MXPA04006073A - Vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una formulacion optima de vacunas de conjugado de Streptococcus pneumoniae </I> de multiples serotipos <I>.

Description

VACUNA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una vacuna de Streptococcus pneumonía mejorada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los niños menores de 2 años de edad no montan una respuesta inmune a la-mayoría de las vacunas de polisacáridos, de manera que ha sido necesario volver a los polisacáridos inmunogénicos mediante conjugación química a un vehículo de proteína. El acoplamiento del polisacárido, un antígeno independiente de T, a una proteína, un antígeno dependiente T, confiere al polisacárido las propiedades de dependencia T incluyendo intercambio de isotipo, maduración de afinidad, e inducción de memoria. Sin embargo, puede haber emisiones con administración de repetición de conjugados de polisacárido-proteína, o la combinación de conjugados de polisacárido-proteína para formar vacunas multivalentes. Por ejemplo, se ha reportado que una vacuna de polisacárido de Haemophilus influenzae (PRP) tipo b utilizando toxoide de tétanos (TT) como el vehículo de proteína, se prueba en un rango de dosificación con inmunización simultánea con TT (libre) y una vacuna de conjugado de polisacárido pneumococal-TT después de un programa infantil estándar. A medida que la dosificación de vacuna pneumococal se incrementa, la respuesta inmune a la porción de polisacárido PRP de la vacuna de conjugado Hib se reduce, indicando interferencia inmune del polisacárido, posiblemente a través del uso de la misma proteína portadora (Dagan er al., Infect lmmun. (1998), 66:2093-2098). El efecto de la dosificación de proteína portadora en la respuesta humoral a la proteína por sí misma también se ha probado que tiene múltiples facetas. En los infantes humanos, se reportó que el incremento de la dosificación de un conjugado de toxoide de tétano trivalente resultó en una respuesta reducida al vehículo de tétanos (Dagan et al., supra). El análisis clínico de estos efectos de vacunas de combinación se han descrito como supresión epitópica inducida por vehículo, que no se entiende completamente, pero se cree que resulta de una cantidad en exceso de proteína portadora (Fattom, Vaccine 17:126 (1999)). Esto parece resultar en la competición de células Th, por las células B a la proteína portadora, y células B al polisacárido. Si las células B a la proteína portadora predominan, no existen suficientes células Th disponibles para proporcionar la ayuda necesaria para que las células B específicas para el polisacárido. Sin embargo, los efectos inmunológicos observados han sido inconscientes, con la cantidad total de proteína portadora en algunos casos incrementando la respuesta inmune, y en otros casos disminuyendo la respuesta inmune. Por lo tanto, existen dificultades técnicas restantes para combinar múltiples conjugados de polisacáridos en una formulación de vacuna, eficaz, única. De esta manera, es un objeto de la presente invención desarrollar una formulación mejorada de una vacuna de conjugado de polisacárido de Streptococcus pneumoniae de serotipo múltiple. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención es una vacuna de Streptococcus pneumonía mejorada que comprende 1 1 o más polisacáridos de diferentes serotipos diferentes de S. pneumonía conjugados con 2 o más proteínas de vehículo, donde los polisacáridos de serotipos 6B, 19F y 23F se conjugan con una primer proteína portadora y los serotipos restantes se conjugan en 1 o 2 proteínas de vehículo secundarias, y donde la(s) proteína(s) de vehículo secundaria(s) son diferentes de la primer proteína portadora. Preferentemente los serotipos 6B y 23F se conjugan con la primer proteína portadora, y más preferentemente solamente el serotipo 6B se conjuga con la primer proteína portadora, y más preferentemente solamente el serotipo 6B se conjuga con la primer proteína portadora. En una modalidad preferida, una(s) de la proteína(s) portadora(s) secundaria(s) es proteína D de H. influenzae. La presente invención puede comprender además proteínas de superficie de S. pneumonía, preferentemente de la familia PhtX, familia CbpX, familia truncada CbpX y Ply. En un aspecto relacionado, la presente invención es un método mejorado para producir una respuesta inmune protectora a infantes contra S. pneumoniae al administrar la vacuna de conjugado de polisacárido de la presente invención. En otro aspecto relacionado, la presente invención es un método mejorado para producir una respuesta inmune protectora, es decir, para la prevención o mejora de infección pneumococal en las personas mayores (por ejemplo, pneumonía) y/o en infantes (por ejemplo, Otitis media), al administrar la vacuna de conjugado de polisacárido de la presente invención y una proteína de superficie de S. pneumonía.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 es una representación gráfica de la respuesta inmune a 12 diferentes polisacáridos pneumococales según se determina por el incremento de veces promedio geométrico después de inmunización de polisacárido. Figura 2 muestra la concentración de IgG promedio geométrico [GMC] ^g/ml) y concentraciones opsónicas el día 14 (Post II) después de la inmunización de ratas adultas con 1 .0 µg PS-PD solo o combinado en vacuna tetravalente, pentavalente, heptavalente o decavalente. Figura 3 muestra GMC para 1 1 serotipos y PD (proteína D) contra la dosificación de 6B y 23F en una dimensión, y la dosificación de los 9 otros en la segunda dimensión. La tendencia siempre es la misma para todos los serotipos y PD. El incremento de la dosificación de 6B y 23F tiene un efecto dramático para reducir la respuesta inmune a los conjugados restantes, aún cuando la dosificación de aquellos conjugados no se cambia. Figura 4 muestra una gráfica de GMC IgG en ratas infantes contra la cantidad total de PD inmunizada para 1 1 serotipos (es decir, al resumir todo el PD de cada componente en cada dosis). La tendencia general es que a medida que la dosificación de proteína portadora aumenta, existe una reducción en la respuesta de IgG a todos los polisacáridos, y a PD por sí mismo. Esta tendencia total es de fuerte evidencia de supresión epitópica inducida por vehículo. Sin embargo, al hecho de que la curva no es monótona es una indicación de que existe otro factor incluido que parece depender de Serotipo 6B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una formulación óptima de vacunas de conjugado de polisacárido de Streptococcus pneumoniae de serotipo múltiple, mediante selección juiciosa de varios polisacáridos conjugados para proteínas portadoras alternas o diferentes. La invención se basa en el hecho de que los conjugados de polisacárido de un serotipo pueden influenciar, o modular, la respuesta inmune observada para otros conjugados de polisacárido (serotipo). De esta manera, una vacuna de conjugado de polisacárido multivalente, óptima puede prepararse al colocar diferentes polisacáridos de S. pneumonía, con diferentes propiedades reguladoras inmunes, o proteínas portadoras alternativas. La presente invención se basa en la combinación de varios factores: (i) la curva de respuesta de dosificación a polisacáridos se forma frecuentemente en campana (Gaussian), con la respuesta máxima en una dosificación distintiva para cada polisacárido (es decir, serotipo o estructura); (ii) la inmunogenicidad de ciertos polisacáridos se regula con edad en humanos y en modelos animales; (iii) la combinación de conjugados de polisacárido de S. pneumoniae en formulaciones multivalentes con frecuencia resulta en una reducción en inmunogenicidad de uno o más componentes de la vacuna; (iv) sin embargo, ciertos conjugados de polisacárido resultan en una respuesta inmune aumentada cuando se combinan; (v) polisacáridos de serotipos 6B y 23F, y a un grado menor de 19F pueden regular la respuesta inmune de otros polisacáridos (es decir, otros serotipos) cuando se conjugan con una proteína