WO2006088226A1 - リン脂質症の判定方法 - Google Patents

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WO2006088226A1
WO2006088226A1 PCT/JP2006/303205 JP2006303205W WO2006088226A1 WO 2006088226 A1 WO2006088226 A1 WO 2006088226A1 JP 2006303205 W JP2006303205 W JP 2006303205W WO 2006088226 A1 WO2006088226 A1 WO 2006088226A1
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plsis
expression
gene
nucleic acid
seq
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PCT/JP2006/303205
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English (en)
French (fr)
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Hiroshi Sawada
Ikuo Mori
Kenji Takami
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining phospholipidosis and a tool therefor. More specifically, the present invention relates to a method for determining phospholipidosis (eg, drug-induced phospholipidosis, etc.) using blood marker gene gene expression fluctuation as an index, and a method for detecting the blood marker gene. Reagents ⁇ Kits etc.
  • Phospholipidosis (hereinafter sometimes abbreviated as “PLsis”) is defined as a phenomenon in which phospholipids accumulate excessively in cells. In addition to hereditary lipid metabolism homeostasis abnormalities, antidepressants, It is also caused by many drugs or metabolites such as anti-anginal drugs, anti-malarial drugs, anti-anorexic drugs, anti-hyperlipidemic drugs. In PLsis, phospholipids mainly accumulate in lysosomes, and circular or elliptical myelin-like structures (lamellar bodies) are observed by electron microscopy. The mechanism of toxic expression has not been fully elucidated.
  • CAD cationic amphiphilic drug
  • microarray technology exclusive gene expression analysis, transcriptomics
  • transcriptomics transcriptomics
  • Toxic phenomena include not only independent changes in one or several genes, but also a number of genes associated with each other, such as gene interactions and cascades : it is conceivable that. Therefore, it is expected that the behavior of molecules involved in the development of toxicity can be comprehensively grasped by using a microarray technology that enables analysis at the level of the transcribome.
  • the inventors previously analyzed gene expression in cultured human cells exposed to known PLs is-inducing compounds using a microarray, and found marker gene groups that markedly change expression when PLsis is induced. Identification ⁇ Reported (Sawada, H. et al., Toxicol. Sci., 83: 282-92 (2005)).
  • the in vitro screening system using cultured cells can evaluate multiple samples in a short time with a small amount of compound, and therefore, in the early stages of drug discovery where the amount of compound synthesis is limited, the presence or absence of PLsis induction is confirmed. It is an excellent tool for predicting quickly and optimizing structures efficiently.
  • the results of in vitro evaluation systems do not always reflect the in vivo toxicity.
  • a compound that induces PLsis in a cell by in vitro staring can be said to have a PLsis-inducing potential, but may not be toxic because it is quickly metabolized in a living body. The reverse is also true. Or, if the concentration that exerts a medicinal effect is sufficiently low relative to the concentration at which toxicity appears, it is possible to advance to the preclinical / clinical stage.
  • the sample used for analysis is preferably blood lymphocytes.
  • marker genes When biological samples such as blood and lymph are targeted for analysis, new and more appropriate marker genes (groups) may be found that differ from the marker gene groups used in in vitro evaluation systems (for example, Rockett, JC et al., Toxicol. Sci., 69 ' ⁇ 49-59 (2002)). However, there have been no reports on specific marker genes that can accurately determine PLsis induction in an in vivo evaluation system.
  • An object of the present invention is to identify a gene whose expression in blood or the like fluctuates in correlation with the expression of PLsis, that is, a PLsis marker gene, and to evaluate PLsis in vivo using the expression variation of the gene as an index. Is to provide.
  • the present inventors conducted a comprehensive gene expression analysis using a microarray using rat blood administered with various known PLsis-inducing compounds for 3 days and 7 days, respectively. We succeeded in identifying a group of genes whose expression varies significantly in all of these compounds for each administration period. In addition, for many compounds, the majority of these genes showed altered expression at both 3 and 7 days. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • nucleic acid having the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: n (n is an odd number from 1 to 5 7; an integer from 5 9 to 63; an even number from 6 4 to 9 8; 1 0 Q or 1 0 1) And a nucleic acid that can be hybridized under highly stringent conditions, and a nucleic acid that can hybridize under highly stringent conditions with a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or the base sequence.
  • Reagent for determination of phospholipidosis [2] A transcription product of a gene whose expression varies in correlation with the expression of phospholipidosis and a nucleic acid that can hybridize under high stringency conditions, or having a base sequence that is complementary to the transcription product
  • a kit for determining phospholipidosis in a mammal comprising two or more reagents containing a nucleic acid capable of hybridizing with a nucleic acid under highly stringent conditions,
  • At least one reagent is the reagent described in [1] above,
  • each reagent can detect the expression of a different gene
  • a method for determining phospholipidosis in a mammal comprising detecting changes in the expression of one or more genes whose expression varies in correlation with the expression of phospholipidosis in a sample collected from the mammal. And at least one gene has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: n (n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 100 or 100) A method having the same or substantially the same nucleotide sequence;
  • the PLsis determination method of the present invention is characterized by detecting changes in the expression of a single PLsis marker gene in a sample collected from a mammal, so that it is less invasive than conventional in vivo toxicity tests, etc. Moreover, it has an excellent effect that it can accurately determine the expression of PLsis.
  • the present invention relates to a gene whose expression varies in correlation with the expression of PLsis (ie, PLsis marker).
  • a reagent for judging PLsis containing a nucleic acid capable of detecting the expression of each gene.
  • the expression varies in correlation with the expression of PLsis means that the expression is substantially increased or decreased when histopathological findings of PLsis are observed in one or more tissues of mammals. This means that it is statistically significant.
  • substantially increase or decrease means to increase 1.5 times or more than normal, or decrease to 2/3 or less of normal, 1.-If the expression level is 5 times, it shall be regarded as substantially unchanged.
  • the sequence number n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 10 5 or 4 types of genes (including 7 types of ESTs) each having the same or substantially the same base sequence as that shown in 0 or 10 1).
  • substantially the same nucleotide sequence means SEQ ID NO: n (n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 to 9 to 3, an even number from 6 to 9 to 8, 1 0 0 or 1 0 1) a base sequence that can hybridize with a nucleic acid having a complementary strand sequence of each base sequence shown in 1) under highly stringent conditions, and the protein encoded thereby is encoded by the base sequence shown in the SEQ ID NO. Sequence that is identical or substantially identical to the protein.
  • the “high stringent condition” is represented by SEQ ID NO: n (n is an odd number of 1 to 5 7, an integer of 5 9 to 6 3, an even number of 6 4 to 9 8, 1 0 0 or 1 0 1)
  • the person skilled in the art will know the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, By changing the temperature etc. as desired Can be easily adjusted to the stringency.
  • the “substantially identical protein” means about 60% or more, preferably about 70% of each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: m (m is an even number of 2 to 58 or odd number of 65 to 99). % Or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more of amino acid sequences having homology of about 95% or more, and represented by the respective SEQ ID NOs.
  • the PLsis marker gene has the same or substantially the same base sequence as each base sequence shown in SEQ ID NO: n (n is an integer of 59 to 63, 1 00 or 1 0 1).
  • the “substantially identical protein” means a portion encoded by each base sequence represented by SEQ ID NO: n (n is an integer of 59 to 63, 1 0 0 or 1 0 1)
  • Amino acid sequence has a homology of about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • “Homogeneous activity” means that the activity is qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same and quantitatively equivalent (eg, 0.5 to 2 times). It is preferred, but it can be different. Also, other quantitative elements such as molecular weight may be different as long as the homology of amino acid sequences is satisfied.
  • homology refers to the optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably the algorithm is for optimal alignment).
  • the ratio of the same amino acid residue and the similar amino acid residue to the entire amino acid residues that overlap each other (%) can be considered in the introduction of a gap to one or both of the sequences.
  • Similar amino acids mean amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids ( Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). It is expected that such substitutions with similar amino acids will not alter the protein phenotype (ie, conservative amino acid substitutions).
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: m is the amino acid sequence shown in each SEQ ID NO.
  • the partial amino acid sequence substantially identical to the partial amino acid sequence is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more with the partial amino acid sequence encoded by the base sequence shown in each SEQ ID NO.
  • proteins having such homology include: 1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: m (m is an even number of 2 to 58 or odd number of 65 to 99) (or SEQ ID NO: n (n is 59 to 63) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10), in particular, a partial amino acid sequence encoded by each base sequence represented by 100 or 10 1) Preferably, an amino acid sequence in which a number (1 to 5) amino acids are deleted, 2) SEQ ID NO: m (m is an even number of 2 to 5 8 or an odd number of 6 5 to 9 9) The amino acid sequence shown (or SEQ ID NO: n (where n is an integer of 5 9 to 63, 100 or 100 1), 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably An amino acid sequence added with about 1 to 10 amino acids, particularly preferably a number (1 to 5) amino acids; 3) Each base shown in the amino acid sequence (or SEQ ID NO: m (m is an even number of 2 to 58 or
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: m (m is an even number from 2 to 58 or odd number from 65 to 99) (or SEQ ID NO: n (n is an integer from 59 to 63), 1 or 2 (preferably about 1-30, more preferably about 1-10, particularly preferably a number) in the partial amino acid sequence encoded by each base sequence shown in (100 or 10 1)) (1-5) amino acid sequences substituted with other amino acids, or 5) a combination of them
  • proteins containing the amino acid sequence include proteins containing the amino acid sequence.
  • the position of the insertion deletion or substitution is not particularly limited.
  • SEQ ID NO: n (n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 9 to 63, 64 ⁇ 98 (even number, 10 0 or 1 0 1) as a gene having a base sequence substantially identical to the base sequence shown in each SEQ ID NO.
  • Mutants and mammals other than rats eg, humans, monkeys, mice, horses, peta, hidges, goats, inu, cats, usagis, hamsters, mono-remotes, mice, etc.
  • ortholog for example, ortholog.
  • nucleotide sequence of the rat-derived PLsis marker gene of the present invention [i.e., SEQ ID NO: n (where n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 100 or 10 All of the nucleotide sequences shown in 1) are known, and in the GenBank database, 1) ⁇ _031355, 3) Rei-053359, 5) NM-017051, 7) ⁇ -013052, 9) NM— 053372 11) Hiring-053843, 13) Lotus-001004202, 15) Yes-012512 (or AW916647), 17) Rei_019186, 19) NM_024139, 21) XM- 215858 (or AA891920), 23) ⁇ — 012778 (or L07268), 25) XM_213793 (or AI412863), 27) Employment — 057114, 29) ⁇ — 053
  • the human orthologues corresponding to these are: 1) ⁇ -005662, 3) NM-004045, 5) NM-000636, 7) NM-003405, 9) ⁇ -003064, 11) ⁇ -000569 ( ⁇ -000570 as a variant), 13) (The human gene corresponding to NM_001004202 is not known), 15) AK02 6 463 (NM-004048 as a variant), 17) NM_005738 (NM-212460 as a variant) ) 19) Employment—007236, 21) ⁇ — 013248, 23) ⁇ — 000385 (As a Pariant—198098), 25) Employment _016433, 27) Employment _002574 (As a variant, 1—1 ⁇ 1696, ⁇ —181697) ) 29) ⁇ — 003229, 31) NM— 004219, 33) NM_003851 (similar to both XM—
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter sometimes abbreviated as “vdac3j”) is a gene that may function for transport of adenine nucleotides. It encodes a voltage-dependent anion channel 3 that is the voltage-dependent ion channel of the Tocondria outer membrane.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 3 (hereinafter sometimes abbreviated as “at 0 xl”) is an intracellular copper transport constancy. It encodes a copper-binding protein (ATX1 (antioxidant protein 1) horaolog 1 (yeast)) that mediates maintenance.
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 5 (hereinafter sometimes abbreviated as “sod2”) is used to convert superoxide to hydrogen peroxide.
  • code and encode the tocondria enzyme (superoxide dismutase 2, mitochondrial).
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 7 (hereinafter sometimes abbreviated as “ywhah”) is an apoptosis inhibitor, and is a tyrosine hydroxylase. And a protein that is also an activator of tributophan hydrolase (tyrosine 3-monooxygenase / tryptophan 5-monooxygenase activation protein, encoded by eta polypeptide).
