MXPA04010215A - Bibliotecas universales para inmunoglobulinas. - Google Patents

Abstract

Se describen bibliotecas de inmunoglobulinas de interes, las bibliotecas contienen inmunoglobulina mutadas de interes en el cual ha sido substituido un solo aminoacido predeterminado en una o mas posiciones en una o mas regiones determinantes complementarias de la inmunoglobulina de interes. Las bibliotecas comprenden una serie de bibliotecas subjuego, en las cuales el aminoacido predeterminado es "encaminado a traves" de cada una de las seis regiones determinantes complementarias (CDRs) de la inmunoglobulina de interes no solo individualmente sino tambien para cada una de las variaciones de combinacion posibles de los CDRs que resultan en bibliotecas subjuego que incluyen inmunoglobulinas mutadas que tienen el aminoacido predeterminado en una o mas posiciones en cada CDR, y colectivamente tienen el aminoacido predeterminado en cada posicion en cada CDR. La invencion tambien se refiere a bibliotecas universales que contienen una de dichas bibliotecas para cada aminoacido que ocurre naturalmente a manera del aminoacido predeterminado unico, dando un total de veinte bibliotecas, y tambien a bibliotecas de acidos nucleicos que codifican las bibliotecas descritas.

Description

BANCOS UNIVERSALES PARA IN UNOGLOBÜLINAS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/373.558, presentada el 17 de Abril de 2.002. Todas las enseñanzas de la solicitud anterior se incorporan aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mutagénesis es una herramienta poderosa en el estudio de la estructura y la función de las proteínas. Se pueden realizar mutaciones en la secuencia de nucleótidos de un gel clonado que codifica una proteina de interés y se puede expresar el gen modificado para producir mutantes de la proteina. Comparando las propiedades de una proteína de tipo salvaje y los mutantes generados, a menudo es posible identificar aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son esenciales para la integridad estructural y/o la función bioquímica de la proteína, tal como su unión y/o actividad catalítica. El número de mutantes que puede ser generado a partir de una única proteína, sin embargo, hace difícil seleccionar mutantes que sean informativos o tengan una propiedad deseada, incluso si los mutantes seleccionados que abarcan las mutaciones están solamente en regiones supuestamente importantes, específicas de una proteína (v.g., regiones en o cerca del sitio activo de una proteína) . Por ejemplo, la sustitución, deleción o inserción de un aminoácido concreto puede tener un efecto local o global sobre la proteína. Persiste la necesidad de un método para evaluar los efectos de la mutagénesis de una proteína sistemáticamente .

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención tiene que ver con bancos para una inmunoglobulina de interés. Los bancos, basados en una inmunoglobulina prototipo de interés, pueden ser generados mediante mutagénesis "de recorrido completo" (del inglés "walk-through" ) de la inmunoglobulina prototipo. En una realización, un banco de aminoácidos predeterminados individuales de la invención comprende inmunoglobulinas mutadas de interés en las cuales un único aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de una o más regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina de interés; el banco comprende una serie de subgrupos de bancos, incluyendo: a) un banco subgrupo que contiene la inmunoglobulina prototipo de interés; b) seis bancos subgrupo (un banco subgrupo para cada una de las seis regiones determinantes de - la complementariedad de la inmunoglobulina de interés) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de sólo una de las seis regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina; c) 15 bancos subgrupo (un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las cuales . el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad; d) 20 bancos subgrupo (un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado a sido sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad; e) 15 bancos subgrupo (un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad; f) seis bancos subgrupo (un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad; y g) un banco subgrupo que comprende inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en las seis posiciones determinantes de la complementariedad. Cada banco subgrupo que contiene inmunoglobulinas mutadas contiene inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición de la región determinante de la complementariedad en la cual ha sido introducido el aminoácido predeterminado. Los aminoácidos predeterminados se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. La inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina completa, o un fragmento Fab de una inmunoglobulina, o una única cadena de inmunoglobulina. La inmunoglobulina de interés puede ser cualquiera de los cinco tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA/ IgD, o IgE) . En una realización, la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalxtico. La invención se refiere adicionalmente a un banco universal para una inmunoglobulina prototipo de interés, en el cual el banco universal comprende 20 bancos de "aminoácidos individuales predeterminados" como se ha descrito antes, uno para cada uno de los 20 aminoácidos de origen natural . La invención se refiere adicionalmente a bancos de ácidos nucleicos que codifican los bancos de aminoácidos predeterminados individuales así como bancos de ácidos nucleicos que codifican los bancos universales. Los bancos descritos aquí contienen inmunoglobulinas mutadas fácilmente identificables que permiten el análisis sistemático de las regiones de unión de la inmunoglobulina prototipo de interés, y también el papel de cada aminoácido concreto preseleccionado sobre la actividad de las regiones de unión. Los bancos permiten generar información específica sobre las mutaciones concretas que alteran la interacción de la inmunoglobulina de interés con su antígeno, incluyendo múltiples interacciones por aminoácidos en las regiones determinantes de la complementariedad variantes, mientras evitan al mismo tiempo los problemas relacionados con el análisis de las mutaciones generadas por la mutagénesis al azar.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las FIGS. 1A-1B representan la secuencia completa de la cadena sencilla FV de GP-120, tanto la secuencia del ácido nucleico (SEC ID NUM: 1) como la secuencia de aminoácidos codificada (SEC ID NUM: 2) . La FIG. 2 representa el esquema de ensamblaje total para el gen scFV de GP-120 mostrado en la FIG. 1A-1B. La FIG. 3 resume los bancos del gen scFV obtenidos mediante los métodos de la invención, y el número de variantes del gen producidas para cada banco individual . La FIG. 4 es una Tabla que representa las reservas de oligonucleótidos para su uso en el esquema de ensamblaje mostrado en la FIG. 2. Las FIGS. 5A-5B ilustran ejemplos de las reservas de oligonucleótidos diseñados para introducir tres (3) aminoácidos diana, SER, HIS y ASP, en CDR individuales de la Fv, en numerosas posibles combinaciones. Las secuencias de la reserva se dan utilizando la nomenclatura de la IUPAC para las bases mixtas, mostradas en letras mayúsculas en negrita, R = A o G, Y = C o T, M = A o C, K = G o T, S = C o G, W = A o T; H = A o C o T, B = C o G o T, V = A o C o G, D = A o G o . La FIG. 6 ilustra la estrategia adoptada para el ensamblaje del gel VL y VH con el fin de generar bancos de scFV de GP-120 en los cuales se sometieron a mutagénesis simult neamente tres (3) regiones CDR de las seis para producir la presencia de aminoácidos individuales seleccionados (Ser, His y Asp) en un número de (8) combinaciones diferentes (Ll a L8) . Las FIGS . 7A-7B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la primera región VL (la primera de las 6 regiones CDR) . Las FIGS. 8A-8B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la segunda región VL (la segunda de las 6 regiones CDR) . Las FIGS. 9A-9B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la tercera región VL (la tercera de las 6 regiones CDR) . Las FIGS. 10A-10B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la primera región VH (la cuarta de las 6 regiones CDR) . Las FIGS. 11A-11B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la segunda región VH (la quinta de las 6 regiones CDR) . Las FIGS. 12A-12B ilustran 20 reservas de nucleótidos individuales, cada una correspondiente a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la tercera región VH (la sexta de las 6 regiones CDR) .

