polisacárido de acuerdo con la invención está destinado a la fabricación de conjugados, el compuesto que permite aminar el polisacárido es escogido ventajosamente de acuerdo con la estructura que se desea dar a estos conjugados. De manera general, los conjugados de acuerdo con la presente invención responden a la fórmula Ps-CH2-NH-R en la cual : Ps designa el polisacárido capsular de neumococo tipo 5 esencialmente constituido de unidades repetitivas de fórmula (II) ; R es un polipéptido portador P; un compuesto de fórmula (III) L-P, en la cual un polipéptido portador está ligado a un agente de enlace (L) o un compuesto de fórmula (III' ) S-L'-P, en la cual un polipéptido portador P está ligado a un separador (S) por la intermediación de un agente de enlace (1/ ) ; C designa el átomo del carbono del grupo aldehido terminal del polisacárido y N designa el átomo de nitrógeno del grupo amina aportado por R. Los compuestos P, 'L y S serán descritos posteriormente -en la descripción, en la sección destinada a
los conjugados. Se nota sin embargo en la presente que estos compuestos deben evidentemente comprender un grupo amina primaria libre capaz de reaccionar con una función aldehido. Pueden ser empleados en cada uno de los dos métodos de acuerdo con la invención, sin distinción alguna. En el primer método de acuerdo con la invención, la aminación reductora a la cual es sometida el polisacárido consiste en particular de hacer reaccionar el polisacárido con un compuesto que comprende una función amina, tales como los compuestos P, L o S, en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, tal como cianoborohidruro o piridina borano, en las condiciones del pH y de tiempo ya especificadas, de preferencia entre 30 minutos y 4 horas. Con el fin de obtener una proporción de aminación similar a aquella obtenida en condiciones clásicas, se preconiza una duración de incubación comprendida entre 2 y 4 horas, limites incluidos. Cuando la duración de incubación no excede de 2 horas, los compuestos Sug no son modificados. Más allá de 2 horas, se observan Sug reducidos en forma de ß-D-quinovosamina N-acetilada y/o ß-D-fucosamina N-acetilada coexistente en general con Sug no modificados en la cadena polisacaridica . En consecuencia, mientras más la duración de incubación es importante, más la proporción de Sug reducido es importante. Más allá de 4 horas, se identifica mediante RMN el compuesto X indeseable.
Con el fin de prolongar la duración de la reacción de aminación reductora más allá del tiempo requerido, esta debe ser detenida mediante métodos rápidos, en particular mediante precipitación selectiva del polisacárido aminado. El polisacárido aminado es por ejemplo purificado mediante precipitación alcohólica cuando el compuesto aminado es un agente de enlace o separador. Se prefiere la precipitación en sulfato de amonio, cuando el compuesto aminado es un polipéptido. Los métodos de purificación mediante precipitación son métodos clásicos, bien conocidos por el experimentado en la técnica. La aminación reductora es realizada en general en un medio de pH regulado, tal como solución reguladora del pH de citrato/fosfato, pero otra solución reguladora del pH en donde el pKa está situado entre 2.5 y 6 es conveniente igualmente. Como ejemplo, se puede utilizar una solución reguladora del pH de citrato, acetato o succinato. Se excluye · no obstante las soluciones reguladoras del pH en donde la fórmula química comprende compuestos portadores del grupo amina, tal como por ejemplo una solución reguladora del pH de glicina. La temperatura del medio de reacción se sitúa en general entre 4 a 70°C de acuerdo con el compuesto aminado utilizado, de manera preferida entre 20 y 50°C y de manera aún más preferida entre 20 y 37 °C cuando el compuesto aminado
es un polipéptido. Para uso en el primer método de acuerdo con la invención, el polisacárido puede ya sea natural, ya sea fragmentado previamente. No importa cual método de fragmentación puede convenir, a condición de que conserve la integridad estructural del polisacárido natural. El método de fragmentación por radicales libres, descrito posteriormente en la presente, es conveniente particularmente. Aunque las proporciones pondérales entre el polisacárido, el compuesto aminado y el cianoborohidruro no sean criticas, se obtienen mejores rendimientos de polisacáridos aminados en el intervalo de proporciones pondérales de polisacárido/compuesto aminado/cianoborohidruro de 1/0.1/0.02 a 1/5/0.2 cuando se utiliza como compuesto aminado un agente de enlace L o un separador S o en el intervalo de proporciones pondérales de 1/0.2/0.2 a 1/1/0.2 cuando se utiliza como compuesto aminado un polipéptido portador P. Los rendimientos óptimos de polisacáridos aminados son obtenidos con una proporción 1/1/0.1 cuando el compuesto- aminado es un agente de enlace o un separador o con una proporción 1/0.5/0.1 cuando el compuesto aminado es un polipéptido portador. Para uso en el segundo método de acuerdo con la invención, el polisacárido es de preferencia un polisacárido natural, no despólimerizado, porque durante la aplicación de
