MXPA04004289A - Proteina knobs. - Google Patents
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Abstract
Se describen composiciones que contienen una nov unida a un sitio especifico de una proteina y metodos para producir y usar estas composiciones. Las composiciones comprenden una nov, una porcion de cola y una porcion de proteina. La porcion de proteina contiene un residuo de cisteina sustituido en la ubicacion deseada de marcacion. La porcion de cola se ubica en el extremo terminal de la porcion de proteina. La nov se une al extremo de la porcion de cola y contiene un residuo de cisteina. El residuo de cisteina sustituido en la porcion de proteina y el residuo de cisteina en la nov forman un enlace bisulfuro, por lo tanto marcando la porcion de proteina en el sitio deseado con la knob.
Description
PROTEÍNA KNOBS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la marcación de proteínas.
ARTE PREVIO Los métodos para marcar las proteínas para usarse en el análisis de las interacciones proteína-proteína o la purificación de proteínas actualmente involucran la fusión de una marca a los extremos terminales carboxi-o amino- o insertar los residuos en una espiral de la proteína. Cada uno de éstos métodos tiene sus limitaciones. Por ejemplo, puede ser deseable marcar una proteína, si es con una molécula o una proteína colorante en ubicaciones específicas en la proteína más que ser limitada en la unión de las moléculas en los extremos de la proteína. Estos incluyen estudios designados para probar las interacciones de las proteínas con las macromoléculas como es el caso de la hCG con su receptor. Además, en donde los extremos terminales de una proteína están involucrados en la función de la proteína, la marcación de los extremos de la proteína no puede ser deseable. Con respecto a insertar una marca en la espiral de una proteína, este método se limita porque el tamaño de la maraca usualmente debe ser relativamente pequeño (pocos residuos), a menos que la. marca se inserte entre los dominios de la proteína. Existen ocasiones cuando sería deseable unir varias pruebas dimensionadas en la superficie de una proteína. Además, las modificaciones que involucran el uso de un residuo de cisteína también son difíciles dado que la proteína puede contener otros residuos de cisteína que requerirían la protección o la cisteína podría llegar a ser bloqueada y puede ocurrir la desnaturalización de la proteína cuando se remueve el residuo de bloqueo. Como un resultado, las proteínas marcadas producidas por estos métodos tienen uso y aplicación limitados en la industria.
Por ejemplo, los esfuerzos por identificar las porciones de coriogonadotropina humana (hCG) que contacta el receptor lutropin (LHR) se han frustrado por la estructura del complejo de la hormona y la probabilidad de que interactúa con el receptor en sitios múltiples. La estructura cristalina de la coriogonadotropina humana (hCG) reveló que una hebra de su subunidad ß circunda la subunidad a como un "cinturón de seguridad" (Lapthorn, A. J. Harris, D. C, Litflej'ohn, A, Lustbader, J. W:, Candfleld, . E., Machín, . J., Morgan, F. J. & Isaacs, N. W. (1994) Nature 369, 455-461 ; Wu, H., Lustbader, J. W., Liu, Y., Canfiled, R. E. & Hendrickson, W. A. (1994) Structure 2 , 545-558). A p esar d e q ue I a m ayoría d e las proteínas diméricas que se estabilizan completamente por los contactos intersubunidad, la nCG parece estar asegurada ampliamente por su c inturón d e s eguridad; l a e liminación d el b ¡sulfuro que "cierra" el extremo carboxiterminal del cinturón de seguridad para Cys26 en el centro de la subunidad ß se encontró que interrumpe la secreción de la hCG (Suganuma, N., Matzuk, M. M. & Boime I. (1989) J. Biol. Chem. 264, 19302-19307), presumiblemente mediante la desestabilización del heterodímero. Las ventajas evolutivas de este arreglo estructural inusual permanecen desconocidas y pueden reflejar el hallazgo de que permite movimientos de las subunidades dentro del heterodímero, un fenómeno detectado durante el enlace de algunos análogos hCG para los receptores FSH (Wang, Y.H. Bernard, M. P. & Moyle, W. R. (2000) Mol. Cell. Endocrinol. 170, 67-77).
Los receptores de estas tres clases de hormonas de las glicoproteínas, incluyendo la hCG se acoplan a las proteínas G y tienen grandes dominios extracelulares que contienen múltiples repeticiones ricas en leucina (Segaloff, D. L. & Ascoli M. (1993) Endocr. Rev. 14, 324-347). El último hallazgo sugiere que el dominio extracelular puede estar en forma de herradura, similar a las porciones de otras proteínas de repetición ricas en leucina (Kobe, B. & Deisenhofer, J. (1993) Nature 366, 751-756). Dos regiones del dominio extracelular parecen contribuir a la afinidad y especificidad déla unión de ligandos. La afinidad de la hCG para alternativamente unir y truncar los análogos LHR es similar a aquella para el receptor intacto, sugiriendo que los residuos en la aminoterminai, d os t ercios d el d ominio e xtracelular forman e I s itio d e e nlace d el I ¡gando d e a Ita afinidad (Braun, T., Schofield, P. R. & Sprengel, R. (1991) EMBO. J. 10, 1885-1890; Thomas D., Rozell, T. G. Liu, X & Segaloff, D. L. (1996) Mol. Endocrinol. 10, 760-768). Los residuos en el quinto carboxiterminal del dominio extracelular LHR humano interfieren con el enlace de las lutropinas de mamíferos no humanos, un hallazgo que Indica que los contactos entre esta porción de la hormona y el receptor son primeramente estéricos en la naturaleza, (Bernard, M. P., Myers, R. V. & Moyle, W. R. (1998) Biochem. J. 335, 611-617).
Continúa debatiéndose que las superficies de hCG, hFSH y hTSH contactan más probablemente la LHF, FSHR y TSHR. El extremo carboxiterminal de la subunidad a, que es adyacente a una porción del cinturón de seguridad en el heterodímero (Wu, H., Lustbader, J. W., Liu, Y., Canfield, R. E. & Hendrickson, W. A. (1994) Structure?, 545-558), se ha encontrado que influye en la afinidad de todas las hormonas de la glicoproteína para sus receptores (Lapthorn, A. J., Harris, D. C. Litlejohn, A. Lustbader, J. W., Canfield, R. E., Machín, K. J., Morgan F. J. & Isaacs, N. W. (1994) Nature 369, 455-461 ; Bernard, M. P., Myers, R. V. & Moyle, W. R. (1998) Biochem. J. 335, 611-617) y se propuso ser un receptor de contacto de más de 25 años (Laptorn A. J. Harris, D. C, Littlejohn, A., Lustbader, J. W. Canfield, R. E., Machín, K. J., Morgan, F. J. & Isaacs, N. W. (1994) Nature 369, 455-461 ). Junto con los datos en la estructura y función de la hormona, estas observaciones han conducido a las observaciones del complejo hormona-receptor que difieren radicalmente, (Moyle, W. R., Campbell, R. K., Rao, S. N. V., Ayad, N. G. Bernard, M. P., Han, Y. & Wang, Y. (1995) J. Biol. Chem. 270, 20020-20031), oscilando de uno, en el cual la hormona contacta la superficie cóncava del dominio extracelular del receptor, (Jiang, X., Dreano, M. Buckler, D. R., Cheng S., Ythier, A. Wu, H., Hendrickson, W. A., Tayar, N. E. & el Tayar, N. (1995) Structure 3, 1341-1353) para uno en el cual se contacta con el borde, (Moyle, W. R., Campbell, R. ., Rao, S. N. V. Ayad, N. G., Bernard, M. P. Han, Y. & Wang Y. (1995) J. Biol. Chem. 270, 20020-20031). Todas las vistas del complejo hCG-LHR sugieren que las porciones de la espiral 2 de la subunidad a confrontan al receptor, pero permanece para ser determinada si esta porción de la hormona participa en los contactos del receptor. La mutación de esta espiral se ha reportado que reduce la actividad de la hCG (Peng, K. C, Bousflied, G. R., Pret, D. & Ward, D. N. (1996) Journal of Protein Chemistry 15, 547-552; Xia, H., Chem., F. & Pret, D. (1994) Endocrinol. 134, 1768-1770), sugieren que puede tomarse como esenciales los contactos LHR.
Las interacciones de receptor-proteína son la clave en el entendimiento de la función y la regulación del comportamiento celular. Un p rofundo e ntendimiento de l as i nteracciones que s on necesarias para muchos esfuerzos, tal como el diseño de nuevas drogas farmacéuticas. Actualmente, sin embargo, existen muchas limitaciones para el entendimiento de las interacciones proteína-receptor. Es útil entender que tanto la estructura de la conformación de la proteína y la función de la proteína, así como la estructura de la proteína interactúa con el receptor (que también es comúnmente u na p roteína). A través del entendimiento y la experiencia, si se conocen otros aspectos, un aspecto de una proteína algunas veces puede extrapolarse. Las interacciones receptor-proteína pueden modelarse en una computadora, pero el modelado es una tarea compleja, especialmente porque las moléculas son flexibles y adoptan un número de conformaciones que son de una energía similar. El modelado del proceso de enlace receptor-proteína e s t ambién d ifícil p orque n ecesitan ser consideradas las características del receptor, el ligando y el solvente.
Además d el m odelado, o tro a vanee p ara e I entendimiento de las interacciones receptor-proteína es que hace cambios a la estructura de la proteína, la estructura del receptor o las condiciones bajo las cuales ellos interactúan en una configuración experimental y miden el efecto del cambio en el enlace y por lo tanto, en la función de la proteína o que carece de la misma. Estas técnicas experimentales también tienen limitaciones debido a la dificultad en la manipulación de la proteína o el receptor en la habilidad para medir los cambios. Por lo tanto, una invención que mejoraría la exactitud de los datos experimentales mediante causar consistentemente la interacción o inhibir consistentemente la interacción del receptor-proteína podría ser una mejora en la técnica porque permitiría una determinación de la función o la carencia de la función causada por la misma.
En principio, la identificación de las porciones de la hormona y el receptor que contacta uno con otro deberá elucidarse rápidamente mediante usar la mutagénesis dirigida en sitio. Desafortunadamente, las mutaciones de la subunidad a en el término carboxi y le cinturón de seguridad de la subunidad ß altera las posiciones de las subunidades dentro del heterodímero (Jiang, X, Dreano, M., Buckler, D. R. Cheng, S., Ythier, A. Wu, H., Hendrickson, W. A., Tayar, N. E. & el Tayar, N. (1995) Structure 3, 1341-1353; Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981 ) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495) y s e h a h echo d ifícil i nterpretar I a i nfluencia d e e stas p artes c lave d é l a hormona e n s u función. Además, l as mutaciones que pueden cambiar la actividad hCG pueden hacerlo mediante alterar los contactos LHR clave, cambiando las posiciones de sus subunidades o ambas. En efecto, las mutaciones para la subunidad a del término carboxi (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495, Chen., F., Wang, Y. & Puett, D. (1992) Mol. Endocrinol. 6, 914-919 y el cinturón de seguridad, Campbell, R. K., Dean Emig, D. M. & Moyle, W. R. (1991 ) Proa Nati. Acad. Sci. (EUA) 88, 760-764; Campbell, R. K., Berget, E. R., Wang, Y., Morris, J. C. & Moyle, W. R. (1997) Nature Biotech. 15, 439-443; Grossmann, M., Szudlinski, M. W., Wong, R., Dias, J. A., Ji, T. H. & Weintraub, B. D. (1997) J. Biol. Chem. 272, 15532-15540; Lindau-Shepard, B. Roth, K. E. & Dias, J. A. (1994) Endocrinol. 135, 1235-1240), que tiene grandes influencias en las interacciones hormona-receptor, también altera las posiciones de las subunidades en el heterodímero (Wang, Y. H., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. (2000) Mol. Cell. Endocrinol. 170, 67-77; Moyle, W. R., Campbell, R. K., Rao, S. N. V. Ayad, N. G., Bernard, M. P. Han, Y & Wang, Y. (1995) J. Biol. Chem. 270, 20020-20031). Un método alternativo para identificar que porciones de la proteína y el receptor interactúan, involucra identificar los residuos que no contactan con el receptor. Estos residuos pueden identificarse con mucho más certeza. Sin embargo, ha sido difícil obtener las sondas para usarse en la identificación de estos residuos. Por consiguiente, son necesarios los métodos mejorados para producir las sondas para usarse en el análisis de la interacción de la proteína.
Además para su uso en el análisis de las interacciones de la proteína, las sondas o proteínas marcadas en un sitio específico en la molécula proporcionan herramientas de búsqueda invaluables. Sin embargo, como se describió previamente, los métodos actuales involucran la marcación o unión de una sonda en los extremos terminales de la molécula, limitando su uso. Otros métodos involucran procedimientos complicados que requieren varias interacciones y grupos de protección para producir la modificación en sitio específico sin modificar otros aminoácidos y la estructura de la proteína funcional. Por consiguiente, son deseables los métodos mejorados para ía marcación en sitio específico.
La purificación de la proteína frecuentemente es necesaria, como todo proceso algo oneroso. Las proteínas purificadas pueden ser un producto intermediario requerido de un experimento científico o puede ser un producto terminal. La pureza de la proteína comúnmente es crítica para el éxito terapéutico y experimental. En algunos casos, en donde las proteínas inyectables se examinan por la Administración de Drogas y Alimentos, cualquier contaminante puede removerse o se prueban como i nofensivas. Además para l a p ureza, las p roteínas d eben retener su actividad biológica.
Existe un número de métodos actualmente conocidos en la técnica de purificación de proteínas, aunque todos los métodos tienen algunas limitaciones. La cromatografía por exclusión por tamaño es útil para las separaciones totales, pero no es un método severo y requiere que las muestras se concentren. La electroforesis en gel permite la separación precisa de una proteína en una mezcla, pero es práctica solamente para muestras pequeñas. La cromatografía por afinidad es un método útil, pero típicamente requiere que algunos contaminantes de los iniciales se hayan filtrado. Por consiguiente, una invención que podría ayudar en la separación precisa de las proteínas con pocos pasos sería una mejora significante en la técnica, particularmente si la invención puede aumentar la pureza a grandes volúmenes sin sacrificar la pureza.
