HIBRIDOS DE ACIDOS NUCLEICOS INTERFEREN ES CORTOS Y METODOS DE LOS MISMOS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En años recientes se ha aceptado que la interferencia del ARN está mediada por moléculas de ARN interferentes cortas ("ARNic") que exhiben efectos silenciadores de genes específicos de secuencia. Aunque el mecanismo detallado del silenciamiento del ARNic no se entiende por completo, los genes pueden ser silenciados o deshabilitados mediante la degradación de ARNm celular, al introducir una molécula de ARNic que sea homologa a los genes blanco. Investigaciones experimentales previas que incluyeron el uso de moléculas antisentido, demostraron que la terapia antisentido es excelente contra infecciones virales, pero su utilidad fue desestimada por el hecho de que la vida media de las moléculas antisentido es muy corta. Así mismo, la terapia antisentido es un proceso pasivo en el que simplemente se bloquea la traducción del ARNm viral, mientras que el ARNi en realidad degrada al ARNm. Un trabajo similar que incluyó la transfección de un plásmido productor de ARNic en células, funcionó bien en estudios de mutagénesís, pero un proceso activo tal como éste podría no ser tan útil para la protección de largo plazo de un proceso genético, tal como una infección microbiana. Ref.162437 Las siguientes referencias se relacionan con la tecnología del silenciamiento de genes y se incorporan en la presente en su totalidad como referencia. Referencias : 1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Rostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998) Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature. 408, 325-330. 2. Kennerdell, J.R. , and Carthew, R.W. (1998) Use of dsRNA-mediated genetic interference to demónstrate that frizzled and frizzled 3 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026.
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SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una nueva composición y un método para utilizarla para inhibir la función génica en cualquier organismo o célula, tanto in vitro como in vivo en procariotes y eucariotes. Los híbridos de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico interferentes cortos de la presente invención, se pueden utilizar para hacer blanco e inhibir la función de cualquier gen para el cual se pueda identificar una secuencia específica, independientemente de la función o fuente del gen. En modalidades específicas, la presente invención proporciona una composición que está compuesta por porciones complementarias hibridizadas de cadenas sencillas de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, que se hibridizan con otras cadenas sencillas de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un híbrido-ic que tiene una porción hibridizada y cuando menos un sobrante en el extremo 31. La porción hibridizada del híbrido-ic puede ser tan larga como diez a cien pares de bases de longitud, dependiendo del gen y del organismo o célula a la cual es aplicado. La presente invención también proporciona una composición que está compuesta de porciones complementarias hibridizadas de cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, que se hibridizan con otras cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un Híbrido-ic que tiene una porción hibridizada con una longitud de 19 a 21 pares de bases y dos sobrantes en los extremos 31 que tienen de 2 a 3 bases de longitud. Adicionalmente, la presente invención proporciona una composición que está compuesta por porciones complementarias hibridizadas de cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, que se hibridizan con otras cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un Híbrido-ic que tiene una porción hibridizada con una longitud de 21 pares de bases y dos sobrantes en los extremos 3' que tienen 2 bases de longitud. La presente invención también proporciona un método para preparar las composiciones de Híbrido-ic, proporcionando cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se hibridizan con otras cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un Híbrido-ic que tiene una porción hibridizada y cuando menos un sobrante en el extremo 3". La presente invención además proporciona un método para preparar las composiciones de Híbrido-ic, al proporcionar cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se hibridizan con otras cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un híbrido-ic que tiene una porción hibridizada con una longitud de 19 a 21 pares de bases y dos sobrantes 31 que tienen de 2 a 3 bases de longitud. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para preparar las composiciones de híbrido-ic, proporcionando cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se hibridizan con otras cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar un híbrido-ic que tiene una porción hibridizada con una longitud de 21 pares de bases y dos sobrantes 3' que tienen 2 bases de longitud. La presente invención también proporciona un método para preparar una pluralidad de composiciones de híbrido-ic, proporcionando múltiples cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se hibridizan con otras múltiples cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, para formar una pluralidad de Híbridos-ic que tienen porciones hibridizadas con una longitud de 19 a 21 pares de bases y cuando menos un sobrante en el extremo 3' que tiene de 2 a 3 bases de longitud. La presente invención también proporciona un método para preparar una pluralidad de composiciones de híbrido-ic, proporcionando múltiples cadenas simples de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico que se hibridizan con otras múltiples cadenas simples de diferentes tipos de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico,, para formar una pluralidad de Hibridos-ic que tienen porciones hibridizadas con una longitud de 21 pares de bases y dos sobrantes 3' que tienen 2 bases de longitud. Otra modalidad de la presente invención es un método para aplicar los Híbridos-ic directamente a un sustrato o a un sustrato que utiliza un agente de transfeccion, para silenciar un solo gen o una pluralidad de genes, en donde el sustrato es una célula o un organismo que es un virus, un procariote, una bacteria, un eucariote, células eucarióticas , un vertebrado, un mamífero, un primate, un ser humano, células humanas, una planta, un insecto o un hongo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una ilustración de una molécula de híbrido-ic . La Figura 2 muestra el silenciamiento del gen G6PD, mediante una administración sin ayuda de ARNic y moléculas de híbrido-ic, en células de mamíferos. Las Figuras 3A-3D son gráficas que muestran que la conformación del ácido nucleico de las moléculas interferentes cortas, altera el grado y la persistencia de silenciamiento génico mediado por ARNic, en células de mamíferos. Las Figuras 4A-4C son gráficas que muestran las respuestas al grado y duración de efectos de silenciamiento génico en dos tipos de células de mamífero. La Figura 5 muestra la formación de UFC en células bacterianas con silenciamiento de un gen de resistencia a antibióticos . La Figura 6 muestra la formación de UFC en células bacterianas con silenciamiento del gen folA. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las tres debilidades más grandes del ARNic son sus efectos de corto plazo, su ineficacia en bacterias y el requerimiento de administración auxiliada a las células. La transfección es una estrategia para distribuir genes y otros ácidos nucleicos en células eucarióticas . Existen tres categorías de técnicas de transfección: métodos bioquímicos, métodos físicos y métodos mediados por virus. La técnica de transfección empleada está determinada por el estrés de la transfección sobre las células y la eficiencia del método. Las técnicas bioquímicas incluyen aquélla mediada por fosfato de calcio, la mediada por DEAE-dextr n y la lipotransfección. Los métodos físicos incluyen la electroporacion y la biolística. En bacterias, la incorporación del ácido nucleico se denomina transformación. Las membranas de bacterias deben ser tratadas para permitir que las células sean "competentes" para incorporar ácido nucleico extraño. Las dos técnicas de transformación son el choque térmico y la electroporacion. La corta duración es una característica del ARNic que evita cualquier uso clínico significativo. Las aplicaciones potenciales incluyen terapia del cáncer, agentes antivirales y curación para ciertas enfermedades genéticas, en donde todas éstas requieren un proceso de acción prolongada para facilitar la distribución y la efectividad. Los usos que pueden incluir un tratamiento de vida corta, como agente antibacteriano, por ejemplo, quedan eliminados debido a la ineficacia del AR ic en bacterias. La construcción del h£brido-ic que se describe en la presente, resuelve ambos problemas. En la presente se describen moléculas de híbrido-ic que tienen una función similar al ARNic, pero que son mucho más efectivas en el silenciamiento de genes. En vez de una molécula de ARN de doble cadena, una molécula de híbrido-ic comprende una cadena de ácido nucleico, e.g. , ARN, hibridizada con una segunda cadena de ácido nucleico que es de un tipo diferente al ácido nucleico de la primera, e.g., ADN. El híbrido-ic creado mediante la hibridación de los dos diferentes tipos de ácidos nucleicos, tiene una porción complementaria hibridizada y cuando menos un sobrante en el extremo 31. Se pueden utilizar análogos de ácido nucleico en vez de ácidos nucleicos. El término "análogo de ácido nucleico" se refiere a nucleótidos o estructuras de soporte de origen natural o no natural, tales como ácido péptidonucleico (APN) . Las funciones exclusivas de los Híbridos-ic se pueden relacionar con la estabilidad de la molécula. Una molécula de ARN de doble cadena es inherentemente inestable; es degradada rápidamente en células de mamíferos y casi instantáneamente en bacterias. Un híbrido ADNiARN, por el contrario, es la molécula de ácido nucleico corta más estable por los materiales naturales y la construcción no se degrada en células, en bacterias o en células de mamífero. Los resultados experimentales indican que los híbridos ADN:AR son silenciadores de genes más potentes que el ARNic. Lógicamente, mientras más estable sea la molécula, podrá ser un agente silenciador de genes más potente. Por lo tanto, un híbrido-ic que comprende cuando menos un APN o una molécula hecha con análogos de ácidos nucleicos sintéticos, podría ser igualmente efectiva o más potente que un híbrido ADN:AR , si el híbrido-ic sintético es más estable que el híbrido de ADN:ARN. Con referencia a la Figura 1, los Híbridos-ic más efectivos tienen una porción complementaria hibridizada (2) que tiene de 19 a 21 pares de bases de longitud y cuando menos un sobrante en el extremo 31 (4) que tiene cuando menos 2 bases de longitud. La porción complementaria hibridizada de la molécula puede tener hasta 100 pares de bases. Generalmente, mientras más corta es la longitud, menor será la especificidad. Sí el híbrido-ic contiene menos de diez pares de bases, perderá especificidad para silenciar un gen. Por otro lado, una molécula larga tendrá más dificultades para entrar a la célula y, por lo tanto, no podrá silenciar al gen. Así pues, un híbrido-ic que contiene más de 100 pares de bases, tendrá dificultades para entrar a una célula. Un híbrido-ic con una secuencia común a más de un gen, se puede utilizar para silenciar múltiples genes de manera simultánea. Así mismo, es posible utilizar múltiples Híbridos-ic para silenciar múltiples genes . El silenciamiento de múltiples genes es especialmente útil para propósitos de antibióticos, debido a que el silenciamiento de más de un gen, de manera simultánea, es posible que mate a las bacterias de manera más selectiva y eficiente que el silenciamiento de solamente un gen. El silenciamiento de múltiples genes también es útil para propósitos terapéuticos en seres humanos . Por ejemplo, al suprimir múltiples genes responsables del crecimiento de un tumor, se puede inhibir eficientemente el crecimiento del mismo, lo cual podría no ser logrado al suprimir sólo un gen. Las moléculas de híbrido-ic tienen un potencial casi universal. Se pueden utilizar para silenciar genes en la(s) célula (s) de un organismo. Se pueden emplear para propósitos de terapia o investigación. Se pueden usar como agentes antibióticos, antivirales y agentes de terapia para el cáncer, y también se pueden utilizar para el tratamiento de varias enfermedades genéticas causadas por la expresión excesiva no deseada de un gen. Además, se pueden emplear en plantas para curar enfermedades de las mismas, mejorar sus rasgos, tales como el rendimiento, el color, la tolerancia ambiental, o la calidad. Al silenciar