MXPA04006106A - Metodo para analizar los efectos de agentes medicinales. - Google Patents

Abstract

Se provee un metodo para analizar los efectos de agentes medicinales, y de manera mas particular, un metodo ex vivo para analizar los efectos de agentes medicinales sobre el sistema inmune de humano.

Description

METODO PARA ANALIZAR LOS EFECTOS DE AGENTES MEDICINALES ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las medicinas a base de hierbas, tales como los ginsengs, han sido consideradas como tónicos y los estudios demuestran que el ginseng puede mejorar las funciones inmunes en humanos. Se reporta que los extractos de ginseng, incluyendo el ginseng rojo, y ginseng Panax (también denominado ginseng Americano) tienen efectos ant i - tumora 1 es en modelos en animales y en humanos. Además, las pruebas clínicas demuestran que los extractos de ginseng tienen efectos profilácticos sobre infecciones respiratorias en adultos mayores. Actualmente se desconoce el mecanismo mediante el cual los ginsengs pueden aumentar el sistema inmune para combatir la infección respiratori . Mediante un mejor entendimiento de la manera en la cual trabajan las medicinas a base de hierbas o similares, y aprendiendo cómo seleccionar estas medicinas a base de hierbas respecto a su valor para la salud, se podrían eliminar más rápidamente infecciones bacterianas y virales tales como la influenza. La infección por influenza es un problema serio de salud pública. La influenza puede ser catastrófica para personas en edad avanzada de quienes se sabe tienen una función inmune dificultada. Un remedio a base de hierbas que pudiera incrementar la función inmune para prevenir la infección de influenza y para ayudar a recuperarse de la influenza podría suministrar la tan necesitada ayuda para las personas. La respuesta inmune hacia la infección viral se puede dividir en dos fases: la respuesta inmune innata inicial y la respuesta inmune adaptada subsiguiente. La respuesta inmune innata, que actúa en la frontera de combate a la infección viral, implica la activación de macrófagos (también denominados monocitos en humanos) y de las células asesinas naturales (NK) para que secreten citocinas y quimiocinas. Las citocinas/quimiocinas secretadas por estas células pueden tener una función antiviral directa, y también funcionan para activar la respuesta inmune adaptada. La respuesta inmune adaptada es antígeno-específ ica y por lo tanto, más so_fjj? tJLc^ada^ ^J^ajnbi^ n se puede dividir en respuestas humorales (anticuerpos) y respuestas inmunes mediadas por célula. Los principales participantes en la respuesta inmune mediada por células pueden incluir las células auxiliares T CD4 positivas de tipo 1 (Thl) y los linfocitos T citotóxicos CD8 positivos (CTL) . Las células Thl, en parte, ayudan en la proliferación de CTL, y el CTL puede aniquilar directamente las células infectadas con virus mediante reconocimiento de los antígenos virales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se provee un método para analizar los efectos de agentes medicinales, y de manera más particular, un método ex vivo para analizar los efectos de agentes medicinales sobre el sistema inmune humano. Se desconoce, en su gran mayoría, la manera en la cual los agentes medicinales afectan a las células y/o estimulan al sistema inmune. En un intento para delinear el beneficio potencial de agentes medicinales, se provee en la presente invención un método para analizar los efectos de un agente medicinal. El método se logra poniendo al agente medicinal en contacto con células e hacia el agente medicinal . El contacto se puede lograr coincubando al agente medicinal con las células o utilizando otros métodos conocidos en la técnica. La respuesta celular se puede identificar mediante sondas para marcadores fenotípicos y/o marcadores químicos. Se pueden utilizar marcadores fenotípicos para determinar el tipo de célula afectada por el agente medicinal, mientras que los marcadores químicos pueden identificar las moléculas que son producidas por las células. Se pueden variar tanto los marcadores fenotípicos como los marcadores químicos para identificar una amplia gama de células y/o moléculas. En parte, en la presente invención se provee un método para determinar el efecto de un agente medicinal sobre la respuesta inmune. Esto se logra poniendo en contacto al agente medicinal con células con capacidad de respuesta inmune para formar una mezcla agente - célula y suministrando por lo menos una sonda para la mezcla agente-célula para evaluar la activación celular. Tal como se utiliza en la presente invención, "células con capacidad de respuesta inmune" se refiere a cualquier tipo celular que se active directamente o indirectamente mediante un antígeno unido o no unido a célula. Las sondas _pue_den jm^u^r^anticuerpos para antígenos de superficie celular, antígenos secretados, y/o antígenos intra- celulares. Los ejemplos de antígenos de superficie celular pueden incluir proteínas de superficie o proteínas de la membrana celular de las células con capacidad de respuesta inmune, o cualquier otro tipo de antígeno de superficie celular conocido en la técnica para identificar el tipo celular. Los ejemplos de antígenos / moléculas intra-celulares y/o secretadas incluyen polipéptidos tales como las quimiocinas y/o citocinas. También se provee en la presente invención un método para determinar la reacción celular a un agente medicinal poniendo en contacto el agente medicinal con células con capacidad de respuesta inmune para formar una mezcla agente-célula, y analizando respecto a la presencia de por lo menos dos marcadores fenotípicos en la mezcla agente-célula. Cada marcador fenotípico se utiliza para identificar un tipo particular de célula con capacidad de respuesta inmune activada. Los ejemplos de tipos de células con capacidad de respuesta inmune incluyen células T, células B, células asesinas naturales, y monocitos. De manera adicional, se puede poner en contacto con la mezcla célula-agente por lo menos una sonda para un marcador químico. Cada sonda de marcador químico identifica en forma común una proteína particular, o clases de proteínas producidas por células con capacidad de respuesta inmune. Los ejemplos de proteínas producidas por las células con capacidad de respuesta inmune incluyen citocinas y quimiocinas, aunque también se pueden identificar otras proteínas celulares. Dichas proteínas también pueden ser producidas por un tipo celular individual o pueden ser producidas por más de un tipo de célula. La mezcla agente - célula se puede evaluar en diversos intervalos de tiempo para identificar los efectos del agente medicinal analizando los marcadores de fenotipo y/o los marcadores químicos. Asimismo, se pueden agregar agentes bacterianos o virales a la mezcla de agente - célul a antes de evaluar la mezcla respecto a la presencia de células con capacidad de respuesta inmune activadas. Las evaluaciones pueden tomar lugar a intervalos de tiempo elegidos para la prueba particular, incluyendo evaluaciones por minuto, por hora, y/o día, dependiendo de los parámetros deseados y de los marcadores utilizados . También se pueden agregar a la mezcla de agente-célula sondas para otros tipos de marcadores, incluyendo _sondas_para^ jnarcadores de activación. Los marcadores de activación son producidos por células que se tornan activas y que comúnmente suprimen o incrementan la transcripción de péptidos particulares en presencia de sustancias diferentes. Los ejemplos ilustrativos de marcadores de activación incluyen CD69 (correspondiente a las células T y a los monocitos) y MHC Clase II (también conocida como HLA-DR, el cual corresponde a las células B) . Los marcadores de activación también pueden ayudar a identificar los efectos de agentes medicinales sobre una variedad de tipo celulares. También se provee en la presente invención un método para detectar la respuesta celular incubando células mononucleadas de sangre periférica en presencia de un material de base vegetal y poner en contacto las células mononucleadas de sangre periférica incubadas con un conjunto de sondas para formar un complejo complementario de sonda-célula. Cada sonda puede complejarse con un marcador fenotípico específico para un tipo celular con capacidad de respuesta inmune. Por tanto los complejos sonda-célula se pueden detectar y analizar. También se pueden utilizar sondas para marcadores químicos y/o de activación, y también se pueden detectar los complejos sonda - marcador .

BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURAS La Figura 1 muestra la activación dependiente de la dosis de extracto de ginseng Panax 5 en monocitos CD14+. Se incuban PBMC recién aisladas con 10 o 100 ug/ml de extracto de ginseng Panax (CVT 2001-009 o con control en el cual no se agrega extracto de ginseng, durante la noche (16 horas) . Las células se tiñen con CD14 (APC) , CD69 (PE) y CD86 10 (PerCP) (Becton Dickinson, CA) y después se someten a análisis de citometría de flujo. Las células CD14+ se separan como monocitos (macrófagos ) y se analiza su expresión de CD69 y CD86. Se muestra el porcentaje de monocitos CD69 y CD86 doble positivo. 15 Las figuras 2a y 2b muestran la activación de células NK mediante extracto de ginseng Panax utilizando tinción intracelular del análisis de IFN-g y marcador CD56 de célula NK . Se incuban PBMC recién aisladas provenientes de voluntarios sanos con virus 20 vivo de influenza (total de 30 HAU/ml) sin o con dosis diferentes de extractos de ginseng (CVT 2001- 009), incluyendo el extracto de control (control HT _ _.._1_0_01^_0_0_5_)^__ Después de 16 horas de incubación, las células se fijan, se permeabi 1 i zan , y se tiñen con 25 los siguientes anticuerpos INF -g (FITC) , CD56 (PE) , CD3 (PerCP) o CD19 (APC) . Los linfocitos (los cuales contienen principalmente células T, B y NK) se separan del graficador de dispersión delantero contra lateral para el siguiente análisis de distribución de puntos (dotplot) : expresión de CD56 contra IFN-g. El % de linfocitos que aparece en el cuadrante superior derecho (CD56 e IFN-g doble positivo) se define como células NK activadas (figura 2A) . Además, en la figura 2B se gráfica la manera dependiente de dosis de activación de célula NK mediante extracto de ginseng, CVT-2001 - 009. Se observan resultados similares en otros dos experimentos y se confirman en PBMC proveniente de tres donadores sanos diferentes. La figura 2A muestra la activación específica de células NK mediante extracto de ginseng Panax en presencia de virus de influenza. La Figura 2B muestra la activación dependiente de la dosis de células NK mediante extracto de ginseng. La Figura 3 muestra una comparación de extractos de ginseng Panax diferentes en la activación de las células NK para que secreten IFN-g. El experimento se efectúa de manera similar a la de serita en la leyenda de la figura 2 con excepción que en este experimento se comparan extractos diferentes de Panax. El primer grupo de barras (izquierda) sólo el tratamiento de PB C en presencia de virus de influenza y el segundo grupo (derecha) son con virus. Se advierte que sin la presencia de virus de influenza los extractos de ginseng no activan células N . La Figura 4 muestra el efecto de extractos de ginseng Panax sobre la proliferación de células T Thl CD4+ y CTL CD8+. Se estimulan PBMC aisladas de dos donadores sanos con virus de influenza aniquilados (vacuna de influenza diluida 1:1000 X) durante un periodo de 7 9 días con dosis diferentes de extractos de ginseng Panax. Las células se recolectan después, se cuentan y se mezclan con 1/10 de PBMC autólogas recién aisladas infectadas con virus vivo de influenza. Se utilizan PBMC sin infectar como estimuladores de control. Las células mezcladas se incuban durante 3 horas antes de agregar brefelden A (BFA) para detener la secreción de citocinas hacia el exterior de las células . Las células se incuban durante otras 13 horas en presencia de BFA. Las células se fijan, se permeabi 1 i zan y se someten a tinción de citocina intracelular de IFN-g (FITC) _junto_ con_ CD56 (PE)_, CD8 (PerCP) y CD4 (APC) . Se separan cualquiera de las células T CD4 + o CD8+ para su expresión de IFN-g. Los porcentajes de células T (ya sea CD4 o CD8) que también son positivas para IFN-g se gráfica en forma correspondiente. La Figura 5 muestra el efecto de extracto de ginseng Panax (CVT 2001 009) sobre el crecimiento de células NK en cultivos de CLT estimulados por virus de influenza aniquilados. Se establecen cultivos de CTL estimulados con virus de influenza como se describe en la leyenda de la figura 4. Al final del cultivo de CTL, las células se tiñen con CD56. El porcentaje de células y de CD56+ se cuenta como células NK y se gráfica en forma correspondiente. Los resultados muestran una tendencia de efectos de estimulación dependientes de la dosis de extracto de ginseng (CVT 2001 - 009) . No se observa un incremento en el crecimiento de células NK cuando se utilizan los extractos de control (CVT HT 1001 005 ó 009) (datos mostrados) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se desarrolla un método para analizar los efectos de agentes medicinales. Los agentes medicinales pueden incluir agentes obtenidos de fuentes naturales y los fabricados sintéticamente. Los ejemplos de agentes de origen natural incluyen materiales basados en plantas, tales como las hierbas. Los materiales basados en planta pueden incluir, sin limitación, hojas, raíces, corteza, savia, bayas, y/o