Además de estos usos, las knobs pueden usarse para "cubrir" las superficies específicas en las proteínas. Este tipo de uso tiene aplicaciones en el diseño de las prodrogas que pueden usarse para marcar los tumores u otros tejidos indeseados tal como aquellos encontrados en los ovarios de las mujeres estériles diagnosticadas con síndrome de ovario policístico. Además, la unión de una knob cerca del sitio activo de una toxina o una enzima tóxica permitiría que la enzima tóxica sea usada en los pacientes. Una vez que la tóxica o enzima alcanza al tejido que contiene una enzima capaz de penetrar al ligando que une a la knob, p odría reestablecerse l a actividad enzimática o tóxica. Se espera que esta estrategia reduzca la presencia de efectos colaterales indeseables que de otra manera pueden limitar la utilidad de la toxina o la enzima. De la misma forma, las knobs podrían usarse para bloquear las actividades de los agentes tal como PTEN que promueve la apoptosis.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas maracas en un sitio específico con una knob y métodos para marcar y usar estas composiciones. Una knob refiere una marca para la proteína que puede adecuarse para un uso específico.
En un aspecto de la invención, se describan las proteínas marcadas con una knob en un sitio específico en la proteína. Esta proteína marcada en un sitio específico contiene una knob, una porción de cola y una porción de proteína. La knob comprende la marca o el aspecto de sonda de la proteína y tiene un residuo cisteína. La porción de cola se ubica entre la porción knob y la porción de la proteína. La porción de la proteína tiene un residuo de cisteína s ustituido para el aminoácido natural en el sitio deseado de marcación. Los residuos de cisteína de la knob y la porción de proteína forman un enlace de bisulfuro. En un aspecto adicional de la invención, la porción de cola puede contener una proteasa u otro sitio de penetración.
En otro aspecto de la invención, se describen los métodos para producir proteínas en sitio específicamente marcadas con las knobs. Estos métodos involucran seleccionar una proteína deseada para la marcación, localizando un sitio específico en la proteína deseada para la marcación, produciendo la proteína deseada, en donde un residuo de cisteína se sustituye en el sitio específico para la marcación en la proteína deseada y en donde la proteína deseada además comprende una porción de cola en un extremo de la proteína y una knob en el extremo de la porción de cola, en donde la knob contiene un residuo de cisteína y en donde el residuo de cisteína en la knob forma un enlace de bisulfuro con el residuo de cisteína en la porción de proteína. En un aspecto relacionado de la invención, se describen los métodos para unir las knobs al hCG en los sitios específicos. Estos métodos involucran la inserción de construcciones capaces de expresar los análogos sustituidos de hCG o hCGp-S138C y hCGa natural o hCGa-cisteína en una célula para la co-expresión y fusionando un knob al residuo 140 ó 145 de hCGp.
En otro aspecto de la invención, se describen los métodos para la purificación de proteínas que emplean las proteínas marcadas en sitio específico de esta invención. Estos métodos insertan una codificación que codifica una proteína en una célula, en donde la proteína codificada comprende un residuo cisteína sustituido en un sitio deseado para el marcado, una porción de cola, que tiene un residuo cisteína y un sitio de penetración en un extremo de la proteína y una porción knob en el extremo de la porción de cola, proporcionando condiciones que permiten la expresión de la construcción, lisando la célula y purificando la proteína basada en las características de la knob en la proteína.
En otro aspecto de la invención, se describen métodos para usar las knobs de proteínas modificadas e specíficamente e n u n s itio. L as k nobs d e la proteína pueden usarse, por ejemplo, para mapear distancias entre las proteínas, probar la superficie de una inferíase de proteína-proteína, formar un complejo entre dos proteínas no relacionadas, probar la estructura y la función de la proteína de la proteína knob para inmovilizar proteínas en la superficie, para enviar proteínas a I as c élulas, a sí c orno u na p roteína d e marcación y para la purificación de proteínas. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que una proteína marcada en un sitio específico con una marca común es una herramienta de búsqueda valiosa con un amplio rango de aplicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Vista tridimensional de hCG. La ilustración de los residuos de la subunidad a nCG que pueden analizarse por el término carboxi de la subunidad ß hCG. Las espinas dorsales de la subunidad a y ß se muestran en cintas grises claras y oscuras, respectivamente. La porción de cola ß se muestra como una cinta negra. Las ubicaciones de los carbonos Ca de las sustituciones cisteína que habilitaron la reticulación eficiente entre el residuo de la subunidad a y la sonda cisteína se muestran como esferas oscuras. Las esferas grises más claras se refieren a residuos que tienen menos cantidades de reticulación. Las esferas pálidas pequeñas se refieren a sustituciones de cisteína que conducen a la cantidad insignificante de la reticulación. Notar que los residuos 90, 91 y 92 de la subunidad a parecen ser muy móviles para observarse en la estructura cristalina de hCG y las posiciones arbitrarias de estos residuos mostradas en este documento se intentan que enfaticen solamente sus habilidades aparentes para sujetarse al cinturón de seguridad, en donde: A = Cisteína para el acoplamiento de hCGB, S138C antes de la formación del bisulfuro.
Figura 2A. Enlace de los análogos hCG o hCG en el cual un residuo de la subunidad a en la espiral 2 se ha sustituido por una cisteína, en donde: B = % de la Porción de 1251-hCG unido a LHR C = cAMP (% máximo de respuesta) D = ng hCG o análogos.
Figura 2B. Acumulación cAMP de los análogos hCG o hCG en los cuales un residuo de la subunidad a en la espiral 2 se han sustituido por una cisteína.
Figura 3A. Influencia de las sustituciones cisteína en el término carboxi de la subunidad alfa. Enlace de los análogos hCG o hCG en los cuales un residuo de la subunidad a en el término carboxi se ha sustituido por una cisteína.
Figura 3B. Influencia de las sustituciones de cisteína en el término carboxi de la subunidad alfa. Acumulación cAMP de los análogos hCG o hCG en los cuales un residuo de la subunidad a en el término carboxi se ha sustituido por una cisteína.
Figura 4A. Enlace de los análogos hCG y hCG con la porción de cola ß unida a los residuos de la subunidad a en el circuito 2.
Figura 4B. Acumulación cA P de los análogos hCG o hCG en los cuales la porción de cola ß se une a los residuos de la subunidad a en el espiral 2.
Figura 5A. Enlace de los análogos hCG y hCG con la porción de cola ß unida a los residuos de la subunidad a en el término carboxi.
Figura 5B. Acumulación cAMP de los análogos hCG o hCG en los cuales la porción de cola ß se unió a los residuos de las subunidades a en el término carboxi.
Figura 6. Enlace y actividades de transducción de señales de los análogos en los cuales BLA se une al residuo de la subunidad-a, en donde: E = % de la curva de activación de la transducción de señales cAMP EC50 relativa.
Figura 7. Secuencias d e a minoácidos de l a s ubunidad a y los mutantes que tienen una cisteína. (Nota, las mutaciones son superiores están en letra mayúscula y resaltadas. Estas se prepararon mediante métodos de mutagénesis PCR y mutagénesis de cinta cassette estándar que son estándar en el arte) (SEC ID NO: 1 - SEC ID NO: 35).
Figura 8. Secuencias de aminoácidos de los análogos de la subunidad-ß. (Notar, la cisteína sustituida está en letras mayúsculas y resaltada) (SEC ID NO: 36 - SEC ID NO: 42).
Figura 9A. Proteína Knob con la knob unida en el extremo carboxiterminal de la proteína, en donde: CT = Cisteína blanco CC = Cisteína de acoplamiento CS = Sitio de penetración (si se desea) K = Knob.
Figura 9B. Proteína Knob con la knob unida en el extremo aminoterminal de la proteína.
Figura 10A. Proteína Knob en donde la knob está comprendida de un residuo cisteína, en donde: MK = Knob mínima (Cys) CE = Extremo penetrado del enlazante FP Proteína de fusión.
Figura 10B. Proteína Knob en donde la knob está comprendida de una secuencia de aminoácido que incluye un residuo de cisteína fusionado a una proteína.
Figura 10C. Proteína Knob en donde el residuo de cisteína de la knob se ubica en la superficie de la proteína que es la knob.
Figura 11. Efecto de la Knob en la actividad FSH, en donde: F = cAMP pMoles G = ng hFSH o análogo.
Figura 12. Resumen de la Actividad de los Análogos de la Quimera Reticuiada en LHR y las Pruebas FSHR relativas a CF101-109, una Quimera Bifuncional sin los términos carboxi de la subunidad ß hCG, en donde: H = El porcentaje 1251-hCG (LHR) o 1251-hFSH (FSHR) unido al análogo CF101-109 es
100%.
Figura 13. Efecto de la Knob en la Marcación del Receptor FSH, en donde:
I = cAMP pMoles.
Figura 14A. Efecto de la Knob en la Marcación del Receptor LH.
Figura 14B. Efecto de la Knob en la Marcación del Receptor LH.
Figura 15. Secuencias de aminoácidos de otros análogos (SEC ID NO: 43 - SEC ID NO:
53).
Figura 16. Transducción de señales y actividades de enlace de los heterodímeros
CORTOS y LARGOS, en donde: J = % de la curva de enlace de EC50 relativo de LHR.
Figura 17. Actividad lutropina de los análogos hCG teniendo los knobs ß-lactamasa.
Figura 18. Acumulación cAMP en hCG o Análogos que carecen del oligosacárido aAsn52, en donde: K = AMP cíclico (pMoles) L = ng hCG o Análogo que carece de oligosacárido aAsn52 (dghCG).
Figura 19. Enlace de aK44A+riCG para LHR, en donde: M = Enlace hCG l125-rLHR.
Figura 20A. Enlace de hCG y el análogo hCG c K44E, K45Q+hCG para LHR, en donde: O = Enlace 125l-hCG (CPM).
Figura 20B: Respuesta LHR cAMP para hCG y aK44E, K45Q+hCG .
Figura 21 A. Enlace de hCG y el análogo hCG ccK91E+hCGp para LHR.
Figura 21 B. Actividades relativas de hCG y aK91E+hCGp en las pruebas de acumulación cAMP LHR.
Figura 22A. Respuesta cAMP LHR para hCG y aK91M+hCG .
Figura 22B. Enlace LHR de hCG y aK91 M+hCG .
Figura 23. Enlace LHR de hCG y los análogos que contienen enlazantes más cortos.
Figura 24. Enlace LHR de hCG y un análogo que contiene un enlazante más corto.
Figura 25. Estimulación de cAMP LHR por hCG y aN52C+hCG , S138C.
Figura 26. Enlace LHR de los análogos en los cuales una porción de cola carboxiterminal de la subunidad ß hCG truncada se usó en el extremo carboxiterminal d e I a s ubunidad para agregar una knob a los residuos de la subunidad ß hCG 96, 97 ó 98.
Figura 28. Enlace LHR de los análogos en los cuales una porción de cola carboxiterminal de la subunidad-ß hCG truncada, se usó para agregar una knob a los residuos 95 ó 96 de la subunidad-ß.
Figura 29. Señalización LHR de los análogos en los cuales una porción de cola carboxiterminal de la subunidad-ß hCG truncada se usó para agregar una knob para los residuos 95 ó 96 de la subunidad-ß.
Figura 30. Señalización LHR de los análogos en los cuales una porción GGC se usó para agregar una knob al residuo 96 de la subunidad ß comparada con una que carece de una porción de cola en una en la cual una porción de cola carboxiterminal de la subunidad-ß hCG truncada se usó para agregar una knob al residuo 96 de la subunidad ß de una quimera hCG/hFSH.
Figura 31. Señalización LHR de los análogos en los cuales una cola carboxiterminal de la subunidad-ß hCG truncada se usó para agregar una knob a los residuos 98 ó 99 de la subunidad-ß.
Figura 32. Señalización LHR de los análogos que muestran la influencia de la porción de cola al agregar una knob al residuo 95 de la subunidad ß hCG y en un análogo que carece de la habilidad para glicosilar la subunidad-a en el residuo 52.
Figura 33. Respuesta A P cíclica para los análogos reticulados, en donde: N = ng hCG o Análogo reticulado de bisulfuro.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Actualmente, la mayoría de las proteínas marcadas se preparan como proteínas de fusión con la marca agregada al extremo carboxiterminal o amino terminal de la proteína o con pocos residuos insertados en una espiral de proteína. Mientras las marcas terminales pueden ser de cualquier tamaño, las marcas insertadas en una espiral de protetna se limitan usualmente para los relativamente pocos residuos aminoácidos a menos que se inserten entre los dominios de las proteínas. Las proteínas también pueden marcarse en sitios diferentes a través de la introducción de cisteínas en el sitio para marcarse y posteriormente reacciona el grupo sulfidrilo de la cisteína con un reactivo sulfidrilo específico. Esto puede ser un tanto difícil de llevar a cabo, sin embargo cuando la proteína contiene otras cisteínas o cuando se prepara bajo condiciones que causan que la cisteína llegue a "bloquearse" como es común cuando las proteínas se expresan en las células eucarióticas.
La presente invención proporciona métodos mejorados para marcar o etiquetar proteínas. Los métodos de la presente invención evitan las complicaciones asociadas con la marcación o etiquetación mediante la introducción de una cisteína, como se describió anteriormente y permite que varias sondas dimensionadas o knobs se unan en la superficie de una proteína diferente a esa en sus extremos terminales. La presente invención proporciona métodos para agregar "knobs" de varios t amaños e n u bicaciones d efinidas e n I a s uperficie d e I a h CG. L as k nobs p ueden ser tan pequeñas como un residuo de cisteína simple. Las knobs pueden ser un péptido corto, tal como los residuos que circundan el residuo 138 de la subunidad ß hCG. Las knobs también pueden ser tan grandes como una proteína completa. Por ejemplo, puede usarse la ß-lactamasa como una knob. Las knobs se agregan durante la síntesis de proteínas haciendo innecesario remover cualquier residuo de bloqueo o unir cualquier grupo de protección, tareas que pueden causar la desnaturalización de las proteínas.
La presente invención emplea una nueva estrategia para unir un amplio rango de sondas o marcas a sitios específicos en una superficie de proteínas basadas en el hallazgo de que una porción de cola de la subunidad-ß flexible es capaz de ser reticulada a uno de varios residuos de la subunidad a que se han reemplazado por una cisteína. Las knobs pueden ser una proteína fluorescente, tal como una molécula relacionada o una proteína verde fluorescente. Ellas pueden tener la habilidad de unir otras moléculas, propiedades encontradas en los ligandos o receptores. Ellas pueden ser p roteasas, t oxinas, a nticuerpos o f ragmentos de a nticuerpos, s ecuencias t ales como aquellas encontradas en la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana que habilita a las proteínas para traducirse a través de las membranas, los ácidos nucleicos o oligosacáridos.