selectivamente uno o más genes, los Híbridos-ic se pueden usar como herbicidas, insecticidas, pesticidas y fungicidas . Los Híbridos-ic se pueden utilizar para prevenir la infección viral de células . Al encontrar los genes que son únicos y esenciales para la infección viral, tales como genes de proteinasa o genes de transcriptasa reversa, la construcción de los correspondientes Híbridos-ic y la aplicación de dichos Híbridos-ic a las células, hará que los virus puedan ser eliminados y la infección viral se pueda curar mediante el silenciamiento de los genes. Además, un híbrido-ic se puede emplear como antibiótico, mediante el silenciamiento de rutas génicas esenciales de las bacterias. El silenciamiento de tales rutas proporciona un mecanismo para matar células bacterianas . Además, los Híbridos-ic se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades en seres humanos o animales, las cuales son causadas por la expresión excesiva de genes o por la presencia de genes que causan enfermedades. Tales enfermedades pueden incluir, pero no se limitan a enfermedades autoinmunitarias , tumores, enfermedades inflamatorias e hipertensión. Los Híbridos-ic también se pueden emplear para suprimir genes que se expresan normalmente, para propósitos terapéuticos. Por ejemplo, para hacer posibles trasplantes exitosos de órganos, se pueden suprimir los genes relacionados con la respuesta inmunitaria de rechazo. Formulación y Vías de Administración: Los Híbridos-ic se pueden formular en una forma farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la forma farmacéutica puede ser adecuada para administración intravenosa en seres humanos . Las formas farmacéuticas pueden incluir excipientes, vehículos, soluciones reguladoras, agentes osmóticos y similares farmacéuticamente aceptables, los cuales son conocidos en la técnica. La formulación puede incluir otros ingredientes farmacéuticamente activos para terapias de combinación. La formulación también se puede diseñar para una utilidad específica, en una forma farmacéutica en polvo, sólida, líquida o gaseosa. Los Híbridos-ic se pueden administrar por vía oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral , intramuscular, intramedular, parenteral, transdérmica, nasal o rectal. La forma en la que se administran los Híbridos-ic depende, cuando menos en parte, de la vía de administración. Parte Experimental: Se llevaron a cabo experimentos en células de mamífero y células bacterianas, tal como se describe en las secciones que se presentan a continuación. La concentración del híbrido-ic utilizada en los experimentos en células de mamífero, varió de 10 a 25 //g por 1 x 106 células de concentración final. La concentración del hlbrido-ic utilizado en los experimentos en células bacterianas, varió de 0.25 a 4 µg por mililitro de concentración final. Aunque estos experimentos demostraron que el rango fue efectivo para silenciar genes, la concentración efectiva más baja real puede ser mucho más baja que 10 xg por 1 x 10s células ó 0.25 µg por mililitro. Sumario de Células de Mamífero: Se desarrolló un proceso para probar los efectos de los Híbridos-ic en varios oncogenes y genes supresores de tumores. La meta fue desarrollar una manera de apagar un gen particular por un tiempo prolongado y observar los efectos. Se utilizaron los Híbridos-ic para silenciar el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) en células normales y cancerosas de origen humano y de hámster. Los resultados demostraron que los Híbridos-ic fueron más potentes que el ARNic y el ADNic en suprimir la expresión del gen G6PD, tanto en magnitud como en duración. Los resultados también demostraron que la potencia del híbrido-ic es independiente de la orientación del ADN:AR . En los experimentos de silenciamiento de genes con ARNic. y el híbrido-ic, sólo se utilizó la lipotransfección. La lipotransfección incluye el revestir el ácido nucleico que se va a administrar a las células, con lípidos catiónicos que se unen a las moléculas de dicho ácido nucleico. La membrana artificial se fusiona con la membrana celular, la cual también está hecha de lípidos, pero tiene carga negativa. Para los experimentos de administración sin ayuda, las construcciones se agregaron directamente al medio . No fueron necesarios medios o agentes de transfección; simplemente agregar los Híbridos-ic al medio fue suficiente. La Figura 2 muestra el silenciamiento del gen G6PD mediante la distribución sin ayuda de moléculas de ARNic y el híbrido-ic. En un experimento diferente, los Híbridos-ic se agregaron a células en división y después se hicieron crecer dichas células durante cuando menos ocho días. A varios intervalos durante los ocho días, se intentó inducir el gen G6PD y se observó una expresión del gen menor al 40%. Las células control demostraron una actividad normal de G6PD y las células a las que se les agregaron moléculas de ARNic convencionales, mostraron que la actividad normal de G6PD regresó al 100% de expresión génica en un periodo de dos días. Estas observaciones muestran que los Híbridos-ic se pueden utilizar para silenciar casi todos los genes en células de mamífero. Esta función se puede aprovechar para suprimir cualquier enfermedad que cause la expresión excesiva de genes, proporcionando de esta manera un tratamiento efectivo para ella. Sumario de Células Bacterianas ; La notable eficacia del silenciamiento de genes con el uso de Híbridos-ic en células de mamífero, sugirió su uso en células bacterianas, bajo la premisa lógica de que su notable longevidad en células de mamíferos le permitiría actuar similarmente en bacterias . Los primeros genes blanco fueron simples: genes de resistencia a antibióticos ubicados en plásmidos transformados en bacterias. Cuando se hicieron crecer en medios que contenían antibióticos, sólo la actividad de los genes contenidos en estos plásmidos le permite a las bacterias sobrevivir. Se utilizó E. coli para todas las pruebas bacterianas, ya que estas bacterias son fáciles de obtener y seguras de utilizar. Como el mecanismo por el cual las bacterias degradan el ARNic se supone que es el mismo en todas las bacterias, se asume que esta prueba es razonable. En una serie de experimentos, se silenciaron genes que proporcionan resistencia a la ampicilina y el cloranfenicol , que son dos antibióticos comunes. En todos los casos, las bacterias que eran capaces de crecer con facilidad en medios