  • Genes with identical base sequences hereinafter sometimes abbreviated as “sl P i”) have protease inhibitors (secretory leukocyte protease inhibitors) such as trypsin, cathebsin G and neutrophil elastase. Code and play.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 11 (hereinafter sometimes abbreviated as “fcgr3j”) binds to immunoglobulin and causes various immune responses. It encodes proteins (Fc receptor, IgG, low affinity III).
  • ccl6 A gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 13 (hereinafter sometimes abbreviated as “ccl6”) promotes inflammatory cell migration and invasion in rats. It encodes CC chemokine (chemokine (CC motif) ligand 6), but the corresponding gene in humans is not known.
  • the gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 15 (hereinafter sometimes abbreviated as “B2m”) is MHC class I that acts in transepithelial transport of IgG. It encodes the antigen component (Beta-2 microglobulin).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 17 (hereinafter sometimes abbreviated as “arl4”) plays an important role in vesicular transport and protein secretion. Encodes a GTP-binding protein (ADP-ribosylation-like 4) Yes.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 19 (hereinafter sometimes abbreviated as “chp”) is a Ca 2+ binding protein that plays a role in cross-transport. It encodes (calcium binding protein p22).
  • the gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 21 is a protein similar to NTF2-related export protein NXT1 (Similar to NTF2-related export protein NXT1 (L0C296219), raRNA).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 23 constitutes a water channel 3 ⁇ 4 white matter (aquaporin 1 (channel -forming integral protein, 28kDa code.
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 25 is similar to a glycolipid transport protein involved in transmembrane transport of glycosphingolipids and glycoglyce mouth lipids. It encodes a protein (Similar to Glycolipid transfer protein (L0C288707), mRNA).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 27 (hereinafter sometimes abbreviated as “prdxl”) has an antioxidative activity induced by oxidative stress. It encodes an oxidizing substance (peroxiredoxin 1).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 2.9 (hereinafter sometimes abbreviated as “txn”) is involved in the response to UV and oxidative stress. It encodes a protein (thioredoxin) that reduces reactive oxygen intermediates.
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 31 (hereinafter sometimes abbreviated as “pttg”) is down-regulated in response to serum starvation. It is a pre-oncogene (.pituitary tumor-transforming 1) that promotes proliferative opiogenesis.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 33 is similar to the cell repressor CREG of a gene stimulated by E1A involved in transcriptional control related to cell growth and differentiation It encodes a similar protein to E1A-stimulated genes CREG (L0C289185), mRNA.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 35 is an enzyme conjugated with ubiquitin that controls the transition from G1 phase to S phase and chromosome alignment (Similar to cell division cycle 34; ubiquitin-conjugating enzyme E2-32 KDA complementing; ubiquitin carrier protein; ubiquitin-protein ligase (L0C299602), mRNA).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 37 (hereinafter sometimes abbreviated as “ubadcl”) is an intracellular cell that can control the proliferation of endothelial cells. protein is estimated to signal molecules (ubiquitin associated domain containing 1) 3 ⁇ 4 " co 1. are de ⁇ .
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 39 is a protein similar to eukaryotic translation elongation factor 1 ⁇ 1 (Similar to eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1 ( L0C291057), mRNA).
  • a gene (EST) having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 41 is a protein similar to RNA polymerase II elongation factor ELL2 (Similar to RNA polymerase II elongation factor ELL2 (L0C309918)). , mRNA).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 4 “3 (hereinafter sometimes abbreviated as“ ctsb ”) is a cysteine protease belonging to the lysosomal papain family ( It codes cathepsin B).
  • us P 15 encodes an enzyme belonging to the ubiquitin-specific cysteine protease family (ubiquitin specific protease 15).
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 47 (hereinafter sometimes abbreviated as “emb”) is a transmembrane protein (erabigin), which is a cell adhesion molecule.
  • Code. -A gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 49 (hereinafter sometimes abbreviated as “glul”) encodes glutamine synthetase I. is doing.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 51 (hereinafter sometimes abbreviated as “lcn7j”) is assumed to be an extracellular matrix protein.
  • As an inactive cathebsin B-related protein (lipocalin 7).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 53 (hereinafter sometimes abbreviated as “best5”) is an antiviral protein induced by interferons (Best 5 protein).
  • the gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 55 is a protein similar to the protein (SAP30) related to the transcription corepressor Sin3A related to the histone deacetylase (SAP30). Similar to Sin3A associated protein p30—like).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 57 encodes a protein similar to hypothetical "protein MGC40107 (L0C287442), mRNA" .
  • a gene (EST) having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 59 is a cell repressor of a gene stimulated by E1A involved in transcriptional control related to cell proliferation and differentiation.
  • a gene (EST) having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 60 is similar to the anti-apoptotic protein mRNA that enhances JNK1 activation.
  • a gene (EST) having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 61 is similar to the mRNA of an RNA-binding protein involved in the suppression of raRNA translation in germ cells. It has lj (Similar to germ cel l specific Y-box binding protein).
  • a gene (EST) having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 62 is similar to the mRNA of the cytoskeletal anchor protein Ankyrinl, which attaches cytoskeletal elements to the plasma membrane. It has the sequence (Similar to Ankyrin 1). The function of the gene (EST) having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 63 is unknown.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 64 is a calcium-dependent phospholipid-binding protein that inhibits phospholipase A2. (AnnexinAl) is coded.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 66 (hereinafter sometimes abbreviated as “nudt4”) may be involved in inositol phosphate metabolism. Encodes nudix ⁇ nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 4) with diphosphoinositol polyphosphate phosphine.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 6 '8 (hereinafter sometimes abbreviated as picalmj) binds to the clathrin heavy chain and is It encodes a protein that acts on cis (Phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein).
  • S100a 8 The gene (hereinafter sometimes abbreviated as “S100a 8 ”) is a member of the S100 family and forms a complex with S100A9 to mediate arachidonic acid secretion and leukocyte recruitment to the inflammatory site ( S100 calcium binding protein A8 (calgranulin
  • A)) is coded.
  • S100a9 A gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 72 (hereinafter sometimes abbreviated as “S100a9”) is a member of the S100 family and complexed with S100A8 A protein that mediates arachidonic acid secretion and leukocyte recruitment to the inflammatory site (S100 calcium binding protein A9 (calgranulin
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 74 (hereinafter sometimes abbreviated as “dgat2”) is a gene that catalyzes the biosynthesis of triacylglycerol. It encodes one member of the glycerol glycerol acyltransferase family (Diacylglycerol 0-acyl transferase homolog 2 (mouse)).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 76 (hereinafter sometimes abbreviated as cxcr4J) is a GPCR (Cheraokine (CXC motif) receptor) that binds to CXC chemokines. 4) is coded.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 78 (hereinafter sometimes abbreviated as “il lb”) is a site force that regulates defense responses and inflammatory responses. Codes in (interleukin 1 beta).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 80 (hereinafter sometimes abbreviated as “fbxl5”) is an estimate of SCF ubiquitin ligase involved in proteolysis. Code and submit subunits (F-box and leucine-rich repeat protein 5 (predicted)).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 82 (hereinafter sometimes abbreviated as “pglyrpl”) binds to peptide darlicans and gram-positive bacteria, Proteins involved in innate immunity (peptidoglycan Rereru the recognition protein 1) co-1 "to de to.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 84 may be involved in the ribosome assembly. It is a nucleic acid-binding ribonuclease and encodes a protein (nucleophosmin 1) that is a molecular chaperone.
  • a gene having the same or substantially the same base sequence as shown in SEQ ID NO: 86 is a serum protein containing multiple leucine-rich repeats (Similar to eucine—rich alpha—2-glycoprotein). Code and speak.
  • the nucleotide having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 88 (hereinafter sometimes abbreviated as “aloxl5”) is used to treat arachidonic acid with 15-hydroxyperoxyeco. Enzymes that convert satratenic acid and lipoxin A4 12—Coat with lipoxygenase and “I”.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 90 acts on the cell cycle of mitosis, and apoptosis It encodes a protein (Cut- ike 1 (Drosophi la)) that may regulate the immune response to evoked stimuli.
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 92 is encoded by a tyrosine-serine phosphatase ⁇ cycl in-dependent kinase inhibitor 3 (predicted)) that inhibits cell cycle progression. Yes.
  • the gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 94 is a member of the prenylated Rab acceptor (PRA1) family, and shows similarities between the glutamate transporter and the middle tiger. It encodes a protein (Similar to DXIrax39e protein).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 96 forms a ternary complex with Epb4.1 and Mppl and plays a role in the control of cell shape It encodes a possible erythrocyte transmembrane sialaroglycoprotein (Similar to glycophorin Ciso form 2).
  • a gene having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 98 is identified as the uncharacterized protein UPF0171 family member (similar to CGTHBA protein 14 gene protein) (predicted)). Code. '
  • the gene (EST) having the same or substantially the same nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 100 is a sequence similar to the mRNA of cytoplasmic enzyme that synthesizes thymidine acid for DNA synthesis (similar to thymidine kinase 1 )
  • the nucleic acid capable of detecting the expression of the PLsis marker gene contained in the PLsis determination reagent of the present invention include, for example, a transcription product of the PLsis marker gene and a hyperplasia.
  • the reagent of the present invention include a nucleic acid (probe) that can be soyed, and a set of oligonucleotides that can function as a primer that amplifies a part or all of the transcript.
  • the nucleic acid has a base sequence represented by SEQ ID NO: n (n is an odd number from 1 to 5 7; an integer from 59 to 63; an even number from 64 to 98; either 100 or 101)
  • the phrase “can be highly prehydated under highly stringent conditions” has the same meaning as above.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNAZRNA camera. Preferably, DNA is used.
  • the nucleic acid used as the probe may be double-stranded or single-stranded. If double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, the sense strand (eg, cDNA, cRNA) or antisense strand (eg, mRNA, cDNA) can be selected depending on the sample to be provided. .
  • the length of the nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the target nucleic acid, and is, for example, about 15 bases or more, preferably about 30 bases or more.
  • the nucleic acid is preferably labeled with a labeling agent in order to enable detection and quantification of the target nucleic acid.
  • radioisotopes for example, radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are used.
  • [ 32 P], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used as the radioisotope.
  • the enzyme those which are stable and have high specific activity are preferable.
  • 3-galactosidase for example,] 3-darcosidase, alkaliphosphatase, peroxidase, and malate dehydrogenase are used.
  • fluorescent material for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • nucleic acid to be a probe is immobilized on a solid phase, the nucleic acid in the sample can be labeled using the same labeling agent as described above.
  • the set of oligonucleotides used as primers can specifically hybridize with the base sequence (sense strand) shown in each sequence number and the complementary base sequence (antisense strand).
  • the DNA fragment is not particularly limited as long as it can amplify the DNA fragment, for example, about 15 to about 1 each. Examples include oligo DNA sets each having a length of 00 bases, preferably about 15 to about 50 bases, and designed to amplify DNA fragments of about 100 bp to several kbp.
  • RT—PCR For quantitative analysis of PLsis marker gene expression using trace RNA samples, it is preferable to use competitive RT—PCR or real-time RT—PCR.
  • Competitive RT-PCR is the ability to amplify the DNA of interest-a known amount of another type of nucleic acid that can be amplified by the primer set is used as a competitor in the reaction solution to cause an amplification reaction competitively.
  • the competitor nucleic acid may be DN A or RNA.
  • DNA it is sufficient to synthesize cDNA from the RNA sample by reverse transcription and then add competitor to perform PCR.
  • RT-PCR can be performed by adding it to the RNA sample from the beginning. it can. In the latter case, the efficiency of the reverse transcription reaction is also taken into consideration, so that the absolute amount of the original mRNA can be estimated.
  • real-time RT-PCR can monitor the amount of PCR amplification in real time, so that electrophoresis is unnecessary and the expression of the PLsis marker gene can be analyzed more quickly.
  • Monitoring is usually performed using various fluorescent reagents.
  • fluorescent reagents in addition to reagents (intercalators) that emit fluorescence by binding to double-stranded DNA such as SYBR Green I and ethidium promide, nucleic acids that can be used as the above probes.