extractos o combinaciones de los mismos. De igual manera, los materiales basados en plantas se pueden moler, secar, fraccionar, percolar, o dejar intactos. En una modalidad, los agentes medicinales se ponen en contacto con células mononucleadas de sangre periférica (PBMC), las cuales son una mezcla de tipos celulares incluyendo células con capacidad de respuesta inmune tales como Thl, CTL, NK, células B y monocitos (también conocidos como macrófagos) . Cada uno de estos tipos celulares con capacidad de respuesta inmune tiene por lo menos un marcador de fenotipo tal como un antígeno de superficie que pueda ser detectado. Por ejemplo, CD4 , CD8 , CD56, CD19, y CD 14 son marcadores fenotípicos para Thl, CTL, NK, células B y monocitos, respecti amente. Las células Thl y CTL también tienen el antígeno CD3. Las células NK tienen al antígeno CD16 adicional. Cada antígeno de superficie (marcador fenotípico) se puede identificar utilizando una sonda, la cual típicamente es un anticuerpo para estos antígenos de superficie, pero puede ser cualquier otra sonda que se pueda utilizar para identificar los antígenos de superficie. Las sondas también se pueden marcar con una marca radioactiva, fluorescente, o con color, aunque se pueden utilizar otros tipos de marcas conocidas en la técnica. Las células con capacidad de respuesta inmune comúnmente producen marcadores químicos diferentes cuando se activa, por ejemplo, péptidos y/u otros factores. Muchos de estos marcadores químicos son conocidos como citocinas y quimiocinas. Las citocinas incluyen las interleucinas , tales como IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, e IL-12. Otras citocinas incluyen el interferon-gama (ifn-?) y el factor de necrosis tumoral-alfa (tnf-a) aunque también se pueden utilizar otras citocinas producidas por la células con capacidad de respuesta inmune. Los ejemplos de quimiocinas apropiadas (pol ipéptidos de bajo peso molecular que atraen de manera quimiotác ica a diferentes leucocitos) que también se pueden analizar respecto al factor de activación y quimiotáctico de macrófago (MCAF) , proteína la inflamatoria de macrófago (MIP-la), proteína Ib inflamatoria de macrófago (MIP- lb) , RANTES, e interleucina 8 (IL-8) . Estos marcadores -q-u-ímicos. — t_ambién__se_ pueden identificar utilizando sondas, las cuales con frecuencia son anticuerpos para cada uno de estos péptidos y/o factores pero pueden ser cualquier sonda que identifique un péptido de secreción específico o intra-celular o factor producido a partir de una célula con capacidad de respuesta inmune. Para detectar la respuesta celular, se pueden incubar células PBMC en presencia de un agente medicinal, tal como un agente medicinal a base de hierbas. Después las células PBMC incubadas se pueden poner en contacto con un conjunto de sondas para por lo menos dos marcadores fenotípicos para tipos celulares con capacidad de respuesta inmune específicas (por ejemplo célula Thl y célula B) . Cada sonda identifica en forma específica un marcador de fenotipo particular. Cuando el marcador de fenotipo está presente dentro de las células incubadas y se pone en contacto con su sonda específica, se forma un complejo sonda -marcador . Los complejos sonda-marcador se pueden detectar y analizar después utilizando métodos y pruebas conocidas por los expertos en la técnica. Se pueden agregar componentes adicionales a las células PBMC incubadas para proveer más información acerca de los efectos del agente medicinal. Por ejemplo, se pueden poner en contacto sondas para marcadores químicos específicos tales como citocinas y quimiocinas con las células PBMC incubadas para formar complejos sonda - marcador adicionales que se pueden detectar y analizar. También se pueden incubar agentes infecciosos, tales como agentes bacterianos o virales, con las células PBMC, en combinación con sondas para marcadores de fenotipo y/o marcadores químicos. Por último, se pueden utilizar otros tipos de sondas para que entren en contacto con las células PBMC incubadas incluyendo sondas para marcadores de activación u otros marcadores conocidos por el experto en la técnica. También se pueden incubar otros tipos de agentes conocidos en la técnica con células PBMC y agente medicinal para determinar si se obtiene un beneficio o un detrimento.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplo ilustran el método para analizar el efecto de los agentes medicinales. Estos ejemplos ilustran pero no limitan el campo de la invención que ha sido indicado en la misma. Sin embargo, antes de discutir cada ejemplo, se debe analizar los fundamentos experimentales para proveer un entendimiento suficiente de los métodos utilizados para llegar a los resultados de cada ejemplo. Desde luego, estos métodos se pueden variar o cambiar como se sabe en la técnica para obtener el mismo resultado o resultados similares, o los métodos se pueden mejorar o alterar según se mejore la tecnología.