Las FIGS . 13A-13D muestran el agrupamiento de las reservas de CDR para aminoácidos individuales.

DESRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a bancos -de inmunoglobulinas de interés, incluyendo bancos que contienen los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas , y bancos que contienen las propias inmunoglobulinas . Una "inmunoglobulina" , según se utiliza aqui, es una proteina anticuerpo que se genera en respuesta a un antígeno específico, y que se une a él. Hay cinco clases conocidas, o tipos, de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE (ver, v.g., Dictionary of Cell and Molecular Biology, Tercera Edición) . La forma básica de una inmunoglobulina es la forma IgG; incluye dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos cadenas ligeras idénticas (L) , mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro en forma de "Y" . Las cadenas pesadas comprenden cuatro dominios, incluyendo tres dominios constantes (CH) y una región variable (VH) . Las cadenas ligeras tienen una región constante (CL) y una región variable (VL) . Cada región variable de la cadena pesada y cada región variable de la cadena ligera incluye tres bucles hipervariables, también denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . La región del sitio de unión al antigeno (Fv) (también referida como "bolsillo de unión") incluye estos seis bucles hipervariables (CDR) (tres en la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (VH) y tres en la región variable de la cadena ligera (VL) ) . Los restos de las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, confiriendo especificidad antigénica a cada anticuerpo. Sigue una breve descripción de cada clase de inmunoglobulina .

Immunoglohulina G (IgG) La IgG es el tipo de inmunoglobulina clásica; la IgG tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. Como se ha indicado antes, las IgG están compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. La molécula de IgG se puede romper proteoliticamente en dos fragmentos Fab y un fragmento Fe. Los Fabs incluyen los sitios de unión al antigeno (las regiones variables de ambas cadenas ligeras y pesadas) , la región constante de la cadena ligera, y una de las tres regiones constantes de la cadena pesada. La región Fe consta de las restantes regiones constantes de las cadenas pesadas; contiene sitios de unión celular y de unión al complemento.

Inmunoglohulina M (IgM) Una molécula de IgM (peso molecular de aproximadamente 970 kDa) está constituida a partir de cinco monómeros de tipo IgG juntos, con la ayuda de cadenas J, para formar un pentámero cíclico. La IgM se une al complemento; una sola molécula de IgM unida a la superficie celular puede lisar esa célula. La IgM es producida normalmente primero en una respuesta inmune antes que la IgG.

Inmunoglobulina ? (IgA) Las IgA son una clase de inmunoglobulinas encontrada en las secreciones externas y en el suero de los mamíferos . En las secreciones, las IgA se encuentran en forma de dimeros de monómeros de tipo IgG (dimeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 400 kD) reunidos por una cadena J corta y conectados a una porción secretora y una porción de transporte; en el suero se encuentran en forma de monómeros (peso molecular de aproximadamente 170 kD) . Las IgA son los principales medios de proporcionar inmunidad local frente a infecciones en el intestino o el tracto respiratorio.

Inmunoglobulina D (IgD) La IgD (peso molecular de aproximadamente 184 kD) está presente a un bajo nivel en el suero, pero es la principal inmunoglobulina en la superficie de los linfocitos B donde juega un importante papel en el reconocimiento del antígeno. Su estructura se asemeja a la de la IgG pero las cadenas pesadas son de tipo d.

Inmunoglobulina E (IgE) Las IgE (peso molecular de aproximadamente 188 kD) están asociadas con reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato e infecciones por helmintos . Están presentes en muy pequeñas cantidades en el suero y la mayor parte unidas a mastocitos y basófilos que tienen un receptor Fe específico de IgE (Fe e R) . La IgE tiene un elevado contenido en carbohidratos y también está presente en las secreciones externas. La cadena pesada es de tipo e.