que contenían antibióticos, murieron cuando se agregaron al medio los Híbridos-ic contra el gen de resistencia a antibióticos. No fueron necesarias etapas de transformación ni ningún medio o agente de transfeccion; simplemente agregar los Híbridos-ic al medio fue suficiente. Así mismo, cuando los Híbridos-ic no hicieron blanco en el gen en cuestión cuando fueron agregados al medio, no hubo ningún efecto; las bacterias crecieron exactamente como si nada se hubiera agregado . Esto demostró que lo que se observó era un efecto dirigido, no un efecto de matar células de manera no específica. Para confirmar el efecto de silenciamiento de genes en bacterias, se hizo blanco en el gen folA, el cual produce la proteína DHFR y proporciona un mecanismo de síntesis de purina en bacterias. En medios "ricos" suplementados con purinas, el producto génico no es necesario. Cuando se agregaron los Híbridos-ic silenciadores de DHFR a las bacterias en crecimiento en medio rico, no hubo efecto. Sin embargo, en medios mínimos que no están suplementados con purinas o pirimidinas, la proteína DHFR es necesaria para la supervivencia de las células . Les permite a las células sintetizar purinas a partir de otras moléculas, tales como timidina o adenina. En medios mínimos, si el gen folA no es funcional, entonces las células no pueden realizar la síntesis de ADN y por lo tanto no crecerán. Al agregarle al medio una purina o pirimidina (nucleósido) , tal como adenina o timidina, las células comenzarán a crecer nuevamente puesto que ya no se requiere a la proteína DHFR para la síntesis de purinas. Para este experimento, se agregó el híbrido-ic antagonista de folA al medio y después se añadió ampicilina. Todas las células que adquirieron los Híbridos-ic dejaron de dividirse; aquéllas que no lo hicieron, fueron muertas por la ampicilina, la cual sólo mata células en división. Las células se sacaron del medio que contenía ampicilina y se resuspendieron en medio mínimo que no contenía Híbridos-ic, ampicilina ni nucleósidos .
Inmediatamente después de la adición de purinas al medio, las células comenzaron a crecer a una velocidad normal . Nuevamente, al agregar los Híbridos-ic dirigidos contra genes no esenciales o no expresados, no se obtuvo ningún efecto. Agregar moléculas de ARNic de la misma secuencia que los Híbridos-ic, tampoco tuvo algún efecto. Estos experimentos demuestran que el silenciamiento de genes fue específico y no letal y no es posible con los tratamientos con ARNic convencionales. Los resultados descritos en este experimento, demuestran que al seleccionar un gen único, necesario para la vitalidad de la bacteria, para bacterias específicas, los Híbridos-ic pueden actuar como antibiótico para aquellas bacterias específicas, mediante el silenciamiento del gen. Debido a que las bacterias tienen pared y membrana celular, los resultados de este experimento sugieren que los Híbridos-ic se pueden aplicar directamente a células de mamífero, para ejercer los efectos de silenciamiento de genes, en vez de utilizarse mecanismos de transfección, ya que las células de mamífero sólo tienen una membrana celular que es más fácil para que los Híbridos-ic penetren, y los Híbridos-ic son relativamente más estables que el ARNic. Por lo tanto, además de distribuir Híbridos-ic a las células por medio de transfección, tal como liposomas, proteínas y secuencias de ácido nucleico, los Híbridos-ic también se pueden utilizar directamente para el tratamiento de enfermedades, sin la necesidad de agentes de transfección. Células de Mamífero Para explorar la capacidad de las secuencias ARNi mediadas por ARNic, se diseñó un experimento para silenciar, en una etapa posterior a la transcripción, un gen endógeno inducible, en células de mamífero cultivadas, y determinar la duración de este efecto. Se utilizó ARNic para silenciar al gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) en la línea de células CHO AA8 , que es un gen endógeno inducible encontrado en células de mamífero. La G6PD desempeña una función importante en la ruta de las pentosas en tejidos animales, para generar la forma reducida del dinucleótido trifosfato de nicotinamida (NADPH) y ribosa-5-fosfato que es utilizado para generar los nucleótidos (véase Carson, P.E. y Frischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehidrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. Am J Med. 41, 744-764) . El glucosa-6-fosfato entra a la ruta y es oxidado por la G6PD para generar NADPH y 6-fosfo-gluco-D-lactona (véase Carson, P.E. y Frischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. Am J Med. 41, 744-764) . Las propiedades de reducción oxidativa de esta reacción, se pueden utilizar en combinación con una tinción histoquímica basada en tetrazolio, en células expuestas a glucosa-6-fosfato, como un método colorimétrico para cuantificar el grado de silenciación del gen G6PD, representado por el nivel de actividad enzimática de G6PD en las células. Un análisis del silenciamiento del gen mediado por ARNic con variaciones en la composición del ácido nucleico de las moléculas interferentes cortas, se utilizó para probar sus efectos sobre los parámetros influenciados por este modo de silenciar el gen. Estos factores incluyen el grado y persistencia de efectos de silenciamiento del gen, así como la cantidad de expresión génica recuperada. Con el uso del gen G6PD de mamífero, estos parámetros se afectan dependiendo de la composición del ácido nucleico de las moléculas interferentes cortas a las cuales son expuestas las células . Para demostrar la universalidad de estos resultados en células de mamífero, se realizó un análisis de comparación entre células humanas y células de hámster. Materiales y Métodos Preparación de la molécula interférente corta. Se seleccionó aleatoriamente una secuencia de 21 pb de la secuencia del gen G6PD. Se utilizó una segunda región homologa a una secuencia del gen G6PD tanto de hámster como humano, para los estudios de comparación hámster-humano . Se construyeron cadenas sentido y antisentido con 2 sobrantes de nucleótido uridina en el extremo 3 ' en el Laboratorio de Síntesis de ADN de la Universidad Johns Hopkins . La secuencia de ADNic contenía 2 sobrantes del nucleótido timidina en el extremo 3'. La secuencia de ARNic no fue purificada, las secuencias de ADNic fueron purificadas en un cartucho RP. Las cadenas de sentido y antisentido se aparearon con cantidades