Extractos de ginseng Panax El agente medicinal elegido para los siguientes ejemplos es ginseng Panax. Los extractos de ginseng Panax son suministrados por CV Technologies (CVT) , Edmonton, Canadá. Se obtienen tres lotes diferentes de extractos de ginseng Panax CVT 2001 008, CVT 2001 009, CVT 2001 010, y dos lotes diferentes de extractos de control CVT HT 1001 -005 y CVT HT 1001-009. Todos los extractos se suministran en forma de polvo y se disuelven en solución reguladora PBS . Los extractos se diluyen después hasta sus concentraciones finales en medio para cultivo de tejidos, RPMI, (Gibco, MS) con 10% de FBS (Summit Biotech, CO) .

Purificación de células mononucleadas de sangre periférica Se centrifugan células PBMC heparini zadas -( 2^0-a- 30__ mL de cada_ extracción de sangre) proveniente de individuos sanos a 1200 rpm durante 10 minutos para aislar las capas de recubrimiento de color beíge. Se recolectan las capas de recubrimiento de color beige y se tienden cuidadosamente sobre un gradiente de ficol (Histopaque, Sigma, MO) . Después las células se centrifugan durante 30 minutos a 1700 rpm. Se recolectan las células PBMC de la interfaz, se vuelven a centrifugar, y se lavan dos veces con medio RPMI antes de utilizarlas para los experimentos.