este segundo método, el polisacárido es necesariamente sometido a una fragmentación, luego reducción, para reintroducir grupos aldehido terminales. En el segundo método de acuerdo con la invención, la reducción del polisacárido se hace de manera convencional, por ejemplo a temperatura ambiente, en medio acuoso, a pH básico, de preferencia a un pH comprendido entre 8 y 10. El agente reductor fuerte especifico de las funciones cetona y aldehido es utilizado en exceso, por ejemplo a una concentración molar de por lo menos 10 veces, de manera preferida de por lo menos 100 veces más fuerte que aquella del polisacárido. Un borohidruro tal como borohidruro de sodio ( aBH4) es un agente reductor de elección. El tiempo de reacción puede ser de 30 minutos a 2 horas, de preferencia 1 hora. El polisacárido reducido puede ser enseguida purificado mediante un método cualquiera, de preferencia mediante precipitación alcohólica. La despolimerización del polisacárido reducido se puede hacer en particular mediante hidrólisis controlada. Se utiliza de preferencia el método de despolimerización por radicales oxidante, tal como se describe en EP 562 107. Los polisacáridos fragmentados pueden ser enseguida purificados de manera convencional, por ejemplo mediante precipitación alcohólica antes de la etapa de aminación reductora. En el segundo método de acuerdo con la invención,
la aminación reductora puede ser aplicada de acuerdo con no importa cualquier condición comprendidas en las mismas las condiciones clásicas, porque no existe más compuesto Sug en la estructura del polisacárido reducido y fragmentado y en consecuencia, más riesgo de formar el compuesto X indeseable. Asi, en el segundo método de acuerdo con la invención, la aminación reductora a la cual es sometida el polisacárido requiere simplemente la reacción del polisacárido con un compuesto que comprende una función amina, tales como los compuestos P,L o S, en presencia de un agente reductor, selectivo de una base de Schiff. Se pueden utilizar las condiciones descritas para el primer método de acuerdo con la invención y como en este caso la duración de la incubación, asi como el pH, no son críticos, con o sin las limitaciones de duración o las restricciones con respecto al intervalo de pH. En general en las condiciones clásicas, el pH del medio de reacción se sitúa en un intervalo de 5 a 9, pero se escoge de preferencia un pH comprendido entre 5 y 8. Un tiempo de incubación en general comprendido entre 2 horas y 48 horas da buenos rendimientos de polisacárido aminado. La temperatura de incubación · está en general comprendida entre 20°C y 50°C. Una vez que la aminación reductora ha sido controlada bien, se purifica el polisacárido aminado del medio de reacción con la ayuda de métodos usuales, por
ejemplo mediante precipitación alcohólica o en sulfato de amonio, mediante diálisis, mediante cromatografía de exclusión - difusión o mediante filtración, según se desee. Así como se menciona anteriormente, un polisacárido aminado puede ser ya un conjugado cuando el compuesto que ha reaccionado con la función aldehido terminal del polisacárido es un polipéptido portador. Este conjugado es de fórmula Ps-CH2-NH-P, en la cual el polisacárido (Ps) está directamente acoplado al polipéptido portador (P) . Esto es por lo que la invención tiene también por objeto: a. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención de fórmula (IV) Ps-CH2-NH-P en la cual Ps designa el polisacárido capsular de neumococo de tipo 5; método según el cual se hace reaccionar el polisacárido con un polipéptido portador (P) , en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, a un pH de 4 a 6.5, de preferencia de 5 a 6, por una duración de no más de 4 horas . .. b. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención de fórmula (IV) Ps-CH2-NH-P en la cual Ps designa el polisacárido capsular de neumococo de tipo 5; método según el cual (i) se reduce el polisacárido natural con un agente reductor fuerte específico de las funciones cetona y aldehido, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido
y (iii) se somete el polisacárido reducido y fragmentado a una aminación reductora en presencia de un polipéptido portador P. c. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención de fórmula (V) Ps-CH-2-NH-L-p, según el cual : (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un agente de enlace (L) que posee por lo menos una función amina primaria, en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, a un pH de 4 a 6.5, de preferencia de 5 a 6, por una duración de no más de 4 horas, con el fin de obtener un polisacárido activo de fórmula (VI) Ps-CH2-NH-L-P y (ii) se acopla el polisacárido activo a un polipéptido portador (P) , con el fin de obtener el conjugado de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P o alternativamente, d. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P, según el cual se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un polipéptido portador activo de fórmula (VII) L-P, en la cual L es un agente de enlace que posee por lo menos una función amina primaria y P un1 polipéptido portador, en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, a un pH de 4 a 6.5, de preferencia de 5 a 6, por una duración de no más de 4 horas,
con el fin de obtener el conjugado de fórmula (v) PS-CH2-NH-L-P. e. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P, según el cual : (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un agente capaz de reducir una función cetona, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido, (iü) se acopla mediante aminación reductora el polisacárido reducido y fragmentado con un agente de enlace (L) que posee por lo menos una función amina primaria, con el fin de obtener un polisacárido activo de fórmula (VI) PS-CH2-NH-L y se acopla el polisacárido activo a un polipéptido portador (P) , con el fin de obtener el conjugado de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P o alternativamente, f. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P, según el cual : (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un agente capaz de reducir una función cetona, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido y (iü) se acopla mediante aminación reductora el
polisacárido reducido y fragmentado con un polipéptido portador activo de fórmula (VII) L-P, en la cual L es un agente de enlace que posee por lo menos una función amina primaria, con el fin de obtener el conjugado de fórmula (V) Ps-CH2— H-L-P . g. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (VIII) Ps-CH2~NH-S-L' -P, según el cual: (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de- tipo 5 con un separador (S) que posee por lo menos una función amino primaria, en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, a un pH de 4 a 6.5 de preferencia de 5 a 6, por una duración que no excede de 4 horas, con el fin de obtener un polisacárido derivado de fórmula (IX) Ps-CH2-NH-S, (ii) se acopla el polisacárido derivado con un agente de enlace (L' ) con el fin de obtener un polisacárido activo de fórmula (X) PS-CH2-NH-S-L' y (iii) se acopla el polisacárido activo con un polipéptido portador (P) , con el fin de obtener el conjugado de fórmula (VIII) Ps-CH2-NH-S-L' -P, o alternativamente, h. Un método de. fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (VIII) Ps-CH2-NH-S-L' -P, según el cual: (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de
neumococo de tipo 5 con un separador (S) que posee por lo menos una función amina, en presencia de un agente reductor selectivo de una base de Schiff, a un pH de 4 a 6.5, de preferencia de 5 a 6, por una duración que no excede de 4 horas, con el fin de obtener un polisacárido derivado de fórmula (IX) Ps-CH2-NH-S y (ii) se acopla el polisacárido derivado con un polipéptido portador activo de fórmula (XI) L'-P, en la cual L' es un agente de enlace y P un polipéptido portador, con el fin de obtener el conjugado de fórmula (VIII) PS-CH2-NH-S-I/ -P. i. Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (VIII) Ps-CH2-NH-S-L' -P, según el cual: (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un agente capaz de reducir una función cetona, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido, (iii) se acopla mediante aminación reductora el polisacárido reducido y fragmentado a un separador (S) portador de por lo menos una función de mina primaria, con el fin de obtener un polisacárido derivado de fórmula (IX) PS-CH2-NH-S, (iv) se acopla el polisacárido derivado a un agente de enlace (1 ) con el fin de obtener un polisacárido activado
de fórmula (X) Ps-CH2-NH-S-L' y (v) se acopla el polisacárido activado a un polipéptido portador (P) con el fin de obtener el conjugado de fórmula (VIII) Ps-CH2-NH-S-L' -P, o alternativamente, j . Un método de fabricación de un conjugado de acuerdo con la invención, de fórmula (VIII) Ps-CH2-NH-S-I -P según el cual: (i) se hace reaccionar un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5 (Ps) con un agente capaz de reducir una función cetona, (ii) se fragmenta el polisacárido reducido, (iii) se acopla mediante aminación reductora el polisacárido reducido y fragmentado a un . separador (S) portador de por lo menos una función amina primaria, con el fin de obtener un polisacárido derivado de fórmula (IX) PS-CH2-NH-S y (iv) se acopla el polisacárido derivado con un polipéptido portador activado de fórmula (XI) L'-P, en la cual L' es un agente de enlace y P un polipéptido portador, con el fin de obtener el conjugado de fórmula (VII) Ps-CH2-NH-S-L'-P. En su alcance más general, el término polipéptido portador (P) designa una cadena de aminoácidos, cualquiera que sea su tamaño y las modificaciones post-traduccionales que se han podido producir, que comprende por lo menos un