En una modalidad, una composición que comprende una porción de proteína, en donde la porción de proteína contiene un residuo cisteína sustituido en la ubicación deseada para ser marcada, u na p orción d e c ola e n e I e xtremo t erminal d e I a p orción d e p roteína y u na k nob, e n donde la knob se ubica en el extremo terminal libre de la porción de cola y contiene un residuo cisteína y en donde el residuo cisteína de la knob forma un bisulfido con la cisteína sustituida en la porción de protetna. El término "porción de proteína" se refiere a cualquier proteína o polipéptido. El término "porción de cola" se refiere a una extensión de aminoácidos de una longitud suficiente para permitir que la cisteína en la knob forma un bisulfuro con la cisteína sustituida en la porción de proteína. La porción de cola puede comprender una porción de polipéptido natural de la proteína de la porción de proteína, como el término carboxi de la subunidad ß hace en hCG (ver la Figura 1) o puede comprender un polipéptido no natural agregado a un extremo terminal de la porción de proteína. La porción de cola debe carecer de residuos que preverán a la knob de unirse a la cisteína sustituida, tal como los dominios de transmembrana o los residuos que crearán un sitio para unirse mediante otras proteínas. El término "knob" se refiere a una cisteína y cualquier residuo en otro costado de la cisteína que se ubica adyacente al extremo terminal libre de la cola. La knob puede incluir un residuo de cisteína libre, una extensión lineal de los aminoácidos que contienen una cisteína, una extensión lineal de aminoácidos fusionados a una proteína, en donde la cisteína se ubica en la extensión de aminoácidos, o una proteína que contiene un residuo cisteína en su superficie. Una knob puede tratarse para un propósito particular o usarse resultando en una sonda o marca usual. Por ejemplo, la knob puede ser una marca epítope, una secuencia de señal, una secuencia con alta especificidad para una cama en una columna de purificación, una enzima o una proteína de marcación.
En otra modalidad de la invención, se describen los métodos para marcar una proteína en un sitio específico. El método involucra seleccionar una proteína deseada, ubicar un sitio en la proteína deseada para marcarse y seleccionar una knob deseada. La knob deseada debe contener un residuo de cisteína. El método además involucra preparar una construcción que codifica la proteína deseada, una porción de cola y la knob deseada. La proteína deseada codificada por la construcción incluye un residuo de cisteína sustituido en el sitio a marcarse. La construcción posteriormente se inserta en una célula p ara I a e xpresión d e I a p roteína m arcada, e n d onde I a cisteína en la knob y la cisteína sustituida en la proteína deseada forman un enlace de bisulfuro.
El término "construcción" se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende un promotor unido a un cassette de expresión tratado para codificar un producto de proteína particular. La construcción además incluye todas las secuencias necesarias de manera que la proteína codificada puede expresarse y cualquier secuencia que puede incluirse para controlar la expresión del cassette. Estas secuencias pueden incluir, pero no limitarse a, un promotor o secuencia de iniciación, una secuencia mejoradora, una secuencia de terminación, señales de procesamiento del ARN y/o una secuencia de la señal de poliadenilación. El término "secuencias necesarias para la expresión del cassette de expresión" se refiere a secuencias requeridas para asegurar la transcripción ARN y traducción subsecuente del cassette de expresión para producir un producto de proteína. El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN que se une por la polimerasa ARN y se requiere para iniciar la transcripción ARN de un gen. Existe un número de promotores que se conocen en la técnica, incluyendo aquellos que pueden mejorar o controlar la expresión del gen o del cassette de expresión. Las construcciones de esta invención pueden modificarse por la PCR y la mutagénesis del cassette para crear una construcción que codifica la knob de la proteína deseada.
Las knobs en sitios específicos en una proteína pueden usarse para probar la distancia en los residuos probados para la interfase de un receptor o de otra proteína. Por ejemplo, las knobs pueden usarse para determinar la proximidad de los residuos de la subunidad a para los sitios de enlace del receptor en hCG. La unión de sondas para los residuos que se ubican en la bolsa de enlace debería abolir la actividad de enlace indicando que la marca se ubica en la bolsa de enlace. Otra ventaja de usar las knobs en los sitios específicos es que las sondas más grandes pueden usarse para identificar los residuos que están cerca de la interfase proteína-receptor. Esta estrategia de sondeo también puede usarse para agregar las marcas epítopes o las secuencias de señal a cualquier sitio deseado en la superficie de la proteína. Adicionalmente, las knobs d e la proteína también pueden usarse ampliamente para la inmovilización de la proteína y la marcación de la proteína. Si el sitio de reconocimiento de proteasa se tratan dentro de la cola flexible, la cola entonces pueden penetrarse después de que se lleva a cabo la reticulación, dejando la sonda atorada por un bisulfido para la superficie de proteína, pero no atorada por la cola.
Los usos para las proteínas knobs producidas usando los métodos de la invención no se limitan solamente a interferir la distancia entre los sitios en las proteínas. Si una proteasa marcada se desea, muchas proteasas diferentes podrían unirse al término amino o el término carboxi de una proteína simplemente mediante fundir las secuencias de codificación de la proteasa para el extremo 5' ó 3' de la secuencia de codificación de la proteína para modificarse como se ha descrito para la preparación de las proteínas de fusión. [Patente Norteamericana 6,300,099, SIedziewski et al). Desafortunadamente, la proximidad de la proteasa para la proteína debería resultar en la destrucción de la proteína.
El uso de las proteínas knobs resuelve el problema porque al usar la estrategia para unir una knob a una proteína como se describe en este documento, la proteasa puede mantenerse en una posición que la hace capaz de catalizar la penetración de un sustrato deseado, tal como un receptor. Una proteasa puede tratarse en hCG usando los métodos descritos en este documento de manera que la proteasa penetraría el receptor L H d e p referencia en c ualquier otra p roteína, resultando en una pérdida de la actividad lutropina. Esta knob de la proteína proteasa puede usarse en una manera terapéuticamente deseable para tratar el síndrome de ovario policístico, una causa de casi un tercio de toda la infertilidad humana.
En otra modalidad de la invención, las composiciones y los métodos de esta invención pueden usarse para promover la asociación estable de dos proteínas. Los datos proporcionados en este documento muestran los análogos de las proteínas reticuladas de hCG que son mucho más estables que las hCG naturales en un pH bajo. La introducción de los bisulfuros intersubunidades en la hCG incrementa la estabilidad del heterodímero, (Matzuk, M. M. & Boime, I. (1988) J. Cell Biol. 106, 1049-1059; Heikoop, J. C; van, den Boogaart; Mulders, J. W. Grootenhuis, P. D. (1997), Diseño basado en la estructura e Ingeniería de Proteínas de los enlaces del bisulfuro de la intersubunidad en las gonadotropinas, Nature Biotechnology 15: 658-662. Previamente, los enlaces de bisulfuro de las intersubunidades se han introducido en la proteína basada en su estructura cristal. La presente invención describe métodos para introducir los bisulfuros de intersubunidades en dos proteínas durante su síntesis cuando una estructura de alta resolución no está disponible.
En otra modalidad de la invención, las composiciones y los métodos pueden usarse para promover la asociación estable de la polimerasa ADN para el ADN. La introducción de un enlazante que se envuelve alrededor del ADN y se estabiliza para la polimerasa mediante un enlace de bisulfuro que se esperaría que estabilizara la polimerasa para el ADN, por lo tanto incrementando la longitud de la transcripción resultante.
En aún otra modalidad de la invención, las composiciones y los métodos de la invención pueden usarse para producir los heterodímeros de las proteínas de las hormonas glicoproteínas que carecen de uno o más de sus oligosacáridos. La eliminación de la señal de glicosilación en la espiral 2 de la subunidad a de hCG reduce la habilidad de las células de mamíferos de secretar el heterodímero y para provocar una respuesta biológica (Eínstein, M., Un., W., Macdonald G. J. & Moyle, W. R. (2001) Exp. Biol. Med. 226, 581-590; Slaughter, S. Wang, Y. H. Myers, R. V & Moyle, W. R. (1995) Mol. Cell. Endocrinol. 112, 21-25; Yen, S.S.C., Llerena O., Litíle, B. & Pearson, O. H. (1998) J. Clin. Endocrinol. Metab. 28, 1763-1767; Matzuk, M. M. Boime, I., (1989), La mutagénesis y transferencia de genes definen los roles en sitios específicos de los oligosacáridos de gonadotropina, Biol. Reprod. 40: 48-53). Como se muestra en este documento, la co-expresión de hCG S138C y ctN52C, un análogo de la subunidad a en el cual la cisteína se sustituye por el residuo de la subunidad a Asn52, producción habilitada de un heterodímero en cantidades comparables al hCG. Esta mutación de la subunidad eliminó su señal de glicosilación y conduce a un análogo hCG que tiene considerablemente mayor eficacia que un análogo de hCG en el cual el oligosacárido de la espiral 2 de la subunidad ce se ha eliminado por la digestión glicanasa.
En aún otra modalidad, se describen los métodos para usar las composiciones y métodos de esta invención promueven la formulación de los multímeros de proteínas en los cuales las subunidades tienen poca o no tienen afinidad una por otra. Por ejemplo, los datos proporcionados en la Figura 6 ilustran que es posible atacar la enzima ß-lactamasa para hCG en uno de varios sitios diferentes. La ß-lactamasa no se conoce por asociarse con hCG. Mediante introducir un sitio de penetración de proteasa, entre la subunidad ß hCG y la cisteína en el cinturón de seguridad, este penetra el término carboxi de la s ubunidad ß , sería posible p reparar h eterotrímeros en los cuales la ß-lactamasa u otras proteínas se unen establemente cerca de cualquier sitio en hCG.
En otra modalidad, la cisteína en la knob puede moverse a un sitio en la superficie de la porción knob. Esto permitiría la unión directa de la knob a la proteína en una orientación y sitio deseados en la proteína.
En otra modalidad, los métodos de esta invención pueden emplearse para marcar las proteínas con marcas epítopes. Las marcas epítopes comúnmente se unen a las proteínas para facilitar la detección de las interacciones proteína-macromoleculares o proteína-proteína. En el pasado, las marcas epítopes se unen al extremo aminoterminal o carboxiterminal de la proteína. Sin embargo, muchas marcas epítopes trabajan solamente en un extremo de la proteína. Por lo tanto, la utilidad de las marcas epítopes agregadas a los extremos de las proteínas se disminuye considerablemente cuando los extremos de una proteína se involucran en la función de la proteína. Los métodos de esta invención permiten la localización de las marcas epítope en otros sitios diferentes a los extremos de la proteína, suministrando las marcas epítope lejanas más útiles. Introducción de un sitio de penetración en la porción de cola libraría el extremo de la proteína sin interrumpir la marca epítope.
En otra modalidad de la invención, los residuos aldehido pueden introducirse en los sitios específicos en las proteínas. Los aldehidos son grupos reactivos muy deseables que no se encuentran normalmente en las proteínas y pueden u sarse p ara u nir varios reactivos d iferentes tales como fluoroforas para la superficie de la proteína. Este procedimiento toma ventaja de la reactividad bien conocida de los residuos de treonina o serina aminoterminal para la oxidación suave del periodato (Yoo, J., Ji, I. & Ji, T. H. (1991 ) J. Biol. Chem. 266, 17741-17743; Geoghegan K. F.; Stroh, J. G., (1992) Conjugación en sitio dirigida de los grupos no péptidos a péptidos y proteínas vía oxidación del periodato de un alcohol 2-amino. Aplicación para la modificación en la serina N-terminal. Bioconjug. Chem. 3:138-146). Además, un residuo de serina puede introducirse inmediatamente después de un sitio de penetración de la enzima en una proteína. Por ejemplo, un sitio reconocido por la enterocinasa puede introducir inmediatamente un aminoterminal a una serina, que podría ser un aminoterminal de la cisteína para usarse para reticular la knob para la cisteína blanco en el sitio a marcarse. Esto resultaría en la secuencia XrAsp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ym-Cys-Zn, (SEC ID NO:56) en donde X, Y y Z se refieren a cualquier aminoácido de la porción de cola y I, m y n se refieren a las longitudes de los aminoácidos de la porción de cola. La producción de la proteína resultaría en la cisteína en la porción de cola llegando a reticularse al sitio deseado en la proteína que se ha cambiado a la cisteína. La penetración con enterocinasa resultaría en la creación de una serina aminoterminal que es rápidamente oxidada por el tratamiento de periodato ligero. El aldehido que se produce puede reaccionarse rápidamente con cualquier variedad de compuestos d erivados d e I a h idracida i ncluyendo varias fluoroforas y biotina. Este método sería especialmente útil en las proteínas que no contienen cisteínas no enlazadas.
En aún otra modalidad, se describen los métodos para usar las c omposiciones d e esta invención bloquean sitios específicos en las proteínas. Por ejemplo, sería deseable bloquear el sitio activo de una enzima o una toxina que tiene el potencial para matar las células hasta que se desea su actividad. La terapia contra el cáncer puede tener un área excelente para usar las composiciones y métodos de esta invención. Además, una cisteína podría introducirse en la enzima o toxina en un sitio cercano al sitio activo de la enzima o toxina. La adición de una knob que contiene una cisteína para el extremo aminoterminal o carboxiterminal de la proteína que tiene la habilidad para formar un bisulfuro con la cisteína cercana al sitio activo causaría que la knob previniera al sitio activo de interactuar con su blanco. La knob puede comprender u na p roteína blanco enfocada en el extremo de la porción de cola que habilitaría al complejo de proteína blanco-toxina/enzima para reducirse con un blanco específico en la superficie de una célula. El tratamiento del complejo con una proteasa que penetra la porción de cola expondría el sitio activo de la enzima o toxina. Esta estrategia podría usarse para esconder la actividad de una enzima o toxina hasta que reacciona en un sitio que contiene una enzima que penetra la porción de cola, por lo tanto exponiendo la toxina. Por ejemplo, esto podría ocurrir después de la internalización del complejo dentro de la célula.