Análisis de activación de monocitos utilizando ginsengs Panax Se incuban 5 x 105 PBMC en 200 ul de medio AIM-V (Gibco, MD) con dosis diferentes de extractos de ginseng Panax durante la noche (16 horas) . Las células se centrifugan, se tiñen con anticuerpos para antigeno de superficie CD14-APC, CD69-FITC y CD86-PE. Las células teñidas se someten a análisis de citometría de flujo utilizando un aparato FACSCalibur (Becton Dickinson, CA) y los datos se analizan utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson, CA) . Se separan las células CD14 positivo y se analiza la expresión de los marcadores de activación CD69 y CD86 utilizando los anticuerpos apropiados.

Análisis de la activación de células dendríticas (CP) utilizando ginseng Se generan células dendríticas mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, y se provee el siguiente ejemplo breve para ilustración. Se colocan 1.5 x 107 PBMC recién aisladas en 3 mi de AIM-V en las cavidades de una placa de seis cavidades y se incuban durante 3 horas a 37°C. Las células no adherentes se desechan. Las células adherentes se lavan dos veces suavemente, y después se cultivan en 5 mi de AIM-V en presencia de GM-CSC (800 unidades/ml) y IL-4 (1000 unidades/ml) (BioSource, CA) . Después de 7 días de incubación, los cultivos normalmente contienen más del 50% de células dendríticas, según se determina mediante la morfología rica en dendritos de los cultivos y la expresión alta de MHC y otras moléculas co- estimuladoras . Para analizar el efecto de ginseng en células dendríticas, se recolectan células provenientes de cultivos de células dendríticas en el día 7, se cuentan y se incuban con dosis diferentes de extractos de ginseng Panax durante la noche. Después se tiñen las células con anticuerpos contra CD86, 83, y MHC II (también denominado HLA-DR) .

Prueba inmuno-rápida Se co-incuban 1 X 106 PBMC con dosis diferentes de extractos de ginseng Panax y controles. A las células PBMC se agrega una mezcla de virus de influenza vivos que contienen cantidades iguales (10 HA unidades/ml) de influenza A/H3N2 /Calvadonia , A/H1N1/Panama y B/Yamanashi, según sea necesario. Se utiliza fluido alantóico como el antígeno de control para los virus de influenza vivos. Las células PBMC se activan con o sin influenza durante 3 horas y se agrega Brefeldin A (BFA, 5 ug/ml, Sigma, MO) a las células. Las células PBMC se incuban durante otras 15 horas. Las PBMC se fijan después (paraformaldehído al 1%, Sigma, MO), se permeabi 1 i zan (solución reguladora para permeabi 1 i zac ion , Becton Dickinson, CA) , y se tiñen para los siguientes anticuerpos conjugados: CD56-PE, CD4-APC, CD8-PerCP, e IFN-g-FITC. Las PBMC teñidas se someten a análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro FACSCalibur y el software CellQuest. Los linfocitos se separan del graficador de dispersión para análisis subsiguiente. Las células NK (CD56 positivo) que también son positivos para IFN-g se definen como células NK activadas.

