MXPA04003382A - Agentes terapeuticos y diagnostico para transtornos de la eritropoyesis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion ofrece paneles novedosos de blancos moleculares que regulan la eritropoyesis. Los paneles novedosos de la presente invencion pueden emplearse, por ejemplo, en intervencion terapeutica, tamizado para agentes terapeuticos, y en metodos de diagnostico para enfermedades y/o trastornos de la eritropoyesis.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS Y DE DIAGNÓSTICO PARA TRASTORNOS DE LA ERITROPOYESIS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La eritropoyesis es el proceso a través del cual glóbulos rojos de la sangre (eritrocitos) se desarrollan y diferencian de células madres pluripotentes en la médula ósea. Este proceso incluye una interacción compleja de factores de crecimiento de polipéptidos (citocinas y hormonas) que actúan a través de receptores unidos a membranas en las células blanco. La acción de las citocinas resulta en proliferación y diferenciación celular, y la respuesta a una citocina particular es frecuentemente específica según etapa. Las dos citocinas más prominentes que regulan la eritropoyesis son la eritropoyetina (Epo) y factor de célula madre (SCF; se conoce también como factor de crecimiento de mastocitos [ GF] , factor de Steel [SLF] , o ligando de Kit [KL] ) . La eritropoyetina (Epo) es una proteína hormona que actúa junto con otros factores de crecimiento, como por ejemplo SCF, para estimular la proliferación y maduración de células precursoras eritroides de médula ósea que responden. Las anemias son un padecimiento común de la eritropoyesis, y son el resultado de un número insuficiente de eritrocitos. La anemia resulta en una capacidad disminuida de transporte de oxígeno que puede provocar una actividad física afectada, insuficiencia de un órgano, o fallecimiento. Más de 27 millones de pacientes padecen de alguna forma de anemia cada año. Las anemias progresivas crónicas resultan de enfermedad renal, SIDA, deficiencias en el transporte de hierro, inflamación crónica, así como efecto colateral de terapias citorreductoras contra el cáncer. Otras anemias crónicas resultan de padecimientos congénitos de la eritropoyesis misma o se deben al hecho que factores requeridos para estimular la eritropoyesis están faltando debido a un padecimiento genético. Una anemia aguda resulta de una intervención quirúrgica o trauma con pérdida de sangre rápida o importante. El tratamiento de la anemia se requiere una vez que los hematócrito (el % de masa sanguínea conformada por eritrocitos) caen por debajo del 30%. En contraste, la policitemia, o eritrocitosis, es un padecimiento causado por un exceso de eritrocitos. La policitemia es definida como una elevación del nivel de hematócritos arriba del 55% en hombres y arriba del 50% en mujeres. La policitemia resulta en un riesgo incrementado de trombosis (formación de coágulos; una causa de apoplejía, ataque cardiaco y embolia) , insuficiencia respiratoria, inflamación vascular, cefalea y mareo. Existen tres clases diferentes de policitemia: 1) policitemia relativa, en donde los pacientes parecen tener un exceso de glóbulos rojos debido a una pérdida de volumen de la porción líquida de la sangre, el plasma, debido a deshidratación, diuréticos, quemaduras, estrés, y alta presión sanguínea; 2) policitemia verdadera, un padecimiento mieloproliferativo en donde el conteo de eritrocitos se eleva sin estimulación por la hormona estimuladora de eritrocitos, Epo; y 3) policitemia secundaria en donde el incremento en los conteos de eritrocitos se debe a una elevación de la hormona estimuladora de glóbulos sanguíneos rojos, Epo. Hoy en día, padecimientos que involucran los niveles de eritrocitos son tratados de tres formas principales según lo apropiado: 1) tratamiento de la causa subyacente de la enfermedad, como por ejemplo insuficiencia nutrimental o padecimiento; 2) en el caso de anemias, tratamiento con suplementos de hierro, o en casos extremos, transfusión de eritrocitos a la persona afectada, o bien en el caso de policitemias, adelgazamiento de los eritrocitos del paciente mediante la remoción de sangre u otros métodos; y 3) cambio los niveles de eritropoyesis para afectar el nivel eritrocitos . Tradicionalmente, en casos de anemia en donde el padecimiento subyacente no puede ser tratado efectivamente, se requieren de transfusiones sanguíneas regulares conforme la condición del paciente empeora. Existen dos tipos de transfusiones: 1) transfusión homologa, en donde se recoge sangre del mismo tipo que el tipo de sangre del paciente de donadores y se administra al paciente; y 2) transfusión autóloga en donde se dona y almacena la propia sangre del paciente y se administra posteriormente al paciente. Ambos métodos presentan problemas que deben ser superados mediante el descubrimiento de alternativas a la transfusión. Por ejemplo, la transfusión homologa depende de la capacidad de obtener las cantidades apropiadas de sangre de donadores y es ineficiente y costosa en la medida en que se debe efectuar un estudio extenso para determinar la presencia de enfermedades con el objeto de asegurar la seguridad de la sangre. Un problema principal con la transfusión autóloga es la incapacidad de recoger la cantidad requerida de sangre de un individuo debido a la inducción de la anemia a través del proceso. Técnicas de expansión de eritrocitos podrían ser utilizados para evitar la inducción de anemia cuando se requiera sangre para transfusión o bien evitar la necesidad de transfusiones. En el tratamiento de policitemias que no responden al tratamiento del padecimiento subyacente, se utilizan varios métodos para reducir físicamente el número de eritrocitos: 1) flebotomía, o remoción de aproximadamente medio litro de sangre por semana hasta que los hematócritos bajen a niveles normales; 2) quimioterapia utilizando agentes tales como hidroxiurea para destruir el exceso de glóbulos sanguíneos rojos y; 3) agentes de adelgazamiento de la sangre o anticoagulación co o por ejemplo terapia con aspirina en baja dosis para prevenir la trombosis; la flebotomía es problemática en la medida que se relaciona con un cumplimiento insatisfactorio y un riesgo incrementado de trombosis durante los primeros tres a cinco años de tratamiento. La quimioterapia es todavía más problemática con efectos colaterales como inmunosupresión, pérdida de cabello, nausea, etc. Un tratamiento que pudiera inhibir la sobre producción de eritrocitos por una regulación específica de la eritropoyesis sería más suave para la salud del paciente. Apenas ahora se está empezando a entender la eritropoyesis puesto que técnicas de cultivo y biología molecular están solamente ahora suficientemente desarrolladas para facilitar su estudio. Recientemente, una capacidad limitada de incrementar la eritropoyesis ha sido desarrollada a través de la producción y uso de eritropoyetina humana recombinante . Sin embargo, una terapia de eritropoyetina recombinante es extremadamente costosa y es un tratamiento eficaz solamente para la anemia. Encontrar otros métodos que aumenten o reemplacen una terapia de eritropoyetina recombinante sería deseable. Además, el hecho de encontrar factores que reduzcan la eritropoyesis es también deseable para el tratamiento de la policitemia. El estudio de la eritropoyesis ha sido limitado hasta recientemente debido a la complejidad de la vía de la célula madre hasta el eritrocito, lo que dificulta el mantenimiento de cultivos homogéneos de cada tipo de célula progenitora.

Los estudios que identificaron SCF y Epo como factores eritropoyéticos prominentes y que caracterizaron sus mecanismos de señalización fueron efectuados utilizando líneas de células establecidas o manipuladas. Estudios iniciales del mecanismo de señalización de SCF y Epo fueron también efectuados empleando células progenitoras humanas primarias. Una limitación de estos estudios ha sido la dificultad para obtener grandes números ce células de poblaciones homogéneas de progenitores de células eritroides humanas. Así, a la fecha no se ha efectuado una caracterización bioquímica y molecular detallada de la eritropoyesis . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a genes novedosos y/o a los productos génicos codificados que han sido identificados como diferencialmente expresados durante la eritropoyesis. La presente invención se refiere también a paneles novedosos de objetivos moleculares que consisten de grupos de genes y/o de los productos génicos codificados que han sido identificados como expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis. En una modalidad, los paneles de genes pueden consistir en por lo menos uno de los genes regulados diferencialmente durante la eritropoyesis de conformidad con lo listado en la Tabla I (Figura 3). En ciertas modalidades, el panel de genes consiste de por lo menos uno de los genes que son regulados de manera ascendente durante la eritropoyesis de conformidad con lo listado en la Tabla II (Figura 4) . En otras modalidades, el panel de genes consiste de por lo menos uno de los genes que son regulados de manera descendente durante la eritropoyesis según lo listado en la Tabla III (Figura 5). Los paneles novedosos de la presente invención consisten también de los productos génicos de los genes de panel, por ejemplo, ARNm y proteínas. La presente invención se refiere además al uso de los paneles novedosos en métodos de tamizado de agentes terapéuticos candidatos para su uso en el tratamiento de padecimientos y enfermedades relacionadas con la eritropoyesis. En una modalidad de la invención, el padecimiento es anemia. En otra modalidad de la invención, el padecimiento es policitemia. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos, o "agentes terapéuticos", son evaluados para determinar su capacidad de unirse a una proteína objetivo. Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser seleccionados, por ejemplo, entre las clases siguientes de compuestos: proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, citocinas, y hormonas. En otras modalidades, los agentes terapéuticos candidatos son evaluados para determinar su capacidad para unirse a un gen objetivo. Los agentes terapéuticos candidatos pueden seleccionarse, por ejemplo, entre las siguientes clases de compuestos: ácidos nucleicos de antisentido, moléculas pequeñas, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos, o análogos de ácido nucleico. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden estar en una biblioteca de compuestos. Estas bibliotecas pueden ser generadas utilizando métodos sintéticos de combinación. En algunas modalidades de la presente invención, la capacidad del agente terapéutico candidato para unirse a una proteína objetivo puede evaluarse a través de un ensayo in vitro. En modalidades de la presente invención en donde el objetivo del agente terapéutico candidato es un gen, la capacidad del agente terapéutico candidato para unirse al gen puede evaluarse a través de un ensayo in vitro. En ambas modalidades, el ensayo de enlace puede también efectuarse in vivo . La presente invención contempla además la evaluación de agentes terapéuticos candidatos para determinar su capacidad para modular la expresión de un gen objetivo mediante la puesta en contacto de las células eritroides de un paciente con dicho agente terapéutico candidato. En ciertas modalidades, el agente terapéutico candidato será evaluado para determinar su capacidad para normalizar el nivel de expresión de un gen o grupo de genes involucrados en la promoción de la eritropoyesis . En esta modalidad, si el agente terapéutico candidato puede normalizar la expresión génica de tal manera que se promueva la eritropoyesis, puede considerarse como agente terapéutico candidato para la anemia. De la misma manera, en otras modalidades, si el agente terapéutico candidato puede normalizar la expresión génica de tal manera que se inhiba la eritropoyesis, puede considerarse agente terapéutico candidato para la policitemia . Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser seleccionados entre las clases siguientes de compuestos: ácido nucleico de antisentido, ribozimas, siRNAs, mutantes negativos dominantes de polipéptidos codificados por los genes, moléculas pequeñas, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos, y análogos de ácido nucleico. Alternativamente, agentes terapéuticos candidatos pueden ser evaluados para determinar su capacidad para inhibir la actividad de una proteína mediante la puesta en contacto de la célula eritroide de un sujeto con dichos agentes terapéuticos candidatos. En ciertas modalidades, el agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para inhibir la actividad de una proteína que promueve normalmente la erinropoyesis . En esta modalidad, un agente terapéutico candidato que presenta la capacidad de inhibir la actividad de la proteína puede considerarse como agente terapéutico candidato para el tratamiento de la policitemia. En otras modalidades, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para inhibir la actividad de una proteína que normalmente si se inhibe promueve la eritropoyesis . En esta modalidad, un agente terapéutico candidato que presenta la capacidad de inhibir la actividad de al proteína puede ser considerado como agente terapéutico candidato para el tratamiento de la anemia. Además, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para normalizar el nivel de rotación de una proteina codificada por un gen a partir de los paneles de la presente invención. En otra modalidad, el agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para normalizar el nivel de traducción de una proteína codificada por un gen a partir de los paneles de la presente invención. En otra modalidad, el agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad de normalizar el nivel de rotación de un ARNm codificado por un gen a partir de los paneles de la presente invención. Ensayos y métodos para desarrollar ensayos apropiados para su uso en los métodos descritos arriba se conocen por parte de las personas con experiencia en la materia y, como lo observarán las personas con experiencia en la materia, pueden utilizarse según lo adecuado con los métodos de la presente invención. La eficacia de los agentes terapéuticos candidatos identificados utilizando los métodos de la invención puede ser evaluada, por ejemplo, mediante a) la puesta en contacto de células eritroides de un sujeto con un agente terapéutico candidato y b) la determinación de capacidad para normalizar el nivel de eritropoyesis en las células del sujeto utilizando ensayos dirigidos hacia la determinación del nivel de eritropoyesis. Si, a través de un ensayo, se determina que un agente terapéutico candidato induce un alto nivel de eritropoyesis, entonces el candidato puede ser considerado como fármaco realzador de la eritropoyesis. A la inversa, si se observa a través de ensayo que un agente terapéutico candidato inhibe el nivel de eritropoyesis, entonces el candidato puede ser considerado como fármaco inhibidor de la eritropoyesis. Alternativamente, la eficacia de agentes terapéuticos candidatos pueden ser evaluada mediante la comparación de los niveles de expresión de uno o varios genes asociados con eritropoyesis en un glóbulo sanguíneo rojo de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético con los niveles de expresión de uno o varios genes asociado con la eritropoyesis en un glóbulo sanguíneo rojo normal. En una modalidad, el nivel de expresión de los genes puede ser determinado empleando micro-conjuntos u otros métodos de cuantifícación de ARN o bien mediante la comparación del perfil de expresión de gen de una célula eritroide tratada con un agente terapéutico candidato con el perfil de expresión de gen de una célula eritroide normal.

La presente invención ofrece además métodos para el tratamiento de padecimientos de la eritropoyesis mediante la utilización de composiciones farmacéuticas que consisten de los agentes terapéuticos identificados utilizando los métodos de tamizado proporcionados por la invención. La presente invención contempla el uso de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, para normalizar el nivel de eritropoyesis en un paciente con un padecimiento eritropoyético. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se utilizan para tratar pacientes con anemia. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas se utilizan para tratar pacientes con policitemia. Tales métodos pueden incluir la administración a un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agonista o antagonista de uno o varios genes o sus productos génicos involucrados en la regulación de la eritropoyesis. its que comprenden las composiciones farmacéuticas de la presente invención están también dentro del alcance de la presente invención. La presente invención ofrece además composiciones que comprenden uno o varios agentes de detección para detectar la expresión de genes cuya expresión es característica de un padecimiento eritropoyético, por ejemplo, para su uso en ensayos de diagnóstico. Estos agentes, que pueden ser por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos , pueden estar en solución o unidos a una superficie sólida, como por ejemplo en forma de un micro-con unto Micro-conjuntos de la invención pueden consistir de sondas derivadas de las secuencias de los genes o productos génicos codificados que comprenden los paneles novedosos de la invención. Otras modalidades de la invención incluyen bases de datos, medios legibles en computadora, computadoras que contienen el perfil o los perfiles de expresión de gen de la presente invención o el nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de un padecimiento de eritropoyesis . La presente invención ofrece además métodos de diagnóstico para detectar la existencia y/o monitorear el progreso de un padecimiento eritropoyético en un sujeto, con o sin tratamiento. Los micro-conjuntos de la presente invención pueden ser utilizados en métodos para determinar si agentes terapéuticos inducen un padecimiento eritropoyético como efecto colateral. F,n una modalidad, el método comprende los pasos de a) poner en contacto células eritroides de un sujeto con dicho agente terapéutico y b) determinar los niveles de expresión génica pre y post tratamiento, en donde un efecto sobre los niveles de expresión génica indica que el agente terapéutico candidato puede inducir un padecimiento eritropoyético. Métodos preferidos comprenden la determinación del nivel de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis en las células eritroides de un sujeto. Otros métodos comprenden la determinación del nivel de expresión de decenas, centenas o miles de genes expresados en forma diferencial durante la eritropoyesis, por ejemplo, mediante la utilización de tecnología de micro ensayo. Los niveles de expresión de los genes se comparan después con los niveles de expresión de los mismos genes en una célula eritroide normal. La presente invención ofrece también métodos de diagnóstico para diagnosticar la causa de un padecimiento eritropoyético . En una modalidad, el método comprende los pasos de a) obtener una muestra de célula a partir de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético; b) determinar los niveles de expresión génica en las células del sujeto; y c) comparar los niveles de expresión génica en las células de un sujeto con los niveles de expresión génica en una célula eritroide normal, en donde una diferencia en los niveles de expresión génica indica que el agente terapéutico candidato puede indicar la causa del padecimiento eri~ropoyético . En ciertas modalidades de cualquiera de los métodos de diagnóstico contemplados por la presente invención, el método de diagnóstico comprende la determinación de la actividad de una proteína codificada por un gen en una célula eritroide de un sujeto y la comparación de la actividad con la actividad de proteína en una célula eritroide normal. En otras modalidades, el método de diagnóstico puede comprender la determinación del nivel de proteina o rotación de ARNm, o la determinación del nivel de traducción en células eritroides de un sujeto. La presente invención ofrece también un kit que comprende una biblioteca de patrones de expresión génica y reactivos para determinar uno o varios niveles de expresión de dichos genes. Para dar solamente un ejemplo, el nivel de expresión puede ser determinado proporcionando un kit que contiene un ensayo apropiado y un micro ensayo apropiado con un conjunto de sondas. En otra modalidad, el kit comprende reactivos apropiados para determinar el nivel de actividad de proteína en las células eritroides de un sujeto. Componentes de kit pueden estar empacados para la práctica manual o parcial o totalmente automatizada de los métodos antes mencionados. En otras modalidades en los cuales participan kits, esta invención contempla un kit que incluye composiciones de la presente invención y opcionalmente instrucciones para su uso. Tales kits pueden tener varios usos, incluyendo por ejemplo, formación de imágenes diagnóstico, terapia y otras aplicaciones. Estas modalidades de la presente invención, otras modalidades, y sus características serán aparentes a partir de la descripción, de los dibujos, y de las reivindicaciones siguientes . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un esquema que muestra un diseño experimental adecuado para obtener los paneles novedosos de la presente invención . La Figura 2 es un esquema que muestra otro diseño experimental adecuado para obtener los paneles novedosos de la presente invención. La Figura 3 contiene la Tabla I, que es una lista de los genes que son regulados de manera diferencial durante la eritropoyesis . La Figura 4 contiene la Tabla II, que presenta una lista de los genes que son regulados de manera ascendente durante la eritropoyesis . La Figura 5 contiene la Tabla III, que presenta una lista de los genes que son regulados de manera descendente durante la eritropoyesis. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. - Generalidades El grupo de genes y/o sus productos génicos codificados que conforman los paneles de la presente invención fueron descubiertos utilizando lineas de células homogéneas de progenitores eritroides que pueden ser diferenciados o inducidos para proliferar utilizando condiciones controladas. De esta forma, genes que son expresados de manera diferencial durante estos procesos eritropoyéticos pueden ser identificados. Estos genes y sus productos génicos codificados conforman los paneles de la presente invención. Los paneles de la presente invención fueron descubiertos utilizando determinación de perfil de expresión de genes de los varios progenitores eritroides a través de chips de genes comercialmente disponibles en Affymetrix HU6800 y Human Genome U95Av2 (HG-U95Av2). Un crecimiento in vi tro y un sistema de diferenciación de progenitores eritroides humanos dependientes de SCF/Epo, progenitores E-cadherin+Cd36+, y células progenitoras más tempranas que recapitulan de manera fiel el desarrollo de glóbulos rojos en cultivo se utiliza como la fuente de las células. El chip HU6800 contiene sondas derivadas de 13,000 genes humanos que pueden tener una función potencial en el crecimiento celular, proliferación y diferenciación celulares, y el chip HU-U95Av2 contiene 12,000 genes de longitud completa que han sico previamente caracterizados en términos de función o asociación con enfermedad. Los paneles de genes novedosos comprenden los genes que son regulados de manera ascendente o regulados de manera descendente durante la diferenciación o proliferación de varias células progenitoras en eritrocitos maduros. Por ejemplo, algunos de los genes novedosos blanco son los genes que son regulados de manera ascendente o regulados de manera descendente durante la diferenciación y proliferación de células progenitoras BFU-E en células SCF-Epo de conformidad con lo ensayado por análisis de hibridación del ARNm de las células con el chip de gen Affymetrix HU6800. La Figura 1 muestra un diseño experimental adecuado para obtener los paneles novedosos de la presente invención, y la Figura 2 muestra otro diseño experimental adecuado para obtener los paneles novedoscs de la presente invención. 2. - Definiciones Para mayor comodidad, antes de presentar una descripción más completa de la presente invención, ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos y en las reivindicaciones adjuntas se definen a continuación. Las formas singulares "un", "una", "el" y "las" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Una "dirección" en un ensayo, por ejemplo, un micro ensayo, se refiere a una ubicación en la cual un elemento, por ejemplo, un oligonucleótido, está fijado sobre al superficie sólida del conjunto. Como se emplea aquí, un ácido nucleico u otra molécula fijada sobre un conjunto, se conoce como una "sonda" o "sonda de captura". Cuando un conjunto contiene varias sondas que corresponden a un gen, estas sondas se conocen como "grupo de sondas de gen". Un grupo de sondas de gen puede consistir de, por ejemplo, 2 a 10 sondas, de preferencia de 2 a 5 sondas y muy especialmente de aproximadamente 5 sondas. Un "agonista" se refiere a un agente de imita o regula de manera ascendente (por ejemplo, potencia o suplemental la bioactividad de una proteína, por ejemplo, pollpéptido X. Un agonista puede ser una proteína de tipo silvestre o derivada de la misma que tiene por lo menos una bioactividad de la proteína de tipo silvestre. Un agonista puede ser también un compuesto que regula de manera ascendente la expresión de un gen o que incrementa por lo menos una bioactividad e una proteína. Un agonista puede también ser un compuesto que incrementa la interacción de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo, un péptido blanco o ácido nucleico. Un "alelo" que se utiliza de manera intercambiable con "variante alélica", se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se conoce como homocigótico para el gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigótico para el gen. Alelos de un gen específico pueden diferir entre ellos en un nucleótido individual o varios nucleótidos, y puede incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen puede también tener la forma de un gen que contiene una mutación. El término "amplificación", se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico. La amplificación se efectúa generalmente utilizando tecnologías de reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocidas en la técnica. (Dieffenbach, C. . y G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual [Cebador de reacción en cadena de polimerasa, un Manual de Laboratorio] , Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). El término "anemia" se refiere a una disminución de la producción de glóbulos sanguíneos rojos en un sujeto. El término "antagonista" se refiere a un agente que regula de manera descendente (por ejemplo, suprime o inhibe) por lo menos una bioactividad de una proteína. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o disminuye la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo, un péptido blanco o un sustrato de enzima. Un antagonista puede ser también un compuesto que regula e manera descendente la expresión de un gen o que reduce la cantidad de proteína expresada presente. Un "anticuerpo" incluye anticuerpos enteros, por ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc.) e incluye fragmentos de los mismos que son también específicamente reactivos con una proteína de vertebrado, por ejemplo, mamífero. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos pueden ser tamizados para determinar su utilidad de la misma manera que lo descrito arriba para anticuerpos enteros. Así, el término incluye segmentos de porciones proteoliticamente disociada o recombinantemente preparadas de una molécula de anticuerpo que puede reaccionar selectivamente con una cierta proteina. Ejemplos no limitativos de tales fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen Fab, F(ab')2, Fab' , Fv, y anticuerpos de cadena sencilla (scFv) que contienen un dominio V[L] y/o V [H] unido por un enlazador de péptido. Los scFv' s pueden estar covalente o no covalentemente unidos para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de enlace. La presente invención incluye preparaciones policlonales, monoclonales o de otro tipo purificadas de anticuerpos y anticuerpos recombinantes. El término ácido nucleico de "antisentido" se refiere a oligonucleótidos que se hibridan específicamente (por ejemplo, se unen) bajo condiciones celulares con una secuencia génica, como por ejemplo a nivel de ARNm celular y/o ADN genómico con el objeto de inhibir la expresión de este gen, por ejemplo, mediante la inhibición de transcripción y/o traducción. El enlace puede ser a través de apareamiento convencional de bases complementarias, o bien, por ejemplo, en el caso de unión con Duplexes de ADN, a través de interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. Los términos "conjunto" o "matriz" se refieren a un conjunto de ubicaciones direccionables o "direcciones" en un dispositivo. Las ubicaciones pueden estar colocadas en conjuntos bidimensionales, conjuntos tridimensionales, u otros formatos de matriz. El número de ubicaciones puede estar dentro de un rango de algunos hasta por lo menos cientos de miles. De manera más importante, cada ubicación representa un sitio de reacción totalmente independiente. Un "conjunto de ácido nucleico" se refiere a un conjunto que contiene sondas de ácido nucleico, como por ejemplo oligonucleótidos o porciones mayores de genes. El ácido nucleico en el conjunto es de preferencia de una sola cadena. Conjuntos en donde las sondas son oligonucleótidos se conocen como "conjuntos de oligonucleótidos" o "chips de oligonucleótidos" o "chips de gen". Un "micrc-conjunto" que se conoce también como "chip", "biochip", o "chip biológico", es un conjunto de regiones que tienen una densidad de regiones discretas de por lo menos 100/cm2, y de preferencia por lo menos aproximadamente 1000/cm2. Las regiones en un micro-conjunto tienen típicamente dimensiones, por ejemplo, diámetro, en un rango comprendido entre aproximadamente 10 y 250 mieras, y están separadas de otras regiones en el conjunto por la misma distancia. Las expresiones "actividad biológica" o "bioactividad" o "actividad" o "función biológica", que se utilizan aquí de manera intercambiable, se refieren a una función efectora o antigénica directa o indirectamente efectuada por un polipéptido (ya sea en conformación nativa o desnaturalizada) , o bien por cualquier subsecuencia del mismo. Actividades biológicas incluyen unión con polipéptidos, unión con otras proteínas o moléculas, actividad como proteina de enlace de ADN como regulador de transcripción, capacidad de unir con ADM dañada, etc. Una bioactividad puede ser modulada mediante el hecho de afectar directamente el polipéptido sujeto. Alternativamente, una bioactividad puede ser alterada mediante la modulación del nivel del polipéptido, por ejemplo mediante la modulación de la expresión del gen correspondiente. Los términos "muestra biológica" o "muestra", se refieren a una muestra obtenida de un organismo o de componentes (por ejemplo, células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. Frecuentemente, la muestra será una "muestra clínica" que es una muestra derivada de un paciente. Tales muestras incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, esputo, sangre, glóbulos sanguíneos (por ejemplo, glóbulos blancos), tejido o muestras de biopsias con agujas finas, orina, fluido peritoneal, fluido pleural, o células de los mismos. Muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos. El término "biomarcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad, o estado de fosforilación puede ser detectado y correlacionado con la actividad en una proteína de interés.