  • Both ends are modified with a fluorescent substance (eg, FAM, HEX, TET, FITC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, DABCYL, etc.). Etc. are included.
  • a fluorescent substance eg, FAM, HEX, TET, FITC, etc.
  • a quencher eg, TAMRA, DABCYL, etc.
  • a nucleic acid that functions as a probe capable of detecting the expression of a PLsis marker gene is Using the above primer set that can amplify part or all of the gene transcript, mammals (eg, humans, monkeys, mice, horses, pigs, hidges, goats, nu, cats, usagis, hamsters) 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epithelial cells, epithelial cells, goblet cells [eg, hepatocytes, spleen cells, neurons, glia cells, kidneys] , Endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, Eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary
  • the hybridization can be performed, for example, according to the method described in “Molecular Cloning” 2nd edition (described above). In addition, when using a commercially available library, the hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual for use attached to the library.
  • the nucleic acid has the nucleotide sequence information represented by SEQ ID NO: n (where n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 1100 or 1001)
  • SEQ ID NO: n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 1100 or 1001
  • n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 1100 or 1001
  • SEQ ID NO: n where n is an odd number from 1 to 57, an integer from 59 to 63, an even number from 64 to 98, 1100 or 1001
  • a chip on which the nucleic acid is immobilized can also be produced by directly synthesizing the nucleic acid on a solid phase such as recon glass.
  • the nucleic acid that functions as a primer capable of amplifying a part or all of the transcript of the PLsis marker gene is SEQ ID NO: n (where n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 to 9 to 3, and an even number from 6 to 9 to 8. 1 or 100)), and chemically synthesizing a part of the base sequence and its complementary strand sequence using a commercially available DNAZ RNA automatic synthesizer or the like.
  • n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 to 9 to 3, and an even number from 6 to 9 to 8. 1 or 100
  • Nucleic acid capable of detecting the expression of the PLsis marker gene can be provided as a solid in the dry state or in the form of an alcohol precipitate, or dissolved in water or a suitable buffer (such as TE buffer). Can also be provided. When used as a labeling probe, the nucleic acid can be provided in a state of being previously labeled with any of the above-mentioned labeling substances, or can be provided separately from the labeling substance and used as a label for use. .
  • the nucleic acid can be provided in a state immobilized on an appropriate solid phase.
  • the solid phase include, but are not limited to, glass, silicon, plastic, nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, and the like.
  • immobilization means a functional group such as an amino group, an aldehyde group, an SH group or biotin is introduced into the nucleic acid in advance, and a functional group capable of reacting with the nucleic acid on the solid phase (example: : Aldehyde group, amino group, SH group, streptavidin, etc.), and solid phase and nucleic acid are cross-linked by covalent bond between both functional groups.
  • the method include, but are not limited to, cation coating and immobilizing nucleic acid using electrostatic bonding.
  • nucleic acid probe is provided in a state immobilized on a solid phase
  • ArrayPlate TM provided by High Throughput Genomics.
  • the ArrayPlate TM is a 96-well plate immobilized with various nucleic acid probes regularly arranged on the bottom of each well (eg, 4 X 4 array). It has one end that can be hybridized with the probe and the other end that can be hybridized with the target nucleic acid.
  • the hybridization reaction between the probe and the target nucleic acid can be performed in the liquid phase instead of on the solid surface, and the target nucleic acid can be quantitatively measured.
  • the expression variation of various PLsis marker genes can be detected at the same time with a single well, and if sufficient quantification is obtained, the expression variation of each marker gene can be detected separately than real-time PCR. It also has the advantage of being efficient.
  • the reagent of the present invention is not only a nucleic acid capable of detecting the expression of a PLsis marker gene, but also other substances necessary for the reaction for detecting the expression of the gene. It can further contain substances that do not have an adverse effect.
  • the reagent of the present invention can be provided in the form of a kit together with a separate reagent containing other substances necessary for the reaction for detecting the expression of the PLsis marker gene.
  • examples of the other substance include a reaction buffer, dNTPs, and a heat-resistant DNA polymerase.
  • competitor nucleic acids and fluorescent reagents such as the above intercalators and fluorescent probes
  • individual PLsis marker genes should vary in expression for all PLsis-inducing compounds and substantially not in expression for all non-PLsis-inducing compounds, for example with respect to drug-induced PLsis.
  • individual marker genes when used as a single indicator, the appearance of some false positive and false negative compounds is usually unavoidable.
  • the present invention also provides a PLsis determination kit comprising a combination of two or more reagents containing a nucleic acid capable of detecting a PLsis marker gene.
  • the nucleic acid contained in each reagent can detect different PLsis marker genes.
  • at least one of the reagents is the reagent of the present invention, that is, SEQ ID NO: No. n (where n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 9 to 6 3, an even number from 6 4 to 9 8, 1 0 0 or 1 0 1) Containing a nucleic acid capable of detecting a gene having the same base sequence.
  • kits that detect at least one target.
  • -A a nucleic acid capable of detecting a PLsis marker gene that can be contained in a reagent other than the reagent of the present invention contained as a component of the kit of the present invention, for example, a PLsis marker gene other than the above 54 PLsis marker genes,
  • Genes encoding related proteins genes encoding cell growth-related proteins, genes encoding proteases or protease inhibitors, genes encoding amino acid metabolism-related proteins, etc.
  • the GenBank database contains NM-000859, respectively. , AL518627, NM—002130, AA639705, BC005807, AF116616, — 025225, D80010, NM—001731, AW134535, Rei — 004354, AF135266, AC007182, ⁇ — 003832, NM— 019058, AB040875, AA488687, NM—018687, ⁇ — 021158, BG231932, NM_000235, AA873600, AF096304, AW00135 , AC001305, Hiring-024090, ⁇ -006214, NM_024108, NM-021980, AF003934, Hiring-000596, U15979, M92934, ⁇ -002087, AK023348, NM-002773, NM-000131, BC003169, ⁇ -002217, NM-0031, BC
  • Nucleic acids contained in each reagent that makes up the kit should be able to detect the expression of the PLsis marker gene by the same method (eg, Northern blot, dot plot, DNA array technology, quantitative RT-PCR, etc.) It is particularly preferred that it is built.
  • the kit of the present invention is provided with the above reagents separately [Example: When the nucleic acid functions as a primer for a labeled probe (especially for dot plot analysis) or PCR (especially for real-time quantitative PCR) Etc.] Nucleic acids that can detect the expression of different PLsis genes are provided in the same reagent [Example: Nucleic acid is PCR (especially, each marker gene can be selected according to the size of the amplification product, etc.) As well as labeled probes (especially when each gene can be distinguished by the size of the transcript in the Northern plot analysis)] or for different PLsis marker genes Nucleic acids whose expression can be detected are provided by immobilizing them in separate regions of the same solid phase [Example: Probe for hybridization with labeled c RNA, etc. Etc. If such] that function but are exemplified, but not limited to these.
  • the present invention also provides a method for determining PLsis in a mammal, comprising detecting changes in the expression of one or more genes whose expression varies in correlation with the expression of PLsis in a sample collected from the mammal.
  • Mammals include, but are not limited to, humans, monkeys, mice, horses, peta, hidges, goats, inu, cats, rabbits, hamsters, mono-remotes, mice, rats, etc.
  • Preferred animal species can be appropriately selected according to the purpose.For example, when evaluating the drug-inducing potential of a drug candidate compound, ⁇ in the bed stage, humans in the preclinical stage, monkeys, rats, mice, Nu is preferably used.
  • PLsis in mammals includes drug-induced PLsis (due to the administration of drugs or veterinary drugs or candidate compounds, as well as to accidental swallowing of toxic substances and exposure to chemicals present in the environment. Including aspects) hereditary phospholipids Examples include dysbiosis and PLsis associated with other diseases. Therefore, as a mammal to be examined by the method of the present invention, a tester (experimental animal) to which a drug (or animal drug) candidate compound is administered, or a drug (or animal drug) that may develop PLsis is administered.
  • Patients patients (patients), humans or other mammals exposed to (or possibly with) chemical substances capable of inducing PLsis, hereditary or non-inherited diseases that may cause PLsis Examples include mammals that are affected, or who may be affected (or who will be affected in the future).
  • the method of exposing a mammal to a test compound in determining drug-induced PLsis caused by a drug is not particularly limited.
  • the test compound is given orally or parenterally in solid, semi-solid, liquid, aerosol, etc. (eg: intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, subcutaneous, intradermal, respiratory tract, etc.) Can be administered.
  • the dose of the test compound varies depending on the type of compound, animal species, body weight, dosage form, etc.For example, exposure to the highest concentration of the test compound at which the target cells can survive within a range where the animal can survive The amount necessary to be made.
  • Administration can be done once or in several divided doses.
  • the time from administration to sample collection varies depending on the type of marker gene used, the pharmacokinetics of the test compound, etc., but usually from about 3 hours to about 8 weeks from the initial administration, preferably from about 2 to about 14 days. Can be selected.
  • Samples collected from mammals include mammals (eg, humans, monkeys, mice, horses, pigs, hidges, goats, inu, cats, usagis, nomsters, mono-remotes, mice, rats) Etc.) [e.g., hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, knee i3 cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth cells Muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, moon fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils Monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, stromal cells, or before these cells Progenitor cells, stem cells, cancer cells, etc.]
  • At least one of the PLsis marker genes whose expression variation can be examined in the determination method of the present invention is SEQ ID NO: n (where n is an odd number from 1 to 5 7, an integer from 5 9 to 6 3, and from 6 4 to 9 8
  • the base sequence is not particularly limited as long as it has the same or substantially the same base sequence as shown in any one of the even number, 10 0 or 1 0 1).
  • the method which makes more than a detection object is mentioned.
  • Examples of PLsis marker genes other than the above 54 that can be detected in the determination method of the present invention include genes encoding lysosomal enzymes, lipid metabolism (eg, cholesterol synthesis, fatty acid elongation reaction, unsaturated fatty acid synthesis) Etc.) Genes encoding related proteins, transport (eg fatty acid transport, protein transport, amino acid transport, etc.) genes encoding related proteins, genes encoding cell growth related proteins, genes encoding proteases or protease inhibitors, Examples include genes encoding amino acid metabolism-related proteins.
  • RNA eg, total RNA, mRNA
  • the expression of the PLsis marker gene in can be examined by preparing an RNA (eg, total RNA, mRNA) fraction from the sample and detecting the transcript of the marker gene contained in the fraction.
  • the RNA fraction can be prepared using a known method such as guanidine_C s C 1 ultracentrifugation or AG PC method.
  • a commercially available RNA extraction kit eg RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN) Etc.
  • a means of detecting the transcription product of the PLsis marker gene in the RNA fraction for example, a method using hybridization (Northern plot, dot blot, DNA chip analysis, etc.) or PCR (RT-PCR, competitive PCR, Real-time PCR, etc.). Quantitative PCR methods such as competitive PCR and real-time PCR are also available because they can quickly and easily detect changes in the expression of PLsis marker genes from a small amount of sample with high quantitativeness. DNA chip analysis is preferable because it can improve the quantitativeness by selecting a detection method.
  • detection of the PLsis marker gene can be performed using the reagent or kit of the present invention containing a nucleic acid used as a labeled probe. That is, Northern In the case of hybridization, the RNA fraction prepared as described above is separated by gel electrophoresis and then transferred to a membrane such as nitrocellulose, nylon, polyvinylidene fluoride, etc. In the hybridization buffer containing the reagents or each reagent contained in the kit of the present invention, after hybridization under the above-mentioned “high stringent conditions”, it is bound to the membrane by an appropriate method. By measuring the labeled amount for each pand, the expression level of each PLsis marker gene can be measured.
  • membranes spotted with RNA fractions are similarly subjected to a hybridization reaction (respectively for each PLsis marker gene), and each marker residue is measured by measuring the amount of spot labeling. The expression level of the offspring can be measured.
