MXPA05006091A - Modulacion de polaridad opuesta de la expresion de mitoneet. - Google Patents

Abstract

Se proveen procedimientos, composiciones y compuestos de polaridad opuesta para modular la expresion de una familia de polipeptidos de membranas mitocondriales, las cuales unen tiazolodindionas antidiabeticas (denominadas "mitoNEET"), sensibilizantes a insulina; las composiciones comprenden compuestos de polaridad opuesta, particularmente oligonucleotidos de polaridad opuesta, dirigidos a acidos nucleicos que codifican las mitoNEET; se proveen procedimientos para usar estos compuestos para modulacion de la expresion de la mitoNEET y para el tratamiento de enfermedades asociadas con expresion de la mitoNEET.

Description

MODULACION DE POLARIDAD OPUESTA PE LA EXPRESION DE mitoNEET La presente solicitud reivindica prioridad bajo el título 35, código de Estados Unidos, § 119 a la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 60/431 ,529, presentada el 6 de diciembre de 2002, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad como si se reprodujera en esta memoria descriptiva.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de una familia de polipéptidos de membranas mitocondriales, las cuales unen tiazolodindionas antidiabéticas (denominadas "mitoNEET"), sensibilizantes a insulina. En particular, esta invención se refiere a compuestos de polaridad opuesta, particularmente oligonucleótidos, que se pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican las mitoNEET. Tales oligonucleótidos se ha mostrado que modulan la expresión de las mitoNEET.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes mellitus no insulino dependiente (NIDDM) o diabetes de tipo 2 se caracteriza por la resistencia a insulina de los tejidos periféricos, que incluyen el músculo esquelético, hígado, y adiposo. La hiperglucemia resultante a menudo está acompañada de metabolismo lipídico defectuoso que puede conducir a complicaciones cardiovasculares tales como aterosclerosis e hipertensión. Las tiazolidindionas comprenden un grupo de compuestos antidiabéticos relacionados estructuralmente que incrementan la sensibilidad a insulina de tejidos diana (músculo esquelético, hígado, adiposo) en animales resistentes a insulina. Además de estos efectos sobre la hiperglucemia, las tiazolidindionas también reducen los niveles de lípidos e insulina en modelos animales de NIDDM. Las tiazolidindionas troglitazona, rosiglitazona, y pioglitazona se ha mostrado que tienen estos mismos efectos beneficiosos en pacientes humanos que padecen de tolerancia a la glucosa alterada, una afección metabólica que precede al desarrollo de NIDDM, como en pacientes que sufren NIDDM (por ejemplo, Nolan y col., N. Eng. J. Med. 331 , 1188 -1 193, 1994). Aunque su mecanismo de acción no está claro, se sabe que las tiazolidindionas no producen incrementos en la secreción de insulina o en el número o afinidad de sitios de unión a receptores de insulina, que sugiere que las tiazolidindionas amplifican los episodios post-receptor en la cascada de señalización de insulina (Coica y Morton, New Antidiabetic Drugs (C. J. Bailey y P. R. Flatt, eds.). Smith - Gordon, Nueva York, 255 - 261 , 1990, Chang y col., Diabetes 32: 839 - 845, 983). Se ha encontrado que las tiazolidindionas son inductores eficaces de la diferenciación en líneas celulares de pre - adipocitos cultivadas (Hiragun y col., J. Cell Physiol. 134: 124 - 130, 1998; Sparks y col., J. Cell Physiol. 146: 101 - 109, 1991 ; Kletzien y col., Mol. Pharmacol. 41 : 393 - 398, 1992). El tratamiento de las líneas celulares de pre - adipocitos con la tiazolidindiona pioglitazona da como resultado un incremento de expresión de los genes aP2 específicos de adipocitos y adipsina así como las proteínas transportadoras de glucosa GLUT - 1 y GLUT - 4. Estos datos sugieren que los efectos hipoglucémicos de las tiazolidindionas observados in vivo se pueden mediar a través del tejido adiposo. Sin embargo, según se estima de la contribución del tejido adiposo al cuerpo entero el uso de glucosa varía entre solamente 1 - 3%, permanece poco claro si los efectos hipoglucémicos de las tiazolidindionas se pueden justificar mediante cambios en adipocitos. Adicionalmente, las tiazolidindionas se han implicado en trastornos de regulación de apetito, véase la solicitud de patente PTC WO 94/25026 A1 , y en el incremento de contenido en grasa en la médula ósea, (Willians, y col., Diabetes 42, Suplemento 1 , p. 59A 1993). El receptor ? activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR ?) es un miembro huérfano de la superfamilia esteroide/tiroide/retinoide de factores de transcripción activados por ligandos. El PPAR ? es uno de una subfamilia de PPAR estrechamente relacionados codificados por genes independientes (Dreyer y col., Cell 68: 879 - 887, 1992; Schmidt y col., J. Cell. Physíol. 146: 101 - 109, 1992; Zhu y col., J. Biol. Chem. 268: 26817 - 26820, 1993; Kliewer y col., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 91 : 7355 - 7359, 1994). Se han identificado tres PPAR de mamíferos y denominado PPAR a, ?, y NUC - 1. Los homólogos de PPAR a y ? se han identificado en la rana, Xenopus laevis; sin embargo, un tercer PPAR de Xenopus, denominado PPAR ß, no es un homólogo de NUC - 1 , lo que conduce a la sugerencia de que pueden existir subtipos adicionales en cualquiera o ambas especies. Los PPAR se activan a diversos grados mediante altas concentraciones (micromolares) de ácidos grasos de cadena larga y proliferadores de peroxisomas (Isseman y Green, Nature 347, 645 - 650, 1990; Gottlicher, Proc. Nati. Acad. USA 89, 4653 - 4657, 1992). Los proliferadores de peroxisomas son estructuralmente un grupo diverso de compuestos que incluyen herbicidas, plastificantes de ftalato, y la clase de fibratos de fármacos hipolipidémicos. Aunque estos datos sugieren que los PPAR son receptores auténticos, permanecen "huérfanos" ya que ninguno de estos compuestos se ha mostrado que ¡nteractúan directamente con los PPAR. Los PPAR regulan la expresión de genes diana mediante la unión a elementos de la secuencia de ADN, denominados elementos de respuesta de PPAR (PPRE), como los heterodímeros con los receptores de retinoide X (revisados en Keller y Whali, Trends Endocrin. Met. 4: 291 - 296, 1993). Hasta la fecha, los PPRE se han identificado en los potenciadores de un número de genes que codifican las proteínas que regulan el metabolismo lipídico que incluyen las tres enzimas requeridas para la beta - oxidación peroxisomal de ácidos grasos, acil - CoA deshidrogenase de cadena media, una enzima clave en la beta - oxidación mitocondrial, y aP2, una proteína de unión a lípidos expresada exclusivamente en los adipocitos. La naturaleza de los genes diana de PPAR acoplados con la activación de los PPAR mediante los ácidos grasos y fármacos hipolipidémicos sugiere un papel fisiológico para los PPAR en la homeostasis de lípidos (revisado en Keller y Whali, Trends Endocrín. Met. 4: 291 - 296, 1993). Una segunda isoforma de PPAR ?, denominada PPAR ?2, se clonó a partir de una genoteca de adipocitos de ratón (Tontonoz y col., Genes & Dev, 8, 1224 - 1234, 1994). Los PPAR ?1 y PPAR ?2 difieren en solamente 30 aminoácidos en el extremo N - terminal del receptor y probablemente surgen de un solo gen. El PPAR ?2 se expresa de una manera notablemente específica de tejido adiposo y su expresión está notablemente inducida durante el curso de la diferenciación de varias líneas celulares de preadipocitos; además, la expresión forzada del PPAR ?2 se mostró que era suficiente para activar el potenciador aP2 específico de adipocitos en líneas celulares de no adipocitos. Estos datos sugieren que el PPAR ?2 juega un papel importante en la diferenciación de adipocitos. La tiazolidindiona pioglitazona se reseño que estimula la expresión de un gen quimérico que contiene el potenciador/promotor de la proteína aP2 de unión a lípidos cadena arriba del gen reportero de la cloranfenicol acetil transferasa (Harris y Kletzien, Mol. Pharmacol. 45: 439 -445, 1994). El análisis de supresión condujo a la identificación de una región de aproximadamente 30 pares de bases responsable de la sensibilidad a pioglitazona. De manera interesante, en un estudio independiente, este fragmento de 30 pares de bases se mostró que contiene un PPRE (Tontonoz y col., Genes & Dev. 8: 1224 - 1234, 1994). Tomados juntos, estos estudios sugieren la posibilidad de que las tiazolidindionas modulen la expresión génica a nivel transcripcional a través de las interacciones con un PPAR. La tiazolidindiona sensible a insulina ha mostrado eficacia como agentes anti - cáncer potenciales en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y hepatoma (por ejemplo, Mueller, E. y col., Molecular Cell (1998), 1 (3), 465 - 470; Tanaka, T, y col., Cáncer Research (2001), 61 (6), 2424 - 2428; Itami, A. y col., Internacional Journal of Cáncer (2001), 94 (3), 370 - 376; Goeke, R. y col., Digestión (2001), 64 (2), 75 - 80; Okano, H y col., Anti - Cáncer Drugs (2002), 13 (1), 59 - 65; y documento WO/0243716). La evidencia actual sugiere que una simple interacción directa con receptores nucleares no puede explicar la farmacología de estos fármacos prometedores. Los esfuerzos para mejorar la farmacología directamente mediante la fijación como diana de los receptores nucleares PPAR no han tenido todavía éxito probado. Es posible que un sitio adicional de acción pueda ser relevante. Los inventores han mostrado que las tiazolidindionas también se unen directamente a las mitocondrias y usaron una sonda de fotoafinidad para marcar una proteína de 17 - kDa, denomina "mitoNEET", como la diana potencial para esta interacción. Se describen los aminoácidos y secuencias nucleicas homólogos de un polipéptido humano descrito como una proteína celular de tronco hematopoyético/progenitor no caracterizada (MDS029) (número de acceso del Genbank NM _ 018464). Se describen los aminoácidos y secuencias nucleicas homólogos de un polipéptido murino no caracterizado (número de acceso del Genbank NM _ 134007). La tecnología de polaridad opuesta emerge como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y por lo tanto puede demostrar que es útil de forma extraordinaria en un número de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, y de investigación para la modulación de la expresión de mitoNEET.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a compuestos de polaridad opuesta, particularmente oligonucleótidos, que se dirigen a un ácido nucleico que codifica mitoNEET, y que modula la expresión de mitoNEET. También se proporcionan compuestos farmacéuticos y otras composiciones que comprenden compuestos de polaridad opuesta de la invención. Se proporcionan también procedimientos de modulación de la expresión de mitoNEET en células o tejidos que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos o composiciones de polaridad opuesta de la invención. Adicionalmente se proporcionan procedimientos de tratamiento de un animal, particularmente un ser humano, sospechoso de tener o ser propenso a una enfermedad o afección asociada a la expresión de mitoNEET mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más compuestos o composiciones de polaridad opuesta de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Secuencia de aminoácidos de mitoNEET humana y un ácido nucleico que codifica la misma. Figura 2. Alineación de la secuencia de mitoNEET bovina, humana, y murina. Figura 3. La secuencia de aminoácidos subrayada se encontró experimentalmente mediante análisis espectral de masa de nanopulverización de péptidos trípticos a partir de mitoNEET purificada. La secuencia después de M62 se confirmó mediante la secuenciación N - terminal del fragmento CnBr purificado. Esta porción de la molécula contiene el sitio de entrecruzamiento por la sonda.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se conoce bien en la técnica que las tiazolidindionas antidiabéticas, algunas de las cuales se han aprobado recientemente para uso en hombre, son sensibilizadores de insulina (Hofmann CA. y col., Diabetes Care. 15 (8): 1075 - 8, 1992; Goldstein BJ., Rosiglitazone. International Journal of Clinical Practice. 54 (5): 333 - 7, 2000; Lawrence JM y col., Pioglitazone. International Journal of Clinical Practice. 54 (9): 614 - 8, 2000). Adicionalmente se acepta bien que el mecanismo molecular de acción de estos compuestos implica la interacción/modulación directa de los receptores nucleares, PPAR ? (Olefsky JM. y col., Trends in Endocrinology & Metabolism. 1 1 (9): 362 - 8, 2000; Lenhard JM. Receptors & Channels., 1 (4): 249 - 58, 2001 ; Lehmann JM. y col., Journal of Biological Chemistry. 270 (22): 12953 -6, 1995). De este modo, ha habido una gran cantidad de intentos por parte de los expertos en la técnica para encontrar otros compuestos que son mejores moduladores de éste y otros receptores nucleares similares que producen agentes terapéuticos mejores para tratamiento de una enfermedad metabólica (Willson TM. y col., Annals of the New York Academy of Sciences. 804: 276 -83, 1996; Henke BR. y col., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 9 (23): 3329 - 34, 1999; Murakami K. y col., Diabetes . 47 (12): 1841 - 7, 1998; Cesario RM. y col., Molecular Endocrinology. 15 (8): 1360 - 9, 2001 ; Elbrecht A y col., Journal of Biological Chemistry. 274 (12): 7913 - 22, 1999; Brown KK. y col., Diabetes. 48 (7): 1415 - 24,1999). Debido a los efectos de estos compuestos antidiabéticos en la inhibición de apoptosis e inflamación, los compuestos de esta clase se espera que tengan relevancia en el control de cánceres así como enfermedades relacionadas con la neurodegeneración e inflamación (Eibl G. y col., Biochemical & Biophysical Research Communications. 287 (2): 522 - 9, 2001 ; Takashima T. y col., Internacional Journal of Oncology. 19 (3): 465 - 71 , 2001 ; Goke R. y col., Digestión. 64 (2): 75 - 80, 2001 ; Rohn TT. y col., Neuroreport. 12 (4): 839 - 43, 2001 ; Patel L. y col., Current Biology. 11 (10): 764 - 8, 2001 ). Se acepta generalmente que todos estos efectos se producen después de dirigir la modulación de los receptores nucleares, especialmente PPAR y. Por otra parte, los inventores han descubierto que las tiazolidindionas prototípicas se unen a las mitocondrias y los autores han desarrollado una fotosonda novedosa que han usado para localizar el sitio de unión específica a una proteína mitocondrial de < 17 kDa. Los autores han identificado esta proteína mediante técnicas de separación bioquímica y han obtenido su secuencia de aminoácidos mediante tanto técnicas espectrales de masa como secuencia N - terminal de un fragmento de CnBr que contiene los restos que se entrecruzan mediante una sonda de fotoafinidad marcada radiactivamente. Esta secuencia existe previamente en el dominio público solamente como se predice a partir de una secuencia de ADN de tanto el genoma de ratón como humano y a partir de las dianas de secuencias expresadas encontradas en una genoteca doméstica de riñon bovino. Las secuencias esperadas de la proteína en estas tres especies se muestran en la figura 1. Las secuencias del fragmento tríptico de la proteína que los autores han determinado experimentalmente mediante espectroscopia de masas de nanopulverizacion de proteína entrecruzada por fotosonda purificada a partir de mitocondrias de cerebro bovino y mitocondrias de hígado de rata se muestran en la figura 2. Estas secuencias de péptidos están de acuerdo con la secuenciación N - terminal de la fragmentación de CnBr de la proteína mitocondrial entrecruzada de cerebro bovino de los inventores que comienza en la metionina (M) encontrada en la posición 62. Los componentes claves del descubrimiento de los inventores son que esta proteína real existe en las mitocondrias (dos tejidos de dos especies) y que la proteína está inesperadamente implicada en el reconocimiento directo de las moléculas sensibilizadoras a insulina. El descubrimiento de los autores permitirá el uso de esta proteína y los factores implicados en la regulación de su expresión y disposición para descubrir compuestos terapéuticos y estrategias terapéuticas novedosos. La presente invención emplea compuestos de polaridad opuesta oligoméricos, particularmente oligonucleótidos, para uso en la modulación de la función de moléculas de ácidos nucleicos que codifican mitoNEET, modulando por último la cantidad de mitoNEET producida. Esto se lleva a cabo proporcionando compuestos de polaridad opuesta, que se hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican mitoNEET. Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "ácido nucleico diana" y "ácido nucleico que codifica mitoNEET" abarca ADN que codifica mitoNEET, ARN (que incluye pre - ARNm y ARNm) transcrito a partir de tal ADN, y también ADNc derivado a partir de tal ARN. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana mediante compuestos, que se hibridan específicamente a él, se denomina en general "de polaridad opuesta". Las funciones de ADN a ser interferidas incluyen replicación y transcripción. Las funciones de ARN a ser interferidas incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocación del ARN al sitio de traducción de proteínas, traducción de proteína a partir del ARN, ayuste del ARN que produce una o más especies de ARNm, y actividad catalítica que puede estar emprendida o facilitada por el ARN. El efecto global de tal interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de mitoNEET. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa bien incremento (estimulación) o disminución (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, inhibición es la forma preferida de modulación, de la expresión génica y ARNm es una diana preferida. Se prefiere dirigir los ácidos nucleicos específicos para polaridad opuesta. "Dirección" de un compuesto de polaridad opuesta a un ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, es un proceso de múltiples etapas. El proceso usualmente comienza con la identificación de una secuencia de ácidos nucleicos cuya función se va a modular. Esto puede ser, por ejemplo un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión se asocia a un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico a partir de un agente infeccioso. En la presente invención, la diana es una molécula de ácido nucleico que codifica mitoNEET. El proceso de dirección también incluye la determinación de un sitio o sitios dentro de este gen para que se produzca la interacción de polaridad opuesta de forma que se producirá el efecto deseado, por ejemplo, la detección o modulación de la expresión de la proteína. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico preferido es la región que abarca el codón de inicio o terminación de la traducción de la fase abierta de lectura (ORF) del gen. Ya que, como se sabe en la técnica, el codón de inicio de la traducción es típicamente 5' - AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5' - ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de inicio de traducción también se denomina el codón "AUG", el "codón de partida " o el "codón de partida AUG". Una minoría de genes tienen un codón de inicio de traducción que tiene la secuencia de ARN 5' - GUG, 5' - UUG o 5' - CUG, y 5' - AUA, 5' - ACG y 5' - CUG se ha mostrado que funcionan in vivo. De este modo, los términos "codón de inicio de traducción" y "codón de partida" pueden abarcar muchas secuencias de codones, incluso aunque el aminoácido iniciador en cada caso sea típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de partida alternativos, uno cualquiera de los cuales se puede usar preferentemente para inicio de la traducción en un tipo de células o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de partida" o "codón de inicio de traducción" se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de una molécula de ARNm transcrita a partir de un gen que codifica mitoNEET, independientemente de la (s) secuencia (s) de tales codones. También se sabe en la técnica que un codón de terminación de traducción (o "codón de parada") de un gen puede tener una de las tres secuencias, es decir, 5' - UAA, 5' - UAG y 5' - UGA (las secuencias correspondientes de ADN son 5' - TAA, 5' - TAG y 5' - TGA, respectivamente). Los términos "región de codón de partida" y "región de codón de inicio de traducción" se refieren a una porción de tal ARNm o gen que abarca entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' ó 3') a partir de un codón de inicio de traducción. De manera similar, los términos "región de codón de parada" y "región de codón de terminación de traducción" se refieren a una porción de tal ARNm o gen que abarca entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' ó 3') a partir de un codón de terminación de traducción. La fase abierta de lectura (ORF) o "región codificadora", que se sabe en la técnica que se refiere a la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción, es también una región que se puede dirigir eficazmente. Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5' (5' UTR), conocida en la técnica para referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5' a partir del codón de inicio de traducción, y de este modo incluye nucleótidos entre el sitio de remate 5' y el codón de inicio de traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes sobre el gen, y la región no traducida en 3' (3' UTR), conocida en la técnica para denominar la porción de un ARNm en la dirección 3' a partir del codón de terminación de traducción, y de este modo incluye nucleótidos entre el codón de terminación de traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleótidos correspondientes sobre el gen. El remate 5' de un ARNm comprende un resto guanosina N7 -metilado unido al resto más 5' del ARNm mediante un enlace 5' - 5' trifosfato. La región de remate 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura de remate 5' así como los 50 primeros nucleótidos adyacentes al remate. La región de remate 5" también puede ser una región diana preferida. Aunque algunas transcripciones de ARNm eucarióticas se traducen directamente, muchas contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que están escindidas de una transcripción antes de traducirse. Las regiones restantes (y por lo tanto traducidas) se conocen como "exones" y están ayustadas juntas para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de ayuste de ARNm, es decir, uniones intrón - exón, también pueden ser regiones diana preferidas, y son particularmente útiles en situaciones donde el ayuste aberrante está implicado en una enfermedad, o donde está implicada una sobreproducción de un producto de ayuste de ARNm particular en una enfermedad. Las uniones de fusión aberrantes debido a las transposiciones o supresiones también son dianas preferidas. Se ha encontrado también que los intrones también pueden ser eficaces, y por lo tanto, regiones diana preferidas, para los compuestos de polaridad opuesta dirigidos, por ejemplo, a ADN o pre ARNm. Una vez que se han identificado uno o más sitios diana, los oligonucleótidos que se eligen son suficientemente complementarios a la diana, es decir, se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para conseguir el efecto deseado. En el contexto de esta invención, "hibridación" significa enlace de hidrógeno, que puede ser enlace de hidrógeno Watson - Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o de nucleótidos complementarias. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases complementarias, que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. "Complementario" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de unirse mediante enlace de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran que son complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden unirse por enlace de hidrogeno entre sí. Así pues, "hibridable específicamente" y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o apareamiento preciso de manera que se produce una unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana de ADN o ARN. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto de polaridad opuesta no necesita ser 100% complementario a la de su ácido nucleico diana para ser hibridable específicamente. Un compuesto de polaridad opuesta es hibridable específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para producir una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto de polaridad opuesta a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos. Los compuestos de polaridad opuesta se usan comúnmente como reactivos de investigación y compuestos de diagnóstico. Por ejemplo, los oligonucleótidos de polaridad opuesta, que son capaces de inhibir la expresión génica con especificidad exquisita, a menudo los usan los expertos en la técnica para esclarecer la función de genes particulares. Los compuestos de polaridad opuesta también se usan, por ejemplo, para distinguir entre las funciones de diversos miembros de una ruta biológica. Por lo tanto, la modulación de polaridad opuesta se ha aprovechado para uso en investigación. La especificidad y sensibilidad de polaridad opuesta también la aprovechan los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los oligonucleotidos de polaridad opuesta se han empleado como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales y hombres. Los oligonucleotidos de polaridad opuesta se han administrado de manera segura y eficaz a seres humanos y actualmente están en vías de ejecución numerosos ensayos clínicos. Por lo tanto se establece que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que se pueden configurar para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos. En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleotidos compuestos por nucleobases, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (estructura principal) de origen natural así como los oligonucleotidos que tienen partes no naturales que funcionan de manera similar. Tales oligonucleotidos modificados o sustituidos se prefieren a menudo sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada para diana de ácidos nucleicos y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas. El síndrome X (que incluye síndrome metabólico) está definido escasamente como una colección de anormalidades que incluyen hiperinsulinemia, obesidad, niveles elevados de triglicéridos, ácido úrico, fibrinógeno 20, partículas de LDL de escasa densidad, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI - 1 ), y niveles decrecientes de HDL c. Las afecciones metabólicas similares incluyen dislipidemia que incluye dislipidemia diabética asociada y dislipidemia mixta, síndrome X (como se define en esta solicitud esto abarca síndrome metabólico), fallo cardiaco, hipercolesterolemia, enfermedad cardiovascular que incluye aterosclerosis, arteriesclerosis, e hipertrigliceridemia, diabetes mellitus de tipo II, diabetes de tipo I, resistencia a insulina, hiperlipidemia, inflamación, enfermedades hiperproliferativas epiteliales que incluyen eccema y psoriasis y afecciones asociadas al pulmón e intestino y regulación de apetito e ingesta de alimentos en sujetos que padecen trastornos tales como obesidad, anorexia, bulimia, y anorexia nerviosa. En particular, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento y prevención de diabetes y enfermedades cardiovasculares y afecciones que incluyen aterosclerosis, arterieesclerosis, hipertrigliceridemia, y dislipidemia mixta. MítoNEET, o moduladores de la misma, que tiene actividad en los ensayos cardiovasculares, angiogénicos, y endoteliales, descritas en esta memoria descriptiva, y/o cuyo producto génico se ha encontrado que se localiza en el sistema cardiovascular, es probable que tenga usos terapéuticos en una diversidad de trastornos cardiovasculares, endoteliales, y angiogénicos, que incluyen trastornos sistémicos que afectan a los vasos tales como diabetes mellitus. Su utilidad terapéutica podría incluir enfermedades de las arterias, capilares, venas y/o vasos linfáticos. Los ejemplos de tratamientos más adelante incluyen tratamiento de la enfermedad de desgaste muscular, tratamiento de osteoporosis, que ayuda en la fijación de implantes para estimular el crecimiento de células alrededor del implante y por lo tanto facilita su unión a su sitio propuesto, incrementando la estabilidad de IGF en tejidos o en suero, si es aplicable, e incrementando la unión al receptor IGF (ya que IGF se ha mostrado in vitro que potencia el crecimiento celular eritroide de médula humana y de progenitores de granulocitos). MitoNEET o sus moduladores también se pueden emplear para estimular eritropoyesis o granulopoyesis, para estimular la cicatrización de heridas o regeneración de tejidos y terapias asociadas concernientes a crecimiento de nuevo de tejido, tal como tejido conectivo, piel, hueso, cartílago, músculo, pulmón, o riñon, para promover angiogénesis, para estimular o inhibir la migración de células endoteliales, y para proliferar el crecimiento de músculo liso vascular y producción de células endoteliales. El incremento de angiogénesis mediado por mitoNEET o agonista sería beneficioso para los tejidos isquémicos y para el desarrollo coronario colateral en el corazón posterior a estenosis coronaria. Los antagonistas se usan para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, para limitar la producción de exceso de tejido conectivo durante la cicatrización de heridas o fibrosis pulmonar si mitoNEET promueve tal producción. Esto incluiría el tratamiento de infarto de miocardio agudo e insuficiencia cardiaca. Además, la presente invención proporciona el tratamiento de hipertrofia cardiaca, independientemente de la causa subyacente, mediante la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de mitoNEET, o un agonista o antagonista de ella.