La expresión "ciclo celular" se refiere a una secuencia repetitiva de eventos en células eucarióticas que consiste de dos periodos: primero, un periodo de crecimiento celular que comprende el primer espacio o fase de crecimiento (Gl), la fase de síntesis de ADN (S) , y el segundo espacio o fase de crecimiento (G2); y segundo, un periodo de división que comprende la mitosis (M) . La expresión "una célula normal correspondiente de" o "célula normal correspondiente de" o "célula de contraparte normal de" una célula enferma se refiere a una célula normal del mismo tipo que la célula enferma. La expresión "una biblioteca de combinación" o "biblioteca" se refiere a varios compuestos, que pueden llamarse "miembros", sintetizados o preparados de otra manera a partir de uno o varios materiales iniciales mediante empleo ya sea de los mismos reactivos o condiciones de reacción o bien reactivos y condiciones de reacción diferentes en cada reacción en la biblioteca. En general, los miembros de una biblioteca presentan por lo menos alguna diversidad estructural, que resulta frecuentemente en diversidad química. Una biblioteca puede tener desde dos miembros diferentes hasta aproximadamente 108 miembros o más. En ciertas modalidades, las bibliotecas de la presente invención tienen más que aproximadamente 12, 50 y 90 miembros. En ciertas modalidades de la presente invención, los materiales iniciales y algunos de los reactivos son iguales, y la diversidad química de tales bibliotecas se logra mediante el hecho de variar por lo menos uno de los reactivos o condiciones de reacción durante la preparación de la biblioteca. Bibliotecas de combinación de la presente invención pueden prepararse en solución o bien en la fase sólida . Los términos "complementarios" o "complementaridad", se refieren al enlace natural de polinucleótidos bajo condiciones de temperatura y sal permisibles mediante apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se une a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementaridad entre dos moléculas de una sola cadena puede ser "parcial", en donde solamente una parte de los ácidos nucleicos se unen, o bien puede ser completa cuando existe una complementaridad total entre las moléculas de una sola cadena. El grado de complementaridad entre cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de hibridación entre cadenas de ácido nucleico. El término "citocina" se refiere a bioquímicos solubles producidos por las células que median las reacciones entre células, habitualmente utilizadas para modificadores de la respuesta biológica. Un "complejo de administración" se refiere a un medio de enfoque (por ejemplo, una molécula que resulta en un enlace de afinidad mayor de un gen, proteina, polipéptido o péptido con una superficie de célula objetivo y/o absorción celular o nuclear incrementada por la célula objetivo. Ejemplos de medios de enfoque incluyen: esteróles (por ejemplo, colesterol, lipidos (por ejemplo, un lipido catiónico, virosoma o liposoma) , virus (por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociado, y retrovirus) o bien agentes de enlace específicos para célula objetivo (por ejemplo, ligandos reconocidos por receptores específicos para célula objetivo) . Complejos preferidos son suficientemente estables ín vivo para evitar una separación significativa antes de la internalización por la célula objetivo. Sin embargo, el complejo es disociable bajo condiciones apropiadas dentro de la célula de tal manera que el gen, proteína, polipéptido o péptido es liberado en forma funcional. La expresión "derivado de" como esta expresión se utiliza aquí indica una secuencia de péptidos o nucleótidos seleccionada en una secuencia dada. Una secuencia de péptidos o nucleótidos derivada de una secuencia nombrada puede contener un número pequeño de modificaciones con relación a la secuencia de origen, en la mayoría de los casos a través de deleción, reemplazo o inserción de menos que aproximadamente el 15%, de preferencia menos que aproximadamente el 10% y en muchos casos menos que aproximadamente el 5% de los residuos de aminoácidos o pares de bases presentes en la secuencia de origen. En el caso de ADNs, una molécula de ADN se considera también como derivada de otra si las dos pueden hibridarse selectivamente entre ella. El término "derivado" se refiere a la modificación química de una secuencia de polipéptidos o una secuencia de polinucleótidos . Modificaciones químicas de una secuencia de polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, reemplazo de hidrógeno por grupo alquilo, acilo o amino. Un polinucleótido derivado codifica un polipéptido que retiene por lo menos una función biológica o inmunológica de la molécula natural. Un polipéptido derivado es un polipéptido modificado por glicosilación, pegilación, o cualquier proceso similar que conserve por lo menos una función biológica o inmunológica del polipéptido a partir del cual se deriva. La expresión "agentes de detección de genes" se refiere a agentes que pueden ser utilizados para detectar específicamente el gen u otra molécula biológica relacionada con él, por ejemplo, ARN transcrito del gen polipéptidos codificados por el gen. Ejemplos de agentes de detección son sondas de ácido nucleico que se hibridan con ácidos nucleicos que corresponden al gen y anticuerpos. El término "diferenciación" se refiere al proceso a través del cual una célula se especializa para una estructura o función específica mediante la expresión génica selectiva de algunos genes y la represión selectiva de otros. La expresión "expresión diferencial" se refiere a diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en patrones de expresión temporal y/o tisular de un gen. Genes expresados de manera diferente pueden representar "genes blanco". La expresión "patrón de expresión de gen diferencial" entre célula A y la célula B se refieren a un patrón que refleja las diferencias en cuanto a expresión génica entre la célula A y la célula B. Un patrón de expresión de gen diferencial puede también obtenerse entre una célula en un punto temporal y una célula en otro punto temporal, o bien entre una célula incubada o en contacto con un compuesto y una célula no incubada ni en contacto con el compuesto. El término "equivalente" se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos funcionalmente equivalentes. Secuencias de nucleótidos equivalentes incluyen secuencias que difieren por una o varias sustituciones, adiciones o deleciones, de nucleótidos como por ejemplo variantes alélicas y por consiguiente incluyen secuencias qu difieren de la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos mencionados en las Tablas debido a la degeneración del código genético. El término "eritrocito" se refiere al elemento similar mayor de la sangre periférica, que contiene hemoglobina y especializado para portar oxigeno. En seres humanos, la forma madura es normalmente un disco no nucleado, amarillento, bicóncavo adaptado para portar oxígeno en virtud de su configuración y contenido de hemoglobina. Un término alternativo para "eritrocito" es "glóbulo sanguíneo rojo". El término "eritropoyesis" se refiere a la producción de glóbulos sanguíneos rojos o eritrocitos a partir de células madres . Una "célula progenitora de eritroídes" o "célula eritroide" es cualquier célula a lo largo de la vía de la maduración de células madres en eritrocitos o vía eeritropoyética . La expresión "perfil de expresión", que se utiliza de manera intercambiable aquí con "perfil de expresión génica" y "huella digital" de una célula, se refiere a un conjunto de valores que representan niveles de ARNm de 20 o más genes en una célula. Un perfil de expresión comprende preferentemente valores que representan niveles de expresión de por lo menos aproximadamente 30 genes, de preferencia por lo menos aproximadamente 50, 100, 200 o más genes. Perfiles de expresión comprenden preferentemente un nivel ARNm de un gen que es expresado en niveles similares en múltiples células y condiciones, por ejemplo GAPDH. Por ejemplo, un perfil de expresión de una célula enferma de enfermedad D se refiere a un conjunto de valores que representan niveles de ARNm de 20 o más genes en una célula enferma. La expresión "nivel de expresión de un gen en una célula" o "nivel de expresión de gen" se refiere al nivel de ARNm, asi como transcripto (s) naciente (s) pre-ARNm, intermedios de procesamiento de transcriptos, ARNm maduro (s) asi como productos de degradación, codificados por el gen en la célula . Los términos "gen" o "gen recombinante" se refieren a una molécula de ácido nucleico que comprende un cuadro de lectura abierto y que incluye por lo menos un exon y (opcionalmente) una secuencia de intron. El término "intron" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado que es empalmada durante la maduración de ARNm. La expresión "constructo génico" se refiere a un vector, plásmido, genoma viral o similar que incluye una "secuencia codificadora" para un polipéptido o que puede transcribirse de otra forma en un ARN biológicamente activo (por ejemplo, antisentido, señuelo, ribozima, etc.), puede transfectar células en ciertas modalidades células de mamífero, y puede causar la expresión de la secuencia codificadora en células transíectadas por el constructo. El constructo génico puede incluir uno o varios elementos reguladores enlazados operativamente a la secuencia codificadora, así como secuencias intrónicas, sitios de poli adenilación, orígenes de replicación, genes marcadores, etc. El término "heterocigoto" se refiere a un individuo con alelos diferentes en loci correspondientes en cromosomas homólogos. Por consiguiente, "heterocigóticos" describe un individuo o una cepa que tiene genes alélicos diferentes en uno o varios loci apareados en cromosomas homólogos. El término "homocigoto" se refiere a un individuo con el mismo alelo en loci correspondientes en cromosomas homólogos. Por consiguiente, el término "homocigótico", describe un individuo o una cepa que tiene genes alélicos idénticos en uno o varios loci apareados en cromosomas homólogos. El término "homología" o alternativamente "identidad" se refiere a una similaridad de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede ser determinada por comparación de una posición en cada secuencia que puede ser alineada para propósitos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada es ocupada por la misma base o mismo aminoácido, entonces las moléculas son homologas en esa posición. Un grado de homología entre secuencias depende del número de posiciones correspondientes u homologas compartidas por las secuencias. El término "porcentaje de identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos. La identidad puede determinarse en cada caso mediante la comparación de una posición en cada secuencia que puede alinearse para propósitos de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o el mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esta posición; cuando el sitio equivalente es ocupado por el mismo residuo de aminoácido o un residuo de aminoácido similar (por ejemplo, similar en cuanto a naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden mencionarse como homologas (similares) en esta posición. La expresión como porcentaje de homología, similaridad, o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos idénticos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Varios algoritmos y/o u programas de alineación pueden utilizarse, incluyendo FATAS, BLAST, o ENTREZ . FASTA y BLAST están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (University of isconsin, Madison, Wis.), y pueden utilizarse por ejemplo, con los ajustes por omisión. ENTREZ está disponible en el National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Instituyes of Health, Bethesda, Md. En una modalidad, el porcentaje de identidad de dos secuencias puede determinarse a través del programa CGC con un peso de espacio de 1, por ejemplo, cada espacio de aminoácido es ponderado como si fuese un solo aminoácido o falta de correspondencia de nucleotidos entre dos secuencias. Otras técnicas de alineación se describen den Methods in Enzymology [Métodos en Enzimología] , vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Séquense Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, EUA. Preferentemente, un programa de alineación que permite espacios en las secuencias se utiliza para alinear las secuencias. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en las alineaciones de secuencias. Véase Meth. Mol. Biol . 70: 173-187 (1997). Asimismo, el programa GAP que utiliza el método de alineación Needleman y unsch puede utilizarse para alinear secuencias. Una estrategia de búsqueda alternativa utiliza el software MPSRCH, que funciona en una computadora MASPAR . MPSRCH utiliza el algoritmo Smith-Waterman para calificar secuencias en una computadora paralela de manera masiva. Este enfoque mejora la capacidad de encontrar correspondencias distantemente relacionados y es especialmente tolerante en el caso de pequeños espacios y errores de secuencias de nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos codificadas por ácido nucleico, pueden ser utilizados para buscar en base de datos de ADN y de proteina. Las bases de datos con secuencias individuales se describen en Methods in Enzymology, ed. Doolittle, supra. Las bases de datos incluyen Genbank, EMBL, y DNA Datábase of Japan (DDBJ) . El término '"hormona" se refiere a cualquiera de numerosas sustancias bioquímicas producidas por cierta célula o tejido y que causan un cambio biológico específico o una actividad biológica específica en otra célula o tejido que se encuentra en otra parte del cuerpo.

Una "célula huésped" se refiere a una célula translúcida con un vector de transferencia especifico. La célula es opcionalmente seleccionada entre células in vitro tales como las derivadas de cultivo celular, células ex vivo, tales como las derivadas de un organismo, y células in vivo, tales como las células en un organismo. La expresión "células huéspedes recombinantes" se refiere a células que han sido transformadas o transíectadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante . Las expresiones "células huéspedes" o "células huéspedes recombinantes" son términos que se utilizan de manera intercambiable aquí. Se entenderá que tales términos se refiere no solamente a la célula sujeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie de hecho puede nacer idéntica a la célula de origen, pero se sigue incluyendo dentro del alcance del término de conformidad con lo utilizado aquí. El término "hibridación" se refiere a cualquier proceso a través del cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de bases. La expresión "hibridación específica" de una sonda sobre un sitio blanco de un ácido nucleico de templado se refiere a la hibridación de la sonda predominantemente con el objetivo, de tal manera que la señal de hibridación pueda ser claramente interpretada. De conformidad con lo descrito adicionalmente aquí, tales condiciones que resultan en hibridación específica varían según la longitud de la región de homología, el contenido de GC de la región, la temperatura de fusión "Tm" del híbrido. Las condiciones de hibridación variarán por consiguiente en el contenido de sal, acidez y temperatura de la solución de hibridación y los lavados. El término "interactúa" incluye interacciones detectables entre moléculas, como por ejemplo las interacciones que pueden ser detectadas utilizando un ensayo de hibridación, por ejemplo. El término interactúa incluye también interacciones de "unión" entre moléculas. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, proteína-molécula pequeña o molécula pequeña-ácido nucleico por naturaleza. El término "aislado", con relación a ácidos nucleicos, como por ejemplo ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADNs, o ARNs, respectivamente, presente en la fuente natural de la macromolécula. El término "aislado" se refiere también a un ácido nucleico o péptido sustancialmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo cuando se produce a través de técnicas de ADN recombinante o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, un "ácido nucleico aislado" incluye fragmentos de ácido nucleico que no ocurren naturalmente como fragmentos y no se encuentran en estado natural. El término "aislado" se refiere también a polipéptidos aislados de otras proteínas celulares y abarca tanto polipéptidos purificados como recombinantes . Los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refieren a una molécula que puede ser detectada, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, isótopos radioactivos, fluoróforos, porciones quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, colorantes, iones metal, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y similares. El término "fluoróforo" se refiere a una sustancia o porción de la misma que puede presentar fluorescencia en el rango detectado. Ejemplos particulares de etiquetas que pueden ser utilizadas de conformidad con la presente invención incluyen fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, Texas red, luminol, NADPH, alfa -beta - galactosidasa y peroxidasa de rábano agrio. Los términos "blanco molecular" o "blanco" se refieren a una estructura molecular que es un gen o derivado de un gen que ha sido identificado utilizando los métodos de la invención como presentando una expresión diferencial con relación a otra célula eritroide de interés. Blancos ejemplares como tales son polipéptidos, hormonas, receptores, fragmentos de ADNds, carbohidratos o enzimas. Tales blancos se conocen también como "genes blanco", "péptidos blanco", "proteínas blanco" y similares. El término "modulación" se refiere a la regulación ascendente (es decir, activación o estimulación) , regulación descendente (es decir, inhibición o supresión) de una respuesta o las dos cosas en combinación o separadamente. La expresión "normalización de expresión de un gen" en una célula enferma se refiere a un medio para compensar la expresión alterada del gen en la célula enferma, de tal manera que es expresado esencialmente en el mismo nivel que en la célula no enferma correspondiente. Por ejemplo, cuando el gen es sobre expresado en la célula enferma, la normalización de su expresión en la célula enferma se refiere al tratamiento de la célula enferma de tal manera que su expresión se vuelva esencialmente a la expresión en la célula normal correspondiente. El término "normalización" lleva de preferencia el nivel de expresión dentro de aproximadamente una diferencia de 501 en cuanto a expresión, más preferentemente dentro de una diferencia de aproximadamente 25%, y todavía más preferentemente dentro de una diferencia de 10% en cuanto a expresión. El nivel requerido de cercanía en cuanto a expresión dependerá del gen particular y puede determinarse de conformidad con lo descrito aquí. La expresión "normalización de expresión de gen en una célula eritroide enferma" se refiere a un medio para normalizar la expresión de esencialmente todos los genes en la célula eritroide enferma. La expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) , y en caso apropiado, ácido ribonucleótido (ARN) . El término debe entenderse también como incluyendo, como equivalentes, análogos de ARN o de ADN elaborados a partir de análogos de nucleótidos y, en caso aplicable a la modalidad que se está describiendo, polinucleótidos de una sola cadena (sentido o antisentido) y polinucleótidos de doble cadena. ESTs, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr son ejemplos representativos de moléculas que pueden mencionarse como ácidos nucleicos. La expresión "ácido nucleico correspondiente a un gen" se refiere a un ácido nucleico que puede ser utilizado para detectar el gen, por ejemplo, un ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente con el gen. La expresión "muestra de ácido nucleico derivado de ARN" se refiere a una o varias moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN, que fue sintetizada a partir de ARN, e incluye ADN que resulta de los métodos utilizando reacción en cadena de polimerasa, por ejemplo, RT-PCR. El término "panel" como se emplea aquí, se refiere a un grupo de genes y/o sus proteínas codificadas identificadas a través de perfil de expresión de gen como expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis .

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" se refiere a modos de administración otros que la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal . Los términos "paciente", "sujeto" o "huésped" a tratar por el método de la presente invención pueden referirse ya sea a un ser humano o un animal no humano. El término "peptidomimético" se refiere a un compuesto que contiene elementos estructurales de tipo péptido que pueden imitar la(s) acción (es) biológica (s) de un polipéptido de origen natural. La expresión "identidad porcentual" se refiere a la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos. La identidad puede determinarse en cada caso mediante la comparación de una posición en cada secuencia que puede alinearse para propósito de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esta posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo residuo de aminoácido o un residuo de aminoácido similar (por ejemplo, similar en cuando a su naturaleza estérica y/o electrónica) , entonces las moléculas pueden mencionarse como homologas (similares) en esta posición. La expresión como porcentaje de homología, similaridad, o identidad se refiere a una función en número de aminoácidos idénticos y similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Varias alineaciones de algoritmos y/o programas pueden utilizarse, incluyendo FASTA, BLAST, o ESTRÉS. FASTA y BLAST están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias de GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden utilizarse por ejemplo, con los ajustes por omisión. ENTREZ está disponible en el Nacional Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md . En una modalidad, el porcentaje de identidad de dos secuencias puede determinarse por el programa CGC con un peso de espacio de 1, por ejemplo, cada espacio de aminoácido es ponderado como si fuese una sola falta de correspondencia de aminoácido o nucleótido entre las dos secuencias. Otras técnicas para alineaciones se describen den Methods in Enzymology [Métodos en Enzimología] , vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Séquense Analysis [Métodos Computarizados para Análisis de Secuencias Macromoleculares] (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace S Co., San Diego, California, EUA. Preferentemente, un programa de alineación que permite espacios en las secuencias se utiliza para alinear las secuencias. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en alineaciones de secuencias. Véase Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) . Asimismo, el programa GAP que utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch puede utilizarse para alinear secuencias. Una estrategia de búsqueda alternativa utiliza el software MPSRCH, que funciona en una computadora MASPAR. MPSRCH utiliza un algoritmo Smith-Waterman para calificar secuencias en una computadora paralela masivamente. Este enfoque mejora la capacidad de seleccionar correspondencias distantemente relacionadas y es especialmente tolerante de pequeños espacios y errores de secuencias de nucleótidos. Secuencias de aminoácidos codificadas por ácido nucleico, pueden emplearse para buscar base de datos de ADN y de proteina. Las bases de datos ccn secuencias individuales se describen en Methods in Enzymology [Métodos en Enzimología] , ed. Doolittle, supra. Las bases de datos incluyen Genbank, EMBL, y DNA Datábase of Japan (DDBJ) . La expresión "correspondencia perfecta" con referencia a un dúplex significa que las cadenas de polinucleótidos u oligonucleótidos que conforma el dúplex forman una estructura de cadena doble entre ellas de tal manera que cada nucleótido en cada cadena esté sometido a apareamiento de bases Watson- Crick con un nucleótido en la otra cadena. El término abarca también el apareamiento de análogos de nucleósidos, tales como desoxiinosina, nucleósidos con bases de 2-aminopurina, y similares, que pueden emplearse. Una falta de correspondencia en un dúplex entre un polinucleótido blanco y un oligonucleótido u olinucleótido significa que un par de nucleótidos en el dúplex no está sometido a enlace de Watson-Crick. Con referencia a un triplex, el término significa que el triplex consiste de un dúplex que corresponde perfectamente y una tercera cadena en donde cada nucleótido es sometido a una asociación Hoogsteen o Hoogsteen reversa con un par de bases del dúplex que corresponde perfectamente. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales de adición de ácido orgánico e inorgánico relativamente no tóxico de los compuestos. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, como por ejemplo un líquido o un rellenador sólido diluyente, excipiente, solvente o material de encapsulación que está involucrado en el transporte de cualquier suplemento o composición, o componente del mismo, desde un órgano o parte del cuerpo, a otro órgano u otra parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes del suplemento y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de material que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sucrosa; (2) almidones, como por ejemplo almidón de maíz, y almidón de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetil celulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes tales como manteca de cocoa y ceras para supositorios; (9) aceites, como por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar, (14) agentes de amortiguación, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico, (16) agua sin pirógeno; (17) solución salina isotó ica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de amortiguador de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. El "perfil" del estado biológico de una célula se refiere a los niveles de varios constituyentes de una célula que son conocidos por cambiar en respuesta a tratamientos farmacológicos y otras perturbaciones del estado biológico de las células. Constituyentes de una célula incluyen niveles de ARN, niveles de abundancias de proteína o niveles de actividad de proteína. Un perfil de expresión en una célula es "similar" a un perfil de expresión en otra célula cuando el nivel de expresión de los genes en los dos perfiles son suficientemente similares de tal manera que la similaridad es una indicación de una característica común, por ejemplo, el mismo tipo de célula. Por consiguiente, los perfiles de expresión de una primera célula y de una segunda célula son similares cuando por lo menos el 75% de los genes que son expresados en la primera célula son expresados en la segunda célula en un nivel que se encuentra dentro de un factor de dos con relación a la primera célula. La "policitemia" se refiere a un incremento en la producción de glóbulos sanguíneos rojos en un sujeto. Los términos "proliferación" y "proliferante" se refieren a células en proceso de mitosis. Un tratamiento "profiláctico" o "terapéutico" se refiere a la administración al huésped de una o varias de las composiciones sujeto. Si se administra antes de la manifestación clínica de la condición indeseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado indeseado del animal huésped) entonces el tratamiento es profiláctico, es decir, protege el huésped contra el desarrollo de una condición no deseada, mientras que si se administración después de la manifestación de la condición no deseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, se contempla para disminuir, mejorar o mantener la condición no deseada existente o sus efectos colaterales) : Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan de manera intercambiable aquí cuando se refieren a un producto génico, por ejemplo, producto codificado por una secuencia codificadora. Por "producto génico" entendemos la molécula producida como resultado de la transcripción de un gen. Los productos génicos incluyen moléculas de ARAN transcritas a partir de un gen así como proteínas traducidas a partir de tales transcriptos. Las expresiones "proteína recombinante", "proteína heteróloga" y "proteína exógena" se utilizan de manera intercambiable para referirse a un polipéptido producido por técnicas de ADN recombinante, en donde, en general, el ADN que codifica el polipéptido está insertado en un vector de expresión adecuado el cual a su vez es utilizado para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. Así, el polipéptido es expresado a partir de un ácido nucleico heterólogo. El término "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 kDa. Moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbón) o inorgánicas. Como lo observarán las personas con conocimientos en la material, con base en la presente descripción, bibliotecas de sustancias químicas y/o biológicas, bibliotecas extensas de mezclas químicas y/o biológicas, frecuentemente extractos fúngales, bacterianos, o de algas pueden ser tamizados con cualquiera de los ensayos de la presente invención para identificar compuestos que modulan una bioactividad. Las expresiones "célula madre" o "célula madre pluripotente" se conocen en la técnica y se refieren a una célula, que puede proliferar de manera indefinida y diferenciarse en células especializadas, que sirve como fuente continua de nuevas células. El término "sustituto" se refiere a una molécula biológica, por ejemplo, un ácido nucleico, péptido, hormona, etc., cuya presencia o concentración puede ser detectada y correlacionada con una condición conocida como por ejemplo una enfermedad. Las expresiones "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado periféricamente" se refieren a la administración de un suplemento sujeto, composición, agente terapéutico u otro material de manera distinta de la forma directa en el sistema nervioso central de tal manera que penetre en el sistema del paciente y por consiguiente es sometido a metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea. Las expresiones "agente terapéutico" o "terapéutico" se refieren a un agente gue puede tener un efecto biológico deseado sobre un huésped. Los agentes quimioterapéuticos y genotóxicos son ejemplos de agentes terapéuticos generalmente conocidos por ser químicos de origen a diferencia de los agentes biológicos o por causar un efecto terapéutico a través de un mecanismo particular de acción, respectivamente. Ejemplos de agentes terapéuticos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y citocinas . Varios agentes terapéuticos son conocidos en la técnica y pueden ser identificados por sus efectos. Algunos agentes terapéuticos son capaces de regular la proliferación de glóbulos rojos y su diferenciación. Ejemplos incluyen nucleótidos quimioterapéuticos, fármacos, hormonas, proteínas no específicas (no anticuerpo), oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos de antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico blanco (por ejemplo, secuencia de ARNm) ) , péptidos peptidomiméticos . La expresión "efecto terapéutico" se refiere a un efecto local o sistémico en animales, particulares mamíferos, y muy especialmente seres humanos, causado por una sustancia farmacológicamente activa. El término significa por consiguiente cualquier sustancia contemplada para su uso en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedad o bien en la mejora del desarrollo físico o mental deseable y condiciones en un animal o ser humano. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de dicha sustancia que produce algún efecto local o sistémico deseado con una proporción razonable entre beneficio y riesgo aplicable a cualquier tratamiento. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto dependerá de su índice terapéutico, solubilidad, y similares. Por ejemplo, algunos compuestos descubiertos por los métodos de la presente invención pueden ser administrados en una cantidad suficiente para producir un efecto deseado en una proporción razonable entre beneficio y riesgo aplicable a dicho tratamiento. El término "tratamiento" de una enfermedad en un sujeto o "tratamiento" de un sujeto que tiene una enfermedad se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de tal manera que por lo menos un síntoma de la enfermedad es disminuido o evitado . El término "variante", cuando se utiliza en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con la secuencia de gen X o la secuencia codificadora del mismo. Esta definición puede incluir también, por ejemplo, variantes "alélicas", "empalme", "especies", o "polimórficas" . Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero tendrá generalmente un número mayor o menor de polinucleótidos debido al empalme alternativo de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o ausencia de dominios. Variantes de especie son secuencias de polinucleótidos que varían de una especia a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán generalmente una identidad de aminoácidos significativa entre ellos. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Variantes polimórficas pueden también incluir ¦"polimorfismos de nucleótidos individuales" (SNPs) en donde la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNPs puede ser una indicación, por ejemplo, de una cierta población, un estado de enfermedad o una propensión para un estado de enfermedad. Una "variante" de polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de péptido X en donde está alterado en uno o varios residuos de aminoácidos. La variante puede tener cambios "conservadores", en donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares (por ejemplo, reemplazo de leucina por isoleucina) . Con menor frecuencia, una variante puede tener cambios "no conservadores" (por ejemplo, reemplazo de glicina por triptófano) . Variaciones menores análogas pueden también incluir deleciones o inserciones de aminoácidos o ambas cosas. Lineamientos para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados, o borrados sin cancelar la actividad biológica o inmunológica pueden encontrarse utilizando programas de cómputo bien conocidos en al técnica, por ejemplo, software LASERGENE (DNASTAR) . El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual está unido. Un tipo de vector preferido es un episomo, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosomal . Vectores preferidos son los vectores capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos al cual están unidos. Vectores capaces de dirigir la expresión de genes al cual están operativamente unidos se conocen a continuación como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas ADN recombinante tienen frecuentemente la forma de "plásmidos" que se refieren generalmente a bucles de ADN de doble cadena circulares, que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente certificación, los términos "plásmido" y "vector" se utilizan de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, como lo observarán las personas con conocimientos en la materia, la invención se contempla para que incluya otras formas de vectores de expresión que desempeñan funciones equivalentes y que serán conocidas en la técnica subsecuentemente. 3. - Paneles Novedosos de Objetivos Moleculares a lo Largo de la Via Eritropoyética Los paneles de genes que presentan una expresión diferencial durante la eritropoyesis comprenden genes involucrados en los siguientes procesos biológicos: transcripción, empalme, replicación, traducción, proteolisis, adhesión, señalización, ciclo celular, apóptosis y los procesos del ribosoma. Los genes pertenecen a las siguientes familias de genes: quinasas, fosfatasas, enzimas, proteínas G, ATPasas, receptores, proteínas estructurales, marcadores de superficie, así como proteínas de choque térmico. En una modalidad, los paneles de genes pueden consistir de por lo menos uno de los genes regulados de manera diferencial durante la eritropoyesis en la Tabla T (Figura 3). En algunas modalidades, el panel de genes consiste de por lo menos uno de los genes que son regulados de manera ascendente durante la eritropoyesis, varios ejemplos se presentan en la Tabla II (Figura 4). En otras modalidades, el panel de genes consiste de por lo menos uno de los genes que es regulado de manera descendente durante la eritropoyesis, varios ejemplos se presentan en la Tabla III (Figura 5). Los paneles novedosos de la presente invención pueden también consistir de los productos génicos de los genes de panel, por ejemplo, ARNm y proteínas. Los paneles comprenden grupos de objetivos moleculares que son contemplados para su uso en los métodos terapéuticos y de diagnóstico descritos abajo. Las Tablas ilustradas en las Figuras 3 a 5 se conocen a continuación simplemente como "Tabla I", "Tabla II", o "Tabla III". 4. - Agentes Terapéuticos para Regular la Eritropoyesis 4.1. Tamizado de Agentes Terapéuticos La presente invención se refiere además al uso de objetivos moleculares novedosos en método para tamizar agentes terapéuticos candidatos para su uso en el tratamiento de enfermedades y/o padecimientos de eritropoyesis. En una modalidad de la invención, el padecimiento es anemia En otra modalidad de la invención, el padecimiento es policitemia. En algunas modalidades, agentes terapéuticos candidatos o "agentes terapéuticos", son evaluados para determinar su capacidad para unirse a una proteina objetivo. Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser seleccionados entre las siguientes clases de compuesto: proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, citocinas, u hormonas. En otras modalidades, agentes terapéuticos candidatos son evaluados para determinar su capacidad para unirse a un gen objetivo. Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser seleccionados a partir de las clases siguientes de compuestos: ácidos nucleicos de antisentido, pequeñas moléculas, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos, o análogos de ácido nucleico. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden estar en una biblioteca de compuestos. Estas bibliotecas pueden ser generadas utilizando métodos sintéticos de combinación. En ciertas modalidades de la presente invención, la capacidad de dichos agentes terapéuticos candidatos para unirse a una proteína objetivo puede ser evaluada a través de un ensayo ín vitro. En modalidades de la invención en donde el objetivo de el agente terapéutico candidato es un gen, la capacidad del agente terapéutico candidato par unirse al gen puede ser evaluada a través de un ensayo in vitro. En cualquier modalidad, el ensayo de enlace puede efectuarse también ín vivo. La presente invención ofrece además métodos para evaluar agentes terapéuticos candidatos para determinar su capacidad para modular la expresión de un gen objetivo mediante la puesta en contacto de las células eritroide de un sujeto con dichos agentes terapéuticos candidatos. En ciertas modalidades, el agente terapéutico candidato será evaluado para determinar su capacidad para normalizar el nivel de expresión de un gen o grupo de genes involucrados en la promoción de la eritropoyesis . En esta modalidad, si el agente terapéutico candidato puede normalizar la expresión génica de manera que se promueva la eritropoyesis, puede considerarse como agente terapéutico candidato para la anemia. De la misma manera, en otras modalidades, si el agente terapéutico candidato puede normalizar la expresión génica de tal manera que se inhiba la eritropoyesis, puede considerarse un agente terapéutico candidato para policitemia. Los agentes terapéuticos candidatos pueden ser seleccionados entre las clases siguientes de compuestos: ácidos nucleicos de antisentido, ribozimas, A Nsi, mutantes negativos dominantes de polipéptidos codificados por los genes, moléculas pequeñas, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos , y análogos de ácido nucleico. Alternativamente, agentes terapéutico candidatos pueden ser evaluados para determinar su capacidad para inhibir la actividad de una proteína mediante la puesta en contacto de las células eritroides de un sujeto con dichos agentes terapéuticos candidatos. En ciertas modalidades, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad. Para inhibir la actividad de una proteína que promueve normalmente la eritropoyesis. En esta modalidad, un agente terapéutico candidato que presenta la capacidad de inhibir la actividad de proteína puede considerarse como agente terapéutico candidato para el tratamiento de la policitemia. En otras modalidades, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para inhibir la actividad de una proteína que normalmente, si es inhibida, promueve la eritropoyesis . En esta modalidad, un agente terapéutico candidato que presenta la capacidad de inhibir la actividad de proteina puede considerarse como agente terapéutico candidato para el tratamiento de la anemia. Además, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad para normalizar el nivel de rotación de una proteina codificada con un gen entre los paneles de la presente invención. En otra modalidad, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad de normalizar el nivel de traducción de una proteína codificada por un gen entre los paneles de la presente invención. En otra modalidad, un agente terapéutico candidato puede ser evaluado para determinar su capacidad de normalizar el nivel de rotación de un ARNm codificado por un gen entre los paneles de la presente invención. 4.2. Ensayos de Tamizado de Agente Terapéutico Ensayos y métodos para desarrollar ensayos apropiados para su uso en los métodos descritos se conocen por parte de las personas con conocimientos en la materia, y se contemplan para su uso en caso apropiado con los métodos de la presente invención. La capacidad de dichos agentes terapéuticos candidatos para unirse con una molécula blanco en los paneles de la presente invención puede determinarse empleando varios ensayos apropiados conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. En ciertas modalidades de la presente invención, la capacidad de un agente terapéutico candidato para unirse a una proteína blanco o gen puede evaluarse a través de un ensayo in vitro. En cualquier modalidad, el ensayo de enlace puede también ser un ensayo in vivo. Los ensayos pueden ser efectuados para identificar moléculas que modulan la expresión y/o actividad de un gen. Alternativamente, ensayos pueden ser efectuados para identificar moléculas que modulan la actividad de una proteína codificada por un gen. Una persona con conocimientos en la materia reconocerá que en ciertos ensayos de tamizado, será suficiente evaluar el nivel de expresión de un gen individual y que en otros, la expresión de dos o más genes se prefiere, mientras que en otros la expresión esencialmente todos los genes involucrados en la eritropoyesis se evalúa preferentemente. De la misma manera, será suficiente evaluar la actividad de una proteína individual en algunos ensayos de tamizados, mientras que en otros ensayos de tamizado, las actividades de varias proteínas pueden evaluarse. Ejemplos de ensayes contemplados para su uso dentro del marco de la presente invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, ensayo de enlace competitivo, ensayo de enlace directo, ensayo de dos híbridos, ensayo de proliferación celular, ensayo de quinasa, ensayo de fosfatasa, ensayo de translocalizador de hormona nuclear, ensayo de tamizado celular activado por fluorescencia (FACS) , ensayo de formación de colonia/placa, y ensayo de reacción en cadena de polimerasa. Tales ensayos son bien conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia y pueden ser adaptados a los métodos de la presente invención con solamente experimentos rutinarios. Todos los métodos de tamizado antes mencionados pueden lograrse utilizando varios formatos de ensayo. Tomando en cuenta la presente divulgación, los formatos no expresamente descritos aqui serán sin embargo conocidos y entendidos por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. Los ensayos pueden identificar fármacos que son, por ejemplo, agonistas o antagonistas, de la expresión de un gen blanco de interés, o de una interacción proteína-proteína o proteína-sustrato de un blanco de interés o de la función de productos génicos objetivo en la patogénesis de fisiología celular normal o anormal, proliferación y/o diferenciación y padecimientos relacionados. Formatos de ensayos que se aproximan a condiciones tales como la formación de complejo de proteína o complejo de proteína-ácido nucleico, actividad enzimática, o esta vía de señalización específica pueden ser generados de varias formas diferentes e incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, ensayos basados en sistemas sin células, por ejemplo, proteínas purificadas o Usados celulares, así como ensayos basados en células que utilizan células intactas. Como lo entenderán las personas con conocimientos en la materia, con base en la presente descripción, ensayos de enlace sencillos pueden ser utilizados para detectar agentes que, a través de la perturbación de la unión de interacciones proteína-proteina o interacciones proteina-ácido nucleico, o la unión subsecuente de dicho complejo o proteína individual o ácido nucleico individual sobre un sustrato, pueden inhibir la señalización u otros efectos que resultan de la interacción dada. Por ejemplo, si un polipéptido se une a otro polipéptido, fármacos pueden ser desarrollados los cuales modulan la actividad del primer polipéptido mediante la modulación de su enlace con el segundo polipéptido (se conoce a continuación como un "socio de enlace" o "socio de unión"). Ensayos libres de células pueden ser utilizados para identificar compuestos que son capaces de interactuar con un polipéptido o socio de enlace, con el objeto de modificar de esta manera la actividad del polipéptido o socio de enlace. Dicho compuesto puede, por ejemplo, modificar la estructura del polipéptido o socio de enlace y por consiguiente afectar su actividad, Ensayos libres de células pueden también ser utilizados para identificar compuestos que modulan la interacción entre un polipéptido y un socio de enlace. En una modalidad preferida, ensayos libres de células para identificar tales compuestos consisten esencialmente de una mezcla de reacción que contiene un polipéptido y un compuesto de prueba o una biblioteca de compuesto de prueba en presencia o ausencia de un socio de enlace. Un compuesto de prueba puede ser, por ejemplo, derivado de un socio de enlace, por ejemplo, un péptido biológicamente inactivo, o una molécula pequeña. Agentes a probar para determinar su capacidad para actuar como inhibidores de interacción pueden producirse, por ejemplo, a través de bacterias, levadura u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), producidos químicamente (por ejemplo, moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos ) , o bien producidos de manera recombinante . En una modalidad preferida, el agente terapéutico candidato es una molécula orgánica pequeña, por ejemplo, otra que un péptido u oligonucleótido, que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1,000 daltones.