  • an appropriate promoter such as T7 promoter was introduced by reverse transcription reaction from the RNA fraction prepared as described above. Synthesize cDNA, and then synthesize cRNA using RNA polymerase (At this time, labeled cRNA can be obtained by using a mononucleotide labeled with piotin as a substrate). It is possible to measure the expression level of each PLsis marker gene by bringing this labeled cRNA into contact with the above-mentioned immobilized probe and subjecting it to a hybridization reaction and measuring the amount of label bound to each probe on the solid phase. it can. This method is more advantageous in terms of speed and simplicity as the number of PLsis marker genes to be detected (thus, probes to be immobilized) increases.
  • a quantitative PCR method is used as a method for detecting the expression of a PLsis marker gene.
  • Quantitative PCR includes, for example, competing PCR and real-time PCR, but real-time PCR is more rapid because it does not require electrophoresis after the amplification reaction.
  • competitive PCR in addition to the primer set described in the reagent of the present invention, it can be amplified with the primer set, and can be distinguished from the amplification product of the target nucleic acid (that is, the transcription product of the PLsis marker gene) after amplification.
  • a known amount of competitor nucleic acid is used.
  • the competitor nucleic acid may be DNA or RNA.
  • DNA after cDNA is synthesized from the RNA fraction prepared as described above by reverse transcription, PCR can be performed in the presence of the reagent of the present invention, competitors.
  • the competitor may be added to the RNA fraction to perform a reverse transcription reaction, and then the reagent of the present invention may be added to perform PCR.
  • Real-time PCR is a method for monitoring the amount of amplification in real time using a fluorescent reagent and requires a device that integrates a thermal cycler and a spectrofluorometer. Such devices are commercially available. There are several methods depending on the fluorescent reagent to be used. Examples include the intercalator method, the TaqMan TM probe method, and the Molecular Beacon method. In either case, cDNA is synthesized from the RNA fraction prepared as described above by reverse transcription reaction, and then the reagent of the present invention is combined with a fluorescent reagent (probe called TaqMan TM probe or Molecular Beacon probe). ) Is added to each PCR reaction system.
  • a fluorescent reagent probe called TaqMan TM probe or Molecular Beacon probe
  • the intercalator binds to the synthesized double-stranded DNA and emits fluorescence when irradiated with excitation light
  • the amount of amplification product produced can be monitored by measuring the intensity of the fluorescence.
  • the amount of vertical cDN A can be estimated.
  • the TaqMan TM probe is an oligonucleotide that can be hybridized to the amplification region of the target nucleic acid with both ends modified with a fluorescent substance and a quenching substance. When annealing is performed, the target nucleic acid is hybridized to the target nucleic acid but emits fluorescence due to the presence of the quenching substance.
  • the Molecular Beacon probe can be hybridized to the target nucleic acid amplification region with both ends modified with a fluorescent substance and a quencher.
  • the oligonucleotide has a hairpin type secondary structure, and when it has a hairpin structure, it does not fluoresce due to the presence of the quenching substance, and it hybridizes to the target nucleic acid during annealing and the distance between the fluorescent substance and the quenching substance increases. Fluoresce by spreading. Therefore, the amount of amplification product generated can be monitored by measuring the fluorescence intensity, and the amount of the original vertical cDNA can be estimated accordingly.
  • the expression of a PLsis marker gene in a sample collected from a mammal is obtained by preparing a protein fraction from the sample and detecting a translation product of the marker gene contained in the fraction (ie, a marker protein). Can be examined.
  • Marker One protein can be detected by immunoassay (eg, ELISA, FIA, RIA, Western plot, etc.) using antibodies against each protein, and it can be measured for physiological activity such as enzymes. In the protein to be shown, the physiological activity can also be measured by measuring each marker protein using a known method.
  • the marker protein can also be detected using mass spectrometry such as MALDI-T0FMS.
  • the antibody against each marker protein contains an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: m (m is an even number of 2 to 58 or odd number of 65 to 99).
  • a protein containing substantially the same partial amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof can be obtained as a sensitizing antigen according to a commonly used polyclonal antibody or monoclonal antibody production technique.
  • the criterion for determining the presence or absence of PLsis expression is sufficiently high that the determination result based on the criterion can be used as a diagnostic system for the disease state (compound evaluation system in clinical / preclinical studies). As long as it has high reliability, it is not particularly limited.
  • the expression increases or decreases for all PLsis marker genes to be detected (where “substantially increased or decreased” has the same meaning as above).
  • PLsis is positive for any of the PLsis marker genes, and the expression does not vary substantially (where “expression does not vary” is as defined above).
  • Average rate of variation is defined as follows. That is, for each marker gene, the expression level was measured when the mammal was exposed to the test compound and when it was not exposed, and if the expression level increased when exposed, the magnification (for example, 2 times) 2) for the increase, and the reciprocal of the magnification for the decrease (for example, 2 for 1 to 2), the expression variation rate (X) for each gene.
  • the average value of (n) expression fluctuation rates is defined as the average fluctuation rate (the following formula).
  • a mammal is divided into 2 or more (preferably 5 or more, more preferably 10 or more, more preferably 15 or more) known PLsis-inducing compounds and 2 or more (preferably 5 or more, more preferably 10 or more, More preferably, 15 or more of the known PLsis non-inducing compounds are exposed to each of the samples collected from the mammal, and one or more selected PLsis marker genes (at least one of which is the above-mentioned 5 4 of the present invention). Variation of the expression of each marker gene), and the average variation rate of the expression of the marker gene is compared with the actual presence or absence of PLsis expression.
  • PLsis the presence or absence of actual expression of PLsis depends on the percentage of vacuolated lymphocytes in peripheral blood collected from suckling, or histopathological findings in one or more of various tissues (for example, in the case of lung and mesenteric lymph nodes, Cyst infiltration, hepatocyte or biliary epithelial cell vacuolation in the liver, lymphocyte vacuolation or foam cell infiltration in the spleen, tubular epithelial cell vacuolation in the kidney, cerebellar Purkinje cell vacuolation in the brain ) Is used as an indicator.
  • various tissues for example, in the case of lung and mesenteric lymph nodes, Cyst infiltration, hepatocyte or biliary epithelial cell vacuolation in the liver, lymphocyte vacuolation or foam cell infiltration in the spleen, tubular epithelial cell vacuolation in the kidney, cerebellar Purkinje cell vacuolation in the brain .
  • the presence or absence of the above-mentioned known PLsis-inducing and non-inducing compounds is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and particularly preferably about 9%.
  • the reference value determined in this way is to compare the average variation rate of the expression of the PLsis marker gene with the presence or absence of actual PLsis expression using another known PLsis-inducing or non-inducing compound. Therefore, it is more preferable to examine the validity. If the average variation rate value that can accurately determine the presence or absence of PLsis is obtained with a higher probability by combining the determination results for newly studied compounds, the reference value may be corrected.
  • DNA Deoxyliponucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • mRNA Messenger ribonucleic acid
  • a 1 a Alanine
  • PLsis-inducing compounds (amiodarone: 1000 mg / kg / day, tamoxifen: 1000 mg / kg / day s black mouth: 250 mg / kg / day, penolehexylin: 600 mg / kg / day Fluoxetine: 300 mg / kg / day and quinacrine: 200 mg / kg / day were administered to 5-week-old Crj: CD (SD) IGS rats (produced in a closed environment, Charles River Japan Co., Ltd.) The liquid volume was 10 mL / kg / day, once daily for 3 days (4 days for negative control (0.5 w 8 /. Methylcellulose solution administration)).
  • Post-dose all animals have liver, kidney, spleen, lung and mesenteric lymph nodes, and additional organs in each test compound as tissues: adrenal gland for tamoxifen, pituitary opal eyeball, brain for quinacrine Samples of the tissue sampled in the optical and electron micrographs by sampling the brain and eyeball in the spinal thigh muscle, brain and eyeball in black mouth, brain and skin in perhexiline, and brain in fluoxetine Histopathological changes were examined. In addition, blood smears (Giemsa-stained specimens) were prepared and the vacuolated lymphocyte ratio of peripheral blood was measured while observing under a microscope.
  • Table 1 shows the results of histopathological changes and the percentage of vacuolated lymphocytes in the PLsis-inducing compound administration group. Histopathological examinations in all the compound-administered groups showed changes considered to be PLsis. At the same time, the vacuolation rate of lymphocytes was also high in peripheral blood vacuolation lymphocytes. -Table 1 Vacuolarized lymphocyte ratio in rats treated with a PLsis-inducing compound, histopathological findings, compound name, dose, vacuolated phosphorus, histopathological findings (PLsis)
  • RNA extraction was performed using PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX).
  • Sample preparation for GeneChip analysis Affymetrix's protocol was implemented.
  • Superscript Choice system (Invitrogen) [After this cDNA synthesis reaction, the biotin-labeled cRNA synthesis reaction using Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix) was performed in the next step, and cRNA was fragmented to prepare a labeled sample.
  • the labeled sample was hybridized to Rat Expression Array 230A (RAE230A, Affymetrix), and the array was stained, washed and scanned by GeneChip system (Affymetrix), and the following three image data were obtained from one array.
  • the probe set * that was changed by the addition of the compound was extracted according to the following criteria to obtain a changed probe set.
  • GeneChip analysis using RAE230A measurement is performed at 11 locations for a single sequence to be measured, and the measurement results at 11 locations are combined to obtain a single numerical value and judgment data. 11 locations in RAE230A There are 5924 measurement set powers, and each measurement set is called a probe set.
  • a probe set in which two or more of the above three image data satisfy the following three conditions was defined as a variable probe set.
  • a probe set in which the signal log ratio of the treatment group relative to the control group is 0.6 or more or -0.6 or less.
  • Expression variation probe set number in rats treated with PLsis-inducing compound Compound name. Dose (mg / kg / day) Increased expression Decreased expression
  • the liver, kidney, spleen, lung and mesenteric lymph nodes were sampled from all animals, and the histopathological changes of the samples sampled by light microscopy and electron microscopy were examined by a conventional method.
  • blood smears (Giemsa-stained specimens) were prepared, and the vacuolated lymphocyte ratio of peripheral blood was measured while observing under a microscope.
  • Table 5 shows the results of histopathological changes and the percentage of vacuolated lymphocytes in the PLsis-inducing compound administration group. Histopathological examinations in all the compound-administered groups showed changes considered to be PLsis. At the same time, the vacuolation rate of lymphocytes was also high in peripheral blood vacuolation lymphocytes.
  • the PLsis determination method of the present invention uses changes in the expression of the PLsis marker gene in blood lymphocytes as an index, the expression of PLsis can be determined non-invasively and more accurately than conventional in vivo toxicity tests. You can do it. Therefore, it is useful for evaluating the toxicity of drug candidate compounds in later stages of drug development, such as clinical 'pre-clinical stage'. It is also useful for diagnosing other drug-induced PLsis and hereditary or non-inherited diseases that have PLsis or PLsis-like changes as pathologies.
  • this invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it should be understood that the preferred embodiments may be altered and that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. It will be obvious to those skilled in the art that this can be done. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the invention as defined by the following claims.