Si el objetivo es el tratamiento de pacientes humanos, mitoNEET preferiblemente es el polipéptido de mitoNEET humano recombinante (polipéptido rhmitoNEET). El tratamiento de hipertrofia cardiaca se puede realizar en cualquiera de sus diversas fases, que se puede producir a partir de una diversidad de afecciones patológicas diversas, incluyendo infarto de miocardio, hipertensión, cardiomiopatía hipertrófica, y regurgitación valvular. El tratamiento se extiende a todas las fases de la progresión de hipertrofia cardiaca con o sin daño estructural del músculo cardiaco, independientemente del trastorno cardiaco subyacente. La decisión sobre si usar la propia molécula o un agonista de la misma para cualquier indicación particular, en oposición a un antagonista de la molécula, dependería principalmente de si la molécula promueve la cardiovascularización, genésis de las células endoteliales, o angiogénesis o inhibe estas afecciones. Por ejemplo, si la molécula promueve angiogénesis, un antagonista de la misma será útil para el tratamiento de trastornos donde se desee limitar o prevenir la angiogénesis. Los ejemplos de tales trastornos incluyen tumores vasculares tales como hemangioma, angiogénesis tumoral, neovascularización en la retina, coroide, córnea asociada a retinopatía diabética o retinopatía infantil prematura o degeneración macular y vitreorretinopatía proliferativa, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada a neovascularización, reestenosis posterior a angioplastia de balón, sobreproducción de tejido cauterizado, por ejemplo, el observado en un queloide que se forma después de cirugía, fibrosis después de infarto de miocardio, o lesiones fibróticas asociadas a fibrosis pulmonar. Sin embargo, si la molécula inhibe angiogénesis, se esperaría que se usara directamente para el tratamiento de las afecciones anteriormente mencionadas. Por otra parte, si la molécula estimula la angiogénesis, se usaría por sí misma (o un agonista de la misma) para Indicaciones en las que se desea angiogénesis tal como enfermedad vascular periférica, hipertensión, vasculitis inflamatoria, enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud, aneurismas, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfangitis, linfodema, cicatrización de heridas y reparación de tejidos, lesión isquémica por reperfusión, angina, infarto de miocardio tales como infarto agudo de miocardio, afecciones cardiacas crónicas, insuficiencia cardiaca tal como insuficiencia cardiaca congestiva, y osteoporosis. Sin embargo, si la molécula inhibe angiogénesis, un antagonista de la misma se usaría para el tratamiento de las afecciones en las que se desea angiogénesis. Los tipos específicos de enfermedades se describen más adelante, donde mitoNEET o agonistas o antagonistas de la misma pueden servir por ser útiles para dirigir los fármacos relacionados vasculares o como dianas terapéuticas para el tratamiento o prevención de los trastornos. La aterosclerosis es una enfermedad caracterizada por la acumulación de placas del engrosamiento intimal en arterias, debido a la acumulación de lípidos, proliferación de células de músculo liso, y formación de tejido fibroso en la pared arterial. La enfermedad puede afectar a las arterias grandes, medias y pequeñas en cualquier órgano. Los cambios en la función de las células de músculo liso endotelial y vascular se sabe que juegan un papel importante en la modulación de la acumulación y regresión de estas placas. La hipertensión se caracteriza por un incremento de presión vascular en los sistemas arterial sistémico, arterial pulmonar, o venoso portal. La presión elevada se puede producir a partir de o dar como resultado función endotelial alterada y/o enfermedad vascular. La vasculitis inflamatoria incluye arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, poliarteritis nodosa (que incluye la forma microangiopática), enfermedad de Kawasaki, poliarigtis microscópica, granulomatosis de Wegener, y una variedad 101 de trastornos vasculares relacionados infecciosos (que incluye Henoch - Schonlein Púrpura). La función de las células endoteliales alterada se ha mostrado que es importante en estas enfermedades. La enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud se caracterizan por la alteración anormal intermitente de la circulación a través de las extremidades tras la exposición al frío. La función de las células endoteliales alterada se ha mostrado que es importante en esta enfermedad. Los aneurismas son dilataciones saculares o fusiformes del árbol arterial o venoso que están asociados a la alteración de la célula endotelial y/o células de músculo liso vascular.

La reestenosis arterial (reestenosis de la pared arterial) se puede producir después de angioplastia como resultado de alteración en la función y proliferación de células de músculo liso endoteliales y vasculares. La tromboflebitis y linfangitis son trastornos inflamatorios de las venas y vasos linfáticos, respectivamente, que se pueden producir a partir de, y/o en, función celular endoteliall alterada. De manera similar, el linfedema es una afección que implica vasos linfáticos alterados que se producen de la función celular endotelial. La familia de tumores vasculares benignos y malignos se caracteriza por la proliferación y crecimiento anormal de elementos celulares del sistema vascular. Por ejemplo, los linfangiomas son tumores benignos del sistema linfático que son malformaciones congénitas, a menudo quísticas de los vasos linfáticos que se producen usualmente en recién nacidos. Los tumores quisticos tienden a crecer en el tejido adyacente. Los tumores quisticos usualmente se producen en la región cervical y axilar. También se pueden producir en el tejido blando de las extremidades. Los principales síntomas son linfocistos y vasos linfáticos estructurados, a veces reticulares, dilatados rodeados por tejido conectivo. Se asume que los linfangiomas se producen por vasos linfáticos embriónicos conectados inadecuadamente o su deficiencia. El resultado es la alteración del drenaje linfático local. Otro uso de antagonistas de mitoNEET es la prevención de angiogénesis de tumores, que implica la vascularización de un tumor que permite su crecimiento y/o metástasis. Este proceso depende del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los ejemplos de neoplasmas y afecciones relacionadas que implican la angiogénesis de tumores incluyen carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas de esófago, carcinomas colorrectales, carcinomas de hígado, carcinomas de ovarios, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinomas de endometrio, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas de laringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Sch annoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada a facomatosis, edema (tal como el asociado a tumores cerebrales), y síndrome de Meigs. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa principal de pérdida visual grave en la población anciana. La forma exudativa de AMD se caracteriza por la neovascularización coroidal y desprendimiento de células epiteliales del pigmento retinal. Debido a que la neovascularización coroidal está asociada al empeoramiento drástico en prognosis, el agonista de mitoNEET se espera que sea útil en la reducción de la gravedad de AMD.

La curación de trauma tal como cicatrización de heridas y reparación de tejidos también es un uso dirigido por la mitoNEET o su agonista. La formación y regresión de nuevos vasos sanguíneos es esencial para la cicatrización y reparación de tejido. Esta categoría incluye crecimiento o regeneración de hueso, cartílago, tendón, ligamento, y/o tejido nervioso, así como cicatrización de heridas y reparación y reemplazamiento de tejidos, y en el tratamiento de quemaduras, incisiones y úlceras. La mitoNEET o sus moduladores que induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que el hueso no se forma normalmente tiene aplicación en la cicatrización de fracturas de hueso y daño de cartílago o defectos en seres humanos y otros animales. Tal preparación que emplea mitoNEET o su agonista o antagonista puede tener uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la fijación mejorada de las articulaciones artificiales. La formación de nuevo de hueso inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales inducidos por resección, congénítos, inducidos por trauma, u oncológicos, y también es útil en la cirugía plástica cosmética. MitoNEET o sus moduladores también pueden ser útiles para promover mejor cierre o más rápido de heridas no cicatrizantes, incluyendo sin limitación úlceras por presión, úlceras asociadas a la insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas, y similares. Se espera que los moduladores de mitoNEET también puedan mostrar actividad para la generación o regeneración de otros tejidos, tales como órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, o endotelio), músculo (liso, esquelético, o cardiaco), y tejido vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células que comprenden tales tejidos. Parte de los efectos deseados pueden ser mediante la inhibición o modulación de cicatrización fibrótica que permite que se regenere el tejido normal. Los moduladores de mitoNEET también pueden ser útiles para la protección del intestino o regeneración y tratamiento de fibrosis hepática o de pulmón, lesión por reperfusión en diversos tejidos, y afecciones que se producen de daño por citocinas sistémicas. También, mitoNEET o sus moduladores, pueden ser útiles para promover o inhibir la diferenciación de los tejidos descritos anteriormente a partir tejidos o células precursores, o para inhibir el crecimiento de los tejidos descritos anteriormente. Los moduladores de mitoNEET también pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades periodontales y en otros procesos de reparación de dientes. Tales agentes pueden proporcionar un ambiente para atraer las células formadoras de huesos, estimular el crecimiento de células formadoras de huesos, o inducir la diferenciación de progenitores de las células formadoras de hueso, MitoNEET o un agonista o antagonista de ella, también pueden ser útiles en el tratamiento de osteoporosis u osteoartritis, tal como a través de la estimulación de reparación de hueso y/o cartílago o mediante el bloqueo de la inflamación o procesos de destrucción de tejidos (actividad colagenasa, actividad osteoclástica, etc.) mediada por procesos inflamatorios, ya que los vasos sanguíneos juegan un papel importante en la regulación de recambio y crecimiento óseo. Otra categoría de actividad de regeneración de tejidos que puede ser atribuible a mitoNEET o sus moduladores es la formación de tendones/ligamentos. Una proteína que induce la formación de tejido de tipo tendón/ligamento u otro tejido en circunstancias en las que tal tejido no se forma normalmente tiene aplicación en la curación de desgarros de tendones o ligamentos, deformidades, y otros defectos de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Tal preparación puede tener uso profiláctico en la prevención de daño al tejido de tendones o ligamentos, así como uso en la fijación mejorada de tendón o ligamento a hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejido de tendón o ligamento. La formación de nuevo de tejido de tipo tendón/ligamento inducida por una composición de mitoNEET o agonista o antagonista de ella contribuye a la reparación de defectos congénitos, inducidos por trauma, o diferentes de tendón o ligamento de otro origen, y también es útil en cirugía plástica cosmética para la unión o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones en esta memoria descriptiva pueden proporcionar un entorno para atraer las células formadoras de tendones o ligamentos, estimular el crecimiento de células formadoras de tendones o ligamentos, inducir la diferenciación de progenitores o células formadoras de tendones o ligamentos, o inducir el crecimiento de células de tendones/ligamentos o progenitores ex vivo para volver a efectuar la reparación de tejidos. Las composiciones en esta memoria descriptiva también pueden ser útiles en el tratamiento de tendinitis, síndrome de túnel carpal, y otros defectos de tendón o ligamento. Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o agente secuestrante como un vehículo como se conoce bien en la técnica. MitoNEET o sus moduladores también pueden ser útiles para la proliferación de las células neurales y para la regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedad del sistema nervioso central y periférico y neuropatías, así como trastornos mecánicos y traumáticos, que implican la degeneración, muerte, o trauma de células neurales o tejido nervioso. Más específicamente, mitoNEET o su agonista se puede usar en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como lesiones nerviosas periféricas, neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y síndrome de Shy - Drager. Las afecciones adicionales que también se pueden tratar de acuerdo a la presente invención incluyen trastornos mecánicos y traumáticos, tales como trastornos de la médula espinal, trauma encefálico, y enfermedades cerebrovascualres tales como accidente cerebrovascular. Las neuropatías periféricas que se producen de quimioterapia u otras terapias médicas también se pueden tratar usando mitoNEET, agonista de mitoNEET o antagonista de ella. La lesión isquémica por repercusión es otra indicación. La disfunción de células endoteliales puede ser importante en tanto el inicio como en la regulación de las secuelas de episodios que se producen después de lesión de isquémica por repercusión. La artritis reumatoide es una indicación adicional. El crecimiento de vasos sanguíneos y dirección de células inflamatorias a través de la vasculatura es un componente importante en la patogénesis de formas reumatoides y sero - negativas de artritis. MitoNEET o sus moduladores también se pueden administrar profilácticamente a pacientes con hipertrofia cardiaca, para prevenir la progresión de la afección, y evitar la muerte súbita, incluyendo muerte de pacientes asintomáticos. Tal terapia preventiva se garantiza particularmente en el caso de pacientes diagnosticados con hipertrofia cardiaca ventricular izquierda masiva (un espesor de la pared maximal de 35 mm o más en adultos, o un valor comparable en niños), o en los casos en los que la carga hemodinámica en el corazón es particularmente fuerte. MitoNEET o sus moduladores también pueden ser útiles en la gestión de fibrilación atrial, que desarrolla una porción sustancial de pacientes diagnosticados con cardiomiopatía hipertrófica. Las indicaciones adicionales incluyen angina, infarto de miocardio tales como infartos de miocardio agudos, e insuficiencia cardiaca tal como insuficiencia cardiaca congestiva. Las afecciones no neoplásicas adicionales incluyen psoriasis, retinopatía diabética u otras retinopatías proliferativas que incluyen retinopatía de premadurez fibroplasia, retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante corneal y de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación de pulmón, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascites, efusión pericardial (tal como la asociada a pericarditis), y efusión pleural. En vista de lo anterior, mitoNEET o sus moduladores descritos en esta memoria descriptiva, que se muestra que alteran o impactan la función celular endotelial, endotelial, o especializada, proliferación y/o forma, probablemente juegan un papel importante en la etilogía y patogénesis de muchos o todos los trastornos indicados anteriormente, y como tal pueden servir como dianas terapéuticas para aumentar o inhibir estos procesos o para la dirección de fármacos relacionados vasculares en estos trastornos.

Ensayos para diabetes Se pueden usar diversos ensayos para analizar los compuestos que ¡nteractúan con mitoNEET y/o proteínas asociadas a mitoNEET. Por ejemplo, además de la evaluación de la interacción directa con mitoNEET, los compuestos se pueden evaluar para determinar la capacidad de afectar las actividades enzimáticas que están asociadas a mitoNEET. Esto incluye, pero no se limita a, enzimas implicadas en la oxidación de ácidos grasos particularmente en las mitocondrias. Un ejemplo de este planteamiento es medir la tasa de ß -oxidación de esteres de acil - CoA grasos usando membranas aisladas o mitocondrias intactas que contienen mitoNEET. Los metabolitos se miden mediante la aparición de productos como se determina mediante HPLC o mediante la tasa de reducción de cofactores o sustratos (por ejemplo, figura 9). Los compuestos activos en la modulación de la actividad de mitoNEET con respecto a estas actividades enzimáticas se pueden entonces evaluar en células intactas (por ejemplo, hepatocitos, adipocitos, etc.) donde los intermedios se miden mediante HPLC después de la extracción a partir de las células. Los compuestos activos que modulan la actividad mitoNEET en estos ensayos y que contienen también las propiedades apropiadas para que lleguen a ser agentes terapéuticos (por ejemplo, biodisponibilidad, semivida, etc.) se esperaría entonces que produzcan acciones antidiabéticas en modelos animales de diabetes tal como la reducción de los víveles de glucosa e insulina circulantes y la mejora de la expresión génica dependiente de insulina (por ejemplo, Hofmann, C, Lornez, K., y Coica, J. R. (1991) Endocrinology, 129: 1915 - 1925; Hofmann, C, Lornez, K., y Coica, J. R. (1992) Endocrinology, 130: 735 - 740.).

Ensayos para la evaluación de la actividad cardiovascular, endotelial y angioqénica Se pueden usar diversos ensayos para analizar mitoNEET en esta memoria descriptiva con el fin de evaluar la actividad cardiovascular, endotelial, y angiogénica. Tales ensayos incluyen los proporcionados en los ejemplos más adelante. Los ensayos para evaluar la actividad antagonista de endotelina, como se describe en la patente de Estados Unidos n° 5,773,414, incluyen un ensayo de unión de ventrículo de corazón de rata donde mitoNEET se ensaya para evaluar su capacidad de inhibir la unión de endotelina - 1 yodada en un ensayo de receptor, un ensayo de unión a receptor de endotelina que analiza la unión de células intactas de endotelina - 1 marcada radiactivamente usando células de músculo liso vascular arterial renal de conejo, un ensayo de acumulación de fosfato de inositol donde la actividad funcional se determina en células de rata - I midiendo los niveles intracelulares de mensajeros secundarios, un ensayo de liberación de ácido araquidónico que mide la capacidad de los compuestos añadidos para reducir la liberación de ácido araquidónico estimulada por endotelina en músculos lisos vasculares cultivados, estudios in vitro (vaso aislado) que usan endotelio de conejos macho New Zealand, y estudios in vivo que usan ratas macho Sprague -Dawley. Los ensayos para evaluar la actividad de generación de tejidos incluyen, sin limitación, los descritos en los documentos WO 95/16035 (hueso, cartílago, tendón), WO 95/05846 (nervio, neuronal), y WO 91/07491 (piel, endotelio). Los ensayos para evaluar la cicatrización de heridas incluyen, por ejemplo, los descritos en Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, Hl y Rovee, DT, ediciones. (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71 -112, modificado por el artículo de Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol., 71 : 382 - 384 (1978). Existen varios ensayos de hipertrofia cardiaca. Los ensayos in vitro incluyen la inducción de la difusiónde miocitos cardiacos de rata adulta.

En este ensayo, los miocitos ventricuiares se aislan a partir de una rata individual (macho de Sprague - Dawley), esencialmente siguiendo una modificación del procedimiento descrito en detalle por Piper y col., "Adult ventricular rat heart muscle cells" en Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H. M. Piper, ed. (Berlín: Springer - Verlag, 1990), pp. 36 -60. Este procedimiento permite el aislamiento de miocitos ventricuiares adultos y el cultivo a largo plazo de estas células en fenotipo de forma de bastón. La fenilefrina y prostaglandina F2 (PGF2) se ha mostrado que inducen una respuesta de difusión en estas células adultas. Se ensaya después la inhibición de la difusión de miocitos inducidos por PGF2 o análogos de PGF2 (por ejemplo, fluprostenol) y fenilefrina mediante diversos inhibidores potenciales de hipertrofia cardiaca. La eficacia de acción anti - hipertensiva se puede medir mediante medios directos o indirectos en modelos animales que muestran hipertensión resistente a insulina (por ejemplo, Hypertension 24 (1 ), 106 - 10, (1994); Metabolism, Clinical and Experimental 44: 1105 - 9 (1995)). La eficacia de los compuestos identificados mitoNEET también se pueden medir directamente in vitro (por ejemplo, Journal of Clinical Investigation 96: 354 -60, (1995). Aunque los oligonucleótidos de polaridad opuesta son una forma preferida de compuesto de polaridad opuesta, la presente invención incluye otros compuestos de polaridad opuesta oligoméricos, incluyendo pero sin limitación miméticos de oligonucleótidos tal como se describe más adelante.