En muchos programas de tamizado de fármaco que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, ensayos de alto rendimiento son deseables con el objeto de optimizar el número de compuestos estudiados en un período de tiempo dado. Ensayos de la presente invención . que son efectuados en sistemas sin células tales como los que pueden derivarse con proteínas purificadas o semi-purificadas o con Usados, se prefieren frecuentemente como tamizados "primarios" en la medida en que pueden ser generados para permitir un revelado rápido y una detección relativamente fácil de una alteración en un blanco molecular que es mediada por un compuesto de prueba. Además, los efectos de la toxicidad celular y/o biodisponibilidad del compuesto de prueba pueden ser generalmente ignorados en el sistema in vitro, el ensayo al contrario es enfocado primariamente al efecto del fármaco sobre el blanco molecular como es evidente en una alteración de la afinidad de enlace con otras proteínas o cambios en propiedades enzimáticas del blanco molecular. Por consiguiente, modificadores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores de las interacciones proteína-sustrato, interacciones proteina-proteína o interacciones ácido nucleico-proteína pueden ser detectados en un ensayo sin células generado por la constitución de interacciones de funciones de interés en un lisado celular. En un formato alterno, el ensayo puede ser derivado como mezcla de proteína reconstituida que, como se describe abajo, ofrece un numerosos beneficios en comparación con los ensayos basados en lisado. En un aspecto, la presente invención ofrece ensayos que pueden ser utilizados para tamizar para agentes que modulan interacciones proteína-proteína, interacciones ácido nucleico-proteína o interacciones proteína-sustrato. Por ejemplo, los ensayos de tamizado de fármaco de la presente invención pueden ser diseñados para detectar agentes que perturban el enlace de porciones de enlace de interacción proteína-proteína. En otras modalidades, los ensayos de la presente invención identifican inhibidores de la actividad enzimática de una proteína o complejo de interacción proteína-proteína. En un modalidad preferida, el compuesto es un inhibidor basado en mecanismo que altera químicamente un miembro de la interacción proteína-proteína o un grupo químico de una proteína y que es un inhibidor específico de este miembro, por ejemplo, tiene una constante de inhibición 10 veces, 100 veces o mayor preferencia 1000 veces diferente en comparación con proteínas homologas. En una modalidad de la presente invención, ensayos de tamizado de fármaco pueden ser generados los cuales detectan agentes inhibidores con base en su capacidad de interferir con el enlace de componente de una interacción proteína-sustrato, proteína-proteína, o ácido nucleico-proteína dada. En un ejemplo de ensayo de enlace, el compuesto de interés está en contacto con una mezcla generada a partir de polipéptidos de componentes de interacción proteína-proteína. La detección de cuantificación de la actividad esperada a partir de una interacción dada proteína-proteína proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación de complejo entre los dos polipéptidos. La eficacia del compuesto puede evaluada mediante la generación de curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos utilizando varias concentraciones del compuesto de prueba. Además, un ensayo de control puede también ser efectuado con el objeto de proporcionar una línea basal para propósito de comparación. En el ensayo de control, la formación de complejos es cuantificada en ausencia del compuesto de prueba. La formación de complejo entre polipéptidos de componente, polipéptidos y genes, o entre un polipéptido de componente y un sustrato puede detectarse a través de varias técnicas, muchas de las cuales son efectivamente descritas abajo. Por ejemplo, la modulación en la formación de complejos puede ser cuantificada utilizando, por ejemplo, proteínas marcadas de manera detectable (por ejemplo, radio-marcadas, marcadas de manera fluorescente, o bien marcadas enzimáticamente ) , por inmunoensayo, o bien a través de detección cromatográfica . Por consiguiente, un ensayo de tamizado de ejemplo de la presente invención incluye los pasos de poner en contacto un polipéptido o fragmento funcional del mismo o un socio de enlace con un compuesto de prueba o una biblioteca de compuestos de prueba y detectar la formación de complejos. Para propósitos de detección, la molécula puede ser marcada con un marcador específico y el compuesto de prueba o biblioteca de compuesto de prueba puede ser marcado con un marcador diferente. La interacción de un compuesto de prueba con un polipéptido o fragmento del mismo o socio de enlace puede detectarse a través de la determinación del nivel de los dos marcadores después de un paso de incubación y un paso de incubación. La presencia de dos etiquetas después del paso de lavado es una indicación de una interacción. Una interacción entre moléculas puede también ser identificado mediante la utilización de BIA en tiempo real (Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB) que detecta la resonancia de plasmón superficial (SPR), un fenómeno óptico. La detección depende de cambios en la concentración de masa de macroinoléculas en la interfaz bioespecífica y no requiere de ningún marcado de agentes que interactúan. En una modalidad, una biblioteca de compuestos de prueba puede ser movilizada en una superficie de sensor, por ejemplo, que forma una pared de una célula de micro-flujo. Una solución que contiene el polipéptido, fragmento funcional del mismo, análogo de polipéptido o socio de enlace es entonces pasada continuamente sobre la superficie del sensor. Un cambio en el ángulo de resonancia como se muestra en un registro de señal, indica que ha ocurrido una interacción. Es-a técnica se describe adicionalmente, por ejemplo, en BIAtechnology Handbook por Pharmacia. Otro ejemplo de ensayo de tamizado de la presente invención incluye los pasos de (a) formar una mezcla de reacción que incluye: (i) un polipéptido, (ii) un socio de enlace, e (iii) un compuesto de prueba; y (b) detectar la interacción del polipéptido y del socio de enlace. El polipéptido y el socio de enlace pueden ser producidos de manera recombinante, purificados a partir de una fuente, por ejemplo, plasma, o bien sintetizados químicamente, de conformidad con lo descrito aqui. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) de la interacción del polipéptido y socio de enlace en presencia del compuesto de prueba, en comparación con la interacción en ausencia del compuesto de prueba, indica un agonista potencial (mimético o potenciador) o antagonista potencial (inhibidor) de la bioactividad del polipéptido para el compuesto de prueba. Los compuestos de este ensayo pueden ser puestos en contacto simultáneamente. Alternativamente, un polipéptido puede estar en contacto primero con un compuesto de prueba durante un período apropiado de tiempo, después de lo cual el socio de enlace es agregado a la mezcla de la reacción. La eficacia del compuesto puede ser evaluada mediante la generación de curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos utilizando varias concentraciones del compuesto de prueba. Además, un ensayo de control puede también ser efectuado con el objeto de proporcionar una línea basal para propósitos de comparación. En el ensayo de control, un polipéptido aislado y purificado o socio de enlace se agrega a una composición que contiene el socio de enlace o polipéptido, y la formación de un complejo es cuantificada en ausencia del compuesto de prueba.

La formación de complejo entre un polipéptido y un socio de enlace puede ser detectada a través de varias técnicas. La modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada empleando, por ejemplo, proteínas marcadas de manera detectable como por ejemplo polipéptidos o socios de enlace radio-marcados, marcados de manera fluorescente, marcados de manera enzimática, por inmunoensayo o por detección cromatográfíca . Típicamente, será deseable inmovilizar ya sea el polipéptido o su socio de enlace para facilitar la separación de complejos de las formas que no están en forma de complejos de una o ambas de las proteínas, así como permitir la automatización del ensayo. El enlace de polipéptido sobre un socio de enlace puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de micro-centrifugación. En una modalidad, una proteína de fusión puede proporcionarse la cual agrega un dominio que permite la unión de la proteína sobre una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutation-S-transferasa/polipéptido (GST/polipéptido) pueden estar adsorbidas en perlas de glutation-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o bien placas de microtitulación derivadas de glutationa que son después combinadas con el socio de enlace, por ejemplo, un socio de enlace marcado con 35S, y el compuesto de prueba, y la mezcla es incubada bajo condiciones que llevan a la formación de complejos, por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y Ph, aún cuando se pueden desean condiciones ligeramente más estrictas. Después de la incubación, las perlas son lavadas para remover el marcador no unido, y la matriz es inmovilizada y la radio-etiqueta es determinada directamente (por ejemplo, perlas colocadas en agente de centelleo) , o bien en el sobrenadante después los complejos son subsecuentemente disociados. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados por SDS-PAGE, y el nivel de polipéptido o socio de enlace encontrado en la fracción de perla es cuantificada a partir del gen utilizando técnicas electroforéticas estándares tales como las descritas en los ejemplos adjuntos. Otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices están también disponibles para su uso en el ensayo de la presente invención. Por ejemplo, o bien el polipéptido o bien su socio de enlace correspondiente puede estar inmovilizado utilizando conjugación de biotina y estreptavidina . Por ejemplo, moléculas de polipéptido biotiniladas pueden ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) empleando técnicas bien conocidas (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) , e inmovilizadas en los pozos de placas de 96 pozos revestidas con estreptavidina (Pierce Chemical) . Alternativamente, anticuerpos reactivos con el polipéptido pueden ser derivados hacia los pozos de la placa, y el polipéptido atrapado en los pozos por conjugación con anticuerpo. Como arriba, las preparaciones de un socio de enlace y un compuesto de prueba se incuban en los pozos de presentación de polipéptido de la placa, y la cantidad de complejo atrapado en el pozo puede ser cuantificada . Métodos ejemplares para detectar tales complejos, además de los descritos arriba para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con el socio de enlace, o bien que reaccionan con el polipéptido y compiten con el socio de enlace; así como ensayos enlazados a enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con el socio de enlace, ya sea una actividad intrínseca o una actividad extrínseca. En este último caso, la enzima puede estar químicamente conjugada o suministrada como proteína de fusión con el socio de enlace. Para ilustrar este caso, el socio de enlace puede estar químicamente reticulado o genéticamente fusionado con peroxidasa de rábano agrio, y la cantidad de polipéptido atrapado en el complejo puede ser evaluada con un sustrato cromogénico de la enzima, por ejemplo, tetrahidrocloruro de 3, 3' -diamino-benzadina o 4-cloro-l-naftol . De manera similar, una proteína de fusión que comprende el polipéptido y glutation-S-transferasa puede proporcionarse, y la formación de complejo puede ser cuantificada mediante la detección de la actividad de GST utilizando l-cloro-2, 4-dinitrobenceno (Habig y colaboradores (1974) J. Biol. Chem. 249:7130). Para procesos que se basan en la inmunodetección para cuantificar una de las proteínas atrapadas en el complejo, se pueden utilizar anticuerpos contra la proteina como por ejemplo, anticuerpos anti-polipéptidos . Alternativamente, la proteína a detectar en el complejo puede estar "marcada con epítopo" en forma de una proteína de fusión que incluye, además de la secuencia de polipéptido, un segundo polipéptido para el cual anticuerpos están fácilmente disponibles (por ejemplo, de fuentes comerciales) . Por ejemplo, las proteínas de fusión GST descritas arriba pueden también estar utilizadas para cuantificar el enlace utilizando anticuerpos contra la porción GST. Otras etiquetas de epítopo útiles incluyen epítopos myc (por ejemplo, véase Ellison y colaboradores (1991) J. Biol. Chem. 266:21150-21157) que incluye una secuencia de 10 residuos desde c-myc, así como el sistema Pflag (International Bitechnologies, Inc.) o el sistema pez-proteína A (Pharmacia, NJ) . En modalidades preferidas in vitro de la presente invención, la proteína o el grupo de proteínas que participan en una interacción proteína-proteína, sustrato-proteína, o proteína-ácido nucleico comprende una mezcla de proteína reconstituida de proteínas por lo menos semi-purificadas . Por semi-purificadas entendemos que las proteínas utilizadas en la mezcla reconstituida han sido previamente separadas de otras proteínas celulares o virales. Por ejemplo, en contraste con Usados celulares, las proteínas involucradas en una interacción proteína-sustrato, proteína-proteína o ácido nucleico-proteína están presentes en la mezcla con una pureza de por lo menos el 50% con relación a todas las demás proteínas en la mezcla, y con mayor preferencia están presentes con una pureza de 90-95%. En algunas modalidades del método de la presente invención, la mezcla de proteína reconstituida es derivada mediante el hecho de mezclar proteínas altamente purificadas de tal manera que la mezcla reconstituida sustancialmente no tenga otras proteínas (como por ejemplo de origen celular o viral) que pudieran interferir o alterar de otra forma la capacidad de medir la actividad resultante de la interacción proteína-sustrato, proteína-proteína dada, o la interacción ácido nucleico-proteína . En una modalidad, el uso de mezclas de proteínas reconstituidas permite un control más cuidadoso de las condiciones de interacciones proteína-sustrato, proteína-proteína, o ácido nucleico-proteína. Además, el sistema puede ser derivado para favorecer el descubrimiento de inhibidores de estados intermedios particulares de la interacción proteína-proteína. Por ejemplo, un ensayo de proteína reconstituida puede ser efectuado tanto en presencia como en ausencia de un agente candidato, permitiendo asi la detección de un inhibidor de una interacción proteina-sustrato, proteína-proteina, o ácido nucleico-proteína dada. El ensayo de la actividad biológica resultante de una interacción dada proteina-sustrato, proteína-proteina o ácido nucleico-proteína, en presencia y ausencia de un inhibidor candidato, puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos se micro-centrifugación. Típicamente, será deseable inmovilizar uno de los polipéptidos para facilitar la separación de complejos desde las formas que no son complejos de una de las proteínas, así como permitir la automatización del ensayo. En una modalidad ilustrativa, una proteína de fusión puede ser proporcionada la cual agrega un dominio que permite la unión de la proteína sobre una matriz insoluble. Por ejemplo, proteínas de fusión de componente de interacción proteína-proteína pueden ser adsorbidas en perlas de glutation-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivadas de glutation, que son después combinadas con una proteína de interacción potencial, por ejemplo, un polipéptido marcado con 35S, y el compuesto de prueba e incubadas bajo condiciones que llevan a la formación de complejos. Después de la incubación, las perlas son lavadas para remover la proteína de interacción no unida, y se determina directamente la radio-etiqueta unida a perla de matriz (por ejemplo, perlas colocadas en agente de centelleo) , o bien en sobrenadante después de la disociación de los complejos, por ejemplo, cuando se utiliza una placa de microtitulación . Alternativamente, después de la remoción por lavado de la proteina no unida, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados por SDS-PAGE gel, y se puede encontrar el nivel de polipéptido que interactúa en la fracción unida a matriz cuantificada a partir del gcl utilizando técnicas electroforéticas estándares. En otra modalidad, el componente de interacción proteina-proteína o polipéptido de interacción potencial puede utilizarse para generar un ensayo de atrapamiento de interacción o dos híbridos (véase también Patente Norteamericana No. 5,238,317; Zervos y colaboradores (1933) Cell 72:223-232; Madura y colaboradores (1993) J. Biol . Chem. 268:120'46-12054; Bartel y colaboradores (1993) BioTechniques 14:920-924; e Iwabuchi y colaboradores (1993) Oncogene 8:1693-1696), para detectar subsecuentemente agentes que perturban la unión de los componentes de interacción entre ellos . En particular, el método utiliza genes quiméricos que expresan proteínas híbridas. Para ilustrar un primer gen híbrido comprende la secuencia codificadora para un dominio de enlace con ADN de un activador de transcripción puede estar fusionado en cuadro con la secuencia codificadora para una proteina "carnada", por ejemplo, un polipéptido de componente de interacción proteina-proteina de longitud suficiente para unirse a una proteina de interacción potencial. La segunda proteína híbrida codifica un dominio de activación de transcripción fusionado en cuadro sobre un en que codifica una proteína "pez", por ejemplo, una proteina de interacción potencial de longitud suficiente para interactuar con la porción de polipéptido de componente de interacción proteína-proteína de la proteína de fusión carnada. Si las proteínas carnada y pez pueden interactuar, por ejemplo, formar un complejo de componente de interacción proteína-proteína, acercan los dos dominios del activados de transcripción. Esta cercanía provoca la transcripción de un gen reportero enlazado operativamente a un sitio regulador de transcripción que responde al activador de transcripción, y la expresión del gen reportero puede ser detectado y utilizado para calificar la interacción de las proteínas de tipo carnada y de tipo pez. De conformidad con la presente invención, el método incluye el hecho de suministrar una célula huésped, preferentemente una célula de levadura, por ejemplo, Kluyverei lactis, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago mayáis, Saccharomyces cerevisiaer Neurospora crassa, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Pichía pastoría, Candida tropicalis, y Hansenula polimorfa, aún cuando más preferentemente S. cerevisiae o S. pombe. La célula huésped contiene un gen reportero que tiene un sitio de enlace para el dominio de enlace con ADN de un activador de transcripción utilizado en la proteina de tipo carnada de tal manera que el gen reportero exprese un producto génico detectable cuando el gen es activado de manera transcripcional . El primer gen quimérico puede estar presente en un cromosoma de la célula huésped, o bien como parte de un vector de expresión. La célula huésped contiene también un primer gen quimérico que puede ser expresado en una célula huésped. El gen codifica una proteina quimérica, que comprende (i) un dominio de enlace con ADN que reconoce el elemento que responde del gen reportero en la célula huésped, e (ii) una proteina de tipo carnada, como por ejemplo una secuencia de polipéptido de componente de interacción proteina-proteina . Un segundo gen quimérico se proporciona también el cual puede ser expresado en la célula huésped, y codifica la proteina de fusión de tipo "pez". En una modalidad, tanto el primer gen quimérico como el segundo gen quimérico son introducidos en la célula huésped en forma de plásmidos. Preferentemente, sin embargo, el primer gen quimérico está presente en un cromosoma de la célula huésped y el segundo gen quimérico es introducido en la célula huésped como parte de un plásmido.