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Abstract

本発明は、リン脂質症（PLsis）マーカー遺伝子を検出することによる迅速・簡便かつ非侵襲的なPLsisの新規インビボ判定法を提供する。より詳細には、本発明は、哺乳動物から採取した試料における、リン脂質症の発現と相関して発現が変動する１以上の遺伝子の発現変動を検出することを含む、該哺乳動物におけるリン脂質症の判定方法であって、少なくとも１つの遺伝子は、配列番号ｎ（ｎは１～５７の奇数、５９～６３の整数、６４～９８の偶数、１００または１０１）のいずれかに示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有するものである方法を提供する。

Description

明細書
リン脂質症の判定方法 技術分野
本発明は、 リン脂質症の判定方法およびそのためのツールに関する。 より詳細 には、 本発明は、 血中マーカー遺伝子の発現変動を指標-としたリン脂質症 （例： 薬物起因性リン脂質症等） の判定方法、 並びに該血中マーカー遺伝子を検出する ための試薬 ·キット等に関する。
背景技術
リン脂質症 （Phospholipidosis；以下、 「PLsis」 と略記する場合もある） は 細胞内にリン脂質が過剰に蓄積する現象と定義され、 遺伝性を含む脂質代謝ホメ ォスタシス異常の他、 抗うつ薬、 抗狭心症薬、 抗マラリア薬、 抗食欲減退薬、 抗 高脂血症薬などの多くの薬剤もしくはその代謝物によっても引き起こされる。 PLsisでは、 リン脂質は主としてリソソーム内に蓄積し、 電子顕微鏡学的には円 形ないしは楕円形のミエリ ン様構造物 （lamellar body) が観察される。 毒性の 発現機構は完全には解明されていないが、 1 ) 化合物によるリソソーム酵素 （主 にリン脂質分解酵素 （ホスホリパーゼ） ） の活性阻害、 2 ) 化合物によるリン脂 質代謝に関わる輸送経路の阻害、 3 ) 化合物とリン脂質の複合体形成による複合 体の分解阻害、 4 ) 化合物によるリン脂質の合成亢進などに起因するものと考え られている。
PLsisを誘発する化合物の多くは、 分子内に疎水性領域と陽性荷電した親水性 領域とを併せ持つ （cationic amphiphi lic drug ; CAD) 構造を有する。 近年、 ゲ ノム解析の進展に伴いォーファン受容体の創薬ターゲットとしての価値が認識さ れ、 受容体に対する作動薬もしくは拮抗薬の開発が進められているが、 そのよう な化合物は、 受容体に作用するという性質ゆえに CAD構造を有している場合が多 く、 PLsisの発現が医薬品開発の妨げとなるケースが増加している。 また、 既に 認可されている医薬品の中にも副作用として PLsisを引き起こすことが報告され ているものがある。 従って、 薬物の PLsis誘発性について効率の良い評価 .予測 系の開発が急務である。
ところで、 数千〜数万種の mRNAの発現を同時にモニタリングするマイクロアレ ィ技術 （網羅的遺伝子発現解析、 トランスクリプトミクス（teanscriptomics) ) が医学 '生物学の種々の分野で盛んに利用されてきている。 毒性学の分野でも、 毒性発現メカニズムの解明や毒性予測の研究に本技術が活用され始めており、 ト キシコゲノミタス （toxicogenomi cs) と呼ばれる新たな研究分野として期待され ている。 毒性現象には、 1ないし数個の遺伝子の独立した変化だけでなく、 遺伝 子間の相互作用やカスケ一ド等のように多数の遺伝子が互いに関連し合った一体 : 的な変動が伴うものと考えられる。 そのため、 マイクロアレイという トランスク リブトームレベルでの解析が可能な技術を用いることで、 毒性発現に関わる分子 の挙動を包括的に捉えることが可能になると期待される。
本発明者らは以前、 既知の PLs is誘発性化合物に曝露したヒ ト培養細胞におけ る遺伝子発現を、 マイクロアレイを用いて網羅的に解析し、 PLsis誘発時に顕著 に発現変動するマーカー遺伝子群を同定■ 報告した （Sawada, H. et al. , Toxicol. Sci. , 83： 282-92 (2005) ) 。 培養細胞を用いたインビトロのスクリー ニング系は、 少量の化合物で多検体を短時間で評価し得ることから、 化合物の合 成量に制限のある創薬の初期段階において、 PLsis誘発性の有無を迅速に予測し、 構造の最適化を効率よく行うのに優れたツールである。
一方、 インビトロの評価系での結果が、 必ずしも生体内での毒性発現を反映す るとは限らない。 例えば、 インビトロスタリーエングで細胞に PLsisを誘発する 化合物は、 PLsis誘発ポテンシャルを有するといえるが、 生体內では速やかに代 謝されるなど'して毒性を示さない場合がある。 その逆もまた然りである。 あるい は、 毒性が発現する濃度に対して薬効を発揮する濃度が十分に低ければ、 前臨 床 ·臨床段階へのステージアップは可能である。
したがって、 開発ステージの後期あるいは上巿後において、 化合物投与による 薬物起因性 PLsisの発現の有無を、 迅速かつ簡便に判定し得るインビボでの評価 系の構築が求められる。 かかる評価系では、 実験動物や治験者 ·患者を対象とす るので、 分析に供する試料の採取はできるだけ非侵襲的であることが望ましく、 他方、 トランスクリプトミクスを利用する場合には細胞含有試料である必要があ るので、 分析に供する試料としては血液ゃリンパ球などが好ましい。
血液やリンパ液などの生体試料を分析対象とする場合、 インビトロでの評価系 において用いられるマーカー遺伝子群とは異なる、 新規-かつより適当なマーカー 遺伝子 （群） が見出される可能性がある （例えば、 Rockett, J. C. et al. , Toxicol. Sci. , 69'· 49 - 59 (2002)参照） 。 しかしながら、 インビポでの評価系 において PLsis誘発性を高確度に判定し得る、 特有のマーカー遺伝子に関する報 告はこれまでに皆無である。
発明の開示
本発明の目的は、 PLsisの発現と相関して、 血中などでの発現が変動する遺伝 子、 すなわち PLsisマーカー遺伝子を同定し、 該遺伝子の発現変動を指標とした ィンビボでの PLsisの評価系を提供することである。
本発明者らは、 上記の目的を達成すべく、 種々の既知 PLsis誘発化合物を 3日 間および 7日間投与したラット血液をそれぞれ試料として、 マイクロアレイを用 いた網羅的遺伝子発現解析を行った結果、 投与期間ごとに、 これら化合物の全て で顕著に発現が変動する遺伝子群を同定することに成功した。 また、 多くの化合 物について、 これらの遺伝子群の大部分が、 3日間投与および 7日間投与のいず れにおいても発現変動を示した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいてさらに 研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数 1 0 Qまたは 1 0 1 ) のいずれかに示される塩基配列を有する核酸とハイストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸、 及ぴノ又は該塩基配列に相補 的な塩基配列を有する核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズし 得る核酸を含有してなる、 哺乳動物におけるリン脂質症の判定用試薬； [2] リン脂質症の発現と相関して発現が変動する遺伝子の転写産物とハイス ト リンジェントな条件下でハイブリダィズし得る核酸、 及ぴノ又は該転写産物に相 捕的な塩基配列を有する核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し得る核酸を含有する 2以上の試薬を含んでなる、 哺乳動物におけるリン脂質症 の判定用キットであって、
(a) 少なくとも 1つの試薬は上記 [ 1 ] 記載の試薬であり、
(b) 2以上の上記 [1] 記載の試薬を含む場合、 各試薬は互いに異なる遺伝子の 発現を検出し得るものであるキット ；
[3] 哺乳動物から採取した試料における、 リン脂質症の発現と相関して発現が 変動する 1以上の遺伝子の発現変動を検出することを含む、 該哺乳動物における リン脂質症の判定方法であって、 少なくとも 1つの遺伝子は、 配列番号 n (nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜6 3の整数、 64〜 98の偶数、 100または 1 0 1) のいずれかに示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有する ものである方法；
[4] 哺乳動物が、 化合物を投与されるか化合物に曝露されたものであり、 リン 脂質症が該化合物に起因するものである、 上記 [3] 記載の方法；
[5] 哺乳動物がヒ トである上記 [3] 記載の方法；
[6] 哺乳動物がラッ ト、 マウス、 ィヌまたはサルである上記 [3] 記載の方 法；および
[7] 試料が血液またはリ ンパ球である上記 [3] 記載の方法；
などを提供する。
本発明の PLsisの判定方法は、 哺乳動物から採取した試料における PLsisマーカ 一遺伝子の発現変動を検出することを特徴とすることにより、 従来のインビポ毒 性試験などに比べて、 非侵襲的に、 且つ精度よく PLsisの発現を判定し得るとい う優れた効果を奏する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 PLsisの発現と相関して発現が変動する遺伝子 （すなわち、 PLsisマ 一力一遺伝子） の発現を検出し得る核酸を含有する PLsisの判定用試薬を提供す る。 ここで 「PLsisの発現と相関して発現が変動する」 とは、 哺乳動物の 1以上 の組織において PLsisの組織病理学的所見を認める場合に発現が実質的に増加ま たは減少する傾向が、 統計学上有意に認められることをいう。. 尚、 「実質的に増 加または減少」 とは、 正常時の 1 . 5倍以上に増加するか、 あるいは正常時の 2 / 3以下に減少することをいい、 正常時の 2ノ 3〜1 . - 5倍の発現レベルである 場合には、 実質的に変動しないとみなすものとする。
具体的には、 本発明の試薬により検出される PLsisマーカー遺伝子として、 配 列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0 または 1 0 1 ) に示される各塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を それぞれ有する 5 4種の遺伝子 （7種の ESTを含む） が挙げられる。 ここで 「実 質的に同一の塩基配列」 とは、 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜6 3の 整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列の相補鎖 配列を有する核酸とそれぞれハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズし 得る塩基配列であって、 それにコードされる蛋白質が該配列番号に示される塩基 配列にコードされる蛋白質と同一もしくは実質的に同一のものであるような配列 を意味する。 「ハイストリンジェントな条件」 とは、 配列番号 n ( nは 1〜5 7 の奇数、 5 9〜6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示され る各塩基配列の相補鎖配列を有する核酸と、 オーバーラップする領域において約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 5 %以上の相補性を有する塩基配列を有する核酸とがハイプリダイズ し得る条件をいい、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 miVlで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °C、 特に好 ましくは、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が挙げられる。 当業者は、 ハイブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度、 ハイブリダゼーシヨン反応の 温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 ミスマッチの数、 ハイプリダイゼーショ ン反応の時間、 洗浄液の塩濃度、 洗浄の温度等を適宜変更することにより、 所望 のストリンジエンシーに容易に調節することができる。
「実質的に同一の蛋白質」 とは、 配列番号 m (mは 2〜5 8の偶数または 6 5 ~ 9 9の奇数） に示される各アミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 % 以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好まし くは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、 且つ上記各配列番号に 示されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同質の活性を有する蛋白質をいう。 ある いは、 PLsisマーカー遺伝子が配列番号 n ( nは 5 9〜6 3の整数、 1 0 0また は 1 0 1 ) に示される各塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る場合には、 「実質的に同一の蛋白質」 とは、 配列番号 n ( nは 5 9〜6 3の整 数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列にコードされる部分アミノ酸配 列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特 に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する部分 アミノ酸配列を有し、 且つ上記部分アミノ酸配列を含む蛋白質と同質の活性を有 する蛋白質をいう。
「同質の活性」 とは、 活性が性質的に （例えば、 生理学的に、 または薬理学的 に） 同一であることをいい、 量的には同等 （例： 0 . 5〜2倍） であることが好 ましいが、 異なっていてもよい。 また、 アミノ酸配列の相同性の条件を満たす限 り、 分子量などの他の量的要素が異なってもよい。
アミノ酸配列について、 「相同性」 とは、 当該技術分野において公知の数学的 アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、 最適なァラ インメント （好ましくは、 該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列 の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである） における、 ォ 一バーラップする全ァミノ酸残基に対する同一ァミノ酸および類似ァミノ酸残基 の割合 （％) を意味する。 「類似アミノ酸」 とは物理化学的性質において類似し たアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香族アミノ酸 （Phe、 Trp、 Tyr) 、 脂肪族アミ ノ酸 （Ala、 Leu、 Ile、 Val ) 、 極性アミノ酸 （Gln、 Asn) 、 塩基性アミノ酸 (Lys、 Arg、 His) 、 酸性アミノ酸 （Glu、 Asp) 、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser Thr) 、 側鎖の小さいアミノ酸 （Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met) などの同じグループ に分類されるアミノ酸が挙げられる。 このような類似アミノ酸による置換は蛋白 質の表現型に変化をもたらさない （即ち、 保存的アミノ酸置換である） ことが予 測される。 保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、 種々の文 献に記載されている （例えば、 Bowieら， Science, 247： 1306-1310 (1990)を参 照） 。 - 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリ ズム NCBI BLAST ( National Center for Biotechnology Inrorraation Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マ トリタス =BL0SUM62； フィルタリング =0FF) にて計算することができる。 ァミノ 酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、 例えば、 Karlinら , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは NBLASTおよび XBLASTプログラム （version 2, 0) に組み込ま れている （Altschulら， Nucleic Acids Res.， 25 : 3389 - 3402 (1997) ) ] 、 Needlemanら， J. Mol. Biol. , 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該 アルゴリズムは GCGソフトウエアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれてい る] 、 Myersおよび Mil ler, CAB I OS, 4： 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該 アルゴリズムは CGC配列ァラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム （version 2. 