Los compuestos de polaridad opuesta de acuerdo con esta invención preferiblemente comprenden entre aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases (es decir, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 30 nucleósidos unidos). Los compuestos de polaridad opuesta particularmente preferidos son oligonucleótidos de polaridad opuesta, incluso más preferiblemente los que comprenden entre aproximadamente 12 y aproximadamente 25 nucleobases. Como se sabe en la técnica, un nucieósido es una combinación base - azúcar. La parte base del nucieósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la parte azúcar del nucieósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido a cualquier resto 2', 3' ó 5' hidroxilo del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfatos unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal se pueden unir adicionalmente para formar una estructura circular, sin embargo, se prefieren generalmente estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente como formadores de la estructura principal internucleósido del oligonucleótido. El enlace normal o estructura principal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. Los ejemplos específicos de los compuestos de polaridad opuesta preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras principales modificadas o enlaces internucleosidos no naturales. Como se define en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen estructuras principales modificadas incluyen los que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y los que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para los propósitos de esta memoria descriptiva, y como algunas veces se menciona en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal ¡nternucleósido se puede considerar también que son oligonucleósidos. Las estructuras principales de oligonucleótidos modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilfosfonatos y otros alquilofosfonatos incluyendo 3' alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos unidos 2'-5' de éstos, y los que tienen polaridad invertida en los que los pares de unidades de nucleósidos adyacentes están unidos 3' - 5' a 5' - 3' ó 2' - 5' a 5' - 2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres. Las patentes de Estados Unidos representativas que describen la preparación de los enlaces anteriores que contienen fósforo incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301 ; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321 ,131 ; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821 ; 5,541 ,306; 5,550,111 ; 5,563,253; 5,571 ,799; 5,587,361 ; y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Las estructuras principales de oligonucleótidos modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en ellas tienen estructuras principales que están formadas por enlaces ¡nternucleósidos de cicloalquilos o alquilos de cadena corta, enlaces ¡nternucleósidos mezcla de heteroátomos y de alquilos o cicloalquilos, o uno o más enlaces ¡nternucleósidos o heterocíclicos heteroátómicos de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes de componentes mixtas de N, O, S y CH2. Las patentes de Estados Unidos representativas que describen la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141 ; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541 ,307; 5,561 ,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleósido, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con grupos novedosos. Las unidades de bases se mantienen para hibridación con un compuesto apropiado diana de ácidos nucleicos. Tal compuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos PNA, la estructura principal de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal. Las patentes de Estados Unidos representativas que describen la preparación de los compuestos de PNA incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos 5,539,082; 5,714,331 ; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. La descripción adicional de los compuestos de PNA se puede encontrar en Nielsen y col., Science, 1991 , 254, 1497 - 1500. Las realizaciones más preferidas de la invención son oligonucleótidos con estructuras principales de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-0- CH2- [conocidos como una estructura principal de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-0-N (CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -0-N(CH3)-CH2-CH2- [en los que la estructura principal fosfodiéster nativa se representa como -O-P-O-CH2-] de la patente de Estados Unidos n° 5,489,677 anteriormente mencionada, y las estructuras principales de amida de la patente de Estados Unidos n° 5,602,240 anteriormente mencionada. También preferidos son los oligonucleótidos que tienen estructuras principales de morfolino de la patente de Estados Unidos n° 5,034,506 mencionada anteriormente. Los oligonucleótidos modificados pueden también contener uno o más restos de azúcar sustituido. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Particularmente preferidos son 0[(CH2)nO]mCH3, 0(CH2)n, OCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y 0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 donde n y m están entre 1 y aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C1 a Cío, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, y un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2 -O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-0-(2-metox¡etilo) o 2'-MOE) (Martín y col., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486 - 504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación preferida adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0-(CH2)20N(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos en esta memoria descriptiva más adelante, y 2'-dimetilaminoetox¡etoxi (también conocido en la técnica como 2'-0-dimetilaminoetoxietilo o 2 -DMAEOE), es decir, 2'-0-CH2-0-CH2-N (CH2)2, también descritos en los ejemplos en esta memoria descriptiva más adelante. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metox¡ (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2 -0 CH2CH2CH2Nl-l2) y 2'-fluoro (2 -F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar sobre el nucleótido terminal 3' o en oligonucleótidos unidos en 2' - 5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 4,981 ,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,81 1 ; 5,576,427; 5,591 ,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "base"). Como se usa en esta memoria descriptiva, nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, derivados 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2- tiouracilo, 2- tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8- sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5 - sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8- azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3- desazaadenina. Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente de Estados Unidos n° 3,687,808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Poiymer Science And Engineeríng, páginas 858 - 859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley y Sons, 1990, las descritas por Englisch y col., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991 , 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289 - 302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Ciertas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Éstas incluyen pirimidinas 5 - sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina Las sustituciones 5- metilcitosina se han mostrado que incrementan la estabilidad de los dúplex de ácidos nucleicos en 0.6 - 1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276 - 278) y son sustituciones de bases actualmente preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-0-metoxietilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero sin limitación, la patente de Estados Unidos número 3,687,808, indicada anteriormente, así como las patentes de Estados Unidos números: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,7 ; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,12'; 5,596,091 ; 5,614,617; 5,750,692; y 5,681 ,941 , cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados, que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales restos incluyen, pero sin limitación, restos lipidíeos tales como un resto de colesterol (Letsinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 1989, 86, 6553 - 6556), ácido cólico ( anoharan y col., Bioorg. Med. Chem. Let, 1994, 4, 1053 - 1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306 - 309; Manoharan y col., Biorg. Med. Chem. Let, 1993, 3, 2765 - 2770), un tiocolesterol (Oberhauser y col., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533 - 538), una cadena alifática, por ejemplo, restos dodecandiol o undecilo (Saison - Behmoaras y col., EMBO J., 1991 , 10, 11 1 1 - 1118; Kabanov y col., FEBS Lett., 1990, 259, 327 - 330; Svinarchuk y col., Biochimie, 1993, 75, 49 - 54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1 ,2-di-0-hexadecil-rac-gIicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y col., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 - 3654; Shea y col., Nucí. Acids Res., 990, 18, 3777 - 3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Mancharan y col., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969 - 973), o un ácido adamantano acético (Manoharan y col., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 - 3654), un resto palmitilo (Mishra y col., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229 - 237), o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923 - 937).

Las patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541 ,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580,731 ; 5,591 ,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941 ; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391 ,723; 5,416,203; 5,451 ,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941 , cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén modificadas uniformemente, y de hecho más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas se pueden incorporar en un solo compuesto o incluso a un nucleósido individual en un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos de polaridad opuesta, que son compuestos quiméricos. Compuestos de polaridad opuesta "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de la presente invención, son compuestos de polaridad opuesta, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de al menos una unidad monómera, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado de manera que confiera sobre el oligonucleótido resistencia incrementada a la degradación por nucleasa, captación celular incrementada, y/o afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN: ADN o ARN: ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular, que escinde la hebra de ARN del dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la ARNasa H da como resultado la escisión de la diana de ARN, por lo tanto potenciando en gran medida la eficacia de inhibición de oligonucleótidos de expresión génica. Por lo tanto, se pueden obtener a menudo resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, comparados con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan a la misma región diana. La escisión de la diana de ARN se puede detectar rutinariamente mediante electroforesis sobre gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociados conocidas en la técnica. Los compuestos de polaridad opuesta quiméricos de la invención se pueden formar como estructuras de material compuesto de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente. Tales compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gapmeros. Las patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711 ; 5,491 ,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Los compuestos de polaridad opuesta usados de acuerdo con esta invención se pueden preparar convenientemente, y rutinariamente mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis se vende en varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Adicionalmente o como alternativa se puede emplear cualquier otro medio conocido en la técnica para tal síntesis. Se conoce bien el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de polaridad opuesta de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones de polaridad opuesta de origen biológico, o construcciones de vectores genéticos diseñados para dirigir la síntesis In vivo de moléculas de polaridad opuesta. Los compuestos de la presente invención también se pueden mezclar, encapsular, conjugar o por lo demás asociarse con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas receptoras, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de tales formulaciones auxiliares de captación, distribución y/o absorción incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos números 5,108,921 ; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521 ,291 ; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591 ,721 ; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921 ; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221 ; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los compuestos de polaridad opuesta de esta invención abarcan cualquier sal, éster, o sal de tales ésteres farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo del mismo biológicamente activo. Por ejemplo, de acuerdo a lo anterior, la descripción también se dirige a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, las sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos, y otros bioequivalentes. El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir fármaco) dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros compuestos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones de profármacos de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] según los procedimientos descritos en el documento WO 93/24510 de Gosselin y col., publicado el 9 de diciembre de 1993, o en el documento WO 94/26764 de Imbach y col. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, las sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos no deseados a ellos. Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los ejemplos de metales usados como cationes son sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares. Los ejemplos de aminas adecuadas son ?,?'- dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina, y procaína (véase por ejemplo, Berge y col., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharma ScL, 1977, 66, 119). Las sales de adición de bases de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de ácido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren un poco de sus formas de sal respectivas en ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para propósitos de la presente invención. Como se usa en esta memoria descriptiva, una "sal de adición farmacéutica" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Éstas incluyen sales de ácidos orgánicos o inorgánicos de las aminas. Las sales de ácidos preferidas son los clorhidratos, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales adecuadas farmacéuticamente aceptables las conocen bien los expertos en la técnica e incluyen sales básicas de una diversidad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos carboxílicos orgánicos, ácidos sulfónicos, sulfo o fosfoácidos o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico, o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, tales como los 20 alfa aminoácidos implicados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1 ,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1 ,5- disulfónico, 2- ó 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos también se pueden preparar con un catión farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen bien los cationes farmacéuticamente aceptables adecuados e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y de amonio cuaternario. También son posibles los carbonates o carbonates ácidos. Para oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a (a) las sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas, tales como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) las sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d) las sales formadas a partir de aniones elementales tales como cloro, bromo, y yodo. Los compuestos de polaridad opuesta de la presente invención se pueden utilizar para diagnósticos, compuestos terapéuticos, profilaxis, y como reactivos de investigación y kits. Para compuestos terapéuticos, un animal, preferiblemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno, que se puede tratar mediante la modulación de la expresión de la mitoNEET, se trata mediante la administración de compuestos de polaridad opuesta de acuerdo con esta invención. Los compuestos de la invención se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto de polaridad opuesta a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos de polaridad opuesta y procedimientos de la presente invención también pueden ser útiles profilácticamente, por ejemplo, para prevenir o retrasar infección, inflamación, o formación de tumores. Los compuestos de polaridad opuesta de la invención son útiles para investigación y diagnóstico, debido a que estos compuestos se hibridan a ácidos nucleicos que codifican la mitoNEET, permitiendo ensayos sandwich u otros que fácilmente se construyen para explotar este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos de polaridad opuesta de la invención con un ácido nucleico que codifica la mitoNEET se puede detectar mediante medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se pueden preparar los kits que usan tales medios de detección para detectar el nivel de la mitoNEET en una muestra. La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas, que incluyen los compuestos de polaridad opuesta de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de numerosas formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y a membranas mucosas incluyendo distribución vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador, intratraquecal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2 -O-metoxietilo se cree que son particularmente útiles para administración oral. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. También pueden ser útiles preservativos revestidos, guantes y similares. Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión, o aglutinantes. Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles, que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitación, potenciadores de penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los ingredientes activos con el (los) vehículo (s) o excipiente (s) farmacéuticos. En general las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, configurando el producto. Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas posibles de dosificación tales como, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios, y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mezclas. Las suspensiones acuosas pueden además contener sustancias, que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. En una realización de la presente invención las composiciones farmacéuticas se pueden formular y usar en forma de espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitación, emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas, y liposomas. Aunque básicamente similares en naturaleza estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de tales composiciones y formulaciones la conocen generalmente los expertos en la técnica farmacéutica y de formulación y se puede aplicar a la formulación de las composiciones de la presente invención.

Emulsiones Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular en forma de emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotas que usualmente exceden de 0.1 pm de diámetro. (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1, p. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 2, p. 335; Higuchi y col., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301 ). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas íntimamente y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser bien agua en aceite (ag/ac) o de la variedad aceite en agua (ac/ag). Cuando una fase acuosa está finamente dividida y dispersada en forma de gotas minúsculas en una fase oleosa a granel la composición resultante se llama una emulsión agua en aceite (ag/ac). Como alternativa, cuando una fase oleosa está finamente dividida y dispersada en forma de gotas minúsculas en una fase acuosa a granel la composición resultante se llama una emulsión aceite en agua (ac/ag). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo, que se puede presentar en forma de una solución en bien la fase acuosa, fase oleosa o en sí misma en forma de una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizantes, tintes, y anti - oxidantes también pueden estar presentes en emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que comprenden más de dos fases, tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (ac/ag/ac) y agua en aceite en agua (ag/ac/ag). Tales formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que no tienen las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en las que las gotas de aceite individuales de una emulsión ac/ag encierran pequeñas gotas de agua constituyen una emulsión ag/ac/ag. De manera similar un sistema de gotas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizada en un aceite continuo proporciona una emulsión ac/ag/ac. Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersada o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma mediante los medios emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de las emulsiones puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de bases de pomadas de estilo emulsión y cremas. Otros medios de estabilizar emulsiones suponen el uso de emulsionantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes de origen natural, bases de absorción, y sólidos finamente dispersados (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 199). Los tensiactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. 1988, volumen 1 , p. 199). Los tensioactivos son típicamente anfifílicos y comprenden una parte hidrófila y una hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado el balance hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa en la categorización y selección de tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónicos, catiónicos y anfóteros (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 285). Los emulsionantes de origen natural usados en formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas de manera que pueden absorber agua hasta formar emulsiones ag/ac que mantienen todavía sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina líquida hidrófila. Los sólidos finamente divididos también se han usado como buenos emulsionantes especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Éstos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidroxidos de metales pesados, arcillas no hinchables tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorilonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbono o triestearato de glicerilo. También están incluidos una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones de emulsiones y contribuyen a las propiedades de emulsiones. Éstos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes, y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 199). Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas de origen natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma carayá, y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbomeros, éteres de celulosa, y polímeros de carboxivinilo). Éstos se dispersan o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan emulsiones mediante la formación de películas interfaciales fuertes alrededor de las gotas en la fase dispersadas e incrementando la viscosidad de la fase externa. Ya que las emulsiones contienen a menudo numerosos ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteróles y fosfátidos que pueden soportar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente usados incluidos en las formulaciones de emulsiones incluyen metilparaben, propilparaben, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p- hidroxibenzoico, ácido bórico. Los antioxidantes se añaden también comúnmente a formulaciones de emulsiones para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores tales como ácido ascórbico, y metabisulfito sódico, y sinergistas antioxidantes tales como tales como ácido cítrico, ácido tartárico, y lecitina. La aplicación de las formulaciones de emulsiones mediante vías dermatológicas, orales, y parenterales y procedimientos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 199). Las formulaciones de emulsiones para distribución oral se han usado ampliamente debido a razones de fácil formulación, eficacia desde un punto de vista de absorción y biodisponibilidad. (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 199). Los laxantes a base de aceite mineral, vitaminas solubles en aceite y preparaciones nutritivas con alto contenido en grasas están entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral en forma de emulsiones ac/ag. En una realización de la presente invención, las composiciones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos se formulan en forma de microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfifilo, que es una solución líquida sencilla ópticamente isotrópica, y termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 245). Típicamente las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una solución de tensioactivo acuoso y después añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas de tensioactivos (Leung y Shah, en: Controlled Reléase of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 1852 - 5). Las microemulsiones comúnmente se preparan mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, co - tensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo de agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag) depende de las propiedades del aceite y tensioactivo usados y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburos de las moléculas de tensioactivos (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271 ). El planteamiento fenomenológico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado ampliamente y ha producido un conocimiento comprensivo, para los expertos en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 335). Comparadas con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente. Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero sin limitación, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, polioxietilen oleil éteres de, ásteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monoolelato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monoolelato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (S0750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con co - tensioactivos. El co - tensioactivo, usualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1 -propanol, y 1-butanol, sirve para incrementar la fluidez interfacial penetrando en la película de tensioactivo y por lo tanto creando una película desordenada debido al espacio vacío generado entre moléculas de tensioactivos. Sin embargo, las microemulsiones pueden prepararse sin el uso de co - tensioactivos y se conocen en la técnica sistemas de microemulsiones autoemulsionantes libres de alcohol. La fase acuosa puede típicamente ser, pero sin limitación, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero sin limitación, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8 - C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilado, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos saturados poliglicolizados C8 - C10, aceites vegetales y aceite de silicona. Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de visto de solubilización de fármacos y de la absorción potenciada de fármacos. Las microemulsiones a base de lípidos (tanto ac/ag como ag/ac) se ha propuesto que potencian la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides y col., Pharmaceutical Research , 1994, 1 1 , 1385 -1390; Ritschel, Meth. Fínd. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilización de fármacos mejorada, protección de fármaco respecto a la hidrólisis enzimática, posible potenciación de absorción del fármaco debido a las alteraciones inducidas por tensioactivos en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral respecto a las formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada, y disminución de la toxicidad (Constantinides y col., Pharmaceutical Research, 1994, 11 , 1385; Ho y col., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 - 143). A menudo las microemulsiones se pueden formar espontáneamente cuando sus componentes se ponen en contacto juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos u oligonucleótidos termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión de la presente invención faciliten el aumento de absorción sistémica de oligonucleótidos y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, así como que mejoren de la captación celular local de oligonucleótidos y ácidos nucleicos en el tracto gastrointestinal, vagina, cavidad bucal y otras áreas de administración. Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para potenciar la absorción de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de penetración usados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías - tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensioactivos no quelantes (Lee y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 92). Cada una de estas clases se ha descrito anteriormente.

Liposomas Existen muchas estructuras organizadas de tensioactivos además de las microemulsiones que se han estudiado y usado para la formulación de fármacos. Éstas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como liposomas, han atraído gran interés debido a su especificidad y duración de la acción que puedan ofrecer desde el punto de vista de distribución de fármacos. Como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición a administrar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficazmente con la pared celular, son recogidos por los macrófagos in vivo. Con el fin de atravesar la piel de mamíferos intacta, las vesículas de lípidos deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, es deseable usar un liposoma, que es altamente deformable y capaz de pasar a través de tales poros finos. Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen; los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar un amplio intervalo de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. volumen 1 , p. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial lipídica, tamaño de vesícula y el volumen acuoso de los liposomas. Los liposomas son útiles para la transferencia y distribución de ingredientes activos en el sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, los liposomas comienzan a fusionarse con las membranas celulares. A medida que la fusión del liposoma y célula progresa, los contenidos liposomales se vacían en la célula donde al agente activo puede actuar. Las formulaciones liposomales han sido el foco de amplias investigaciones como el modo de distribución de muchos fármacos. Existe una evidencia creciente de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con una alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación incrementada del fármaco administrado en la diana deseada, y la capacidad de administrar una amplia diversidad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, en la piel. Diversas reseñas han detallado la capacidad de los liposomas de distribuir agentes que incluyen ADN de alto peso molecular en la piel. Se han administrado a la piel compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de alto peso molecular. La mayoría de las aplicaciones dieron como resultado la localización de la epidermis superior. Los liposomas se sitúan en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente, que ¡nteractúan con las moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo ADN/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980 - 985). Los liposomas, que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan el ADN en lugar de formar complejos con él. Ya que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera similar, se produce repulsión en lugar de formación de complejo. No obstante, algún ADN queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para distribuir el ADN que codifica el gen de la timidina quinasa a las monocapas de células en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células diana (Zhou y col., Journal of Controlled Reléase, 1992, 9, 269 - 274). Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos de la fosfatidilcolina obtenida de manera natural. Por ejemplo, las composiciones neutras de liposomas, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones aniónicas de liposomas generalmente se forman a partir de dimiristoil f osf atid i Ig I ¡ce ro I , mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja, y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol. Varios estudios han determinado la distribución tópica de las formulaciones del fármaco liposomal a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a la piel de cobayas dio como resultado una reducción de llagas del herpes cutáneo mientras que la distribución de interferón mediante otros medios (por ejemplo, en forma de una solución o en forma de una emulsión) era ineficaz (Weiner y col., Journal of Drugs Targeting, 1992, 2, 405 - 410). Además, un estudio adicional probó la eficacia de interferón administrado como parte de una formulación liposomal respecto a la administración de interferón usando un sistema acuoso, y concluyeron que la formulación liposomal era superior a la administración acuosa (du Plessis y col., Antiviral Research, 1992, 8, 259 - 265). Los sistemas liposomales no iónicos se han examinado también para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular los sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome ™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno - 10 - estearil éter) y Novasome ™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno - 10 - etearil éter) se usaron para distribuir ciclosporina - A ¡n la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos eran eficaces en la facilitación de la deposición de ciclosporina - A en diferentes capas de la piel (Hu y coi., S.T. P. Pharma. ScL, 1994, 4, 6, 466). Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados esféricamente", un término que, como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a los liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, dan como resultado potenciación de la duración en circulación con relación a liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados esféricamente son aquellos en los que parte de la porción de lípido que forma vesículas del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido GMI , O (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto polietilenglicol (PEG). Sin querer estando sujeto a las limitaciones de ninguna teoría particular, se cree en la técnica que, al menos para liposomas estabilizados esféricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina, o lípidos derivatizados con PEG, la potenciación de la semivida en circulación de estos liposomas estabilizados esféricamente se deriva de una reducción de la captación en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Alien y col., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu y col., Cáncer Research, 1993, 53, 3765).

Se conocen en la técnica diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos y col., (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reseñaron la capacidad del monosialogangliósido G I, sulfato de galactocerebrosido y fosfatidilinositol de mejorar las semividas en sangre de liposomas. Estos hallazgos se explicaron tras el documento de Gabizon y col., (Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A.., 1988, 85, 6949). La patente de Estados Unidos n° 4,837,028 y el documento WO 88/04924, ambos de Alien y col., describen liposomas que comprenden (1 ) esfingomielina y (2) el gangliósido Gjor un éster sulfato de galactocerebrosido. La patente de Estados Unidos n° 5,543,152 (Webb y col.,) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1 ,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina se describen en el documento WO 97/13499 (Lim y col.). Se conocen en la técnica muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos, y los procedimientos de preparación de los mismos. Sunamoto y col., (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto PEG. Illum y col., (FEBS Letí., 1984, 167, 79) indicaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado semividas en sangre significativamente potenciadas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) los describe Sears (patentes de Estados Unidos números 4,426,330. y 4,534,899). Klibanov y col., [FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizados con PEG o estearato de PEG tienen incrementos significativos de semividas de circulación en sangre. Blume y col., (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91 ) extendían tales observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, por ejemplo, DSPE - PEG, formados a partir de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen restos PEG unidos covalentemente en su superficie externa se describen en la patente europea n° EP 0 445 131 B1 y documento WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen 1 - 20 moles por ciento de PE derivatizados con PEG, y procedimientos de uso de los mismos, están descritos por Woodle y col., (patentes de Estados Unidos números 5,013,556 y 5,356,633) y Martín y col., (patente de Estados Unidos n° 5,213,804 y patente europea n° EP 0 496 813 B1 ). Los liposomas que comprenden un número de otros conjugados lípido - polímero se describen en el documento WO 91/05545 y la patente de Estados Unidos n° 5,225,212 (ambas de Martín y col) y en el documento WO 94/20073 (Zalipsky y col.,) Los liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados por PEG se describen en el documento WO 96/10391 (Choi y col.) Las patentes de Estados Unidos números 5,540,935 (Miyazaki y col.) y 5,556,948 (Tagawa y col.) describen liposomas que contienen PEG que se pueden derivatizar adicionalmente con restos funcionales en sus superficies. Un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos se conocen en la técnica. El documento WO 96/40062 de Thierry y col., describe procedimientos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La patente de Estados Unidos n° 5,264,221 de Tagawa y col., describe liposomas unidos a proteínas y asegura que el contenido de tales liposomas puede incluir un ARN de polaridad opuesta. La patente de Estados Unidos n° 5,665,710 de Rahman y col., describe ciertos procedimientos de encapsulación de oligodesoxinucleótidos en liposomas. El documento WO 97/04787 de Love y col., describe liposomas que comprenden oligonucleótidos de polaridad opuesta dirigidos al gen raf. Los transfersomas son todavía otro tipo de liposomas, y son agregados de lipidos altamente deformable que son candidatos atractivos para vehículos de distribución de fármaco. Los transfersomas se pueden describir como gotas de lipidos, que son tan altamente deformables que son fácilmente capaces de penetrar a través de poros, que son más pequeños que la gota. Los transfersomas son adaptables al ambiente en el que se usan, por ejemplo, son auto - optimizadores (adaptados a la forma de los poros en la piel), auto - reparadores, frecuentemente alcanzas sus dianas sin fragmentación, y a menudo auto - cargadores. Para preparar transfersomas es posible añadir activadores del borde de la superficie, usualmente tensioactivos, a una composición liposomal patrón. Los transfersomas se han usado para distribuir albúmina sérica a la piel. La distribución mediada por transfersomas de albúmina sérica se ha mostrado que es eficaz como una inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina sérica. Los tensioactivos encuentran amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La forma más común de clasificar y jerarquizar las propiedades de los muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del balance hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como "cabeza") proporciona los medios más útiles para categorizar los distintos tensioactivos usados en formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1988, p. 285). Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y se pueden usar en un amplio intervalo de valores de pH. En general sus valores de HLB varían entre 2 y aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa, y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados, y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también están incluidos en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos. Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como sulfatas de alquilo y sulfatas de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, isetionatos de acilo, tauratos y sulfosuccinatos de acilo, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatas de alquilo y los jabones. Si la molécula de tensioactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase. Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de llevar una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos. Se ha revisado el uso de tensioactivos en productos fármacos, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1988, p. 285).

Potenciadores de penetración En una realización, la presente invención emplea diversos potenciadores de penetración que efectúan la distribución eficaz de ácidos nucleicos particularmente oligonucleótidos, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en formas ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, usualmente solamente los fármacos solubles en lípidos o lipófilos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana a atravesar se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de penetración también potencian la permeabilidad de los fármacos lipófilos. Los potenciadores de penetración se pueden clasificar por ser pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensioactivos no quelantes (Lee y col., Critica! Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de penetración se describe más adelante en mayor detalle. Tensioactivos: en relación con la presente invención, los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa se potencia. Además de las sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato sódico, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter (Lee y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tal como FC-43. Takahashi y col., J. Pharm. Pharmacol., 988, 40, 252). Ácidos grasos: los diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-.rac-glicerol), dilaurin, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo Ci . 0 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo), y mono- y di - glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee y col., Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems, 1991 , p. 92; Muranishi, Crítica! Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems, 990, 7, 1 - 33; El Hariri y col., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651 - 654). Sales biliares: el papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, capítulo 38 en: Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, ed. 9a, Hardman y col., Eds. McGraw - Hill, Nueva York, 1996, pp. 934 - 935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. Así pues el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes de origen natural de bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica farmacéuticamente aceptable, colato sódico), ácido deshidrocólico (deshidrocolato sódico), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polloxietilen-9-lauril éter (POE) (Lee y col., Crítica! Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems, 1991 , página 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 18a, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 782 - 783; Muranishi, Criticaí Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems , 1990, 7, 1 -33; Yamamoto y col., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita y col., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579 - 583).