Otro uso d e u na k nob p odría p revenir a sociaciones i ndeseables e ntre I as p roteínas q ue normalmente hacen un complejo una con otra. Además, el bisulfido se diseñaría para mantener la knob en una posición en la inferíase entre las dos proteínas.
En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un método para la separación precisa de una proteína blanco con solo pocas etapas. Empleando los documentos descritos en este documento, se crea una construcción de expresión que codifica la proteína de interés, una porción de cola y una knob. La ubicación del residuo de la cisteína blanco en la proteína de interés puede estar en el extremo carboxiterminal, el extremo aminoterminal o en cualquier ubicación deseada en la superficie de la proteína de interés. Una vez que la cisteína de acoplamiento en la knob enlaza a la cisteína en la proteína deseada después de la expresión de construcción, el complejo knob-proteína resultante se corre a través de una columna. Con la selección apropiada de una knob de enlace ajustado, el complejo knob-proteína se enlaza a la resina de afinidad y las proteínas no e nlazadas y I os c omponentes c elulares se d esaparecen. E ntonces, e I c omplejo s e eluye, la knob se penetra y solamente permanece l a p roteína p urificada. Por ejemplo, e l vector pCAL (Afinidad de Strategene™) puede usarse y el péptido de enlace de calmodulin puede seleccionarse como la knob. La knob CBP se enlaza a la resina de calmodulin y puede eluirse con EDTA 2 m en un pH neutral, además evitando las condiciones de elusión severa que pueden desnaturalizar las proteínas. Sin embargo, existen muchas combinaciones de knob y vector posibles que pueden usase con la presente invención.
En un aspecto adicional de la invención relacionado con la purificación de proteínas, la proteína de interés puede construirse de manera que la proteína knob tiene una cola corta con un sitio de penetración. La cola de la knob deberá acortarse lo suficiente de manera que la knob no puede formar un enlace bisulfuro con la proteína por si misma. En cambio, la estructura de la proteína y la cola son tales que la knob es conductiva para formar un enlace bisulfuro con otra proteína. En solución, las proteínas con colas cortas se alinearían como una cadena de lechos, conectada por el enlace bisulfuro entre la cisteína en una primera knob de proteína y la cisteína en la porción de proteína de una segunda proteína. La knob de la segunda proteína entonces formaría un enlace bisulfuro con una cisteína en la porción proteína de una tercera proteína y así sucesivamente. La cadena resultante de proteínas puede correrse en un gradiente de sucrosa y centrifugarse, la cadena caería a la parte inferior del gradiente debido a su peso. Finalmente, para separar las cadenas de proteína de otro material pesado tal como membranas celulares lisadas, la capa inferior en donde las cadenas residen se trataría con una enzima específica para el sitio de penetración en la cola corta, resultando en proteínas individuales. La mezcla posteriormente se recentrifugaría. Las proteínas individuales permanecerían cerca de la parte superior del gradiente, permitiendo la fácil remoción y purificación. Esta cadena de proteínas también podría purificarse usando otros métodos descritos anteriormente y otros métodos conocidos en la técnica para purificación de proteínas.
En otro aspecto de esta invención, la proteína de interés puede construirse de manera que cada proteína knob interactúe con otras proteínas knob para formar una estructura como rejilla. Las colas deberán construirse de manera que la knob sea capaz de reaccionar con la cisteína en la porción de proteína similar a las colas en el método de cuerda de lechos. Las proteínas también pueden comprender colas y knobs en los extremos terminales de la proteína. La porción de proteína deberá comprender múltiples residuos de cisteína sustituía de manera que las knobs de más de una proteína separada p ueda formar enlaces de b isulfuro con l a p roteína. E l n úmero y ubicación de las cisternas sustituidas en la proteína knob tendría que determinarse por anticipado de la construcción usando un programa de modelación por computadora u otro método. En solución, las proteínas formarían una estructura como rejilla como una proteína simple que puede formar enlaces bisulfuro con más de una proteína. Esta matriz de proteínas knobs entonces podría purificarse mediante cualquiera de los métodos anteriores, teniendo en mente que el peso molecular mayor de la estructura sería un buen candidato para las técnicas de centrifugación.
En otra modalidad, la presente invención puede usarse para agregar cisteínas a las proteínas. Frecuentemente es deseable introducir c isteínas p ara tomar ventaja d e l a reactividad única de la cisteína para unir las proteínas a las superficies y para unir otras moléculas tales como las fluoroforas a la proteína que contiene la cisteína adicional. Muchas proteínas contienen cisteínas o bisulfuros, que hacen difícil usar la cisteína que se ha introducido en la molécula. Mediante introducir un triptofano dentro de la cola adyacente para la cisteína que se usa para reticular el knob a la cisteína que se ha introducido en el sitio de la proteína para modificarse, esta dificultad puede esquivarse. Debido a la diferencia en el espectro de la absorción del triptofano, tirosina y fenilalanina, la irradiación de la proteína con la luz en 295 nm señalará selectivamente los residuos de triptofano. Esto causará la interrupción del bisulfuro adyacente, fabricando el residuo de tiol en la cisteína reactiva deseada. La irridación en la presencia del grupo que se ha agregado a la proteína habilitaría la proteína que llega a marcarse en el sitio deseado, incluso en las proteínas que contienen varios otros bisulfuros. Mientras es concebible que otros bisulfuros cercanos a los residuos de triptofano también se harían reactivos, el hecho de que la mayoría de las proteínas contienen pocos triptofanos significa que esto no es comúnmente un problema.
En aún otra modalidad, la presente invención puede usarse para crear y obtener altas producciones de proteínas heterodiméricas. Cuando se crea una construcción de producción para la proteína knob, un dímero del heterodímero puede comprender la porción de proteína. Si el dímero de la porción de proteína no tiene una porción de cola de ocurrencia natural, una porción de cola puede fusionarse al dímero de la porción de proteína. La knob puede comprender el otro dímero del heterodímero. Bajo la expresión de la construcción, existe una probabilidad mayor que el heterodímero se formará debido a la porción de cola que conecta los dímeros y la capacidad de formar e l e nlace d e b ¡sulfuro. Este m étodo evita d e l a formación d el h omodímero e n d onde los dímeros de un heterodímero se co-expresan en la misma célula.
Ejemplo 1- Proteínas Knobs para Estudiar la Interacción hCG-LHR Se han descrito las fuentes de hCG y anticuerpos usados en estos estudios (Bernard, M.
P., Myers, R.V. & Moyle, W. R. (1998) Biochem. J. 335, 611-617; Moyle, W. R., Campbell, R. K., Rao, S.N. V., Ayad, N. G., Bernard, M.P., Han, Y, & Wang, Y. (1995) J. Biol. Chem. 270, 20020-20031 ; Mooyle, W. R., Matzuk, M. M., Campbell, R. K., Cogliani, E., Dean Emig, D. M., richevsky, A., Barnett, R. W. & Boime, I. (1990) J. Biol. Chem. 265, 8511-8518). Una construcción capaz de expresar hCG -S138C se preparó mediante mutagénesis de cassette entre el sitio Apal natural en el cADN hCG y un sitio BamHI que se ha tratado descendente del codón de terminación como se describió para el codón de la terminación (Campbell, R. K., Dean Emig, D. M. & Moyle, W. R. (1991) Proc. Natil. Acad. Sci. (USA) 88, 760-764; Campbell, R. K., Dean Emig. D. M. & Moyle, W. R. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 88, 760-764). Los vectores usados para expresar las substituciones de cisteína de la subunidad a también se prepararon como se describió (Xing, Y., Lin, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. Alternativamente los análogos coriogonadrotropina: implicaciones para la actividad biológica y cruzamiento de hormonas. Journal of Biological Chemistry, 2001). Las construcciones que codifican la subunidad a humana o los análogos de cisteína sustituidos se co-expresaron con la subunidad ß hCG o hCG -S138C en las células COS-7 como se describió (Campbell, R. K., Dean Emig, D. M. & Moyle, W. R. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 88, 760-764). Los materiales secretados dentro de los medios de cultivo se probaron mediante inmunopruebas de intercalación (Moyle, W. R., Ehrlich, P. H. & Canfield, R. E. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 79, 2245-2249) empleando un anticuerpo A113 de la subunidad oc para la captura y radiomarcación del anticuerpo B110 de la subunidad ß para detección. También como se describe fueron tratados en el pH ácido para promover la disociación de I os h eterodímeros q ue carecen de una reticulación de bisulfuro (Xing, Y., Lin, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M. P. & Moyle.W. R. Alternativamente los análogos coriogonatropina cruzados: Implicaciones para el cruzamiento de hormonas y la actividad biológica.
Journal of Biological Chemistry. 2001). Células de hámster chino (células CHO) que sobre-expresan el LHR de ratas se usaron para monitorear la influencia de los análogos en la habilidad de 1251-hCG para u nir el enlace L HR y para eluir l a acumulación A MP cíclica como s e reportó previamente (Bemard, M. P., Myers, R. V. & Moyle, W. R. (1998) Biochem. J. 335, 611-617; Moyle, W. R., Matzuk, M. M. Campbell, R. K. Cogliani, E., Dean Emig, D. ., Krichevsky, A. Barnett, R. W. & Boime, I. (1990) J. Biol. Chem. 265, 8511-8518; Moyle, W. R., Campbell, R. ., Myers, R. V., Bernard, M. P., Han, Y. & Wang, X. (1994) Nature 368, 251-255).
Un avance alterno para descifrar las interacciones hCG-LHR involucra las superficies de identificación de la hormona que permanece expuesta en el complejo del receptor-hormona (Moyle, W. R. Matzuk, M. M., Campbell, R. K., Cogliani, E., Dean Emig, D. M., Krichevsky, A., Barnett, R. W. & Boime, I. 81990) J. Biol. Chem. 265, 85 -8518). A través de un proceso de eliminación, las áreas que permanecen expuestas en el complejo receptor-hormona posteriormente se mapean en la superficie de la hormona para revelar los sitios capaces de contactar el receptor. Dado que estos datos se colectan durante los estudios en los cuales la hormona retiene su habilidad para interactuar con los receptores, los datos se interpretan más rápidamente que aquellos dependientes en los cambios en las interacciones del receptor de hormonas. La mayoría de los métodos para detectar los residuos de no contacto han confiado en el uso de sondas de anticuerpos monoclonales, un procedimiento que es severamente limitado en la resolución. Para esquivar esta limitación, se midieron las actividades de los análogos en los cuales el cinturón de seguridad se cerró en la subunidad (Xing, Y. Lin, W., Jiang, M., Myers, R.V., Cao, D., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. Alternativamente análogos de coriogonadotropina cruzados: implicaciones para el cruzamiento de hormonas y la actividad biológica. Journal of Biological Chemistry. 2001). Varios de éstos análogos tienen esencialmente la misma actividad como hCG, incluso aquellos que contienen partes del cinturón de seguridad y el término carboxi de la subunidad ß unido a las áreas que se esperaría bloquearan la interacción del receptor de hormonas. La unión del cinturón de seguridad para la subunidad a tiene el potencial para alterar la conformación del heterodímero, un fenómeno que puede haber sido responsable de la baja actividad de algunos análogos.
Recientemente, se encontró que el extremo carboxiterminal grande desordenado de la subunidad ß fue suficientemente móvil para analizar mucha de la superficie del heterodímero hasta que se introdujo una cisteína en el residuo 138 formó un bisulfuro con la cisteína introducida en la subunidad- . Los cinturones de seguridad de éstos análogos se sujetaron como ellos estaban en hCG, haciendo menos probable que la mutación altere la conformación del heterodímero. Como se describe en este documento, muchos de estos análogos hCG, som mucho más activos que aquellos en los cuales el cinturón de seguridad se ha unido a la subunidad-ß. Los resultados de los estudios realizados también mostraron que mucho de la espiral 2 de la subunidad a hCG, u na porción de la hormona como para estar cerca de la interfase del receptor, no contacta el LHR. Se compararon las actividades de los análogos hCG antes y después de que una porción del término carboxi de la subunidad ß desordenada se ha atado a las cisteínas introducidas en la espiral 2 y el término carboxi de la subunidad a por un bisulfuro (Ver las Figuras 2 y 3). Excepto para los análogos con las cisteínas en la punta de la espiral 2, los heterodímeros que carecen de reticulación tienen al menos 25% de la actividad de hCG en el enlace LHR y las pruebas de señalización. Esto sugiere que pocos residuos en su región contribuyen más que a una fracción de la energía de enlace hCG-LHR total y tiene conflictos con los reportes de esos residuos carboxiterminal que son esenciales para la eficacia. La unión de la sonda del término carboxi de la subunidad ß a la superficie de la espiral 2 de la subunidad que confronta las espirales 1 y 3 de la las espirales de la subunidad ß tienen influencia relativamente pequeña en la unión o señalización indicando esta porción de la hormona probablemente para contactar el receptor. La pérdida de la actividad causada por la unión del término carboxi de la subunidad ß para otros residuos puede indicar estas porciones de la subunidad oc que están cerca del receptor. La aplicación de este procedimiento a I estudio de las interacciones hFSH con el receptor FSH reveló que los enlaces hFSH enlazan al receptor FSH en una forma similar total pero que diferentes partes del hFSH hacen que el receptor los contacte. La aplicación de este procedimiento al estudio de un ligando hCG-hFSH quimérico que tiene la habilidad de interactuar con ambos receptores LH y FSH conformaron estas observaciones. Además, las porciones diferentes de la quimera se encontraron para estar más cerca del LHR que el FSHR. Las estrategias de mutagénesis similares deberían ser útiles para identificar las superficies de otras proteínas que no participan en los contactos proteína-proteína.