epitopo "T-helper". Ya que un epitopo t-helper puede estar constituido por 10-15 aminoácidos, el término polipéptido portador abarca los péptidos. Aunque evidentemente, abarca también las proteínas. Por epitopo "T-helper" se entiende una cadena de aminoácidos que, en el contexto de una o varias moléculas de MHC, activa los linfocitos T-helper. El polipéptido portador del conjugado provoca el desarrollo de una inmunidad Independiente específica del polisacárido de neumococo de tipo 5, con producción de anticuerpos específicos dirigidos contra el polisacárido enseguida de la administración del conjugado. Induce igualmente una elevación de la proporción de anticuerpos específicos durante una vacuna de refuerzo. Para uso en los conjugados de acuerdo con la invención, el polipéptido portador puede ser una anatoxina bacteriana obtenida mediante destoxificación química, como la anatoxina tetánica u obtenida mediante mutación genética tal como la anatoxina diftérica (CRM 197, como ejemplo), la exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa o la exotoxina A de Staphylococcus aureus. Se pueden igualmente utilizar proteínas de membrana externa de bacterias, como las proteínas O Pl u OMP2 de Neisseria meningitidis. Las proteínas LambB, OmpC, OmpA, OmpF y PhoE de Escherichia coli, la proteína Cote o CotD de Bacillus subtilis, las porinas bacterianas como la porina de clase 1 de Neisseria
meningitidis B, la porina 40 de Klebsiella pneumoniae; igualmente las proteínas como OspA de Borrelia burgdorfi, PspA de Streptococcus pneumoniae, la proteína de enlace de transferina tipo 2 (TBP2) de Neisseria meningitidis, TraT de Escherichia coli, la ad esina A de Streptococcus pneumoniae. Las proteínas de origen viral, como hemaglutinina de virus gripal pueden igualmente jugar el papel de polipéptido portador así como los péptidos p24E, p24N, p24H descritos en WO 94/29339 que llevan un epítopo T helper o los péptidos PADRE (epítopos helper PandR T) descritos por Del guercio et al (Vaccine (1997), vol 15/4, p441-448) . La fabricación de conjugados de fórmula (IV) Ps-CH2-NH-P se realiza en una sola etapa, la reacción de aminación reductora del polisacárido que asegura igualmente la conjugación del polisacárido al polipéptido. Por el contrario, la fabricación del conjugado de fórmula (V) Ps-CH2-NH-L-P o (VIII) Ps-CH2-NH-S-L' -P se realiza en varias etapas distintas, la primera etapa está constituida por la aplicación de uno de los dos métodos de fabricación de un polisacárido aminado de acuerdo con la invención que llega a la aminación reductora del polisacárido por el compuesto L o S. El separador S y los agentes de enlace L Y L' son compuestos que poseen por lo menos dos grupos funcionales y dispuestos al seno del compuesto, en direcciones
relativamente opuestas. En lo que concierne al separador S y el agente de enlace L uno de los grupos funcionales debe ser capaz de reaccionar con el aldehido terminal del polisacárido durante la aminación reductora, el otro es respectivamente capaz de reaccionar con un agente de enlace L' o con un polipéptido portador. En lo que concierne al agente de enlace L' , uno de los grupos funcionales debe ser capaz de reaccionar con el separador, el otro es capaz de reaccionar con un polipéptido portador. Para los fines de la presente invención, el agente de enlace L es un compuesto de fórmula (XII) R1-A-R2, en la cual : A designa una cadena alifática, aromática o una cadena mixta alifática y aromática, sustituida o no, saturada o insaturada; Rl designa una amina primaria o un radical químico portador de una amina primaria, como por ejemplo el radical hidracida, NH2-NH-CO y R2 designa un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo funcional del polipéptido portador. De manera ventajosa, A designa un alquilo, un alquileno o un ditioaquilo, que comprende de 1 a 12, ventajosamente de 2 a 8, de preferencia de 2 a 6 átomos de carbono; De manera ventajosa, R2 es capaz de reaccionar con
un grupo carboxilo, tiol o amina. Así R2 puede ser independientemente de Rlr un grupo amina o un radical portador de un grupo amina tal como el radical hidracida. R2 puede también ser un grupo diol o carboxilo. Así, un compuesto de fórmula R1-A-R2 puede ser una alquil dihidracida tal como el ácido adípico dihidracida; una tio alquil monoamina tal como cisterna o cisteamina o diamina tal como cistamina; un diamino alquil o alquileno, tal como diaminometano, diaminoetano y diaminohexano . Para los fines de la presente invención, el separador S es un compuesto de fórmula (XIII) R1-AR2' en la cual : A designa una cadena alifática y/o aromática, sustituida o no, saturada o insaturada; Rl designa una amina primaria o un radical químico portador de una amina primaria, como por ejemplo el radical hidracida, NH2-NH-C0 y R2' designa un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo funcional de un agente de enlace 1 . De acuerdo con un modo particular, el separador S puede ser escogido de entre los compuestos de fórmula (XII) R1-A-R2. Para los fines de la presente invención, la elección del agente de enlace 1/ está condicionada en primer lugar por el grupo funcional R2' portado por S luego por el