Agentes quelantes Agentes quelantes, como se usan en relación con la presente invención, se puede definir como compuestos que eliminan los iones metálicos de la solución formando complejos con ellos, con el resultado de que se potencia la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa. Con relación a su uso como potenciadores de penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de la ADNasa, como la mayoría de las ADN nucieasas caracterizadas requieren un ion metálico divalente para catálisis y así pues son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993 618, 315 - 339). Los agentes quelantes de la invención incluyen, pero sin limitación, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N- acilo de colágeno, laureth-9 y N-amino acil derivados de beta -dicetonas (enaminas) (Lee y col., Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , página 92; Muranishi, Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 - 33; Buur y col., J. Control Reí., 1990, 14, 43 -51). No - tensioactivos no - quelantes: como se usa en esta memoria descriptiva, compuestos potenciadores de penetración no - tensioactivos no -quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que no obstante potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 - 33). Esta clase de potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas no saturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee y col., Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , 92); y agentes antiinflamatorios no esteroides tales como diclofenac sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita y col., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621 - 626). Los agentes que potencian la captación de oligonucleótidos a nivel celular también se pueden añadir a las composiciones farmacéuticas y otras de la presente invención. Por ejemplo, los lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Junichi y col., patente de Estados Unidos n° 5,705,188), derivados catiónicos de glicerol, y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo y col., solicitud PCT WO 97/30731), se conocen también por potenciar la captación celular de oligonucleótidos. Se pueden usar otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirróles, tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.

Vehículos Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos vehículo en la formulación. Como se usa en esta memoria descriptiva, "compuesto vehículo" o "vehículo" puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica per se) pero se reconoce como un ácido nucleico mediante procesos in vivo que reducen la biodisponibilldad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica mediante, por ejemplo, la degradación del ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La co - administración de un ácido nucleico y un compuesto vehículo, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñon u otros reservónos extracirculatorios, presumiblemente debido a la competición entre el compuesto vehículo y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido fosforotioato parcialmente en el tejido hepático se puede reducir cuando se co - administra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetam¡do-4- isotiociano-est¡lbeno-2,2'-d¡sulfónico (Miyao y col., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115 - 121 ; Takakura y col., Antisense & Nucí. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177 - 183).

Excipientes En contraste con un compuesto vehículo, un "vehículo farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para distribuir uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera planeada de administración en mente, de manera que proporcione la cantidad deseada, consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero sin limitación, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.,); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato ácido de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.,); disgregantes (por ejemplo, almidón, almidón glicolato sódico, etc.,); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico, etc.). El excipiente orgánico o inorgánico farmacéuticamente aceptable para administración no parenteral, que no reacciona perjudicialmente con ácidos nucleicos, también se puede usar para formular las composiciones de la presente invención. Los vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones de sales, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, paraflna viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinllpirrolidona y similares. Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral, que no reaccionan perjudicialmente con ácidos nucleicos. Los excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones de sales, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinllpirrolidona y similares.

Otros componentes Las composiciones de la presente invención pueden adicionalmente contener otros componentes adjuntos convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así pues, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos tales, como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar, y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no ¡nteractúan perjudicialmente con el (los) ácido (s) nucleico (s) de la formulación. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos de polaridad opuesta y (b) uno u más agentes quimioterapéuticos distintos que funcionan mediante un mecanismo de no polaridad opuesta. Los ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación, fármacos anti -cancerosos tales como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrógeno, clorambucilo, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatina y dietilestilbestrol (DES). Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, ed. 15a, Berkow y col., eds., 1987, Rahway, N. J., páginas 1206 - 1228). Los fármacos antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitación, fármacos antiinflamatorios no esteroides y corticosteroides, y fármacos antivirales, incluyendo pero sin limitación, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también se pueden combinar en las composiciones de la invención. Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, ed. 15a, Berkow y col., eds., 1987, Rahway, N. J., páginas 2499 - 2506 y 46 - 49, respectivamente). Otros compuestos quimioterapéuticos no de polaridad opuesta también están dentro del alcance de la presente invención. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o secuencialmente. En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos de polaridad opuesta, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos de polaridad opuesta adicionales dirigidos a una segunda diana de ácidos nucleico. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de compuestos de polaridad opuesta. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente. La formulación de las composiciones terapéuticas y su administración posterior se cree que está dentro de la habilidad de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y de la sensibilidad del estado patológico a tratar, durando el curso de tratamiento entre varios días a varios meses, o hasta que se efectúa una cura o se logra una disminución del estado patológico. Los programas de dosificación óptima se pueden calcular a partir de mediciones de acumulación de fármacos en el cuerpo del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y generalmente se pueden estimar basándose en los valores de CE50 que se encuentra que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación está entre 0.01 pg y 100 g por kg de peso corporal, y se puede proporcionar una vez o más al día, semanalmente, mensualmente, o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden fácilmente estimar las tasas de repetición para la dosificación basándose en los tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Después de tratamiento exitoso, puede ser deseable tener al paciente sometido a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, en la que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían entre 0.01 pg y 100 g por kg de peso corporal, de una vez o más al día, a una vez cada 20 años. Aunque la presente invención se ha descrito con especificidad de acuerdo a ciertas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no intentan limitar la misma.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Fosforamiditos de nucleósidos para la síntesis de oliqonucleótidos desoxi v 2'-alcoxiam¡ditos Fosforamiditos de 2'-desoxi y 2 -metoxi beta-cianoetildiisopropilo están disponibles en fuentes comerciales (por ejemplo, Chemgenes, Needham MA o Glen Research, Inc. Sterling VA). Otros amiditos de nucleósidos 2'-O-alcoxi sustituidos se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos n° 5,506,351 , incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Para los oligonucleótidos sintetizados usando 2'-alcoxi amiditos, se utiliza el ciclo habitual para oligonucleótidos no modificados, excepto que la etapa de espera después de la distribución por pulsos de tetrazol y base se incrementa hasta 360 segundos. Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-Me-C) se sintetizan según procedimientos publicados [Sanghvi, y col., Nucleic Acids Research, 1993, 21 , 3197 - 3203] usando fosforamiditos disponibles comercial mente (Glen Research, Sterling VA o ChemGenes, Needham MA). 2'-Fluoroamid¡tos 2'Fluorodesoxiadenosinaamiditos Los 2'-fluorooligonucleótidos se sintetizan como se ha descrito previamente [Kawasaki, y col., J. Med. Chem., 1993, 36, 831 - 841] y la patente de Estados Unidos n° 5,670,633, incorporados en esta memoria descriptiva como referencia. En resumen, el nucleósido protegido N6-benzoil-2'-desoxi-2'- fluoroadenosina se sintetiza utilizando 9-beta-D-arabinofuranosiladenina comercialmente disponible como material de partida y modificando los procedimientos de la bibliografía en los que el átomo 2'-alfa-fluoro se introduce mediante un desplazamiento SN2- de un grupo 2'-beta-tritilo. Así pues N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina se protege selectivamente con rendimiento moderado como el intermedio 3',5'-ditetrahidropiranilo (THP). La desprotección de los grupos THP y N6-benzoílo se logra usando la metodología habitual y se usan procedimientos habituales para obtener los intermedios 5'-dimetox¡trit¡l-(DMT) y 5'-DMT-3'-fosforamidito. 2'-fluorodesoxiguanosina La síntesis de 2'-desoxi-2'-fluoroguanosina se logra usando 9-beta-D- arabinofuranosilguanina tetraisopropildisiloxanil (TPDS) protegido como material de partida, y conversión en el intermedio diisobutirilarabinofuranosilguanosina. A la desprotección del grupo TPDS sigue la protección del grupo hidroxilo con THP proporcionando arabinofuranosilguanina protegido con diisobutiril di- THP. A la O-desacilación selectiva y triflación sigue el tratamiento del producto bruto con fluoruro, después la desprotección de los grupos THP. Las metodologías habituales se usan para obtener los 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditos. 2'-Fluorouridina Síntesis de 2'-desoxi-2'-fluorouridina se logra mediante la modificación de un procedimiento de la bibliografía en el que 2,2'-anhidro-1-beta-D- arabinofuranosiluracilo se trata con fluoruro de hidrógeno al 70% -pirdina. Los procedimientos habituales se usan para obtener los 5'-DMT y 5'- DMT-3'-fosforamiditos. 2'-Fluorodesox¡citidina 2'-desox¡-2'-fluoroc¡t¡dina se sintetiza mediante la aminación de 2'- desox¡-2'-fluorouridina, seguido de protección selectiva proporcionando N4-benzoil-2'-desoxi-2'-fluorocit¡dina. Los procedimientos habituales se usan para obtener los 5'-DMT y 5'-DMT-3'-fosforamiditos.

Amiditos 2'-0-(2-Metoxietil) modificados Los amiditos de nucleósidos 2'-0-metoxietil sustituidos se preparan como sigue, o como alternativa, según los procedimeintos de Martín, P., Helvética Chimica Acta, 1995, 78, 486 - 504. 2,2'-Anhidroí1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metilur¡dinel 5-Metiluridina (ribosiltimina, comercialmente disponible a través de Yamasa, Choshi, Japón) (72.0 g, 0.279 M), difenilcarbonato (90.0 g, 0.420 M) y bicarbonato sódico (2.0 g, 0.024 M) se añadieron a DMF (300 mi). La mezcla se calienta a reflujo, con agitación, dejando que el gas dióxido de carbono desprendido se libere de una manera controlada. Después de 1 hora, la solución oscurecida ligeramente se concentra a presión reducida. El jarabe resultante se vierte en dietiléter (2.5 I), con agitación. El producto formado es una goma. El éter se decanta y el residuo se disuelve en una cantidad mínima de metanol (aproximadamente 400 mi). La solución se vierte en éter recién preparado (2.5 I) produciendo una goma rígida. El éter se decanta y la goma se seca en un horno de vacío (60°C a 1 mm de Hg durante 24 horas) proporcionando un sólido que se tritura hasta un polvo de color castaño claro. El material se usa como está para reacciones posteriores (o se puede purificar adicionalmente mediante cromatografía en columna usando un gradiente de metanol en acetato de etilo (10 - 25%) proporcionando un sólido blanco. 2'-0-Metoxietil-5-metiluridina 2,2'-Anhidro-5-metiluridina (195 g, 0.81 M), tris(2-metoxietil)borato (231 g, 0.98 M) y 2-metoxietanol (1.2 I) se añaden a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 I y se sitúan en un baño de aceite precalentado a 60°C. Después de calentar durante 48 horas a 155 -160°C, el recipiente se abre y la solución se evapora hasta sequedad y se tritura con eOH (200 mi). El residuo se suspende en acetona caliente (1 I). Las sales insolubles se filtran, se lavan con acetona (150 mi) y se evapora ei filtrado. El residuo (280 g) se disuelve en CH3CN (600 mi) y se evapora. Se compacta una columna de gel de sílice (3 kg) en ChbCb/acetona/MeOH (20:5:3) conteniendo Et3NH al 0.5%. El residuo se disuelve en CH2CI2 (250 mi) y se adsorbe sobre sílice (150 g) antes de cargar en la columna. El producto se eluye con el disolvente de compactación proporcionando el compuesto del título. Se puede obtener material adicional con un reprocesamiento de las fracciones impuras. 2'-0-Metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metiluridina 2'-0-metox¡etil-5-metilur¡dina (160 g, 0.506 M) se co - evapora con piridina (250 mi) y el residuo seco se disuelve en piridina (1.3 I). Se añade una primera alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94.3 g, 0.278 M) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante una hora. Se añade una segunda alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94.3 g, 0.278 M) y la reacción se agita durante una hora adicional. Después se añade metanol (170 mi) para detener la reacción. Se evapora el disolvente y se tritura con CH3CN (200 mi). El residuo se disuelve en CHCI3 (1.5 I) y se extrae con 2 x 500 mi de NaHC03 saturado y 2 x 500 mi de NaCI saturado. La fase orgánica se seca sobre Na2S04, se filtra y se evapora. El residuo se purifica sobre una columna de gel de sílice de 3.5 kg, se compacta y se eluye con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1 ) conteniendo ??ß?? al 0.5%. Las fracciones puras se evaporan proporcionando el producto del título. 3'-0-Acetil-2'-0-metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metiluridina 2'-0-Metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metilur¡dina (106 g, 0.167 M), DMF/piridina (750 mi de una mezcla 3:1 preparada a partir de 562 mi de DMF y 188 mi de piridina) y anhídrido acético (24.38 mi, 0.258 M) se combinan y se agitan a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se controla mediante TLC ¡nactivando primero la muestra de TLC con la adición de MeOH. Después de la terminación de la reacción, según se juzga mediante TLC, se añade MeOH (50 mi) y la mezcla se evapora a 35°C. El residuo se disuelve en CHCI3 (800 mi) y se extrae con 2 x 200 mi de bicarbonato sódico saturado y 2 x 200 mi de NaCI saturado. Las fases acuosas se vuelven a extraer con 200 mi de CHCI3. Las fases orgánicas combinadas se secan con sulfato sódico y se evaporan hasta un residuo. El residuo se purifica sobre una columna de gel de sílice de 3.5 kg y se eluye usando EtOAc/hexano (4:1 ). Las fracciones del producto puro se evaporan produciendo los compuestos del título. 3'-0-acetil-2'-0-metoxietil-5'-Q-dimetoxitritil-5'-metil-4-triazoluridina Una primera solución se prepara disolviendo 3'-0-acetil-2'-0-metoxietil- 5'-0-dimetoxitritil-5-metilurid¡na (96 g, 0.144 M) en CH3CN (700 mi) y se deja aparte. Se añade trietilamina (189 mi, 1.44 ) a una solución de triazol (90 g, 1.3 M) en CH3CN (1 I), se enfría hasta -5°C y se agita durante 0.5 horas usando un agitador en la parte superior. Se añade gota a gota POCI3, durante un período de 30 minutos, a la solución agitada mantenida a 0 - 0°C, y la mezcla resultante se agita durante 2 horas adicionales. La primera solución se añade gota a gota, durante un período de 45 minutos, a la última solución. La mezcla de reacción resultante se almacena durante toda una noche en una habitación fría. Las sales se filtran de la mezcla de reacción y la solución se evapora. El residuo se disuelve en EtOAc (1 I) y los sólidos insolubles se retiran por filtración. El filtrado se lava con 1 x 300 ml de NaHC03 y 2 x 300 ml de NaCI saturado, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. El residuo se tritura con EtOAc proporcionando el compuesto del título. 2'-Q-metoxietil-5'-Q-dimetoxitrit¡l-5-metilcitidina Una solución de 3'-0-acetil-2'-0-metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metil-4- triazoluridina (103 g, 0.141 ) en dioxano (500 mi) y NH4OH (30 mi) se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de dioxano se evapora y el residuo se destila azeotrópicamente con MeOH (2 x 200 mi). El residuo se disuelve en MeOH (300 mi) y se transfiere a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 litros. Se añade MeOH (400 mi) saturado con gas NH3 y el recipiente se calienta hasta 100°C durante 2 horas (TLC mostró conversión completa). Los contenidos del recipiente se evaporan hasta sequedad y el residuo se disuelve en EtOAc (500 mi) y se lava una vez con NaCI saturado (200 mi). Los extractos orgánicos se secan sobre sulfato sódico y el disolvente se evapora proporcionando el compuesto del título.

N4-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina 2'-O-metoxietil-5'-O-d¡metoxitrit¡l-5-metilcitidina (85 g, 0.134 M) se disuelve en DMF (800 mi) y se añade anhídrido benzoico (37.2 g, 0.165 M) con agitación. Después de agitar durante 3 horas, la TLC mostró que la reacción estaba aproximadamente 95% completa. El disolvente se evaporó y el residuo se destiló azeotrópicamente con MeOH (200 mi). El residuo se disolvió en CHCI3 (700 mi) y se extrajo con NaHCO3 saturado, (2 x 300 mi) y NaCI saturado (2 x 300 mi), se secó sobre MgS04 y se evaporó proporcionando un residuo. El residuo se cromatografía sobre una columna de sílice de 1.5 kg usando EtOAc/hexano (1 :1) conteniendo Et3NH al 0 - 5% como disolvente de elución. Las fracciones del producto puro se evaporan proporcionando el compuesto del título.

N4-Benzoil-2'-Q-metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3'-amidito N4-Benzo¡l-2'-0-metoxietil-5'-0-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0.10 M) se disuelve en CH2CI2 (1 I). Se añaden con agitación tetrazoldiisopropilamina (7.1 g) y 2- cianoetoxi-tetra(isopropü)fosfito (40.5 mi, 0.123 M), en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agita durante 20 horas a temperatura ambiente (TLC mostró que la reacción estaba 95% completa). La mezcla de reacción se extrae con NaHC03 saturado (1 x 300 mi) y NaCI saturado (3 x 300 mi). Los lavados acuosos se vuelven a extraer con CH2CI2 (300 mi), y los extractos se combinan, se secan sobre MgS04 y se concentran. El residuo obtenido se cromatografía sobre una columna de sílice de 1.5 kg usando EtOAc/hexano (3:1) como el disolvente de elución. Las fracciones puras se combinan proporcionando el compuesto del título.

Amiditos de 2'-O-(aminoox¡eti0nucleós¡do y amiditos de 2'-Q-(dimetilaminooxietiQnucleósido Amiditos de 2'-(dimetilaminoox¡etoxi)nucleósido Amiditos de 2'- (dimetilaminooxietoxi)nucleósido [también conocidos en la técnica como amiditos de 2'-0-(dimetilaminooxietiI)nucleósido] se preparan como se describe en los siguientes párrafos. Amiditos de nucleósidos de adenosina, citidina y guanosina se preparan de manera similar al de la timidina (5-metiluridina) excepto que las aminas exocílicos se protegen con un resto benzoílo en el caso de adenosina y citidina y con isobutirilo en el caso de guanosina. 5'-Q-terc-Butildifenilsilil-02-2'-anhidro-5-metiluridina 02-2'-anhidro-5-met¡Iuridina (Pro. Bio. Sint., Várese, Italia, 100.0 g, 0.46 mmoles), dimetilaminopiridina (0.66 g, 0.013 eq, 0.0054 mmoles) se disuelven en piridina seca (500 mi) a temperatura ambiente en una atmósfera de argón y con agitación mecánica. Se añade terc-butildifenilclorosilano (125.8 g, 119.0 mi, 1.1 eq, 0.458 mmoles) de una vez. La reacción se agita durante 16 horas a temperatura ambiente. TLC (Rf 0.22, acetato de etilo) indicó una reacción completa. La solución se concentra a presión reducida hasta un aceite espeso. Éste se reparte en diclorometano (1 I) y bicarbonato sódico saturado (2 x 1 I) y salmuera (1 I). La fase orgánica se seca sobre sulfato sódico y se concentra a presión reducida hasta un aceite espeso. El aceite se disuelve en una mezcla 1 :1 de acetato de etilo y éter etílico (600 mi) y la solución se enfría hasta -10°C. El producto cristalino resultante se recoge por filtración, se lava con éter dietílico (3 x 200 mi), y se seca (40°C, 1 mm de Hg (0.13 kPa), 24 horas) hasta un sólido blanco. 5'-0-terc-Butildifenilsilil-2'-Q-(2-hidroxietin-5-metiluridina En un reactor a presión sin agitación de acero inoxidable de 2 I, se añade borano en tetrahidrofurano (1.0 M, 2.0 eq. 622 mi). En la campana de extracción y con agitación manual se añade etilenglicol (350 mi, exceso) cuidadosamente al principio hasta que disminuye el desprendimiento del gas hidrógeno. Se añaden 5'-0-terc-Butildifen'ilsi il-02-2'anhidro-5-meti!uridina (149 g, 0.3? moles) y bicarbonato sódico (0.074 g, 0.003 eq) con agitación manual. El reactor se sella y se calienta en un baño de aceite hasta que se alcanza una temperatura interna de 160°C y después se mantiene durante 16 horas (presión < 100 psig (689.66 kPa)). El recipiente de reacción se enfría hasta temperatura ambiente y se abre. TLC (Rf 0.67 para el producto deseado y Rf 0.82 para el producto secundario ara-T, acetato de etilo) indicó aproximadamente 70% de conversión al producto. Con el fin de evitar la formación adicional del producto secundario, la reacción se detiene, se concentra a presión reducida (10 a 1 mm, Hg) (1.33 a 0.13 kPa) en un baño de agua caliente (40 - 100°C) con las condiciones más extremas usadas para retirar el etilenglicol. [Como alternativa, una vez que el disolvente de bajo punto de ebullición se ha ido, la solución restante se puede repartir entre acetato de etilo y agua. El producto estará en la fase orgánica]. El residuo se purifica mediante cromatografía en columna (2 kg de gel de sílice, gradiente de acetato de etilo - hexanos 1 :1 a 4:1). Las fracciones apropiadas se combinan, se destilan y se secan hasta un producto en forma de una espuma crujiente de color blanco, material de partida contaminado, y material de partida puro reutilizable. 2'-0-fr2-ftal¡midox¡)et¡n-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina 5'-0-terc-Butildifenils¡lil-2'-0-(2-hidrox¡etil)-5-metilurid¡na (20 g, 36.98 mmoles) se mezcla con trifenilfosfina ( 1.63 g, 44.36 mmoles) y N-hidroxiftalimida (7.24 g, 44.36 mmoles). Después se seca sobre P205 a alto vacío durante dos días a 40°C. La mezcla de reacción se purga con argón y se añade THF seco (369.8 mi, Aldrich, botella de cierre seguro) consiguiendo una solución transparente. Se añade gota a gota dietil-azodicarboxilato (6.98 mi, 44.36 mmoles) a la mezcla de reacción. La velocidad de adición se mantiene de manera que la coloración rojo oscura resultante desaparece justo antes de añadir la siguiente gota. Después de que la adición se ha completado, la reacción se agita durante 4 horas. En ese tiempo la TLC mostró la finalización de la reacción (acetato de et¡lo:hexano, 60:40). El disolvente se evapora a vacío. El residuo obtenido se coloca sobre una columna ultra - rápida y se eluye con acetato de etilo:hexano (60:40), consiguiendo 2'-0-([2- ftalimidooxi)etil]-5'-t-butildifeniIsiIil-5-metiluridina en forma de una espuma blanca. 5'-0-terc-butildifenilsilil-2'-0-[(2-formadoximinooxi)etin-5-metiluridina 2'-0-([2-ftal¡midoxi)etil]-5'-t-but¡ldifen¡ls¡l¡l-5-metilur¡d¡na (3.1 g, 4.5 mmoles) se disuelve en CH2CI2 seco (4.5 mi) y se añade gota a gota metilhidrazina (300 mi, 4.64 mmoles) a -10°C a 0°C. Después de 1 hora la mezcla se filtra, el filtrado se lava con CH2CI2 enfriado en hielo y la fase orgánica combinada se lava con agua, salmuera y se seca sobre Na2S04 anhidro. La solución se concentra consiguiendo 2'-0(aminooxietil)timidina, que después se disuelve en MeOH (67.5 mi). A esto se añade formaldehído (solución acuosa al 20%, p/p, 1.1 eq) y la mezcla resultante se agita durante 1 hora. Se retira el disolvente a vacío; el residuo se cromatografía consiguiendo 5'-O- terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina en forma de una espuma blanca. 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-rN,N-dimetilaminooxietin-5-metiluridina 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoxim¡nooxi)et¡l]-5-metiluridina (1.77 g, 3.12 mmoles) se disuelve en una solución de p-toluenosulfonato de piridinio (PPTS) 1 M en MeOH seco (30.6 mi). Se añade a esta solución cianoborohidruro sódico (0.39 g, 6.13 mmoles) a 10°C en atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agita durante 10 minutos a 10°C. Después de eso el recipiente de reacción se retira del baño de hielo y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción se controla mediante TLC (MeOH al 5% en CH2CI2). Se añade solución acuosa de NaHC03 (5%, 10 mi) y se extrae con acetato de etilo (2 x 20 mi). La fase de acetato de etilo se seca sobre Na2S04 anhidro y se evapora hasta sequedad. El residuo obtenido se disuelve en una solución de PPTS 1 M en MeOH (30.6 mi). Se añade formaldehído (20% p/p, 30 mi, 3.37 mmoles) y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se enfría hasta 10°C en un baño de hielo, se añade cianoborohidruro de sodio (0.39 g, 6.13 mmoles), y la mezcla de reacción se agita a 10°C durante 10 minutos. Después de 10 minutos, la mezcla de reacción se retira del baño de hielo y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. A la mezcla de reacción se añade solución de NaHC03 al 5% (25 mi) y se extrae con acetato de etilo (2 x 25 mi). La fase de acetato de etilo se seca sobre Na2S04 anhidro y se evapora hasta sequedad. El residuo obtenido se purifica mediante cromatografía en columna ultra - rápida y se eluye con MeOH al 5% en CH2CI2 consiguiendo 5'-O- terc-butildifenils¡lil-2'-0- [?,?-dimetilaminooxietil]- 5-metiluridina en forma de una espuma blanca. 2'-Q-rdimetilaminooxietin-5-metiluridina Se disuelve trifluorohidrato de trietilamina (3.91 mi, 24.0 mmoles) en THF seco y trietilamina (1.67 mi, 12 mmoles, seca, mantenida sobre KOH). Después esta mezcla de trietilamina - THF se añade a 5 -0- terc-butildifenilsilil^'-O-fN.N-dimetilaminooxieti -S-metiluridina (1.40 g, 2.4 mmoles) y se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se controla mediante TLC (MeOH al 5% en CH2CI2). Se retira el disolvente a vacío y el residuo se coloca en una columna ultra - rápida y se eluye con MeOH al 10% en CH2CI2 consiguiendo 2'-0-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina. 5'-0-DMT-2'-0-(dimetilaminooxiet¡n-5-metilur¡d¡na 2'-0-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (750 mg, 2.17 mmoles) se seca sobre P2O5 a alto vacío durante toda una noche a 40°C. Después se co - evapora con piridina anhidra (20 mi). El residuo obtenido se disuelve en piridina (11 mi) en atmósfera de argón. Se añade 4-dimetilaminopiridina (26.5 mg, 2.60 mmoles), cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (880 mg, 2.60 mmoles) a la mezcla y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente hasta que todo el material de partida desaparece. Se retira la piridina a vacío y el residuo se cromatografía y se eluye con MeOH al 10% en CH2CI2 (conteniendo unas pocas gotas de piridina) consiguiendo 5'-0-DMT-2'-0(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina. 5'-0-DMT-2'-0-(2-N,N-dimetilaminooxietin-5-metiluridina-3'-r(2-cianoetiO-N.N-diisopropilfosforamiditol 5'-0-DMT-2'-0-(dimetiIaminooxietil)-5-metiIuridina (1.08 g, 1.67 mmoles) se co - evapora con tolueno (20 mi). Al residuo se añade N,N-diisopropilamina tetrazonida (0.29 g, 1.67 mmoles) y se seca sobre P20, a alto vacío durante toda una noche a 40°C. Después la mezcla de reacción se disuelve en acetonitrilo anhidro (8.4 mi) y se añade 2-cianoetil-N,N,N1 N1-tetraisopropilfosforamidito (2.12 mi, 6.08 mmoles). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 horas en atmósfera inerte. El progreso de la reacción se controla mediante TLC (hexano:acetato de etilo 1:1). El disolvente se evapora. Después el residuo se disuelve en acetato de etilo (70 mi) y se lava con NaHC03 acuoso al 5% (40 mi). La fase de acetato de etilo se seca sobre Na2S04 anhidro y se concentra. El residuo obtenido se cromatografía (acetato de etilo como eluyente) consiguiendo 5'-0-DMT-2'-0-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoet¡l)-N,N-diisopropilfosforamidito] en forma de una espuma.