En una realización preferida, la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina de clase IgG. Según se utiliza aquí, el término "inmunoglobulina de interés" puede hacer referencia a una inmunoglobulina intacta (es decir, una inmunoglobulina que contiene dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas) . Alternativamente, una inmunoglobulina de interés también puede hacer referencia a una porción de una inmunoglobulina (es decir, una inmunoglobulina que contiene menos de dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas) , en la cual la porción contiene las regiones variables (v.g., un fragmento Fab, o un fragmento Fv) de una inmunoglobulina. En otra realización, la inmunoglobulina de interés también puede ser una inmunoglobulina "de hebra sencilla" o de cadena sencilla" que contiene, por ejemplo, una cadena pesada sencilla y una cadena ligera sencilla unidas por regiones conectoras, o un fragmento Fv de una sola cadena. En una realización, por ejemplo, se puede preparar una inmunoglobulina de interés que incluye las tres regiones variables de la cadena ligera conectada (v.g., con tres regiones ligadoras) a las tres regiones variables de la cadena pesada, formando una inmunoglobulina Fv de cadena sencilla. Si se desea, la inmunoglobulina de interés puede ser acoplada a una molécula mayor. En una realización, puede ser acoplada a una proteína, tal como una enzima, toxina o citoquina. Por ejemplo, las enzimas proteolíticas podrían ser acopladas a las moléculas de inmunoglobulina para dirigir la actividad enzimática hacia proteínas específicas, tales como la Fibrina para la aplicación trombolítica, o la proteína de la envuelta viral y el ARN para la terapia anti-viral . Las toxinas acopladas a las inmunoglobulinas pueden ser dirigidas a células cancerosas (ver, v.g., Antibody Engineering, R. Konterman, S. Dubel (Eds.). Springer Lab manual. Spriger-Verlag. Berlín, Heidelberg (2001), Capítulo 41. "Stabilization Strategies and Application of recombinant Fvs and Fv Fusión Proteins" . Por U. Brinckmann, Págs . 593-615. y col.) y citoquinas (IL-2, etc.) para aplicación anti-inflamatoria, etc. La inmunoglobulina de interés puede ser de cualquier especie que genere anticuerpos, preferiblemente un mamífero, y concretamente un humano; alternativamente, la inmunoglobulina de interés puede ser un anticuerpo quimérico o una estructura "consenso" o canónica generada a partir de bancos de datos de aminoácidos para anticuerpos (ver, v.g., Kabat y col., J". Im nol. 1991 Sep 1 ; 147 (5) .1709-19) . La inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina de tipo salvaje (v.g., una que esté aislada de un organismo, tal como una inmunoglobulina que se pueda encontrar en una muestra fisiológica apropiada (v.g., sangre, suero, etc.) de un mamífero, concretamente un ser humano) . Alternativamente, la inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina modificada (v.g., una inmunoglobulina previamente de tipo salvaje, en la cual se han introducido alteraciones en una o más regiones variables y/o regiones constantes) . En otra realización, la inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina sintética (v.g., preparada mediante métodos de recombinación de ADN, en lugar de aislada de un organismo) . En una realización preferida, la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina humana. En una realización de la invención, la inmunoglobulina de interés es un . anticuerpo catalítico. Una inmunoglobulina se puede volver catalítica, o se puede intensificar la actividad catalítica, mediante la introducción de aminoácidos adecuados en el sitio de unión de la región variable de la inmunoglobulina (región Fv) en el método descrito aquí. Por ejemplo, las tríadas catalíticas elaboradas tomando como modelo las serina proteasas pueden ser creadas en los segmentos hipervariables de la región Fv de un anticuerpo y rastreadas en cuanto a la actividad proteolítica . Entre los anticuerpos catalíticos representativos se incluyen oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas entre estas categorías se incluyen proteasas, carbohidrasas , lipasas, dioxigenasas y peroxidasas, así como otras enzimas. Estas y otras enzimas pueden ser utilizadas para conversiones enzimáticas en el cuidado de la salud, cosméticos, alimentos, elaboración de cerveza, detergentes, medio ambiente (tratamiento de aguas residuales) , agricultura, curtido, textiles, y otros procesos químicos, tales como aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, conversiones de grasas, carbohidratos y proteínas, degradación de contaminantes orgánicos y síntesis de productos químicos. Por ejemplo, se pudieron diseñar proteasas terapéuticamente eficaces con actividad fibrinolítica, o actividad frente a estructuras virales necesarias para la infectividad, tales como proteínas de la envuelta viral . Tales proteasas podrían ser agentes antitrombóticos o agentes anti-virales útiles contra virus tales como el del SIDA, los rinovirus, el de la influenza, o el de la hepatitis. Alternativamente, en otro ejemplo, las oxigenasas (v.g., dioxigenasas) , una clase de enzimas que requieren un co-factor para la oxidación de anillos aromáticos y otros dobles enlaces, tienen aplicaciones industriales en procesos de "biopulpación" , conversión de biomasa en combustibles u otros productos químicos, conversión de contaminantes de las aguas residuales, tratamiento biológico del carbón, y destoxificación de compuestos orgánicos peligrosos. Los bancos de la invención hacen referencia a una única inmunoglobulina prototipo de interés . La inmunoglobulina "prototipo" es la inmunoglobulina (o fragmento Fab, descrito antes) en la cual se basan todas las mutaciones posteriores.