grupo funcional del polipéptido portador que debe intervenir en la operación de conjugación. El agente de enlace 1/ es un compuesto de fórmula (XIV) R3-B-R4, en la cual: B designa una cadena alifática y/o aromática, sustituida o no, saturada o insaturada-; R3 designa un grupo capaz de funcionar con el grupo funcional R2' y R4 designa un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo funcional del polipéptido portador. De manera ventajosa, B designa un alquilo o un alquileno sustituido o no, que comprende de 1 a 12, de manera preferida de 2 a 8 átomos de carbono; un arilo, un alquilarilo o un arilalquileno que comprende de 7 a 12 átomos de carbono; un fenilo o fenileno sustuido o no. Cuando R2' es un grupo tiol, R3 puede ser un grupo tiol; un carbonilo a o ß insaturado o un grupo imidilo, en particular un grupo maleimidilo; un halogenuro de acilo o un halogenuro de alquilo, en el cual el halógeno es un bromo, un cloro o un yodo. De manera ventajosa, R4 es capaz de reaccionar con un grupo de carboxilo, tiol o amino . Asi, si el grupo funcional del polipéptido portador debe intervenir de la operación de conjugación es un tiol, R4 puede ser un grupo maleimida. Asimismo, si el grupo funcional del polipéptido portador que debe intervenir en la operación de conjugación
es una amina, R4 puede ser un grupo carboxilo o de preferencia un grupo N-hidroxi succinimidilo o N-hidroxi sulfosuccinimidilo . Cuando el separador S es un aminotiol, tal como cisteina, cisteamina o cistamina, el agente de enlace L' es de manera ventajosa un succinimidil maleimidil alquilo. Este último puede ser en particular el ácido ?-maleimido butírico N-hidroxisuccinimida éster o N-sulfosuccinimida éster (GMBS o sulfo-GMBS) , el ácido e maleimido capróico N-hidroxisuccinimida éster (MCS) , el succinimidil-4- (p-maleimidofenil) -butirato (SMPB) o el sulfosuccinimidil-4- (p-maleimidofenil ) -butirato (sulfo-SMPB) , el ácido maleimido benzoico N-hidroxisuccinimida éster (MBS) o el ácido maleimido benzoico N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), el ácido 4- (N-maleimidometil) ciclohexancarboxílico N-hidroxisuccinimida éster (SMCC) o el ácido N-maleimidometil) ciclohexan carboxílico N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-SMCC) . Cuando el separador S es un diaminoalquilo o una dihidracida, el agente de enlace L' es ventajosamente escogido de entre los compuestos disuccinimidil alquilos o succinimidil maleimido alquilos de fórmula (XIV) R3-B-R4 en la cual B es un grupo alquilo, R3 es un grupo succinimidilo y R4 es un grupo succinimidilo o maleimido. El compuesto disuccinimidilo puede ser el
disuccinimidil suberato (DSS) , el bis ( sulfosuccinimidil) suberato (BS3) , el disuccinimidil glutarato (DSG) , el succinimidil diéster del ácido adipico (SIDEA) o el succinimidil diéster de ácido succinico. Los grupos succinimidilos y/o sulfosuccinimidilos son capaces de reaccionar con un grupo amina. El compuesto succinimidil maleimido alquilo puede ser uno de estos dos citados anteriormente en la presente. En los métodos de conjugación (a) a (j) las etapas de derivación, de activación y de conjugación propiamente dichas pueden ser aplicadas de acuerdo con modos de operación bien conocidos por aquellos experimentados en la técnica. Son .en particular descritos en la obra de referencia intitulada Bioconjugate Techniques (1996) Ed Academic Press.. Como ejemplo, se referirá a esta obra para indicar reacciones de conjugación que ponen en juego un grupo amina y un grupo carboxilo que se realizan ventajosamente en presencia de una carbodiimida . Las etapas de derivación, de activación y de conjugación están sin efecto en la estructura química de las unidades repetitivas del polisacárido . Los conjugados obtenidos de acuerdo con uno de los métodos (a) a (j) pueden ser finalmente purificados, por ejemplo mediante precipitación en sulfato de amonio, mediante ultrafiltración, cromatografía de exclusión-difusión o