Amiditos de 2'-(aminooxietoxi) nucleósido Amiditos de 2'-(aminooxietoxi) nucleósido [también conocidos en la técnica como amiditos de 2'-0-(aminooxietil) nucleósido] se preparan como se describe en los siguiente párrafos. Amiditos de nucleósidos de adenosina, citidina y timidina se preparan de manera similar.

N2-¡sobut¡ril-6-0-d¡fenilcarbamoil-2'-Q-(2-etilacet¡n-5'-0-í4,4'-dimetoxitritinquanosina-3'-r(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidito1 El análogo de 2'-0-aminooxietil guanosina se puede obtener mediante 2'-0-alquilación selectiva de diaminopurina ribósido. Cantidades multigramos de diaminopurina ribósido se puede comprar en Schering AG (Berlín) proporcionando 2'-0-(2-etilacetil) diaminopurina ribósido junto con una cantidad minoritaria del 3'-0-isómero. 2'-0-(2-etilacetil) diaminopurina ribósido se puede resolver y convertir en 2'-0-(2-etilacetil)guanosina mediante tratamiento con adenosina desaminasa. (McGee, D. P. C, Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 A1 940203.) Los procedimientos habituales de protección deben producir 2'-0-(2-et'ilacetil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina y 2-N-isobutiril-6-0- difenilcarbamoil-2'-0-(2-etilacetil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina que se pueden reducir proporcionando 2-N-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-0-(2- etilacetil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina. Como antes el grupo hidroxilo se puede desplazar mediante N-hidroxiftalimida por medio de una reacción Mitsunobu, y el nucleósido protegido se puede fosfitilar de la manera usual produciendo 2-N-isobutiril-6-0-difenilcarbamoil-2'-0-(2-etilacetil)-5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamiditel.

Amiditos de nucleósido 2'-d¡met¡laminoetoxietoxi (2'-??????') Amiditos de nucleósido 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocidos en la técnica como 2'-0-dimetilaminoetoxietilo, es decir 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2)2, o amiditos de nucleósido 2'-DMAEOE) se preparan como sigue. Otros amiditos de nucleósido se preparan de manera similar. 2'-0-r2(2-N,N-d¡metilaminoetoxi)et¡n-5-metil uridina 2[2-(Dimetilamino)etoxi]etanol (Aldrich, 6.66 g, 50mmoles) se añade lentamente a una solución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 10 mi, 10 mmoles) con agitación en una reactor de 100 mi. El gas hidrógeno se desprende a medida que el sólido se disuelve. 0 -,2'-anhidro-5-metiIuridina (1.2 g, 5 mmoles), y bicarbonato sódico (2.5 mg) se añaden y se sella el reactor, se coloca en un baño de aceite, y se calienta hasta 155°C durante 26 horas. El reactor se enfría hasta temperatura ambiente y se abre. La solución bruta se concentra y el residuo se reparte entre agua (200 mi) y hexanos (200 mi). El exceso de fenol se extrae en la fase de hexano. La fase acuosa se extrae con acetato de etilo (3 x 200 mi) y las fases orgánicas combinadas se lavan una vez con agua, se secan sobre sulfato sódico anhidro y se concentran. El residuo se somete a una cromatografía en columna sobre gel de sílice usando metanol/cloruro de metileno 1 :20 (que tiene trietilamina al 2%) como eluyente. A medida que las fracciones de la columna se concentran se forma un sólido incoloro que se recoge proporcionando el compuesto del título en forma de un sólido blanco. 5'-0-dimetoxitritil-2'-0-r2(2-N,N-dimetilaminoetoxi^etini-5-metil uridina A 0.5 g (1.3 mmoles) de 2'-0-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metil uridina en piridina anhidra (8 mi), se añaden trietilamina (0.36 mi) y cloruro de dimetoxitritilo (DMT-CI, 0.87 g, 2 eq.) y se agitan durante 1 hora. La mezcla de reacción se vierte en agua (200 mi) y se extrae con CH2CI2 (2 x 200 mi). Las fases de CH2CI2 combinadas se lavan con NaHC03 saturado, seguido de NaCI saturado y se secan sobre sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente seguido de cromatografía sobre gel de sílice usando MeOH: CH2CI2:Et3N (20:1 , v/v, con trietilamina al 1%) proporciona el compuesto del título. 5'-O-Dimetoxitritil-2'-0-f2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)et¡m-5-met¡l uríd¡na-3'-O-fc¡anoetil-N,N-diisoproDinfosforamidito Diisopropilaminotetrazolida (0.6 g) y fosforamidito de 2-cianoetoxi-?,?- diisopropilo (1.1 mi, 2 eq.) se añaden a una solución de 5'-0-dimetox¡tritil-2'-O- [2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metilur¡dina (2.17 g, 3 mmoles) disuelto en CH2CI2 (20 mi) en una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agita durante toda una noche y se evapora el disolvente. El residuo resultante se purifica mediante cromatografía en columna ultra -rápida sobre gel de sílice con acetato de etilo como eluyente proporcionando el compuesto del título.

EJEMPLO 2 Síntesis de oligonucleótidos Los oligonucleótidos fosfodiéster no sustituidos y sustituidos (P = O) se sintetizan en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 380B) usando la química de fosforamidito habitual con oxidación por yodo. Los fosforotioatos (P = S) se sintetizan como para los oligonucleótidos fosfodiéster excepto que la botella de oxidación habitual se reemplaza por solución 0.2 M de 1 , -dióxido de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la tiación en varias etapas de los enlaces de fosfito. La etapa de espera de tiación se incrementa hasta 68 segundos y le sigue la etapa de poner remate. Después de la escisión de la columna de CPG y desbloqueo en hidróxido amónico concentrado a 55°C (18 horas), los oligonucleótidos se purifican precipitando dos veces con 2.5 volúmenes de etanol a partir de una solución de NaCI 0.5 M. Los oligonucleótidos fosfinato se preparan como se ha descrito en la patente de Estados Unidos n° 5,508,270, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos alquilfosfonato de alquilo se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos n° 4,469,863, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos 3'-desoxi-3'-metileno fosfonato se preparan como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5,610,289 ó 5,625,050, incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos fosforamidito se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos número 5,256,775 ó la patente de Estados Unidos número 5,366,878, incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos alquilfosfonotioato se preparan como se describe en los documentos WO 94/17093 y WO 94/02499 incorporados en esta memoria descriptiva como referencia.

Los oligonucleótidos 3'-desox¡-3'-amino fosforamidato se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos número 5,476,925, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos fosfotriéster se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos número 5,023,243, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleótidos borano fosfato se preparan como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5,130,302 y 5,177,198, ambas incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia.

EJEMPLO 3 Síntesis de oligonucleósidos Los oligonucleósidos unidos a metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos unidos a MMl, oligonucleósidos unidos a metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos a MDH, y oligonucleósidos unidos a metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-3, y oligonucleósidos unidos a metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-4, así como compuestos de la estructura principal mixta que tienen, por ejemplo, enlaces MMl y enlaces P = O o P = S alternos se preparan como se describe en las patentes números 5,378,825; 5,386,023; 5,489,677; 5,602,240; y 5,610,289, todas las cuales se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleósidos unidos a formacetal y tioformacetai se preparan como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5,264,562 y 5,264,564, incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia. Los oligonucleósidos unidos a óxido de etileno se preparan como se describe en la patente de Estados Unidos número 5,223,618, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia.

EJEMPLO 4 Síntesis de PNA Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) se preparan de acuerdo a cualquiera de los diversos procedimientos mencionados en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and potencial Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 523. También se pueden preparar de acuerdo a las patentes de Estados Unidos números 5,539,082; 5,700,922; y 5,719,262, incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia.

EJEMPLO 5 Síntesis de oligonucleótidos quiméricos Los oligonucleótidos, oligonucleósidos o mezclas de oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos de la invención pueden ser de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo en el que el segmento "hueco" de los nucleósidos unidos se posiciona entre los segmentos "ala" 5' y 3' de los nucleósidos unidos y un segundo tipo de "extremo abierto" en el que el segmento "hueco" se localiza en cualquiera de los extremos 3' ó 5' del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo se conocen también en la técnica como "gapmeros" u oligonucleótidos con gap (hueco). Los oligonucleótidos del segundo tipo también se conocen en la técnica como "hemimeros" o "wingmeros".

Oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato de G2'-0-?T1--G2'-desoxil- -r2'-Q-Me1 Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótidos de fosforotioato de 2'-0-alquilo y fosforotioato de 2'-desoxi se sintetizan usando un sintetizador de ADN automático de Applied Biosystems modelo 380B, como se ha indicado anteriormente. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automático y 2'-desoxi-5'-d¡metoxitritil-3'-0-fosforamidito para la parte de ADN y 5'-dimetoxitritil-2'-0-metil-3'-0- fosforamidito para las alas 5' y 3'. El ciclo de síntesis habitual se modifica aumentando la etapa de espera después de la distribución de tetrazol y base a 600 segundos repetida cuatro veces para el ARN y dos veces para 2 -0-metilo. El oligonucleótido completamente protegido se escinde del soporte y el grupo fosfato se desprotege en amoníaco:etanol 3:1 a temperatura ambiente durante toda una noche después se liofiliza hasta sequedad. El tratamiento en amoníaco metanólico durante 24 horas a temperatura ambiente se hace después para desproteger todas las bases y la muestra se liofiliza otra vez hasta sequedad. El sedimento se vuelve a suspender en TBAF 1 M en THF durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. Después la reacción se inactiva con TEAA 1 M y la muestra después se reduce hasta la mitad de volumen mediante un rotavapor antes de desalarse sobre una columna de exclusión por tamaño G25. El oligo recuperado después se analiza espectrofotométricamente respecte al rendimiento y la purificación mediante electroforesis capilar y mediante espectrometría de masas.

Oliqonucleótidos quiméricos de fosforotioato de [2'-Q-(2-Metoxietil)l-r2'-desox¡1-r2'-Q-(metox¡etilo1 Los oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato de [2'-0-(2-metoxietil)]- [2'-desoxi]-[2'-0-(metoxietilo)] se preparan según el procedimiento anterior para el oligonucleótido quimérico de 2'-0-metilo, los oligonucleótidos de forotioato se preparan según el procedimiento anterior sustituyendo ios 2 -O-metilamiditos por los 2'-0- (metoxietil) los amiditos.

Oligonucleótidos quiméricos de f2'-Q-(2-Metoxietil)fosfodiéster1--r2'-desox¡ fosforotioatol--r2'-0-(2-metoxietil)1fosfodiéster1 Los oligonucleótidos quiméricos de [2'-0-(2-metoxietil) fosfodiéster]- -[2'- desoxi fosforotioato]-[2'-0-(metoxietil) fosfodiéster] se preparan según el procedimiento anterior para el oligonucleótido quimérico de 2'-0-metilo, con la sustitución de amiditos de 2'-0-metilo por los amiditos de 2'-0-(metoxietilo), oxidación con yodo para generar los enlaces entre nucleótidos de tipo fosfodiéster en las partes de ala de las estructuras quiméricas y sulfurización utilizando 1,1 dióxido de 3.H-1 ,2-benzoditiol-2-ona (reactivo Beaucage) para generar los enlaces internucleótido de tipo fosforotioato para el hueco central. Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y las mezclas de oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos se sintetizan según la patente de Estados Unidos n° 5,623,065, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia.

EJEMPLO 6 Aislamiento de oligonucleótidos Después de la escisión de la columna de vidrio porosa controlada (Applied Biosystems) y desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55°C durante 18 horas, los oligonucleótidos u oligonucleósidos se purifican mediante precipitación dos veces con NaCI 0.5 M con 2.5 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida sobre geles desnaturalizantes y se juzga que es al menos 85% de material de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidos en la síntesis se comprueban periódicamente mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear "P, y para algunos estudios los oligonucleótidos se purifican mediante HPLC, como describen Chiang y col., J. Biol. Chem. 1991 , 266, 18162 - 18171.

EJEMPLO 7 Síntesis de oligonucleótidos - formato de placas de 96 pocilios Los oligonucleótidos se sintetizan mediante la química de fosforamidito de fase sólida P (III) sobre un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato patrón de 96 pocilios. Los enlaces internucleótidos de tipo fosfodiéster se producen mediante oxidación con yodo acuoso. Los enlaces internucleótidos de tipo fosforotioato se generan mediante sulfurización utilizando 1 ,1 -dióxido de 3,H-1 ,2-benzoditiol-3-ona (reactivo de Beaucage) en acetonitrilo anhidro. Los fosforamiditos de beta-cianoetildiisopropilo protegidos con bases convencionales se pueden comprar en vendedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleósidos no habituales se sintetizan como se conoce en la bibliografía o procedimientos patentados. Se utilizan como fosforamiditos de beta-cianoetildiisopropilo protegidos con bases. Los oligonucleótidos se escinden del soporte y se desprotegen con NH4OH concentrado a temperatura elevada (55 - 60°C) durante 12 - 16 horas y después el producto liberado se seca a vacío. Después el producto seco se vuelve a suspender en agua estéril produciendo una placa maestra a partir de la cual todas las muestras de placas de ensayo y analíticas se diluyen después utilizando pipeteadores robóticos.

EJEMPLO 8 Análisis de oligonucleótidos en formato de placas de 96 pocilios La concentración de oligonucleótidos en cada pocilio se determina mediante dilución de las muestras y espectroscopia de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se evalúa mediante electroforesis capilar (CE) en bien formato de 96 pocilios (Beckman P/ACE ™ MDQ) o, para muestras preparadas individualmente, sobre un aparato de CE comercial (por ejemplo, Beckman P/ACE ™ 5000, ABI 270). Las composiciones de bases y estructura principal se confirman mediante análisis de masa de los compuestos utilizando espectroscopia de masas por electropulverización. Todas las placas analizadas de ensayo se diluyen a partir de la placa maestra usando pipeteadores robóticos de canales múltiples de un solo canal. Las placas se juzga que son aceptables si al menos el 85% de los compuestos sobre la placa son al menos 85% de longitud completa.

EJEMPLO 9 Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos El efecto de compuestos de polaridad opuesta sobre la expresión de un ácido nucleico diana se puede analizar en cualquiera de una diversidad de tipos de células con tal que el ácido nucleico diana esté presente a niveles medlbles. Esto se puede determinar rutinariamente usando, por ejemplo, PCR o análisis de transferencia de Northern. Los siguientes 6 tipos de células se proporcionan para propósitos ilustrativos, pero se pueden usar rutinariamente otros tipos de células, con tal que la diana se exprese en el tipo elegido de célula. Esto se puede determinar fácilmente mediante procedimientos rutinarios en la técnica, por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, ensayos de protección de ribonucleasa, o RT - PCR.

Células T - 24 La línea celular T - 24 de carcinoma humano de vejiga de células de transición se obtiene de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las células T - 24 se cultivan de manera rutinaria en medio basal 5A de McCoy completo (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por mi, y 100 microgramos de estreptomicina por mi (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se subcultivan rutinariamente mediante tripsinización y dilución cuando alcanzan 90% de confluencia. Las células se siembran en placas de 96 pocilios (Falcon - Primaria n° 3872) a una densidad de 7000 células/pocilio para uso en análisis de RT - PCR. Para transferencia de Northern u otro análisis, las células se pueden sembrar en placas de cultivo de tejidos de 100 mm u otra habitual y tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.

Células A549: La línea celular A549 de carcinoma humano de pulmón se puede obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las células A549 se cultivan de manera rutinaria en medio basal de DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por mi, y 100 microgramos de estreptomicina por mi (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se subcultivan rutinariamente mediante tripsinización y dilución cuando alcanzan 90% de confluencia.

Células NHDF: Fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF) se pueden obtener de Clonetics Corporation (Walkersville MD). Los NHDF se mantienen rutinariamente en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville MD) suplementado como recomienda el proveedor. Las células se mantienen durante hasta 10 subcultivos según recomienda el proveedor.

Células HEK: Queratinocitos de embriones humanos (HEK) se pueden obtener de Clonetics Corporation (Walkersville MD). Los HEK se mantienen rutinariamente en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville MD) formulado como recomienda el proveedor. Las células se mantienen rutinariamente durante hasta 10 subcultivos según recomienda el proveedor.

Células MCF - 7: La línea celular MCF - 7 de carcinoma de mama humano se obtiene de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las células MCF - 7 se cultivan de manera rutinaria en medio de bajo contenido en glucosa DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se subcultivan rutinariamente mediante tripsinización y dilución cuando alcanzan 90% de confluencia. Las células se siembran en placas de 96 pocilios (Falcon - Primaria n° 3872) a una densidad de 7000 células/pocilio para uso en análisis de RT - PCR. Para transferencia de Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de cultivo de tejidos de 100 mm u otra habitual y tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.

Células LA4: La línea celular LA4 de epitelio de pulmón de ratón se obtiene de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las células LA4 se cultivan de manera rutinaria en medio F12K (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con suero de ternera fetal al 15% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se subcultivan rutinariamente mediante tripsinización y dilución cuando alcanzan 90% de confluencia. Las células se siembran en placas de 96 pocilios (Falcon - Primaria n° 3872) a una densidad de 3000 - 6000 células/pocilio para uso en análisis de RT - PCR. Para transferencia de Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de cultivo de tejidos de 100 mm u otra habitual y tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.

Tratamiento con compuestos de polaridad opuesta: Cuando las células alcanzaron 80% de confluencia, se tratan con oligonucleótido. Para las células crecidas en placas de 96 pocilios, los pocilios se lavan una vez con 200 pl de medio de suero reducido OPTI - ME ™ - 1 (Gibco BRL) y después se trata con 30 pl de OPTI - MEM ™ - 1 conteniendo 3.75 pg/ml de LIPOFECTIN ™ (Gibcol BRL) y la concentración deseada de oligonucleótido. Después de 4 - 7 horas de tratamiento, el medio se reemplaza por medio recién preaparado. Las células se recogen 16 - 24 horas después de tratamiento con oligonucleótido. La concentración de oligonucleótido usado varía de línea celular a línea celular. Para determinar la concentración de oligonucleótido óptima para una línea celular particular, las células se tratan con un control positivo de oligonucleótido a un intervalo de concentraciones.