Preferentemente, el dominio de enlace con ADN de la primera proteina híbrida y el dominio de activación de transcripción de la segunda proteína híbrida se derivan de activadores de transcripción que tienen dominios de enlace con ADN y activación de transcripción separables. Por ejemplo, estos dominios de enlace con ADN y de activación de transcripción separados son conocidos por encontrarse en la proteína de levadura GAL4, y se sabe que se encuentran en las proteínas de levadura GCN4 y ADR1. Muchas otras proteínas involucradas en la transcripción tienen también dominios de enlace y de activación de transcripción separables que hacen que sean útiles para la presente invención, e incluyen, por ejemplo, las proteínas LexA y VP16. Se entenderá que otros dominios de enlace con ADN y sustancialmente transcripcionalmente inertes pueden ser utilizados en los constructos de la presente invención; tales como dominios de ACE1, XCi, represor lac, j un o fos . En otra modalidad, el dominio de enlace con ADN y el dominio de activación transcripcional pueden ser de proteínas diferentes. El uso de un dominio de enlace con ADN de LexA ofrece ciertas ventajas, por ejemplo, en levadura, la porción LexA no contiene función de activación ni tiene efectos conocidos sobre la transcripción de genes de levadura. Además, el uso de LexA permite controlar la sensibilidad del ensayo al nivel de la interacción (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO94/10300 de Brent y colaboradores) . En modalidades preferidas, cualquier actividad enzimática asociada con la desactivación de proteínas de tipo carnada o pez, por ejemplo, mutantes negativos dominantes o de otros 5 tipos de un componente de interacción proteína-proteina puede emplearse . Siguiendo con el ejemplo ilustrado, la interacción mediada por componente de interacción proteína-proteína, si existe, entre las proteínas de fusión de carnada y pez en la célula C huésped, provoca por consiguiente, que el dominio de activación active la transcripción del gen reportero. El método se efectúa mediante la introducción del primer gen quimérico y del segundo gen quimérico en la célula huésped, y sometiendo esta célula a condiciones en las cuales las 5 proteínas de fusión carnada y pez son expresadas en cantidad suficiente para la activación del gen reportero. La formación de un complejo de componente de interacción proteína- proteína/proteína de interacción resulta en una señal detectable producida por la expresión del gen reportero. Por 0 consiguiente, el nivel de formación de un complejo en presencia de un compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba puede ser evaluado mediante la detección del nivel de expresión del gen reportero en cada caso. Varios constructos reporteros pueden ser utilizados de conformidad 5 con los métodos de la invención e incluyen, por ejemplo, genes reporteros que producen señales detectables tales como las seleccionadas dentro del grupo que consiste de una señal enzimática, una señal fluorescente, una señal fosforescente y resistencia a fármacos. Un aspecto de la presente invención ofrece preparaciones de proteínas reconstituidas, por ejemplo, combinaciones de proteínas que participan en interacciones proteína-proteína. En otras modalidades adicionales del presente ensayo, la interacción proteína-proteína de interés es generada en células enteras, aprovechando técnicas de cultivo celular para soportar el ensayo de la presente invención. Por ejemplo, de conformidad con lo descrito abajo, la interacción proteína-proteína de interés puede estar constituida en un sistema de cultivo de células eucarióticas , incluyendo células de mamífero y de levadura. Las ventajas de la generación del ensayo de la presente invención en una célula intacta incluye la capacidad de detectar inhibidores que son funcionales en un entorno que se acerca de manera más estrecha al entorno de uso terapéutico del inhibidor, incluyendo la capacidad del agente para penetrar en la célula. Además, algunas de las modalidades in vivo del ensayo, como los ejemplos proporcionados abajo, se prestan para un análisis de alto rendimiento de agentes candidatos. Los componentes de la interacción proteína-proteína de interés pueden ser endógenos para las células seleccionadas para soportar el ensayo. Alternativamente, algunos o la totalidad de los componentes pueden ser derivados de fuentes exógenas . Por ejemplo, proteínas de fusión pueden ser introducidas en la célula mediante técnicas recombinantes (como por ejemplo, mediante el uso de un vector de expresión) , así como mediante microinyección de la proteína de fusión misma o TARNm que codifica la proteína de fusión. De cualquier manera, la célula es finalmente manipulada después de incubación con un inhibidor candidato con el objeto de facilitar la detección de un evento de señalización mediada por interacción proteína-proteína (por ejemplo, modulación de una modificación post transnacional de un sustrato de componente de interacción proteína-proteína, como por ejemplo fosforilación, modulación de transcripción de un gen en respuesta a señalización celular, etc.). De conformidad con lo descrito arriba para ensayo efectuados en mezclas de proteínas reconstituidas o lisado, la efectividad de un inhibidor candidato puede ser evaluada mediante la medición directa de las características del polipéptido componente de interacción proteína-proteína, como por ejemplo cambios en cuanto a peso molecular por medios electroforéticos o detección en un ensayo de enlace. Para estas modalidades, la célula será típicamente lisada al final de la incubación con el agente candidato, y el lisado será manipulado en un paso de detección de una manera muy similar a la mezcla de proteína reconstituida o lisado, por ejemplo, que se describió arriba. Una medición indirecta de la interacción proteina-proteína puede también lograrse mediante la detección de la actividad biológica asociada con un componente de interacción proteína-proteína que es modulado por un evento de señalización mediado por interacción proteína-proteína. De conformidad con lo indicado arriba, el uso de proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de componente de interacción proteína-proteína y una actividad enzimática son modalidades representativas del ensayo de la presente invención en donde el medio de detección se basa en la medición indirecta de un polipéptido de componente de interacción proteína-proteína mediante la cuantificación de una actividad enzimática asociada. En otras modalidades, la actividad biológica de un polipéptido de componente de interacción de ácido nucleico-proteína, sustrato o proteína-proteína puede ser evaluada mediante el monitoreo de los cambios en el fenotipo de la célula objetivo. Por ejemplo, el medio de detección puede incluir un constructo de gen reportero que incluye un elemento regulador de transcripción que depende de alguna manera del nivel de un componente de interacción o un sustrato de componente de interacción. El componente de interacción de proteína puede proporcionarse como una proteína de fusión con un dominio que se une a un elemento de ADN del constructo de gen reportero. El dominio agregado de la proteina de fusión puede ser un dominio en el cual, a través de su capacidad de enlace con ADN, se eleva o disminuye la transcripción del gen reportero. Cualquiera que sea el caso, su presencia en la proteína de fusión hace que sea responsable de la vía de señalización mediada por interacción proteína-proteína. Por consiguiente, el nivel de expresión del gen reportero variará con el nivel de expresión del componente de interacción de proteína. El producto de gen reportero es una etiqueta detectable, como por ejemplo luciferasa, ß-lactamasa o ß-galactosidasa, y es producido en la célula intacta. La etiqueta puede ser medida en un lisado subsecuente de la célula. Sin embargo, el paso de lisis es evitado preferentemente, y el suministro de un paso de lisis de la célula para medir la etiqueta se empleará típicamente solamente en casos en ios cuales la detección de la etiqueta no puede lograrse en células enteras. Además, en las modalidades de células enteras del ensayo de la presente invención, el constructo de gen reportero puede proporcionar, bajo expresión, un marcador seleccionable . Un gen reportero incluye cualquier gen que expresa un producto génico detectable, que puede ser A N o proteína. Genes reporteros preferidos son los genes fácilmente detectables. El gen reportero puede también estar incluido en el constructo en forma de un gen de fusión con un gen que incluye secuencias reguladoras de transcripción deseadas o presenta otras propiedades deseables. Por ejemplo, el producto del gen reportero puede ser una enzima que otorga resistencia a los antibióticos o a otro fármaco, o una enzima que complementa una deficiencia en la célula huésped (es decir, timidina quinasa o dihidrofolato reductasa) . Para ilustrar este punto, la aminoglicósido fosfotransferasa codificada por el gen de transposon bacteriano Tn5 neo puede estar colocado bajo el control transcripcional de un elemento promotor que responde al nivel de un polipéptido de componente de interacción proteina-proteina presente en la célula. Tales modalidades del ensayo de la presente invención son especialmente adecuadas para análisis de alto rendimiento en donde la proliferación de la célula puede ofrecer una medida sencilla de la inhibición de la interacción. Otros ejemplos de genes reporteros incluyen, sin limitarse a CAT (cloranfenicol acetil transferasa) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282:864-869) luciferaza, y otros sistemas de detección de enzima, tales como ß-galactosidasa, ß-lactamasa, (G. Zlokarnik y colaboradores (1998) Science, 279:84-88); luciferaza de luciérnaga (deWet y colaboradores (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737); luciferaza bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin y colaboradores (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh y colaboradores (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hall y colaboradores (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101), fosfatasa alcalina secretada placental humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216: 362-368). La cantidad de transcripción del gen reportero puede medirse empleando cualquier método conocido por parte de una persona con conocimientos en la materia. Por ejemplo, la expresión especifica de ARNm puede ser detectada empleando Northern volts o producto proteinico especifico puede ser identificado a través de una cepa característica, Western blot o una actividad intrínseca. En modalidades preferidas, el producto de un gen reportero puede ser detectado a través de una actividad intrínseca asociada con este producto. Por ejemplo, el gen reportero puede codificar un producto génico que, a través de actividad enzimática, produce una señal de detección basada en color, fluorescencia o luminiscencia. La cantidad de expresión del gen reportero se compara entonces con la cantidad de expresión ya sea en la misma célula en ausencia del compuesto de prueba o bien puede compararse con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que no tiene un componente de la interacción proteína-proteína de interés. 4.3. Tamizado de Eficacia de Agente Terapéutico La eficacia de agentes terapéuticos candidatos identificados utilizando los métodos de la invención puede ser evaluada, por ejemplo, por a) la puesta en contacto de células eritroides de un sujeto con un agente terapéutico candidato y b) la determinación de su capacidad para normalizar el nivel de eritropoyesis en las células del sujeto utilizando ensayos dirigidos a la determinación del nivel de eritropoyesis. Si un ensayo muestra que dicho agente terapéutico candidato induce igual que el nivel de eritropoyesis, entonces el candidato puede ser considerado como fármaco realzador de la eritropoyesis. A la inversa, si un ensayo muestra que un agente terapéutico candidato inhibe el nivel de eritropoyesis, entonces el candidato puede ser considerado como un fármaco inhibidor de la eritropoyesis. Alternativamente, la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos puede ser evaluada comparando los niveles de expresión de uno o varios genes asociados con la eritropoyesis en un glóbulo rojo sanguíneo de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético con los niveles de expresión en un glóbulo rojo normal. En una modalidad, el nivel de expresión de los genes puede ser determinado utilizando micro-conjuntos u otros métodos de cuantificación de ARN, o bien mediante la comparación del perfil de expresión del gen de una célula eritroide tratada con un agente terapéutico candidato con el perfil de expresión de gen de una célula eritroide normal.

La eficacia de los compuestos puede ser probada entonces en ensayos in vitro adicionales e in vivo, y en estudios de xenoinjerto de tumor. Un compuesto de prueba puede ser administrado a un animal de prueba y la inhibición del crecimiento tumoral puede ser monitoreada. La expresión de uno o varios genes característicos de padecimientos eritropoyéticos puede también medirse antes y después de la administración del compuesto de prueba al animal. Una normalización de la expresión de uno o varios de estos genes es una indicación de la eficiencia del compuesto para el tratamiento de padecimientos eritropoyéticos en el animal. En otra modalidad de la invención, un fármaco es desarrollado a través de un diseño racional de fármaco, es decir, se diseña o se identifica con base en información almacenada en forma legible en computadora y analizado por algoritmos. Se están estableciendo actualmente más y más bases de datos de perfiles de expresión, numerosas bases están disponible al público. Mediante el tamizado de tales bases de datos para la descripción de fármacos que afectan la expresión de por lo menos algunos de los genes característicos de un padecimiento eritropoyético en un mamífero similar al cambio de perfil de expresión génica de una célula eritroide enferma con una célula normal que corresponde a la célula eritroide enferma, se puede identificar compuestos que normalizan la expresión génica en una célula eritroide enferma. Derivados y análogos de tales compuestos pueden entonces ser sintetizados para optimizar la actividad del compuesto, y probados y analizados de conformidad con lo descrito arriba. Compuestos identificados por los métodos descritos arriba están dentro del marco de la presente invención. Composiciones comprenden tales compuestos, en particular, composiciones que comprenden una cantidad farmacéuticamente eficiente del fármaco en un vehículo farmacéuticamente aceptable se proporcionan también. Algunas composiciones comprenden uno o varios compuestos activos para tratar padecimientos eritropoyéticos . 4.4. Composiciones Farmacéuticas de Agentes Terapéuticos La presente invención ofrece además métodos para el tratamiento de padecimientos de la eritropoyesis utilizando composiciones que comprenden agentes terapéuticos identificados empleando los métodos de tamizado proporcionados por la invención. La presente invención contempla el uso de composiciones farmacéuticas para normalizar el nivel de eritropoyesis en un paciente con un padecimiento eritropoyético . En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son utilizada para tratar pacientes con anemia. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas se utilizan para tratar pacientes con policitemia. Tales métodos pueden incluir la administración a un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agonista o antagonista de uno o varios genes o sus productos génicos codificados involucrados en la regulación de la eritropoyesis . Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados de varias formas, según el uso contemplado, como se sabe en la técnica. Por ejemplo, si compuestos de la presente invención deben ser administrados oralmente, pueden ser formulados como tabletas, cápsulas, gránulos, polvos o jarabes. Alternativamente, formulaciones de la presente invención pueden ser administradas parenteralmente como inyecciones (intravenosas, intramusculares subcutáneas), preparaciones para infusión gota a gota o supositorios. Para aplicación por vía de membrana mucosa oftálmica, los compuestos de la presente invención pueden ser formulados como gotas para los ojos o ungüentos para los ojos. Estas formulaciones pueden ser preparadas por medios convencionales, y si se desea, los compuestos pueden ser mezclados con cualquier aditivo convencional, como por ejemplo excipiente, aglomerante, agente de desintegración, lubricante, corrector, agente de solubilización, auxiliar de suspensión, emulsificante o agente de revestimiento. En formulaciones de la presente invención, agentes humectantes, emulsi ficantes y lubricantes, tales como sulfato de lauril sódico y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, endulzantes, saborizantes y perfumes, conservadores y antioxidantes pueden estar presentes en los agentes formulados . Compuestos de la presente invención pueden ser adecuados para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal, aerosol y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en formas unitarias de dosificación y pueden prepararse a través de cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de agente que puede combinarse con un material vehículo para producir una sola dosis varía según el sujeto que se está tratando y el modo particular de administración. Métodos para preparar estas formulaciones incluyen el paso de asociar agentes de la presente invención con el vehículo y, opcionalmente, uno o varios ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan mediante el hecho de asociar uniforne e íntimamente agentes con vehículos líquidos, o bien vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, en caso necesario, se le da al producto una forma específica. Formulaciones adecuadas para administración oral pueden tener forma de cápsulas, pildoras, grageas, tabletas, pastillas (utilizando una base de sabor, habitualmente sucrosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos, o bien en forma de una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o bien como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite o bien en forma de un elixir o jarabe, o bien como pastillas (utilizando una base inerte como por ejemplo gelatina y glicerina, o sucrosa y acacia) , cada una conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto como ingrediente activo. Compuestos de la presente invención pueden también administrarse en forma de bolo, electuario o pasta . En formas sólidas de dosificación para administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, gránulos y similares) , el complejo de coordinación se mezcla con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) rellenadores o extendedores tales como almidones, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol y/o ácido de silícico; (2 ) aglomerantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sucrosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes de desintegración, como por ejemplo agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o de tapioca, ácido algínico, algunos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de solución, por ejemplo como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, como por ejemplo, alcohol acetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, como por ejemplo caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, como por ejemplo talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, sulfato de laurilo sódico, y mezclas de los mismos; y (10) colorantes. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones pueden comprender también agentes de amortiguación. Composiciones sólidas de un tipo similar pueden también emplearse como rellenadores en cápsulas de gelatina blanda y dura rellenadas utilizando excipientes tales como lactosa o azucares de leche, asi como polietilenglicoles de altos pesos moleculares y similares. Una tableta puede ser elaborada por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o varios ingredientes accesorios. Tabletas comprimidas pueden ser preparadas empleando aglomerante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, agentes de desintegración (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetil celulosa sódica reticulada) , agente tenso activo o dispersante. Tabletas moldeadas pueden ser elaboradas mediante el moldeo en una máquina adecuada de una mezcla del suplemento o de los componentes humedecidos con un diluyente liquido inerte. Tabletas, y otras formas sólidas de dosificación, como por ejemplo, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos, pueden ranurados opcionalmente o preparados con revestimientos y envolturas como por ejemplo revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación de agentes farmacéuticos. Formas liquidas de dosificación para administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, micro emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del compuesto, las formas liquidas de dosificación pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como por ejemplo, agua y otros solventes, agentes de solubilización y emulsificantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1, 3-butilenglicol, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuate, maíz, germen, oliva, ajonjolí y ricino), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Suspensiones, además de compuestos, pueden contener agentes de suspensión, por ejemplo, alcoholes isoestearílieos etoxilados, polioxietileno sorbitol o ésteres de sorbitano, celulosa micro cristalina, metahidróxido de aluminio, bentonito, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos. Formulaciones para administración rectal o vaginal pueden tener la forma de supositorios que pueden prepararse mediante la mezcla de un complejo de coordinación de la presente invención con uno o varios excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cocoa, polietilenglicol, cera para supositorio o salicilato, y que se encuentran en estado sólido a temperatura ambiente pero en estado líquido a temperatura corporal y por consiguiente, se derriten en la cavidad corporal y liberan el agente activo. Formulaciones que son adecuadas para administración vaginal incluyen también pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de rocío que contienen tales vehículos conocidos en la técnica por ser apropiados . Formas de dosificación para administración transdérmica de un suplemento o complemento incluye polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. Los componentes activos pueden mezclarse bajo condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservador, amortiguador o impelente que pueda requerirse. Para administración transdérmica de complejos de metales de transición, los complejos pueden incluir grupos lipofílicos e hidrofílicos para lograr la solubilidad deseada en agua y las propiedades deseadas de transporte. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un suplemento o componentes del mismo, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, silicona, bentonitos, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos. Polvos y rocíos pueden contener, además de un suplemento o complemento del mismo, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Rocíos pueden contener además impelentes habituales tales como clorofluorohidrocarbauros e hidrocarburos volátiles insustituidos tales como butano y propano. Compuestos de la presente invención pueden ser administrados alternativamente por aerosol. Esto se logra mediante la preparación de un aerosol acuoso, preparación liposomal o partículas sólidas que contienen el compuesto. Una suspensión no acuosa (por ejemplo, impelente de fluoro arburo) puede utilizarse. Agentes de atomización sónicos pueden utilizarse puesto que minimizan la exposición del agente al corte, lo que puede resultar en degradación del compuesto. Habitualmente, un aerosol acuoso se elabora mediante la formulación de una solución acuosa o suspensión del compuesto junto con vehículos y estabilizadores farmacéuticamente aceptables convencionales. Los vehículos y estabilizadores varían con requisitos del compuesto particular pero incluyen típicamente surfactantes no iónicos (Tweens, Pluronics, o polietilenglicol ) , proteínas inocuas tales como albúmina sérica, ésteres de sorbitano, ácido oleico, lecitina, aminoácidos tales como glicina, amortiguadores, sales, azucares o alcoholes de azucares. Aerosoles se preparan generalmente a partir de soluciones isotónicas. Composiciones farmacéuticas de esta invención adecuados para administración parenteral comprenden uno o varios componentes de un suplemento en combinación con una o varias soluciones isotónicas estériles acuosas o no acuosas farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de uso, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos , solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del receptor contemplado o agentes de suspensión o espesadores. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), así como mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento tales como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño requerido de las partículas en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes . 4.5 Métodos de Tratamiento utilizando Composiciones Farmacéuticas La dosificación de cualquier composición farmacéutica de la presente invención varía según los síntomas, la edad, el peso corporal del paciente, la naturaleza y severidad de la enfermedad a tratar o a prevenir, la vía de administración, y la forma del suplemento. Cualquiera de las formulaciones de la presente invención puede administrase en una sola dosis o bien dosis divididas. Las dosificaciones para los compuestos de la presente invención pueden ser fácilmente determinadas a través de técnicas conocidas por las personas con conocimientos en la materia o bien de conformidad con lo enseñado aquí. Asimismo, la presente invención ofrece mezclas de más que un compuesto sujeto, así como otros agentes terapéuticos . El tiempo exacto de administración y cantidad precisa de cualquier compuesto particular que ofrecerá el tratamiento más eficaz en un paciente dado dependerá de la actividad, características farmacocinéticas y biodisponibilidad de un compuesto particular, condición fisiológica del paciente {incluyendo edad, sexo, tipo y etapa de la enfermedad, condición física general, respuesta a una dosificación dada y tipo de medicación), vía de administración, y similares. Los lineamientos presentados aquí pueden ser utilizados para optimizar el tratamiento, por ejemplo, determinando el tiempo óptimo y/o cantidad óptima de administración, lo que no requerirá más que experimentos rutinarios que consisten de monitoreo del sujeto y ajuste de la dosis y/o tiempo de administ ación . Mientras se está tratando el sujeto, la salud del paciente puede ser monitoreada mediante la medición de uno o varios de los índices relevantes en momentos predeterminados durante un período de 24 horas. El tratamiento, incluyendo suplemento, cantidades, tiempos de administración y formulación, puede optimizare de conformidad con los resultados de dicho monitoreo. El paciente puede ser revaluado periódicamente para determinar la magnitud de la mejora mediante la medición de tales parámetros, la primera de dicha reevaluación ocurre típicamente al final de cuatro semanas desde el principio de la terapia, y reevaluaciones subsecuentes que ocurren cada cuatro a ocho semanas durante la semana y después cada tres meses. La terapia puede proseguir durante varios meses o hasta años, con un mínimo de un mes siendo la duración típica de la terapia para seres humanos. Ajustes a la cantidad (a las cantidades) de agente que se administran y posiblemente a la hora de la administración pueden efectuarse con base en estas reevaluaciones.

El tratamiento puede ser iniciado con dosificaciones más pequeñas que son inferiores a la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, la dosificación puede ser aumentada en incrementos pequeños hasta alcanzar el efecto terapéutico óptimo . El uso combinado de varios conpuestos de la presente invención, o alternativamente otros agentes quimioterapéuticos, puede reducir la dosificación requerida de cualquier componente individual puesto que el inicio y la duración de efecto de los diferentes componentes pueden ser complementados. En dicha terapia combinada, los agentes activos diferentes pueden ser administrados juntos o separadamente, y simultáneamente o en horas diferentes en el día . La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos de la presente invención pueden ser determinadas por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinación de la LD50 y la ED50. Composiciones que presentan grandes índices terapéuticos se prefieren. Aun cuando compuestos que presentan efectos colaterales tóxicos pueden ser utilizados, se debe tomar precauciones para diseñar un sistema de administración que enfoque los compuestos al sitio deseado con el objeto de reducir los efectos colaterales. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivos celulares y estudios con animales pueden utilizarse en la formulación de un rango de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de cualquier suplemento, o alternativamente de cualquier complemento del mismo se encuentra preferentemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango según la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. En el caso de agentes de la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Una dosis puede ser formulada en modelos de animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semi máxima de síntomas) de conformidad con lo determinado en cultivo celular. Dicha información puede ser utilizada para determinar con mayor precisión dosis útiles en seres humanos. Niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto desempeño. 5. Composiciones que Comprenden Sondas Derivadas de los Blancos de la Invención La presente invención ofrece composiciones que comprenden sondas derivadas de las secuencias de los genes o proteínas codificadas por ellos que comprenden los paneles de la presente invención. Estas composiciones se contemplan para su uso en aplicaciones para diagnóstico de conformidad con lo comentado aqui. Composiciones preferidas para su uso de conformidad con la presente invención incluyen una o varias sondas de genes cuya expresión es regulada de manera diferencial durante la eritropoyesis seleccionadas entre los paneles en las Tablas I. En ciertas modalidades, las sondas de la composición son derivadas de secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas entre los genes blanco cuya expresión es regulada de manera ascendente en croitropoyesis listados en la Tabla IUI. En otras modalidades, las sondas de las composiciones se derivan de las secuencias deáacido nucleico seleccionadas de genes blanco cuya expresión es regulada de manera descendente la eritropoyesis, listados en la Tabla III. La composición puede comprender sondas que corresponden a por lo menos 10, preferentemente por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100 o por lo menos 1000 genes involucrados en neoplasia. La composición puede comprender sondas que corresponden a cada gen listado en la Tabla I, II o III, o bien subgrupos de los genes en las Tablas I, II o III que son regulados de manera ascendente o regulados de manera descendente durante la eritropoyesis. En otra modalidad de la presente invención, la composición es un micro-conjunto. Puede existir una o varias sondas que corresponden a cada gen en un micro-conjunto. Por ejemplo, un micro-conjunto puede contener de 2 a 20 sondas que corresponden a un gen y preferentemente aproximadamente 4 a 10. La sondas pueden corresponder a la secuencia de ARN de longitud completa o bien a complemento de la misma de genes involucrados en la eritropoyesis, o bien pueden corresponder a una porción de la misma, dicha porción es de longitud suficiente para permitir una hibridación especifica. Tales sondas pueden comprender de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 100, 200, 500 ó 1000 nucleótidos o más de 1000 nucleótidos. Como se describen adicionalmente aquí, micro ensayos pueden contener sondas de oligonucleótido que consisten de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, y de manera todavía más preferida de 20 a 25 nucleótidos. Las sondas preferentemente son de una sola cadena. La sonda tendrá una complementaricad suficiente con su blanco para proporcionar nivel deseado de hibridación especificado en secuencia (véase abajo) . Conjuntos adecuados para su uso en la presente invención tendrán una densidad de sitios de más de 100 sondas diferentes por cm2, aún cuando cualquier densidad de sitio adecuada está incluida en la presente invención. Preferentemente, los conjuntos tendrán una densidad de sitios mayor que 500/cm2, con mayor preferencia mayor que aproximadamente 1000/cm2, y especialmente mayor que aproximadamente 10,000/cm2. Preferentemente, los conjuntos tendrán más de 100 sondas diferentes en un solo sustrato, con preferencia aún mayor más que aproximadamente 1000 sondas diferentes, con preferencia todavía mayor más de aproximadamente 10,000 sondas diferentes y muy especialmente más que 100,000 sondas diferentes en un solo sustrato. Micro-conjuntos pueden ser preparados por métodos conocidos en la técnica, de conformidad con lo descrito abajo, o bien pueden ser adaptados por compañía, por ejemplo, Affymetrix (Santa Clara, CA) . En forma general, se pueden utilizar dos tipos de micro-conjuntos. Estos dos tipos se conocen como "síntesis" y "entrega". En el tipo de síntesis, el micro-conjunto se prepara en forma paso a paso a través de la síntesis in situ de ácidos nucleicos a partir de nucleótidos. Con cada ronda de síntesis, se agregan nucleótidos a cadenas en crecimiento hasta lograr la longitud deseada. En el tipo de micro-conjunto de entrega, ácidos nucleicos previamente preparados son depositados en ubicaciones conocidas empleando varias tecnologías de entrega. Numerosos artículos describen las diferentes tecnologías de micro ensayos, por ejemplo, Shena y colaboradores (1998) Tibtech 16:301; Duggan y colaboradores (1999) Nat. Genet. 21:10; Bowell y colaboradores (1999) Nat . Genet. 21:25. Una tecnología de síntesis novedosa desarrollada por Affymetrix (Santa Clara, CA) , que combina tecnología fotolitográfica con química sintética de ADN con el objeto de permitir la preparación de micro-conjunto de oligonucleótidos de alta densidad. Tales chips contiene hasta 400,000 grupos de oligonucleótidos en un área de aproximadamente 1.6 cm2. Los oligonucleótidos son anclados en el extremo 3' optimizando así la disponibilidad de ácido nucleico de una sola cadena para hibridación. En general, tales tipos que se conocen como "GeneChips©, contienen varios oligonucleótidos de un gen particular, por ejemplo, entre 15 y 20, como por ejemplo 15 oligonucleótidos. Puesto que Affymetriz (Santa Clara, CA) vende micro-conjuntos elaboradas según instrucciones del cliente, micro-conjuntos que contienen genes cuya expresión es regulada de manera diferencial durante la eritropoyesis pueden ser pedidos para su adquisición en Affymetrix (Santa Clara, CA) . Micro-conjuntos pueden también ser preparados a través de micro-colocación mecánico, por ejemplo, los comercializados en Synteni (Fremont, CA) . De conformidad con estos métodos pequeñas cantidades de ácidos nucleicos son impresas en superficies sólidas. Los conjuntos micro-colocados preparados a Synteni contienen hasta 10,000 grupos de ADNc en un área de aproximadamente 3.6 cm . Un tercer grupo de tecnología de micro-conjunto consiste de los enfoques de entrega de "suministro sobre pedido", los más avanzados son las tecnologías de chorro de tinta que utiliza elementos piezoeléctricos y otras formas de propulsión para transferir ácidos nucleicos desde boquillas miniaturas hacia superficies sólidas. La tecnología de inyección de tinta se desarrolla en varios centros incluyendo Incyte Pharmaceuticals ¡Palo Alto, CA) y Protogene (Palo Alto, CA) . Esta tecnología resulta en una densidad de 10,000 puntos por cm2. Véase también, Hughes y colaboradores (2001) Nat. Biotechn. 19:342. Conjuntos incluyen preferentemente ácidos nucleicos de control y de referencia. Los ácidos nucleicos de control son ácidos nucleicos que sirven para indicar que la hibridación fue efectiva. Por ejemplo, todos los conjuntos de expresión Affymetrix (Santa Clara, CA) contienen grupos de sondas para varios genes procarióticos, por ejemplo, bioB, bíoC y bioD a partir de la síntesis de biotina de E. coli y ere de bacteriófago Pl. La hibridación con estos conjuntos se lleva a cabo en presencia de una mezcla de estos genes o porciones de los mismos, como por ejemplo la mezcla proporcionada por Affymetrix (Santa Clara, CA) para este propósito (Número de Parte 900299) , con el objeto de confirmar de esta forma que la hibridación fue efectiva. Ácidos nucleicos de control incluidos con los ácidos nucleicos blanco pueden también ser ARNm sintetizada a partir de clones de ADNc por transcripción in vitro. Otros genes de control que pueden estar incluidos en los conjuntos son polyA, como por ejemplo dap, lys, phe, thr, y trp (que están incluidos en Affymetrix GeneChips®) . Ácidos nucleicos de referencia permiten la normalización de los resultados de un experimento a otro y permiten comparar varios experimentos a nivel cuantitativo. Ácidos nucleicos de referencia incluyen genes de mantenimiento de niveles de expresión conocidos, por ejemplo, GAPDH, hexoquinasa y actina . Controles de falta de correspondencia pueden también proporcionarse para las sondas en los genes blanco, para controles de niveles de expresión o para controles de normalización. Los controles de falta de correspondencia son sondas de oligonucleótidos u otras sondas de ácido nucleico idénticas a las sondas de prueba o de control correspondientes excepto en cuanto a la presencia de una o varias bases con falta de correspondencia. Conjuntos pueden también contener sondas que se hibridan con más que un alelo de un gen. Por ejemplo el conjunto puede contener una sonda que reconoce el alelo 1 y otra sonda que reconoce el alelo 2 de un gen particular. Micro-conjuntos pueden ser preparados de la manera siguiente. En una modalidad, un conjunto de oligonucleótidos es sintetizado en un soporte sólido. Soportes sólidos de ejemplo incluyen vidrio, plástico, polímeros, metales, metaloides, cerámicas, orgánicos, etc. utilizando tecnologías de recubrimiento de chips y química fotoprotectora es posible generar conjuntos ordenados de sondas de ácido nucleico. Estos conjuntos, que son conocidos por ejemplo, como "chips de ADN", o bien como conjuntos de polímeros inmovilizados a muy grande escala (conjuntos "VLSIPS1**") pueden incluir millones de regiones de sondas definidas en un sustrato que tiene un área de aproximadamente 1 cm2 hasta varios cm2, incorporando por consiguiente grupos desde algunas sondas hasta millones de sondas (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,631,734). La construcción de conjuntos de ácido nucleico en fase sólida para detectar ácidos nucleicos blanco se describen en la literatura. Véase, Fodor y colaboradores (1991) Science, 251:767-777; Sheldon y colaboradores, (1993) Clinical Chemistry 39(4): 718-719; Kozal y colaboradores (1996) Nature Medicine 2(7): 753-759 y Hubebell Patente Norteamericana No. 5,571,639; Pinkel y colaboradores PCT7US95/16155 (WO 96/17958); Patentes Norteamericanas Nos. 5,677,195; 5,624,711; 5,599,695; 5,451,683; 5,424,186; 5,412,087; 5,384,261; 5,252,743 y 5,143,854; Publicaciones de Patentes PCT Nos. 92/10092 y 93/09668; y PCT WO 97/10365. En resumen, una estrategia de combinación permite la síntesis de conjuntos que contienen un gran número de sondas empleando un número mínimo de pasos sintéticos. Por ejemplo, es posible sintetizar y fijar todos los oligonucleótidos de ADN 8 mer (48, ó 65,536 combinaciones posibles) empleando solamente 32 pasos sintéticos químicos. En general procedimientos VLSIPSMR ofrecen un método para producir 4n sondas de oligonucleótidos diferentes en un conjunto empleando solamente 4n pasos sintéticos (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,631,734 5; Publicaciones de Patentes PCT Nos. WO 90/15070; WO 95/11995 y WO 92/10092). La síntesis de combinación dirigida por luz de conjuntos de oligonucleótidos en una superficie de vidrio puede ser efectuada con química automatizada de fosforami di ta y técnicas de recubrimiento de chips de manera similar a tecnologías de fotoprotección en la industria de los chips para computadoras. Típicamente, una superficie de vidrio es derivada con un reactivo de silano que contiene un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo o un grupo amina bloqueado por un grupo de protección fotolábil. La fotolisis a través de una máscara fotolitográfica se utiliza selectivamente para exponer grupos funcionales que están entonces listos para reaccionar con fosforamiditas de nucleótidos 5' -fotoprotegidos entrantes. Las fosforamiditas reaccionan solamente con los sitios iluminados /y por consiguiente expuestos por remoción del grupo de bloque fotolábil) . Así, las fosforamiditas se agregan solamente a las áreas selectivamente expuestas a partir del paso precedente. Estos pasos son repetidos hasta la síntesis del conjunto deseado de secuencias en la superficie sólida. Algoritmos para diseñar máscaras para reducir el número de ciclos de síntesis se describen en Hubbel y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,571,639 y Patente Norteamericana No. 5,593,839. Un sistema de cómputo puede ser utilizado para seleccionar sondas de ácido nucleico en el sustrato y diseñar la distribución de un conjunto de conformidad con la Patente Norteamericana No. 5,571,639. Otro método para sintetizar conjuntos de alta densidad se describe en la Patente Norteamericana No. 6,083,697. Este método utiliza un proceso novedoso de amplificación química que utiliza un sistema de catalizador iniciado por radiación para ayudar a la síntesis de las secuencias de polímeros. Métodos de la presente invención incluyen el uso de compuestos fotosensibles que actúan como catalizadores para alterar químicamente la síntesis de intermedios de manera que se promueva la formación de secuencias de polímeros. Tales compuestos fotosensibles incluyen lo que se conoce generalmente como catalizadores activados por radiaciones (RACs), y más específicamente catalizadores foto activados (PACs) . Los RACs pueden alterar químicamente per se la síntesis de intermedios o bien pueden activar un compuesto auto catalítico que altera químicamente la síntesis de intermedios de manera a permitir que el intermedio de síntesis se combine químicamente con un intermedio de síntesis agregado posteriormente o con otro compuesto. Conjuntos pueden también ser sintetizados de manera combinatoria mediante el suministro de monómeros a células de un soporte mediante trayectorias de flujo mecánicamente restringidas. Véase Winkler y colaboradores, EP 624,059. Los conjuntos pueden también ser sintetizados mediante el hecho de colocar puntos de monómeros reactivos sobre un soporte utilizando una impresora de chorro de tinta. Véase id. Y Pease y colaboradores, EP 728,520. Sondas de ADNc pueden ser preparadas de conformidad con los métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente aquí, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR) de ARN empleando cebadores específicos para secuencias. Sondas de oligonucleótidos pueden ser sintetizadas químicamente. Secuencias de los genes o ADNc a partir de los cuales se elaboran sondas, por ejemplo, en GenBank, oirás bases de datos públicas o publicaciones . Sondas de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos naturales, ácidos nucleicos químicamente modificados, etc., que consisten de análogos de nucleótidos, en la medida en que tienen grupos hidroxilo activados compatibles con la química de enlace. Los grupos protectores, pueden en si, ser fotolábiles. Alternativamente, los grupos protectores pueden ser lábiles bajo ciertas condiciones químicas, por ejemplo, ácido. En este ejemplo, la superficie del soporte sólido puede contener una composición que genera ácidos al estar sometido a exposición a la luz. Asi, la exposición de una región del sustrato a la luz genera ácidos en esta región que remueven los grupos protectores en la región expuesta. Asimismo, el método de síntesis puede utilizar desoxinucleósido activado por 5' -0-fosforamidita protegido en posición 3. En este caso, el oligonucleótido es sintetizado en la dirección 5' hacia 3', que resulta en un extremo 5' libre. En una modalidad, los oligonucleótidos de un conjunto son sintetizados empleando un sintetizador de oligonucleótidos multiplex automatizado de 96 pozos (A.M.O.S.) que puede elaborar miles de oligonucleótidos (Lashkari y colaboradores (1995) PNAS 93: 7912) puede utilizarse. Se observará que el diseño de los oligonucleótidos está influenciado por la aplicación contemplada. Por ejemplo, puede ser deseable tener temperaturas de fusión similares para todas las sondas. Por consiguiente, la longitud de las sondas se ajustan de tal manera que las temperaturas de fusión para todas las sondas en el conjunto sean similares (se observará que longitudes diferentes para sondas diferentes pueden ser necesarias con el objeto de lograr un T[m] particular en donde sondas diferentes tienen contenidos de GC diferentes. Aún cuando la temperatura de fusión es una consideración primaria en el diseño de sondas, otros factores se utilizan opcionalmente para ajusfar adicionalmente la construcción de la sonda, como por ejemplo, en selección contra alta complementaridad de cebadores y similares. Conjuntos, por ejemplo, micro-conjuntos, pueden almacenarse convenientemente después de fabricación o adquisición para su uso posteriormente. Bajo condiciones apropiadas, los conjuntos de la presente invención pueden ser almacenados durante por lo menos aproximadamente 6 meses y pueden almacenarse hasta durante un año o más. Los conjuntos se almacenan generalmente a temperaturas entre aproximadamente -20°C hasta temperatura ambiente, los conjuntos estando de preferencia sellados en un recipiente de plástico, por ejemplo, bolsa y protegidos contra luz. 5.1 Hibridación de los ácidos nucleico blanco con el micro-conjunto El paso siguiente es poner en contacto los ácidos nucleicos marcados con el conjunto bajo condiciones suficientes para la unión entre la sonda y el blanco del conjunto. En una modalidad preferida, la sonda estará en contacto con el conjunto bajo condiciones suficientes para que ocurra una hibridación entre los ácidos nucleicos marcados y las sondas en el micro-conjunto, en donde las condiciones de hibridación serán seleccionadas con el propósito de proporcionar el nivel deseado de especificidad de hibridación.