mediante cromatografía de división con el fin de eliminar las fracciones polisacaridicas y proteicas residuales no conjugadas . La invención tiene igualmente por objeto una composición farmacéutica para uso terapéutico o profiláctico, que comprende un polisacárido de acuerdo con la invención, de manera preferida en forma de un conjugado. Este último puede ser formulado con un diluyente o un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico, por ejemplo una solución reguladora del pH de fosfato y si es necesario un excipiente de liofilización. En general, estos productos pueden ser seleccionados en función del modo y la vía de administración y de acuerdo con las prácticas farmacéuticas estándar. Los diluyentes apropiados así como lo que es indispensable para la elaboración de una composición farmacéutica son descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, que sirve de referencia estándar en este campo. La composición puede también contener un adyuvante por ejemplo un hidróxido de aluminio, un fosfato de aluminio o un hidroxifosfato de aluminio. Se puede igualmente utilizar un conservador tal como fenoxietanolformol . Una dosis vacunal puede ser preparada bajo un volumen de 0.1 mi a 2 mi . de manera preferida bajo un volumen de 0.5 mi. Como ejemplo se indica que una dosis que puede contener 0.475 mg de ion P042-' 4.5 mg de cloruro de sodio y eventualmente 300 µg de iones, Al3+. La
composición vacunal de acuerdo con la invención puede estar igualmente asociada a otros antigenos vacunales, en particular antigenos polisacaridicos de neumococo conjugados o no a un portador polipeptidico. Se obtiene entonces una vacuna multivalente contra el neumococo en la cual el polisacárido de neumococo tipo 5 está bajo una de las formas descritas en la invención. La invención tiene también por objeto un método de tratamiento o de prevención contra infecciones de neumococo tipo 5, que consiste en administrar a lactantes, niños jóvenes, adultos o personas de edad avanzada, una dosis suficiente de una composición de acuerdo con la invención, eventualmente - --con adyuvante, para inducir una respuesta inmune especifica protectora contra este patógeno. El método es aplicado mediante _adminis:t ación de por lo menos .una dosis vacunal de la composición de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se pueden practicar entre 1 y 3 inyecciones, pero de preferencia se practican 3 inyecciones con respecto a un retardo de un mes entre cada inyección. Una composición de acuerdo con la invención pueden ser administradas no importa cualquier vía convencional en uso en el campo de vacunas, en particular por via sistémica, esto es parenteral, por ejemplo por via subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa o por via mucosa, por ejemplo por via oral o nasal. La cantidad administrada tiene en cuenta el polipéptido portador
utilizado o la vía de administración. Como ejemplo, la dosis de polisacárido necesaria contenida en el conjugado para observa . una inmunidad protectora frente al serotipo 5 consecutiva a una administración parenteral está comprendida en general entre 0.5 µg y 10 µg; pero de manera preferida entre 0.5 y 5 µg, de manera aún más preferida entre 0.5 µg y 2 µg, cuando la proteína portadora es anatoxina tetánica. Bajo una forma no conjugada, la dosis de polisacárido necesaria está comprendida entre 10 y 50 µg, de manera preferida entre 20 y 30 µg. La presente invención se comprenderá mejor a la luz de los ejemplos siguientes que sirven para ilustrar la invención sin, por otra parte limitar el contenido. La figura 1 representa los. espectros de RMN de un polisacárido aminado de acuerdo con diferentes métodos de fabricación. El primer espectro es aquel del polisacárido de neumococo tipo 5 fragmentado después de despolimerización oxidante por radicales. Se identifican en la zona de altos campos del espectro las señales de resonancia de carbonos metílicos de 3-hexosaminas N-acetiladas de la unidad repetitiva del polisacárido: la fucosamina N-acetilada (C6 FucNAc) , la pneumosamina N-acetilada (C6 PneNAc) y el Sug (C6 Sug) .
El segundo espectro es aquel del polisacárido aminado obtenido de acuerdo con el segundo método de acuerdo con la invención. Se observa la desaparición de la señal correspondiente al Sug (C6 Sug) y la aparición de una nueva señal correspondiente a la quinovosamina N-acetilada (C6 QuiNAc) . El tercer espectro es aquel del polisacárido aminado obtenido de acuerdo con el primer método de acuerdo con la invención. Es idéntico al espectro de RMN del polisacárido fragmentado no aminado. El cuarto espectro es aquel del polisacárido aminado en condiciones clásicas. Se nota la presencia de dos señales adicionales en la zona de altos campos del espectro, correspondiente a la quinovosamina N-acetilada y al compuesto X, asi como una disminución de la altura de la señal correspondiente al Sug. La figura 2 representa el cromatograma obtenido mediante HPAEC-PAD del polisacárido natural despolimerizado (curvas de lineas continuas) , del polisacárido aminado de acuerdo con el método clásico de aminación reductora (curva en lineas de cuadros) , de acuerdo con el primer método objeto de la invención (curvas en lineas) o de acuerdo con el segundo método de acuerdo con la invención (curva en lineas de puntos) .