EJEMPLO 10 Análisis de inhibición por oligonucleótido de la expresión de la mitoNEET La modulación de polaridad opuesta de la expresión de la mitoNEET se puede ensayar en una diversidad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de la mitoNEET se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR), o PCR a tiempo real (RT - PCR). Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa a tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar sobre ARN celular total o ARNm poli (A) +. Los procedimientos de aislamiento de ARN se han descrito en por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1 , p. 4.1.1 - 4.2.9 y 4.5.1 - 4.5.3, John Wiley y Sons, Inc., 1993. El análisis de transferencia de Northern es rutinario en la técnica y se describe en, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1 , p. 4.2.1 - 4.2.9, John Wiley y Sons, Inc., 1996. La PCR cuantitativa a tiempo real (RT - PCR) se puede llevar a cabo convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM ™ 7700, comercialmente disponible en PE - Applied Biosystems, Foster City, CA y usado según las instrucciones del fabricante. Antes del análisis de la PCR cuantitativa, los conjuntos cebador - sonda específicos para el gen diana que se han medido se evalúan para determinar su capacidad de "multiplexarse" con una reacción de amplificación de GAPDH. En la multiplexación, tanto el gen diana como el gen patrón interno GAPDH se amplifican simultáneamente en una muestra individual. En este análisis, el ARNm aislado de células sin tratar se diluye en serie. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos cebador - sonda específicos para GAPDH solamente, el gen diana solamente ("plexado individual"), o ambos ("mutiplexado"). Después de la amplificación por la PCR, se generan curvas patrones de GAPDH y señal de ARNm diana como una función de dilución a partir de muestras tanto plexadas individualmente como multiplexadas. Si tanto la pendiente como el coeficiente de correlación del GAPDH y señales diana generados a partir de las muestras multiplexadas caen dentro del 10% de sus valores correspondientes generados a partir de las muestras plexadas individualmente, el conjunto cebador - sonda específico para esa diana se considera multiplexable. Otros procedimientos de la PCR se conocen en la técnica. Los niveles de proteínas de la mitoNEET se pueden cuantificar en una diversidad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia de Western (¡nmunotransferencia), ELISA o aislamiento en citofluorímetro (FACS). Los anticuerpos dirigidos a la mitoNEET se pueden identificar y obtener a partir de una diversidad de fuentes, tales como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar mediante procedimientos de generación de anticuerpos convencionales. Los procedimientos para la preparación de antisueros policlonales se describen por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, p. 11.12.1 -1 1.12.9, John Wiley y Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se describe por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, p. 11.4.1 - 11.11.5, John Wiley y Sons, Inc., 1997. Los procedimientos de inmunoprecipitación son habituales en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, p. 10.16.1 - 10.16.11 , John Wiley y Sons, Inc., 1998. El análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia) es habitual en la técnica y se puede encontrar en, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, pp. 10.8.1 - 10.8.21 , John Wiley y Sons, Inc., 1997. Los enzimoensayos de inmunoabsorbencia (ELISA) son habituales en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, p. 1 1.2.1 - 1 .2.22, John Wiley y Sons, Inc., 1991.

EJEMPLO 11 Aislamiento de ARNm poli (A)+ El ARNm poli (A)+ se aisla según Miura y col., Clin. Chem. 1996, 42, 758 - 1764. Otros procedimientos para aislamiento de ARNm poli (A) + se describen en, por ejemplo, Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1 , p. 4.5.1 - 4.5.3, John Wiley y Sons, Inc., 1993. En resumen, para las células crecidas en placas de 96 pocilios, se retira el medio de crecimiento de las células y cada pocilio se lava con 200 µ? de PBS frío. 60 µ? de tampón de lisis (Tris - HC1 10 mM, pH 7.6, EDTA 1 mM, Na Cl 0.5 M, NP - 40 al 0.5%, complejo vanadilo - ribonucleósido 20 mM) se añade a cada pocilio, la placa se agita cuidadosamente y después se incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfieren 55 µ? de lisado a placas de 96 pocilios recubiertas con Oligo d (T) (AGCT Inc., Irvine CA). Las placas se incuban durante 60 minutos a tempetarura ambiente, se lavan tres veces con 200 µ? de tampón de lavado (Tris - HC1 0 mM ph 7.6, EDTA 1 mM, NaCI 0.3 M). Después del lavado final, la placa se seca con toallas de papel para retirar el exceso de tampón de lavado y después se seca al aire durante 5 minutos. Se añaden 60 pl de tampón de elución (Tris - HCI 5 mM pH 7.6), precalentados a 70°C a cada pocilio, la placa se incuba sobre una placa caliente a 90°C durante 5 minutos, y el eluido se transfiere después a una placa de 96 pocilios limpia. Las células crecidas sobre placas de 100 mm o otra habitual se puede tratar de manera similar, usando volúmenes apropiados de todas las soluciones.

EJEMPLO 12 Aislamiento de ARN total El ARNm total se aisla usando el kit RNEASY 96 ™ y tampones comprados en Qiagen Inc. (Valencia CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. En resumen, para las células crecidas en placas de 96 pocilios, se retira el medio de crecimiento de las células y cada pocilio se lava con 200 µ? de PBS frío. Se añaden 100 pl de tampón RLT a cada pocilio y la placa se agita vigorosamente durante 20 segundos. Después se añaden 100 pl de etanol al 70% a cada pocilio y el contenido se mezcla pipeteando tres veces arriba y abajo. Después las muestras se transfieren a la placa de pocilios de RNEASY 96 ™ unida a un colector QIAVAC ™ equipado con una bandeja de recogida de desperdicio y unido a una fuente de vacío. Se aplica vacío durante 15 segundos. Se añade 1 mi de tampón RW1 a cada pocilio de la placa de RNEASY 96 ™ y se aplica vacío de nuevo durante 15 segundos. Después se añade 1 mi de tampón RPE a cada pocilio de la placa de RNEASY 96 ™ y se aplica vacío durante un período de 15 segundos. Después se repite el lavado con tampón RPE y se aplica vacío durante 10 minutos adicionales. Después la placa se retira del colector QIAVAC ™ y se seca con toallas de papel. Después la placa se vuelve a conectar al colector QIAVAC ™ equipado con un armazón de tubos de recogida conteniendo tubos de recogida de 1.2 mi. Después el ARN se eluye pipeteando 60 pl de agua en cada pocilio, incubando un minuto, y después aplicando el vacío durante 30 segundos. La etapa de elución se repite con 60 µ? adicionales de agua. Las etapas de pipeteado y elución repetitivas se pueden automatizar usando un QIAGEN Bio - Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). Esencialmente, después de lisar las células sobre la placa de cultivo, la placa se transfiere a la plataforma robot donde se llevan a cabo las etapas de pipeteado, tratamiento con ADNasa y elución.

EJEMPLO 13 Análisis de PCR cuantitativa a tiempo real de niveles de ARNm de la mitoNEET La cuantificación de niveles de ARNm de la mitoNEET se determina mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM ™ 7700 (PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Éste es un sistema de detección de fluorescencia de tubo cerrado, de base no gel, que permite la cuantificación de alto rendimiento de los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real. En oposición a la PCR habitual, en la que los productos de amplificación se cuantifican después de que la PCR se ha completado, los productos de la PCR cuantitativa a tiempo real se cuantifican a medida que se acumulan. Esto se lleva a cabo incluyendo en la reacción de la PCR una sonda de oligonucleótido que se híbrida específicamente entre los cebadores delanteros e inversos de la PCR, y contiene dos tintes fluorescentes. Un tinte indicador (por ejemplo, JOE, FAM ™, o VIC, obtenido en bien Operan Technologies Inc., Alameda, CA o PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5' de la sonda y un tinte ¡nactivador (por ejemplo, TAMRA, obtenido de bien Operan Technologies Inc., Alameda, CA o PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y tintes están intactos, la emisión del tinte indicador se inactiva por la proximidad del tinte ¡nactivador en 3'. Durante la amplificación, la hibridación de la sonda a la secuencia diana crea un sustrato que se puede escindir mediante la actividad de la 51 - exonucleasa de la Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación de la PCR, la escisión de la sonda mediante la Taq polimerasa libera el tinte indicador del resto de la sonda (y por lo tanto del resto inactivador) y se genera una señal fluorescente específica de secuencia. Con cada ciclo, se escinden moléculas de tinte indicador adicionales de sus respectivas sondas, y la intensidad de fluorescencia se controla a intervalos regulares mediante ópticas láser construidas en el sistema de detección de secuencias AB1 PR1SM ™ 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie del ARNm de muestras de control no tratadas genera una curva patrón que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento con oligonucleótidos de polaridad opuesta de las muestras de ensayo. Los reactivos de la PCR se pueden obtener de PE - Applied Biosystems, Foster City, CA. Las reacciones de RT - PCR se llevan a cabo añadiendo 25 µ? de cóctel de PCR (1 x tampón A TAQMAN ™, MgCI2 5.5 MM, 300 µ? de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 600 µ? de dUTP, 100 nM de cada uno de cebador delantero, cebador inverso, y sonda, 20 unidades de inhibidor de la ARNasa, 1.25 unidades de AMPLITAQ GOLD ™, y 12.5 unidades de transcriptasa inversa MuLV) a placas de 96 pocilios que contienen 25 µ? de solución de ARNm poli (A). La reacción a timpo real (RT) se lleva a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48°C. Después de 10 minutos de incubación a 95°C para activar el AMPLITAQ GOLD ™, se llevan a cabo 40 ciclos de un protocolo PCR de dos etapas: 95°C durante 15 segundos (desnaturalización) seguido de 60°C durante 1.5 minutos (hibridación/extensión). Las sondas y cebadores para mitoNEET humana se diseñaron para hibridarse a una secuencia de la mitoNEET humana, usando una información de secuencia publicada (número de acceso de GenBank NM _ 018464, incorporada en esta memoria descriptiva como la figura 1). Para la mitoNEET humana los cebadores de la PCR fueron: cebador delantero: TCCTAGTG CACACGCCTTTG SEC 618 cebador inverso: ACTCGTACGCTGGAACTGGAA SEC ID N°: 619 y la sonda PCR es FAM ™- AAGCGACGGCGCCATGAGTCTG SEC ID N°: 620 - TAMRA donde FAM ™ (PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte indicador fluorescente) y TAMRA (PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte inactivador. Para ciclofiiina humana los cebadores de la PCR fueron: cebador delantero: CCCACCGTGTTCTTCGACAT SEC 621 cebador inverso: TTTCTGCTGTCTTTGGGACCTT SEC | D No. 622 y la sonda PCR es 5' JOE - CGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGCA SEC ID N°: 623 - TAMRA 3' donde JOE (PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte indicador fluorescente y TAMRA (PE - Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte ¡nactivador.

EJEMPL0 14 Inhibición de polaridad opuesta de expresión de la mitoNEET humana mediante oligonucleótidos quiméricos de fosforotíoato que tienen alas 2' - MOE y un hueco desoxi De acuerdo a la presente invención, se diseña una serie de oligonucleótidos para dirigir diferentes regiones del ARN de la mitoNEET humana, usando secuencias publicadas (número de acceso de Genbank NM _ 018464) incorporadas en esta memoria descriptiva como la SEQ ID NO 2 en la figura 1. Los oligonucleótidos se muestran en el cuadro 1. "Posición" indica el primer número de nucleótidos (más 5') sobre la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido. Los parámetros indicados para cada oligo se predijeron usando la estructura de ARN 3.7 de David H. Mathews, Michael Zuker, y Douglas H. Turner. Los parámetros se describen bien como energía libre (la energía que se libera cuando se produce una reacción. Cuanto más negativo es el número, más probablemente se produce la reacción. Todas las unidades de energía libre están en kcal/mol.) o temperatura de fusión (la temperatura a la que dos hebras de hibridación de ácido plinucleico se separan. Cuanta más alta es la temperatura, mayor es la afinidad entre las dos hebras). Cuando se diseña un oligonucleótido de polaridad opuesta (oligómeros) que se unirán con alta afinidad, es deseable considerar la estructura de la hebra de ARN diana y el oligómero de polaridad opuesta. Específicamente, para un oligómero que se une estrechamente (en el cuadro descrita como formación "dúplex"), debe ser complementario a un tramo de ARN diana que tiene poca estructura propia (en el cuadro la energía libre de la que se describe como 'estructura diana'). También, el oligómero debe tener una pequeña estructura propia, bien intramolecular (en el cuadro la energía libre de la cual se describe como 'oligo intramolecular') o bimolecular (en el cuadro la energía libre de la que se describe como 'oligo intermolecular'). Fraccionar hasta que cualquier estructura propia sume una penalización de unión. Todos los compuestos en el cuadro 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región central "hueco" constituida por diez 2' desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (posiciones 5' y 3') por cuatro nucleótidos "alas". Las alas están compuestas de nucleótidos 2'-metoxietilo (2'-MOE). Los enlaces ¡ntemucleósidos (estructura principal) son fosforotioato (P = S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Los restos citidina en las alas 2'-MOE son 5-metilcitidinas. Todos los restos citidina son 5-metilcitidinas.