"Mutagénesis "de recorrido completo"" Para preparar los bancos de la invención, se realiza la "mutagénesis de recorrido completo" de la inmunoglobulina prototipo. La mutagénesis "de recorrido completo" se describe con detalle en las Patentes de los Estados Unidos 5.830.650 y 5.798.208, cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. Aunque la mutagénesis "de recorrido completo" es igualmente aplicable a proteínas y polipeptidos distintos de las inmunoglobulinas, aquí se trata en referencia a la mutagénesis de las inmunoglobulinas de interés. En la mutagénesis "de recorrido completo", se genera un grupo (banco) de inmunoglobulinas en las cuales se incorpora un aminoácido predeterminado al menos una vez en cada posición de una región definida (o varias regiones definidas) de interés de la inmunoglobulina (es decir, en uno o más bucles hipervariables (CDR) de las inmunoglobulinas) . Las inmunoglobulinas resultantes (referidas aquí como "inmunoglobulinas mutadas") difieren de la inmunoglobulina prototipo, en que tienen el único aminoácido predeterminado incorporado a una o más posiciones dentro de una o más CDR de la inmunoglobulina, en lugar del aminoácido "nativo" o de "tipo salvaje" que estaba presente en la misma posición o posiciones de la inmunoglobulina prototipo. En el grupo de inmunoglobulinas mutadas se incluyen inmunoglobulinas mutadas individuales para cada posición de la región diana de interés; así, para cada posición de la región definida de interés (v.g., la CDR) cada inmunoglobulina mutada tiene o bien un aminoácido encontrado en la inmunoglobulina de interés, o bien el aminoácido predeterminado, y la mezcla de todas las inmunoglobulinas mutadas contiene todas las posibles variantes . El aminoácido predeterminado puede ser un aminoácido de origen natural. Los veinte aminoácidos naturales existentes difieren sólo con respecto a su cadena lateral . Cada cadena lateral es responsable de las propiedades químicas que hacen único cada aminoácido (ver, v.g., Principies of Protein Structure, 1988, de G.E. Schulz y R.M. Schirner, Springer-Verlag) . Las cadenas polares y neutras típicas son aquellas de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. Gly también es considerada un miembro dudoso de este grupo. Ser y Thr juegan un importante papel en la formación de enlaces de hidrógeno. Thr tiene una asimetría adicional en el carbono beta, por lo tanto sólo se utiliza uno de los estereoisómeros . Los amiduros de ácido Gln y Asn también pueden formar enlaces de hidrógeno, funcionando los grupos amido como donadores de hidrógeno y funcionando los grupos carbonilo como aceptores . Gln tiene un grupo C¾ más que Asn, lo que hace más flexible el grupo polar y reduce su interacción con la cadena principal . Tyr tiene un grupo hidroxilo muy polar (OH fenólico) que se puede disociar a valores de pH elevados. Tyr se comporta como una cadena lateral cargada; sus enlaces de hidrógeno son bastante fuertes. Se encuentran ácidos polares neutros en la superficie así como dentro de las moléculas de proteína. Como restos internos, normalmente forman enlaces de hidrógeno entre sí o con la cadena principal del polipéptido. Cys puede formar puentes disulfuro. La Histidina (His) tiene una cadena lateral aromática heterocíclico con un valor p de 6,0. En el intervalo de pH fisiológico, su anillo de imidazol puede estar o bien descargado o bien cargado, después de captar un ión hidrógeno de la solución. Puesto que estos dos estados son fácilmente asequibles, His es bastante provechosa al catalizar reacciones químicas, y se encuentra, en los centros activos de muchas enzimas . Asp y Glu están cargados negativamente a pH fisiológico. Debido a su corta cadena lateral, el grupo carboxilo de Asp es bastante rígido con respecto a la cadena principal; esto puede explicar porqué el grupo carboxilo en mucho sitios catalíticos es proporcionado por Asp en lugar de por Glu. Los ácidos cargados se encuentran generalmente en la superficie de una proteína. Lys y Arg se encuentran frecuentemente en la superficie.

Tienen cadenas laterales largas y flexibles. Balanceándose en la solución circundante, aumentan la solubilidad del glóbulo de proteína. En muchos casos, Lys:' y Arg toman parte en la formación de puentes salinos internos o ayudan a la catálisis. Debido a su exposición en la superficie de las proteínas, Lys es un resto menos frecuentemente atacado por las enzimas que o bien modifican la cadena lateral o bien escinden la cadena peptídica en el extremo carbonilo de los restos de Lys .