equimolares en presencia de Tris-HCl 10 mM (pH 8.0), desnaturalizando durante 5 minutos a 94 °C y renaturalizando a 53 °C durante 3 h y después enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente. Cultivo Celular y Transfección. Se propagaron células de Ovario de Hámster Chino (CHO) AA8 en Mezcla Nutriente de Ham F-12 (Life Technologies, Nueva York) suplementada con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) , L-glutamina al 1% y antibiótico-antimicótico al 1%, a 37°C. Se propagaron células MCF-7 humanas en DMEM/F-12 (Life Technologies) suplementado con SFB al 10%, L-glutamina al 1%, penicilina-estreptomicina al 1%, solución de aminoácidos no esenciales MEM al 1%, piruvato de sodio al 1% y solución de aminoácidos BME al 2%. El SFB fue inactivado por calentamiento durante 30 minutos a 56°C, para eliminar la actividad de las nucleasas . Las células se sometieron a pases 3 veces a la semana para mantener el crecimiento exponencial . Veinticuatro horas antes de la transfección, las células se lavaron 3 veces con lxPBS, se tripsinizaron y se colocaron en cajas de cultivo de tejidos de 35 mm a una densidad de 1 x 106 células/placa, en 2 mL de medio de crecimiento sin antibióticos, y se incubaron a 37°C.
La transfección de las moléculas interferentes cortas se realizó utilizando el Reactivo Lipofectamina (Life Technologies, Nueva York) de conformidad con el protocolo del fabricante para células adherentes, empleando 10 µg de ácido nucleico. Las células se incubaron con complejos de transfección durante 5 horas . Para evitar la toxicidad de las células, los complejos fueron aspirados y las células se lavaron dos veces con medio de crecimiento completo y se incubaron a 37°C en medio de crecimiento, con antibióticos, hasta que estuvieran listas para el ensayo de la actividad enzimática de G6PD. Ensayo Colorimétrico de G6PD y Cuantificación de la Actividad Enzimática. La actividad enzimática de la G6PD se supervisó de la manera descrita por Stamato et al. (véase Stamato, T.D., Mackenzie, L . , Pagani, J.M. , y Weinstein, R. 1982) Mutagen treatment of single Chínese Hámster Ovary cells produce colonies mosaic for Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. Somatic Cell Genetics. 8, 643-651). Brevemente, se lavaron monocapas celulares con 2 L de NaCl 0.14M Triton-X 100 0.012% y se incubaron a 37°C durante 1 h en 2 mL de solución que contenía 2.5 mg/mL de sal disódica de glucosa-e-fosfato, pH 6.5, 0.17 mg/mL de metasulfato de fenazina, 0.33 mg/mL de nitro azul de tetrazolio, NaCl 0.14M, 0.17 mg/mL de NADP y Tríton-X 100 al 0.012%. Las células se fijaron por 15 min. con 2 mL de formalina con amortiguador de acetato al 10%, se lavaron y se secaron con nitrógeno. Para cuantificar la actividad enzimática, la intensidad del pixel promedio de las células se obtuvo para representar el grado de color de las células, lo cual se relaciona con el nivel de la actividad de G6PD. Las células se observaron con el uso de un microscopio óptico Zeiss Axiophot a 20x. Se tomaron imágenes de las placas en regiones en donde había monocapa de células. Se obtuvo la diferencia del promedio de intensidad de pixel de células individuales y de regiones que no contenían células que representaban el fondo. Los análisis de las imágenes se realizaron con el software Smart Capture VP. Transferencia de Puntos. Las células CHO AA8 transfectadas con moléculas interferentes cortas en los puntos de tiempo 0, 6, 12, 18 y 24 horas posteriores a la transfección, se lavaron tres veces con lxPBS y se incubaron con tripsina durante 5 minutos . Las células se lavaron con lxPBS y se resuspendieron en lxPBS . Las suspensiones celulares (aproximadamente 105 células) se hirvieron durante 10 minutos a 95°C para obtener lisados celulares. Los procedimientos de hibridación se realizaron de la manera descrita en el Sistema de Detección de Ácido Nucleico no Radioactivo Blugene de Gibco, para detectar la presencia de las moléculas interferentes cortas en los lisados. Las sondas utilizadas fueron secuencias de ADN de G6PD antisentido que estaban biotinadas.
Estadística. Los valores presentados en los experimentos de ARNic y ADNic en células CHO AA8, representan el promedio de cinco experimentos replicados, los datos de hibridación representan los promedios de tres experimentos replicados . Los valores presentados de la comparación de células de hámster-células humanas con respecto al tiempo, representan el promedio de dos experimentos replicados. Los valores relativos se obtuvieron al representar el valor promedio de las condiciones del control positivo como 100% y dividiendo los promedios de las condiciones experimentales entre el valor del control positivo promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. Resultados Experimentales La transfección de moléculas interferentes cortas utilizando liposomas catiónicos, causa de manera inconsistente toxicidad en las células y proporciona una baja eficiencia de transfección. Las células CHO ??.8 y células humanas MCF-7 fueron transíectadas con las moléculas interferentes cortas, empleando liposomas catiónicos . La cuenta vital demostró que más del 50% de las células expuestas a los complejos de transfección murieron, independientemente del reactivo de transfección utilizado. Se probaron cinco diferentes reactivos de transfección de liposomas catiónicos, con el fin de minimizar la toxicidad y la mortalidad de las células, en donde la Lipofectamina (Life Technologies) produjo el nivel más bajo de muerte celular. Sólo las células que parecían saludables después de la transfección, fueron evaluadas con respecto a la actividad de G6PD. Aproximadamente del 40 al 50% de las células transfectadas en una placa de 35 mm, fueron transfectadas con las moléculas interferentes cortas, basándose en el color de las células cuando fueron evaluadas con respecto a la actividad enzimática de G6PD. Las células transfectadas y no transfectadas en cultivos en monocapa, tendieron a formar parches discretos, tal como fue indicado por el color de las células. Sólo las células en las regiones transfectadas se analizaron para evaluar el silenciamiento génico. En las placas de control, en donde la actividad de G6PD no fue inhibida, no se presentaron estas regiones de diferentes intensidades de color de las células, lo cual indica que el ensayo de G6PD no producía ese efecto. El ensayo colorimetrico proporcionó un método eficiente