CUADRO 1 k el/moi ksal/mol keal/mol kcal/<»?l keai mol olígo unión formación -¾ esirucíura íncra- interposición óligs total dúplex dúplex diana molecular molecular TTGTCTCCRGTCTCTTOERíT 382 £?ß,??,¾0?1 -24,4 -26.1 7S-* -1.7 0 ~3 G CTCCaGTCrCTTCSrrAT 380 SEQ.lD,K0s2 -24 -25.7 77.5 -3.7 0 -3 tSTCTCC¾5TC rT S3 A 3B1 SEO-lD.MOí3 -24 -25.7 77.3 -1.7 0 -3 ft TGTCTC AGTCT TTCST 383 SEQ.JD.HQií -23, S -26 77, 9 -2*2 0 -3 CTCCAGTCrrariCGrTAlG 378 SS0.ID.N0i5 -23.6 -25,3 7S.4 -1,7 0 -3 Tc XGTC riiístTR era 377 SBQ;JBJBQí6 -22. T -24. S 73,7 -1.7 o -3 CTCt-ñST TCTrCGTTRTG 375 SE0.JD.KQi7 SZ, B -24.5 73.5 -1.7 0 -3 ccAGTCTcrrcGiTA'rern- 376 SEQ.ID.W = e -22.5 -2 .2 72.3 -1.7 0 -3 CTCTcrrrcGrrATGrrrTGT 373 SEQ.ID.NQ--9 -21.2 -2 .8 70.7 -1.5 0 -3 CAT GTCTCCAíSTC Cr CG 384 SEO, ID. NO: 10 -20.8 -2S.5 75.3 -í.7 0 -2.4 57 5E0.lt>. 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LISTADO DE SECUENCIAS <110> P rmacia Corp. Coica, Jerry <120> MODULACION DE POLARIDAD OPUESTA BE LA EXPRESION DE mitoNEET <130> 01455_1_PCT <160> 627 170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> ¿ jf <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> i ttgtctccag tctcttcgtt 20 210> 2 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 2 gtctccagtc tcttcgttat <210> 3 <211> 20 <21 ADN . . <213> artificial <220> <223> ???^?^ opuesta de la mityoNEET ni <400> 3 tgtctccagt ctcttcgtta <210> 4 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 4 attgtctcca gtctcttcgt 20 <210> 5 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> . <223> Polaridad opuesta de la mitoNEE!E .humana <400> 5 ctccagtctc ttcgttatgt <210> 6 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <4D0> 6 tccagtctct tcgttatgtt <210> 7 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40D> 7 tctccagtct cttcgttatg <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 8 ccagtctctt cgttatgttt <210> 9 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 9 gtctcttcgt tatgttttgt <210> 10 <211? 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> c223> Polaridad opuesta de la mitoNEET Humana <400> 10 cattgtctcc agtctcttcg <210? 11 <211> 20 <:212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 11 accgagctca aacgggttcg 210> 12 211> 20 < <72?1V3> AaDrNti.f.i.ci·ail 220> <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 12 cagtctcttc gttatgtttt <210? 13 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> c2 3> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 13 ccgagctcaa acgggttcgc <210? 14 <211? 20 «212 ADN <213> artificial <220> c223> Po áladad opuesta de la mitoNEET humana <400> 14 agtctcttcg ttatgttttg <210> 15 <211> 20 <212> AM . . , <213> artificial <220> <223> olaridad opuesta de- la mitoNEET K mána <400> 15 gataccgagc tcaaacgggt <210> 16 <211> 20 212> ¿JJJJ <213> artificial <220> <223> Bolaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> is taccgagctc aaacgggttc 210> 17 <211> 20 c212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 17 ataccgagct caaacgggtt 210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 18 acattgtctc cagtctcttc <210> 19 <211> 20 <212> ¿JJJJ <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 19 ggataccgag ctcaaacggg <210> 20 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> *«3> Polaridad opuesto de la mitoNEET humana <400> 20 gagctcaaac gggttcgcgc <210> 21 <211> 20 <212> m <213> artificial <220> ?? la mitoNEET humana <223> Polaridad opues&a .· de 3 mitüM* c400> 21 tctcttcgtt atgttttgtg 20 <210> 22 <211> 20 <212> AD <213> artificial <223°> p0iaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 22 ttagaatcca gcgaaggtga 20 210> 23 211¾ -20 212> ADN 213> artificial 220> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 23 agctcaaacg ggttcgcgcg 20 <210> 24 <211> 20 <212> <213> artificial <220> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 24 cacattgtct ccagtctctt 20 <210> 25 <211> 20 <212> · ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 25 atcctccatg tcaaaagcat <210> 26 <211> 20 ¿212> <213> artificial <220> ¦=223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 26 ccacattgtc tccagtctct <210> 27 <211> 20 <2i2 ADN <213> artificial <220> <223> p0iari(ia¿ opuesta de la mitoNEET humana <400> 27 ttcaactcgt acgotggaac <210> 28 <211> 20 <212> <213> artaficial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET K mána <400> 28 agaatccagc gaaggtgaat <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 29 ctcttcgtta tgttttgtgt <210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> folaridad opuesta de la mitoNEEf humana <400> 30 cctccatgtc aaaagcatgt <210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEEf humana <400> 31 tagaatccag cgaaggtgaa <210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> 0iari(iad opuesta de la mitoNEET humana <400> 32 tcctccatgt caaaagcatg <210> 33 <211> 20 212> ADN -=213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 33 cgagctcaaa cgggttcgcg c210> 34 <211> 20 <212> ^ <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 34 tgcaccacga tgtttcaaca ^210¾ 35 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 35 ctaggatacc gagctcaaac <210> 36 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial 220> c223 Polaridad opuesta de la. mitoNEET humana <400> 36 actaggatac cgagctcaaa <210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> =223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana c400> 37 tcaactcgta cgctggaact <210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 38 actcgtacgc tggaactgga 210> 39 <211> 20 2i2> ADN c2a3> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 39 aatcctccat gtcaaaagca <210> 40 «211> 20 <212> ADJJ 213> artificial <220> <:223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana ¿400> 40 tttagaatcc agcgaaggtg ¿210> 41 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 41 aatccagcga aggtgaatca <210> 42 c211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> ggiaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 42 tccattcaac tcgtacgctg <210> 43 =211> 20 <213> ar&ficial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 43 cagcgaaggt gaatcagaca <210> 44 <211> 20 ÷212> ADN . . . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de 'la mitoNEET humana <400> 44 gtgaatcaga cagaggtggt <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 45 gcgaaggtga atcagacaga 210> 46 211> 20 2i2 ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 46 attcaactcg tacgctggaa <c210> 47 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> c223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana =400> 47 cccacattgt ctccagtctc 20 <210> 48 <211> 20 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 4B gaatccagcg aaggtgaatc 20 <210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 49 gcaccacgat gtttcaacaa 20 <210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 50 ctcgtacgct ggaactggaa <210> 51 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 51 ggtgaatcag aeagaggtgg <210> 52 <211¾ 20 212> ADN . . . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400¾ 52 gctcaaacgg gttcgcgcgg <210> 53 <211> 20 <212> ADN. . . , <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de .la mitoNEET humana <400> 53 aggataccga gctcaaacgg <210> 54 <211> 20 ÷2X2> ADN ¾213> artificial <220> <223> 0iarida¿ opuesta de la mitoNEET humana <400> 54 atccagcgaa ggtgaatcag <210> 55 <211> 2?' <212> A])N <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 55 atccattcaa ctcgtacgct <210> 56 c211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 56 agcgaaggtg aatcagacag <210> 57 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET Humana <400> 57 atttcgatga tctttaacat 210> 58 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 58 ccacatttag aatccagcga <210> 59 <211> 20 ^2i2 ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 59 ctcccaaatc ctccatgtca <210> 60 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 60 aatgtgcacc acgatgtttc <210> 61 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 61 tttcgatgat ctttaacata <210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> artificial c220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 62 tatttcgatg atctttaaca <210> 63 <211> 20 <212> ADN '. , . . . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET hi <400> 63 cattcaactc gtacgctgga 210> 64 211> 20 212> ADN . . . . 213> artificial <220> 223> Pfolaridad opuesta de la mitoNEET Ruinaría <400> 64 ctccatgtca aaagcatgta <210> 65 <211> 20 <2i2> DN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 65 accacattta gaatccagcg <210> 66 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 66 cctccaacaa cggcagtaca <210> 67 <211> 20 <2i2¿ ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 67 atttagaatc cagcgaaggt <210 68 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 68 tcgtacgctg gaactggaag <210> 69 <211> 20 <212> ADN . . . , <213> artificial 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 69 ccatgtcaaa agcatgtact <210> 70 <211> 20 <212> ADN , . . . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 70 tgaatcagac agaggtggta <210> 71 <211> 20 <212> <213> artifi .ci.a.l <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 71 aaatcctcca tgtcaaaagc <210> 72 <211> 20 212> ADH. <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 72 tcccaaatcc tccatgtcaa <210> 73 <211> 20 <2i2> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 73 tccagcgaag gtgaatcaga <210> 74 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> <223> Bolaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 74 cggcgagagt aaaggtgcca <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 75 gcccacattg tctccagtct <210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 76 aggtgaatca gacagaggtg <210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 77 atgtgcacca cgatgtttca c210> 78 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 78 taggataccg agctcaaacg <210> 79 <211> 20 <212> ADN 213¾ artificial <220> <223> >0iari¿a¿ 0pUes a de la mitoNEET humana <400> 79 ttcgatgatc tttaacataa 4 <210> 80 <211> 20 <212:> ADN <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta del la mitoNEET humana <400> 80 tccatgtcaa aagcatgtac <210> 81 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 81 cgaaggtgaa tcagacagag <210> 82 <220> < <222233>> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400 82 cactaggata ccgagctcaa 210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de" la mitoNEET humana <400> 83 caactcgtac gctggaactg <210> 84 c211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 84 tcttcgttat gttttgtgtg <210> 85 <211> 20 <21Z> <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEE humana <400> 85 aaatgtgcac cacgatgttt <210> 86 <211> 20 < <221123>> aSrDtNificial <220> <223 Polaridad opuesta de la rnito EET humana <400> 86 tcagacagag gtggtagtca <210> 87 <211> 20 <212> jj^yj <213 artificial <220> <223> polaridad opuesta de la ndtoNEET humana <400> 87 tttttttttt ttttttgttt <210> 88 <211> 20 <2I2> ¾I¾Í <213> artificial <220? <223> olaridad opuesta de la ndtoEET humana <400> 88 ccggcgagag tasaggtgcc <210? 89 <211> 20 <221123>=> ftarDtMi,fi.ci.a,l <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 89 gccgtcgctt gcaaaggcgt <:210> 90 2?a> 20 <212> <213> ¾r?ificial <220> <223> Polaridad opuesta de la ndto EEP humana <400> 90 cgtacgctgg 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Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 106 ggtggtagtc attctaatta <210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <;220> 223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 107 gtttgcaata taccacattt <210> 108 <211> 20 <2i2> ¿y^j <213> artificial <220> <223> olaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 108 acaaatgtgc accacgatgt <210> 109 <211> 20 <212> ADN . . <213> artificial <220> 223 polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 109 tcaaacgggt tcgcgcggcc 210> 110 211> 20 <212> £DN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 110 tgtgcaccac gatgtttcaa 210> 111 <211> '20 <212> ¾E»I <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 111 cgggttcgcg cggccggcga <210> 112 <211> 20 <212> M¾I <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana ^400? 112 agacagaggt ggtagtcatt <210=· 113 <211> 20 <212> ADN. <213> artificial <220> c2 3 polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 113 gatccattca actcgtacgc <210> 114 211> 20 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<211> 20 <212> ¾EW <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoEET humana <400> 122 tcttttttct tgatgatcag 210> 123 <211> 20 ¦-212> M3Ñ <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 123 gaatcagaca gaggtggtag <210> 124 <211> 20 <212> ¾DfJ <213> artificial <220> <22 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 124 tttatttcga tgatctttaa <210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta, de la mitoNEET humana 4O0> 125 acgggttcg cgcggccggc <210> 126 <211> 20 <212=· ¾DN <213> artificial <220> 223> olaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 126 gtcagactca tggcgccgtc <210> 127 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 127 cgatgatctt taacataaaa <210> 128 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 128 gttgtctttc tggatgtgaa <210> 12S <211> 20 < ÷221123>> MarMtificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 129 gcgagagtaa aggtgccagc 210> 130 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta, de la mitoNEET humana 400> 130 :cattcaact cgtacgctgg <210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 131 tcaaaagcat gtactatctt <210> 132 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 132 aaacaaatgt gcaccacgat <210> 133 <211> 20 <212> ACN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 133 aaggtgaatc agacagaggt <210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 134 ataccacatt tagaatccag <210> 135 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET hunana <400> 135 gccggcgaga gtaaaggtgc <210> 136 <211> 20 <2i2> AE»Í <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mito EET humana <400> 136 ttcgcgcggc cggcgagagt <210> 137 211> 20 c2l2> ADN <213> artificial <220> <223> oiaj-idad opuesta de la ndtoNEET humana <400> 137 gttcgcgcgg ccggcgagag <210> 138 211> 20 <212> ¾|3N <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesat de la mitoNEET humana <400> 138 tctttaacat aaaatctttt <210> 139 <211> 20 12 : t-Kf <213> frfificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 139 gcatgtacta tcttggggtt <210> 140 211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 140 gcaatatacc acatttagaa <210> 141 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEEír humana 400> 141 tttttttttt tttttgttta 210> 142 211> 20 2i2> 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoEET humana 400> 142 gcgcggccg gcgagagtaa <210> 143 <211> 20 <212> ara <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 143 tcgcgcggcc ggcgagagta <210> 144 <211> 20 <212> &DN <213> artificial =220> <223> Polaridad opuesta de la iriitoNEET humana <400> 144 tcagactcat ggcgccgtcg <210> 145 <211> 20 <212> ¾Ki <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 145 cgatccattc aactcgtacg <210> 146 <211> 20 <212> ADN <213 artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 146 atctttaaca taaaatcttt <210> 147 <211> 20 <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 147 taaacaaatg tgcaccacga <210> 148 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la nmfoNEET humana c400> 148 gatctttaac ataaaatctt <210> 149 <211> 20 212> ¿jyn <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40Q> 149 ttcttttttc ttgatgatca <210> 150 c211> 20 ' 1 > ADN . . , 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mito EET humana <400> 150 tttaagtttc ttttttcttg 210> 151 <211> 20 <212> AHJ <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta, de la mitoNEET humana <400> 151 tataccacat ttagaatcca 210> 152 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 152 ttctaattaa acaatcaggt <210> 153 <211> 20 <213> 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de la mitoNEET humana <400> 176 atataccaca tttagaatcc <210> 177 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220? <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 177 gtgcaccacg atgtttcaac <210> 178 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400? 178 tactatcttg gggttgtctt <210> 179 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta -de la mitoNEET humana <400> 179 tacgctggaa ctggaagtca <210> 180 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> 223 > Polaridad- cpuesta de la mitoNEET humana 400> 180 tgatcttta acataaaatc <210> 181 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400s 181 aatcagacag aggtggtagt <210> 182 <211> 20 212=> ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la ultoNEET humana <400> 182 tcccagcagc aatggtaact <210> 183 <211> 20 <212> ADN · <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitoNEET humana 400> 183 ttaagtttct tttttcttga <210> 184 <211> 20 <212> ADN «213> artificial 220> <223> Polaridad cpuesta de la mitdSEET humana <400> 184 tttgcaatat accacattta <210> 185 c211> 20 <212> AD <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la ndtoEET hunana <400> 185 agtaaaggtg ccagcggcgt <210> 186 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> c223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 186 acgctggaac tggaagtcag <210> 187 <211> 20 <212? ADN <213> artificial <220> 223 Polaridad opuesta de la mitoNEET huraña <400> 187 gcgatccatt caactcgtac <210> 188 211> 20 <212> ADN <213> artificial 220? 223> polaridad opuesta de la mitoNEET huraña <400> 188 tggacctcca acaacggcag 210> 189 211> 20 12> ADN 213? artificial ¿220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana =400> 189 actaaagcac cgactccgcg <210> 190 <211> 20 <212> £EN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 190 aactcgtacg ctggaactgg <210> 191 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 191 tcttggggtt gtctttctgg <210> 192 <211> 20 <212> ABN <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 192 attctaatta aacsatcagg <210> 193 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <22Q> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 193 gtaaaggtgc cagcggcgta <210> 194 <211> 20 <212> ADN 213s artificial <220 <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 194 gcgtgtgcac taggataccg <210> 195 211> 20 <212> ADN- <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta .de la mitoNEET humana 400> 195 cagtttgcaa tataccacat 210> 196 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET huraña <400> 196 atttaagttt cttttttctt <210> 197 <211> 20 <212> ADN <2Z3> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 197 cagaggtggt agtcattcta <210> 198 <2I1> 20 <212> ADN. <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET huraña <400> 198 aacaaatgtg caccacgatg <210> 199 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 199 tttttttttt ttttgtttaa <210> 200 <211> 20 <212> AD · <213> artificial <220> <223> Polaridad ¦ opuesta de la mitoNEET humana <400> 200 cgcggccggc gagagtaaag <210> 201 <211 20 <212> ADN <213> artificial <220> c223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 201 gactcatggc gccgtcgctt <210> 202 <211> 20 <212> ADN <213=> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 202 cgctggaact ggaagtcaga <210> 203 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220? <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 203 gggaactttt tggacctcca ^210? 204 <211> 20 <212? ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 204 atcagacaga ggtggtagtc <210> 205 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitoNEET huraña <¾oo> 205 caatatacca catttagaat <210> 206 <211> 20 <212> <213> artificial <220> 223> Polaridad cpuesta de la mitoMET humana <400> 206 gagtaaaggt gccagcggcg <210> 207 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitolNEET humana <400> 207 gctttatttc gatgatcttt <210> 208 <211> 20 <212> ADN' <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitoNEET humana <400> 208 ttggacctcc aacaacggca <210> 209 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> polaridad cpuesta de mitoNEET humana <400> 209 gtagtcattc taattaaaca <210> 210 <211> 20 <212> ADN <213> artif icial <220> <223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 210 caccacgatg tttcaacaag <210¾ 211 <211=· 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400¾ 211 ttgtctttct ggatgtgaag <210> 212 <211> 20 <212> ADN <213 > artificial <220> <223 > Polaridad opuesta (te mitoNEET humana <400> 212 cttggggttg tctttctgga <210> 213 <211> 20 <212> ADN <213 > artificial 220 > <223 > Polaridad' opuesta' de la mitoNEET humana <400> 213 actatcttgg ggttgtcttt <210> 214 <211> 20 <212> ADN <213 > artificial <220> <223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 214 gtactatctt ggggttgtct <210> 215 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 215 cggccggcga gagtaaaggt <210> 216 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitoNEET humana <400> 216 «ccaaatcctc catgtcaaaa <210> 217 211> 20 <212 ADN <213> artificial <220> <:223> Polaridad opuesta de la mitoNEET hunana <400> 217 tccaacaacg gcagtacaca <210> 218 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> <2 3> Polaridad opuesta de la mito EET hunana <400> 218 tgggaacttt ttggacctcc <210> 219 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoMSET hunana <400> 219 tctaattaaa caatcaggta <210> 220 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitóNEET humana <400> 220 ggttcgcgcg gccggcgaga <210> 221 <211> 20 <212> p£N <213> artificial <220> <223» Polaridad opuesta de la p?????G humana <400> 221 ttaacataaa atcttttgta <210> 222 <211> 20 <212> pm <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 222 atctcccaaa tcctccatgt <210> 223 <211> 20 <212¾ ADN <213> artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 223 gagggcccac attgtctcca <210> 224 <211> 20 2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la raitoNEET humana c400> 224 tactaaagca ccgactccgc <210> 225 <211> 20 <212> ADN c213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40Q> 225 gagagtaaag gtgccagcgg 210> 226 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223 > polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 226 gtgtgcact aggataccga <210> 227 <211> 20 212=> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la ndtoNEET humana <400> 227 aacaacggca gtacacagct <210> 228 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 228 gacctccaac aacggcagta <210> 229 <211> 20 <212> ADN «;213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 229 agactcatgg cgccgtcgct <210> 230 <211> 20 <212> MM <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400=> 230 acaacggcag tacacagctt <210> 231 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad cpuesta de la mitoNEET humana <400 231 tttctttttt cttgatgatc <210> 232 <211> 20 <212¾ ¿D <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 232 aaagcatgta ctatcttggg <210> 233 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 233 caaaagcatg tactatcttg <210> 234 <211> 20 <2i2> ¡ <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 234 gaggtggtag tcattctaat <210> 235 <211> 20 <212> ??? ' <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 235 aagctgcagt ttgcaatata <210> 236 <211> 20 ¾212:> AEN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la ndtóNEET humana <400> 236 ctttatctcc caaatcctcc <210> 237 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 237 atcttggggt tgtctttctg <210> 238 <211> 20 <212> m¡ <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 238 taagtttctt ttttcttgat <210> 239 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <22D> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 239 ttaaacaaat gtgcaccacg <210> 240 <2?a> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET huraña 400> 240 caacggcagt acacagcttt <210> 241 <211 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 241 agggcccaca ttgtctccag <210> 242 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 242 agaggtggta gtcattctaa <210> 243 <211> 20 <213> artificial <220> <223> Póláridaá. opuesta de la mitoNEET humana <400> 243 tatcatagct ttatttcgat <210> 244 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 244 caacaacggc agtacacagc <210> 245 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta dB la mitüNEET humana <400> 245 agagggccca cattgtctcc <210> 246 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 246 aaacaatcag gtaacttcac <210> 247 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad apuesta de la mitoNEET humana <400> 247 gcaaaggcgt gtgcactagg <210> 248 <211 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 248 agcaatggta actgctgcga <210> 249 <211> 20 ^212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta dB la mitoNEET humana <400> 249 tatcttgggg ttgtctttct 210> 250 211> 20 212=> ff 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 250 ggcagtacac agctttatct <210> 251 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 251 acagaggtgg tagtcattct <210> 252 <211> 20 <212> ADNA <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 252 acatttagaa tccagcgaag <210> 253 <211> 20 212> ADN <213> artificial «r220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 253 tgtccattta agtttctttt 210> 254 211> . 20 212=» ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 254 agctgcagtt tgcaatatac 210> 255 211> 20 <212> ADN 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEE humana 400> 255 ccacgatgt ttcaacaaga <210> 256 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 256 gcaatggtaa ctgctgcgat <210 257 <211> 20 212? ADN <213> artificial <220> <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 257 aatataccac atttagaatc <210> 258 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 258 tgtcccagca gcaatggtaa <210> 259 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 259 ctgtcccagc agcaatggta <210> 260 <211> 20 <212> 7?G)? <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 260 ggtttatcat agctttattt <210> 261 <211> 20 <212> 7ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> ' 261 tttatctccc aaatcctcca <210> 262 <211> 20 <213> artificial <220> ¦<223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 262 ttgtttaaac aaatgtgcac <210> 263 <211? 20 <212> ADN <213 artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 263 gtgtgcacta ggataccgag <210> 264 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400¾ 264 aggtttatca tagctttatt <210> 265 c211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 265 ttcgttatgt tttgtgtgag <210» 266 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 266 attaaacaat caggtaactt 210> 267 :211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 267 attctaatt aaacaatcag <210> 268 <211> 20 <2i2> ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 268 tttaaacaaa tgtgcaccac <210> 269 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 269 aggtgccagc ggcgtactaa <210> 270 <211> 20 <212? ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 270 tgcagcatca aaagtgtcca <210? 271 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 271 agtcattcta attaaacaat <210> 272 <211> 20 <212> ¾D <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 272 ttgcaatata ccacatttag <210> 273 <211> -20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 273 tttttttttt tttgtttaaa <210> 274 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400=> 274 cgccgtcgct tgcaaaggcg ADN artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana tgcgatccat tcaactcgta ADN artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana catgtactat cttggggttg ADN artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana ttatgttttg tgtgagcccc ADN artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana gctggaactg gaagtcagac ADN artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana ggacctccaa caacggcagt <210> 280 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 280 atcacagaat gggaactttt <210> 281 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 281 caaacgggtt cgcgcggccg <210> 282 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 282 ttttgtaagc tagataacca <210> 283 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 283 taacataaaa tcttttgtaa <210> 284 <211> 20 <212> ¾]3N <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 284 ttatcatagc tttatttcga <210> 285 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 285 ctatcttggg gttgtctttc <210> 286 <211> 20 <212> ADN <213> ' artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <4 00> 286 tagtcattct aattaaacaa <210> 287 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 287 gacagaggtg gtagtcattc c210> 288 <211> 2Q <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 288 aacaatcagg taacttcacg <210> 289 211> 20 <212> ADN <213 > artificial <220> <223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 289 tcattctaat taaacaatca <210> 290 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 290 ggtagtcatt ctaattaaac <210> 291 <211> 20 <212> J^JJ <213> artificial <220? <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 291 gtgaaagctg cagtttgcaa <210> 292 <211> 20 <2i2> ADN . <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40D? 292 tttttttttt tgtttaaaca <210? 293 <211p 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 293 gggttcgcgc ggccggcgag <210> 294 <211> 20 <212> fiDN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 294 agctttattt cgatgatctt <210> 295 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mi o EET humana <400> 295 gtccatttaa gtttcttttt 210> 296 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 296 aagctgcag tttgcaatat <210> 297 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220? <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 297 tgtgaaagct gcagtttgca <210> 298 <211> 20 2i2 AD <213> artificial <220> <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 298 ctgcgatcca ttcaactcgt <210 299 <211 20 < <221123> aArDtNif,i.ci.a-l <220> <223> Polaridad opuesta fie la mitoNEET humana <400? 299 ggaacttttt ggacctccaa <210> 300 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 300 ctaattaaac aatcaggtaa <210> 301 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 301 ggtgccagcg gcgtactaaa <210> 302 <211? 20 <212> ADN <213> artificial <220> <22 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 302 ccgtcgcttg caaaggcgtg <210> 303 <211> 2.0 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 303 tatgttttgt gtgagcccca <210> 304 «211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> . Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 304 cagagggccc acattgtctc <210> 305 <211> 20 <212> 3N <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 4O0> 305 aattaaacaa tcaggtaact <210> 305 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 306 gcggccgg'cg agagtaaagg <210> 307 <211> 20 <212> <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 307 ggcgtgtgca ctaggatacc <210> 308 ¿211> 20 <212> M)N <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 308 aagtcagact catggcgccg <210> 309 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 309 ttatctccca aatcctccat <210> 310 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la raitoNEET humana <400> 310 gtttcttttt tcttgatgat <210> 311 c211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <2 3> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 311 catttaagtt tcttttttct <210> 312 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 312 ggtaactgct gcgatccatt <210> 313 <211> 20 . <r212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 313 ccaacaacgg cagtacacag <210> 314 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 314 catcacagaa tgggaacttt <210> 315 «211> 20 <212> <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 315 cacatttaga atccagcgaa <210> 316 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 316 tttgtttaaa caaatgtgca <210> 317 <211> 20 <212 ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 317 tgcaaaggcg tgtgcactag <210> 318 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 318 gaagtcagac tcatggcgcc <210> 319 <211> 20 <212> ADN <213> cütificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 319 tggtaactgc tgcgatccat <21?5 320 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 320 atggtaactg ctgcgatcca <210> 321 <211> 20 <212=> 7ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 321 tttgtaagct agataaccaa <210> 322 <211> 20 <212> c213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 322 ctttctggat gtgaaggttt <210> 323 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 323 gctttatctc ccaaatcctc <210> 324 <211> 20 <212> ¾DN ¿213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 324 gcagtacaca gctttatctc <210> 325 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la miUoNEET humana. <400> 325 gcgccgtcgc ttgcaaaggc <210> 326 <2-_l> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mifcoNEET liumana. <400> 326 ttgtaagcta gataaccaat 210> 327 211> 20 212 > AD 213> artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mifcoNEET liumana. 400> 327 aggtttatc atagctttat <210> 328 <211> 20 <212 SÍ <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEE liumana. <400> 328 tctggatgtg aaggtttatc <210> 329 <211> 20 <212> AEN <213> artificial 220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEEP humana. <400> 329 tgtctttctg gatgtgaagg <210> 330 <211> 20 <212> ?????' <213> artificial <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 330 tatctcccaa atcctccatg <210> 331 <211> 20 <212> ACN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta da la mitoNEET humana. <400> 331 ccagcagcaa tggtaactgc <210> 332 <211> 20 <212? ADN <213> artificial <220> <223=. Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 332 tttctggatg tgaaggttta <210> 333 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 333 gggcccacat tgtctccagt <210> 334 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 334 agcatcaaaa gtgtccattt 20 <210> 335 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> ¿223> Polaridad opuesta de -la mitoNEET humana. <400> 335 tgatttgcag catcaaaagt <210> 336 211s 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> ¦ <223> Polaridad opuesta de_la mitoNEET humana. <400> 336 atgtgaaagc tgcagtttgc 210> 337 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <2 3> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 337 ttctggatgt gaaggtttat <210> 338 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 338 cggcagtaca cagctttatc <210> 339 <211> 20 <212> ADN <213> artiticial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 339 tcgttatgtt t-tgtgtgagc <210=> 340 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 340 acaatcaggt aacttcacga <210> 341 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223¾ Polaridad opuesta de la tnitoNEET humana. <400> 341 tgaaagctgc agtttgcaat <210> 342 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 342 ccacgatgtt tcaacaagac <210> 343 <211> 20 <212> ADN <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta' de la mitoNEET humana-^OOs 343 aaggtgccag cggcgtacta · <210> 344 <211> 20 <212> ADN 213 artificial <220> . . <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 344 aggcgtgtgc actaggatac <210> 345 <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mito EET humana. <400> 345 atttgcagca tcaaaagtgt <210> 346 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223¾ Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 346 gtttaaacaa atgtgcacca <210> 347 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220 <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 347 aaaagcatgt actatcttgg <210> 348 <211> 20 <212=> ADN <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 348 gaactttttg gacctccaac <210> 349 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 349 gatgtttcaa caagacaaat 20 <210> 350 <211> 20 <=212> ADN 213> artificial <220> 223> polaridad opuesta de la mito EET humana. <400> 350 acgatgtttc aacaagacaa 20 <210> 351 ' i\ -> 20 <212> ADÑ <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. *400> 351 ttttgtttaa acaaatgtgc <210> 3B2 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 352 agagtaaagg tgccagcggc <210> 353 <211> 20 <212> ADN. .. <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 353 agtcagactc atggcgccgt 20 <210> 354 <211=> 20 <212> ADN <2i3> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 354 ggaactggaa gtcagactca 20 <210> 355 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mito EET humana <400> 355 cagctttatc tcccaaatcc <210> 356 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 356 gtaacttcac gacaagctga <210> 357 <211> 20 <212¾ ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 357 taaaggtgcc agcggcgtac <210> 358 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <:400> 358 gcttgcaaag gcgtgtgcac <210> 359 <211> 20 <212> ADN- <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 359 tcagagggcc cacattgtct <210> 360 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 360 ttttttcttg atgatcagag <210> 361 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400 361 ttaaacaatc aggtaacttc <210> 362 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 362 gaaagctgca gtttgcaata <210> 363 <211s 20 ¾212 ADN <213> artificial " <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 363 cgatgtttca acaagacaaa <210> 364 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 364 aaagcaccga ctccgcgatc <210> 365 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 365 aaaggtgcca gcggcgtact <210> 366 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <:400 366 atgttttgtg tgagccccat <210> 367 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 367 agtttcttt tttcttgatg <210> 368 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> . . 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 368 tggtagtcat tctaattaaa 210> 369 <211> 20.- <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400 369 tttttttttt gtttaaacaa <210> 370 <211> 20 <212> ADN <2135 artificial . · · ·. · <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 370 ctggaactgg aagtcagact <210> 371 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 371 caatggtaac tgctgcgatc <210> 372 <211> 20 · <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humojia. <400> 372 ataaaatctt ttgtaagcta <210> 373 •<211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta' dé la; mitoNEET humana. <400¾ 373 gaactggaag tcagactcat <210> 374 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta, de la mitoNEET humana. <400> 374 atcatagctt tatt.tcgatg 210> 375 <211> 20 <212> ADN <213> artificial;. · <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 375 tttatcatag ctttatttcg <210> 376 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitcNEET humana. <400> 376 cagactcatg gcgccgtcgc <210> 377 <211> 20 · <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400 377 1. cttttgtaag ctagataacc <210> 378 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 378 atagctttat ttcgatgatc <210> 379 <211> 20 <212> ADÑ <213> artificial <220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana. -:400 379 ccatcacaga atgggaactt <210> 380 . 211s 20" <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 380 tagctttatt tcgatgatct <210> 381 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> . <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <40D> 381 gaaggtttat catagcttta <210> 382 <211> 20. <2i2> ADN <213> artificial c2205 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 382 cagtacacag ctttatctcc <210> 383 <211> .20 <2i2> ADN <213> artificial <220T> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET hismana. <400> 383 aacggcagta cacagcttta <210> 384 <211> 20 <212> spfi <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 384 · gtgtccattt aagtttcttt <210> 3.85 <211¾. 2,0. . <212> ÁDN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 385 aaggcgtgtg cactaggata <210> 386 <211> 20 <212> ADN <213¾ artificial <220> ' ; <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 386 cccagcagca atggtaactg <210> 387 <211> 20. <212> ADN <213> artificial <220> ¦ <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 387 tgtaagctag ataaccaatt <210> 388 <211> 20 <212> ¾DN <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 388 aacataaaat cttttgtaag 210> 389 211> 20 2i2¾ ADN 213¾ artificial 220> 223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 389 gtcattctaa ttaaacaatc <210> 390 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 390 gcatcaaaag tgtccattta <210> 391 <211> 20 <212> ADN <213s artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 391 ttttgtgtga gccccatcac <210=> 392 <211» 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitonNEET humana. <400> 392 caatcaggta acttcacgac <210> 393 <211> 20 212 AÍ3N <213> artificial <220 = <223>' Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 393 taaacaatca ggtaacttca 20 <210> 394 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 394 tggaagtcag actcatggcg 20 <210> 395 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 395 acataaaatc ttttgtaagc «210> 396 <211> 20 <212> SDN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 396 gcagtttgca atataccaca <210> 397 <211> 20 <2Z2> AD <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 3S7 tggaactgga agtcagactc 210> 398 211> 20 212> 213> artificial <220> < 3> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 398 tcacgacaag ctgatttgca 210> 399 211> 20 212 213> artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 399 taacttcacg acaagctgat 20 <210> 400 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 400 tttttttttt ttgtttaaac 210> 401 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 401 cacagcttt atctcccaaa <210> 402 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 402 tctttctgga tgtgaaggtt <210> 403 <211> 20 <212 ¾DJJ <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 403 agtacacagc tttatctccc <210> 404 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 404 cgttatgttt tgtgtgagcc 21Q> 405 <211> 20. 212> ADN <213> artificial <220> . <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 405 cagcagcaat ggtaactgct <210> 406 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 406 cacagcttta tctcccaaat <210> 407 <211> 20 <212> áDN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 407 ggtaacttca cgacaagctg <210> 408 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> 223 Polacidad opuesta de la mitoNEET humana <400> 408 cacgatgttt caacaagaca <210> 409 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> PolaridaS opuesta de la mitoNEET humana <400> 409 ttttttgttt aaacaaatgt <210> 410 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 410 aaacgggttc gcgcggccgg <210> 411 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 411 agctttatct cccaaatcct <210> 412 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 412 gatgatcaga gggcccacat <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220= <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 413 tgatgatcag agggcccaca <210=> 414 <211> 20 <212> ADN <213> artificial ' <220> 223> o|arida(j opuesta de la mitoNEET humana <400 414 tttttgttta aacaaatgtg <210> 415 <211 20 <212> ADN <213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 415 aaggcgtgt gcactaggat <210> 416 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 416 ctggaagtca gactcatggc <210> 417 <211> 20 <212> AD[| <213> artificial 220>. <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana c400> 417 acggcagtac acagctttat <210> 418 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 418 ctgcagtttg caatat <210> 419 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 419 gctgcgatcc attcaactcg <210> 420 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de Ta mitoNEET humana <400> 420 aaccaattgc agctgtccca <210> 421 211> 20 <212> AON <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 421 acagctttat ctcccaaatc <210> 422 <211> 20 <212> flDN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 422 tttttggacc tccaacaacg <210> 423 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 423 aactttttgg acctccaaca c210> 424 211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana c400> 424 gcagcaatgg taactgctgc 33 210> 425 211> 20 212> ADN 213> artificial <220 <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 425 gctgtcccag cagcaatggt <210> 426 c211> 20 <212> ADN . . <213> artificial <220> <2 3> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 426 gtacacagct ttatctccca <210> 427 <211> 20 <212> ADN" . . . — <213> artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 427 agaatgggaa ctttttggac <210> 428 <211> 20 <212=· ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 428 atcagagggc ccacattgtc <210> 429 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 429 gctgcagttt gcaatatacc <210:> 430 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 430 taaagcaccg actccgcgat <210> 431 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 431 actcatggcg ccgtcgcttg <210> 432 <211> 20 <212> ADN . . <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 432 gtaactgctg cgatccattc <210> 433 <211> 20 <212 ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 433 agataaccaa ttgcagctgt <210> 434 <211> 20 <212 ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 434 ttcacgacaa gctgatttgc <210> 435 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 435 gtactaaagc accgactccg <210> 436 <;211> 20 <212=> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 436 caaaggcgtg tgcactagga <210> 437 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 437 cttgcaaagg cgtgtgcact <210> 438 c211> 20 ¦=2125 ADN <213> artificial <220¾ <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 438 taaccaattg cagctgtccc 210> 439 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 439 agtgtccatt taagtttctt 36 <210 440 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 440 agcagcaatg gtaactgctg 210> 441 2X1> 20 2125 ADN 213> artificial 220> 222 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 441 aagtgtcca tttaagtttc <210> 442 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 442 gatttgcagc atcaaaagtg 210> 443 211> 20 212> ADN 213> artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 443 aatcaggtaa cttcacgaca 210> 444 21l> 20 212> ADN 213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 444 taattaaaca atcaggtaac 20 <210> 445 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> p0iaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 445 gggttgtctt tctggatgtg <210> 446 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 446 tttttcttga tgatcagagg <210> 447 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 447 tttgcagcat caaaagtgtc <210> 448 <211> 20 ^212' ADN <213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 448 ataaaatct tttgtaagct 210> 449 211> 20 212> ADN 213> artificia] <220> <223> Polaridad opuesra de la mitoNEET humana <400> 449 tgaaggttta tcatagcttt <210> 450 <211> 20 212> ADN" <213 artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 450 gtaagctaga taaccaattg <210> 451 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 451 atgggaactt tttggacctc <210> 452 <211> 20 <212¾ ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 452 tccatttaag tttctttttt <210> 453 <211> 20 '212; ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 453 cagcatcaaa agtgtccatt 210> 454 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta e la mitoNEET humana <400> 454 ggcgccgtcg cttgcaaagg <210> 455 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 455 ggaagtcaga ctcatggcgc <210> 456 <211> 20 <212> ADN <213> artif 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 456 atgtgaaag ctgcagtttg 210> 457 211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 457 tttttttgtt taaacaaatg <210> 458 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 458 cggcgtacta aagcaccgac <210> 459 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET .humana <4O0> 459 ttttggacct ccaacaacgg 210? 460 <211 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223 polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 460 tgttttgtgt gagccccatc <210> 461 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 461 gacaaatgcc ataaatgtga <210> 462 <211> 20 *212= ADN <213> artificial <220> ·. <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 462 cgtactaaag caccgactcc <210> 463 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 463 actggaagt cagactcatg <210> 464 <211> 20 <212> ADN . . . . <213> artificial <220> <:223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 464 tcatagcttt atttcgatga 210> 465 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> ¿223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana ¿400> 465 tcacagaatg ggaacttttt <210> 466 <2li> 20 <212> ADN <213> artificial 220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 466 aatggtaact gctgcgatcc <210> 467 <21Z> 20 212> ADN <:213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 467 tttggacctc caacaacggc <210> 468 <211> 20 212> ADN 213> artificial ¿220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 468 tgcagtttgc aatataccac ¿210> 469 211> 20 <212 ADN <213> artificial «=220> «:223> Polaridad 'opuesta de la mitoNEET humana 400> 46S tggatgtgaa ggtttatcat <210> 470 <211? 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 470 atgtactatc ttggggttgt <210> 471 <211> 20 <212> ADN <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 471 agtttctttt ttcttgatga <210> 472 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 472 ttggggttgt ctttctggat <210> 473 <211> 20 212? ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 473 gttatgtttt gtgtgagccc <210> 474 <211> 20 zl2> ADN . . . . <213> artificial 220> 223 > Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 474 a.caagctga tttgcagcat <210> 475 211> 20 <2,12> ADN ... . . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 475 tttttttttg tttaaacaaa <210> 476 <211 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 476 ctcatggcgc cgtcgcttgc <210> 477 <212> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> '477 ggggttgtct ttctggatgt 210> 478 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 478 tcatggcgcc gtcgcttgca <210> 479 <2ll> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> p0iari(jad opuesta de la mitoNEET humana <400>·· 479 ataaccaatt gcagctgtcc <210> 480 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <4O0> 480 ttgcagcatc aaaagtgtcc <210> 481 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 481 ctgatttgca gcatcaaaag 210> 482 211> 20 212 > ADN 213> artificial Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 482 cttcacgaca agctgatttg <210> 483 <211> 20 <212¾ ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 483 catagcttta tttcgatgat <210> 484 <211> 20 c212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana c400> 484 gtttatcata gctttatttc <210> 485 <211> 20 <212> ADN <213> artificisl <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 48S ctggatgtga aggtttatca <210> 486 211> 20 <2i2> A3DN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoUEET humana <400> 486 gttttgtgtg agccccatca <210> 487 <211> 20 <212> Affl <213> artificial <220> ·· . 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 487 aagtgtccat ttaagtttct 488 artificial 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 488 tgtactatct tggggttgtc 210> 489 <211> 20 212> ADN 213> artificial <220> < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 489 atgatcagag ggcccacatt <21Q> 490 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220=> <223> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. <400> 490 ggcgtactaa agcaccgact <210> 491 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <:220> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. <400> 491 taaaatcttt tgtaagctag <210> 492 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. <400¾ 492 gcagcatcaa aagtgtccat <210> 493 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <222> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. 400> 493 cacgacaagc tgatttgcag <210> 494 <211> 20 * 12¾ ADK <213> artificial <220> „ <223> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. <400> 494 acrtcacgac aagctgattt <210> 495 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 495 caagctgatt tgcagcatca <210> 496 2X1> 20 <2X2> MSS <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 496 cagcaatggt aactgctgcg <210> 497 <211> 20 <2i2> <213> artificial <220> ' " <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 497 attgcagctg tcccagcagc 210 498 <211> 20 <212> ADN 212> artificial <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 498 ggatgtgaag gtttatcata <210> 499 < m213u> a¾rtificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 499 ccatttaagt ttcttttttc <210> 500 <211> 20 <212> MM <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoKEET humana. <400> 500 ttttttttgt ttaaacaaat <210> 501 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Plaridad opuesta de la mitoMEET humana. <400> 501 tggggttgtc tttctggatg c210> 502 <211> 20 <2i2> AM <213> artificial <220s < 23> Polaridad opuesta de la mitoNEET iimana <400> 502 cagaatggga actttttgga <210> 503 <211s 20 <213> artificial <220> <223> Polaridad apuesta de la mitoKEET humana. <400> 503 atcaggtaac ttcacgacaa <210> 504 <213> artificial <220 . <223> Polaridad opuesta de la mitoMEET humana. <400> 504 gtgccagcgg cgtactaaag <210> 505 <211> 20 <212> HM <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la flátoMEET humana. <400> 505 cgcttgcaaa ggcgtgtgca <210> 506 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <2 3> Polaridad opuesta de la nátoHEET humana. 400> 506 tttgtgtgag ccccatcaca <210> 507 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoMEET humana. <-900> 507 actggaagtc agactcatgg <210> 508 <211> 20 <212> AEH <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoHEET humana. <400> 508 ttgcagctgt cccagcagca <210> 509 c211> 20 <=212> M <213> artificial <220> <223¾ Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 509 gtgaaggttt atcatagctt <210> 510 <2?a> 20 <212> ADN <213> ártificial <220> <223=> Polaridad opuesta de la natoHEET humana. <400> 510 tgctgcgatc cattcaactc <210> 511 <211> 20 <212> -DN <213> artificial <220> · · ¦ <223> Polaridad opuesta de la initoHEET humana. <400> 511 acagaatggg aactttttgg <210 512 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitoHEET humana. <400 512 tcaggtaact tcacgacaag <210> 513 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> , . <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 513 aaatgtgaaa gctgcagttt <210> 514 <211> 20 <2i2> ADN ¾213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoHEET humana. <400> 514 gcggcgtact aaagcaccga <210> 515 211> 20 <2i2> ADH <213> artificial 220> <223> Polaridad, opuesta de la mitoíIEET humana. <400> 515 ttgcaaaggc gtgtgcacta <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> · <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 516 taactgctgc gatccattca <210> 517 <211> 20 <212> ADU <213> artificial <220> · · <223> Polariodad opuesta de la mitoNEET humana. 400> 517 aaatctttt gtaagctag <210> 518 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 518 ctttttggac ctccaacaac <210> 519 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <:223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 519 gatcagaggg cccacattgt <210> 520 <:211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 520 ttttcttgat gatcagaggg <210> 521 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoBEET humana. <400> 521 caaaagtgtc catttaagtt <210> 522 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 522 cgacaagctg atttgcagca <210> 523 211> 20 <212> ADN <213> artificial. <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 523 gataaccaat tgcagctgtc <210> 524 <211s 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> 223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <40D> 524 aatgggaact ttttggacct <210> 525 <211> 20 <212> AD1Í <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 525 gtgtgagccc catcacagaa <210> 526 <211> 20 <212> ADU <213> artificial <220> ; . ¦ - <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 526 aacttcacga caagctgatt <210> 527 <211> 20 <212> <213> artificial <220> <223 Polaridad opuesta de la mitiEET humana. <400> 527 gcgtactaaa gcaccgactc <210> 528 <211> 20 <212>ADÍJ . <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 528 actgctgcga tccattcaac <210> 529 <211> 20 <212>ADN <213 artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 529 tacacagctt tatctcccaa <210> 530 <211> 20. <212> AOT <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoíJEET humana <400> 530 cacagaatgg gaactttttg 210> 531 211> 20 212> Affi 213> artificial 220> 223> Polaridad opuesta de la iidtoNEET humana. 400> 531 agctgattt gcagcatcaa <210 532 <211> 20 212> ¿j ¦ <2?-3 · artificial <220> 223 Polaridad opuesta de la mitoMEET humana. <400> 532 tggcgccgtc gcttgcaaag <210> 533 <211> 20 <2i2> AM <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoHEE humana <400> 533 tgcagctgtc ccagcagcaa <210> 534 <211> 20 <2i2> ADN <¿213> artificial <220> <223s Polaridad opuesta de la mitoHEET humana <400> 534 catggcgccg tcgcttgcaa <210> 535 <211> 20 <212 ADN <t213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 535 catcaaaagt gtccatttaa 210> 536 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 536 cgtcgcttgc aaaggcgtgt 210> 537 211> 20 212> ADN 213 .- artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 537 gctgatttg cagcatcaaa <210P 538 <21J> 20 <2i2> ADN <213 artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 538 taagctagat aaccaattgc <210> 53S <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 539 aaaagtgtcc atttaagttt 210> 540 <211> 20 «:212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 540 tgtttcaaca agacaaatgc 210> 541 211> 20 212=> ADN 213> artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humi 400> 541 tgtttcaac aagacaaatg <210 542 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 542 gtctttctgg atgtgaaggt <210> 543 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 543 atggcgccgt cgcttgcaaa <210> 544 <211> 20 <212 ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 544 agccccatca cagaatggga <210> 545 <211> 20 ; <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 545 ttcttgatga tcagagggcc <210> 546 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400¾ 54fi caggtaactt cacgacaagc <210> 547 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la initoNEET humana. <400> 547 accaattgca gctgtcccag <210> 548 <21J> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223¾ Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 548 actttttgga cctccaacaa <210> 549 <211's 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la. mitoNEET humana. <400> 549 tgtgagcccc atcacagaat <210> 550 <211> 20 <212> ADN <:213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 550 gctgatttgc agcatcaaaa <210> 551 <211> 20 <2i2> ADN <213> · artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 551 aactgctgcg atccattcaa <210> 552 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 552 taaatgtgaa agctgcagtt <210> 553 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 553 ctgctgcgat ccattcaact <210> 554 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> Z23> olaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 554 tttcttgatg atcagagggc 9 «;210> 555 <2X1> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400=> 555 agctgtccca gcagcaatgg <210> 556 <2ll> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 556 teaaaagtgt ccatttaagt <210> 557 <211> 20 212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET hi <400> 557 acaagctgat ttgcagcatc <210> 558 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> . polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 558 agcggcgtac taaagcaccg <210> 559 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 559 tcgcttgcaa aggcgtgtgc <210:> 560 <211> 20 <212> <213> ar xficial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 560 tagataacca attgcagctg <210> 561 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 561 ctagataacc aattgcagct <210> 562 <211> 20 <212> &£SN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <400> 562 gatgtgaagg tttatcatag <210> 563 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> ¦ <223? Polaridad opuesta de la mitoNEET humanan. «:400> 563 gaatgggaac tttttggacc «210:» 5S4 <211> 20 <212> A <213> artificial ¾220> <223> Polaridad opuesta de la mitoNEET humana. <40Q> 564 atcaaaagtg tccatttaag 20 <210> 565 <211> 20 <2i2> AD <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 565 tgccagcggc gtactaaagc <210> 566 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 566 acgacaagct gatttgcagc <210> 567 <211> 20 <212> ADN <213 artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 567 aggtaacttc acgacaagct <210> 568 <211> 20 <2i2> ADN- <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 568 cagcggcgta ctaaagcacc <210> 569 <211> 20 <2i2 ADN <213> artificial <220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400 569 gccagcggcg tactaaagca <210> 570 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 570 aaatcttttg taagctagat <210> 571 <211¾ 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> .571 aatcttttgt aagctagata <210¾ 572 <211> 20 212> AD . _ . . - <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 572 cccatcacag aatgggaact <210> 573 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 573 gccccatcac agaatgggaa 210> 574 <211> 20 «212* AD <213> artificial 220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 574 atcttttgta agctagataa <210> 575 211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 575 gagccccatc acagaatggg <210> 576 <211> 20 <212> ADN <213> artifxcial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 576 ccaattgcag ctgtcccagc <210> 577 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 577 ataaatgtga aagctgcagt <210> 578 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 578 aagacaaatg ccataaatgt <210> 579 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 579 aagctagata accaattgca <210> 580 <211> 20 <212> ADN <213 > artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 580 ttgtgtgagc cccatcacag <210> 581 <211> 20 <212> AD ' <213 > artificial c220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 581 tgtgtgagcc ccatcacaga 210> 582 211> 20 212> ADN . , 213 > artificial 220> 2Z3> polaridad opuesta de la mitoNEET hum¡ 400> 582 aattgcagc tgtcccagca <210> 583 <211> 20 <212> ADff <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 583 tttcaacaag acaaatgcca <210> 584 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220 > <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 584 cagctgtccc agcagcaatg <210> 585 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223 polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 585 ttcaacaaga caaatgccat <210> 586 «211> 20 <212> ÁDN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 586 tgatcagagg gcccacattg <210> 587 <211> 20 <212> ADN 213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 587 ccagcggcgt actaaagcac <210> 588 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 588 ccccatcaca gaatgggaac <210> 589 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 589 tgagccccat cacagaatgg <210> 590 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 590 aattgcagct gtcccagcag <210> 591 c211> 20 <2i2> AD <213> artificial <220> 2 3> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 591 tcttttgtaa gctagataac <210> 592 <211> 20 <212> ADN... . . <213> artifícaal <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 592 atgtgaaggt ttatcatagc <210> 593 <211> 20 <212> ADN. , . . . <213> artificial <220> <2 3> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 593 gtttcaacaa gacaaatgcc <2io> 594 <211> 20 <2i2> ADN 213 artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 594 caaatgccat aaatgtgaaa 67 <210> 5S5 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> 223 polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 595 acaaatgcca taaatgtgaa <210> 596 <211> 20 <212 ÁDN <213> artificial <220> <223> 0iaridati opuesta de la mitoNEET humana <400> 596 tcaacaagac aaatgccata 210> 597 211> 20 212> AD 213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 597 gtcgcttgca aaggcgtgtg 210> 598 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 598 cataaatgtg aaagctgcag <210> 599 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 599 caacaagaca aatgccataa <210> 600 «=211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 600 aaatgccata aatgtgaaag <210> 601 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 601 agacaaatgc cataaatgtg <210> 602 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 602 tcttgatgat cagagggccc <210> 603 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 603 gcagctgtcc cagcagcaat <210=. 604 <211> 20 212> ADN ¦=213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 604 ccataaatgt gaaagctgca 210> 605 211> 20 212> ADN 213> artificial 220> 223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana 400> 605 atgccataa atgtga <210> 606 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> 222> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 606 cttgatgatc agagggccca <210> 607 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 607 caagacaaat gccataaatg <210> 608 ¦=211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 608 ttgatgatca gagggcccac <210> 609 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial 220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 609 atgccataaa tgtgaaagct <210> 610 ¿211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 610 acaagacaaa tgccataaat <210> 611 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 611 tgtgaaggtt tatcatagct <210> 612 <211> 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 612 aacaagacaa atgccataaa <210> 613 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad . opuesta de la mitoNEET humana <400> 613 gtgagcccca tcacagaatg <210> 614 <211> 20 <212=> ADN 213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 614 tgccataaat gtgaaagctg <210> 615 <211> 20 <212> AD <213> artificial <220=> <223 > polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 615 gctagataac caattgcagc <210> 616 211? 20 <2i2> ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <40O> 616 agctagataa ccaattgcag <210> 617 <211? 20 <2i2 ADN <213> artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET hi <400> 617 gccataaatg tgaaagctgc <210> 618 211 20 <2iz> ADN <213> Artificial <220> <223> polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400 618 tcctagtgca cacgcctttg <210> 619 ¦<211> 21 <212 ADN <213> Artificial <220> <22 > polaridad opuesta de la mitoNEET humana <400> 619 actcgtacgc tggaactgga a <210> 620 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial ¿220> <223> <400> 620 aagcgacggc gccatgagtc <210> 621 ¿211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador delantero de la PCR de ciclofilina humana <400> 621 cccaccgtgt tcttcgacat <2ia> 622 <211> 22 < 12> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador inverso de la PCR de ciclofilina hi <400> 622 tttctgctgt ctttgggacc tt <210> 623 <211> 24 <2i2> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador de sonda de la PCR de ciclofilina humana <400> 623 cgcgtctcct ttgagctgtt tgca <210> 624 <211> 636 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 624 gatcgcggag tcggtgcttt agtacgccgc tggcaccttt actctcgccg gccgcgcgaa cccgtttgag ctcggtatcc tagtgcacac gcctttgcaa gcgacggcgc catgagtctg acttccagtt ccagcgtacg agttgaatgg atcgcagcag ttaccattgc tgctgggaca gctgcaattg gttatctagc ttacaaaaga ttttatgtta aagatcatcg aaataaagct 240 atgataaacc ttcacatcca gaaagacaac cccaagatag tacatgcttt tgacatggag 300 gatttgggag ataaagctgt gtactgccgt tgttggaggt ccaaaaagtt cccattctgt 360 gatggggctc acacaaaaca taacgaagag actggagaca atgtgggccc tctgatcatc 420 aagaaaaaag aaacttaaat ggacactttt gatgctgcaa atcagcttgt cgtgaagtta 480 cctgattgtt taattagaat gactaccacc tctgtctgat tcaccttcgc tggattctaa 540 atgtggtata ttgcaaactg cagctttcac atttatggca tttgtcttgt tgaaacatcg 600 tggtgcacat ttgtttaaac aaaaaaaaaa aaaaaa 636 <210> 625 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 625 Met Ser Leu Thr Ser Ser Ser Ser Val Arg Val Glu Trp lie Ala Ala 1 5 10 15 Val Thr lie Ala Ala Gly Thr Ala Ala lie Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys 20 25 30 Arg Phe Tyr Val Lys Asp His Arg Asn Lys Ala Met lie Asn Leu His 35 40 45 Gln Lys Asp Asn Pro Lys lie Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp 50 55 60 Leu Gly Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro Phe Cys Asp Gly Ala His Thr Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Val Gly Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Glu Thr 100 105 <210> 626 <211> 106 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 626 Met Ser Met Thr Ser Ser Val Arg Val Glu Trp lie Ala Ala Val Thr 1 5 10 15 lie Ala Ala Gly Thr Ala Ala lie Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys Arg Phe 20 25 30 Tyr Val Lys Asp His Arg Asn Lys Ser Met lie Asn Pro His lie Gln 35 40 45 Lys Asp Asn Pro Lys Val Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp Leu Gly 50 55 60 Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Lys Phe Pro Leu 65 70 75 80 Cys Asp Gly Ser His Thr Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp Asn Val 85 90 95 Gly Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Asp Thr 100 105 <210> 627 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <40D> 627 Met Gly Leu Ser Ser Asn Ser Ala Val Arg Val Glu Trp lie Ala Ala 1 5 10 15 Val Thr Phe Ala Ala Gly Thr Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys 20 25 30 Lys Phe Tyr Ala Lys Glu Asn Arg Thr Lys Ala Met Val Asn Leu Gln 35 40 45 lie Gln Lys Asp Asn Pro Lys Val Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp 50 55 60 Leu Gly Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro Phe Cys Asp Gly Ala His lie Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp 85 90 95 Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Glu Thr 100 105