Los estudios descritos en este documento también ¡lustran la aplicación de este procedimiento para identificar el sitio de enlace de hFSH para el receptor FSH y para comparar las interacciones de un análogo bifuncional hCG/hFSH con ambos receptores FSH. Un análogo hFSH de la subunidad ß que codifica una porción de los residuos del término carboxi de la subunidad ß hCG (fqdsssskapppslpspsripgpstdpilpg, SEC ID No: 55) en su término carboxi de la subunidad ß se preparó dado que hFSH no tiene un "cinturón de seguridad" (porción de cola) (Figura 8, SEC ID NO: 41). Similar a los estudios realizados con hCG en los cuales el residuo 138 se reemplazó con cisteína, el residuo serina 132 del análogo de la subunidad ß hFSH se reemplazó con una cisteína (Figura 8, SEC ID NO: 42). El análogo S132C de la subunidad ß hFSH posteriormente se expresó con varios análogos de la subunidad que contienen una cisteína substituida. Como se esperaba con base en la experiencia con los análogos hCG similares, la subunidad ß del análogo hFSH llegó a reticularse con la subunidad a mediante un bisulfuro como se evidencia por el hecho de que el heterodímero es mucho más estable en un pH bajo que fue hFSH natural. Muchos de estos análogos que tienen actividades altas en las pruebas del receptor hFSH (Figura 13). Varias diferencias se detectaron en las actividades de los análogos FSH-derivados comparadas con aquellas de los análogos hCG derivados. Estas diferencias revelan que el FSH interactuó con el receptor FSH a diferencia que el hCG interactuó con el receptor LH por lo tanto habilitando la construcción de los modelos de cada complejo receptor-hormona. Los resultados también indican que la secuencia del término carboxi de la subunidad ß hCG puede usarse como la "porción de cola" para agregar una knob a la superficie de una proteína que carece de un sitio apropiado para la "porción de cola" para hacerlo. Un experto en la técnica reconocerá que muchas secuencias más que el término carboxi de la subunidad ß hCG podrían usarse para llevar a cabo la misma tarea. Una secuencia de "porción de cola" requiere ambas de manera que la secuencia sea lo suficientemente larga para que la cisteína en la porción de cola pueda alcanzar la cisteína en la superficie de la proteína para la cual esta se unió y que la secuencia que no contiene residuos la prevenga de no alcanzar la cisteína en la superficie de la proteína. Los residuos que prevendrían a la cisteína en la porción d e c ola d e a lcanzar I a c isteína e n I a s uperficie d e I a p roteína i ncluyen residuos que causarían que la secuencia se doble en un dominio separado que podría secuenciar la cisteína en la porción de cola, los residuos tales como aquellos que contienen una señal para la proteína para que llegue a adherirse a una membrana celular por lo tanto secuenciando la cisteína, los residuos que contienen una señal para que la proteína se una a otra proteína por lo tanto secuenciando la cisteína o los residuos que están altamente cargados que bloquean las interacciones entre la superficie de la proteína.
Los análogos bifuncionales de las hormonas glicoproteína pueden prepararse mediante intercambiar las partes de sus cinturones de seguridad. (Patente Norteamericana No. 5,508,261 , Moyle et al.). Para además distinguir las diferencias en las interacciones de lutropinas, tales como hCG con el receptor LH y las folitropinas, tales como hFSH con el receptor FSH, se preparó un análogo de hCG que es conocido or e nlazar a mbos receptores L H y F SH. Los residuos d e l a subunidad ß hCG 101-114 se reemplazaron con sus contrapartes de la subunidad ß hFSH, a saber los residuos de la subunidad ß hFSH 95-108 (Figura 8, SEC ID NO: 38). Como se hizo anteriormente en el caso de los análogos hCG y hFSH, el residuo de serina 138 (ver la Figura 8, SEC ID NO: 39) en el término carboxi de la subunidad ß de este análogo se reemplaza con cisteína (Figura 8, SEC ID NO: 39). La construcción se expresó en las células COS-7 con varios análogos de la subunidad que contienen una cisteína sustituida. Los heterodímeros que se produjeron en las células COS-7 se cuantificaron usando una inmunoprueba de intercalación empleando anticuerpos para las subunidades a y ß de hCG. Muchos se encontraron reticulados por un bisulfuro entre las subunidades y ß en la base de su estabilidad incrementada en un pH bajo. Algunos de los análogos tienen interacciones significativamente diferentes con los receptores LH y FSH. Por ejemplo, el análogo en el cual el término carboxi de la subunidad ß se retículo a la cisteína 37 del residuo de la subunidad a bien interactuado con los receptores LH y pobremente con los receptores FSH (Figuras 12-14). Esto confirmó el hallazgo de que las interacciones con los receptores LH difirieron significativamente de aquellos de hFSH con los receptores FSH y proporcionaron considerable soporte adicional para los modelos por los cuales cada una de éstas hormonas interactúan con sus receptores.
Resultados Análogos de la Subunidad a hCG y la Subunidad ß hCG Natural o hCG -S138C Las células COS-7 que fueron co-transferidas con los vectores que codifican la mayoría de los análogos de la subunidad y la subunidad ß natural (Tabla 1) o hCGp-S138C (Tabla 2) fueron capaces de ensamblar el heterodímero y secretarlo dentro del medio de cultivo. Los heterodímeros pobremente secretados o no en todos aquellos incluidos que contienen los análogos de la subunidad a y la subunidad ß e n e l cual u na c isteína s e h a s ustituido p ara l os residuos Tyr37, Pro40, Asn52 e Y89C (Tabla 1). La pobre secreción de ?520/ß puede reflejar la ausencia de la señal de glicosilación N-unida normalmente encontrada en esta posición de hCG que se requiere para l a s ecreción eficiente d el h eterodímero ( Matzuk, M . . & B oime, 1 . ( 1988) J . Cell Biol. 106, 1049-1059).
Tabla 1. Producción de los heterodímeros por las células COS-7 transferidas con las construcciones de la subunidad indicada
La mayoría de los análogos de la subunidad a probados se detectaron en los heterodímeros q ue contienen h CGp-S138C (Tabla 2 ). El hCGp rescató la formación de algunos análogos que se secretaron pobremente cuando se expresaron con la subunidad ß natural, incluyendo Tyr37, Pro40 y Asn52 pero no Tyr89 (Tabla 2, Figura 1). Muchos de estos heterodímeros en la Tabla 2 parecen que contienen una reticulación intersubunidad porque ellos se detectaron rápidamente siguiendo un breve tratamiento en un pH bajo. Los heterodímeros que contienen los análogos de la subunidad natural o la aG22C y aV53C se destruyeron en un pH bajo sugiriendo que carecen de un bisulfuro intersubunidad. Sin embargo, solamente una fracción de los heterodímeros que contienen los análogos de la subunidad a, aQ5C, aQ27C, P40C, aK51C, aL41C, aM71C y aV76C parecen estabilizarse mediante bisulfuros intersubunidad. Las cisteínas en los análogos de la subunidad ce de los análogos que forman pocos o ningún heterodímero reticulado están en la interfase de la subunidad o están lejos del residuo Asp111 de la subunidad ß, el primer residuo en la extensión carboxiterminal en la subunidad ß. Consecuentemente, el residuo 138 de la subunidad ß parece que se ha prevenido de alcanzar estas cisteínas de la subunidad-ct. Este fenómeno sugiere que la mayoría de las reticulaciones del bisulfuro de la intersubunidad formadas después de que las subunidades se han ensamblado en un heterodímero similar en estructura para el hCG. Solamente el análogo de la subunidad a probó que falla para formar un heterodímero con la subunidad ß hCG o G??Tß-31380 contuvo una cisteína en lugar de Tyr89. Mientras esta tirosina no es esencial para el plegado de la subunidad porque puede omitirse o cambiarse a los residuos con excepción de la cisteína sin la interrupción de la formación del heterodímero (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495), reemplazando la tirosina con una cisteína que puede interrumpirse plegando la subunidad a (Chen, F., Wang, Y. & Pret, D. (1992) Mol. Endocrino!. 6, 914-919).
Tabla 2. Construcciones de la subunidad indicada y hCG -S138C
a) Este valor se calcula como el porcentaje del material que permanece en la muestra siguiendo al tratamiento en un pH ácido como se describe en el texto. b) Este valor se calcula como la proporción de la actividad determinada en las pruebas de intercalación empleando A113 y 125I-B110 después de un tratamiento con pH bajo. La detección de cualquier enlace B111 indica que el cinturón de seguridad se sujetó. Los valores bajos observados en algunos casos pueden reflejar una influencia esférica del término carboxi de la subunidad ß en la habilidad de B111 para interactuar con el heterodímero reticulado.
La sustitución de la cisteína con muchos residuos de la subunidad a en el espiral 2 solamente tiene una pequeña influencia en las actividades de transducción de señales y el enlace del receptor de hCG (Tabla 3, Figura 2). El reemplazo de os residuos de la subunidad-a aMet47 (Tabla 3, Fig. 2) y aLys51 (Einstein , M., Lin, W„ W„ Macdonald, G. J. & Moyle, W.R. (2001 ) Exp. Biol. Med. 226, 581-590) con l a c isteína redujo la actividad del heterodímero en las pruebas de señalamiento y enlace relativas a aquella de hCG. Mientras que un análogo en el cual al_ys51 se ha reemplazado por alanina también tiene considerablemente menos actividad que hCG (Einstein, M., Lin., W., Macdonald, G. J. & Moyle, W. R. (2001 ) Exp. Biol. Med. 226, 581-590), hCG-ccM47A, un análogo en el cual aMet47 se ha reemplazado previamente por alanina estuvo cercanamente como activo como el hCG en ambas pruebas (Tabla 3). Esto sugiere que la presencia de una metionina en el residuo 47 de la subunidad a no fue esencial para la actividad hCG. El rol específico de aLys51 en la interacción del receptor permanece para determinarse. Con base en el hallazgo de que un heterodímero en el cual el residuo 51 de la subunidad a se retícula para el residuo 99 de la subunidad ß por un bisulfuro es más activo que aquellos en los cuales otLys51 se reemplaza por cisteína o alanina, parece comúnmente que el reemplazo de la cadena lateral aLys51 puede alterar la conformación del heterodímero.
Tabla 3. Influencia de las mutaciones en la espiral 2 de la subunidad a y el término carboxi en la actividad lutropina del heterodímero.
) Con base en la concentración del análogo determinado por la inmunoprueba de intercalación.
Estos valores se calcularon de los valores IC50 a p artir d e l os experimentos resumidos. Varios análogos se probaron en estas pruebas debido al hecho de que solamente pequeñas cantidades se produjeron por las células COS-7 transfectadas. También como se muestra en la Tabla 1 , no se obtuvo ningún heterodímero estable siguiendo el tratamiento ácido de a/hCGp-S138C.
El cambio del residuo aLys44 de la espiral 2 de la subunidad ce para la alanina se ha reportado que reduce la actividad hCG 100 veces o más (Xia, H., Chen, F. & Pret, D. (1994) Endocrinol. 134, 1768-1770). Además, el hallazgo de reemplazar al_ys44 y varios residuos cercanos a la subunidad oc con la cisteína tuvieron mucho menos influencia en la actividad hCG que la esperada (Tabla 3). Durante la parte de un estudio no relatado para probar las predicciones hechas acerca de la carga en la extremidad de la espiral 2 de la subunidad a en la combinación de la subunidad (Slaughter, S., Wang, Y. H., Myers, R. V. & Moyle, W. R. (1995) Mol. Cell. Endocrinol. 112, 21-25), se preparó un análogo hCG que contuvo glutamato y glutamina en lugar de las lisinas en los residuos 44 y 45, respectivamente (hCG-a 44E, K45Q) (Figura 15, SEC ID NO: 52). Inesperadamente, este análogo tiene alta actividad en ambas pruebas como en hCG-c¡ 44A (Figura 15, SEC ID NO: 51 ) y hCG-aK44R (Figura 15, SEC ID NO: 53), los análogos que tuvieron la alanina y la arginlna en lugar de aLys44 (Tabla 3, Fig. 19). La alta actividad del último análogo se esperaba con base al hecho de que la subunidad aequina tiene esta misma sustitución (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495; Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495). Estos estudios fueron consistentes con las observaciones hechas mediante el reemplazo de estos residuos con cisteína. Estas observaciones fueron contrarias a los primeros hallazgos (Xia, H., Chen, F. & Puett, D. (1994) Endocrinol. 134, 1768-1770, sugiriendo que los residuos de lisina positivamente cargados altamente conservados en la hélice pequeña que se encontraron en la espiral 2 de la subunidad fueron esencialmente para las interacciones LHR.
Eliminación de pCys26 Se encontró que pCysl 10, la cisteína que sujeta el extremo carboxiterminal del cinturón de seguridad para el centro de la subunidad ß, puede llegar a reticular a la cisteína que se introdujo en muchos de estos análogos de la subunidad si el pCys110 se previene de formar un bisulfuro con el residuo 26 de la subunidad ß (Xing, Y. Lin, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. Alternativamente los análogos coriogonadotropina plegados: implicaciones para el cruzamiento de hormonas y la actividad biológica. Journal of Biological Chemistry 50, 46953-46960, 2001). Este hallazgo cambió la posición del cinturón de seguridad y eliminó el epítope para el anticuerpo B111. Para aprender si los cinturones de seguridad de estos análogos de reticulación se unieron a Cys26, sus habilidades se reconocieron por el anticuerpo B111 y por B110 se compararon, un anticuerpo que reconoce un epítope diferente de la subunidad-ß. Como se muestra en la Tabla 2, cada heterodímero reticulado se reconoció por B111 , aunque no siempre así como B110, una observación que sugiere que el cinturón de seguridad fue sujetado a ??326 en la misma manera como está en hCG. Mientras que no se puede excluir la posibilidad que el $Cys 110 se sujetó a la cisteína que se ha introducido en la subunidad a de algunos análogos, esto parece altamente inverosímil por dos razones. Primero, todas las subunidades ß usadas en estos estudios contienen una cisteína en el residuo 26. La eliminación de esta cisteína en el residuo 26 se requiere para causar que el cinturón de seguridad llegue a reticularse a una cisteína introducida dentro de la subunidad a a pesare de su ubicación (Xing, Y., Un, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M.P. & Moyle, W. R. Alternativamente los análogos coriogonadotropina plegados: implicaciones del cruzamiento de hormonas y actividad biológica. Journal of Biological Chemistry. 2001 ). Y segundo, la ubicación de la cisteína de la subunidad a en los análogos reticulados que se reconocieron al menos por B 11 (aY37C, ctP40C, aL41C, aR42C y ccT86C) es el más cerca del sitio de enlace B111 (Figura 1). Esto sugiere que la reticulación puede tener posición estabilizada del término carboxi de la subunidad ß de estos análogos en una posición que interfiere con el acceso de B111 para el heterodímero.