para detectar la presencia de silenciamiento del gen G6PD en células individuales . El gen G6PD probó ser una elección ventajosa para investigar el silenciamiento de genes mediado por AR ic. Para separar la eficiencia de la transformación del estudio de ARNic, fue importante poder evaluar células individuales, en vez de obtener un promedio de la población. Para llevar a cabo esto, la actividad enzimática de la proteína G6PD se ensayó con el uso de un ensayo colorimétrico desarrollado por Stamato et al. (22). Estudios previos que emplearon AR ic para silenciar genes en células de mamífero en cultivo, realizados por Elbashir et al. (20) también emplearon técnicas colorimétricas de tinción fluorescente y actividad de luciferasa, para evaluar los resultados. Después de la transfección, las células se incubaron con una tinción histoquímica basada en tetrazolio que contenía glucosa-e-fosfato (G6P) y dinucleótido trifosfato de nicotinamida (NADP) . La adición de G6P a las células, activó la transcripción del gen G6PD y la síntesis de proteína. La actividad enzimática de la G6PD acoplada a la oxidación de G6P y la reducción de NADP en NADPH, creó un cambio de color en las células de blanco a púrpura. Si la adición de ARNic con una secuencia homologa a la secuencia del gen G6PD indujo un silenciamiento del gen posterior a la transcripción en células CHO ??8 , entonces se sintetizaría una cantidad insuficiente de la proteína G6PD, dando como resultado una falta de actividad enzimática G6PD y la inhibición de la reacción de cambio de color . Existe una reducción en la actividad enzimática de G6PD inducible en células de Hámster Chino expuestas a moléculas de ARNic. Los cambios relativos de actividad de G6PD en células transfectadas con ARNic se midió comparando la intensidad de color de las células con células no transfectadas que también fueron incubadas en la tinción histoquímica. Para asegurar que el silenciamiento del gen posterior a la traducción era un efecto especifico del ARNic, también se midió la actividad enzimática en células CHO AA8 transíectadas con una secuencia nucleotídica no homologa, el polímero T7, así como células que fueron expuestas a liposomas catiónicos sin vector. Las células CHO AA8 incubadas con la tinción histoquímica en ausencia de G6P, sirvieron como control negativo para el ensayo. Se obtuvieron imágenes de las células después de incubar, y la intensidad de pixel, basándose en el color de células individuales, se midió para determinar los cambios relativos de la actividad de la enzima G6PD. La actividad de la enzima G6PD se pudo determinar en células de mamífero a través del acoplamiento de la oxidación del glucosa-6-fosfato y la reducción de NADP por la enzima G6PD, con una tinción histoquímica basada en tetrazolio. Cinética del silenciamiento del gen inducido por ARNic de G6PD. Para determinar la cinética del silenciamiento del gen de la enzima G6PD posterior a la transcripción causado por ARNic, el ensayo colorimétrico se realizó en puntos específicos del tiempo en un lapso de 96 horas después de 5 horas de transfección, para medir la presencia de actividad enzimática G6PD. El silenciamiento del gen mediado por el ARNic proporcionó aproximadamente un 60% de reducción en la actividad de la enzima G6PD durante las primeras 24 horas posteriores a la transfección. Las células comenzaron a recuperar la expresión del gen G6PD a las 48 horas y exhibieron una expresión completa a las 95 horas después de la transfección. En la Figura 3A, células CHO ??8 transfectadas con moléculas de ARNic; Figura 3B células expuestas a moléculas de ADNic; Figura 3C introducción de moléculas híbridas interferentes cortas ADNs :ARNa y Figura 3D ARNs:ADNa. Las reacciones de control consistieron en la transfección con moléculas ic (ya sea AR :AR , ARN:ADN o ADN:ADN) que tenían la secuencia del cebador del promotor del fago T7 (T) o la exposición a complejos liposómicos catiónicos sin vector (B) . Todas las células expuestas a las pruebas de control exhibieron el 100% de expresión génica y actividad enzimatica. Las células transfectadas con moléculas de ADNic exhibieron el grado más bajo de efecto silenciador de genes, mientras que las moléculas transfectadas con ARNic proporcionaron una mayor inhibición de la expresión génica. La duración del silenciamiento fue de aproximadamente 24 horas para las células transfectadas con ARNic o ADNic. Las moléculas híbridas interferentes cortas tanto de la conformación ADNs :ARNa como de la conformación ARNs :ADNa exhibieron el grado más alto y la mayor persistencia de inhibición de la expresión génica endógena. Los efectos persistieron hasta las 96 horas. Las gráficas de las figuras 3A y 3B representan los datos de cinco experimentos replicados y las gráficas de las figuras 3C y 3D representan los datos de tres experimentos replicados . Las células exhiben una respuesta diferencial en el silenciamiento del gen G6PD cuando son expuestas a moléculas interferentes cortas de diferente composición de ácidos nucleicos. Debido a que el mecanismo de interferencia de AR i mediado por ARNic no está claro, se cuestionó si el silenciamiento géníco posterior a la transcripción era un efecto específico de las secuencias interferentes cortas hechas de AR o si las moléculas de ARNic con variaciones en su composición de ácidos nucleicos proporcionarían efectos de silenciamiento de genes. Para probar esto, secuencias de ADNic y moléculas híbridas interferentes cortas compuestas por ARN y ADN, idénticas en secuencia a los vectores ARNic, se utilizaron para transfectar células CHO AA8 , y se evaluó la actividad enzimática G6PD nuevamente en puntos de tiempo específicos en un transcurso de 96 horas posteriores a la transcripción. Se construyeron dos moléculas híbridas diferentes, cuya diferencia era la composición de las cadenas de ácido nucleico de sentido y antisentido. El análisis de las células sugirió que había una respuesta diferencial en el silenciamiento de G6PD entre las diferentes moléculas interferentes cortas utilizadas. Las células transfectadas con moléculas de ADNic mostraron el grado más bajo de silenciamiento génico, y la máxima inhibición de expresión no se observó hasta 12 horas posteriores a la transfección. En contraste, las células transfectadas con moléculas de ARNic, mostraron una disminución de la expresión en un tiempo tan corto como casi 0 horas después de la transfección, con