Cultivos de CTL Se colocan 1.5 X 10s PBMC en 1.5 mi de medio completo (RPMI más 10% de FBS) en las cavidades de una placa de 24 cavidades con dosis diferentes de extracto de ginseng. Las PBMC se estimulan con virus de influenza aniquilados (provenientes de vacuna de influenza 1 -.1000 diluida) de influenza A Calvadonia, A Panamá y B Yamanashi . Los cultivos se complementan con una dosis baja de IL-2 (20 IU/ml) e IL-7 (20 ng/ml) cada 48 horas. Después de 7 a 9 días de cultivo, se recolectan las células, se cuentan y analizan respecto a la frecuencia de células T específicas para influenza.

Cuantificacion de células T CD4 positivo o CD8 positivo específicas para influenza provenientes de cultivo CTL El día en que se recolectan los cultivos de CTL para análisis, también se obtiene sangre periférica a partir de los donadores originales cuyas PBMC se utilizaron para iniciar los cultivos de CTL. Se infectan PBMC recién aisladas con virus de influenza. Estas PBMC recién aisladas suministran células que presentan antígenos autólogos. Las PBMC infectadas se mezclan con las células recolectadas a partir del cultivo de CTL a una relación de 1:10 ( PBMC : CTL ) respectivamente. Como control, se utilizan PBMC no infectadas para mezclarlas con las células provenientes de cultivos de CTL. Las mezclas de células se incuban durante 3 horas antes que se agregue BFA. Las células T específicas para influenza se cuantifican mediante la prueba inmunológica rápida en una forma similar a la descrita anteriormente. La frecuencia de células T específicas para influenza se define como células T CD8 positivo o CD4 positivo que también son IFN-g positivo después de la estimulación mediante células infectadas con influenza.

EJEMPLO 1 Efecto de ginseng sobre células que presentan antígeno tales como monocitos y células dendríticas Las células presentadoras de antígeno, las cuales incluyen monocitos o macrófagos y células dendríticas, son células importantes en la mediación de la respuesta de célula T que procesan y presentan antígenos virales a las células T en el caso de una infección viral. Se sabe que las células presentadoras de antígeno activadas son células presentadoras de antígeno más efectivas debido a su expresión más alta de HC y moléculas co- est imuladoras . Además, las células presentadoras de antígeno activadas pueden secretar citocinas tales como IL-12 e IL-10 para reclutar células T y para estimular a las células T para que proliferen. Se efectúan los siguientes dos experimentos para determinar los efectos del ginseng sobre células presentadoras de antígeno. Primero, se incuban PBMC con dosis diferentes de extracto de ginseng Panax durante la noche (16 horas) para determinar si los monocitos (células CD14 positivo) pueden o no ser activadas por el ginseng Panax. Se utilizan los marcadores de activación CD69 y CD86 doble positivo como un indicador de monocitos activados. Este primer experimento da como resultado un incremento de monocitos activados en presencia de extracto de ginseng Panax, y la activación de monocitos es dependiente de la dosis (Figura 1) . El segundo experimento es para determinar el efecto del ginseng sobre células dendríticas generadas in vitro, las células presentadoras de antígeno especializadas. Se generan células dendríticas a partir de PBMC adherentes en presencia de GM-CSF e IL-4 durante 7 días. Después se recolectan las células dendríticas y se incuban con dosis diferentes de extracto de ginseng durante la noche, y se analiza el efecto de activación mediante la expresión incrementada potencial de MHC II, CD86 y CD83. CD86 es una molécula co-estimulante (B7.2) y CD83 es un marcador para células dendríticas maduras. Se sabe que las células dendríticas activadas tienen una expresión incrementada de CD83, CD86 y MHC II. Los resultados demuestran que existe un incremento en CD83 (datos no mostrados) después que las células dendríticas se co-incuban con extracto de ginseng durante la noche.