portadora común. De esta manera, la presente invención se basa en la relación compleja de todo lo anterior y, en contraste a estudios anteriores, concluye que la curva de dosificación-respuesta en forma de campana (es decir, que denota inmunogenicidad pico) de conjugados de polisacárido-proteína se influencia de manera pensada por la cantidad y naturaleza de otros polisacáridos. Este efecto inmunológico se refiere a modulación. Además, se ha descubierto que la modulación de conjugados de polisacárido ocurre a través de una proteína vehículo común. Es decir, unos pocos conjugados de polisacárido pueden modular la respuesta inmune a diferentes conjugados de polisacárido, siempre que tengan una proteína portadora común. De esta manera, como se observa arriba, la invención se basa en los polisacáridos de selección juiciosa, para determinar que los polisacáridos deben conjugarse a las mismas o diferentes proteínas vehículo. Como se muestra en más detalle abajo: (1 ) ciertos polisacáridos de S. pneumonía (PS), cuando se conjugan, se regulan fuertemente con la edad, en particular serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Serotipos 8, 12 y 1 8C se regulan semanalmente con la edad. Los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 7F y 9V no se regulan con la edad (ver figura 1 ). Además (b), polisacáridos 1 , 3, 6B, 9V y 23F, cuando se combinan en una multiformación 1 1 -multivalente, mostraron un incremento en la respuesta inmune producida, en comparación con un conjugado de polisacárido monovalente. En contraste, el serotipo 14 mostró una reducción significativa en la formulación multivalente (ver figura 2). Además (c), polisacáridos de serotipos 6B y 23F, y a un grado menor de 19F pueden regular la respuesta inmune de otros polisacáridos (es decir, otros serotipos) su se conjugan a una proteína portadora común (ver figuras 3 y 4). De esta manera, en una modalidad, la presente invención comprende polisacáridos 6B, 19F y 23F conjugados con una proteína portador (primera), y los polisacáridos restantes se conjugan con una(s) proteína(s) portadora(s) alternativa(s) (o secundaria(s)), con la provisión de que las proteínas portadoras, primaria y secundaria, son diferentes. Preferentemente, los polisacáridos 6B y 23F se conjugan con la misma proteína portadora, y los polisacáridos restantes se conjugan con una(s) proteína(s) portadora(s) secundaria(s). Más preferentemente, solamente el polisacárido 6B se conjuga con una (primer) proteína portadora y los polisacáridos restantes se conjugan con unas proteína(s) portadora(s) secundaria(s). La proteína portadora primaria no necesita limitarse a una modalidad específica, pero puede incluir proteínas o fragmentos de los mismos de DT (toxoide de Difteria), TT (toxoide de Tétanos), DT crm197 (un mutante DT), otros mutantes de punto DT (por ejemplo, en posición Glu-148, ver, por ejemplo, U.S. 4,709,017, WO93/25210, W095/33481 ), FragC (fragmento de TT), Ply (pneumolisirra y mutantes de la misma), PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, (Pht A-E se describen en más detalle abajo) OmpC (de N. meningitidis), PorB (de N. meningitidis), etc. Preferentemente es DT, TT o crm1 97. Más preferentemente es DT. La(s) proteína(s) portadora(s) secundaria(s) también se seleccionarán del grupo que consiste de PD (proteína D de Haemophilus influenzae, ver, por ejemplo, EP 0 594 610 B), DT, TT, DT crm197, FragC, Ply, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, OmpC, PorB, etc. Se contempla que 2 diferentes proteínas portadoras secundarias pueden utilizarse, pero preferentemente, solamente una proteína portadora secundaria está por utilizarse en la presente invención. El número de polisacáridos de S. pneumoniae puede variar de 1 1 diferentes serotipos (o "V", valencias) a 23 diferentes serotipos (23V). preferentemente es 1 1 , 13 o 16 diferentes serotipos. En otra modalidad de la invención, la vacuna puede comprender polisacáridos de S. pneumoniae conjugados y polisacáridos de S. pneumoniae sin conjugar. Preferentemente, el número total de serotipos de polisacárido es menor o igual a 23. Por ejemplo, la invención puede comprender 1 1 serotipos conjugados y 12 polisacáridos sin conjugar. En una manera similar, la vacuna puede comprender 13 o 16 polisacáridos conjugados y 10 o 7 respectivamente, polisacáridos sin conjugar. Preferentemente, la vacuna pneumococal multivalente de la invención se seleccionará de los siguientes serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 1A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 53F, aunque se aprecia que uno o dos serotipos podrían substituirse dependiendo de la edad del recipiente que recibe la vacuna y la ubicación geográfica donde la vacuna se administrará. Por ejemplo, una vacuna 1 1 -valente puede comprender polisacáridos de serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Una vacuna pediátrica 13-valente (infante) también puede incluir los serotipos 6A y 19A, mientras que una vacuna 13-valente para individuos de edad mayor puede incluir serotipos 8 y 12F. Preferentemente, los Streptococcus polysaccharides de la invención se depolimerizan (dimensionan) a un rango final de 100-500 kD. De esta manera, otra característica de la presente invención es la proporción de proteína portadora a polisacárido. Para los polisacáridos conjugados, la proporción de proteína portadora a polisacárido (P/PS) será mayor que 0.5 (es decir, >0.05, y hasta 1 .7) (p/p) para al menos siete serotipos. Preferentemente la proporción es 0.70 a 1.5 (por ejemplo, por al menos serotipos 6B, 19F, 23F). Más preferentemente el rango será 0.8 a 1 .5 (por ejemplo, por al menos serotipos 6B, 19F, 23F). Más preferentemente aún, la proporción de P/PS será al menos un planteamiento 1 (por ejemplo, 0.9-1.1 ) para uno o más serotipos de la invención (por ejemplo, 4). Una característica relacionada de la presente invención es que el nivel de proteína portadora sin conjugar (libre) es menor a 10% de la cantidad total de proteína portadora, y que el nivel de polisacárido sin conjugar es menor a 10% de la cantidad total de polisacárido, para cada serotipo. Los polisacáridos pueden enlazarse a la(s) proteína(s) portadora(s) por cualquier método conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de E.U. 4,372,945 por Armor et al., Patente de E.U. 4,474,757 y Jennings et al., Patente de E. U. 4,356, 170). Preferentemente, la química de conjugación CDAP se lleva a cabo (ver WO 95/08348). En CDAP, el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1 -ciano-dimetilaminopiridino (CDAP) se utiliza preferentemente para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse bajo condiciones relativamente medias, que evita la hidrólisis de los polisacáridos sensibles alcalinos. Esta síntesis permite el acoplamiento directo a una proteína portadora. El polisacárido se solubiliza en agua o una solución salina. CDAP se disuelve en acetonitrilo y se agrega inmediatamente a la solución de polisacárido. CDAP reacciona con los grupos hidróxilo del polisacárido para formar un éster de cianato. Después del paso de activación, la proteína portadora se agrega. Los grupos amino de lisina reacciona con el polisacárido activado para formar un enlace covalente isourea. Después de la reacción de acoplamiento, un gran exceso de glicina se agrega entonces para enfriar los grupos los grupos funcionales activados residuales. El producto se pasa entonces a través de una columna de permeación de gel para remover la proteína portadora sin reaccionar y reactivos residuales. En otra modalidad, los conjugados de S. pneumonía pueden combinarse con otros polisacáridos, por ejemplo, N. meningitidis tipos A, C, W, Y, H. influenzae tipo B, S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus Grupo B, Streptococcus Grupo A, etc. Preferentemente es N. meningitidis (tipos A y/o C son más preferidos) y/o H. influenzae tipo B. Alternativamente, los conjugados de S. pneumonía de la invención pueden combinarse con antígenos virales, por ejemplo, virus