Utilizando la mutagénesis "de recorrido completo", se puede preparar un grupo de ácidos nucleicos (v.g., ADNc) que codifica cada inmunoglobulina preparada. En una realización, se puede preparar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada reuniendo las secuencias de nucleótidos que codifican regiones de la inmunoglobulina que no son elegidas como diana por la mutagénesis "de recorrido completo" (v.g., regiones constantes), con secuencias de nucleótidos que codifican regiones de inmunoglobulinas que están elegidas como diana por la mutagénesis "de recorrido completo" (v.g., CDR) . Por ejemplo, en una realización, se puede preparar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada reuniendo secuencias de nucleótidos que codifican las regiones constantes de la inmunoglobulina, con secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables. Alternativamente, en otro ejemplo, se puede preparar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada reuniendo secuencias de nucleótidos que codifican las regiones constantes, secuencias de nucleótidos que codifican porciones de las regiones variables que no están alteradas durante la mutagénesis "de recorrido completo" (v.g., oligonucleótidos que están fuera de las CDR) , y secuencias de nucleótidos que codifican las CDR (v.g., oligonucleótidos que están sometidos a la incorporación de nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado) . En otra realización más, se pueden insertar individualmente secuencias de nucleótidos que codifican las CDR (v.g., oligonucleótidos que están sometidos a la incorporación · de nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado) en un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina prototipo, en lugar de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del bucle hipervariable (CDR) . Si se desea, se pueden elaborar secuencias de nucleótidos que codifican las CDR para que contengan sitios de reconocimiento contiguos para enzimas de restricción (v.g. , Patente de los Estados Unidos Núm. 4.888.286), o se pueden utilizar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de origen natural . La mezcla de oligonucleótidos puede ser introducida con posterioridad clonándola en una posición apropiada utilizando los sitios de las enzimas de restricción. Por ejemplo, se puede preparar una mezcla de oligonucleótidos, en la cual cada oligonucleótido codifica o bien una CDR de la inmunoglobulina prototipo (una porción de una CDR de la inmunoglobulina prototipo) , o bien uno o varios nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado en lugar de uno o más aminoácidos nativos de la CDR. La mezcla de oligonucleótidos puede ser producida en una única síntesis incorporando, en cada posición dentro del oligonucleótido, o bien un oligonucleótido requerido para la síntesis del aminoácido presente en la inmunoglobulina prototipo o bien (en lugar de ese nucleótido) un único nucleótido apropiado requerido para un codón del aminoácido predeterminado. La síntesis de la mezcla de oligonucleótidos puede ser realizada utilizando un sintetizador de ADN automático programado para liberar o un nucleótido en la cámara de reacción (v.g., el nucleótido presente en la inmunoglobulina prototipo de esa posición en el ácido nucleico que codifica la CDR) , o bien un nucleótido diferente en la cámara de reacción (v.g., un nucleótido no presente en la inmunoglobulina prototipo de esa posición) , o bien una mezcla de los dos nucleótidos, con el fin de generar una mezcla de oligonucleótidos que comprenda no sólo los oligonucleótidos que codifican la CDR de la inmunoglobulina prototipo, sino también los oligonucleótidos que codifican la CDR de una inmunoglobulina mutada. Por ejemplo, se puede emplear un total de 10 recipientes de reactivo, conteniendo cuatro de los cuales las bases individuales y conteniendo los 6 restantes todas las posibles mezclas de dos bases de entre las 4 bases, para sintetizar cualquier mezcla de oligonucleótidos para el procedimiento de mutagénesis "de recorrido completo". Por ejemplo, el sintetizador de ADKT puede ser diseñado para que contenga las siguientes diez cámaras : Tabla 1: Sintonas para la Síntesis de ADM Automatizada Con esta disposición, se puede remplazar cualquier nucleótido por cualquier combinación de dos nucleotidos en cualquier posición de la secuencia. Alternativamente, si es posible mezclar las bases individuales en los tubos del sintetizador de oligonucleótidos, la máquina puede ser programada para retirar dos o más reservorios de bases puras para generar la proporción deseada de nucleotidos. En una realización, los dos nucleotidos, (es decir, el nucleótido de tipo salvaje y el nucleótido de tipo no salvaje) se utilizan en concentraciones aproximadamente iguales para la reacción de manera que haya la misma oportunidad de incorporar cualquiera en la secuencia en esa posición. Alternativamente, la proporción de las concentraciones de los dos nucleotidos puede ser alterada para aumentar la probabilidad de que se incorpore uno u otro al oligonucleótido . Las alteraciones de la proporción de las concentraciones (referidas aquí como "dopaje") se discuten con más detalle en la solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 60/313.686 , Número de Expediente del Agente 1551.2002-000, titulada "'Doping' in Walk-Through Mutagenesis, y también en la solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie --/ . , Número de Expediente del Agente 1551.2002-001, titulada '"Doping" in Walk-Through Mutagenesis", y presentada a la vez que esta solicitud; las enseñanzas completas de estas solicitudes de patente se incorporan aquí como referencia. En otra realización, se puede utilizar la química de la beta-cianoetil fosforamidita en fase sólida en lugar de la síntesis de ADN automatizada para la generación de los oligonucleótidos descritos antes (ver, v.g., la Patente de los Estados Unidos 4.725.677). Alternativamente, en otra realización, se puede utilizar la expresión en ribosomas (ver, v.g., Hanes y Pluckthun, "In vitro selection and evolution of funcional proteins by using ribosome display", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (1997) ; oberts y Szostak, "RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:12297-12302 (1997); Hanes y col., "Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library elected and evolved by ribosome display", Nature Biochemistry 18 :1287-1292 (2000) ) . Después se puede preparar un banco que contiene ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas a partir de tales oligonucleótidos, como se ha descrito antes, y después se puede generar un banco que contiene las inmunoglobulinas mutadas a partir de los ácidos nucleicos, utilizando mecanismos normalizados. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas pueden ser introducidos en una célula huésped para su expresión (ver, v.g., Huse, W.D. y col., Science 246:1275 (1989); Viera, J. Y col . , Meth. Enzymol. 153:3 (1987)). Los ácidos nucleicos pueden ser expresados, por ejemplo, en un sistema de expresión de E. Coli (ver, v.g., Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra, A. Y col., Biotechnology 9:23-278 (1991)) . Pueden ser expresados para la secreción al medio y/o al citoplasma de bacterias (ver, v.g., Setter, M. y Horwitz, ?. , Meth. Enzymol. 178:476 (1989)); alternativamente, pueden ser expresados en otros organismos tales como células levadura o mamífero (v.g., células de mieloma o hibridoma) . Un experto normal en la técnica comprenderá que se pueden emplear numerosos métodos de expresión para producir los bancos descritos aquí . Fusionando el gen (banco) a otros elementos genéticos adicionales, tales como promotores, terminadores, y otras secuencias adecuadas que facilitan la transcripción y la traducción, se puede lograr la expresión in vitro (presentación del ribosoma) como describen Pluckthun y col., (Pluckthun, A. Y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989) ) . De un modo similar, se pueden obtener la presentación en Fagos, la expresión bacteriana, las células de insectos infectadas por baculovirus, y la expresión en células de hongos (levaduras) , plantas y mamíferos como se describe. (Antibody Engineering R. Konterman, S. Dubel (Eds . ) . Springer Lab. Manual. Spriger-Verlag, Berlín, Heidelberg (2001), capítulo 1, "Recombinant Antibodies de S. Dubel y R.E. Konterman, Págs . 4-16). Los bancos de scFV también pueden ser fusionadas a otros genes para producir proteínas quiméricas con radicales de unión (Fv) y otras funciones, tales como catalítica, citotóxica, etc. (Antibody Engineering R. Konterman, S. Dubel (Eds.) Springer Lab Manual. Spriger- Verlag. Berlín, Heidelberg (2001) , Capítulo 41, Stabilization Strategies and Application of recombinant Fvs y Fv Fusión proteins. De U. Brinckmann, págs. 593-615) .