El contacto del conjunto y de la sonda incluye la puesta en contacto del conjunto con un medio acuoso que comprende la sonda. El contacto puede lograrse de varias formas diferentes según la configuración especifica del conjunto. Por ejemplo, cuando el conjunto comprende simplemente el patrón de blancos separados por tamaño en la superficie de un sustrato rígido de "tipo placa", el contacto puede lograrse mediante la simple colocación del conjunto en un recipiente que comprende las solución de sonda, como por ejemplo bolsa de polietileno y similares. En otras modalidades en donde el conjunto es atrapado en un medio de separación unido por dos placas rígidas, existe la oportunidad de suministrar la sonda a través de medios electroforéticos . Alternativamente, cuando el conjunto es incorporado en un dispositivo de tipo biochip que tiene puertos de entrada y salida de fluido, la solución de la sonda puede ser introducida en la cámara en donde el patrón de moléculas blanco es presentado a través del puerto de entrada, en donde la introducción del fluido puede efectuarse manualmente o bien a través de un dispositivo automatizado. En modalidades de pozos múltiples, la solución de la sonda será introducida en la cámara de reacción que comprende el conjunto, ya sea manualmente, por ejemplo con una pipeta, o bien a través de un dispositivo automatizado de manejo de fluido. El contacto de la solución de sonda y los blancos se mantendrá durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra la unión entre la sonda y el blanco. Aún cuando depende de la naturaleza de la sonda y del blanco, el contacto se mantendrá generalmente durante un periodo de tiempo dentro de un rango de aproximadamente 10 minutos a 24 horas, a habitualmente de aproximadamente 30 minutos a 12 horas y con mayor frecuencia de aproximadamente de 1 hora a 6 horas . Cuando se utilizan micro-conjuntos disponibles en el comercio, se proporcionan condiciones de hibridación adecuadas por parte del fabricante. Cuando se utilizan micro-conjuntos que no son comerciales, se pueden determinar las condiciones adecuadas de hibridación con base en los siguientes lineamientos de hibridación, asi como en base a las condiciones de hibridación descritas en los numerosos artículos publicados para el uso de micro-conjuntos. Las condiciones de hibridación y lavado de ácido nucleico se seleccionan para que sean óptimas de tal manera que la sonda "se una específicamente" o "se híbrida específicamente" con un sitio específico de conjunto, por ejemplo, la sonda se híbrida, forma dúplex o se une con un sitio de conjunto de secuencia con una secuencia de ácido nucleico complementaria pero no se híbrida con un sitio con una secuencia de ácido nucleico no complementaria. Como se emplea aquí, una secuencia de pclinucleótido se considera complementaria de otra secuencia cuando, si el más corto de los polinucleótidos es inferior o igual a 25 bases, no hay faltas de correspondencias mediante la utilización de las reglas de apareamiento de bases estándares o bien, si el más corto de los polinucleótidos es mayor que 25 bases, no existe más que 5% de falta de correspondencia. Preferentemente, los polinucleótidos son perfectamente complementarios (sin faltas de correspondencia) . Puede ser fácilmente demostrado que condiciones especificas de hibridación resultan en una hibridación especifica mediante la realización de un ensayo de hibridación que incluye controles negativos. La hibridación es efectuada en condiciones que permiten una hibridación esencialmente especifica. La longitud de la sonda y el contenido de GC determinarán la Tm del híbrido y por consiguiente las condiciones de hibridación necesarias para la obtención de una hibridación específica de la sonda sobre el ácido nucleico de templado. Estos factores son bien conocidos por parte de una persona con conocimientos en la materia y pueden también ser probados en ensayos. Una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993), "Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hibridization with nucleic acid probes" [Técnicas de laboratorio en bioquímica e hibridación de biología molecular con sondas de ácido nucleico] . En general, se seleccionan condiciones estrictas que son por lo menos 5°C menor que el punto de fusión térmico Ver para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y Ph definido. Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y Ph definido) a la cual el 50% de las secuencias blanco se hibridan con una sonda que corresponde perfectamente. Condiciones altamente estrictas se seleccionan para que sean iguales al punto de Tm para una sonda particular. A veces el término "Td" se utiliza para definir la temperatura a la cual por lo menos la mitad de la sonda se disocia de un ácido nucleico blanco que corresponde perfectamente. De cualquier manera varias técnicas de estimación para determinar Tm o Td están disponibles y se describen en términos generales en Tijssen, supra. Típicamente, se estima que los pares de bases G-C en un dúplex contribuyen aproximad mente 3°C a Tm, mientras que pares de bases A-T contribuyen, según las estimaciones, aproximad mente en 2°C hasta un máximo teórico de aproximadamente 80-100°C. Sin embargo, modelos más sofisticados de Tm y Td están disponibles y apropiados en los cuales interacciones de apilamiento de G-C, efectos de solvente, la temperatura de ensayo deseada y similares se toman en cuenta. Por ejemplo, sondas pueden ser diseñadas de tal manera que tengan una temperatura de disociación (Td) de aproximadamente 60°C, utilizando la fórmula: Td = ( ( ( ( (3 x #GC) + (2 x #AT) ) x 37) - 562) #bp) - 5; en donde #GC, #AT y #bp son el número de pares de bases de guanina-citocina, el número de pares de bases adenina-timina, y el número de pares de bases totales, respectivamente, que participan en la fusión de la sonda sobre el ADN de "emplado. La diferencia en cuanto a estabilidad entre un dúplex que corresponde totalmente y un dúplex con faltas de correspondencia, especialmente si la falta de correspondencia es solamente una base, puede ser bastante pequeña, correspondiendo a una diferencia en cuanto Tm entre los dos de solamente 0.5 grados. Véase Tibanyenda, N. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) y Ebel, S. y colaboradores, Biochem. 31:12083 (1992). De manera más importante, se entiende que conforme se incremente la longitud de la región de homología, el efecto de la falta de correspondencia de una sola base sobre la estabilidad global del dúplex disminuye. La teoría y la práctica de la hibridación de ácido nucleico se describen, por ejemplo en S. Agrawal (ed. ) Methods in Molecular Biology [Métodos de Biología Molecular] , volúmen 20; y Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-hibridization with nucleic acid probes [Técnicas de Laboratorio en Bioquímica e Hibridación de Biología Molecular con sondas de ácido nucleico] , por ejemplo, parte I capítulo 2 "overview of principies of hibridization and the strategy of nucí ei c acid prob assays" [generalidades sobre principios de hibridación y estrategia de ensayos de sonda de ácido nucleico] , Elsevier, Nueva York, proporcionan una guia básica de la hibridación de ácido nucleico . Algunos micro-conjuntos son de naturaleza "activa", es decir, ofrecen un control electrónico independiente sobre todos los aspectos de la reacción de hibridación (o bien cualquier otra reacción de afinidad) que ocurre en cada micro ubicación especifica. Estos dispositivos proporcionan un nuevo mecanismo para afectar las reacciones de hibridación que se conoce como control electrónico de estrictez (ESC) . Los dispositivos activos de esta invención pueden producir electrónicamente "condiciones de estrictez diferentes" en cada micro ubicación. Asi, todas las hibridaciones pueden efectuarse óptimamente en la misma solución volumétrica. Estos conjuntos se describen en la Patente Norteamericana No. 6,051,380 de Sosnowski y colaboradores. En una modalidad preferida, la señal de fondo es reducida a través del uso de un detergente (por ejemplo, C-TAB) o un reactivo de bloqueo (por ejemplo, ADN de esperma, ADN de con-1, etc.) durante la hibridación para reducir el enlace no especifico. En una modalidad particularmente preferida, la hibridación se efectúa en presencia de aproximadamente 0.5 mg/ml de ADN (por ejemplo, ADN de esperma de arenque) . El uso de agentes de bloqueo en hibridación es bien conocida por parte de las personas con conocimientos en la materia (véase, por ejemplo, Capítulo 8 en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology [Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular], Volumen 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes [Hibridación con Sondas de Ácido Nucleico], P. Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993) ) . El método puede o no comprender además un paso de remoción de etiqueta no unida antes del paso de detección, según la etiqueta particular empleada en el ácido nucleico blanco. Por ejemplo, en ciertos formatos de ensayo (por ejemplo, "formatos de ensayo homogéneos") , una señal es generada solamente al enlazarse específicamente el blanco sobre la sonda. Como tal, en estos formatos de ensayo, el patrón de hibridación puede ser detectado sin un paso de remoción de etiqueta no unida. En otras modalidades, la etiqueta empleada generará una señal que el blanco esté unido específicamente o no a su sonda. En tales modalidades, la etique marcada no unida es removida de la superficie de soporte. Una forma de remover la etiqueta marcada no unida es efectuar la técnica bien conocida de lavado, en donde varias soluciones de lavado y varios protocolos para su uso en la remoción de etiqueta no unida se conocen por parte de las personas con conocimientos en la materia y pueden emplearse. Alternativamente, una etiqueta marcada no unida puede ser removida por medios electroforéticos .