Extremo Carboxiterminal de la Subunidad a El extremo carboxiterminal de la subunidad a se piensa que es esencial para las interacciones LHR (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981 ) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495; Yen, S. C, Llerena, O., Little, B. & Pearson, O. H. (1968) J. Clin. Endocrinol. Metab. 28, 1763-1767). La presencia de las cisternas en el extremo carboxiterminal de la subunidad a también condujo a una reducción pequeña en la actividad del heterodímero (Tabla 3, Fig. 3) un fenómeno consistente con el rol putativo de esta porción de la hormona como un receptor de contacto (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981 ) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495; Chen, F., Wang, Y. & Puett, D. (1992) Mol. Endocrinol. 6, 914-919). Sin embargo, estos análogos fueron mucho más activos que un análogo que carece de cinco residuos carboxiterminal de la unidad a (Pierce, J. G. & Parsons, T. F.
(1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495), una indicación de que no solo el residuo en esta región es esencial para la actividad de la hormona y que cada uno hace solamente una contribución menor a la energía de enlace total de hCG para el LHR. Sorpresivamente se encontró que el heterodímero que contiene aK19C retuvo mucha de la eficacia de hCG (Fig. 3), dado que Lys91 se ha reportado que tiene un rol esencial en la transduccion de señales (Ybo, J., Ji, I. & Ji, T. H . (1991) J. Biol. Chem. 266, 17741-17743) debido a un contacto putativo que se hace con un residuo ácido aspártico en el dominio de transmembrana (Ji, I., Zeng, H. & Ji, T.H. (1993) J. Biol. Chem. 268, 22971-22974). El hallazgo de que hCG-aK91C retuvo eficacia substancial es inconsciente con este propósito. Como un resultado, hCG-ocK91E y hCG-aK91M se prepararon y sus actividades se probaron. Se ha reportado que estos análogos tienen eficacia muy baja (Yoo, J., Ji, L, & Ji, T. H. (1991) J. Biol. Chem. 266, 17741-17743). Como se observa en la Figura 17, ambos análogos tienen eficacia sustancial, aunque el análogo que contiene el glutamato interactuado con LHR con afinidad aproximadamente 10 veces más baja que hCG. Esta observación es consistente con las observaciones hechas cuando aLys91 se convirtió a la cisterna (Tabla 3, Fig. 3) y puede indicar que este residuo de lisina no es tan importante para la transduccion de señales como se ha reportado (Yoo, J., Ji, I. & Ji, T. H. (1991) J. Biol. Chem. 266, 17741-17743).
Término carboxi de la Espiral 2 de la Subunidad ß y la Subunidad a Muchos de los análogos de ácido estables en los cuales el término carboxi de la subunidad a se retículo para los residuos en la espiral 2 de la subunidad a tuvieron actividades considerables en el enlace del receptor y las pruebas de transducción de señales (Tabla 3, Figura 4). Estas incluyen aquellas en las cuales se unió a los residuos 35, 37, 40, 44, 42, 45, 50 y 52 de la espiral 2 de la subunidad (Tabla 3). El enlace del término carboxi de la subunidad ß al residuo 47 de la espiral 2 de la subunidad abolió cercanamente la actividad de enlace del receptor y lo acopló al residuo 43 y el 46 redujo la actividad del heterodímero por la mitad. Las cadenas laterales de los residuos de la espiral 2 de la subunidad-a, en casi todos los análogos más activos se proyectaron hacia las espirales 1 y 3 de la subunidad-ß. Esto sugiere que la superficie de la espiral 2 de la subunidad que confronta a las espirales 1 y 3 de la subunidad ß no contacta el LHR. Las cadenas laterales de los residuos 43 y 40 d e la s ubunidad se p royectan h acia e 1 c inturón d e seguridad y tal del residuo 47 confronta la espiral del cinturón de seguridad pequeño formado por el bisulfuro entre Cys93 y CysIOO. Por lo tanto, la pérdida en la actividad causada por la reticulación d e I a p orción c arboxiterminal dé la s ubunidad ß a e stos s itios p uede i nterrumpir las interacciones entre estas porciones de la espiral 2 de la subunidad a con el receptor o alterar la conformación de la espiral 2 de la subunidad en una forma que reduce la habilidad de la hormona para interactuar con el receptor.
Esta longitud del término carboxi de la subunidad ß sugiere que el residuo 138 podría unirse a los residuos en la espiral 2 de la subunidad a sobre las espirales 1 y 3 de la subunidad ß (Figura 1). Además, la porción carboxiterminal de la subunidad ß no debería ocupar el espacio en el canal entre la espiral 2 de la subunidad a y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß en cualquiera de estos análogos. Para estudiar las actividades de los análogos en los cuales esta porción de la porción carboxiterminal de la subunidad ß ocupa este canal, se prepararon los análogos que carecen de los residuos 116-135 de la subunidad ß y 121-135. En estos análogos, el término carboxi ß fu muy corto para formar una reticulación con los residuos de la subunidad a en la espiral 2 sin pasar a través de este canal de intersubunidad. Estos análogos tienen actividades sustanciales en el enlace LHR y las pruebas de señalización (Fig. 4) proporcionando soporte adicional para el concepto de que esta porción de la espiral 2 de la subunidad no contacta el LHR.
Espirales 1 y 3 de la Subunidad y la Subunidad ß Para aprender si el residuo 138 de la subunidad ß podría llegara a reticularse a otras porciones del centro de la subunidad a, hCG-ß S138C se expresó con varios análogos de la subunidad a que contienen una cisteína en lugar de un residuo en las espirales 1 ó 3. Con excepción del heterodímero que contiene una cisteína en lugar de ocSer64, solamente cantidades pequeñas de los heterodímeros resultantes se reticularon como se reveló por su baja estabilidad en el pH ácido (Tabla 2). Las cisternas de muchos de los análogos de la subunidad en estos heterodímeros se ubicaron mucho más lejos del extremo carboxiterminal del cinturón de seguridad de aquellos análogos que participan en las reticulaciones de la intersubunidad y pueden estar más allá del rango que es capaz de alcanzarse eficientemente por la región carboxiterminal de la subunidad ß (Figura 1 ). El heterodímero ocS64C/hCG- S138C tuvo actividad considerable en el enlace del receptor y las pruebas de señalización (Tabla 3), mostrando que este residuo de la subunidad a no hace contacto esencial con el LHR.
La reticulación del término carboxi de la subunidad ß para los residuos en el término carboxi de la subunidad a tuvo mucho mayor influencia en las interacciones del heterodímero con LHR que las sustituciones de las cisteínas en la subunidad (Figura 5). Esto sugirió que el término carboxi de la subunidad esta cerca de la interfase del receptor LH como se ha propuesto con base a los estudios realizados hace más de 25 años (Pierce, J. G. & Parsons, T. F. (1981) Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495). Sin embargo, es posible que se una el extremo carboxiterminal de la subunidad ß a esta región alterando la estructura del heterodímero o causa que el extremo de la subunidad ß pase cerca de otras porciones de la hormona que contacta el receptor.
Proteína Knobs - hCG- Lactamasa Estos estudios proporcionaron soporte considerable para la idea de que la mayoría de los residuos en la espiral 2 de la subunidad no participan en los contactos del receptor LH esencial. Sin embargo los estudios no excluyen la posibilidad que esta porción de la hormona está cerca de la interfase del receptor. Para dirigir este problema, se prepararon análogos hCB de la subunidad-ß en los cuales la lactamasa-ß, una proteína globular similar en tamaño a hCG, se unió a sitios específicos en la subunldad- . Esto se llevó a cabo mediante la fusión de la lactamasa ß para los residuos 140 y 145 de hCG- S138C para producir hCG^S138C^LA145, respectivamente. El último análogo tuvo un "espaciador" de siete residuos entre la cisterna que se retículo para la subunidad a y el término amino de la ß-lactamasa. La co-expresión de estos análogos de la subunidad ß con los análogos de la subunidad-cc, T46C, aL48C, ocS64C y S92C condujeron a la formación de los heterodímeros estables ácidos (Figura 6). Esto mostró que la presencia de la ß-lactamasa no previene al residuo 138 de la subunidad-ß de llegar a unirse a la subunidad- .
Estos análogos hCG-^-lactamasa tienen actividades biológicas mucho menores que los análogos correspondientes que carecen de ß-lactamasa (Figura 6).
En conjunción con los estudios anteriores designados para identificar las porciones de la subunidad que no están involucrados en los contactos clave del receptor (Xing, Y., Lin, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M.P. & Moyle, W. R. Alternativamente análogos coriogonadotropina plegados: implicaciones para el cruzamiento de hormonas y la actividad biológica. Journal of Biological Chemistry. 2001), estas observaciones expanden el conocimiento presente de las superficies de la hormona que no parecen contactar el LHR y sugieren que el canal entre la espiral 2 de la subunidad ce y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß no participan en los contactos del receptor clave (Xing, Y., Lin, W., Jiang, M., Myers, R. V., Cao, D., Bernard, M.P. & Moyle, W. R. Alternativamente los análogos coriogonadotropina plegados: implicaciones para el cruzamiento de hormonas y la actividad biológica. Journal of Biological Chemistry. 2001), estas observaciones expanden el conocimiento presente de las superficies de la hormona que no parecen contactar el LHR y sugieren que el canal entre la espiral 2 de la subunidad y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß no participan en los contactos del receptor LH esencial, un requerimiento d e u n p rimer m odelo (Moyle, W . R . Campbell, R . K., Rao, S . N. V., Ayad, N. G., Bernard, M. P., Han, Y. & Wang, Y. (1995) J. Biol. Chem. 270, 20020-20031). Desde luego, con base en las habilidades de los anticuerpos monoclonales para reconocer el hCG y los análogos hCG unidos al LHR en la superficie de las células (Wang, Y. H., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. (2000) Mol. Cell. Endocrinol. 170, 67-77) y las habilidades de las quimeras hCG/hFSH y hCG/hTSH para unir el LHR (Campbell, R. K., Dean Emig, D. M. & Moyle, W. R. (1991 Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 88, 760-764; Campbell, R. K., Berget, E. R., Wang, Y., Morris, J. C. & Moyle, W. R. (1997) Nature Biotech. 15, 439-443; Grossmann.M., Skudlinski, M. W., R., Dias, J. A. Ji, T. H. & Weintraub, B. D. (1997) J. Biol. Chem. 272, 15532-15540; oyle, W. R., Campbell, R. K., Myers, R. V., Bernard, M. P„ Han, Y. & Wang, X. (1994) Nature 368, 251-255), parece que pocos residuos hCG-específicos participan en los contactos LHR esenciales. Los residuos que tienen la mayor influencia en la actividad hCG se ubican en el cinturón de seguridad, pero incluso la mayoría de estos puede alterarse uno por uno sin interrumpir las interacciones de receptor-hormona más que pocas veces (Han, Y., Bernard, M. P. & Moyle, W. R. (1996) Mol. Cell. Endocrinol. 124, 151-161 ). Con base a estas observaciones, el hallazgo de que dos sitios distantes del receptor a parecen para influenciar las interacciones hCG-LHR Bernard, M. P., Myers, R. V. & Moyle, W. R. (1998) Biochem. J. 335, 611-617 y el hallazgo de que las interacciones de lutropina en mamíferos con el LHR humano son particularmente sensibles a pequeños cambios en la conformación de la hormona, se propone que las interacciones de las hormonas de glicoproteína y sus receptores no sean dominados por contactos relativamente pocos, tales como aquellos entre la hormona en crecimiento y su receptor (Claxon, T. & Wells, J. A. (1995) Science 267, 383-386; Wells, J. A. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 83, 1-6).
Ejemplo 2 - Proteínas Knobs para Estudiar la Reducción de hFSH para los Receptores FSH Se obtuvo una secuencia de codificación cADN para el hFSH de la subunidad ß de Chn'stie Kelton, Ares Advanced Technology, una división de Serano, 280 Pond Street, Randolph MA que corresponde a la porción traducida del mARN. La secuencia de aminoácidos de esta subunidad ß que carece del péptido líder se ilustra en (Figura 8, SEC ID NO: 40). El cADN hFSH se modificó mediante PCR y la mutagénesls de cassette para crear una construcción llamada FCI-??dß (Figura 8, SEC ID NO: 41 ) que codifica los residuos 1-108 hFSH y los residuos 115-145 hCG en tándem. La secuencia de aminoácidos de FCI-??dß que carece del péptido líder se encontró en la subunidad ß hFSH también se ilustra en la Figura 8. Un análogo de FCI- ?dß en el cual el residuo Ser132 se convirtió a Cys se preparó mediante reemplazar el fragmento Xhol-Apal de la construcción que codifica el ???s-51380ß con aquel de FCI-??dß para crear FC1-108, e?320ß (Figura 8, SEC ID NO: 42). El FC1-108, d1320ß se expresó con varios de los análogos de la subunidad ce mostrados en la Figura 7 en las células COS-7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los heterodímeros secretados por las células dentro del medio de cultivo se midieron usando los anticuerpos A113 y 25I-B603. El formador es un anticuerpo para la subunidad-a y el último es un anticuerpo monoclonal que enlaza a hFSH de la subunidad-ß. El hFSH purificado se usó como un estándar. Siguiendo el tratamiento ácido para disociar cualquier heterodímero no reticulado, el material se re-probó con A113 y 125I-B603 como se estableció anteriormente p ara determinar la cantidad de material reticulado en la muestra. Los análogos reticulados resultantes se probaron por sus habilidades pare elicitar la acumulación AMP cíclica en las células CHO que expresan los receptores FSH.
Como se muestra en la Figura 11 , la influencia de la knob en el residuo 35 de la subunidad a resultó en solamente un incremento modesto en la actividad de este análogo FSH. La adición de la knob para los residuos 92, 64, 48, 46, 42, 90, 43, 88 y 86 de la subunidad resultaron en una pérdida progresiva en la actividad del análogo. Esto mostró que el residuo 35 de la subunidad no está cerca de la inferíase del receptor FSH y que varios otros residuos parecen estar cerca de la inferíase del receptor. A pesar de las interacciones de hCg con el receptor LH, la presencia de una knob en los residuos 42 y 43 fueron mucho más inhibidora para el enlace del análogo FSH para su receptor. Esto reveló que la superficie de la parte de la espiral 2 de la subunidad a fue mucho más cercana al receptor FSH que para el receptor LH cuando FSH y hCG interactúan con sus receptores respectivos. El hallazgo de que la unión de una knob al residuo 86 de la subunidad de ambos receptores mostró que esta porción de ambos ligandos está cerca de la interfase del receptor.