Preparación del Banco Universal Para generar un banco para la inmunoglobulina de interés, se realiza la mutagénesis "de recorrido completo" utilizando un único aminoácido predeterminado para la inmunoglobulina prototipo, produciendo bancos de ácidos nucleicos individuales que comprenden los nucleótidos que codifican las inmunoglobulinas mutadas (y también nucleótidos que codifican la inmunoglobulina prototipo) . Los bancos de ácido nucleico pueden ser traducidos para formar bancos de aminoácidos que comprenden las proteínas inmunoglobulinas mutadas (referidos aquí como "bancos de un único aminoácido predeterminado") . Cada banco de un único aminoácido predeterminado contiene 64 bancos subgrupo, en los cuales el aminoácido predeterminado es "walked-t rough" por cada bucle hipervariable (CD ) de la inmunoglobulina de interés (esto es, los tres bucles hipervariables de la región variable de la cadena pesada (VH1, VH2 y VH3) , y los tres bucles hipervariables de la región variable de la cadena ligera (VL1, VL2 y VL3) ) . Las inmunoglobulinas resultantes incluían inmunoglobulinas mutadas que tenían el aminoácido predeterminado en una o más posiciones de cada CDR, y colectivamente tenían el aminoácido predeterminado en cada posición de cada CDR. El aminoácido predeterminado individual es "paseado" por cada uno de los seis bucles hipervariables (CDR) individualmente; y después a través de cada una de las posibles variaciones combinatorias de las CDR (pares, tríadas, tetradas, etc.) . Las posibles variaciones combinatorias se exponen en la Tabla 2 : Tabla 2 : Bancos Subgrupo para cada Banco de un Sólo Aminoácido Predeterminado Banco Número de Subgrupo Regiones Número de Bancos Hipervariables (CDR) A 1 6 (VH1, VH2, VH3, VL1, VL2 o VL3) B 2 15 (todas las posibles combinaciones de 2) C 3 20 (todas las posibles combinaciones de 3) D 4 15 (todas las posibles combinaciones de 4) E 5 6 (todas las posibles combinaciones de 5) F 6 1 (VH1, VH2, VH3, VL1 , VL2 o VL3) Total: 63 bancos subgrupo. Un 64- banco subgrupo incluye la inmunoglobulina prototipo. Para preparar un banco "universal" para la inmunoglobulina prototipo de interés, se realiza la mutagénesis "de recorrido completo" utilizando un único aminoácido predeterminado para la inmunoglobulina prototipo, para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, produciendo 20 "bancos de un solo aminoácido predeterminado individuales" como se ha descrito antes. Estos 20 "bancos de un solo aminoácido predeterminado" individuales forman en conjunto un banco universal para la inmunoglobulina de interés . Así, en total, el banco universal para una inmunoglobulina de interés contiene 20 bancos (de un único aminoácido predeterminado) que incluyen cada uno 64 bancos subgrupo, para un total de 1.208 bancos.

Usos del Banco Los bancos descritos aquí contienen inmunoglobulinas mutadas que han sido generadas de manera que permitan el análisis sistemático y completo de las regiones de unión de la inmunoglobulina prototipo, y concretamente, de la influencia de un aminoácido concreto preseleccionado sobre las regiones de unión. Los bancos evitan problemas referentes al control o la predicción de la naturaleza de una mutación asociada con la mutagénesis al azar; permiten la generación de información específica de mutaciones concretas que permiten la interacción alterada de la inmunoglobulina de interés con su antigeno, incluyendo múltiples interacciones por aminoácidos en las regiones determinantes de la complementariedad variantes . Los bancos pueden ser rastreados mediante medios apropiados en cuanto a inmunoglobulinas concretas que tienen características especificas. Por ejemplo, se puede averiguar la actividad catalítica mediante análisis adecuados para la conversión del sustrato y la actividad de unión puede ser evaluada mediante inmunoanálisis normalizado y/o cromatografía de afinidad. Se pueden diseñar análisis para estas actividades en los que una célula requiere la actividad deseada para el crecimiento. Por ejemplo, en el rastreo de inmunoglobulinas que tienen una actividad concreta, tales como la capacidad de degradar compuestos tóxicos, la incorporación de niveles letales del compuesto tóxico a las placas de nutrientes sólo permitiría el crecimiento de células que expresen una actividad que degrade el compuesto tóxico (Wasserfalien. A., Rekik, M. , y Harayama, S. Biotechnology 9:296-298 (1991)). Los bancos también pueden ser rastreados en cuanto a otras actividades, tales como la capacidad de dirigirse a patógenos o destruirlos . Se pueden diseñar análisis de estas actividades en los cuales el patógeno de interés se expone al anticuerpo, y se pueden seleccionar los anticuerpos que demuestran la propiedad deseada (v.g., eliminación del patógeno). La información relativa al efecto del aminoácido específico incluido en las regiones CDR, ya sea sólo o en forma de una sustitución de múltiples aminoácidos, proporciona una información única sobre el efecto específico de un aminoácido dado en lo que se refiere a la afinidad y especificidad entre el anticuerpo y el antxgeno (maduración y optimización del anticuerpo) . Además, la presencia o enriquecimiento de aminoácidos específicos en las regiones de unión de una molécula de anticuerpo (inmunoglobulina) proporciona nuevas secuencias (dominios de aminoácidos) susceptibles de interaccionar con una variedad de nuevos antígenos para el descubrimiento de anticuerpos .

Las siguientes Ej emplificaciones se ofrecen con el fin de ilustrar la presente invención y no se debe considerar que limitan el alcance de esta invención. Las enseñanzas de todas las referencias citadas se incorporan aquí en su totalidad.

EJEMPLIFICACION A. Materiales y Métodos El siguiente ejemplo ilustra la síntesis de bancos de genes mediante mutagénesis "de recorrido completo" (WTM en sus siglas en inglés) incluyendo el diseño y la síntesis de bancos de aminoácidos universales . La construcción de estos bancos se basaba en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal anti-GP120 de HIV humano, específicamente limitado a sus regiones Fv (VL y VH) , diseñado en forma de una cadena sencilla (scFv) . La secuencia de aminoácidos de las regiones VL y VH del anticuerpo monoclonal GP-120 fue obtenida de una secuencia humana publicada en la literatura (Antibody Engineering R. ONTERMAN, S. Dubel (Eds.). Spriger Lab manual. Spriger- Verlag Berlín, Heidelberg (2001) , Capítulo 1, "Recombinant Antibodies" de S. Dubel y R.E. Konterman. págs . 4-16) . Las FIGS . 1A-1B muestran la secuencia completa (aminoácidos y ADN) de Fv de GP-120 organizado en forma de cadena sencilla (scFv) . La secuencia de ADN completa fue obtenida conectando artificialmente el extremo C del gen VL al extremo N del gen VH con una secuencia de ADN que codificaba un péptido sintético (G4S)3 como se ha informado previamente (Huston JS, Levinson D, Mudget-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margulis M , Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber EC, Crea R, y Opperman H, Protein engineering of antibody binding site: recovery of specific activity in an anti-digioxin single-chain Fv analogue produced in E. coli. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883, 1988; Bird RE, Hardman KD, Jacobson JW, Johnson S, Kaufman BM, Lee SM, Pope SH, Riordan GS y Witlow M, Single-chain antigen binding proteins. Science 242, 423-426, 1988.) . Las secuencias de aminoácidos de VL y VH se numeran según Kabat y col. (Kabat EA, Wu T, Reid-Miller M, Perry HM, Gottesman KS . Foeller C, (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest . 5- Edición. US Department Of Health and Human Services, Public Service, NIH.). Las regiones CDR (Ll,L2,L3 y H1,H2,H3) se muestran en negrita. La secuencia de ADN para VL y VH fueron diseñadas para hacer uso de los codones de a. a. más frecuentes en E. Coli. Además, se incluyeron diversos sitios de enzimas de restricción en la secuencia para facilitar el análisis R.E. Asimismo se incorporaron 5 extremos cohesivos (Xbal, HindIII, y Salí) y dos codones de terminación (TAA, TAG) en la secuencia del gen scFv para facilitar la clonación, la secuenciación y la expresión en plásmidos fácilmente asequibles comercialmente .' El esquema de ensamblaje total para el gen scFv de GP-120 fue obtenido a partir de oligonucleótidos sintéticos, como se muestra esquemáticamente en la FIG. 2. El ensamblaje completo fue diseñado para que incluyera la fusión (ligadura) de los genes VL y VH ensamblados independientemente. Esto último se logró mediante ligadura enzimática (ligasa de T4) de los oligonucleótidos sintéticos apropiadamente solapantes como se muestra en la FIG. 4. Tras el aislamiento de los genes VL y VH mediante electroforesis en gel preparativa y adicional ligadura mediante la ayuda de oligonucleótidos sintéticos (#174,175,177 y 189) que codifican el conector (G4S) 3 en presencia de Ligasa se produjo el constructo scFv.