un mayor grado de silenciamiento en comparación con el proporcionado por las moléculas de ADNic. Ambos efectos de las moléculas ADNic y ARNic duraron aproximadamente 24 horas, y los niveles de expresión normales se volvieron a presentar a las 96 horas. Las células CHO AA8 transfectadas con moléculas híbridas interferentes cortas tanto de ADNs:ARNa como de ARNs : DNa exhibieron la mayor disminución de actividad enzimática G6PD, con la mayor duración. Las células transfectadas con ADNs:ARNa mostraron una disminución de GSPD en un tiempo tan corto como casi 0 horas después de la transfección, con un porcentaje relativo de actividad en aproximadamente 20%. Estos efectos persistieron durante el transcurso del experimento, permaneciendo la cantidad de actividad aproximadamente en 20% o menor. Se observaron efectos similares con células transfectadas con moléculas de ARNs :ADNa. Con referencia a las Figuras 3A-3D, el porciento de actividad enzimática permaneció en o por abajo de aproximadamente 20% durante todo el experimento. Se realizó una transferencia de puntos para detectar la presencia de moléculas híbridas interferentes cortas. No se detectó nada, lo cual demuestra únicamente que la concentración intracelular de las moléculas era demasiado baja como para ser detectada. La presencia de actividad de G6PD se ensayó en células expuestas a las moléculas híbridas cada 24 horas entre las 120 y 192 horas posteriores a la transíección, para determinar qué tan prolongados eran los efectos con las construcciones híbridas. La presencia de actividad de G6PD se incrementó a aproximadamente 40% a las 120 horas, pero permaneció en este nivel hasta las 192 horas. Se realizó un ensayo de transferencia de puntos para detectar la presencia de moléculas híbridas interferentes cortas. No se detectó nada, lo cual demuestra únicamente que la concentración intracelular de las moléculas era demasiado baja como para ser detectada. Posiblemente existe una respuesta diferencial en el silenciamiento de genes mediado por ARNic con composiciones variadas del ácido nucleico, en células de mamífero. Para demostrar que la respuesta diferencial no era un efecto específico de las células de hámster, se llevó a cabo un estudio de comparación, con respecto al tiempo, de la persistencia de las moléculas interferentes cortas con variaciones en su composición de ácidos nucleicos, en células humanas y células de hámster. Este experimento también abordó los efectos de la variación de la secuencia del gen al cual es homologa la molécula interférente corta. Las moléculas eran idénticas a una secuencia de la región codificadora de G6PD de células de hámster y células humanas . Las Figuras 4A-4C muestran que también hubo una respuesta diferencial en células MCF-7 humanas, lo cual sugiere la posible universalidad de esta aplicación a todas las células de mamífero en cultivo. Las células transfectadas con moléculas de ADNic exhibieron el grado más bajo de silenciamiento génico, mientras que las moléculas de ARNic proporcionaron un mayor grado de inhibición de la expresión génica. Los efectos de silenciamiento del ARNic y el ADNic mostraron una pérdida por aproximadamente 24 horas posteriores a la transfección, en donde se reconstituyó la expresión completa a las 96 horas . Las moléculas híbridas tanto de células humanas como de células de hámster ofrecieron la mayor reducción de silenciamiento génico, con el tiempo de inhibición más prolongado de la expresión génica endógena. Sólo se utilizaron las moléculas híbridas compuestas por una cadena de ARN de sentido y una cadena de ADN antisentido, debido a la similitud de los resultados obtenidos para ambas moléculas híbridas en el experimento previo, que involucró únicamente células de hámster. Con referencia a las Figuras, 4A-4C las células CHO AA8 y MCF-7 humanas transfectadas con (Fig. 4A) moléculas de ARNic ; (fig. 4B) moléculas de ADNic y (Fig. 4C) molécula híbrida interférente corta de ARNs:ADNa. Como la secuencia empleada aquí es una secuencia diferente a la utilizada en la primera serie de experimentos en células CHO AA8, estos resultados demuestran que la respuesta diferencial no fue un efecto específico de célula, ni tampoco fue un efecto específico de secuencia. La introducción de moléculas de ADNic dio como resultado la inhibición más baja de expresión génica, mientras que las moléculas de ARNic proporcionaron un mayor grado de silenciamiento génico. Los efectos en ambas líneas celulares duraron aproximadamente 24 horas posteriores a la transíección. La molécula híbrida interférente corta exhibió el grado mayor y la mayor persistencia de inhibición de la expresión del gen G6PD, que duró todo el experimento. Los datos de las tres gráficas representan los datos de dos experimentos replicados . Además de demostrar el uso potencial que tiene esta aplicación en células de mamífero, estos experimentos demuestran que hay una respuesta diferencial independientemente de la secuencia de la región codificadora a la cual es homologa la molécula interférente corta. Los experimentos iniciales que probaron los efectos de la composición de los ácidos nucleicos en células de hámster, utilizaron una secuencia interférente corta diferente a la del experimento de comparación de células humanas-células de hámster, y ambas secuencias eran homologas a regiones indistinguibles de la cadena codificadora. Sin embargo, ambas dieron como resultado el silenciamiento del gen, con una respuesta diferencial y una inhibición prolongada por las moléculas híbridas. CÉLULAS BACTERIANAS Solamente se utilizó la administración sin ayuda de Híbridos-ic. La administración sin ayuda, incluye agregar los Híbridos-ic directamente al medio de cultivo de las bacterias. 