Ejemplo 3 - Proteínas nobs para el Estudio de la Reducción de I a Q uimera h CG/hFSH Bifuncional para los receptores LH y FSH Una secuencia cADN que codifica una quimera en la cual los codones de la subunidad ß hCG para los aminoácidos 101-114 fue reemplazada con sus contrapartes de la subunidad ß hFSH se preparó mediante métodos estándares. La secuencia de aminoácidos de esta quimera llamada CFC101- 14p se mostró en la Figura 8 (SEC ID NO: 38) menos los residuos líderes. Un análogo de ??0101-114ß en el cual el residuo Ser138 se convirtió a Cys se preparó mediante reemplazar el fragmento Xhol-Apal de la construcción que codifica hCG-SÍ38C, se expresó con varios de los análogos de la subunidad a mostrados en la Figura 7 en las células COS-7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los heíerodímeros secretados por las células en el medio de cultivo se midieron usando los anticuerpos A113 y 125I-B110. El formador es un anticuerpo para la subunidad a y el último es un anticuerpo monoclonal que enlaza a la subunidad ß hCG. El hCG purificado se usó como un estándar. Siguiendo el tratamiento ácido para disociar cualquier heterodímero no reticulado, el material se re-probó con A1 3 y 125I-B110 como se describió anteriormente para determinar la concentración del material reticulado en la muestra. Los análogos reticulados resultantes se probaron por sus habilidades para inhibir el enlace de 2 l-hCG para las células CHO expresando los receptores LH y para inhibir el enlace de 125l-hFSH para las células CHO que expresan los receptores FSH (Figura 12). Ellos también se probaron por sus habilidades para elicitar la acumulación AMP cíclica en las células CHO que expresan los receptores LH y en las células CHO que expresan a los receptores FSH.
Como se observó en la Figura 12, la presencia de una knob en el residuo 35 de la subunidad a no interfiere con la habilidad de la quimera de bloquear el enlace del hCG radioionizado o hFSH radioionizado para los receptores LH o FSH, respectivamente relativos para una quimera bifuncional que carece de la mayoría del término carboxi de la subunidad ß hCG. Sin embargo l a p resencia de u na knob en el residuo 37 de la subunidad a conduce a un resultado dramáticamente diferente. Además, esta knob tiene muy poca influencia en la habilidad de la quimera para enlazar a los receptores LH pero casi eliminó su habilidad para enlazar a los receptores FSH. La presencia de una knob en los residuos de la subunidad a 43 y 46 redujo las habilidades de la quimera para enlazar a ambos receptores. Como se encontró para el enlace hCG a los receptores LH y el enlace hFSH a los receptores FSH, la presencia de la knob en estos sitios fue mucho más inhibidora para las interacciones del receptor LH. Esto mostró que estos residuos estuvieron mucho más cercanos a la inferíase del receptor FSH que para la inferíase del receptor LH. La presencia de la knob en los residuos 48 y 52 de la subunidad tuvo mucho menos influencia en las interacciones de la quimera con su receptor, indicando que estos residuos además están desde la interfase del receptor. Como se ha observado en los ejemplos 1 y 2, la presencia de una knob en el residuo 86 de la subunidad a fue muy inhibidora para el enlace de las quimeras a ambos receptores. Esto mostró que esta porción de la hormona esta cerca de la interfase de la quimera con ambos receptores. Un resultado similar se observó con la knob en el residuo 91 de la subunidad- .
Como puede observarse en las Figuras 13 y 14, la presencia de una knob reduce la actividad d e I a m ayoría d e I as q uimeras e n e I receptor L H y I as p ruebas d e transducción d é l a señal del receptor FSH. La cantidad de reducción difirió, sin embargo, dependiendo del receptor con el cual el análogo fue probado. Por ejemplo, la presencia de una knob en el residuo 37 de la subunidad fue mucho más inhibidora en el receptor FSH elicitado por la acumulación AMP cíclica que en el receptor LH mediado por la acumulación AMP cíclica. Completamente, la influencia relativa de las knobs en las habilidades de las quimeras para elicitar una respuesta celular fue similar a sus habilidades para afectar a las interacciones del receptor. Estos estudios condujeron a la c onclusión d e q ue I as i nteracciones d e I as I utropinas t ales c orno h CG c on I os r eceptores LH fueron rápidamente distinguidas de aquellas de las folitropinas tales como hFSH con los receptores FSH. Además, incluso aquellas lutropinas y folitropinas tienen estructuras muy similares e incluso aunque sus receptores son muy similares, la manera en la cual estos ligandos se encontró que interactúan con los receptores no fue idéntica. Este ejemplo ilustra el poder de usar las sondas de la presente invención en la identificación de las interacciones proteína-proteína.
Ejemplo 4: Knobs que tienen ß-lactamasa Los análogos que contienen las subunidades ß hCGp, S138C tuvieron knobs relativamente pequeñas que consisten de residuos que circundan a Ser138. Estos son suficientemente grandes para d etectar I as d istancias e ntre e 1 1 igando y s u r eceptor q ue son relativamente pequeñas. Sin embargo, estas knobs son muy pequeñas para ser útiles para detectar la proximidad de los residuos que además están desde el receptor. Esta limitación puede esquivarse mediante incrementar el tamaño de la sonda, como se hizo mediante agregar ß-lactamasa. La ß-lactamasa se seleccionó para usarse como una sonda porque su estructura de cristal se conoce y porque sus extremos carboxiterminal y aminoterminal están en la superficie de la proteína. Además, e s útil para genera las proteínas de fusión en el extremo de la hormona. Otra ventaja de la ß-lactamasa es que es una enzima con un alto número de reorganizaciones que penetran los substratos fluorescentes (Zlokarnik, G., Negulescu, P. A., Knapp, T. E., Mere, L. Burres, N., Feng, L., Whitney, M., Roemer, K. & Tsien, R. Y. (1998) Science 279, 84-88), un fenómeno que podría ser útil para la detección de la proteína de fusión. A este respecto, la ß-lactamasa se ha usado como un reportero eficiente (Moore, J. T., Davis, S. T. & Dev, I. K. (1997) Anal. Biochem. 247, 203-209), aunque en un muy diferente contexto que se contempla en este documento, la ß-lactamasa también se inhibe por una proteína que la enlaza (Strynadka, N. C: Jensen, S. E., Johns, K. Blanchard, H., Page, M., Matagne, A. Frere, J. M. & James, M. N. (1994) Nature 368, 657-660). Además, sería posible incrementar el tamaño de la knob ß-lactamasa simplemente mediante agregar el inhibidor.
Dos derivados de ??3ß, S138C se prepararon, los cuales contienen una proteína de fusión ß-lactamasa. Una, conocida como ??Tß, S138C-pLA (larga) (SEC ID NO: 44) o simplemente más LARGA, contiene ß-lactamasa fusionada al extremo carboxiterminal de ???Tß, S138C como se muestra en la Figura 15. Esta proteína se preparó mediante mutagénesis PCR usando pUC 8 como una plantilla. La otra sonda conocida como hCGp, S138C-pi_A(corta) (SEC ID NO: 43) o simplemente más CORTA, contiene ß-lactamasa fusionada a una versión truncada de ??T , S138C como se muestra en la Figura 15. La proteína CORTA tiene solamente un aminoácido entre la cisteína de acoplamiento y el inicio de la ß-lactamasa. Claramente, otras versiones de estos podrían fabricarse, en los cuales un número diferente de residuos se colocaron entre la cisteína de acoplamiento y la ß-lactamasa. También deberá reconocerse que un experto en la técnica de vaciamiento celular y biología molecular podrían diseñar y fraguar un análogo de la ß-lactamasa en la cual, un residuo de la superficie se reemplaza por una cisteína. Esta cisteína podría servir como la cisteína de acoplamiento, un fenómeno que podría mantener a la knob de la ß-lactamasa en una conexión más rígida para la cisteína blanco que posiblemente podría usarse como una cola.
Cinco diferentes heterodímeros ácidos estables se produjeron conteniendo las subunidades ß LARGA y CORTA. Estos se fabricaron para determinar la proximidad relativa de los residuos 46, 48, 52, 64 y 92 de la subunidad a para el receptor LH. Como se observa en la Figuras 16 y 17, ninguno de estos análogos fueron activos como el hCG. Los heterodímeros en los cuales las sondas knot de la subunidad ß LARGA y CORTA se acoplaron a) residuo 52 de la subunidad [es decir a?520+??06ß, S138C (LARGA) y a?520+??Tß, S138C (CORTA), respectivamente] retuvieron mucha de la actividad de hCG en las pruebas de transducción de señales. El cambio en el residuo Asn52 de la subunidad-a para la cisteína interrumpe una señal de glicosilación y resulta en la pérdida de un oligosacárido en la espiral 2 de la subunidad-a. La remoción de este oligosacárido de hCG causa que pierda aproximadamente 60% de su eficacia (Figura 18). Además, la adición de la knob ß-lactamasa a este sitio puede compensar la pérdida en la eficacia causada por la remoción del oligosacárido de la espiral 2. La actividad relativamente alta de ambos estos análogos LARGO y CORTO muestran que el residuo de la subunidad a no está cerca de la interfase del receptor. Dado que ambos análogos tienen alta eficacia, estos hallazgos tienen implicaciones para el rol del oligosacárido en la transducción de señales inducidas por hCG. Las actividades de los análogos LARGO y CORTO indican que el rol del oligosacárido en la espiral 2 de la subunidad-a es para distorsionar las posiciones de las subunidades dentro de hCG; un fenómeno que no depende de los contactos específicos entre el oligosacárido y su subunidad.
Las actividades de los análogos restantes LARGO y CORTO muestran que los residuos 48 y 64 de la subunidad a están mucho más cerca del receptor que se habrían determinado de las actividades de ????ß31380+a?480 y ???ßß1380+ 864a Este descubrimiento tiene consecuencias importantes para los modelos del complejo del receptor hCG-LH. Los hallazgos iniciales también confirman que los residuos 46 y 92 de la subunidad están cerca de la inferíase del receptor.
Ejemplo 5: Knos que tienen una cisteína de acoplamiento en el extremo aminoterminal de la subunidad a No es necesario para el acoplamiento de la cisteína en el extremo carboxiterminal de la proteína y los análogos se han diseñado en los cuales el acoplamiento de la cisteína está en el extremo carboxiterminal de la proteína. La secuencia de aminoácidos de uno de dichos análogos (ß101-145, - ) se ilustra posteriormente. Este análogo se preparó mediante omitir los residuos 3-100 de la subunidad ß hCG y fusionando la subunidad a al extremo de la subunidad ß restante usando los métodos de mutagénesis de cassette y la PCR estándar. Tiene una cisteína libre en el residuo 12 que sirve como la cisteína de acoplamiento. 10 20 30 40 50 60 ß101-145 , (SEC ID NO:54) skggpkdhpltcddprfgdsssskapppslpspsrlpgpBdtpilpqapdvqdcpectlg- 70 80 90 100 110 120 enpffsqpgapilqcmgccfsrayptplrskktmlvciknvtsestccvaksynrvtviiigg- 130 140 f kvenhtachcstcyyhks
Ejemplo 6 - Método para Producir Proteínas Knobs en Sitio Específico Se selecciona una proteína a la cual una knob se une. Entonces, se determina la ubicación específica para marcarse en la proteína. Usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica, una construcción es capaz de expresar la proteína que puede prepararse de manera que un residuo de cisteína se sustituye para el residuo natural en la ubicación específica de marcación en la proteína codificada. Además, la proteína codificada en la construcción además comprende al menos una porción de cola que contiene un residuo de cisteína unido a un extremo de la proteína y una knob unida al extremo de la porción de cola. La construcción posteriormente se inserta en una célula para la expresión resultante en la producción de una proteína con una knob unida en el sitio específico.
Además de una knob para una proteína que involucra introducir una cisteína en la superficie en donde la knob se ubicará e introduciendo una cisteína en un sitio en el extremo aminoterminal o carboxiterminal de la proteína de manera que la cisteína en el extremo de la proteína pueda formar un bisulfuro con el que se ha agregado a la superficie. La formación de un bisulfuro entre dos cisteínas causará que el extremo de la proteína que contiene la c isteína s e estabilice en la superficie que crea una knob en este sitio (ver la Figura 9).
Para crear la knob, el extremo de la proteína que contiene la cisteína deberá ser de suficiente longitud para permitir que su cisteína forme un bisulfuro con la cisteína en el sitio que contendrá la knob. Esto puede requerir la adición de una porción de cola de manera que el extremo carboxiterminal de la subunidad ß hCG, como fue el caso para la adición de una proteína knob a hFSH. La composición de la porción de cola puede variarse extensamente y no necesita ser limitada por esa de la subunidad ß hCG. Los requerimientos principales de la porción de cola son aquellos q ue d eberán s er s uficientemente I argos p ara a Icanzar la cisteína en la superficie de la proteína que define la ubicación de la knob y que carece de residuos que previenen de llegar a ese sitio. Esto incluirá los residuos característicos de dominios de transmembrana que crean sitios que enlazan a otras proteínas o a una parte de la proteína distante de la cisteína en la superficie de la proteína en la knob.
Los residuos en el lado de la cisteína que es el extremo carboxiterminal o aminoterminal de la proteína forman la knob. (Ver la Figura 9). En general, entre mayor número de residuos en este sitio, más grande la knob. Las knobs más pequeñas consistirán solamente de una cisteína. (Ver la Figura 1 0A). Estas podrían crearse mediante incorporar una cisteína en el extremo del extremo carboxiterminal o aminoterminal del enlazante y agregando un sitio de penetración inmediatamente adyacente a la cisteína (Ver la Figura 10A). El sitio de penetración deberá contener una secuencia de aminoácidos para una proteasa que no se encuentra dentro de otras partes de la proteína. El tamaño de la knob puede incrementarse en al menos tres formas. Primero, una proteína puede fusionarse al extremo de la proteína usada para construir la knob (Ver la Figura 10B). Como se describió anteriormente, la ß-lactamasa se fusionó al extremo de la proteína. Sin embargo, la ß-iactamasa no es solamente la proteína que es apropiada para este propósito. La selección de la ß-lactamasa como una sonda fue facilitada por su estructura cristal, que mostró que su extremo aminoterminal se ubicó en su superficie, una posición favorable para la construcción de una proteína de fusión. Segundo, la penetración del enlazante por una proteasa que puede usarse para reducir el tamaño del enlazante y su contribución a la knob. Y tercero, la distancia entre el acoplamiento de cisteína y la sonda de la proteína de fusión puede variar mediante incrementar o reducir el número de aminoácidos. Como se observa para el ejemplo hCG, una distancia más corta causó una reducción más grande en la actividad de la hormona debido al hecho de que restringe los movimientos de la knob. Esto conserva a la knob cercana a la interfase entre la hormona y el receptor LH.