Cuando todas las secuencias blanco son detectadas utilizando el mismo marcador, diferentes conjuntos se emplean para cada fuente fisiológica (en donde diferente puede incluir el uso del mismo conjunto en momentos diferentes) . Los métodos antes mencionados pueden ser variados con el objeto de ofrecer un análisis multiplex, mediante el empleo de etiquetas diferentes y distinguibles para las diferentes poblaciones blanco (que representan cada una de las diferentes fuentes fisiológicas que se están ensayando) . Según este método multiplex, el mismo conjunto es utilizado al mismo tiempo para cada una de las diferentes poblaciones blanco. En otra modalidad, la hibridación es monitoreada en tiempo real utilizando una cámara de formación de imagen de dispositivo acoplada a carga (Guschin y colaboradores (1997) Anal. Biochem. 250:203). La síntesis de conjuntos en grupos de fibras ópticas permite una lectura fácil y sensible (Healy y colaboradores (1997) Anal. Biochem. 251:270). En otra modalidad, una detección de hibridación de tiempo real es efectuada en micro-conjuntos sin lavado empleando un efecto de onda evanescente que excita solamente los fluoróforos unidos a la superficie (véase, por ejemplo, Stimpson y colaboradores (1995) PNAS 92:6379). 5.2 Detección de hibridación y análisis de resultados Los pasos antes mencionados resultan en la producción de patrones de hibridación de ácido nucleico blanco marcado sobre la superficie del conjunto. Los patrones de hibridación resultantes de ácidos nucleicos marcados pueden ser visualizados o detectados de varias formas, y la forma particular de detección se selecciona con base en la etiqueta particular del ácido nucleico blanco, en donde medios de detección representativos incluyen conteo de centelleo, auto radiografía, medición de fluorescencia medición calorimétrica, medición de emisión de luz, dispersión luminosa y similares. Un método para detectar incluye un escáner de conjunto comercialmente disponible en Affymetrix (Santa Clara, CA) , por ejemplo el 417™, el Arrayer, el 418™ Array Scanner, o el Agilent GeneArry™ Scanner. Este escáner es controlado a partir de la computadora de sistema con una interfaz Windows™ y herramientas de software fáciles de utilizar. La salida es un archivo 16-bit.tif que puede importarse directamente o leerse directamente a través de varias aplicaciones de software. Dispositivos de escaneo preferidos se describen por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,143,854 y 5, 424, 186. Cuando se utilizan sondas marcadas de manera fluorescente, las emisiones de fluorescencia en cada sitie de un conjunto de transcripto o puede ser detectado preferentemente por microscopía láser confocal de exploración. En una modalidad, una exploración separada, empleando la línea de excitación apropiada, se efectúa para cada uno de los dos fluorósforos utilizados. Alternativamente, se puede utilizar un láser que permite la iluminación simultánea de muestras de longitudes de onda especificas para los dos fluoroforos y emisiones a partir de los dos fluoróforos pueden ser analizadas simultáneamente (véase Shalon y colaboradores, 1996, A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples Using two-color fluorescent probé hybridization [Un sistema de micro-conjunto de ADN para analizar muestras de ADN complejas utilizando hibridación de sonda fluorescente de dos colores] , Genome Research 6:639-645, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . En una modalidad preferida, los conjuntos son explorados con un explorador fluorescente láser con una etapa X-Y controlada por computadora y un objetivo de microscopio. La excitación secuencial de los dos fluoróforos puede lograrse con un láser de gas mixto multilíneas y la luz emitida es dividida por longitud de onda y detectada con dos tubos de fotomultiplicador . Dispositivos de exploración láser de fluorescencia son descritos en Schena y colaboradores, 1996, Genome Res. 6:639-645 y en otras referencias citadas aquí. Alternativamente, el grupo de fibras ópticas por Ferguson y colaboradores, 1996, Nature Biotech. 14:1681-1684, puede utilizarse para monitorear los niveles de abundancia ARNm. En una modalidad en donde se utilizan ácidos nucleicos blanco fluorescentes, los conjuntes pueden ser explorados utilizando láser con el objeto de excitar blancos marcos de manera fluorescente que se han hibridado en regiones de conjunto de sonda, que pueden entonces ser representados en forma de imagen utilizando dispositivos acoplados cargados ("CCDs") para una exploración de campo amplio del conjunto. Alternativamente, otro método particularmente útil para recopilar datos a partir de los conjuntos es a través del uso de microscopía confocal láser que combina la facilidad y velocidad de un proceso fácilmente automatizado con detección de alta resolución. Después de la operación de recuperación de datos, los datos son típicamente reportados a una operación de análisis de datos. Para facilitar la operación de análisis de muestra, los datos obtenidos por el lector a partir del dispositivo serán típicamente analizados utilizando una computadora digital. Típicamente, la computadora será programada apropiadamente para recibir y almacenar los datos del dispositivo, así como para analizar y reportar los datos recopilados, por ejemplo, sustracción del fondo, imágenes multicolores de deconvulación, marcado o remoción de artefactos, verificación que los controles han sido efectuados apropiadamente, normalización de las señales, interpretación de datos de fluorescencia para determinar la cantidad de blanco hibridado, normalización de fondo e hibridaciones de falta de correspondencia de bases individuales, y similares. En una modalidad preferida, el sistema comprende una función de búsqueda que permite la búsqueda de patrones específico, por ejemplo, patrones que se relacionan con la expresión diferencial de genes, por ejemplo, entre el perfil de expresión de una célula de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético y el perfil de expresión de una célula normal correspondiente en un sujeto. Un sistema permite preferentemente la búsqueda de patrones de expresión génica entre más de dos muestras. Un sistema deseable par analizar datos es un sistema general y flexible para la visualización, manipulación y análisis de datos de expresión de genes. Dicho sistema incluye preferentemente una interfaz gráfica de usuario para desplazarse y navegarse a través de los datos de expresión, permitiendo al usuario ver selectivamente y recalcar los genes de interés. El sistema incluye también preferentemente funciones de clasificación y búsqueda y está disponible preferentemente para usuarios generales con estaciones de trabajo PC, Mac o Unix. El sistema incluye también preferentemente algoritmos de agrupamiento que son cualitativamente más eficientes que los existentes. La precisión de tales algoritmos es preferentemente ajustable de manera jerárquica de tal manera que el nivel de detalle de agrupamiento pueda ser sistemáticamente refinado según lo deseado . Varios algoritmos están disponibles para analizar los datos de perfil de expresión de genes, por ejemplo, el tipo de comparaciones a efectúa. En algunas modalidades, es deseable agrupar genes que son co-regulados . Esto permite la comparación de grandes números de perfiles. Una modalidad preferida para identificar tales grupos de genes incluye algoritmos de agrupamiento (para reseñas de algoritmo de agrupamiento, véase, por ejemplo, Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2a. [Edición, Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, Londres: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, Nueva York: Wiley; Sneath y Sokal 1973, Numerical Taxonomy, Freeman: Anderber, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: Nueva York) . El análisis de agrupamiento es útil para ayudar a reducir los patrones complejos de miles de curvas de tiempo en un pequeño conjunto de grupos representativos. Algunos sistemas permiten el agrupamiento y la vista de genes con base en secuencias. Otros sistemas permiten el agrupamiento basado en otras características de los genes, por ejemplo, su nivel de expresión (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,203,987). Otros sistemas permiten el agrupamiento de curvas de tiempo (véase, por ejemplo. Patente Norteamericana No. 6,263,287). Un análisis de grupo puede ser efectuado utilizando la rutina hclust (véase, por ejemplo, "hclust" a partir del paquete de programática S-Plus, MathSoft, Inc., Cambridge, Mass.). En algunas modalidades especificas, genes son agrupados de conformidad con el grado de co-variación de su transcripción, presuntamente co-regulación, de conformidad con lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6,203,987. Grupos de genes que tienen transcriptos co-variables se conocen como "genesets". Un análisis de grupo u otros métodos estadísticos de clasificación puede utilizarse para analizar la co-variación de la transcripción de genes en respuesta a varias perturbaciones, por ejemplo, causadas por una enfermedad o un fármaco. En una modalidad específica, algoritmos de agrupamiento son aplicados a perfiles de expresión para construir un "árbol de similaridad" o "árbol de agrupamiento" que relaciona los genes por la cantidad de co-regulación presentada. Los genesets son definidos en las ramas de un árbol de agrupamiento mediante el hecho de cortar a través del árbol de agrupamiento a diferentes niveles en la jerarquía de las ramificaciones. En algunas modalidades, un perfil de expresión de gen es convertido en un perfil de expresión de gen proyectado. El perfil de expresión de gen proyectado es una colección de valores de expresión de geneset. La conversión se logra, en algunas modalidades, mediante el hecho de promediara el nivel de expresión de los genes dentro de cada geneset. En algunas otras modalidades, otros procesos de proyección lineales pueden utilizarse. La operación de proyección expresa el perfil en un conjunto más pequeño y biológicamente más significativo de coordenadas, reduciendo los efectos de los errores de medición mediante el hecho de promediarlos en cada conjunto de constituyentes celulares y ayudando a la interpretación biológica del perfil. 6. Prueba de Toxicidad de Agentes Terapéuticos Potenciales Utilizando Micro-con untos Muchos agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas de los mismos son tóxicos o inducen una enfermedad, en el sujeto al cual se administran. Por ejemplo, la anemia es un efecto colateral común de los tratamientos quimioterapéuticos utilizados para tratar varios tipos de canceres. Los micro-conjuntos de la presente invención pueden ser utilizado en métodos para determinar si un agente terapéutico candidato para una enfermedad induce un padecimiento eritropoyético en el sujeto al cual se le debe administrar. En una modalidad, el método comprende los pasos de a) poner en contacto células eritroides de un sujeto con dicho agente terapéutico candidato y b) determinar los niveles de expresión génica antes y después del tratamiento mediante la hibridación de un micro-conjunto con los ácidos nucleicos aislados de las células eritroides del sujeto, en donde cualquier efecto sobre los niveles de expresión génica indica que el agente terapéutico candidato puede inducir un padecimiento eritropoyético . 7- Diagnósticos para Padecimientos de Eritropoyesis La presente invención ofrece además métodos de diagnóstico para monitorear la existencia y/o avance de un padecimiento eritropoyético en un sujeto. Los micro-conjuntos de la presente invención pueden ser utilizados en métodos para determinar si el agente terapéutico candidato no contemplado para su uso en el tratamiento de un padecimiento eritropoyético induce un padecimiento eritropoyético como efecto colateral. En una modalidad, el método comprende los pasos de a) poner en contacto células eritroides de un sujeto con dicho agente terapéutico candidato y b) determinar los niveles de expresión génica antes y después de tratamiento, en donde un efecto sobre los niveles de expresión génica indican que el agente terapéutico candidato puede inducir un padecimiento eritropoyético. Métodos preferidos comprenden la determinación del nivel de expresión de uno o varios genes expresados diferentemente durante la eritropoyesis en las células eritroides de un sujeto. Otros métodos comprenden la determinación del nivel de expresión de decenas, centenas o miles de genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis, por ejemplo, mediante la utilización de tecnología de micro-conjuntos. Los niveles de expresión de los genes son después comparados con los niveles de expresión de los mismos genes en una célula eritroide normal. La presente invención ofrece también métodos de diagnóstico para diagnosticar la causa de un padecimiento eritropoyético . En una modalidad, el método comprende los pasos de a) obtener una muestra de célula de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético; b) determinar los niveles de expresión génica de las células del sujeto; y c) comparar los niveles de expresión génica de las células del sujeto con los niveles de una célula eritroide normal, en donde la diferencia en cuanto a los niveles de expresión génica indican que el agente terapéutico candidato puede indicar la causa del padecimiento eritropoyético . En ciertas modalidades de cualquiera de los métodos de diagnóstico contemplados por la invención, el método de diagnóstico comprende la determinación de la actividad de una proteina codificada por un gen en las células eritroides de un sujeto y la comparación de la actividad con la actividad de proteina en una célula eritroide normal. En otras modalidades, el método de diagnóstico puede comprender la determinación del nivel de proteína o rotación de ARNm, o bien la determinación del nivel de traducción en células eritroides de un sujeto. Ejemplos de herramientas de diagnóstico y ensayos se presentan abajo, bajo (i) a (iv) , seguido por métodos ejemplares para llevar a cabo sus ensayos. Los ensayos pueden utilizar opcionalmente los micro-conjuntos de la invención. (i) . En una modalidad, la invención ofrece un método para determinar si un sujeto tiene o es probable que desarrolle una enfermedad eritropoyética, dicho método comprende la determinación del nivel de expresión de uno o varios genes que son regulados de manera ascendente o descendente durante la eritropoyesis en una célula del sujeto, y la comparación de estos niveles de expresión con los niveles de expresión de los genes en una célula enferma de un sujeto conocido por tener un padecimiento eritropoyético, de tal manera que un nivel similar de expresión de los genes es una indicación que el sujeto tiene o es probable que desarrolle un padecimiento eritropoyético o por lo menos un síntoma del mismo. En una modalidad preferida, la célula es esencialmente del mismo tipo que la célula enferma en el sujeto. (ii) . En otra modalidad, los perfiles de expresión de genes en los paneles de la invención pueden ser utilizados para confirmar que un sujeto tiene un tipo específico de padecimiento eritropoyético, y en particular, que el sujeto no tiene un padecimiento relacionado ni una enfermedad con síntomas similares. Esto puede ser importante, en particular, para diseñar un régimen terapéutico óptimo para el sujeto. Se ha descrito en la técnica que perfiles de expresión pueden ser utilizados par distinguir un tipo de enfermedad de una enfermedad similar. Por ejemplo, dos subtipos de linfomas no Hodgkin, uno de los cuales responde a métodos terapéuticos actuales y el otro no, pueden ser diferenciados mediante la investigación de 17,856 genes en muestras de pacientes padeciendo de linfoma de célula B grande difuso (Alizadeh y colaboradores Nature (2000) 405:503) . De manera similar, subtipos de melanoma cutáneo fueron predichos con base en determinación de perfil de 8150 genes (Bittner y colaboradores, Nature (2000) 406:536) . En este caso, características de melanomas metastasicos altamente agresivos podrían ser reconocidas. Numerosos estudios adicionales que comparan los perfiles de expresión de células cancerosas y de células normales han sido descritos, incluyendo estudios que describen los perfiles de expresión que distinguen entre canceres altamente metastásico y canceres menos metastásicos y estudios que describen nuevos subtipos de enfermedades, por ejemplo, nuevos tipos de tumores (véase, por ejemplo, Perou y colaboradores (1999) PNAS 96: 9212; Perou y colaboradores (2000) Nature 606:747; Clark y colaboradores (2000) Nature 406:532; Alón y colaboradores (1999) PNAS 96:6745; Goub y colaboradores (1999) Science 286:531) . Por consiguiente, el perfil de expresión de la invención permite la distinción de un padecimiento eritropoyético específico de enfermedades relacionadas. En una modalidad preferida, el nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de un padecimiento eritropoyético es determinado en una célula del sujeto. En una modalidad todavía más preferida, el nivel de expresión de esencialmente todos los genes involucrados en la eritropoyesis es determinado en una célula del sujeto, como por ejemplo mediante la utilización de sondas que comprenden micro-conjuntos que corresponden a todos los genes identificados en la Tabla I o esencialmente a todos estos genes. Un nivel de expresión de uno o varios genes involucrados en la eritropoyesis, y no de enfermedades relacionadas, que es similar al nivel de expresión en una célula de un sujeto con un padecimiento eritropoyético indica que el sujeto tiene este padecimiento eritropoyético y no una enfermedad relacionada o con síntomas similares a un padecimiento eritropoyético . Antes de utilizar este método para determinar si el sujeto tiene una enfermedad eritropoyética o una enfermedad relacionada, puede ser necesario determinar primero el perfil de expresión de células de enfermedades que son similares a un padecimiento eritropoyético y células de numerosos sujetos que tienen cáncer pulmonar de conformidad con lo diagnosticado por métodos tradicionales (es decir, no basados en micro-conjuntos) . Esto puede entenderse utilizando un micro-conjunto que contiene el panel de genes expresados diferentemente durante la eritropoyesis de conformidad con métodos descritos en su momento aquí. (iii). En otra modalidad, la invención ofrece un método para determinar la probabilidad de éxito de una terapia particular que induce un padecimiento eritropoyético en un sujeto. En una modalidad, el sujeto es tratado inicialmente con una terapia particular, y la eficacia de la terapia es determinada, por ejemplo mediante la determinación del nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es regulada de manera diferencial durante la eritropoyesis en una célula eritroxde del sujeto. Un efecto sobre el nivel de expresión de estos genes, es decir, un cambio en el nivel de expresión de los genes, de tal manera que su nivel de expresión se parezca al nivel de expresión de una célula enferma, indica que el tratamiento puede inducir un padecimiento eritropoyético en el sujeto. Por otra parte, ningún efecto sobre el nivel de expresión de los genes involucrado en la eritropoyesis indica que es improbable que el tratamiento induzca un padecimiento eritropoyético en el sujeto. La predicción del resultado del tratamiento de un padecimiento eritropoyético del sujeto puede también prenderse in vitro. En una modalidad, células son obtenidas de un sujeto a evaluar para determinar la respuesta al tratamiento, e incubadas in vitro con el fármaco terapéutico. El nivel de expresión de uno o varios genes involucrados en la eritropoyesis es medible entonces en las células y estos valores son comparados con el nivel de expresión de este gen o de estos varios genes en la célula que es la célula correspondiente normal en la célula enferma. El nivel de expresión puede también ser comparado con el nivel de expresión en una célula normal. En una modalidad preferida, el nivel de expresión de esencialmente todos los genes cuya expresión es regulada diferencialmente durante la eritropoyesis, es decir, los genes mostrados en la tablqas I, II y III se determinan. El análisis comparativo se efectúa preferentemente empleando una computadora que comprende una base de datos que incluye el nivel de expresión de por lo menos un gen característico de un padecimiento eritropoyético en una célula enferma y/o normal. Un nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de un padecimiento eritropoyético en las células del sujeto después de incubación con el fármaco que es similar a su nivel de expresión en una célula normal y diferente de su nivel de expresión en la célula enferma indica que es probable que el sujeto responda positivamente a un tratamiento con el fármaco. Al contrario, un nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de un padecimiento eritropoyético en las células del sujeto después de incubación con el fármaco que es similar al nivel de expresión en una célula enferma y diferente del nivel de expresión en una célula normal es una indicación que es probable que el sujeto no responderá positivamente a un tratamiento con el fármaco. Puesto que es posible que un fármaco para el tratamiento del padecimiento eritropoyético no actúe directamente sobre las células enfermas sino que sea por ejemplo, metabol izado o actúe en otra célula que secreta entonces un factor que tendrá un efecto sobre las células enfermas, el ensayo anterior puede también ser efectuado en una muestra de tejido de un sujeto que contiene células otras que las células enfermas. Por ejemplo, una muestra de tejido que comprende células enfermas se obtiene de un sujeto; la muestra de tejido es incubado con el fármaco potencial; opcionalmente una o varias células enfermas son aisladas de la muestra de tejido, por ejemplo, por microdisección o Láser Capture Microdissection ( CM, véase infra) [Microdisección de Captura Láser] ; y el nivel de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característi a de un padecimiento eritropoyético se examina. (iv) La invención puede ofrecer también métodos para seleccionar una terapia para un padecimiento eritropoyético para un paciente a partir de una selección de varios tratamientos diferentes. Algunos sujetos que tienen un padecimiento eritropoyético pueden responder mejor a un tipo de terapia que a otro tipo de terapia. En una modalidad preferida, el método comprende la comparación del nivel de expresión de por lo menos un gen característico de cáncer pulmonar en el paciente con el nivel de expresión en células de sujetos tratados in vitro o in vivo con uno o varios fármacos terapéuticos, dichos sujetos son sujetos que responden o no responden a uno de los fármacos terapéuticos, e identifican la célula que tiene el nivel de expresión más similar del gen o de los varios genes con el nivel de expresión del paciente, con el objeto de identificar de esta manera una terapia para el paciente. El método puede comprender además la administración de la terapia identificada al sujeto. Una persona con conocimientos en la materia reconocerá que en ciertos ensayos de diagnóstico y pronóstico será suficiente evaluar el nivel de expresión de una sola característica génica de un padecimiento eritropoyético y que en otros, la expresión de dos, se prefiere, mientras que en otros, la expresión de esencialmente todos los genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis se ensaya preferentemente . A continuación se presentan ejemplos de métodos que pueden ser utilizados para determinar el nivel de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis, por ejemplo, para su uso en los métodos descritos arriba. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen puede ser determinado por reacción en cadena de polimerasa - transcripción reversa (RT-PCR) , análisis de dotblot; análisis Northern blot asi como hibridación in sítu. En una modalidad preferida, el nivel de expresión es determinada mediante la descripción de un microensayo que contiene sonda de los genes que son regulados de manera ascendente o descendente durante la eritropoyesis . En otra modalidad, el nivel de proteina codificada por uno o varios de los genes que son regulados de manera ascendente o descendente durante la eritropoyesis se determina en una célula del tipo enfermo. Esto puede efectuarse a través de varios métodos, por ejemplo, inmunohistoquímica . 7.1 Uso de microensayos para determinar el nivel de expresión de genes cuya expresión es característica de un padecimiento eri tropoyético En general, la determinación de perfiles de expresión con microensayos incluye los pasos siguientes: (a) obtener una muestra ARNm a partir de un sujeto y preparar ácidos nucleicos marcados (los "ácidos nucleicos blancos" o "blancos"); (b) poner en contacto los ácidos nucleicos blanco con el conjunto en condiciones suficientes para que los ácidos nucleicos blancos se unan con la sonda correspondiente en el conjunto, por ejemplo, por hibridación o enlace especifico; (c) remoción opcional de blancos no unidos del conjunto; y (d) detección de blancos unidos y análisis de los resultados, por ejemplo, empleando métodos y análisis basados en computadoras. Como se emplea aquí, las "sondas de ácidos nucleicos" o "sondas" son ácidos nucleicos fijados sobre el conjunto, mientras que los "ácidos nucleicos blancos" son ácidos nucleicos que son hibridados sobre el conjunto. Cada uno de estos pasos se describe con mayores detalles abajo. Obtención de una muestra de ARNm de un sujeto Muestras de ácido nucleico pueden ser obtenidas a partir de un individuo a probar utilizando medios de muestreo "invasivos" o "no invasivos". Un medio de muestreo se califica de "invasivo" sin incluye la recolección de ácidos nucleicos desde dentro de la piel u órganos de un animal (incluyendo, especialmente, un murino, ser humano, ovino, equino, bovino, porcino, canino o felino) . Ejemplos de métodos invasivos incluyen recolección de sangre, recolección de semen, biopsia con aguja, aspiración pleural, biopsia de cordón umbilical, etc. Ejemplos de tales métodos se comentan en Kim, C.H. y colaboradores, (J. Vi rol . 66:3879-3882 (1992)); Biaswas, B. y colaboradores (Annals NY Acad. Sci. 590:582-583 (1990)); Biaswas B. y colaboradores (J. Microbol. 29:2228-2233 (1991)). En una modalidad, una o varias células del sujeto, a prueba se obtienen y se aisla en ARN a partir de la célula. En una modalidad preferida, una muestra de célula se obtiene del sujeto. Cuando se obtienen las células, es preferible obtener una muestra que contiene predominantemente células del tipo deseado, por ejemplo, una muestra de células en donde por lo menos aproximadamente el 50%, preferentemente por lo menos aproximadamente 60%, con preferencia aún mayor por lo menos aproximadamente 70%, 80% y aún más preferentemente, por lo menos aproximadamente 90% de las células son de tipo deseado. Un porcentaje mayor de células del tipo deseado es preferible puesto que una muestra de este tipo tendrá mayor probabilidad de proporcionar datos claros de expresión de gen. Muestras de sangre pueden ser obtenidas de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Es también posible obtener una muestra de célula a partir de un sujeto, y después enriquecerla en el tipo de célula que se desea. Por ejemplo, células pueden ser aisladas de otras células utilizando varias técnicas, por ejemplo, aislamiento con anticuerpo que se enlace sobre un epítopo en la superficie de la célula del tipo de célula que se desea. En una modalidad, se obtiene ARN de una sola célula. Es también posible obtener células de un sujeto y cultivar las células in vitro con el objeto de obtener una población mayor de células a partir de las cuales se puede extraer el ARN. Métodos para establecer cultivos de células no transformadas, es decir, cultivos de células primarias, se conocen en la técnica . Cuando se aisla ARN de muestras de tejido o células de individuos, puede ser importante evitar cambios adicionales en la expresión del gen después de la remoción del tejido o células del sujeto. Cambios en cuanto a los niveles de expresión se conocen por variar rápidamente después de perturbaciones, por ejemplo, choque térmico o activación con lipopolisacárido (LPS) u otros reactivos. Además, el ARN en el tejido y células puede degradarse rápidamente. Por consiguiente, en una modalidad preferida, las células obtenidas de un sujeto son congeladas instantáneamente, lo más pronto posible. Se puede extraer el ARN de muestras de tejido a través de varios métodos, por ejemplo, la lisis de tiocianato de guanidio seguido por centrifugación CsCl (Chirgwin y colaboradores, 1979, Biochemistry 18:5294-5299). Ekl ARN de células individuales puede ser obtenido de conformidad con lo descrito en métodos para la preparación de una biblioteca de ADNc a partir de células individuales tales como se describe en Dulac, C. (1998) Curr . Top. Dev. Biol. 36, 245 y Jena y colaboradores (1996) J. Immunol. Methods 190:199. Se debe evitar la degradación del ARN, por ejemplo, por inclusión de ARNsin. La muestra de ARN puede ser entonces enriquecida en especies en particular. En una modalidad, poli (A) + ARN es aislado de la ARN. En general, dicha purificación aprovechas las colas poli-A en ARNm. En particular y como se indico arriba, oligonucleótidos poli-T pueden ser movilizados en un soporte sólido para servir como ligandos por afinidad para ARNm. Kits para este propósito están disponibles en el comercio, por ejemplo, el kit MessageMaker (Life Technologies, Grand Island, NY) . En una modalidad preferida, la población de ARN es enriquecida en secuencias de interés, por ejemplo, las secuencias de los genes expresados diferencialmente durante la eritropoyesis . El enriquecimiento puede emprenderse, por ejemplo, por síntesis de ADNc específico para cebador, o bien múltiples rondas de amplificación lineal con base en síntesis de ADNc y transcripción in vitro dirigida por templado (véase, por ejemplo, Wang y colaboradores (1989) PNAS 86,9717, Dulac y colaboradores, supra y Jena y colaboradores, supra) . La población de ARN, enriquecida o no en especies o secuencias particulares, puede ser amplificada adicionalmente . Dicha modificación es especialmente importante cuando se utiliza ARN de una sola célula o de algunas células. Varios métodos de amplificación son adecuados para su uso en los métodos de la invención, incluyendo, por ejemplo reacción en cadena de polimerasa; reacción en cadena de ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, u y Wallace, Genomics 4,560 (1989), Landergren y colaboradores, Science4 241,1077 (1988)), replicación de secuencias auto-sostenidas (SSR) (véase, por ejemplo, Gautelli y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 87,1874 (1990)), amplificación de secuencias basada en ácido nucleico (NASBA) asi como amplificación por transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América 86,1173 (1989) ) . Para tecnología de reacción en cadena de polimerasa, véase, por ejemplo, PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification [Tecnología de Reacción en Cadena de Polimerasa: Principios y Aplicaciones para Amplificación de ADN] (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, N.Y. N.Y. 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications [Protocolos de Reacción en Cadena de Polimerasa: Una Guía para Métodos y Aplicaciones] (eds. Innis, y colaboradores, Academic Press, San Diego, Calif. 1990); Mattila y colaboradores, Nucleic Acids Res. 19,4967 (1991); Eckert y colaboradores, PCR Methods and Applications [Métodos y Aplicaciones de Reacción en Cadena de Polimerasa], 1,17 (1991); PCR (eds. McPherson y colaboradores, IRL Press, Oxford); y Patente Norteamericana No. 4,683,202. Métodos de amplificación se describen, por ejemplo, en Ohyama y colaboradores (2000) BioTechniques 29:530; Luo y colaboradores (1999) Nat. Med. 5,117; Hegde y colaboradores (2000) BioTechqniques 29:548; Kacharmina y colaboradores (1999) Meth Enzymol . 303:3; Liveseyy colaboradores (2000) Curr. Biol. 10:301; Spirin y colaboradores (1999) Invest.

Opthamol. Vis. Sci. 40:3108; y Sakai y colaboradores (2000) Anal. Biochem. 287:32. La amplificación de ARN y la síntesis de ADNc pueden también llevarse a cabo en células in situ (véase, por ejemplo, Eber ine y colaboradores (1992) PNAS 89:3010). Una persona con conocimientos en la materia observará que cualquiera que sea el método de amplificación utilizado, si se desea un resultado cuantitativo, se debe tomar precauciones en ei sentido de utilizar un método que mantiene o controla para frecuencias relativas de los ácidos nucleicos amplificados con el objeto de lograr una amplificación cuantitativa. Métodos de amplificación "cuantitativo" son bien conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. Por ejemplo, una reacción en cadena de polimerasa cuantitativa incluye la co-amplificación simultánea de una cantidad conocida de una secuencia de control utilizando los mismos cebadores. Esto proporciona un estándar interno que puede ser utilizado para calibrar la reacción en cadena de polimerasa. Un conjunto de alta densidad puede incluir entonces sondas especificas para el estándar interno con el objeto de cuantificar el ácido nucleico amplificado. Un estándar interno preferido es un ARNC sintético AW106. El AW106 ERNA es combinado con ARN aislado de la muestra de conformidad con técnicas estándares conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia. El ARN es después transcrito de manera reversa utilizando una transcriptasa reversa para proporcionar copia de ADN. las secuencias de ADNC son después amplificadas (por reacción en cadena de polimerasa) empleando cebadores marcados. Los productos de amplificación son separados, típicamente por electrofóresis y la cantidad de radioactividad (proporcional a la cantidad de producto amplificado) se determina. La cantidad ARNm en la muestra se calcula entonces por comparación con la señal producida por el estándar de AW106 ARN conocido. Protocolos detallados para reacción en cadena de polimerasa cuantitativo se proporciona en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications [Protocolos de Reacción en Cadena de Polimerasa, Una Guía de Métodos y Aplicaciones] , Innis y colaboradores, Academic Press, Inc., N.Y., (1990). En la modalidad preferida, un ARNm de muestra es transcrito de manera reversa con una transcriptasa reversa y un cebador que consiste de oligo(Dt) y una secuencia codificadora del promotor de fago G7 con el objeto de proporcionar un templado de ADN de una sola cadena. La segunda cadena de ADN es polimerizada empleando un ADN polimerasa. Después de la síntesis de ADNc de doble cadena, se agrega T7 ARN polimerasa y se transcribe ARN a partir del templado de ADNc. Rondas sucesivas de transcripción de cada templado de ADNc individual resulta en ARN amplificado. Métodos de polimerización ín vitro son bien conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook, (aupra) y Van Gelder y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América 87:1663-1667 (1990) describen este método particular con detalles, quienes demuestran que la amplificación ín vitro de conformidad con este método conserva las frecuencias relativas de los varios transcritos de ARN. Además, Eber ine y colaboradores, prtoc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 89:3010-3014 proporciona un protocolo que utiliza dos rondas de amplificación a través de una transcripción in vitro para lograr una amplificación mayor que 106 veces del material inicial original, permitiendo así el monitoreo de la expresión aún cuando las muestras biológicas son limitadas. Se observará por parte de una persona con conocimientos en la materia que el método es una transcripción directa descrito arriba ofrece un conjunto de antisentido (ARNa) . Cuando el ARN de antisentido es utilizado como ácido nucleico blanco, las sondas de oligonuleótidos proporcionadas en el conjunto son seleccionadas para que sean complementarias de subsecuenicas de los ácidos nucleicos de antisentido. A la inversa, cuando el grupo de ácidos nucleico blanco es un grupo de ácidos nucleicos de sentido, las sondas de oligonucleótidos se seleccionan para que sean complementarias de subsecuencias de los ácidos nucleicos de sentido. Finalmente, cuando el conjunto de ácido nucleico es de doble cadena, las sondas pueden ser de cualquier sentido puesto que los ácidos nucleicos blanco incluyen tanto cadenas de sentido como cadenas de antisentido. (ii) Marcado de los ácidos nucleicos a analizar En general, las moléculas blanco serán marcadas para permitir la detección de la hibridación de moléculas blanco en un micro-conjunto. Por marcado entendemos que la sonda comprende un miembro de un sistema que produce señales y por consiguiente puede ser detectada ya sea directamente o bien a través de la acción combinada con uno o varios miembros adicionales de un sistema de producción de señales. Ejemplos de etiquetas directamente detectables incluyen porciones y isotópicas y fluorescentes incorporadas en una porción de la sonda, habitualmente enlazada covalentemente con una porción de la sonda, por ejemplo, una unidad monomérica de nucleótidos, por ejemplo, Dnmp de un cebador, o bien un derivado fotoactivo o químicamente activo de una etiqueta detectable que puede estar unida a una porción funcional de la molécula. Los ácidos nucleicos deben ser marcados después durante el enriquecimiento y/o amplificación de ARNs . Por ejemplo, ADNc marcado se preparan a partir de ARNm por transcriptor reversa cebada con oligo dTo cebada de manera aleatoria, ambos métodos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, lug y Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:316-325). La transfusión reversa puede ser efectuada en presencia de Dntp conjugado con una etiqueta detectable, con mayor preferencia un Dntp marcado de manera fluorescente. Alternativamente, ARNm aislado puede ser convertido en ARN de antisentido marcado sintetizado por transcripción ín vitro de ADNc de doble cadena en presencia de dNTPs marcados (Lockhart y colaboradores, 1996, Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays [ onitoreo de la Expresión por Hibridación con Conjuntos de Cligonucleótidos de Alta Densidad], Nature Biotech, 14:1675, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad aquí para todos los propósitos) . En modalidades alternativas, la sonda de ADNc o ARN puede ser sintetizada en ausencia de etiqueta detectable y pueden marcarse subsecuentemente, por ejemplo, por incorporación de dNTPs o Rntps, o algún medio similar (por ejemplo, fotoreticulación derivada de psoraleno de biotina con ARNs, seguido por adición de estreptavidina marcado (por ejemplo, estreptavidina conjugada con ficoeritrina) o un equivalente . En una modalidad, ADNc marcado es sintetizado por incubación de una mezcla que contiene Dgtp a 0.5 Mm, Datp y Dctp más Dttp 0.1 Mm más desoxirribonucleótidos fluorescentes (por ejemplo, Rhodamine 110 UTP 0.1 Mm (Perken Elir.er Cetus) y Cy3 Dutp 0.1 Mm (Amersham) ) con transcriptasa reversa (por ejemplo, SuperScript . ™. II, LT1 Inc.) a una temperatura de 42° C durante 60 minutos.

Porciones fluorescentes o etiquetas de interés incluyen coumarina y sus derivados, por ejemplo, 7-amino-4-metilcoumarina, aminocoumarina, colorantes bodipy, por ejemplo, Bodipy FL, azul cascada, fluoresceina y sus derivados, por ejemplo, isotiocianato de fluorosceina, verde Oregon, colorantes de rodamina, por ejemplo rojo Texas, tetrametilrodamina, eosinas y eritrosinas, colorantes de ciamina, por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX, quelatos, macrocíclicos de iones de lantánidos, por ejemplo, colorantes Quantum™, colorantes de transferencia de energía fluorescente, por ejemplo, heterodímero de tiazol anaranj ado-etidio, TOTAB, dansilo, etc. Compuestos fluorescentes individuales que tienen funcionalidades para enlazarse con un elemento deseablemente detectable en un aparato o ensayo de la presente invención, o bien que pueden ser modificados para incorporar dichas funcionalidades incluyen, por ejemplo, cloruro de dansilo; fluoresceí ñas tales como 3, 6-dihidro-9-fenilxantidrol; isoticianato de rodamina; l-amino-8-sulfonatonaftaleno de N-fenilo; 2-amino-6-sulfonatonaftaleno de N-fenilo; ácido 4-acetamido—4-isotiocianat-stilbeno-2-2 ' -disulfónico; ácido piren-3-sulfónico; 2-toluidinonaftalen6-sulfonato; N-fenil-N-metil-2-aminoftalen-6-sulfonato; bromuro de etidio; estebrina; auromin-0 , 2- ( 9 ' -antroil ) palmitato; fos fatidiletanolamina de dansilo; oxacarbocianina de N, N' -dioctadecilo; oxacarbocianina de N, N ' -dihexilo; merocianina, 4-(3'-pirenil) -estearato; d-3-aminodesoxi-equilenino; 12- (9'-antroil ) estearato; 2-metilantraceno; 9-viniltraceno; 2,2'- (vinilen-p-fenilen) bisbenzoxazol; p-bis (2-metil-5-fenil-oxazolil) benzeno; 6-dimetilamino-l, 2-benzofenazina; retinol; bis (3 ' -aminopiridinio ) 1, 10-decandiilo diiodido; sulfonaftilhidrazona de helilbrienina; clorotetraciclina; N-( 7-dimetilamlno-4-metil-2-oxo-3-crometil ) maleimida; N- (p- (2-benzimidazolil ) -fenil ) maleimida; N- ( 4-fluoroantil ) maleimida; bis (ácido homovanilico) ; resazarina; 4-cloro-7-nitro-2 , 1 , 3-benzooxadiazol ; merocianina 540; resorufina; bengal rosa; y 2, 4-difenil-3 (2H) -furanona, (véase por ejemplo, Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probé Techniques [Técnicas de Sondas de ADN NO Iostopicas] , Academic Press San Diego California) . Muchas etiquetas fluorescentes están disponibles en el comercio SIGMA chemical company (Saint Louis, Mo.), Amersham, Molecular Probes, R&D systems (Minneapolis , Minn.), Pharmacia L B Biotechnology (Piscataway, N.J.), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, California), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Md.), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chetnie AG, Buchs, Suiza), y Applied Biosystems (Foster City, California), asi como otras fuentes comerciales conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia.