Ejemplo 1: Aminación reductora a pH 6, durante 2 horas, del polisacárido capsular de neumococo tipo 5, después de ragmentación . (a) Despolimerización por radicales del polisacárido de neumococo tipo 5 natural. El polisacárido a una concentración de 2.5 mg/ml en solución acuosa es fragmentado mediante ácido ascórbico, sulfato ferroso asi como sulfato cúprico. La cantidad en número de milimoles de ácido ascórbico es cien veces superior a aquella del sulfato ferroso y del sulfato cúprico. La proporción ponderal entre el ácido ascórbico y el polisacárido es de 0.1. La incubación de la mezcla de reacción se hace en baño maria a 30°C y al abrigo de la luz durante 1 hora 30 minutos. El polisacárido hidrolizado es purificado mediante precipitación en etanol a 80% seguido de una centrifugación. El producto de centrifugación es sometido a diálisis y luego liofilizado. El tamaño promedio del polisacárido fragmentado es de aproximadamente 30-35 unidades repetitivas, tal como se mide mediante cromatografía de exclusión de triple detección (Viscoteck) . (a) Aminación reductora del polisacárido El polisacárido fragmentado es vuelto a poner en solución reguladora de citrato/fosfato 0.02 M, pH- 6 a una concentración de 10 mg/ml en presencia de clorhidrato de diaminohexano (DAH) (Aldrich) y de cianoborohidruro de sodio
(NaCNBHs) (Sigma) . Las proporciones ponderales de polisacárido/clorhidrado de DAH y NaCNBH3/clorhidrato de DAH son respectivamente de 0.8 a 0,1. La incubación de la mezcla de reacción se hace a 50 °C en baño maria durante 2 horas. La reacción es enseguida detenida mediante precipitación del polisacárido aminado en etanol a 80% seguido de una centrifugación. El producto de precipitación es enseguida recuperado mediante NaCl 0.5 M a razón de 10 mg/ml en polisacárido, luego sometido a 8 baños de diálisis sucesivos (4 primeros baños efectuados en una solución de NaCl 0.5 M, seguidos de 4 baños efectuados en agua ultrafiltrada) . El polisacárido derivado y asi aminado es finalmente liofilizado.
Ejemplo 2: Aminación reductora del polisacárido capsular de neumococo tipo 5 , después de reducción y fragmentación (a) Reducción y fragmentación del polisacárido natural . A 10 mi de una solución acuosa del polisacárido natural a 10 mg/ml ajustada a pH 9 ± 0.5 con amoniaco 1 N, se agregan 10 mg de borohidruro de sodio (NaBH4) , luego se deja el medio de reacción a una temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. El NaBH4 es enseguida destruido mediante adición de algunas gotas de ácido acético glacial. Se dializa enseguida el polisacárido reducido contra agua,
luego se fragmenta utilizando el protocolo descrito en el párrafo (a) del ejemplo 1. Se obtiene un polisacárido que contiene en " promedio 30 - 35 unidades 'repetitivas. El polisacárido reducido y fragmentado es a continuación liofilizado. (b) Aminación reductora del polisacárid© reducido y fragmentado El polisacárido reducido fragmentado es vuelto a poner en solución en una solución reguladora del pH de fosfato 0.02 M, pH 7.5, a una concentración de 10 mg/ml en presencia de clorhidrato de - aminohexano (DAH) y de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) preparado extemporáneamente. Las condiciones ponderales de polisacárido/clor-hidrato de OL y IIaCNBH3/clorhidrato de DAH son respectiva-mente de 0.8 y 0.1'L'. La incubación de la mezcla de reacción se hace a 50° en baño aria durante 48 a 72 horas. El polisacárido aminado es enseguida purificado mediante presentación en etanol a 80%, seguido de centrifugación. El residuo de precipitación es recuperado mediante NaCl 0.5 M a razón de 10 mg/ml en polisacárido, luego sometido a 8 baños de diálisis sucesivos (4 primeros baños efectuados en una solución de NaCl 0.5 M, seguidos de 4 baños efectuados en agua ultrafiltrada) . El polisacárido derivado y asi aminado es finalmente liofilizado.