Como deberá ser evidente a partir de la Figura 10, no es esencial para el acoplamiento de la cisteína para estar presente en la porción de cola. La introducción de una cisteína en la superficie de la proteína de fusión que es parte de la knob en donde puede formar un bisulfuro con la cisteína blanco en la proteína deberá causar que la proteína de fusión llegue a unirse directamente a la superficie de la proteína a probarse. (Ver la Figura 10C). Este método también puede usarse para controlar la orientación de la proteína de fusión que es parte de la porción knob. Cuando se usan las proteasas como proteínas de fusión, la introducción de las cisternas dentro de una superficie del sitio activo conservarán el sitio activo de la proteína de fusión de la superficie a la cual la knob se está uniendo.
Ejemplo 7. Uso de la porción de cola acortada como la sonda. La adición de las knobs a las proteínas permite la estimación de distancias entre dos superficies de proteínas. Como se mostró, las porciones de la espiral 2 de la subunidad a de hCG no contactan al receptor. La ubicación del acoplamiento de la cisteína en el aminoácido 138 de la subunidad ß hCG coloca relativamente pocas coacciones en las posiciones que pueden ocuparse por los residuos 111-137 de la subunidad ß que unen el acoplamiento de la cisteína en la knob para el centro de la subunidad ß hCG. La porción de cola, por si misma también puede usarse para probar la superficie de proteínas y existen varias instancias en las cuales sería deseable cubrir una porción de un sitio activo de una proteína, por lo tanto haciéndola inactiva hasta que la porción de cola se sujetó mediante una proteasa.
En estudios de las interacciones del receptor hCG-LH, fue deseable que constriña la ubicación de la porción de cola para el canal entre la espiral 2 de la subunidad y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß para probar la afirmación de que este canal formó un contacto receptor clave. El uso de la porción de cola descrita anteriormente permitiría pasarla a través de esta porción de la hormona pero no la forzaría para ubicarse ahí. Debido a su longitud, la porción de cola debería pasar sobre la superficie convexa de las espirales 1 y 3 de la subunidad ß para habilitar a la cisteína de acoplamiento knob para alcanzar varias cisteínas que se han sustituido para los residuos en la espiral 2 de la subunidad-a. Por lo tanto, acortando la porción de cola para forzarla a pasar a través del canal entre la espiral 2 de la subunidad y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß cuando se marca la cisteína que se ha sustituido para los residuos 42, 46 ó 48 de la subunidad- . Los a nálogos d e p orción de cola ???Tß, 8116-135, S138C (SEC ID NO: 45) y bCG >, 5121-135, S138C (SEC ID NO: 46) (Figura 15) fueron cortos para habilitar la formación de un bisulfuro entre la knob y la proteína blanco a menos que los análogos de la porción de cola pasen a través del canal entre la espiral 2 de la subunidad y las espirales 1 y 3 de la subunidad-ß. Como se observa a partir de los resultados mostrados en la Figura 23 y 24, los heterodímeros que contienen ccT46C y hCGp, 5116-135, S138C ó hCG , 5121-135, S138C tuvieron actividad de enlace del receptor sustancial. El heterodímero que contiene aL48C y CGfi, 5121-135, S138C también tuvieron considerable actividad de enlace del receptor. Cantidades mucho más pequeñas del heterodímero estable ácido que contienen L48C y CGfi, 5116-135, S138C se formaron, indicando que la porción de cola más corta probada puede no haber sido de suficiente longitud para la cisteína de acoplamiento knob para alcanzar la cisteína blanco en la proteína. Dado que no fue necesario para la porción de cola de estos análogos para pasar a través del canal entre la espiral 2 de la subunidad a y las espirales 1 y 3 de la subunidad ß para que la cisteína de acoplamiento knob alcance a I a c isteína b lanco e n e I r esiduo 42 d e I a s ubunidad-cc, e ste a nálogo s e usó como un control positivo.
De manera conjunta, estas observaciones mostraron que el canal no participó en los contactos del receptor esenciales. También se demostró como la posición de la porción de cola puede manipularse para habilitar su paso cerca de porciones específicas de la proteína. Esto permitiría que la porción de cola se use para oscurecer un sitio específico, una propiedad que cuando se combina con los sitios de penetración que se han introducido en la porción de cola podría ser útil para preparar las proteasas latentes, toxinas y otros análogos útiles. Las porciones de cola q ue oscurecen u na p roteasa o s itio de la toxina permitirían la preparación y uso de los reactivos capaces de ingresar a las células en donde las endógenas u otras proteasas penetrarían la porción de cola para activar la toxina. Estos agentes serían útiles como terapéuticos para tratar las malignidades u otras enfermedades.
Ejemplo 8. Uso de las sondas unidas a la subunidad ß Se ha sugerido que la espiral pequeña en el cinturón de seguridad tiene un rol en la actividad biológica de hCG y se desea para unir las knobs a esta región de la subunidad ß para investigar esta posibilidad. Los análogos de la subunidad alfa se produjeron de manera que contuvieron los residuos carboxiterminal en la subunidad ß hCG. Mientras se ha demostrado que el enlace de una porción del término carboxi de la subunidad ß hCG para el extremo carboxiterminal de la subunidad-a redujo la actividad del heterodímero por 50 veces o más, el uso de la secuencia total de la subunidad ß no tuvo dicha consecuencia. Los análogos que contienen los residuos carboxiterminal de la subunidad ß hCG unidos a la subunidad-ct, incluyendo los aminoácidos Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gin-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-lle-Leu-Pro-GIn, tuvieron 50% o más de la actividad de hCG en el enlace del receptor y en las pruebas de señalización. Esto se encontró debido a la presencia de los residuos cargados cerca de la unión de los residuos derivados de la subunidad- y la subunidad-ß.
Para unir una knob a los residuos de la subunidad ß en la espiral pequeña del cinturón de seguridad, una versión truncada del término carboxi de la subunidad ß hCG se agregó al extremo de la subunidad para crear hCG-aCT5116/135, 138C (SEC ID NO: 57). Esto se co-expresó en las células COS-7 con un análogo de la subunidad ß hCG teniendo una cisteína en lugar de Arg94 (SEC ID NO: 58), Arg95 (SEC ID NO: 59), Ser96 (SEC ID NO:60), Thr97 (SEC ID NO:61), Thr98 (SEC ID NO: 62) y Asp99 (SEC ID NO: 63). Todo de estas proteínas formaron heterodímeros estables ácidos y como puede observarse de los datos en las Figuras 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32, estos estudios revelaron como esta parte de la subunidad ß interactúa con los receptores LH (LHR). La presencia de esta knob en los residuos 95 y 99 eliminaron la interacción LHR y la actividad biológica. Esta knob tiene mucho menos influencia cuando está presente en los residuos 96 ó 97 como estos análogos tienen actividad sustancial en el enlace y las pruebas de señalización. La knob redujo la interacción del receptor, más cuando se unió al residuo 98 pero cercanamente al nivel observado cuando se unió a los residuos 95 ó 99. Esto sugiere que los últimos residuos pueden ubicarse más cerca de la interfase del receptor.
La cadena lateral del residuo 95 de la subunidad ß hCG se confronta en una dirección opuesta de aquella de los residuos 94 y 96, un fenómeno que puede contar para el hecho de que unir una knob a este sitio fue mucho más inhibidor para las interacciones hCG-LHR que unir una knob en los residuos 94 y 96. Esto sugiere que la superficie del cinturón de seguridad de Arg95 podría estar cerca de la interfase del receptor. Para aprender si la cadena lateral contactó la superficie de la proteína, se prepararon análogos que contuvieron knobs más pequeñas. Estas se construyeron mediante reemplazar la serina en el residuo 92 de I a s ubunidad con l a cisteína (SEC ID NO: 35) o mediante agregar una cola compuesta de Gly, Gly, Cys al término carboxi de la subunidad-a (SEC ID NO: 64). Como puede observarse en las Figuras 30 y 32, estas knobs más pequeñas tienen mucho menos habilidad de interferir con la actividad del heterodímero en las pruebas LHR. Además, ambos heterodímeros reticulados ácido estables retuvieron actividades considerables en estas pruebas. Esto mostró que la cadena lateral del residuo Arg95 de la subunidad ß está probablemente cerca de la interfase del receptor pero no necesita el contacto esencial del receptor. Esto también mostró que la ubicación del extremo carboxiterminal de la subunidad está cerca de la espiral pequeña del cinturón de seguridad después de que la hormona ¡nteractúa con la LHR.
Dado que el término carboxi de la subunidad es necesario para completar la actividad de la hormona glicoproteína, como es el oligosacárido en la espiral 2 de la subunidad a en Asn52, fue de interés determinar como el cambio de posición del término carboxi de la subunidad-a en el heterodímero influyó su actividad biológica. Se preparó un análogo de la subunidad hCG que no puede glicosarse en la espiral 2 de (a subunidad a debido al cambio de Asn52 para Asp y que tuvo la habilidad de agregar una cisteína knob a los residuos 92, 94, 95 y 96 de la subunidad ß (SEC ID NO: 65). La co-expresión de este análogo en las células COS-7 con los análogos de la subunidad ß que contienen una cisteína en los residuos 92, 94, 95 y 96 conducen a la formación de los heterodímeros reticulados ácido estables. Las actividades de estos análogos y un análogo de la subunidad-ß de la quimera que contiene una cisteína en lugar de Asg96 (SEC ID NO: 66), mostró que el término carboxi de la subunidad- puede unirse a varios sitios en la subunidad-ß, indicando que su ubicación no se constriñe excesivamente (Figura 33). Además, el hallazgo de que la eficacia del análogo de la quimera poco demostró que la conformación de esta porción de la hormona tiene una influencia en la transducción de señales.
Un experto en la técnica rápidamente apreciará que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetos y obtener los términos y las ventajas mencionadas como aquellas inherentes en la presente. Las composiciones junto con los métodos y procedimientos descritos en este documento son realmente representativas de las modalidades preferidas y son solo ejemplos y no se intentan como limitaciones en el alcance de la invención. Los cambios en las mismas y otros usos ocurrirán por aquellos expertos en la técnica, los cuales se establecen dentro del espíritu de la invención o se definen por este alcance con las reivindicaciones.
Será rápidamente aparente para un experto en la técnica que varias sustituciones y modificaciones pueden hacerse a la invención descrita en este documento sin apartarse del alcance y espíritu de la invención.
Todas las patentes y publicaciones referidas en este documento se incorporan como referencia a la misma extensión como si cada publicación individual fue específica e individualmente indicada para incorporarse como referencia. La s iguiente l ista d e referencias e s asimismo incorporada como referencia.
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Claims (19)
1. Una composición que comprende, una porción de proteína, en donde la porción de proteína contiene un residuo de cisteína substituido en una ubicación deseada para marcarse; una porción de cola en el extremo terminal de la porción de proteína y una knob, en donde la knob se ubica en el extremo libre terminal de la porción de cola y contiene un residuo de cisteína y en donde el residuo de cisteína de la knob es capaz de formar un bisulfuro con la cisteína sustituida en la porción de proteína.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la cola contiene un sitio de penetración de proteasa.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la knob comprende una etiqueta epítope.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la knob comprende un polipéptido.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la knob comprende una proteína.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde la cisteína knob se ubica en la superficie de la proteína.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la porción de proteína es una proteína monomérica.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la porción de proteína es una proteína multimérica.
9. Un método para marcar una proteína en un sitio específico que comprende: a) seleccionar una proteína deseada; b) localizar un sitio específico en la proteína deseada a marcarse; c) seleccionar una knob deseada, en donde la knob deseada contiene un residuo de cisteína; d) preparar una construcción que codifica la proteína deseada, una porción de cola y la knob deseada, en donde la proteína deseada tiene un residuo de cisteína sustituido en el sitio a marcarse; e) insertar la construcción e n u na c élula p ara I a e xpresión d e I a p roteína s eñalada, e n donde la cisteína en la knob y la cisteína sustituida en la proteína deseada forma un enlace de bisulfuro.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la knob comprende una etiqueta epítope, una secuencia de señal o una proteína.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteína knob es una proteasa.
12. E l m étodo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la proteína deseada es monomérica.
13. E l m étodo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la proteína deseada es multimérica.
14. Un método de purificación de proteínas que comprende, a) insertar una construcción capaz de expresarse en una célula, en donde la construcción codifica una proteína, en donde la proteína comprende un residuo de cisteína sustituido en un sitio deseado para marcarse, una porción de cola en el extremo terminal de la proteína en donde la porción de cola contiene un sitio de penetración de proteasa y una knob en el extremo de la porción de cola, en donde la knob contiene un residuo de cisteína; b) lisar la célula; c) purificar la proteína con base en las características de la knob.
15. Un método para marcar el hCG que comprende: a) preparar una construcción capaz de expresar la hCGp o hCGp-S138C natural; b) preparar una construcción capaz de expresar la hCGa natural o los análogos cisteína hCGa sustituidos; c) insertar las construcciones de la etapa a) y b) en las células COS-7 para la co-expresión.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la construcción de la etapa a) además comprende fusionar una proteína para el residuo 140 ó 145 de hCGp.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la proteína es ß-lactamasa.
- 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde los análogos sustituidos con cisteína hCGot se seleccionan de la SEC ID No: 1 hasta la SEC ID NO: 35.
19. Un método para mapear la distancia entre las moléculas de proteína que comprende: a) seleccionar una primera molécula de proteína; b) seleccionar una segunda molécula de proteína, en donde la primera molécula de proteína y la segunda molécula de proteína interactúan; c) producir primeras moléculas de proteína, en donde cada primera molécula de proteína producida contiene una knob ubicada en un sitio diferente en la primera proteína; d) producir la segunda molécula de proteína; e) usar las proteína producidas en las etapas c) y d) para analizar la distancia entre la primera proteína y la segunda proteína.
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