EJEMPLO 2 Efecto de extractos de ginseng Panax sobre la estimulación de células NK en respuesta a la infección por influenza Las células NK juegan un papel importante en la fase inicial de una infección viral debido a que las células NK pueden aniquilar directamente células infectadas con virus. Además, las células NK activadas pueden secretar citocinas tales como IFN-g e IL-2. IFN-g tiene tanto efecto antiviral directamente así como la capacidad de proveer ayuda para la proliferación de CTL . Se efectúan experimentos para determinar si el ginseng estimula o no a las células NK, lo cual da como resultado el hallazgo de que el extracto de ginseng estimula las células NK cuando se incuban PBMC durante la noche con virus de influenza vivos (Figura 2A) . La estimulación del ginseng se demuestra por la secreción de IFN-g mediante células NK. La activación de las células NK es dependiente de la dosis de extracto de ginseng (Figura 2B) . Además, la activación de células NK mediante ginseng es específica de las células NK debido a que el ginseng no activa células T CD3 positivas activas (las cuales se evalúan respecto a células tanto Thl como CTL) o células NKT (células CD3 y CD56 doble positivo) . Se descubrió que la estimulación de células NK mediante ginseng es dependiente del patógeno, es decir, el ginseng estimula a las células NK a secretar IFN-g únicamente en presencia de virus de influenza (Figura 2A, segundo y cuarto paneles) . También se efectúan experimentos para evaluar los dos extractos de ginseng de control suministrados por CVT (CVT HT 1001-005 y CVT HT 1001-009) . Se sabe que estos extractos de control no tienen función inmunológica detectable. Estos dos extractos de control no activan las células NK incluso cuando están presentes virus de influenza en el cultivo (Figura 2, tercer panel) . Los experimentos demuestran que los ginseng estimulan al sistema inmune en respuesta a la infección con virus de influenza estimulando/activando las NK específicamente. La activación de células NK mediante los ginsengs es específico para la influenza, y dependiente de la dosis de extracto de ginseng. De los tres extractos de ginseng y los dos extractos de control evaluados, los extractos de ginseng demostraron efecto de estimulación específico en células NK para secretar IFN-g, solo con muy poca variación en términos del grado de activaciones utilizando estos tres extractos diferentes (véase Figura 3) . Asimismo, no se observa estimulación de células NK por parte de estos dos extractos de control, o cuando no se agrega ginseng.

EJEMPLO 3 Efecto del ginseng sobre el crecimiento de células Thl CD4 positivo específicas de influenza, células CTL CD8 positivas y células NK Los experimentos de los Ejemplos 1 y 2 anteriores son experimentos ex vivo que utilizan el cultivo a corto plazo (durante la noche) de PBMC recién aisladas. Aunque se prefieren los experimentos ex vivo para analizar el mecanismo celular mediante el cual funcionan los extractos de ginseng, no se pueden utilizar experimentos ex vivo para estudiar el efecto a largo plazo de los extractos de ginseng sobre la proliferación de CTL u otros tipos celulares. Por esta razón, se efectúan cultivos de CTL de PBMC estimuladas por vacuna de influenza diluida (que contiene virus de influenza aniquilados) en presencia de extractos de ginseng. Como controles, se efectúan experimentos utilizando ya sea los extractos de control CVT o se agrega extracto de ginseng. Después de 7 a 9 días de co- incubación con la vacuna, se recolectan células provenientes de los cultivos de CTL, se cuentan y se someten a la prueba inmuno-rápida. Las células T IFN-g positivo se definen como células T específicas de antígeno después de la reactivación mediante las células presentadoras de antígeno infectadas con influenza (véase la sección de materiales y métodos) . Se observa que en los cultivos de CTL provenientes de un donador, el extracto de ginseng estimula un crecimiento mayor de células T específicas de influenza, en particular las células CTL CD8 positivo (donador 1, células CD8+, Figura 4) . También se descubrió que existen números significativamente más altos de células NK en el cultivo de CTL cuando se agrega el extracto de ginseng en comparación con los controles en los cuales no se agrega extracto de ginseng (Figura 5) .