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de polaridad opuesta de 8 a 30 nucleobases de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la mitoNEET, en el que dicho compuesto de polaridad opuesta se híbrida específicamente con e inhibe la expresión de la mitoNEET.

2. - El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un oligonucleótido de polaridad opuesta.

3. - El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho oligonucleótido de polaridad opuesta comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia ácidos nucleicos SEQ ID N° 1 - SEQ ID N°: 617.

4. - El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho oligonucleótido de polaridad opuesta comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 617.

5.- El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho oligonucleótido de polaridad opuesta consta de ai menos 8 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 617.

6.- El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho oligonucleótido de polaridad opuesta consta de una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 617.

7.- El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, ó 6, caracterizado además porque el oligonucleótido de polaridad opuesta comprende al menos un enlace internucleósido modificado.

8. - El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque el oligonucleótido de polaridad opuesta comprende al menos un resto de azúcar modificado.

9. - El compuesto de polaridad opuesta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, caracterizado además porque el oligonucleótido de polaridad opuesta comprende al menos una nucleobase modificada.

10. - Una composición que comprende un compuesto de polaridad opuesta como el que se reclama en la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11.- El uso de un compuesto de polaridad opuesta como el que se reclama en la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, para preparar un medicamento para el tratamiento de un ser humano que tiene una enfermedad o afección asociada a mitoNEET.

12.- El uso que se reclama en la reivindicación 12, en donde la enfermedad o afección se selecciona entre diabetes, un trastorno inmunológico, un trastorno cardiovascular que incluye hipertensión, un trastorno neurológico, y lesión de isquemia/reperfusión.