polio inactivado (IPV), influenza (inactivado, dividido, subunidad (por ejemplo, antígenos F, G)), etc. En otra alternativa, los conjugados de S. pneumonía pueden administrarse concomitantemente con vacunas DTPa (difteria, tétanos, pertusis acelular) y vacunas de combinación DTPa (DTPa+/-Hepatitis B+/-IPV+/-H. influenzae tipo B). Las vacunas DTPa preferidas tienen 25Lf o menos de toxoide de Difteria. Estos antígenos adicionales pueden encontrarse en forma líquida o forma liofilizada. En todavía otra modalidad, la presente invención es un método mejorado para producir una respuesta "inmune (protectora) en infantes (0-2 años de edad) al administrar una cantidad segura y efectiva de la vacuna de la invención. Modalidades adicionales de la presente invención incluyen la provisión de las composiciones de conjugado de S. pneumoniae antigénicas de la invención para utilizarse en medicina y el uso de los conjugados de S. pneumoniae de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención (o tratamiento) de enfermedad pneumococal. La presente invención proporciona además una vacuna mejorada para la prevención o mejora de infección pneumococal en infantes (por ejemplo, Otitis media) al yacer en la adición de proteínas pneumococales a las composiciones de conjugado de S. pneumoniae de la invención. Preferentemente, la proteína pneumococal es de la familia PhtX (ver abajo) a la cual pueden agregarse proteínas adicionales. Tales proteínas pneumococales adicionales pueden comprender CbpX, truncados de CbpX y Ply (ver abajo), con la provisión de que las proteínas de superficie de S. pneumoniae seleccionadas son diferentes de las proteínas portadoras, primaria y secundaria. Uno o más antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis también pueden incluirse en la vacuna de combinación. De esta manera, la presente invención es un método mejorado para producir una respuesta inmune (protectora) contra Otitis media en infantes. En todavía otra modalidad, la presente invención es un método mejorado para producir una respuesta inmune (protectora) en la población de mayor edad (en el contexto de la presente invención un paciente se considera de mayor edad si son de 50 años o más en edad, típicamente más de 55 años y más generalmente más de 60 años), al administrar una cantidad efectiva y segura de la vacuna de la invención, preferentemente junto con uno, dos o posiblemente tres proteínas de superficie S. pneumoniae, con ia provisión de que las proteínas de superficie de S. pneumoniae seleccionadas son diferentes de las proteínas portadoras, primaria y secundaria. Preferentemente, la proteína pneumococal es de la familia PhtX (ver abajo) a la cual puede agregarse PIy y opcionalmente CbpX o truncados de CbpX (ver abajo). Las proteínas de Streptococcus pneumoniae de ia invención son ya sea superficie expuesta, al menos durante parte del ciclo de vida del pneumococo, o son proteínas que se secretan o liberan por pneumococo. Preferentemente, las proteínas de la invención se selecciona de las siguientes categorías, tales como proteínas teniendo un motivo de secuencia de señal Tipo II de LXXC (donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, la familia trivalente de polihistidina (PhtX)), proteínas de unión de colina (CbpX), proteínas que tienen un motivo de secuencia de señal Tipo I (por ejemplo, Sp101 ), proteínas que tienen un motivo LPXTG (donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, Sp128, Sp130), y toxinas (por ejemplo, Ply). Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las siguientes proteínas, o equivalentes inmunológicamente funcionales de los mismos. Preferentemente, la composición inmunogénica de la invención comprende una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia trivalente poli histidina (PhtX), familia de proteína de unión de colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado LytX-truncado CbpX (o fusiones), pneumolysina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101 , Sp1 30, Sp125 y Sp133. Sin embargo, si CbpX es PspC, entonces la segunda proteína no es PspA o PsaA. Más preferentemente, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia trivalente de poli histidina (PhtX), familia de proteína de unión de colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado LytX-truncado CbpX (o fusiones), pneumolysina (Ply), PspA, PsaA y Sp128. Más preferentemente, aún, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia trivalente poli histidina (PhtX), familia de proteína de unión de colina (CbpX), truncados de CbpX, y pneumolisina (Ply). La familia Pht (trivalente poli histidina) comprende proteínas PhtA, PhtB, PhtD y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varios trivalentes de histidina, posiblemente incluidos en unión de nucleósido o metal o actividad enzimática, regiones de bobina (3-5), un término N conservado y un término heterogéneo C. Esta presente en todas las cepas de pneumococo probado. Las proteínas homologas también se han encontrado en otros Streptococci y Neisseria. Los miembros preferidos de la familia comprende PhtA, PhtB y PhtD. Más preferentemente, comprende PhtA o PhtD. Más preferentemente comprende PhtD. Sin embargo, se entiende, que los términos PhtA, B, D y E se refieren a proteínas que tienen secuencias descritas en las citaciones de abajo así como también variantes de las mismas que ocurren de manera natural (y hechas por el hombre) que tienen una homología de secuencia que es al menos 90% idéntica a las proteínas referenciadas. Preferentemente es al menos 95% idéntica y más preferentemente es 97% idéntica. Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp36. Como se observa arriba, es una proteína de la familia trivalente polihistidina y tiene el motivo de señal tipo II de LXXC. PhtD se describe en WO 00/37105, y también se refiere como Sp036D. Como se observa arriba, también es una proteína de la familia trivalente polihistidina y tiene el motivo de señal LXXC tipo II. PhtB se describe en WO 00/37105, y también se refiere como Sp036B. otro miembro de la familia PhtB es el Polipéptido que degrada C3, como se describe en WO 00/17370. Esta proteína también es de la familia trivalente polihistidina y tiene el motivo de señal LXXC tipo II. Un equivalente inmunológicamente funcional preferida es la proteína Sp42 descrita en WO 98/ 8930. Un truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) se describe en WO 99/15675 que también se considera un miembro de la familia PhtX. PhtE se describe en WO 00/30299 y se refiere como BVH-3. Con respecto a la familia de proteína de unión colina (CbpX), los miembros de esa familia se identifican de manera originaria como proteínas pneumococaies que podrían purificarse por cromatografía por afinidad de colina. Todas las proteínas de unión de colina se enlazan covalentemente a porciones de fosforilcolina de ácido teicóico de pared celular y ácido lipoteicóico asociado a membrana. De manera estructura, tienen varias regiones en común sobre la familia completa, aunque la naturaleza exacta de las proteínas (secuencia de aminoácido, longitud, etc) puede variar. En general las proteínas de unión de colina comprenden una región de terminal N (N), regiones repetición conservadas (R1 y/o R2) una región rica en prolina (P) y una región de unión de colina conservada (C), hecha de múltiples repeticiones que comprende aproximadamente una mitad de la proteína. Como se utiliza en esta solicitud, el término "familia de proteína de unión de colina (CbpX)", se selecciona del grupo que consiste de proteínas de unión de colina como se identifica en WO 97/41 151 , PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD y CbpG. CbpA se describe en WO 97/41 151 . CbpD y CbpG se describen en WO 00/29434. PspC se describe en WO 97/09994. PbcA se describe en WO 98/21337. SpsA es una proteína de unión de colina descrita en WO 98/34950. Preferentemente, las proteínas de unión de colina se seleccionan del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Otra modalidad preferida es truncados