La síntesis de oligonucleótidos se realizó en un sintetizador Eppendorf D-300 siguiendo el procedimiento proporcionado por el vendedor. Cada oligonucleótido fue purificado mediante electroforesis en gel, sometido a eliminación de las sales a través de una mini-columna con una base de Sephadex y almacenado individualmente a una concentración igual a una D.O. de 5 u/ml. La ligadura enzimática de los genes VL y VH se realizó en condiciones normalizadas (Maniatis y col.) donde todos los oligonucleótidos de VL y VH, con la excepción del extremo 5' de las hebras superior e inferior, fueron fosforilados primero mediante Kinasa de T-4, y utilizados a una concentración equimolar para el ensamblaje del gen en presencia de ligasa de T4 y ATP. El ensamblaje final de scFv fue obtenido mediante la ligadura de una cantidad equimolar de VL y VH en presencia de un exceso (lOx) de oligoconectores . El scFv final fue amplificado primero mediante el uso de ADN polimerasa en presencia de NTP y los fragmentos #201 y #103, y después purificado mediante electroforesis en gel preparativa. • La corrección del gen scFv fue confirmada mediante análisis de secuenciación de ADN, utilizando un secuenciador de ADN automático de Applied Biosystems, siguiendo las condiciones normalizadas proporcionadas por el vendedor. Para generar bancos de genes de scFv de GP-120 que contenían los aminoácidos seleccionados en algunas de las regiones CDR de la proteína scFV, se diseñaron reservas de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a las regiones CDR diana y se sintetizaron siguiendo las normas dictadas por el procedimiento de mutagénesis "de recorrido completo" (como se ha descrito aquí; ver también las Patentes de los Estados Unidos 5.830.650 y 5.798.208, cuyas enseñanzas completas se incorporan aqui como referencia) utilizando un sintetizador Eppendorf D300. La FIG. 5 ilustra ejemplos de reservas de oligonucleótidos diseñados para introducir tres (3) aminoácidos SER, HIS y ASP elegidos como diana, en las CDR individuales del Fv, en numerosas combinaciones posibles. Las reservas de oligonucleótidos fueron producidas mezclando cantidades iguales de fosforamidatos de nucleósidos activados durante la síntesis química. Las secuencias de la reserva de la FIG. 5 se dan utilizando la nomenclatura de la IUPAC de las bases mixtas (muestra en letras mayúsculas en negrita, R = A o G, Y = C o T, M = A o C, K = G o T, S = C o G, W = A o T; H = A o C o T, B = C o G o T, V = A o C o G, D = A o G o T. La FIG. 6 ilustra la estrategia adoptada para el ensamblaje de los genes de VL y VH con el fin de generar bancos de scFv de GP-120 en los cuales tres (3) regiones CDR de las seis, fueron sometidas a mutagénesis simultáneamente para producir la presencia de aminoácidos individuales seleccionados (Ser, His y Asp) en numerosas (8) combinaciones diferentes (Ll a L8) . La Fig. 3 resume los bancos de genes de scFV resultantes obtenidos mediante la estrategia anterior y el número de variantes génicas producidas para cada banco individual . Los- bancos de scFV individuales pueden ser clonados en plásmidos de secuenciación y/o expresión adecuados. De este modo, se pueden obtener por consiguiente el análisis de secuenciación y la expresión génica. En este ejemplo, se empleó un plásmido pFLAG como plásmido de secuenciación, mientras que para obtener la expresión de los bancos de genes de scFV en E. Coli se utilizó el plásmido pCANTAB 5E (espacio periplásmico) .

B. Diseño y síntesis de bancos de aminoácidos universales Utilizando los métodos descritos antes, se pueden diseñar 20 reservas de oligonucleótidos individuales, correspondientes cada una a uno de los 20 aminoácidos naturales para cada una de las seis CDR, como se ilustra en las FIGS . 7-12. A partir de la recopilación de estas reservas de oligonucleótidos, se pueden utilizar las seis (6) reservas correspondientes a cada aminoácido seleccionado (cualquiera de los 20 aminoácidos naturales) en cualquier disposición combinatoria posible para someter a, mutagénesis las regiones CDR correspondientes del gen scFV. La FIG. 13 muestra el agrupamiento de las reservas de CDR para aminoácidos individuales. Las seis reservas pueden ser utilizadas en cualquier fórmula combinatoria, desde la reposición de una sola CDR (seis bancos individuales) a la saturación total (las SEIS regiones CDR sometidas a mutagénesis) y cualquier combinación intermedia, como se ha descrito antes . Todos y cada uno de los bancos resultantes (63 en total + una secuencia de tipo salvaje) contendrán sólo reservas de oligonucleótidos diseñadas para proporcionar un aminoácido seleccionado, que por lo tanto está sistemáticamente distribuido en las seis regiones CDR del gen scFv, como se ha descrito antes. Como resultado de este esquema sintético, los bancos de genes que contienen predominantemente un aminoácido seleccionado, distribuido en las seis regiones CDR de cualquier modo combinatorio, se obtendrán en forma de entidades individuales y en bancos separados .