0 ) に糸且み込まれている] 、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85： 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該ァルゴ リズムは GCGソフトウエアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、 それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、 配列番号 m (mは 2〜5 8の偶数または 6 5〜9 9の奇数） に示されるァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、 各配列番号に示さ れるアミノ酸配列とそれぞれ約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ま しくは約 8 0 %以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、 配列番号 n ( nは 5 9〜6 3の整数、 . 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列にコードされる部 分アミノ酸配列と実質的に同一の部分アミノ酸配列とは、 各配列番号に示される 塩基配列にコードされる部分アミノ酸配列と約 60%以上、 好ましくは約 70% 以上、 より好ましくは約 80%以上の同一性を有する部分アミノ酸配列である。 かかる相同性を有する蛋白質としては、 例えば、 1)配列番号 m (mは 2〜58 の偶数または 6 5〜 99の奇数） に示されるアミノ酸配列 （もしくは配列番号 n (nは 5 9〜6 3の整数、 100または 1 0 1) に示される各塩基配列にコード される部分アミノ酸配列） 中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 特に好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、 2)配列番号 m (mは 2〜5 8の偶数または 6 5〜9 9の 奇数） 示されるアミノ酸配列 （もしくは配列番号 n (nは 5 9〜6 3の整数、 100または 1 0 1) に示される各塩基配列にコードされる部分アミノ酸配列） に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程 度、 特に好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 3)配 列番号 m (mは 2〜 58の偶数または 6 5〜 99の奇数） に示されるアミノ酸配 列 （もしくは配列番号 n (nは 59〜6 3の整数、 100または 10 1) に示さ れる各塩基配列にコードされる部分アミノ酸配列） に 1または 2個以上 （好まし くは 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 特に好ましくは数 （1〜 5) 個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 4)配列番号 m (mは 2〜58の 偶数または 6 5〜 9 9の奇数） に示されるアミノ酸配列 （もしくは配列番号 n (nは 5 9〜6 3の整数、 100または 1 0 1) に示される各塩基配列にコード される部分アミノ酸配列） 中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 特に好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が 他のアミノ酸 置換されたアミノ酸配列、 または 5)それらを組み合わせたァミノ 酸配列を含有する蛋白質などが含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷入 欠失または置換の位置は特に限定されない。
より具体的には、 配列番号 n (nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 63の整数、 64 ~ 9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列と実質的に同一の塩 基配列を有する遺伝子として、 各配列番号に示される塩基配列を有するラット遺 伝子のアレル変異体や、 該遺伝子の、 ラット以外の哺乳動物 （例： ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ゥマ、 プタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ハムスター、 モノレモッ ト、 マウス等） におけるオルソログ （ortholog) などが該当する。
本発明のラット由来 PLsisマーカー遺伝子の塩基配列' [すなわち、 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0または1 0 1 ) に示される塩基配列] はいずれも公知であり、 GenBankデータベース上で、 それぞれ 1)丽_031355、 3)麗— 053359、 5)NM— 017051、 7)丽— 013052、 9) NM— 053372、 11)雇— 053843 、 13)蓮— 001004202 、 15)應— 012512 ( ま た は AW916647) 、 17)麗_019186 、 19) NM_024139 、 21) XM— 215858 ( ま た は AA891920) 、 23)丽— 012778 (または L07268)、 25) XM_213793 (または AI412863)、 27)雇— 057114、 29)歷— 053800、 31)丽— 022391、 33) XM— 213921 (または BE099979)、 35) L38482、 37)丽_001007742 ( ま た は BI275880) 、 39) XM— 214451 (ま た は AI600237) 、 41) XM— 226624 (または BI291626)、 43)匪— 022597、 45)匪— 145184、 47)醒_053719、 49)屬_017073、 51) NM— 053582、 53)麗— 138881、 55) XM— 340803 (または BI303656)、 57) XM— 213333 (または AI 171327)、 59) AI029175、 60) BM392055、 61) BI288013、 62) ΑΙ172141、 63)ΑΙ600030、 64)ΝΜ— 012904、 66)麗— 053598、 68)丽— 053554、 70)麗— 053822 、 72)雇— 053587 、 74) ΝΜ_001012345 ( ま た は XM—341887) 、 76)丽— 022205、 78)丽— 031512、 80) ΧΜ— 223508、 82) ΝΜ— 053373、 84)蘭— 012992、 86)丽— 001009717、 88) ΝΜ_031010 , 90) ΧΜ_341053 , 92) ΧΜ_214152, 94) XM— 346274、 96)删— 001013233 (または XM_344660) 、 98) XM_340780、 100) BM389006および 101)AA799328め登録番号を付されて公開されている。 また、 これらに対応するヒ トオルソ ロ グ しては、 順に 1)丽—005662、 3) NM— 004045、 5) NM— 000636、 7) NM— 003405、 9)删ー 003064、 11)删— 000569 (バリアントとして丽— 000570) 、 13) (NM_001004202に対応するヒ ト遺伝子は知られていない） 、 15) AK026463 (バリ アントとして NM— 004048 ) 、 17) NM_005738 (バリアントと して NM— 212460 ) 19)雇— 007236、 21)丽— 013248、 23)丽— 000385 (パリアントとして删— 198098) 、 25)雇 _016433、 27)雇 _002574 (バリアン トと して丽—1^1696、 丽— 181697 ) 、 29)删— 003229、 31) NM— 004219、 33) NM_003851 (XM— 213921、 AI029175の双方と類 似する） 、 35)應— 004359、 37)應— 016172、 39)NM_004280、 41)NM— 012081、 43)删— 001908 (バ リ ア ン ト と して NM— 147780、 丽_147781、 ■— 147782、 雇—147783 ) 、 45)歷—006313、 47)丽」98449、 49)腿—ひ 02065、 51)丽—022164、 53)顺— 080657、 55)麗— 024632、 57)丽— 152766、 59)NM— 003851 ( XM— 213921、 AI029175の双方と類似する) 、 60)雇— 018571、 61)删— 015982、 62)應— 000037 (バ リアントとして NM— 020475、 腿 _020476、 NM— 020477) 、 63) (AI600030に対応する ヒ ト遺伝子は知られていない） 、 64)丽— 000700、 66)麗— 019094 (バリアントとし て NM— 199040 ) 、 68) NM— 001008660 (バ リ ア ン ト と し て NM— 007166 ) 、 70)雇 _00296.4、 72) NM_002965、 74) NM— 032564、 76) NM— 001008540 (バリアントと して删—003467) 、 78)扁— 000576、 80)NM_012161 (バリアントとして應— 033535) 82)應— 005091、 84)應_002520 (バリアントとして丽— 199185) 、 86) NM— 052972、 88)應— 001140、 90)麗— 001913 (バリアン ト と して丽— 181500、 丽— 181552 ) 、 92)麗_005192、 94)眉— 007213、 96)丽_002101 (バリアントとして丽— 016815) 、 98)丽_012075および 100)NM_003258 ( 101) AA799328に対応するヒ ト遺伝子は知ら れていない） が挙げられる。
配列番号 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る遺伝子 （以下、 「vdac3j と略記する場合がある） は、 アデニンヌクレオチド 類の輸送に機能する可能性のあるミ トコンドリァ外膜の電圧依存性ィオンチヤネ ノレの開口部にあたる蛋白質 （voltage- dependent anion channel 3) をコードし ている。 ―
配列番号 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る遺伝子 （以下、 「at0xl」 と略記する場合がある） は、 細胞内銅輸送おょぴ恒 常性維持に介在する銅結合蛋白質 （ATX1 (antioxidant protein 1) horaolog 1 (yeast) ) をコードしている。 配列番号 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る遺伝子 （以下、 「sod2」 と略記する場合がある） は、 スーパーォキシドを過酸 化水素に変換する ミ ト コ ン ド リ ア酵素 .（ superoxide dismutase 2， mitochondrial) をコードしてレヽる。
配列番号 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る遺伝子 （以下、 「ywhah」 と略記する場合がある） は； アポトーシスインヒビ ターであり、 また、 チロシンヒドロキシラーゼおよびトリブトファンヒドロ シ ラーゼのァクティベータでもある蛋白質 (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, eta polypeptideノをコードしてレヽる。 配列季号 9に示される:^基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有す る遺伝子 （以下、 「slPi」 と略記する場合がある） は、 トリプシン、 カテブシン Gおよび好中球エラスターゼ等のプロテアーゼのインヒ ビター （ secretory leukocyte protease inhibitor) をコードしてレヽる。
配列番号 1 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「fcgr3j と略記する場合がある） は、 免疫グロブリンに結 合し、 種々の免疫応答を惹起する蛋白質 （Fc receptor, IgG, low affinity III) をコードしている。
配列番号 1 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「ccl6」 と略記する場合がある） は、 ラットにおいて、 炎症 細胞の遊走および浸潤を促進する C Cケモカイ ン （chemokine (C-C motif) ligand 6) をコードしているが、 ヒ トで対応する遺伝子は知られていない。
配列番号 1 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 ぐ以下、 「B2m」 と略記する場合がある） は、 IgGの経上皮輸送におい て作用する MHCクラス I抗原の成分 （Beta- 2 microglobulin) をコードしている。 配列番号 1 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「arl4」 と略記する場合がある） は、 小胞輸送や蛋白質分泌 に重要な役割を果たす GTP結合蛋白質 （ADP- ribosylation- l ike 4) をコードして いる。
配列番号 1 9に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 'する遺伝子 （以下、 「chp」 と略記する場合がある） は、 跨輸送において役割を 果たす Ca2 +結合蛋白質 (calcium binding protein p22) をコードしている。 配列番号 2 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 NTF2関連輸送蛋白質である NXT1に類似-する蛋白質 （Similar to NTF2-related export protein NXT1 (L0C296219) , raRNA) をコードしている。 配列番号 2 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「aqpl」 と略記する場合がある） は、 水チャネルを構成する ¾白質 (aquaporin 1 (channel-forming integral protein, 28kDa をコ"ド している。
配列番号.2 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 糖スフインゴ脂質、 糖グリセ口脂質の膜間輸送に関与する、 糖脂 質輸送蛋白質に類似する蛋白質 （Similar to Glycolipid transfer protein (L0C288707) , mRNA) をコードしている。
配列番号 2 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「prdxl」 と略記する場合がある） は、 酸化ス トレスで誘導 されるペルォキシダーゼ活性を有する抗酸化物質 （peroxiredoxin 1) をコード している。
配列番号 2. 9に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「txn」 と略記する場合がある） は、 U Vおよび酸化ス トレ スに対する応答に関与し、 反応性の酸素中間体を低減する蛋白質 (thioredoxin) をコードしている。
配列番号 3 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「pttg」 と略記する場合がある） は、 血清飢餓に応答してダ ゥンレギュレートされる、 細胞増殖おょぴ血管新生を促進する前癌遺伝子 (.pituitary tumor-transforming 1) である。 配列番号 3 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 細胞の増殖 ·分化にかかる転写制御に関与する E1Aで刺激される 遺伝子の細胞リプレッサー CREGに類似する蛋白質 （Similar to cel lular repressor of E1A- stimulated genes CREG (L0C289185) , mRNA) をコードしてい る。
配列番号 3 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 G1期から S期への移行および染色体ァライメントを制御する、 ュ ビキチンとコンジュゲートする酵素 （Similar to cell division cycle 34； ubi qui tin-conjugating enzyme E2-32 KDA complementing ; ubiquitin carrier protein; ubiquitin - protein l igase (L0C299602) , mRNA) をコードしている。 配列番号 3 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子.（以下、 「ubadcl」 と略記する場合がある） は、 内皮細胞の増殖を制 御し得る細胞内シグナル分子と推定される蛋白質 （ubiquitin associated domain containing 1) ¾ "コ1 ~ .ドしてい < 。