de CbpX en donde "CbpX" se define arriba y "truncados" se refiere a proteínas de CbpX que carecen del 50% o más de la región de unión de colina (C). preferentemente, tales proteínas carecen de la región de unión de colina completa. Más preferentemente, tales truncados de proteína carecen (i) de región de unión de colina y (ii) retienen la región rica en prolina y al menos una región de repetición (R1 o R2). Más preferentemente todavía, el truncado tiene 2 regiones de repetición (R1 y R2). Ejemplos de tales modalidades preferidas son NR1 xR2, NR1 xR2P, R1 xR2P y R1 xR2 como se ilustra en WO 99/51266 o WO 95/51 188, sin embargo, otras proteínas de unión de colina que carecen de una región de unión de colina similar también se contemplan dentro del alcance de esta invención. La familia LytX son de proteínas asociadas de membrana asociadas con lisis celular. El dominio de terminal N comprende dominio(s) de unión de colina, sin embargo, la familia LytX no tiene todas las características encontradas en la familia CbpA observadas arriba y de esta manera para la presente invención, la familia LytX se considera distinta de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio de terminal C contiene el dominio catalítico de la familia de proteína LytX. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto a la familia LytX, LytA se describe en Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621 -624 (1 987). LytB se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp46. LytC también se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp91 . Un miembro preferido de esa familia es LytC. Otra modalidad preferida son los truncados de LytX en donde "LytX" se define arriba y los "truncados" se refieren a proteínas LytX que carecen de 50% o más de la región de unión de colina. Preferentemente tales proteínas carecen de la región de unión de colina entera. Todavía otra modalidad preferida de esta invención son proteínas quiméricas de truncado LytX-truncado CbpX (o fusiones). Preferentemente esto comprende NR1 xR2 (o R1 xR2) o CbpX y la porción de terminal C (Cterm, es decir, que carece de los dominios de unión de colina) de LytX (por ejemplo, LytCterm o Sp91 Cterm). Más preferentemente, CbpX se selecciona del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Más preferentemente aún, es CbpA. Preferentemente, LytX es LytC (también referida como Sp91 ). Otra modalidad de la presente invención es PspA o truncados de PsaA que carecen del dominio de unión de colina (C) y expresados como una proteína de fusión con LytX. Preferentemente, LytX es LytC. Pneumolisina es una toxina multifuncional con un citolítico distinto (hemolítico) y actividades de activación complemento (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 1 53: 1339-1346 (1996)). La toxina no se secreta por pneumococo, pero se libera en lisis de pneumococo bajo la influencia de autolisina. Los efectos incluyen, por ejemplo, la estimulación de la producción de citoquinas inflamatorias por monocitos humanos, la inhibición del latido de cilios en epitelio respiratorio humano, y la reducción de actividad bactericida y migración de neutrófilos. El efecto más obvio de pneumolisina se encuentra en la lisis de glóbulos rojos, que incluye la unión a colesterol. Debido a que es una toxina, necesita detoxicarse (es decir, no tóxica a un humano cuando se proporciona en una dosificación adecuada para protección) antes de que pueda administrarse in vivo. La expresión y clonación de pneumolisina nativa o tipo silvestre se conoce en la materia. Ver, por ejemplo, Walker et al., (Infecí Immun, 55: 1 1 84-1 1 89 (1 987)); Mitchell et al., (Biochim Biophys Acta, 1 007:67-72 (1 989) y Mitchell ef al., (NAR, 1 8:401 0 (1990)). Detoxificación de ply puede conducirse por medios químicos, por ejemplo, sujeto a GMBS, o tratamiento de glutaraldehído o formalina o una combinación de ambos. Tales métodos se conocen bien en la materia para varias toxinas. Alternativamente, ply puede detoxificarse genéticamente. De esta manera, la invención comprende derivados de proteínas pneumococales que pueden ser, por ejemplo, proteínas mutadas. El término "mutado" se utiliza en la presente para significar una molécula que ha experimentado eliminación , adición o substitución de uno o más aminoácidos utilizando técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida de sitio o cualquier otro método convencional, por ejemplo, como se describe arriba, una proteína ply mutante puede alterarse de manera que es biológicamente inactiva mientras mantiene aún sus epítopos ¡nmunogénicos, ver, por ejemplo, WO 90/06951 , Berry et al., (Infecí Immun, 67:981 -985 (1 999)) y WO 99/03884. Como se utiliza en la presenfe, se eníiende que el término "Ply" se refiere a pneumolisina deíoxificada o mutada adecuada para uso médico (es decir, no tóxica). Con respectos a PsaA y PspA, ambos son conocidos en la materia. Por ejemplo, PsaA y variantes de eliminación de transmembrana del mismo se han descrilo por Berry & Paíon, Infecí Immun 1996 Dic; 64(12):5255-62. PspA y variantes de eliminación de transmembrana de la misma se han descrito en , por ejemplo, US 58041 93, WO 92/14488, y WO 99/53940.

Sp128 y Sp130 se describen en WO 00/76540. Sp125 es un ejemplo de una proteína de superficie pneumococal con el motivo sujetado de pared celular de LPXTG (en donde X es cualquier aminoácido). Cualquier proteína dentro de esta clase de proteína de superficie pneumococal con este motivo se encuentra útil dentro del contexto de esta invención, y por lo tanto, se considera una proteína adicional de la invención. Sp125 por sí mismo se describe en WO 98/18930, y también se conoce como ZmpB-una metaloproteinasa de zinc. Sp101 se describe en WO 98/06734 (donde tiene la referencia # y85993). Se caracteriza por una secuencia de señal Tipo 1 . Sp 33 se describe en WO 98/06734 (donde tiene la referencia # y85992). También se caracteriza por una secuencia de señal Tipo I. Ejemplos de antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: O P106 [WO 97/41731 (Antes) & WO 96/34960 (PMC)]; O P21 ; LbpA %/o LbpB [WO 98/55605 (PMC)]; TbpA &/o Tbp [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, eí al., (1993) Infecto. Immun. 61 :2003-2010]; UspA1 y/o UspA2 [WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Iipo06 (GB 991977.2); Iipo10 (GB 9918202.1 ); lipo1 1 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); Omp1A1 (PCT/EP99/06781 ); Hly (PCT/EP99/03257); y OmpE. Ejemplos de antígenos de Hemophilus influenza que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: proteína de fibrina [(US 5766608 - Estado de Ohio, Fundación de Investigación)] y fusiones que comprenden péptidos de los mismos [por ejemplo, LB1 (f) fusiones de péptido; US 5843464 (OSU) o WO 99/64067]; O P26 [WO 97/01638 (Cortees)]; P6 [EP 281673 (Universidad Estatal de Nueva York)]; TbpA y/o TbpB, Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1 ; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641 ); P2; y P5 (WO 94/26304). Como se observa arriba, las proteínas de la invención también pueden combinarse benéficamente. Las combinaciones preferidas incluyen pero no se limitan a, PhtD+NR1 xR2, PhtD+NR1 xR2P, PhtD+NR1 xR2-Sp91 Cterm de proteínas de fusión o quiméricas, PhtD+Ply, PhtD+Sp128, PhtD+PsaA, PhtD+PspA, PhtA+NR1 xR2, PhtA+NR1 xR2P, PhtA+NR1 xR2-Sp91 Cterm de proteínas de fusión o quiméricas, PhtA+Piy, PhtA+Sp128, PhtA+PsaA, PhtA+PspA, NR1 xR2+LytC, NR1 xR2P+PspA, NR1 xR2+PspA, NR1 xR2P+PsaA, NR1 xR2+PsaA, NR1 xR2+Sp128, R1 xR2+LytC, R1 xR2+PspA, R1 xR2+PsaA, R1 xR2+Sp128, R1 xR2+PDT, R1 xR2 + PhtA. Preferentemente, NR1xR2+/-P (o R1xR2+/-P) es de CbpA o PspC. Más preferentemente es de CbpA. Otras combinaciones incluyen 3 combinaciones de proteína tales como PhtD+NR1 xR2P+Ply, PhtD+NR1xR2+Ply, PhtA+NR1 xR2+Ply y PhtA y PhtA+NR1xR2+Ply. Las vacunas de la presente invención son preferentemente adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares aciladas, polisacáridos catiónica o aniónicamente derivados o polifosfazenos.