Las etiquetas quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas, por ejemplo, luminol. Porciones isotópicas o etiquetas de interés incluyen 32P, 33P, 35S, 125I, ZH, 14C, y similares (véase Zhao y colaboradores, 1995, High Density Cdna filter analysis: a novel approach for large-scale, quantitative analysis of gene expression [Análisis de Filtro de ADNc de Alta Densidad: Un Enfoque Novedoso para Análisis Cuantitativo a Gran Escala de Expresión de Gen], Gene 156:207; Pietu y colaboradores, 1996, Novel gene transcripts preferentially expressed in human muscles revealed by quantitative ybridation of a high density Cdna array [Transcritos Génicos Novedosos Preferentemente Expresados en Músculos Humanos Revelados por Hibridación Cuantitativa de un Conjunto de ADNc de Alta Densidad], Genome Res. 6:492). Sin embargo, debido a la dispersión de partículas radioactivas y debido al requisito consiguiente de sitios de enlace ampliamente separados, el uso de radio isótopos es una modalidad menos preferida. Etiquetas pueden también ser miembros de un sistema de producción de señales que actúa junto con uno o varios miembros adicionales del mismo sistema con el objeto de proporcionar una señal detectable. Ejemplos ilustrativos de etiquetas de este tipo son miembros de un par de enlace específico, por ejemplo, ligandos, por ejemplo biotina, fluoresceina, digoxigenina, antígeno, cationes polivalentes, grupos quelatores y similares, en donde los miembros se unen específicamente con miembros adicionales del sistema de producción de señales, en donde los miembros adicionales ofrecen una señal detectable ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, anticuerpo conjugado con una porción fluorescentes o una porción enzimática capaz de convertir un sustrato en un producto cromogénico, por ejemplo, anticuerpos de conjugados de fosfatasa alcalina y similares. Etiquetas adicionales de interés incluyen las etiquetas que proporcionan señales solamente cuando la sonda con la cuál están asociadas esta unida específicamente a una molécula blanco, en donde tales etiquetas incluyen: "molecular beacons" [Fanales moleculares] según lo descrito en Tyagi & ramer, Nature Biotechnology (1996) 14:303 y EP 0 070 685 Bl . Otras etiquetas de interés incluyen las descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,563,037; WO 97/17471 y WO 97/17076. En algunos casos, ácidos nucleicos blanco hibridados pueden ser marcados después de la hibridación. Por ejemplo, cuando se utilizan de dNTPs marcados con biotina por ejemplo, en amplificación o transcripción, grupos reporteros enlazados a estreptavidina pueden ser utilizados para marcar los complejos hibridados. En otras modalidades, el ácido nucleico blanco no es marcado. En este caso, la hibridación puede ser determinada, por ejemplo, por resonancia de plasmón, de conformidad con lo descrito, por ejemplo, en Thiel y colaboradores (1997) Anal. Chem. 69:4948. En una modalidad, varios grupos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó más) de ácidos nucleicos blanco son marcados y utilizados en la reacción de hibridación (análisis "multiplex") . Por ejemplo, un grupo de ácidos nucleicos pueden corresponder a ARN de una célula y otro grupo de ácidos nucleicos pueden corresponder a ARN de otra célula. Los varios grupos de ácidos nucleicos pueden ser marcados con etiquetas diferentes, por ejemplo, etiquetas fluorescentes diferentes que tienen espectros de emisión distintos de tal manera que puedan distinguirse. Los grupos pueden entonces ser mezclados e hibridados simultáneamente con un micro-con unto. Por ejemplo, dos células diferentes pueden ser una célula eritroide enferma y una célula correspondiente normal. Alternativamente, las dos células diferentes pueden ser una célula eritroide enferma de un paciente que tiene un padecimiento eritropoyético y una célula eritroide enferma de un paciente sospechado de tener un padecimiento eritropoyético. En otra modalidad, una muestra biológica es expuesta a un fármaco y otra muestra biológica del mismo tipo no es expuesta al fármaco y otra muestra biológica del mismo tipo no es expuesta al fármaco. El ADNc derivado de cada uno de los tipos de células es marcado diferentemente de tal manera que pueda distinguirse. En una modalidad, por ejemplo, el ADNc de una célula enferma es sintetizado empleando un Dntp marcado con fluoresceína y ADNc de una segunda célula, es decir, la célula normal, es sintetizada utilizando un Dntp marcado con rodamina. Cuando los dos ADNc se mezclan e hibridan con el conjunto, la intensidad relativa de la señal de cada grupo de ADNc se determina para cada sitio del conjunto y cualquier diferencia relativa en cuanto a abundancia de un ARNm particular se detecta. En el ejemplo descrito arriba, el ADNc de la célula eritroide enferma emitirá una fluorescencia verde cuando el fluorófono es estimulado y el ADNc de la célula de un sujeto sospechado de tener un padecimiento eritropoyético emitirá una fluorescencia roja. Como resultado, si las dos células son esencialmente las mismas, el ARN particular será igualmente predominante en ambas células y, al efectuarse una transmisión reversa, el ADNc marcado con rojo y el ADNc marcado con verde serán igualmente presentes. Cuando se híbrida con el micro-conjunto, el sitio de enlace o los sitios de enlace para esta especie de ARN emitir (n) longitudes de onda características de ambos fluoróforos (y aparecerán de color café en combinación. En contraste, si las dos células son diferentes, la proporción entre fluorescencia verde y fluorescencia roja será diferente. El uso de un esquema de de marcado y detección con fluorescencia de dos colores para definir las alteraciones en la expresión de gen ha sido descrita, por ejemplo, en Shena y colaboradores, 1995. Un monitoreo cuantitativo de patrones de expresión de gen con un micro-conjunto de ADN complementario, Science 270:467-470. Una ventaja de la utilización de ADNc marcado con dos fluoróforos diferentes es que se puede efectuar una comparación directa y controlada internamente de los niveles de Arnm que corresponden a cada gen conjuntado en dos estados de células y variaciones causadas por diferencias menores en condiciones experimentales (por ejemplo, condiciones de hibridación) no afectarán los análisis subsecuentes . Ejemplos de etiquetas distinguibles para su uso cuando se hibridan varios ácidos nucleicos blanco con un conjunto son bien conocidos en la técnica e incluyen: dos o más colorantes fluorescentes con longitud de onda de emisión diferentes, por ejemplo, Cy3 y Cy5, combinaciones de proteínas fluorescentes y colorantes, por ejemplo, ficoeritrina y Cy5, dos o más isótopos con energía diferente de emisión, por ejemplo, 32P y 33P, partículas de oro o plata con espectros de dispersión diferentes, etiquetas que generan señales bajo condiciones diferentes de tratamiento, por ejemplo, temperatura, Ph, tratamiento por agentes químicos adicionales, etc., o bien generan señales en puntos de tiempo diferentes después de tratamiento. La utilización de una o varias enzimas para generación de señales permite el uso de una variedad aún mayor de etiquetas distinguibles con base en diferente especificidad para sustrato de las enzimas (fosfatasa alcalina/peroxidasa) . Además, es preferible para reducir el error experimental invertir las etiquetas fluorescentes en dos experimentos de hibridación diferencial de dos colores con el objeto de reducir el sesgo peculiar para genes individuales o ubicaciones de punto de conjunto. En otras palabras, es preferible medir primero la expresión génica con una etiqueta (por ejemplo, etiqueta de ácido nucleico de una primera célula con un primer fluorocromo y ácido nucleico de una segunda célula con un segundo fluorocromo) de ARNm de las dos células que se están midiendo, y medir después la expresión de genes a partir de las dos células con marcado invertido (por ejemplo, marcado de ácido nucleico de la primera célula con el segundo cluorocromo y ácido nucleico de la segunda célula con el primer fluorocromo) . Mediciones múltiples en un nivel de exposición y niveles de parámetro de control de perturbación ofrecen un control adicional del error experimental . La calidad de ácidos nucleicos marcados puede ser evaluada antes de la hibridación con un conjunto. Una muestra de los ácidos nucleicos marcados puede ser hibridada en sondas derivadas de las porciones 5', media y 3' de genes de los cuales se sabe o se sospecha que están presentes en la muestra de ácido nucleico. Esto será una indicación en cuanto a si los ácidos nucleicos marcados son ácidos nucleicos de longitud completa o si están degradados. En una modalidad, el conjunto de prueba 3 GeneChip® de Affymetrix (Santa Clara, CA) puede emplearse para este propósito. Este conjunto contiene sondas que representan un subgrupo de genes caracterizados a partir de varios organismos incluyendo mamíferos. Así, la calidad de una muestra de ácido nucleico marcada puede ser determinada por hibridación de una fracción de la muestra con un conjunto, por ejemplo, el conjunto de Test 3 GeneChip® en Affymetrix (Santa Clara, CA) . 7.2 Otros métodos para determinar los niveles de expresión de genes En ciertas modalidades, es suficiente determinar la expresión de un gen o de solamente algunos pocos genes, a diferencia de cientos o miles de genes. Aún cuando los micro-conjuntos pueden ser utilizados en estas modalidades, varios otros métodos de detección de expresión de gen están disponibles. Esta sección describe algunos ejemplos de métodos para detectar y cuantificar el ARNm o polipéptido codificado. En el caso en el cuál el primer paso de los métodos incluye el aislamiento de ARNm de células, este paso puede ser efectuado de conformidad con lo descrito arriba. El marcado de uno o varios ácidos nucleicos puede efectuarse de conformidad con lo descrito arriba. En una modalidad, el ARNm obtenido a partir de una muestra es transcrita de manera reversa en una primera cadena de ADNc y sometida a reacción en cadena de polimerasa, por ejemplo, RT-PCR. Genes de mantenimiento u otros genes cuya expresión no varia pueden emplearse como controles internos y controles en los experimentos. Después de la reacción en cadena de polimerasa, los productos amplificados pueden ser separados por electroforesis y detectados. Mediante la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa, el nivel de de producto amplificado se correlacionará con el nivel de ARN que esta presente en la muestra. Las muestras amplificadas pueden también ser separadas en un gel de poliacrilamida o agarosa, transferidos en el filtro y el filtro puede ser hibridado con una sonda especifica para el gen de interés. Numerosas muestras pueden ser analizadas simultáneamente mediante la realización de amplificación por reacción en cadena de polimerasa en paralelo, por ejemplo, por reacción en cadena de polimerasa multiplex. En otra modalidad, niveles de ARNm son determinados por análisis de dotblot y métodos relacionados (véase, por ejemplo, G.A. Beltz y colaboradores, en Methods en Enzymology [Métodos en Enzimologia] , Volumen 100, Parte B, R. Wu L. Grossmam, . Moldave, Eds . , Academic Press, Nueva York, Capítulo 19, páginas 266-308, 1985) . En una modalidad, una cantidad especificada de ARN extraído de células es absorbido íes decir, unido de manera no covalente) en un filtro, y el filtro es hibridado con una sonda del gen de interés. Numerosas muestras de ARN pueden ser analizadas simultáneamente, puesto que un blot puede comprender múltiples puntos de ARN. La hibridación es detectada utilizando un método que depende del tipo de etiqueta de la sonda. En otro método dotblot, una o varias sondas de uno o varios genes cuya expresión es regulada de manera diferencial durante la eritropoyesis se fijan sobre una membrana y la membrana es incubada con ácidos nucleicos marcados obtenidos y opcionalmente derivados de ARN de una célula o tejido de un sujeto. Dicho dotblot es esencialmente un conjunto que comprende un número menor de sondas que un micro-conjunto. La hibridación "dotblot" logró un uso generalizado y muchas versiones fueron desarrolladas (véase, por ejemplo, M.L.M. Anderson y B.D. Young un Nucleic Acid Hybridation A Practical Approach [Hibridación de Ácido Nucleico - Un Enfoque Práctico], B.D. Hames y S.J. Higgins, Eds. IRL Press, Washington, D.C., Capítulo 4, páginas 73-111, 1985). Otro formato, que se conoce como la hibridación "emparedado" incluye el hecho de fijar covalentemente sondas de oligonucleótidos sobre un soporte sólido y usarlas para capturar y detectar múltiples blancos de ácido nucleico (véase, por ejemplo, M. Ranki y colaboradores, Gene, 21, páginas 77-85, 1983; A.M. Palva, T.M. Ranki, y H.E. Soderlund, en Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2156074A, 2 de Octubre, 1985; T. M. Ranki y H.E. Soderlund en Patente Norteamericana No. 4,563,419, 7 de Enero de 1986; A.D.B. Malcom y J. A. Langdale, en PCT WO 86/03782, 3 de Julio de 1986; Y. Stabinsky, en Patente Norteamericana No. 4,751,177, 14 de Enero de 1988; T.H. Adams y colaboradores, en PCT WO 90/01564, 22 de Febrero de 1990; R. B. Wallace y colaboradores, 6 Nucleic Acid Res. 11, página 3543, 1979; y B.J. Connor y colaboradores, 80 Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos de América páginas 278-282, 1983) . Versiones multiplex de estos formatos se conocen como "dot blots reversos" . Los niveles de ARNm pueden también ser determinados a través de análisis de Nrthern blot. Cantidades específicas de ARN son separadas por electroforesis en gel y transferidas a un filtro que es después hibridado con una sonda que corresponde al gen de interés. Este método, aún cuando es más complejo cuando se deben de analizar numerosas muestras y varios genes ofrece la ventaje de ser muy preciso. Un método preferido para un análisis de alto rendimiento de expresión de gen es el análisis en serie de técnica de expresión de gen (SAGE), descrita por vez primera en Velculescu y colaboradores (1995) Science 270,484-487. Entre las ventajas SAGE se encuentra la ventaja en el sentido que tiene el potencial de proporcionar la detección de todos los genes expresados en un tipo de células dado, ofrece información cuantitativa sobre la expresión relativa de tales genes, permite una comparación fácil de la expresión génica de genes en dos células, y proporciona una información de secuencia que puede ser utilizada para identificar los genes detectados. A la fecha, la metodología SAGE ha comprobado ser capaz de detectar de manera confiable la expresión de genes regulados y no regulados en varios tipos de células (Velculescu y colaboradores (1997) Ccll 88,243-251; Zhang y colaboradores (1997) Science 276, 1268-1272 y Velculescu y colaboradores (1999) Nat. Genet. 23, 387-388). Técnicas para la producción y sondeo de ácidos nucleicos se describen adicionalmente, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio], (Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Alternativamente, el nivel de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis es determinado por la hibridación in situ. En una modalidad, una muestra de tejido se obtiene de un sujeto, la muestra de tejido es cortada, y la hibridación in situ es efectuada de conformidad con métodos conocidos en la técnica para determinar el nivel de expresión de los genes de interés. En otros métodos, el nivel de expresión de un gen es detectado mediante la medición del nivel de proteina codificada por el gen. Esto puede efectuarse, por ejemplo, por inmunoprecipitación, ELISA o inmunohistoquimica utilizando un agente, por ejemplo, un anticuerpo que detecta específicamente la proteína codificada por el gen. Otras técnicas incluyen análisis Western blot. Inmunoensayos se utilizan comúnmente para cuantificar los niveles de proteínas en muestras de células y muchas otras técnicas de inmunoensayos son bien conocidas en la técnica. La invención no se limita a un procedimiento de ensayo particular y por consiguiente se contempla para incluir tanto procedimientos homogéneos como procedimientos heterogéneos. Ejemplos de inmunoensayos que pueden efectuarse de conformidad con la presente invención incluyen inmunoensayos de polarización de fluorescencia (FPIA), inmunoensayos de fluorescencia (FIA), inmunoensayo enzimático (EIA) , inmunoensayo de inhibición de nefelométricos (NIA) , ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , y radioinmunoensayo (RIA) . Una porción indicadora o grupo marcador, puede fijarse sobre los anticuerpos sujeto y se selecciona con el objeto de cumplir las necesidades de varios usos del método que son frecuentemente indicados por la disponibilidad de equipo de ensayo y procedimientos de inmunoensayo compatibles. Técnicas generales, a utilizar en la reacción de los varios inmunoensayos indicados arriba son conocidos por parte de las personas con conocimientos ordinarios en la materia. En el caso de polipéptidos que son secretados a partir de células, el nivel de expresión de estos polipéptidos puede ser medido en fluidos biológicos. 7.3 Métodos de análisis de datos La comparación de los niveles de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis con referencia a los niveles de expresión, por ejemplo, niveles de expresión en células eritroides enfermas de un sujeto que tiene un padecimiento erit ropoyético o en células correspondientes normales se efectúa preferentemente empleando sistemas computarizados . En una modalidad, los niveles de expresión son obtenidos en dos células y estos dos conjuntos de niveles de expresión son introducidos en un sistema de cómputo para propósitos de comparación. En una modalidad preferida, un grupo de niveles de expresión es ingresado en un sistema computarizado para comparación con valores que ya están presentes en el sistema computerizado, o bien en forma legible en computadora que se ingresa después en un sistema computarizado . En una modalidad, la invención ofrece una forma legible en computadora de los datos de perfil de expresión de genes de la invención, o de los valores correspondientes en el nivel de expresión de por lo menos un gel involucrado en un padecimiento eritropoyético en una célula enferma. Los valores pueden ser niveles de expresión de ARNm obtenidos de experimentos, por ejemplo, análisis de micro-conjunto. Los valores pueden ser también niveles de ARNm normalizados con relación a un gen de referencia cuya expresión es constante en numerosas células bajo condiciones variadas, por ejemplo, GAPDH . En otras modalidades, los valores en la computadora son proporciones o diferencias entre niveles de ARNm normalizados o no normalizados en diferentes muestras. Los datos de perfil de expresión de gen pueden tener la forma una tabla, por ejemplo una tabla Excel. Los datos pueden ser individuales o bien pueden formar parte de una base de datos grande, por ejemplo, comprender otros perfiles de expresión. Por ejemplo, los datos de perfil de expresión de la invención pueden ser parte de una base de datos pública. El formato de legible en computadora puede estar en una computadora. En otra modalidad, la invención proporciona una computadora que presenta los datos de perfil de expresión de gen. En una modalidad, la invención ofrece un método para determinar la similitud entre el nivel de expresión de uno o varios genes expresado diferencialmente durante la eritropoyesis en una primera célula, por ejemplo, una célula de un sujeto y que, en una segunda célula, comprende la obtención del nivel de expresión de uno o varios gene expresados diferencialmente durante la eritropoyesis en una primera célula e ingresan estos valores en una computadora que comprende una base de datos que incluye registros que comprenden valores que corresponden a niveles de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de un padecimiento eritropoyético en una segunda célula e instrucciones de procesador, por ejemplo, una interfaz de usuario, que puede recibir una selección de uno o varios valores para propósitos de comparación con datos almacenados en la computadora. La computadora puede comprender además un dispositivo para convertir los datos de comparación en un diagrama o gráfica u otro tipo de salida. En otra modalidad, valores que representan niveles de expresión de genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis son ingresados en un sistema de computadoras, que comprende una o varias bases de datos con niveles de expresión de referencia obtenidos de más que una célula. Por ejemplo, la computadora comprende datos de expresión de células enfermas y normales. Se proporcionan instrucciones a la computadora y la computadora puede comparar los datos ingresados por los datos en la computadora con el objeto de determinar si los datos ingresados son más similares a los datos de una célula normal o a los datos de de una célula enferma. En otra modalidad, los perfiles de expresión de referencia en la computadora son perfiles de expresión provenientes de células de uno o varios sujetos cuyas células son tratadas in vivo o in vitro con un fármaco utilizado para la terapia de un padecimiento otro que un padecimiento de eritropoyesis . Al ingresar los datos de expresión en una célula de un sujeto tratado in vivo o in vitro con el fármaco, la computadora recibe instrucciones en el sentido de comparar los datos ingresados con los datos en la computadora y proporcionar resultados que indican si los datos de expresión ingresados en la computadora son más similares a los datos de expresión de una célula eritropoyesis en un sujeto afectado por el fármaco o más similares a los datos de expresión de una célula de un sujeto que no es afectado por el fármaco. Asi, los resultados indican si el sujeto tiene propensión al desarrollo de un padecimiento eritropoyético debido al tratamiento con el fármaco o si es improbable que desarrolle dicho padecimiento. En una modalidad, la invención ofrece un sistema que comprende un medio para recibir datos de expresión de gen de uno o varios genes; un medio para comparar los datos de expresión de gen de cada uno de dicho gen o de dicho varios genes con un marco de referencia común; y un medio para presentar los resultados de la comparación. Este sistema puede comprender además un medio para agrupar los datos. En otra modalidad, la invención ofrece un programa de cómputo para analizar datos de expresión de genes que comprenden (i) un código de computadora que recibe unos datos de expresión de gen ingresados de varios y (ii) un código de computadora que compara dichos datos de expresión de genes de cada uno de dichos varios genes con un marco de referencia común. La invención ofrece también un medio legible en máquina o un medio legible en computadora que incluye instrucciones de programa para llevar a cabo los pasos siguientes: (i) comparar varios valores que corresponden al nivel de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis en una célula objeto de búsqueda con una base de datos que incluye registros que comprenden expresión de referencia o datos de perfil de expresión de una o varias células de referencia y una anotación del tipo de célula; y (ii) indicar a que célula la célula en investigación es más similar con base en similitudes de perfiles de expresión. Las células de referencia pueden ser células de sujetos que responden o que no responden a un tratamiento farmacológico particular y opcionalmente incubadas ín vitro o in vivo con el fármaco. Las células de referencia pueden ser también células de sujetos que responden o que no responden a varios tratamientos diferentes para un padecimiento eritropoyético, y el sistema de cómputo indica un tratamiento preferido para el sujeto. Por consiguiente, la invención ofrece un método para seleccionar una terapia para un paciente, el método comprende (i) proporcionar el nivel de expresión de uno o varios genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis en una célula eritroide enferma de un sujeto tratado; (ii) proporcionar varios perfiles de referencia, cada uno asociado con una terapia, en donde el perfil de expresión del sujeto y cada perfil de referencia tiene varios valores, cada valor representando el nivel de expresión de un gen involucrado en la neoplasia de células pulmonares; y (iii) seleccionar el perfil de referencia más similar al perfil de expresión del sujeto con el objeto de seleccionar de esta forma una terapia para dicho paciente. En una modalidad preferida, el paso (iii) es efectuado por una computadora. El perfil de referencia más similar puede ser seleccionado ponderando un valor de comparación de la pluralidad utilizando un valor de ponderación asociado con los datos de expresión correspondientes. La abundancia relativa de un ARNm en dos muestras biológicas puede ser calificada como perturbación y se puede determinar su magnitud (es decir, la abundancia es diferente en las dos fuentes de ARNm probadas9, o bien como no perturbado (es decir, la abundancia relativa es la misma) . En varias modalidades, una diferencias entre las dos fuentes de ARN de por lo menos un factor de aproximadamente 25% (ARN de una fuente es 25% más abundante en una fuente que en la otra fuente), más habitualmente aproximadamente 50%, con frecuencia aún mayor por un factor de aproximadamente 2 (dos veces más abundante), 3 (tres veces más abundante) ó 5 (cinco veces más abundante) se clasifica como perturbación. Perturbaciones pueden ser utilizadas por una computadora para el calculo y la expresión de comparaciones. Preferentemente, además de identificar una perturbación como positivo o negativo, es provechoso determinar la magnitud de la perturbación. Esto puede efectuarse de conformidad con lo indicado arriba mediante el cálculo de la proporción de la emisión de los dos fluoróforos utilizado para marcado diferencial o bien por métodos análogos que serán fácilmente aparentes a las personas con conocimientos en la materia. El medio legible en computadora puede comprender además un puntero hacia un descriptor de un tratamiento para un padecimiento eritropoyético. En una operación, el medio para recibir datos de expresión de gen, el medio para comparar los datos de expresión de gen, el medio para presentar el medio par normalizar, y el medio para agrupar dentro del contexto de los sistemas de la presente invención pueden incluir una computadora programada con las funcionalidades respectivas descritas aquí, implementadas en hardware o hardware y software; un circuito lógico u otro componente de una computadora programada que lleva a cabo las operaciones específicamente identificadas aqui, dictadas por un programa de cómputo; o una memoria de computadora codificada con instrucciones ejecutables que representan un programa de cómputo que puede causar que una computadora funcione en la forma particular descrita aquí. Las personas can conocimientos en la materia entenderán que los sistemas y métodos de la presente invención pueden ser aplicados a varios sistemas, incluyendo computadoras personales compatibles con IBM que utilizan MS-DOS o Microsoft Windows. La computadora puede tener componentes internos enlazados a componentes externos. Los componentes internos pueden incluir un elemento de procesador interconectado con una memoria principal. El sistema de cómputo puede ser un procesador basado en Intel pentium® de 200 MHz o más como régimen de reloj y con 32 MB o más de memoria principal. El componente externo puede comprender un almacenamiento de mas que puede ser uno o varios discos duros (típicamente juntos con el procesador y la memoria) . Tales discos duros son típicamente de 1 GB o más en cuanto a su capacidad de almacenamiento. Otros componentes externos incluyen un dispositivo de interfaz de usuario que puede ser un monitor, junto con un dispositivo de entrada que puede ser un "ratón" u otros dispositivos de entrada gráficos y/o un teclado. Un dispositivo de impulsión puede también adjuntarse a la computadora . Típicamente, el sistema de cómputo esta también unido a un enlace de red que puede ser parte de un enlace Ethernet con otros sistemas de computadoras locales, sistemas de computadora remotas, o bien sistemas de comunicación de área amplia, por ejemplo, Internet. El enlace de red permite al sistema de computadoras compartir datos y tareas de procesamiento con otros sistemas de computadoras. En la memoria de este sistema durante la operación se cargan varios componentes de software que son tanto estándares en la técnica y especiales para la presente invención. Estos componentes de software hacen colectivamente que el sistema de computadoras funcione según los métodos de la presente invención. Estos componentes de software están almacenados típicamente en un almacenamiento de masa. Un componente de software representa el sistema operativo que es responsable de administrar el sistema de la computadora y sus interconexiones de red. Este sistema de operación puede ser, por ejemplo, de la familia Microsoft Windows, por ejemplo, Windows 95, Windows 98 o bien Windows NT. Un componente de software representa lenguajes y funciones comunes convenientemente presentes en un sistema para ayudar los programas a implementar los métodos específicos para esta invención. Muchos lenguajes de computadora del nivel alto o del nivel bajo pueden ser utilizados para programar los métodos analíticos de esta invención. Las instrucciones pueden ser interpretadas durante el tiempo de funcionamiento o bien compiladas. Los lenguajes preferidos incluyen C/C++, y JAVA®. Mas preferentemente, los métodos de esta invención están programados en paquetes de software matemáticos que permiten entradas simbólicas de ecuaciones y especificaciones de procesamiento de alto nivel incluyendo algoritmos a utilizar, liderando si al usuario de la necesidad de programar ecuaciones individuales o algoritmos individuales. Tales paquetes incluyen Matlab de Mathworks (Natick, Mass.), Mathematica de olfram Research (Champaign III), o bien S-Plus de Soft (Camberidge, Mass.). Por consiguiente, un componente de software represente los métodos analíticos de esta invención programados en un lenguaje de procedimiento o paquete simbólico. En una modalidad preferida, el sistema de cómputo contiene también una base de datos que comprende valores que representan niveles de expresión de uno o varios genes cuya expresión es característica de cáncer de pulmón. La base de datos puede comprender uno o varios perfiles de expresión de genes cuya expresión es característica de cáncer de pulmón en células diferentes. En un ejemplo de implementación, para practicar los métodos de la presente invención, un usuario descarga primero datos de perfiles de expresión en el sistema de cómputo. Estos datos pueden ser ingresados directamente por el usuario desde un monitor y teclado o bien de otros sistemas de cómputo enlazados por una conexión de red o bien en un medio de almacenamiento removible, por ejemplo, CD-ROM o disco blando o a través de la red. Después, el usuario ejecuta un software de análisis de perfil de expresión que efectúa los pasos de comparar y, por ejemplo, agrupar genes co-variantes en grupos de genes. En otro ejemplo de implementación, perfiles de expresión son comparados empleando un método descrito en la Patente Norteamericana No.6, 203, 987. Un usuario carga primero datos de perfil de expresión en el sistema de la computadora. Definiciones de perfiles de Geneset son cargadas a la memoria a partir del medio de almacenamiento o a partir de una computadora remota, preferentemente a partir de un sistema de base de datos Geneset dinámico, a través de la red. Después, el usuario ejecuta el software de proyección que efectúa los pasos de convertir el perfil de expresión en perfiles de expresión proyectados. Los perfiles de expresión proyectados son después desplegados. El otro ejemplo de implementación, un usuario dirige primero un perfil proyectado en la memoria. El usuario carga entonces un perfil de referencia a la memoria. Después, el usuario ejecuta el software de comparación que efectúa los pasos de comparar objetivamente los perfiles. 7.4 Ejemplos de composiciones y dispositivos de diagnóstico y pronóstico de la presente invención Cualquier composición y dispositivo (por ejemplo, un micro-conjunto) utilizado en los métodos descritos arriba esta dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, la invención ofrece una composición que comprende varios agentes de detección para detectar la expresión de genes en las tablas I, II y III. En una modalidad preferida, la composición comprende por lo menos 2, preferentemente por lo menos 3, 5, 10, 20, 50 ó 100 agentes de detección diferentes. Un agente de detección puede ser una sonda de ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN o bien puede ser un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo que se une al polipéptido codificado por un gen listado en las tablas I, II y III. Las sondas pueden estar presentes en una cantidad igual o en cantidades diferentes en la solución. Una sonda de ácido nucleico puede tener por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos de largo, preferentemente por lo menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50, 100 nucleótidos o más, y puede comprender el gen de longitud completa. Sondas preferidas son las sondas que se hibridan específicamente con genes listados en las tablas I, II y III. Si el ácido nucleico es corto (es decir, 20 nucleótidos o menos), la secuencia es preferentemente complementaria del gen blanco (es decir, un gen involucrado en la eritropoyesis ) de tal manera que se pueda obtener una hibridación especifica. Sin embargo, los ácidos nucleicos, aún ácidos nucleicos cortos, que no son perfectamente complementarios del gen blanco pueden también estar incluidos en una composición de la invención, por ejemplo, para su uso como control negativo. Algunas composiciones pueden comprender también ácidos nucleicos que son complementarios de un alelo de un gen y capaces de detectar un alelo de un gen. En una modalidad preferida, la invención ofrece ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones altamente estrictas de 0.2 a 1 x SSC a una temperatura de 65° C seguido por lavado a 0.2 x SSC a una temperatura de 65° C con genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis . En otra modalidad, la invención ofrece ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones poco estrictas de 6 x SSC a temperatura ambiente seguido por un lavado a 2 x SSC a temperatura ambiente. Otras sondas de ácido nucleico se hibridan con su blanco en 3 x SSC a 40 ó 50° C, seguido por un lavado en 1 ó 2 x SSC a 20, 30, 40, 50, 60, ó 65° C. Ácidos nucleicos que tienen un nivel de identidad de por lo menos aproximadamente 80%, preferentemente por lo menos aproximadamente 90%, con preferencia aún mayor por lo menos aproximadamente 95% y muy especialmente por lo menos aproximadamente 98% con genes involucrados en la eritropoyesis o ADNc de los mismos, y complementos de los mismos están también dentro del alcance de la presente invención . Sondas de ácido nucleico pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de segmentos de gen a partir de ADN, ADNc (por ejemplo, por RT-PCR) , o bien secuencias clonadas. Los cebadores de reacción en cadena de polimerasa se seleccionan, con base en una secuencia conocida de los genes o ADNc, que resultan en una amplificación de fragmentos únicos. Programas de cómputo pueden ser utilizados en el diseño de cebadores con la especificidad requerida y propiedades óptimas de amplificación. Véase, por ejemplo, Oligo versión 5.0 (National Biosciences ) . Factores que aplican al diseño y a la selección de cebadores para amplificación son descritos, por ejemplo, por Rylchik, W. (1993) "Selection of Primers for Polymerase Chain Reaction" [Selección de Cebadores para Reacción en Cadena de Polimerasa] , en Methods in Molecular Biiology [Métodos en Biología Molecular] , volumen 15, White B. ed. Human Press, Totowa, N.J. Secuencias pueden ser obtenidas de GenBank u otras fuentes públicas. Oligonucleotidos de la presente invención pueden ser sintetizados por métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tales como los cornercialmente disponibles en Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, oligonucleotidos de fosforotioato pueden ser sintetizados por el método de Stein y colaboradores (1988, Nucí. Acids. Res. 16:3209), oligonucleotidos de metilfosfonato pueden ser preparados mediante el uso de soportes de polímero de vidrio de poros controlado (Sarin y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci, Estados Unidos de América, 85:7448-7451), etc. En otras modalidades, el oligonucleótido es un 2'~0-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores, 1987, Nucí. Acids Res. 15:6131-6148), o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores, 19S7, FEBS Lett. 215:327-330). Sondas que tienen secuencias de genes listadas en las tablas I, II y III pueden también ser generadas sintéticamente. Un ensamble de un solo paso de un gen entre grandes números de oligodesoxiribonucleótidos pueden efectuarse de conformidad con lo descrito por Stemmer y colaboradores Gene (ñmsterdam) (1995) 16 ( 1) : 49-53. En este método, se describe una reacción en cadena de polimerasa de ensamblaje (síntesis de secuencia de ADN larga de grandes números de oligodesoxiribonucleótidos (oligos )) . El método se deriva de desplazamiento de ADN (Stemmer, Natura (1994) 370:389-391), y no se basa en ADN ligasa sino que se basa al contrario en ADN polimerasa para construir fragmentos de ADN cada vez más largos durante el proceso de ensamblaje. Por ejemplo, un fragmento de 1.1 kb que contiene el gen codificador de TEM-1-beta-lactamasa (bla) puede ser ensamblado en una reacción única a partir de un total de 56 oligos, cada uno de 40 nucleótidos (nt) de longitud. El gen sintético puede ser amplificado por reacción en cadena de polimerasa y hace que este enfoque sea un método general para la síntesis rápida y económica de cualquier gen. La "amplificación rápida de extremo de ADNc" o RACE es un método de reacción en cadena de polimerasa que puede ser utilizado para amplificar ADNc de varios ARNs diferentes. Los ADNc pueden ser ligados a un enlazador de oligonucleótidos y amplificados por reacción en cadena de polimerasa empleando dos cebadores. Un cebador puede ser basado en una secuencia de los ácidos nucleicos de la presente invención para los cuales se desea una secuencia de longitud completa, y un segundo cebador puede comprender una secuencia que se híbrida con el enlazador de oligonucleótido para amplificar el ADNc. Una descripción de este método se reporta en Publicación PCT No. WO 97/19110. En otra modalidad, la invención ofrece una composición que comprende varios agentes que pueden detectar un polipéptido codificado por un gen involucrado en la eritropoyesis . Un agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo. Anticuerpos de polipéptidos descritos aquí pueden obtenerse comercialmente, o pueden ser producidos de conformidad con los métodos conocidos en la técnica. La sondas pueden ser sujetadas a un soporte sólido, como por ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, pines o láminas de vidrio, o cualquier otro sustrato apropiado, como por ejemplo los descritos adicionalmente aquí. Por ejemplo, sondas de genes involucrados en la eritropoyesis pueden fijarse covalentemente sobre membranas para su uso, por ejemplo, en dotblots, o bien para crear conjuntos, por ejemplo, micro-con untos . 7.5 Métodos Alternativos de Diagnóstico En otras modalidades de los métodos de diagnóstico contemplados por la presente invención, el método de diagnóstico comprende los pasos de determinar la actividad de una proteina codificada por un gen seleccionado entre los paneles de la invención en las células eritroides de un sujeto, y comparar la actividad de dicha proteina en las células de dicho sujeto con la actividad de dicha proteina en una célula eritroide normal del mismo tipo. El método de diagnóstico puede comprender también los pasos de determinar el nivel de rotación de una proteina, el nivel de traducción de una proteina, o el nivel de rotación de un ARNm codificado por un gen a partir de los paneles de la presente invención. Ensayos para determinar la actividad de una proteina particular, niveles de rotación, y niveles de traducción son utilizados rutinariamente en la técnica como lo saben las personas con conocimientos en la materia, y pueden ser adaptados a los métodos de la presente invención sin más que experimentos de rutina. 8. Kits Terapéuticos y de Diagnóstico La presente invención ofrece kits para tratar padecimientos eritropoyéticos . Por ejemplo, un kit puede comprender también uno o varios ácidos nucleicos que corresponden a uno o varios genes característicos de un padecimiento eritropoyético, por ejemplo, para uso en el tratamiento de un paciente que tiene este padecimiento. Los ácidos nucleicos pueden estar incluidos en un plásmido o un vector, por ejemplo, un vector viral. Otros kits comprenden un polipéptido codificado por un gen característico de un padecimiento eritropoyético o un anticuerpo para un polipéptido. Otros kits comprenden kits identificados aquí como agonistas o antagonistas de genes característicos de un padecimiento eritropoyético. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas que incluyen un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un kit puede comprender un micro-conjunto que comprende sondas de genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis. Un kit puede comprender una o varias sondas o cebadores para detectar el nivel de expresión de uno o varios genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis y/o un soporte sólido en donde se fijan sondas y que puede emplearse para detectar la expresión de uno o varios genes que son expresados de manea diferencial durante la eritropoyesis. Un kit puede comprender además controles de ácido nucleico, amortiguadores e instrucciones de uso. La presente invención ofrece además un kit que comprende una biblioteca de patrones de expresión de genes y reactivos para determinar uno varios niveles de expresión de genes. Para proporcionar solamente un ejemplo, el nivel de expresión puede ser determinado proporcionando un kit que contiene un ensayo apropiado y un micro-con unto apropiado con un conjunto de sondas. En otra modalidad, el kit comprende reactivos apropiados para determinar el nivel de actividad de proteina en las células eritroides de un sujeto. Los kits pueden ser útiles para identificar sujetos predispuestos a desarrollar un padecimiento eritropoyético o que tienen un padecimiento eritropoyético, asi como para identificar y validar agentes terapéuticos para padecimientos eritropoyéticos . En una modalidad, el kit comprende un medio legible en computadora en donde está almacenado uno o varios perfiles de expresión de gen de células enfermas de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético, o por lo menos valores que representan niveles de expresión de uno o varios genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis . El medio legible de computadora puede también comprender perfiles de expresión génica de células normales correspondientes, células enfermas tratadas con un fármaco y cualquier otro perfil de expresión de gen descrito aquí. El kit puede comprender software de análisis de perfil de expresión capaz de ser cargado en la memoria de un sistema de cómputo . Un kit puede comprender reactivos apropiados para determinar el nivel de actividad de proteina de células eritroides de un suj eto . Componentes de kit pueden estar empacados ya sea para práctica manual o parcial o totalmente automatizada de los métodos antes mencionados. En otras modalidades que involucran kits, esta invención contempla un kit que incluye composiciones de la presente invención, y opcionalmente instrucciones para su uso. Tales kits pueden tener varios usos, incluyendo, por ejemplo, formación de imágenes, diagnósticos, terapia, y otras aplicaciones. EJEMPLOS La presente invención se ilustra adicionalmente a través de los ejemplos siguientes que no deben considerarse como limitativos de ninguna manera. El contenido de todas las referencias citadas incluyendo referencias de literatura, patentes expedidas, solicitudes de patentes publicadas o no publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan aquí expresamente por referencia. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro del alcance de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la literatura (véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual [Clonación Molecular Un Manual de Laboratorio], 2". Edición, ed. Por Sambrook, Fritsch y aniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning [Clonación de ADN] , Volúmenes I e II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis [Síntesis de Oligonucleotidos] (M.J. Gait y colaboradores, 1984); Mullís y colaboradores Patente Norteame icana No. 4,5683,195; Nucleic Acid Hibridization [Hibridación de Ácido Nucleico] (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation [Transcripción y Traducción] (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. 1987); Immobilized Cells And Enzimes [Células Inmovilizadas y Enzimas] ( IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning [Una Guía Practical hacia la Clonación Molecular] (1984 ) ; el tratado, Methods In Enzymology [Métodos en Enzimología] (Academi Press. Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells [Vectores de Transferencia de Genes para Células de Mamíferos] (J. H. Mi] ler y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Vols. 154 y 155 (Wu y colaboradores eds.), Immunoche ical Methods In Cell And Molecular Biology [Métodos Inmunoquímicos en Biología Celular y Molecular] (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology [Manual de Inmunología Experimental], Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986) (Cold Springs Harbor Laboratoy Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