配列番号 3 9に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 真核性の翻訳伸長因子 1 ε 1に類似する蛋白質 （Similar to eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1 (L0C291057) , mRNA) をコードしている。
配列番号 4 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST ) は、 RNAポリメラーゼ II伸長因子 ELL2に類似する蛋白質 ( Similar to RNA polymerase II elongation factor ELL2 (L0C309918) , mRNA) をコードしている。
配列番号 4 "3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「ctsb」 と略記する場合がある） は、 リソソーム由来のパパ インファミリーに属するシスティンプロテアーゼ （cathepsin B) をコードして いる。
' 配列番号 4 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「usP15」 と略記する場合がある） は、 ュビキチン特異的シ スティンプロテアーゼファミ リーに属する酵素 （ubiquitin specific protease 15) をコードしている。
配列番号 4 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「emb」 と略記する場合がある） は、 細胞接着分子である膜 貫通蛋白質 （erabigin) をコードしている。 - 配列番号 4 9に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「glul」 と略記する場合がある） は、 グルタミン合成酵素 (.glutamine synthetase I ) をコードしている。
配列爭号 5 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「lcn7j と略記する場合がある） は、 細胞外マトリ ックス蛋 白質と推定される、 触媒としては不活性なカテブシン B関連蛋白質 （lipocalin 7) をコードしている。
配列番号 5 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「best5」 と略記する場合がある） は、 インターフェロン類 により誘導される抗ウィルス蛋白質 （Best5 protein) をコードしている。
配列番号 5 5に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 ヒス トン脱ァセチル化酵素と関連する転写コリプレッサー Sin3A に関連する蛋白質 （SAP30) に類似する蛋白質 （Similar to Sin3A associated protein p30— like) をコードしている。
配列番号 5 7に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 仮想蛋白質 MGC40107に類似する蛋白質 （ Similar to hypothetical" protein MGC40107 (L0C287442) , mRNA) をコードしている。
配列番号 5 9に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST) は、 細胞の増殖■分化にかかる転写制御に関与する E1Aで刺激 される遺伝子の細胞リプレッサー CREGの mRNAに類似する配列 （Simi lar to cellular repressor of E1A- stimulated genes CREG (L0C289185) , mRNA) を有 する。
配列番号 6 0に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST) は、 JNK1の活性化を増強する抗アポトーシス蛋白質の mRNAに 類似する酉己 ' J ( Similar to amyotrophic lateral sclerosis 2 (juveni le) chromosome region, candidate 2) を T o。
配列番号 6 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST) は、 生殖細胞における raRNAの翻訳抑制に関与する RNA結合蛋白 質の mRNAに類似する酉己歹 lj ( Similar to germ cel l specific Y - box binding protein) を有する。
配列 =号 6 2に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST) は、 細胞骨格エレメントを原形質膜に接着させる細胞骨格ァ ンカー蛋白質 Ankyrinlの mRNAに類似する配列 （Simi lar to Ankyrin 1) を有する。 配列番号 6 3に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （EST) の機能 ίま未知である。
配列番号 6 4に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「anxal」 と略記する場合がある） は、 ホスホリパーゼ A2を 阻害するカルシウム依存性リン脂質結合蛋白質 （annexinAl) をコードしている。 配列番号 6 6に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「nudt4」 と略記する場合がある） は、 イノシトールリン酸 の代謝に関与している可能性のあるジホスホイノシトールポリホスフェートホス ホヒ ドロ フーゼ ( nudix ^nucleoside diphosphate l inked moiety X) - type motif 4) をコードしている。
配列番号 6 '8に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「picalmj と略記する場合がある） は、 クラスリン重鎖に結 合してエンドサイ ト-シスに作用する蛋白質 （Phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein) をコードしている。
配列番号 7 0に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「S100a8」 と略記する場合がある） は、 S100ファミリーのメ ンバーで、 S100A9と複合体を形成して、 ァラキドン酸分泌および炎症部位への白 血球補充を仲介する蛋白質 (S100 calcium binding protein A8 (calgranulin
A) ) をコードしている。 .
配列番号 7 2に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「S100a9」 と略記する場合がある） -は、 S100ファミリーのメ ンバーで、 S100A8と複合体を形成して、 ァラキドン酸分泌および炎症部位への白 血球補充を仲介する蛋白質 （S100 calcium binding protein A9 (calgranulin
B) ) をコードしている。
配列華号 7 4に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「dgat2」 と略記する場合がある） は、 トリァシルグリセ口 ール生合成を触媒するジァシルグリセロールァシルトランスフェラーゼファミリ 一のメンバー (Diacylglycerol 0-acyl transferase homolog 2 (mouse) ) をコー ドしている。
配列番号 7 6に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「cxcr4J と略記する場合がある） は、 CXCケモカインに結合 する GPCR (Cheraokine (C-X-C motif) receptor 4) をコードしている。
配列番号 7 8に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「il lb」 と略記する場合がある） は、 防御反応および炎症反 応を調節するサイト力イン （interleukin 1 beta) をコードしている。
配列番号 8 0に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「fbxl5」 と略記する場合がある） は、 蛋白質分解に関与す る SCFュビキチンリガーゼの推定サブュニット （F- box and leucine- rich repeat protein 5 (predicted) ) をコードしてレヽる。
配列番号 8 2に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「pglyrpl」 と略記する場合がある） は、 ペプチドダリカン 及ぴグラム陽性菌に結合し、 先天性免疫に関与する蛋白質 （peptidoglycan recognition protein 1) をコ1 "~ドしてレヽる。
配列番号 8 4に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「npml」 と略記する場合がある） は、 リボソームのアッセン プリに関与している可能性のある核酸結合リボヌクレアーゼであり、 分子シャぺ ロンである蛋白質 （nucleophosmin 1) をコードしている。
配列番号 8 6に示される塩基配列と同一もしくは実質-的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 複数のロイシンリッチリピートを含む血清蛋白質 （Simi lar to 丄 eucine— rich alpha— 2— glycoprotein) をコードして ヽる。
配列番号 8 8に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺 子 （以下、 「aloxl5」 と略記する場合がある） は、 ァラキドン酸を 15- ヒ ドロペルォキシエイコサテ トラェン酸と リポキシン A4に変換する酵素
Figure imgf000018_0001
12— lipoxygenaseリ をコートし" Iレヽる。
配列番号 9 0に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子 （以下、 「cutl l」 と略記する場合がある） は、 有糸分裂の細胞周期 に作用し、 アポトーシス誘発刺激に対する免疫応答を制御している可能性のある 蛋白質 （Cut- l ike 1 (Drosophi la) ) をコードしている。
配列番号 9 2に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 細胞周期の進行を阻害するチロシンーセリ ンホスファターゼ ^cycl in-dependent kinase inhibitor 3 (predicted) ) コードしている。 配列番号 9 4に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 プレニル化した Rabァクセプター （PRA1 ) ファミ リーのメンバー で、 グルタミン酸トランスポーターと中程虎の類似性を有する蛋白質 （Similar to DXIrax39e protein) をコードしている。
配列番号 9 6に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 Epb4. 1及ぴ Mpplと三者複合体を形成し、 細胞の形状の制御に役割 を果たしている可能性のある赤血球膜貫通型シァロ糖タンパク質 （Similar to glycophorin C i so form 2) をコードしている。 配列番号 98に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有 する遺伝子は、 キャラクタライズされていない蛋白質 UPF0171ファミリ一のメン ハー (similar to CGTHBA protein 14 gene protein) (predicted) ) をコード している。 '
配列番号 100に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を 有する遺伝子 （EST) は、 DNA合成のためのチミジン酸を合成する細胞質酵素の mRNAに類似する配列 （similar to thymidine kinase 1) を有する。
配列番号 10 1に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を 有する遺伝子 （EST) の機能は未知である。
配列 号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 64、 6 6、 68、 70、 7 2、 74、 76、 78、 80、 8 2、 84および 8 6に示される塩基配列と同 一もしくは実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子は、 いずれかの臓器における PLsis発現と相関して体内での発現が増加し （後記実施例 2、 表 3および実施例 4、 表 7参照） 、 一方、 配列番号 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 2 7、 29、 3 1、 3 3、 3 5、 3 7、 39、 4 1、 43、 45、 47、 49、 5 1、 5 3、 5 5、 5 7、 5 9〜6 3、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00および 1 0 1 (後記実施例 2、 表 4および実施例 4、 表 8参照） に示される塩基配列と 同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子は、 PLsis発現と相関して 発現が減少する。
本発明の PLsis判定用試薬 （以下、 「本発明の試薬」 と略記する場合がある） に含有される PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸としては、 例えば、 PLsisマーカー遺伝子の転写産物とハイプリダイズし得る核酸 （プローブ） や、 該転写産物の一部もしくは全部を增幅するプライマーとして機能し得るオリゴヌ クレオチドのセットなどが挙げられる。 すなわち、 該核酸としては、 配列番号 n (nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 64〜 98の偶数、 100または1 0 1のいずれか） に示される塩基配列を有する核酸 （センス鎖 =コード鎖） とハ イストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る核酸、 及び 又は該塩基配 列に相捕的な塩基配列を有する核酸 （アンチセンス鎖 =非コード鎖） とハイス ト リンジェントな条件下でハイブリダィズし得る核酸が好ましく例示される。 「ハ イストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る」 とは上記と同義である。 該核酸は DN Aであっても RN Aであってもよく、 あるいは DNAZRNAキメ ラであってもよい。 好ましくは DNAが挙げられる。
プローブとして用いられる核酸は、 二本鎖であっても-一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイプリ ッドでもよい。 一本鎖の場合は、 供される試料に応じてセンス鎖 （例： c DNA、 c RNAの場合） またはアンチセンス鎖 （例： mRNA、 c DNAの場合） を選 択して いることができる。 該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダィズ し得る限り特に制限はなく、 例えば約 1 5塩基以上、 好ましくは約 30塩基以上 である。 該核酸は、 標的核酸の検出 ·定量を可能とするために、 標識剤により標 識されていることが好ましい。 標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔32 P] 、 〔3H〕 、 〔14C〕 などが用いられる。 酵素としては、 安定で比活性の大 きなものが好ましく、 例えば、 ]3—ガラク トシダーゼ、 ]3—ダルコシダーゼ、 ァ ルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 'リンゴ酸脱水素酵素などが用いら れる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチォ シァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノ ール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 プロープと 標識剤との結合にピオチン一 （ストレブト） アビジンを用いることもできる。 一 方、 プローブとなる核酸を固相上に固定化する場合には、 試料中の核酸を上記と 同様の標識剤を用いて標識することができる。