Cuando se adyuvatan con sales de aluminio, la proporción de sal de aluminio a polisacárido es menor a 10: 1 (p/p). Preferentemente, es menor a 8: 1 y más de 2: 1 . Se prefiere que el adyuvante se seleccione para ser un inductor preferencial de un tipo TH 1 de respuesta. Tales niveles elevados de citoquinas tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula a un antígeno dado, mientras que niveles elevados de las citoquinas tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno. Es importante recordar que la distinción de respuesta inmune tipo Th2 y Th1 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como siendo predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de aquella descrita en clones de célula T CD4+ve de murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) células TH1 y TH2; diferentes patrones de secreción de linfoquina conducen a diferentes propiedades funcionales. Annual Review of Immunology, 7, p.145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th 1 se asocian con la producción de las citoquinas IFN-? e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas con frecuencia se asocian directamente con la inducción de respuestas inmune tipo Th 1 no se producen por células T, tal como IL-12. En contraste, respuestas tipo Th2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: lípido de monofosforilo A o un derivado de los mismos, particularmente lípido de monofosforilo 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación ver GB 222021 1 A); y una combinación de lípido de monofosforilo A, preferentemente lípido de monofosforilo A de 3-de-O-acilado, junto con ya sea una sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En tales combinaciones, el antígeno y 3D- PL se contienen en las mismas estructuras particuladas, permitiendo suministro más eficiente de señales inmunoestimuladoras y antigénicas. Los estudios han mostrado que SD-MPL es capaz de aumentar además la inmunogenicidad de un antígeno alum-absorbido [Thoelen et al., Vaccine (1998) 16:708-14; EP 68954-B1]. Un sistema aumentado incluye la combinación de un lípido de monofosforilo A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde QS21 se enfría con colesterol como se describe en WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que incluye QS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210, y es una formulación preferida. Preferentemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferentemente QS21 . La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (WO 95/1721 0). La presente invención también proporciona un método para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL. Oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar (WO 96/02555) son también inductores preferenciales de una respuesta de TH1 y son adecuados para utilizarse en la presente invención. Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden utilizarse para proteger o tratar un mamífero susceptible a infección, por medio de administrar dicha vacuna a través de vía mucosal o sistémica. Estas administraciones pueden incluir inyección a través de vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o a través de administración mucosal a los tractos oral/alimenticio, respiratorio, genitourinaria. La administración intranasal de vacunas para el tratamiento de pneumonía u otitis media se prefiere (como portador nasofaringeal de pneumoco puede prevenirse de manera más efectiva, atenuando así la infección en su etapa más temprana). Aunque la vacuna de j ^vención puede administrarse como una dosis única, componentes de los mismos también pueden co-administrarse juntos al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, polisacáridos pneumococales podrían administrarse por separado al mismo tiempo o 1 -2 semanas después de la administración del componente de proteína bacteriana de la vacuna para coordinación óptima de las respuestas inmunes con respecto entre sí). Para co-administración, el adyuvante Th1 opcional puede estar presente en cualquiera o todas las diferentes administraciones, sin embargo se prefiere si está presente en combinación con el componente de proteína bacteriano de la vacuna. Además a una vía de administración única, 2 diferentes vías de administración , pueden utilizarse. Por ejemplo, polisacáridos pueden administrarse IM (o ID) y proteínas bacterianas pueden administrarse IN (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden administrarse IM para cargas de dosis e IM o IN (sin aluminio) para dosis intesificadoras. La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de cual inmunógeno específico se emplea y como se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 0.1 -100 µ9 de polisacárido, para conjugados de polisacárido 0.1 -50 iig de polisacárido, preferentemente 1 -10 µg, del cual 1 a 5 es un rango preferido y 2-5 µg es un rango más preferido. Sin embargo, para el serotipo 6B, la dosificación preferida comprenderá 3-10 µg de polisacárido, más preferentemente 5-10 µg de conjugado de polisacárido. El contenido de antígenos proteínicos en la vacuna típicamente estará en el rango de 1 -100 µg, preferentemente 5-50 µg, más típicamente en el rango de 5-25 µg. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones impulsoras adecuadamente separadas. La preparación de vacuna se describe generalmente en Vaccine Design ("The subunit and adyuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulación con liposomas se describe por Fullerton, Patente de E.U. 4,235,877. Las vacunas de la presente invención pueden almacenarse en solución o liofilizarse. Como un líquido, la vacuna de la invención se almacena típicamente en 0.5 mi solución/dosis. Preferentemente la vacuna se absorbe en una sal de aluminio. Si la solución se liofiliza, es preferentemente en la presencia de una azúcar tal como sucrosa o lactosa o trehalosa. Aún es preferible que se liofilicen y reconstituyan extemporáneamente antes de utilizarse. La üofilización de polisacáridos de Streptococcus puede resultar en una composición más estable (vacuna) y puede conducir posiblemente a concentraciones más altas de anticuerpo en la presencia de 3D-MPL y en la ausencia de un adyuvante a base de aluminio. Aunque las vacunas de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "callosa" exterior, llamada estrato corneo, que cubre la epidermis. Por debajo de esta epidermis se encuentra una capa llamada la dermis, que a su vez cubre el tejido subcutáneo. Los investigadores han mostrado que la inyección de una vacuna en la piel, y en particular la dermis, estimula una respuesta inmune, que puede también asociarse con un número de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente forma una característica preferida de la presente invención. La técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento mantoso", comprende pasos para limpiar la piel, y después estirarla con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31 ) que da hacia arriba, la aguja se inserta a un ángulo de entre 10-1 5°. Una vez que el bisel de la aguja se inserta, el barril de la aguja se baja y avanza además mientras proporciona una presión ligera para elevarla bajo la piel. El líquido se inyecta entonces muy lentamente formando una bomba o burbuja en la superficie de la piel, seguido por extracción lenta de la aguja. Más recientemente, los dispositivos que se diseñan específicamente para administrar agentes líquidos en o a través de la piel se han descrito, por ejemplo, los dispositivos descritos en WO 99/34850 y EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos por ejemplo en WO 01 /13977; US 5,480,381 US 5,599,302, US 5,334, 144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569, 189, US 5,704,91 1 , US 5,383,851 , US 5,893,397. US 5,466,220, US 5,339, 163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941 ,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Métodos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de vacuna pueden incluir agujas y jeringas convencionales, o dispositivos diseñados para suministro balístico de vacunas sólidas (WO 99/27961 ) o parches transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicarse a la superficie de la piel (suministro transcutáneo o transdérmico WO 98/20734; WO 98/28037). Cuando las vacunas de la presente invención están por administrarse a la piel, o más específicamente en la dermis, la vacuna se encuentra en un bajo volumen líquido, particularmente un volumen de entre aproximadamente 