1. Dosis efectiva de Híbridos-ic cat: se transformaron células de E. coli UltraMAX DH5a-FT competentes (Invitrogen, Carlsbad, California) mediante choque térmico con el plásmido pBC SK+ (Promega, Madison, WI) que codificaba para la protexna de resistencia a la enzima cloranfenicol acetil transferasa (gen cat) . Las transformantes se cultivaron en 2 mL de medio Luria-Bertani (LB) que contenía 25 g/mL del antibiótico cloranfenicol (Sigma, St . Louis, MO) , en presencia de las construcciones Híbridas-si cat. Para determinar la dosis efectiva de los Híbridos-ic cat, las células se hicieron crecer en presencia de 0.125, 0.25, .50, 1.0, 2.0, 4.0 y 8.0 /¿g/mL de las construcciones. Los Híbridos-ic tenían 21 pares de bases de longitud y eran homólogos a una secuencia específica de la región codificadora del gen cat del plásmido pBC SK+ . Las construcciones se diseñaron de conformidad con los lineamientos de Tuschl et al. (véase "The siRNA user guide" en el sitio web mpibpc.gwdg.de/abteilungen/l00/l05/sirna.html). La cadena de sentido estaba compuesta por AR de secuencia 5 ' CGGUGGUAUAUCCAGUGAUUUUU31 (Dharmacon, Lafayette, CO) . La cadena antisentido estaba compuesta de ADN de secuencia 5 'AAATCACTGGATATACCACCGTT3 ' (Sigma Genosys, The Woodlands, TX) . Las condiciones de control incluyeron un control positivo, que contenía células cultivadas en medio LB-cloranfenicol , cultivos en medio LB-cloranfenicol en presencia de 4 /¿g/mL de ARNic idéntico en secuencia al Híbrido-ic cat. Para demostrar que la acción del Híbrido-ic era específica de secuencia, también se utilizó una construcción de Híbrido-ic que no era homologa (NH) a ninguna región del genoma de E. coli. La cadena de sentido de la construcción no homologa estaba compuesta por ARN de secuencia
' CUGGCCAGCCACAUAGGAGUUUU31 (Dharmacon) . La cadena antisentido estaba compuesta por ADN de secuencia
'AACTCCTATGTGGCTGGCCAGTT3 ' (Sigma Genosys). Los cultivos se incubaron en agitación a 250 rpm a 37°C durante una noche. Después de la incubación, los cultivos se distribuyeron en medio LB 1:1000 y 10 L de diluyente, se colocaron en placas de LB/agar suplementadas con 25 µg/mL del antibiótico cloranfenicol . Para obtener colonias uniformes en las placas, se aplicaron cuentas de vidrio de 5 mm de diámetro (VWR, Westchester, PA) y se agitaron a mano. Las placas se incubaron invertidas a 37°C durante una noche. Para cuantificar la actividad de silenciamiento de genes por los Híbridos-ic, se calcularon las unidades formadoras de colonia (UFC) con la siguiente ecuación: [(número de colonias/10 mL inoculados) x (factor de dilución) x (2000 ^L) ] . Con referencia a la Figura 5, se midió la actividad del Híbrido-ic cat y se expresó en 107 unidades formadoras de colonia. Las barras de control, de Híbrido-ic no homólogo y de ARNic, exhibieron un crecimiento similar en el área de 36.0 a 43.0 x 107 UFC. Los resultados indican que el crecimiento de colonias es inversamente proporcional a la concentración del Híbrido-ic cat. Las concentraciones de 2.0, 4.0 y 8.0 µg/xdL· del Híbrido-ic cat demostraron una disminución del 72.2% de la formación de colonias, en comparación con el control. Hubo una disminución promedio de 23.6% en el crecimiento de colonias por cada dosis de Híbrido-ic cat agregada. El porcentaje de error se calculó en aproximadamente 5% para todas las técnicas experimentales presentadas aquí . 2. Silenciamiento del gen folA con Híbridos-ic. Se iniciaron cultivos de E. coli MG1655 en 2 mL de medio mínimo M9 en presencia de 4 ^g/mL de Híbridos-ic homólogos a una secuencia de la región codificadora del gen folA, cuyo producto proteico es la enzima dihidrofolato reductasa. La cadena de sentido estaba compuesta por AR de la secuencia 5 ' UCUCGCCUGGUUUAAACGCAAUU31 (Johns Hopkins Synthesis Facility, Baltimore, Maryland) . La cadena antisentido estaba compuesta por ADN de la secuencia 51 TTGCGTTTAAACCAGGCGAGATT3 ' (Johns Hopkins Synthesis Facility) . El silenciamiento del gen folA evita el crecimiento de células de E. coli en medios mínimos, debido a su incapacidad de sintetizar purinas y pirimidinas . Hubo seis condiciones experimentales, las cuales incluyeron el control positivo que contenía células en medio mínimo, células en medio mínimo con 4 g/mL de la construcción del Híbrido-ic folA, células en medio mínimo con 4 /xg/mL de ARNic de folA (con secuencia idéntica al Híbrido-ic de folA) , células en medio mínimo con 4 ^g/mL de una construcción de Híbrido-ic no homologa y células cultivadas en medio mínimo con 4 ^g/mL del Híbrido-ic folA y suplementado con timidina, citidina, adenosina y guanosina 20 mM (Sigma) . También se cultivaron células en medio mínimo suplementado con 50 µg/mL de trimetoprim (Sigma) , el cual es un antibiótico que inhibe específicamente la acción de la dihidrofolato reductasa, el cual sirvió como una comparación farmacológica. Los cultivos se hicieron crecer durante una noche a 37°C y en agitación a 250 rpm. Los cultivos se diluyeron 1:1000 y 1:100, 000 y se inocularon en placas al día siguiente. Las colonias se contaron y las UFC se calcularon para cada condición experimental . Con referencia a la Figura 6, el valor de UFC obtenido para el control positivo (células cultivadas en medio mínimo solo) se estableció como 100% y todas las demás condiciones se expresaron con relación a ese valor. Hubo una reducción significativa de más del 80% en la formación de UFC en los cultivos que se hicieron crecer en presencia de los Híbridos-ic de folA. Hubo una diferencia significativa entre la cantidad de UFC formadas en el control positivo, en los cultivos crecidos en presencia de ARNic de folA y en los cultivos crecidos en presencia de Híbrido-ic no homólogo. Los cultivos crecidos en presencia de Híbridos-ic de folA, así como las purinas y pirimidinas (Híbrido-ic/Rescate) exhibieron más del 100% de formación de UFC. Se ha determinado experimentalmente (datos no mostrados) que esto es causado por la velocidad de crecimiento de los cultivos de rescate, la cual es significativamente más rápida que la del control positivo. Se estableció la hipótesis de que la velocidad de crecimiento es más rápida debido a que las células en los cultivos de rescate no necesitan sintetizar sus propias purinas y pirimidinas, de modo que la división puede ocurrir a una tasa más acelerada. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la anterior descripción, se incorporan en la presente como referencia. Es posible realizar varias modificaciones y variaciones del método y sistema descritos de la presente invención, que serán evidentes para los técnicos en la materia, sin apartarse de los alcances y espíritu de la invención. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con modalidades específicas, deberá entenderse que la presente invención tal como está reivindicada no se deberá limitar a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de las modalidades para llevar a cabo la invención, que son obvias para los técnicos en biología molecular o campos relacionados, están dentro de los alcances de las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.