Ejemplo 1: Cultivo de Células Progenitoras Células progenitoras SCF/Epo Células de sangre de cordón umbilical, programadas para ser desechadas y recogidas de conformidad con lineamientos institucionales, fueron obtenidas después de embarazos de duración normal. Después de la entrega de la placenta, las venas umbilicales fueron canuladas y aspiradas. Se recuperó aproximadamente 30 a 40 MI de sangre de cordón umbilical de manera rutinaria y esta sangre fue recogida en jeringas que contenían 100 U de heparina sólida (Novo Nordisk Pharma, Mainz, Alemania) por mililitro de sangre de cordón umbilical. Los coágulos sanguíneos residuales fueron removidos por pasaje a través de una coladera para células de 70 pm (Becton Dickinson, Mountain View, CA) y células mononucleares de densidad ligera, fueron aisladas empleando centrifugación Ficoll-Hypaque (densidad: 1.077 g/Ml; Eurobio, París, Francia) . Las células fueron colocadas en placas a razón de 4 x 10 células/Ml (días 1 a 3) y después a razón de 2 x 106 células/Ml y cultivas a una temperatura de 37°C en atmósfera de C02 al 5% y alta humedad (95%) . Cambios parciales de medio fueron efectuados diariamente. Las células mononucleares de sangre periférica movilizadas fueron recogidas por aféresis a partir de pacientes con cáncer de mama después de la obtención de su consentimiento informado seguido por selección de CD34+ utilizando un dispositivo CEPRATE LC34 (CellPro Inc, Bothell, WA) o Isolex 300 (Baxter Inc., Santa Ana, CA) para enriquecer las células madres de sangre periférica CD34+, de conformidad con lo publicado. Las células CD34+ (de 2 a 10 veces 106) con una pureza de 85% a 99% fueron utilizadas según experimento y cultivadas según lo descrito arriba a una densidad celular de 2.5 x 106 células/Ml. El medio de cultivo utilizado fue una modificación del medio de cultivo establecido previamente para el padecimiento de progenitores eritroides de pollo. En resumen, el medio de cultivo consistía de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco-BRL, Paisley, Reino Unido) que contenían 15% de suero fetal de becerro (FCS; Boehringer Manheim, Manheim, Alemania) , 1% de albúmina sérica bovina dializada, deslipidada, desionizada (fracción V; Sigma, St. Louis, MO) , 15% de agua destilada, 1.9 mmol/L de bicarbonato de sodio, 0.1 mmol/L de mcrcaptoetanol, 0.128 mg/Ml de transferina humana saturada en hierro (Sigma) , y 100 U/Ml de penicilina y estreptomicina (Gibco-BRL) . El medio de cultivo fue suplementado con 1 U/Ml de Epo humano recombinante (rhuEpo; Recormon 1000; 1.2 x 105 U/mg; Boehringer Manheim, Manheim, Alemania) , 100 ng/Ml de SCF de ser humano recombinante (rhuSCF; Amgen Inc, Thousand Oaks, CA) , 40 ng/Ml de factor de crecimiento 1 de tipo insulina R3 largo (IGF-1; Sigma), 106 mol/L de dexametasona (Sigma) , y 106 mol/L estradio (Sigma) .

Para monitorear la proliferación de células, células fueron contadas diariamente con un dispositivo electrónico para contar celular (CASY1; Scharfe Systems, Reutlingen, Alemania) y se determinaron los números acumulados de células. Durante la fase inicial del establecimiento del cultivo, células fueron sometidas a centrifugación Ficoll-Hypaque para remover residuos y células muertas, en caso requerido. De manera similar, se utilizó una centrifugación Ficoll-Hypaque para remover eritrocitos maduros y parcialmente maduros asi como células muertas que se acumularon durante las etapas tardías de cultivo. Para inducir la diferenciación, células progenitores eritroides humanas fueron recuperadas el día 9 del cultivo (véase arriba) , lavadas dos veces con medio libre de suero, y sembradas a 4 x 106 células/Ml en medio de cultivo que contenía 1 U/Ml de rhuEpo y 1 µg/Ml de insulina humana recombinante (rhulns Actrapid HM40; Novo Nordisk Pharma) . El medio fue parcialmente reemplazado diariamente por medio de cultivo fresco más factores. La diferenciación de eritroide fue monitoreada por medición de tamaño de células (CASY1; Scharfe Systems) y por tinción de preparación de citospina para hemoglobina (véase abajo) . En caso requerido, células de diferentes etapas de diferenciación fueron purificadas por centrifugación de densidad Percoll. Ejemplo 2: Caracterización de Progenitores Cultivados y Eritrocitos a) Ensayo de Proliferación La proliferación de las células fue evaluada cuantitativamente mediante la medición de la velocidad de incorporación de 3H-timidina. Células (2 x 104 por pozo) fueron incubadas en placas de microtitulación durante 48 horas a una temperatura de 37 °C en 100 pL de medio de cultivo que contenía varios factores de crecimiento o combinaciones de los mismos o sin factor. Se agregó 3H-timidina (0.75 pCi por pozo; actividad específica, 29 Ci/mmol; Amersham. Buchler, Braunschweig, Alemania) y células fueron incubadas durante 2 horas. Las células fueron después Usadas a través de un ciclo de congelación/descongelación, cosechadas en placas de filtro (Packard Instruments, Meriden, CT), y sometidas a conteo de centelleo líquido. Los valores promedio de muestras por triplicado (conteos por minuto [cpm]) fueron normalizados para 1 x 105 células sembradas. b. Ensayo de colonias Células de sangre de cordón umbilical (5 x 104) antes de cultivo y 1 x 103 células el día 6 de cultivo fueron colocadas en placas en alícuotas de 1-M1 en medio de metilcelulosa en platos de cultivo de plástico de 35 itim. El medio de metilcelulosa contenía metilcelulosa al 0.9% en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; MethoCult H4100; Stemcell Technologies Inc, Vancouver, British Columbia, Canadá) , complementado con FCS desactivado térmicamente al 10%, albúmina sérica bovina detoxificada al 1% (BSA) , 2 mmol/L de L-glutamina, 0.1 mmol/L-mercaptoetanol , 0.128 mg/Ml de transferina humana saturada con hierro (Sigma), 2 U/Ml rhuExpo, 200 ng/Ml rhuSCF, 2 x 106 mol/L -estradiol, y 2 x 106 mol/L dexametasona . Cultivos fueron incubados durante 14 días en CO2 al 5% y con humedad elevada a una temperatura de 37 °C. Placas duplicadas fueron analizadas para colonias que contenían 30 o más células utilizando un estéreo microscopio. Colonias de tipo de eritroides de unidades formadoras de ráfagas (BFU-E) y eritroides de unidades formadoras de colonias (CFU-E) fueron evaluadas los días 12 a 14. Similarmente, colonias de granulocitos, eritrocitos, monocitos y macrófagos de unidades formadoras de colonias (CFU-GEMM) así como colonias de macrófagos de unidades formadoras de colonias (CFü-M) fueron identificadas morfológicamente y evaluadas. c. Morfología celular y contenido de hemoglobina Para el análisis de la morfología celular y del contenido de hemoglobina, células fueron citocentrifugadas en láminas de vidrio (700 revoluciones por minutos durante 7 minutos; Cytospin 2; Shandon Inc., Pittsburgh, PA) y teñidas con bencidina neutral y colorantes histológicos, de conformidad con lo previamente descrito, (ref) Fotografía fueron tomadas con microscopio Axiophot II y cámara Kontron ProgRes 3012 CCD (Zeiss, Jena, Alemania) y procesadas con el software Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., San José, CA) . Expresión de antígeno de superficie La expresión de antígeno de superficie de células eritroides fue analizada por citometría de flujo. Por consiguiente, células fueron preincubadas con BSA al 1% (fracción V; Sigma) e IgG de ser humano al 1% (Beriglobina; Behringwerke, Marburg, Alemania) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) durante 1 hora y después reaccionaron con anticuerpos específicos (1 hora). El inmunofenotipado utilizó anticuerpos monoclonales para CD3 (anti-LEU-4, clon SK7; Becton Dickinson) , CD14 (I0M2, clon RM052; Immunotech, Marseille, Francia), CD19 (HD37; DAKO, Glostrup, Dinamarca), CD29 (MAR4; Pharmingen, San Diego, CA) , CD34 (anti-HPCA-l, clon MylO; Becton Dickinson), CD44 (IM7; Pharmingen); CD49d (9F10; Pharmingen), CD71 (Ver.T9; DAKO), CD117 (YB5.B8; Pharmingen), banda 3 (BIII-136; Sigma), y g] icoforina A/B (E3; Sigma), seguido por reacción con IgG de anti-ratón conjugada con isotiocianato de fluorescencia (FTC) (específico para Fe; 45 minutos; Sigma) . Células fueron lavadas dos veces y resuspendidas en PBS que contenía BSA al 1% y yoduro de propidio (2 g/Ml; Sigma) para fijación en células viables. Para citometría de flujo, se utilizó un dispositivo FACScalibur con un software CELLQuest (Becton Dickinson) . Ejemplo: Determinación de perfil de expresión La expresión diferencial de genes en células en varias etapas de la eritropoyesis fue detectada mediante la preparación de muestras de células en dos etapas de la eritropoyesis. Por ejemplo, muestras de SCF-Epo fueron preparadas como arriba. ARNs de cada una de las muestras fueron purificadas a través de gradientes de CsCl, extraídas con fenol-cloroformo, y purificada sen una columna Qiagen ARNeasy de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Para verificar la integridad del ARN aislado, alícuotas de cada muestra fueron sometidas a electroforesis en geles de agarosa desnaturalizantes al 1%. Muestras que presentaron una banda ribosomal 28S y 18S intacta fueron seleccionadas para la generación de sondas. Los ARNs fueron preparados para análisis de micro-conjuntos Affymetrix utilizando materiales y métodos proporcionados por Affymetrix. (Mahadevappa, M. y Warrington, J. A. (1999) Nat. Biotechnol. , 17:1134-1136) En resumen ADNc del ARN total fueron generados utilizando cebadores T7-Dt24. ARNc de antisentido fue generado utilizando ribonucleótidos marcados con biotina y un kit de transcripción in vitro. Los ARNc fueron fragmentos e hibridados con el micro-conjunto durante la noche El conjunto hibridado fue teñido con SAPE (estreptavidina-ficoeritina) . Los niveles de hibridación (por ejemplo, fluorescencia SAPE) fueron medidos empleando un explorador GeneArray de Hewlett-Packard.

La abundancia relativa de un ARNn en dos muestras fue registrado y se determinó su magnitud (es decir, la abundancia es diferente en las dos fuentes de ADNm probadas) , o bien sin cambio (es decir, la abundancia relativa es la misma). Como se utiliza aqui, la diferencia entre ARN derivado de células no diferenciadas y de células diferenciadas es por lo menos un factor de aproximadamente 2 (dos veces más abundante) en dos muestras diferentes. Métodos actuales de detección permiten la detección confiable de diferencia de un orden de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces, pero métodos más sensibles que podrán distinguir magnitudes inferiores de perturbación están en desarrollo. Se evaluaron seis grupos de datos de glóbulos rojos. Los genes que estuvieron presentes por lo menos 4 veces entre los grupos y tenían valores de más de 50 fueron seleccionados para la lista en la Tabla I. Ejemplos de genes que fueron regulados de manera ascendente se presentan en la lista de la Tabla II, mientras que ejemplos de genes regulados de manera descendente se presentan en la lista en la Tabla III. REFERENCIAS Los contenidos de todas las referencias citadas incluyendo referencias de literatura, patentes expedidas, solicitudes de patentes publicadas o no publicadas citadas a lo largo de esta solicitud asi como las mencionadas abajo, se incorporan expresamente por referencia en sus totalidades. En caso de conflicto, la presente solicitud incluyendo cualquier definición contenida aquí, tendrá preferencia. Sieweke, M. H. y Graf, T. (1998) Curren Opinión in Genetics & Development [opinión Actual en Materia de Genética y Desarrollo] 8, 545-551; Lacombe, C. y Mayeux, P. (1999) Nephrology Dialysis Transplantation [Transplanta de Diálisis de Nefrología] 14[suppl 2], 22-28; Socolovsky, M. y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. 95, 6573-6575; Krantz, S. B, (1991) Blood [Sangre] 77, 419-434; Alter, B. P. (1994) Ann N. Y. Acad Sci. 731, 36-47; Shivdasani, R. A. y Orkin, S. H. (1996) .Blood [Sangre] 87, 4025-4039; y Broudy, V. C. (1997) Blood [Sangre] 90, 1343-1364. EQUIVALENTES Con base en la invención descrita, será aparente a una persona con conocimientos ordinarios en la materia que numerosos cambios y modificaciones pueden efectuarse sin requerir más que experimentos rutinarios ni salirse del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas. La especificación y ejemplos deben considerarse solamente como ejemplos y el alcance cabal y el espíritu verdadero de la invención se indican a través de las reivindicaciones adjuntas .

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un agente terapéutico candidato para tratar un padecimiento eritropoyético, dicho método comprende : (a) poner en contacto un compuesto con un panel que comprende por lo menos un gen seleccionado a partir de la Tabla I; y (b) evaluar si dicho compuesto es un agente terapéutico candidato para un padecimiento eritropoyético, en donde dicho paso de evaluación se efectúa mediante la medición de la interacción entre dicho compuesto y dicho gen, o bien mediante la medición de un cambio en dicho gen causado por dicho compuesto.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dichos compuestos se seleccionan entre las siguientes clases de compuestos: ácidos nucleicos de antisentido, ribozimas, ARNsi, mutantes negativos dominantes de polipéptidos codificados por los genes, moléculas pequeñas, polipéptidos, proteínas, peptidomiméticos y análogos de ácido nucleico.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho padecimiento eritropoyético es anemia.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho padecimiento eritropoyético es policitemia.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se encuentra en una biblioteca de compuestos .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha biblioteca es generada empleando métodos sintéticos de combinación.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho paso de evaluación se efectúa empleando un ensayo in vi tro.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho paso de evaluación se efectúa empleando un ensayo ín vivo.
9. 9. Un método para identificar un agente terapéutico candidato para tratar un padecimiento eritropoyético, dicho método comprende : (a) poner en contacto un compuesto con un panel que comprende por lo menos un producto génico seleccionado a partir de la Tabla I; y (b) evaluar si dicho compuesto es un agente terapéutico candidato para un padecimiento eritropoyético; en donde dicho paso de evaluación se efectúa mediante la medición de la interacción entre dicho compuesto y dicho producto génico o bien mediante la medición de un cambio en dicho producto génico causado por dicho compuesto.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dichos compuestos de dicha biblioteca se seleccionan entre las siguientes clases de compuesto: proteina, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, citocinas u hormonas.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho padecimiento eritropoyético es anemia.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho padecimiento eritropoyético es policitemia.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho compuesto está en una biblioteca de compuestos .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicha biblioteca es generada mediante la utilización de métodos sintéticos de combinación.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho paso de evaluación se efectúa empleando un ensayo in vitro.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho paso de evaluación se efectúa empleando un ensayo in vivo.
17. 17. Un método para identificar un agente terapéutico candidato para un padecimiento eritropoyético, dicho método comprende la puesta en contacto de un compuesto con un proteina codificada por los genes de la Tabla I cuya actividad promueve la eri t ropoyesis ; en donde la capacidad de inhibir la actividad de la proteina indica un agente terapéutico candidato. 8. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde dicho padecimiento es anemia. 9. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde dicho padecimiento es policitemia. 0. Un método para determinar la eficacia de un agente terapéutico candidato como fármaco para un padecimiento eritropoyético, dicho método comprende la comparación de los niveles de expresión de uno o varios genes asociados con la eritropoyesis en una célula eritroide de un sujeto que tiene un padecimiento eritropoyético con los niveles de expresión de dicho gen o de dichos varios genes en una célula eritroide normal. 1. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el nivel de expresión de los genes es determinado empleando un micro-conjunto. 2. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el nivel de expresión de los genes es determinado empleando un método de cuantificación de ARN. 3. Una superficie sólida a la cual están unidos varios agentes de detección de genes expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis, y que pueden detectar la expresión de los genes o el polipéptido codificado por los genes. . La superficie sólida de la reivindicación 23, en donde los agentes de detección son ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos que corresponden a los genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis . La superficie sólida de la reivindicación 24, que comprende ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente con genes de la Tabla I. La superficie sólida de la reivindicación 24, que comprende ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente con genes de la Tabla II. La superficie sólida de la reivindicación 24, que comprende ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente con genes de la Tabla III. La superficie sólida de la reivindicación 25, que comprende ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente con por lo menos 10 ácidos nucleicos diferentes que corresponden a genes que son expresados diferencialmente durante la eritropoyesis. La superficie sólida de la reivindicación 25, que comprende ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con por lo menos 100 ácidos nucleicos diferentes que corresponden a genes que son expresados diferencialmente durante la eritropoyesis. La superficie sólida de la rei indicación 25, que comprende ácidos nucleicos aislados que se hibridan esencialmente con todos los genes de la Tabla I. 31. La superficie sólida de la reivindicación 23, en donde los agentes de detección detectan los polipéptidos codificados por los genes que son expresados de manera diferencial durante la eritropoyesis . 32. La superficie sólida de la reivindicación 31, en donde los agentes de detección son anticuerpos que reaccionan específicamente con los polipéptidos.