0.05 mi y 0.2 mi. El contenido de antígenos en la piel o vacunas transdérmicas de la presente invención puede ser similar a dosis convencionales como se encuentra en vacunas intramusculares (ver arriba). Sin embargo, es una característica de la piel o vacunas transdérmicas que las formulaciones puedan ser "baja dosis". De acuerdo con lo anterior los antígenos en vacunas de "baja dosis" están preferentemente presentes en tan poco como 0.1 a 10 preferentemente 0.1 a 5 µ? por dosis; y los antígenos de polisacárido (preferentemente conjugado) pueden estar presentes en el rango de 0.01 -1 µg, y preferentemente entre 0.01 a 0.5 µ9 de polisacárido por dosis. Como se utiliza en la presente, el término "suministro intradérmico" significa suministro de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente se ubicará exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel ubicada entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 mm desde la superficie en la piel humana, pero existe una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, puede esperarse alcanzar la dermis al ir 1 .5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se ubica entre el estrato corneo y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea por debajo. Dependiendo del modo de suministro, la vacuna puede ubicarse por último solo o principalmente dentro de la dermis, o puede por último distribuirse dentro de la epidermis y la dermis. Con objeto de que esta invención pueda entenderse mejor, los siguientes ejemplos se establecen. Estos ejemplos son para propósitos de ilustración solamente, y no se construyen como limitantes del alcance de la invención en ninguna manera. Ejemplos: Ejemplo 1 Determinación de los polisacáridos para los cuales la respuesta inmune se regula con la edad Las concentraciones de anticuerpo humano para tanto polisacáridos post-inmunización (2 semanas a 3 meses) (sin conjugar) y pre-inmunes se recolectan ya sea internamente o a través de fuentes externas. Figura 1 muestra la relación entre la inmunogenicidad de cada polisacárido de serotipo, según se mide por el incremento de vez promedio geométrico en concentración de anticuerpo (GFl) después de inmunización de polisacárido, y la edad promedio de los sujetos en el estudio. Las correlaciones lineales del incremento de vez promedio geométrico log y edad dan una indicación de si la respuesta inmune se regula con la edad. Como se muestra en la figura 1 , los serotipos 6, 14, 19 y 23 se correlacionan significativamente con la edad (p<0.001 ), mientras que los serotipos 8, 12 y 18 se correlacionan menos con la edad (0.05 < p < 0.2). Finalmente, los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 7 y 9 no se correlacionan significativamente con la edad (p>o=0.20). Ejemplo 2 Metodología general para determinar respuestas de anticuerpo en varios mamíferos Los sueros se prueban para anticuerpos de IgG a los polisacáridos pneumococales por un ELISA en base a un análisis consenso para sueros humanos propuestos por los trabajos conjuntos de CDC/SHO mantenidos entre 1994 y 1996 (WHO 1996, Plikatis et al., J Clin. Microbiol. 38:2043 (2000)). Brevemente, los polisacáridos capsules purificados de ATCC (Rockville, Md, 20852) se revisten en 25 µg/ml en salina regulada de fosfato (PBS) en placas de microconcentración de alta unión (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 C. Las placas se bloquean con 1 0% de suero de bovino fetal (FCS), 1 hora a 37 C. Las muestras de suero se pre-incuban con el polisacárido de pared celular de 20 µ9/??? (Statens Serum Institute, Copenhagen) y 10% FCS a temperatura ambiente por 30 minutos para neutralizar los anticuerpos en este antígeno. Un suero de referencia 89SF (cortesía del DR. C Frasch, USFDA) se trata en la misma manera, y se incluye en cada placa. Las muestras se diluyen dos veces en la microplaca e 10% FCS en PBS, y equilibran a temperatura ambiente por 1 hora con agitación. Después de enjuagar, las microplacas se equilibran con anticuerpo monoclonal IgG Fe anti-humano marcado con peroxidasa (HP6043-HRP, Stratech Scientific Ltd) diluido 1 :4000 en 10% FCS en PBS por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. ELISA se realiza para medir IgG de rata utilizando IgG anti-rata de cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H+L) (código 1 12-035-003) a 1 :5000. Las curvas de concentración se referencian a suero estándar para cada serotipo utilizando comparación log logística por SoftMax Pro. Las concentraciones de polisacárido utilizadas para revestir la placa ELISA se han fijado a 10 µg/ml para todos los serotipos excepto 6B y 23F, en donde 20µg/ml se han utilizado. Además, 100% de suero de bovino fetal se utiliza como el diluyente cuando se prueba antisuero para serotipo 6B, ya que este serotipo fue propenso a respuestas ELISA no específicas. La serología de serotipo 3 en suero Rhesus utilizó comezcla mHSA para el antígeno de revestimiento. El color se desarrolló utilizando 4 mg OPD (Sigma) por 10 mi pH 4.5 regulador de citrato 0.1 M con 14 µ? H202 por 15 minutos en la obscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 50 µ? HCI, y la densidad óptica se lee en 490 nm relativo a 650 nm. Las concentraciones de IgG se determinan para referencia de los puntos de concentración a la curva de concentración modelada utilizando una ecuación log logística de 4 parámetros calculada por SoftMax Pro. Para obtener las concentraciones absolutas de anticuerpo en µg/ml, los antisueros de referencia agrupados se calibran por dos métodos independientes. Para antisueros de rata, el método de Zollinger y Boslego (1981 ) se utilizó para 1 1 serotipos, y para 4 serotipos esto se comparó con valores obtenidos por inmunoprecipitación. Excelente correspondencia se encontró entre los dos métodos. Para suero de murino, los anticuerpos lgG1 monoclonales preferidos se utilizaron, y sus concentraciones activas se confirmaron por respuesta corolaria (PVW 1999). En este caso, la correspondencia razonable se encontró. Para suero de mono Rhesus, se demostró que los reactivos anti-lgG utilizados reaccionan igualmente con IgG de Rhesus y humano; de esta manera el suero de referencia humano calibrado 89SF (disponible de US FDA) se emplea para referencia de ELISA. ELISA para medir IgG de rata y murino para los polisacáridos pneumococales fue similar con las siguientes excepciones. Los polisacáridos localmente fabricados se utilizan para revestir las placas ELISA en 20 µg/ml en PBS para serotipos 6B y 23F, y 10 µg/ml en PBS para serotipos 14 y 19F, IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugado con perox/dasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H+L) se emplea para detectar IgG unido. HP6043-HRP se reacciona igualmente con IgG purificado de Rhesus y humano, y así este reactivo se utiliza para antisuero de Rhesus, y el suero de referencia que se utilizó fue 89SF. El suero de referencia para serología de Rhesus y humano fue 89SF, amablemente proporcionado por Dr. Cari Frasch. Los valores de calibración de concentra a base de peso umversalmente aceptados para el suero de referencia humano 89SF para IgG, IgA e IgM contra 10 serotipos pneumococales utilizando 2 diferentes métodos, se publicaron (Salazar et al.,). ELISA de proteína se realiza de manera similar que ELISA de polisacárido con las siguientes modificaciones. La proteína se revista durante la noche a 2.0 µg/ml en PBS. Las muestras de suero se diluyen en PBS conteniendo 1 0% de suero de bovino fetal 0.1 % de alcohol de poiiviniio. Anticuerpo humano unido se detecta utilizando anticuerpo purificado de cabra conjugado con Peroxidasa Sigma para Fe IgG humano (referencia A-2290). Para calibrar la respuesta de proteína en la serología de mono de Rhesus y humano, lote de Sandoglobuiina 069, encontrado por contener anticuerpo anti-proteína D significativo, se utilizó como la referencia y se le da un valor arbitrario de 100 unidades ELISA. Para serología de rata y murino, las concentraciones de anticuerpo se cuantifican para realizar la respuesta corolaria ya sea por revestimiento de antígeno directo, o por captura de anticuerpo. Los sueros se prueban también por su habilidad para matar pneumocoecus vivo en un análisis opsonofagocítico in vitro. El análisis de opsonofagocitosis se adapta del procedimiento publicado (Romero-Steiner et al., 1997), así como también un procedimiento detallado proporcionado por Sandy Steiner de CDC como parte de un estudio de multi-laboratorio.