Además, los resultados demuestran un incremento de células NK con ginseng en una manera dependiente de dosis de extracto de ginseng. Cuando se utilizan extractos de control (CVT HT 1001-005 o CVT 1001-009), no se observa incremento en el crecimiento de células NK (datos no mostrados) en los cultivos de CTL . Este resultado es consistente con la observación de que los extractos de ginseng Panax estimulan las células NK (para que secreten IFN-g) en la fase inicial de activación por parte de los virus de influenza (Figura 2 ) . Como se puede observar en los ejemplos antes identificados, los extractos de ginseng Panax activan directamente a los monocitos, y en presencia de los extractos también aumenta la activación de células NK en respuesta a la infección por influenza. Los extractos de ginseng Panax también ayudan a la proliferación de células T específicas de influenza, incluyendo células T Thl CD4 positivo y células CTL CD8 positivo, así como la proliferación de células NK totales. También se observa que los virus de influenza inducen la secreción de IFN-g a partir de células T de memoria específicas para influenza (cuadrante derecho inferior en la Figura 2A, tercer panel) . Los extractos de ginseng Panax no tienen efecto de aumento sobre células T en cultivo a corto plazo en cualquiera de las células T específicas para influenza o no específicas para influenza. Aunque se puede observar la activación de células NK mediante virus de influenza sólo, aún sin la presencia de extracto de ginseng, la activación de células NK por parte de los virus de influenza requiere una incubación prolongada (> de 16 horas) de PBMC con virus de influenza vivos. Con condiciones ex vivo en las cuales todas las secreciones de citosina se detienen (mediante BFA) después de 3 horas de coincubación de PBMC y virus, no se observa activación de las células NK a menos que se agreguen los extractos de ginseng Panax . Por último, los resultados demuestran la factibilidad de un análisis ex vivo para estudiar la mecánica de cómo los agentes medicinales pueden afectar a las células, incluyendo células con capacidad de respuesta inmune. Esto suministra un método para seleccionar agentes medicinales para determinar si éstos pueden o no estimular al sistema inmune. Este análisis ex vivo también se puede utilizar para analizar los efectos inmunológicos de agentes medicinales, incluyendo medicinas a base de hierbas, en respuesta a un patógeno particular de interés.

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar los efectos de un agente medicinal sobre la respuesta inmune que comprende : poner en contacto el agente medicinal con células con capacidad de respuesta inmune para formar una mezcla agente- célula ,- y analizar la mezcla agente - célula respecto a la activación celular con una sonda.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracte izado porque la sonda utilizada para analizar la mezcla agente - célula respecto a la activación celular incluye una sonda de marcador de fenotipo, una sonda de marcador químico, una sonda de marcador de activación, o una combinación de las mismas .

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda utilizada para analizar la mezcla de agente - célul a respecto a la activación celular incluye un anticuerpo para antígenos de superficie celular, anticuerpo para antígenos secretados, anticuerpo para antígenos 5 intra-celulares , o una combinación de los mismos.

4. - Un método para determinar la reacción celular hacia un agente medicinal que comprende: poner en contacto al agente medicinal con células con capacidad de respuesta inmune para formar 10 una mezcla agente- célula ; y analizar la mezcla agente -célula respecto a la presencia de por lo menos dos marcadores de fenotipo.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los marcadores 15 de fenotipo incluyen CD , CD8 , CD56, CD19, CD14, CD3 , CD16, o una combinación de los mismos.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, que comprende también poner en contacto la mezcla agente - célula con una sonda para 20 un marcador químico y analizar la mezcla agente- célula respecto a la presencia del marcador químico.

7.- Un método para detectar la respuesta celular que comprende: ~~ incubar células mononucleadas de sangre 25 periférica en presencia de un material a base de plantas; y poner en contacto las células raononucleadas de sangre periférica con un conjunto de sondas para formar un complejo sonda-célula.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, que comprende también detectar al complejo sonda - célula .

9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, que comprende también poner en contacto las células mononuc leadas de sangre periférica incubadas con una sonda para un marcador químico, marcador de activación, o una combinación de los mismos para formar una complejo sonda -marcador y detectar al complejo sonda-marcador.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 7, que comprende también incubar las células mononucleadas de sangre periférica en presencia de un agente infeccioso.

11. - Los métodos de las reivindicaciones 1 y 4, en los cuales el agente medicinal incluye material derivado de ginseng Panax .