Si bien esta invención ha sido mostrada y descrita concretamente con referencias a las realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la técnica comprenderán que se pueden realizar diversos cambio en la forma y en los detalles de la misma sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención definida por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

REIVI DICACIONES

1. Un banco para una inmunoglobulina prototipo de interés, que comprende inmunoglobulinas mutadas de interés donde el único aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en una o más regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina de interés, incluyendo el banco bancos subgrupo que comprenden: a) un banco subgrupo que comprende la inmunoglobulina prototipo de interés, b) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de una de las seis regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina, con un banco subgrupo para cada una de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 6 bancos subgrupo; c) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 15 bancos subgrupo; d) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado a sido sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 20 bancos subgrupo; e) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 15 bancos subgrupo; f) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 6 bancos subgrupo,- y g) un banco subgrupo que comprende inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de la complementariedad, donde cada banco subgrupo que contiene inmunoglobulinas mutadas comprende inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición de la región determinante de la complementariedad en la cual ha sido introducido el aminoácido predeterminado.

2. El banco de la Reivindicación 1, donde la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico.

3. El banco de la Reivindicación 1, donde la inmunoglobulina de interés es IgG.

. El banco de la Reivindicación 1, donde la inmunoglobulina de interés es IgM.

5. El banco de la Reivindicación 1, donde la inmunoglobulina de interés es IgA.

6. El banco de la Reivindicación inmunoglobulina de interés es IgD.

7. El banco de la Reivindicación inmunoglobulina de interés es IgE.

8. El banco de la Reivindicación 1, donde inmunoglobulina de interés es un fragmento Fab de inmunoglobulina .

9. El banco de la Reivindicación 1, donde la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina de cadena sencilla .

10. Un banco universal para una inmunoglobulina prototipo de interés, que comprende: veinte bancos de aminoácidos predeterminados individuales que constan de un banco de un único aminoácido predeterminado para cada uno de los veinte aminoácidos de origen natural, donde cada banco de un único aminoácido predeterminado comprende inmunoglobulinas mutadas de interés donde un único aminoácido predeterminado a sido introducido en una o más posiciones en la inmunoglobulina mutada mediante mutagénesis "de recorrido completo", y donde cada banco de un único aminoácido predeterminado comprende un grupo de bancos subgrupo, incluyendo el banco bancos subgrupo que comprenden: a) un banco subgrupo que comprende la inmunoglobulina prototipo de interés, b) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de una de las seis regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina, con un banco subgrupo para cada una de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 6 bancos subgrupo; c) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 15 bancos subgrupo ; d) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado a sido sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 20 bancos subgrupo; e) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 15 bancos subgrupo; f) bancos subgrupo que comprenden inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 6 bancos · subgrupo; y g) un banco subgrupo que comprende inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de la complementariedad, donde cada banco subgrupo que contiene inmunoglobulinas mutadas comprende inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición de la región determinante de la complementariedad en la cual ha sido introducido el aminoácido predeterminado.

11. Un banco para una inmunoglobulina prototipo de interés, que comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas de interés donde un único aminoácido predeterminado ha sido introducido en una o más posiciones de una o más regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina de interés, incluyendo el banco bancos subgrupo que comprenden: a) un banco subgrupo que comprende ácidos nucleicos que codifican la inmunoglobulina prototipo de interés, b) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de una de las seis regiones determinantes de la complementariedad de la inmunoglobulina, con un banco subgrupo para cada una de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 6 bancos subgrupo; c) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 15 bancos subgrupo; d) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado a sido sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 20 bancos subgrupo,- e) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 15 bancos subgrupo; f) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 6 bancos subgrupo; y g) un banco subgrupo que comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de la complementariedad, donde cada banco subgrupo que contiene ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición de la región determinante de la complementariedad en la cual ha sido introducido el aminoácido predeterminado .

12. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico.

13. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es IgG.

14. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es IgM.

15. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es IgA.

16. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobul na de interés es IgD.

17. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es IgE.

18. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es un fragmento Fab de una inmunoglobulina.

19. El banco de la Reivindicación 11, donde la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina de cadena sencilla .

20. Un banco universal para una inmunoglobulina prototipo de interés, que comprende: veinte bancos de un único aminoácido predeterminado que constan de un banco de un único aminoácido predeterminado para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, donde cada banco de un único aminoácido predeterminado comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas de interés donde un único aminoácido predeterminado ha sido introducido en una o más posiciones de la inmunoglobulina mutada mediante mutagénesis "de recorrido completo", y donde cada banco de un único aminoácido predeterminado comprende un grupo de bancos subgrupo, incluyendo el banco bancos subgrupo que comprenden: a) un banco subgrupo que comprende ácidos nucleicos que codifican la ínmunoglobulina prototipo de interés, b) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas imitadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de una de las seis regiones determinantes de la complementariedad de la ínmunoglobulina, con un banco subgrupo para cada una de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 6 bancos subgrupo; c) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando de ese modo 15 bancos subgrupo; d) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado a sido sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 20 bancos subgrupo; e) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas rnutadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 15 bancos subgrupo; f) bancos subgrupo que comprenden ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas imitadas en las cuales el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, con ~ un banco subgrupo por cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de la complementariedad, sumando en total 6 bancos subgrupo; y g) un banco subgrupo que comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales -el aminoácido predeterminado ha sido sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de la complementariedad, donde cada banco subgrupo que contiene ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas, comprende ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas en las cuales el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición de la región determinante de la complementariedad en la cual ha sido introducido el aminoácido predeterminado.