Se utilizan dos métodos. En el método A, las cepas pneumococales proporcionadas por CDC se reemplazan por cepas de producción SB. Segundo, las células HL-60 se reemplazan por neutrófilos humanos recientemente purificados (PMN). Los resultados se expresan como la dilución de suero requerida para 50% de muerte bacteriana. En el método B, el procedimiento CDC se sigue más cercanamente de un procedimiento estandarizado detallado y publicado proporcionado por CDC como parte de un estudio de multi-laboratorio (Romero-Steiner 1997, Romero-Steiner 2000). Brevemente, las células HL60 diferenciadas se centrifugan a 1000 rpm (300 xg) y el sobrenadante de cultivo se extrae. Las células se resuspenden en el regulador de análisis consistiendo de HBSSA-BSA. Si los anticuerpos están presentes en el medio de cultivo, este procedimiento se repite para asegurar retiro completo de antibióticos. Las muestras de suero se pre-diluyen por avanzado para 4 análisis para optimizar las mediciones de volumen. Se demostró que las muestras diluidas 1 :2 en regulador de análisis produjeron concentraciones opsónicas estables por al menos 5 días si se mantienen a 4°C. Veinticinco µ? de suero diluido se agrega a 25 µ? de regulador de análisis en una cavidad de fondo redondo de microplaca. La dilución serial doble se realiza con 25 µ? de volumen, de nuevo para optimizar las mediciones de volumen. Los cultivos pneumococales y complementarios de conejo bebe se mantienen a -70°C hasta su uso. Una combinación de volumen 4:2:1 de células HL60 activadas, cultivo pneumococal recientemente descongelado y complemento de conejo bebe recientemente descongelado se mezcla con vórtice. Veinticinco µ? de esta mezcla se distribuyen rápidamente a las cavidades de microplaca que contienen suero diluido, produciendo un volumen final de 50 µ?. Esto dio 1 E 5 HL60, 150 CFU pneumococal y 7.1 % concentración complemento por cavidad en la mezcla final, excepto para serotipo 6B en el cual dos modificaciones se hacen; la concentración complemento final fue 12.5% y 5% FCS se incluyen en el regulador de análisis para ecualizar el crecimiento de pneumococus durante incubación. Las microplacas se incuban por 2 horas a 37°C con 5% C02 con agitación a 210 rpm. Después de la incubación, un conteo viable se hace de pneumococus de una alícuota de 20 µ? de las cavidades. Las cavidades que contienen solamente regulador de análisis sin suero se utilizan como las cavidades vacías para determinar el número exacto de pneumococus agregados por cavidad. El número promedio de CFU en 8 cavidades vacías en cada placa se utilizó para cálculos subsecuentes. El por ciento de muerte se calcula relativo al promedio de las cavidades vacías. La concentración de muestra de suero se determina por la dilución recíproca máxima de suero capaz de facilitar más del 50% de muerte de pneumococus. Los valores se reportan como concentraciones discontinuas de 8, 16, 32 etc. Las muestras para las cuales se reportó menos del 50% de muerte con una concentración <8. Las muestras en las cuales un efecto de prozona se observa se repiten, y el segundo resultado se toma. Si un efecto de prozona se observa de nuevo, el resultado se considera inválido. Esto ocurre en menos del 5% de las muestras. Las muestras que tuvieron una concentración mayor a 1024 se repiten iniciando en una dilución 1 :64. Ejemplo 3 Efectos de combinación de conjugados PS-PD pneumococales en inmunogenicidad en ratas adultas Se ha observado que la combinación de vacunas en formulaciones multivalentes puede resultar en la reducción de inmunogenicidad de uno o más componentes de la vacuna. Esto se ha observado especialmente para vacunas conjugadas, y se ha llamado supresión epitópica inducida por vehículo. El mecanismo subyacente para esta supresión no se entiende bien, pero tiende a pasar en dosificaciones mas altas de proteína portadora. Una vacuna de conjugado pneumococal 1 1 -valente es un ejemplo de vacunas de combinación. Ya que la combinación de cada conjugado del serotipo se agregará a la cantidad total de proteína utilizada para inmunizar, es importante determinar si la combinación de cada vacuna de conjugado en una formulación multivalente resulta en una reducción significativa en la inmunogenicidad del conjugado. Procedimiento: Las ratas adultas se inmunizan con vacunas de conjugado de pneumococal-polisacárido de proteína D (ver, WO 00/56360) ya sea individualmente, o combinadas con una formulación multivalente. Los grupos de 10 ratas se inmunizan dos veces 28 días aparte, y los sangrados de prueba se obtienen el día 28 y día 24 (14 días después de la segunda dosis).

La concentración de anticuerpo se mide como se describe. Las concentraciones opsónicas se miden de acuerdo al método A. Resultados: Todos los conjugados indujeron anticuerpos IgG específicos como se mide por ELISA (Figura 2). La actividad opsónica (según se determina por la reciprocidad de la dilución de sueros agrupados capaz de matar 50% de los pneumococus vivos) también se detecta en todo el suero. Figura 2 también muestra el efecto de combinación de conjugados PS-PD monovalentes en su inmunogenicidad en ratas adultas, según se mide por concentración de IgG y concentración opsónica el día 14 post II. El análisis estadístico se realiza en todas las muestras para determinar si diferencias en concentración de IgG en combinación fueron significativas. Solamente el tipo 14 mostró una reducción significativa en concentraciones ELISAS en la combinación. La concentración de IgG s reduce a niveles que fueron similares a los otros serotipos. Todas las otras diferencias no fueron significativas, pero el tipo 7F planteó significado (p=0.08). Serotipos 1 , 3, 6B, 9V y 23F actualmente muestran incrementos en combinación. Ejemplo 4 Variación independiente de la dosificación de serotipos 6B y 23F La combinación de vacunas de conjugado individuales en una formulación multivalente resulta en incrementos y reducciones de la respuesta de anticuerpo. La regulación inmune de la respuesta es dependiente de serotipo. Para caracterizar la respuesta inmune a una vacuna de conjugado 1 1 -valente combinada, se toma un experimento que combina las 1 1 valencias en dos grupos, 6B y 23F, juntos contra las 9 valencias restantes. Procedimiento: Ratas adultas e infantes se inmunizan con vacuna de conjugado de PS 1 1 -valente-PD pneumococal en una dosificación de dos concentraciones, es decir, la dosificación 6B&23F varió independientemente de las otras 9 valencias, como se muestra en la Tabla 1 . Tabla 1 : Formulación de doble dosificación de PS 1 1 -valente-PD Las ratas OFA infantes se aleatorizan para diferentes madres y fueron 7 días de edad cuando se reciben para ia primer inmunización. Diez ratas por grupo recibieron 3 inmunización los días 0, 14 y 28. Los sagrados se realizan el día 42 (14 días post III) y 56 (28 días post III). Resultados: Análisis 3D de las dosificaciones de dos concentraciones indica regulación inmune en ratas infantes causada por 6B-PD y 23F-PD.