Ejemplo 3: Fabricación y estudio de poder inmunógeno de conjugados obtenidos a partir de los polisacáridos derivados y aminados de los ejemplos 1 y 2. (a) Fabricación de conjugados. Los polisacáridos aminados de los ejemplos 1 y 2 son conjugados con anatoxina tetánica (ATT) por la intermediación de DSS. En un primer tiempo, se activa el polisacárido aminado con DSS, luego se conjuga la anatoxina tetánica al polisacárido activado. El polisacárido aminado del ejemplo 1 o 2 es recuperado en solución acuosa a una concentración de 40 mg/ml. El DSS es recuperado en una solución en DMSO a razón de 5 mg/ml. Se agregan gota a gota 2.5 mi de una solución acuosa del polisacárido aminado en 10 mi de la solución de DMS bajo agitación. Después de hora y media de incubación, la reacción es detenida mediante precipitación en 50 mi de acetona. Se recupera el precipitado mediante filtración en embudo de Buchner No. 5, que se lava enseguida cinco veces por 20 a 50 mi de acetona. Se seca enseguida el precipitado bajo vacio, luego bajo una corriente de nitrógeno. El precipitado que contiene el polisacárido derivado es recuperado mediante un volumen apropiado de una solución de anatoxina tetánica a 10 mg/ml, en una solución reguladora del pH de fosfato 0.2 M, de tal manera que la proporción ponderal entre el polisacárido derivado y la
anatoxina tetánica esté comprendida entre 1 y 2. La mezcla es incubada a la temperatura de laboratorio, bajo agitación durante 16 a 20 horas. La reacción es enseguida detenida mediante precipitación en sulfato de amonio a 70%, después dilución a ¾ de la mezcla en una solución reguladora de fosfato 0.2 M. El medio que contiene el precipitado es agitado durante 1 hora a la temperatura del laboratorio, luego 4 a 20 horas a +4°C. Después de haber recibido el precipitado mediante_ centrifugación, el mismo es finalmente recuperado y disuelto en una solución reguladora de fosfato 0.2 . La solución del conjugado es obtenida bajo una forma prácticamente pura. Las cantidades de anatoxina tetánica y de polisacárido no conjugados son despreciables. La solución es finalmente ajustada a la concentración en vista de una utilización vacunal. La proporción de polisacárido/proteina en el conjugado es de 1/5. (b) Estudio del poder inmunogeno de los conjugados El poder inmunogeno de los conjugados asi obtenidos es comparado con aquel de un conjugado que hace uso de un polisacárido capsular de neumococo de tipo 5, previamente sometido a una aminación reductora clásica, descrita como sigue: El polisacárido natural · es primero fragmentado mediante despolimeración por radicales, según el método de operación del párrafo (a) del ejemplo 1. Se obtiene un polisacárido despolimerzado que contiene 30-35 unidades
repetitivas. Luego el polisacárido fragmentado es sometido a una aminación reductora según el protocolo de operación del párrafo (b) del ejemplo 2. El polisacárido aminado es enseguida conjugado con anatoxina tetánica por la intermediación de DSS, en las condiciones de operación del párrafo (a) del ejemplo 3. El conjugado asi obtenido tiene las mismas características de pureza y es utilizable como vacuna. La proporción de polisacárido/proteína en el conjugado es del/5. Quince conejos NZB repartidos en tres grupos distintos reciben por vía intramuscular en los días Jl y J23 uno de los 3 conjugados de polisacáridos a razón de 0.5 µg de polisacárido y de 2.5 µg de anatoxina tetánica por conejo y por inyección. El grupo 1 es inmunizado con el conjugado obtenido a partir del polisacárido aminado del ejemplo 1, el grupo 2 con el conjugado obtenido a partir del polisacárido aminado del ejemplo 2, el grupo 3 con el conjugado obtenido a partir del polisacárido aminado de acuerdo con un método clásico, tal como se describe en el párrafo precedente del presente ejemplo. Un grupo de conejos "testigo" recibe en los días Jl y J23 suero fisiológico por vía intramuscular. Tomas de sangre son realizadas los días Jl, J23 y J36 para controlar la tasa de anticuerpos séricos que son específicos del polisacárido de neumococo tipo 5 mediante ELISA en microplacas sensibilizadas con polisacárido natural
de neumococo tipo 5 (1 µ?/????G??oso) . La proporción de anticuerpos contenidos en cada conejo es definida como el inverso de la dilución del suero, que da una densidad óptica de 1 en el espectrofotómetro, enseguida de la revelación de la prueba ELISA con la ayuda de un indicador coloreado de trimetilbencidina . Los resultados son agrupados en la tabla 1 posteriormente en la presente.
*: representa el promedio geométrico de tasa de anticuerpos séricos específicos de 5 conejos **: indica el valor de tasa de anticuerpos más bajo y .el valor de tasa más elevado en cada grupo. Después de dos inmunizaciones, los valores promedio de la tasa de anticuerpos específicos de conejos inmunizados con los conjugados obtenidos a partir de polisacárido aminados de los ejemplos 1 y 2 son aproximadamente 5 veces superiores aquel de los conejos inmunizados con un conjugado obtenido a partir de un polisacárido aminado de acuerdo con un método clásico de aminación reductora. Cuando se hacen variar las proporciones ponderales de polisacárido/ánatoxina tetánica en un intervalos de 1/0.5,
a 1/5, los resultados que se obtienen en la prueba descrita anteriormente son en todo punto similares. La funcionalidad de estos anticuerpos es controlada mediante una prueba de opsonofagocitosis . El titulo opsonizante es definido como el inverso de la dilución de suero que permite exterminar el 50% de bacterias. Los resultados son agrupados en la tabla II a continuación:
*: representa el promedio geométrico de los títulos opsonizantes de 5 conejos: **: indica el valor del título opsonizante más bajo y el valor del título más elevando en cada grupo. n.t.: no titulado Los títulos opsonizantes se correlacionan con los títulos de anticuerpos séricos específicos del polisacárido del neumococo tipo 5.