Figura 3 muestra GMC para 1 1 serotipos y PD contra la dosificación de 6B y 23F en una dimensión, y la dosificación de los otros 9 en la segunda dimensión. La tendencia es siempre la misma para todos los serotipos y PD. Incrementando la dosis de 6B y 23F tiene un efecto dramático en reducir la respuesta de anticuerpo a los conjugados restantes, aún cuando la dosificación de aquellos conjugados. Este efecto es muy fuerte en las ratas infantes, pero la dosificación de estos conjugados sin cambiar. Este efecto es muy fuerte en las ratas infante, pero solamente ligeramente observable en las ratas adultas (no mostradas). Figura 4 muestra la concentración de anticuerpo contra cada serotipo en la vacuna de conjugado como una función total del contenido de Proteína D. Si la supresión epitópica inducida por vehículo fue el principio o solamente causa de reducción en al respuesta inmune con dosificación de vacuna creciente, se espera que estas curvas se reduzcan monóticamente. Preferentemente, la función de onda indica que existen algún otro factor que influencia la respuesta del anticuerpo. Como se observa a partir de la figura 3, cuando la dosificación se divide combinando serotipos 6B y 23F, una superficie 3D lisa se obtiene, indicando que 6B y 27F regulan la respuesta inmune a los otros serotipos. Debido a que en la figura 4 el serotipo 6B mo muestra una respuesta inmune monótonamente reducida, puede emplearse la dosificación de serotipo 6B como el factor dominante, como su intersección consigo misma siempre es constante, y de esta manera solamente muestra el efecto de supresión epitópica inducida por vehículo. Conclusiones La variación independiente de la dosificación de 6B&23F y los otros 9 serotipos relevó que la dosificación de serotipos 6B&23F ejerce una influencia en la respuesta del anticuerpo a los otros serotipos. La respuesta de anticuerpo a cada serotipo se reduce con cantidad total creciente de PD inmunizado, indicando supresión epitópica inducida por vehículo, pero ya que la relación no es lisa, existe un factor adicional, además, la respuesta de IgG a PD también disminuye con la dosificación creciente, opuesto a lo que se espera de supresión epitópica inducida por vehículo. Tomados juntos, esto implica una regulación desconocida hasta ahora de la respuesta inmune para conjugar vacunas mapeadas en la dosificación de serotipos 6B y 23F. Ejemplo 5 Demostración de que la regulación inmune de serotipos 6B y 6F se transmite a través del vehículo de proteína Objetivo Es aparente que la dosificación de conjugados 6B y 23F regulan la respuesta de anticuerpo con los otros conjugados en una formulación multivalente. El siguiente experimento se realiza para determinar si la regulación inmune con 6B&23F-PD (conjugados) en ratas infantes se debe al polisacárido, o el conjugado de proteína de polisacárido. Procedimiento Los conjugados 6B&23F-PD o PS (sin conjugar) se combinan con otros serotipos en una formulación multivalente, con la dosificación de 6B&23F a 0.01 y 0.1 µg y con el polisacárido plano en 1.0 µ? (soin conjugados de 6B&23F). Los sangrados se realizan el día 42 (14 días post III). Resultados: Como se observa previamente, un incremento en la dosificación de 6B&23F-PD redujo la respuesta a 19F. Cuando PS reemplaza el conjugado, una respuesta más alta a 19F se observa. Conclusión: La presencia de una dosificación de 1 µg de vacuna de conjugado 6B y 23F es suficiente para regular la respuesta inmune a serotipo 19F en una vacuna de conjugado multivalente, sin embargo, la misma dosificación de polisacárido plano no tuvo efecto. Ya que se ha determinado que los serotipos 6B y 23F se regulan en su respuesta inmune en humanos y animales, podemos concluir que la regulación inmune de serotipos 6B y 23F se transmite a los otros serotipos a través del vehículo de proteína común. Ejemplo 6 Modificación del vehículo de proteína para serotipo 6B La tasa de seroconversión de conjugado 6B PS fue baja en la rata infante en dosificación de 0.1 µg. Otros factores que podrían influenciar la inmunogenicidad del conjugado se examinan. Estos incluyen la proporción de carbohidrato a la proteína presente en el material, el método específico de enlace utilizado, la presencia de polisacárido libre, y la proteína de vehículo específica. La modificación de la química de acoplamiento no incrementa la inmunogenicidad de los conjugados 6B en ya sea modelos de ratas infantes o ratón. Parece que el uso del vehículo TT incrementa la inmunogenicidad en el modelo de ratón, pero solamente a una dosis más alta. Los conjugados se sintetizan con una proteína portadora inicial proporción (proteína D)/PS de 2.5:2. Otros conjugados se sintetizan con una proteína portadora inicial proporción (Proteína D)/PS de 1 :1 . Ejemplo 7 Evaluaciones clínicas Varias formulaciones de vacuna de la presente invención experimentan evaluación clínica en humanos. La tabla 2 ilustra la composición de tales vacunas. Tabla 2 Formulaciones de S. pneumoniae Aunque las modalidades preferidas de la invención se ilustran por lo anterior, se entiende que la invención no se limita a las instrucciones precisas en la misma descritas y que el derecho a todas las modificaciones que vienen dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones se reserva.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una vacuna de Streptococcus pneumoniae mejorada que comprende 1 1 o más polisacáridos de diferentes serotipos de S. pneumonía conjugados con 2 o más proteínas portadoras en donde los serotipos 6B, 19F y 23F se conjugan con una primer proteína portadora y los serotipos restantes se conjugan con 1 o 2 proteínas portadoras secundarias, y donde las proteínas portadoras secundarias son diferentes de la primer proteína portadora. 2. Una vacuna de Streptococcus pneumoniae mejorada que comprende 1 1 o más polisacáridos de diferentes serotipos de S. pneumonía conjugados con 2 o más proteínas portadoras en donde los serotipos 6B, y 23F se conjugan con una primer proteína portadora y los serotipos restantes se conjugan con 1 o 2 proteínas portadoras secundarias, y donde las proteínas portadoras secundarias son diferentes de la primer proteína portadora. 3. Una vacuna de Streptococcus pneumoniae mejorada que comprende 1 1 o más polisacáridos de diferentes serotipos de S. pneumonía conjugados con 2 o más proteínas portadoras en donde el serotipo 6B se conjuga con una primer proteína portadora y los serotipos restantes se conjugan con 1 o 2 proteínas portadoras secundarias, y donde las proteínas portadoras secundarias son diferentes de la primer proteína portadora. 4. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde la primer proteína portadora se selecciona del grupo que consiste de DT, crm197, TT, Fragmento C, Ply, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, OpmC y PorB. 5. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde la proteína portadora secundaria se selecciona del grupo que consiste de una o 2 proteínas seleccionadas del grupo que consiste de PD, DT, crm197, TT, Fragmento C, Ply, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, OmpC y PorB. 6. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde existe 1 proteína portadora secundaria. 7. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde los polisacáridos de cada serotipo están presentes en una cantidad de 1 -10 ug. 8. La vacuna de la reivindicación 7 en donde uno o más serotipos seleccionados del grupo que consiste de 1 , 3, 4, 5, 7F, 9V, 14 y 1 8C están presentes en una cantidad de 2-5 ug. 9. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde la proporción de proteína portadora a polisacárido es 0.5 a 1.7 (p/p). 10. La vacuna de la reivindicación 9 en donde la proporción de proteína portadora a polisacárido es de 0.7 a 1.5 para uno o más serotipos seleccionados del grupo que consiste de 6B, 19F y 23F. 1 1. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde la proteína portadora secundaria es proteína D de H. influenzae (PD). 12. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde el serotipo de polisacárido 6B se conjuga con una primer proteína portadora seleccionada del grupo que consiste de DT, crm197 o TT. 13. La vacuna de la reivindicación 12 en donde la primer proteína portadora es DT. 14. La vacuna de cualquier reivindicación precedente en donde el polisacárido 6B está presente en una cantidad de 5- 0 ug/dosis. 15. La vacuna de cualquier reivindicación precedente que comprende además polisacáridos de S. pneumoniae sin conjugar de serotipos diferentes de aquellos conjugados, de manera que el número de polisacáridos conjugados y sin conjugar es menor o igual a 23. 16. Un método para producir una respuesta inmune protectora para infantes 0-2 años de edad contra S. pneumoniae al administrar la vacuna de cualquier reivindicación precedente. 17. Un método para producir una respuesta inmune protectora a las personas de 50 años o de mayor edad contra S. pneumoniae al administrar (i) la vacuna de cualquier reivindicación precedente y (¡i) una proteína de superficie S. pneumoniae de la familia PhtX, en donde la proteína de superficie S. pneumoniae es diferente de las proteínas portadoras, primera y secundaria. 1 8. Un método para producir una respuesta inmune protectora para infantes 0-2 años de edad contra Otitis media al administrar (i) la vacuna de cualquier reivindicación precedente y (¡i) una proteína de superficie de S. pneumoniae de la familia PhtX, en donde la proteína de superficie S. pneumoniae es diferente de las proteínas portadoras, primera y secundaria. 19. El método de la reivindicación 17 o 18 en donde la proteína de familia PhtX es PhtD o PhtB. 20. El método de la reivindicación 19 en donde la proteína de familia PhtX es P tD. 21 . El método de la reivindicación 17 que comprende además una proteína de familia CbpX. 22. El método de la reivindicación 21 en donde la proteína CbpX es un truncado que carece del dominio de unión de colina. 23. El método de la reivindicación 22 en donde el truncado de CbpX es proteína de unión de colina A. 24. El método de la reivindicación 18 que comprende además Ply.