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、 各配列番 号に示される塩基配列 （センス鎖） およびそれに相補的な塩基配列 （アンチセン ス鎖） とそれぞれ特異的にハイブリダィズすることができ、 それらに挟まれる D NA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、 例えば、 各々約 15〜約 1 00塩基、 好ましくは各々約 1 5〜約 50塩基の長さを有し、 約 1 00 b p〜数 k b pの DNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴ DNAのセットが挙 げられる。
微量 RN A試料を用いて PLsisマーカー遺伝子の発現を定量的に解析するため には、 競合 RT— P C Rまたはリアルタイム RT— P C Rを用いることが好まし レ、。 競合 RT— PCRとは、 目的の DNAを増幅し得る-プライマーのセットによ り増幅され得る既知量の他の铸型核酸を competitorとして反応液中に共存させて 競合的に増幅反応を起こさせ、 増幅産物の量を比較することにより、 目的 DNA の量を算出する方法をいう。 従って、 競合 RT— PCRを用いる場合、 本発明の 試薬は、 上記プライマーセットに加えて、 該プライマーセットにより増幅され、 目的 DN Aと区別することができる増幅産物 （例えば、 目的の DNAとはサイズ の異なる増幅産物、 制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物な ど） を生じる核酸をさらに含有することができる。 この competitor核酸は DN A であっても RNAであってもよい。 DNAの場合、 RNA試料から逆転写反応に より c DNAを合成した後に competitorを添加して P CRを行えばよく、 RNA の場合は、 RNA試料に最初から添加して RT— PCRを行うことができる。 後 者の場合、 逆転写反応の効率も考慮に入れているので、 元の mRNAの絶対量を 推定することができる。
一方、 リアルタイム R T— P C Rは、 P C Rの増幅量をリアルタイムでモニタ リングできるので、 電気泳動が不要で、 より迅速に PLsisマーカー遺伝子の発現 を解析可能である。 通常、 モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。 こ れらの中には、 SYBR Green I、 ェチジゥムプロマイド等の二本鎖 D N Aに結合す ることにより螢光を発する試薬 （インターカレーター） の他、 上記プローブとし て用いることができる核酸 （但し、 該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダ ィズする） の両端をそれぞれ蛍光物質 （例： FAM、 HEX, TET、 FITC等） および消 光物質 （例： TAMRA、 DABCYL等） で修飾したもの等が含まれる。
PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得るプローブとして機能する核酸は、 該 遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得る上記プライマーセットを用い、 哺乳動物 （例： ヒト、 サル、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥ サギ、 ハムスター、 モルモッ ト、 マウス、 ラット等） のあらゆる細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 鸱臓 ]3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム 細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細 胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞な ど] も くはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小 脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脖臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副 腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織、 骨格筋など] 由来の c D N Aもしくはゲノム D N Aを铸型として P C R法によって所望の長さ の核酸を増幅するか、 前記した細胞■組織由来の c D N Aもしくはゲノム D N A ライプラリーから、 コロニーもしくはプラークハイプリダイゼーシヨン等により 上記 PLsisマーカー遺伝子もしくは c D N Aをクローユングし、 必要に応じて制 限酵素等を用いて適当な長さの断片とすることにより取得することができる。 ノ、 ィプリダイゼーシヨ ンは、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライプラリーを使用する場合、 ハイプリダイゼーシヨンは、 該ライブラリ 一に添付されナこ使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 あるいは、 該核酸は、 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜9 8の 偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列情報に基づいて、 該塩基配列 および /またはその相捕鎖配列の一部もしくは全部を市販の D N A/ R N A自動 合成機等を用いて化学的に合成することによつても得ることができる。 また、 シ リコンゃガラス等の固相上で該核酸を直接 in situ (on chip) 合成することによ り、 該核酸が固相化されたチップを作成することもできる。
PLsisマーカー遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得るプライマー として機能する核酸は、 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列情報に基づいて、 該塩基配列およびその相補鎖配列の一部を市販の D N AZ R N A自動合成機等を 用いて化学的に合成することによって得ることができる。
PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸は、 乾燥した状態もしくはアル コール沈澱の状態で、 固体として提供することもできるし、 水もしくは適当な緩 衝液 （ ： T E緩衝液等） 中に溶解した状態で提供することもできる。 標識プロ ーブとして用いられる場合、 該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した 状態で提供することもできるし、 標識物質とそれぞれ別個に提供され、 用時標識 して用いることもできる。
あるいは、 該核酸は、 適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。 固相としては、 例えば、 ガラス、 シリコン、 プラスチック、 ニトロセルロース、 ナイロン、 ポリビニリデンジフロリ ド等が挙げられるが、 これらに限定されない。 また、 固定化手段としては、 予め核酸にアミノ基、 アルデヒド基、 S H基、 ビォ チンなどの官能基を導入しておき、 一方、 固相上にも該核酸と反応し得る官能基 (例：アルデヒ ド基、 アミノ基、 S H基、 ストレプトアビジンなど） を導入し、 両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、 ポリア二オン性の核酸に対し て、 固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化する などの方法が挙げられるが、 これらに限定されない。
核酸プローブが固相に固定化された状態で提供される好ましい一例として、
High Throughput Genomics社より提供される ArrayPlateT M等が挙げられる。 ArrayPlateT Mは 9 6ゥエルプレートの各ゥエル底面に種々の核酸プローブが規則 正しく配置した状態 （例、 4 X 4アレイ） で固定化されたものである。 プローブ とハイプリダイズし得る一端と標的核酸とハイプリダイズし得る他端とを有する 核酸をスぺーサ一として介在させることで、 プローブと標的核酸とのハイブリダ ィゼーシヨン反応を固相表面上ではなく液相中で行わせることができ、 標的核酸 の定量的な測定が可能となる。 従って、 単一のゥエルで種々の PLsisマーカー遺 伝子の発現変動を同時に一括検出することができ、 十分な定量性が得られれば、 各マーカー遺伝子の発現変動を別個に検出するリアルタイム P C Rよりもさらに 効率がよいという利点を有する。 - 本発明の試薬は、 PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸に加えて、 該 遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、 共存状態 で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することがで きる。 あるいは、 本発明の試薬は、 PLsisマーカー遺伝子の発現を検出するため の反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともにキット化して提供 することもできる。 例えば、 PLsisマーカー遺伝子の発現を検出するための反応 が P C Rの場合、 当該他の物質としては、 例えば、 反応緩衝液、 d N T P s、 耐 熱性 D N Aポリメラーゼ等が挙げられる。 競合 P C Rやリアルタイム P C Rを用 いる場合は、 competitor核酸や蛍光試薬 （上記インターカレーターや蛍光プロ一 ブ等） などをさらに含むことができる。
個々の PLsisマーカー遺伝子は、 例えば薬物起因性 PLsisに関して言えば、 すべ ての PLsis誘発化合物について発現が変動し、 すべての PLsis非誘発化合物につい て実質的に発現が変動しないというのが理想的であるが、 現実的には必ずしもそ のような結果は得られない。 そのため、 個々のマーカー遺伝子の発現を単独の指 標とした場合、 通常は、 ある程度の偽陽性および偽陰性化合物の出現は避けられ ない。 しかしながら、 複数の PLsisマーカー遺伝子の発現変動を調べることによ り、 判定精度 さらに向上させることができる。
したがって、 本発明はまた、 PLsisマーカー遺伝子を検出し得る核酸を含有す る 2以上の試薬を組み合わせてなる、 PLsis判定用キットを提供する。 ここで各 試薬中に含有される核酸は、 互いに異なる PLsisマーカー遺伝子を検出し得るも のである。 また、 .該試薬の少なくとも 1つは、 上記本発明の試薬、 即ち、 配列番 号 n ( nは 1〜 5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0また は 1 0 1 ) のいずれかに示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配 列を有する遺伝子を検出し得る核酸を含有するものである。 より好ましくは、 上 記 5 4個の PLsisマーカー遺伝子のうちのいずれか 2個以上、. さらに好ましくは 3個以上、 いっそう好ましくは 4個以上、 特に好ましくは 5個以上、 最も好まし くは 6個以上を検出対象とするキットが挙げられる。 - 本発明のキットの構成として含まれる、 本発明の試薬以外の試薬に含有され得 る PLsisマーカー遺伝子を検出し得る核酸としては、 例えば、 上記 5 4個の PLsis マーカー遺伝子以外の PLsisマーカー遺伝子、 例えば、 リソソーム酵素をコード する遺 子、 脂質代謝 （例： コレステロール合成、 脂肪酸伸長反応、 不飽和脂肪 酸合成等） 関連蛋白質をコードする遺伝子、 輸送 （例：脂肪酸輸送、 蛋白質輸送、 アミノ酸輸送等） 関連蛋白質をコードする遺伝子、 細胞増殖関連蛋白質をコード する遺伝子、 プロテアーゼもしくはプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝 子、 アミノ酸代謝関連蛋白質をコードする遺伝子など、 より具体的には、 GenBankデータベースに、 それぞれ NM— 000859、 AL518627、 NM— 002130、 AA639705、 BC005807、 AF116616、 麗— 025225、 D80010、 NM— 001731、 AW134535、 麗— 004354、 AF135266, AC007182、 丽— 003832、 NM— 019058、 AB040875、 AA488687、 NM— 018687、 丽ー 021158、 BG231932、 NM_000235、 AA873600、 AF096304, AW150953, NM_001360、 AC001305 、 雇— 024090、 删— 006214、 NM_024108、 NM— 021980、 AF003934、 雇— 000596、 U15979、 M92934、 丽— 002087、 AK023348、 NM— 002773、 NM— 000131、 BC003169、 丽— 002217、 NM— 003122、 删— 001673、 丽— 000050、 U08024、 NM二 003167、 BC005161、 AF162690、 AW517464、 AF116616、 NM— 017983、 應— 016061、 BE966922、 BE552428、 NM_012445、 雇—000792、 丽ー 015930、 删— 021800、 丽— 005980、 删ー 000565、 AB033025、 AL110298、 麗—006931、 應— 001955、 腿 _003897、 AA778684、 丽— 001283、 雇— 012242、 AI934469、 丽— 003186および丽_002450の I Dを付されて 登録されている塩基配列を有するヒ ト遺伝子 （上記 Sawada, H. et al. , Toxicol. Sci. , 83： 282-92 (2005)を参照） および他の哺乳動物におけるそれらのオルソ ログ等を検出し得る核酸が挙げられるが、 それらに限定されない。
キットを構成する各試薬中に含有される核酸は、 同一の方法 （例： ノーザンブ ロッ ト、 ドッ トプロッ ト、 D N Aアレイ技術、 定量 R T— P C R等） により PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得るように構築されていることが特に好ま しい。
本発明のキットの構成として、 上記の試薬がそれぞれ別個に提供されるもの [例：核酸が標識プローブ （特にドットプロット解析の場合） や P C R (特にリ アルタイム定量 P C R ) 用プライマーとして機能する場合等] 、 異なる PLsisマ 一力一遺伝子の発現を検出し得る核酸が同一の試薬中に含有されて提供されるも の [例 :核酸が P C R (特に、 増幅産物のサイズ等により各マーカー遺伝子を区 別し得る場合） や標識プローブ （特に、 ノーザンプロット解析で転写産物のサイ ズにより各ァ一力一遺伝子を区別し得る場合） として機能する場合等] 、 あるい は、 異なる PLsisマーカー遺伝子の発現を検出し得る核酸が、 同一の固相の別個 の領域にそれぞれ固定化されて提供されるもの [例：標識 c R N A等とのハイプ リダィゼーシヨン用プローブとして機能する場合等] などが例示されるが、 これ らに限定されない。
本発明はまた、 哺乳動物から採取した試料における、 PLsisの発現と相関して 発現が変動する 1以上の遺伝子の発現変動を検出することを含む、 該哺乳動物に おける PLsisの判定方法を提供する。 哺乳動物としては、 .ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ゥ マ、 プタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ハムスター、 モノレモッ ト、 マウ ス、 ラット等が挙げられるが、 これらに限定されない。 好ましい動物種は、 目的 に応じて適宜選択され得るが、 例えば、 医薬候補化合物の PLsis誘発性を評価す る場合には、 ^床段階ではヒ ト、 前臨床段階ではサル、 ラット、 マウス、 ィヌ等 が好ましく用いられる。
哺乳動物における PLsisとしては、 薬物起因性 PLsis (医薬もしくは動物薬また はその候補化合物の投与によるものの他、 毒物の誤飲や環境中に存在する化学物 質に曝露されたことによるもの等、 あらゆる態様を包含する） 、 遺伝性のリン脂 質代謝異常症、 その他の疾患に付随する PLsisなどが挙げられる。 したがって、 本発明の方法の検査対象となる哺乳動物としては、 医薬 （もしくは動物薬） 候補 化合物を投与される治験者 （実験動物） 、 PLsisを発現するおそれのある医薬 (もしくは動物薬） を投与された患者 （患畜） 、 PLsisを誘発し得る化学物質等 に曝露された （もしくはその可能性のある） ヒ トまたは他の哺乳動物、 PLsisを 引き起こすおそれのある遺伝性もしくは非遺伝性の疾患に罹患しているか、 ある いは罹患している （もしくは将来罹患する） おそれのある哺乳動物などが挙げら れる。
医薬 （もしくは動物薬） 候捕化合物による薬物起因性 PLsisを判定する場合に おける、 _ 哺乳動物を試験化合物に曝露する方法は特に制限されない。 例えば、 試 験化合物を固形、 半固形、 液状、 エアロゾル等の形態で経口的もしくは非経口的 (例：—静脈.内、 筋肉内、 腹腔内、 動脈内、 皮下、 皮内、 気道内等） に投与するこ とができる。 試験化合物の投与量は、 化合物の種類、 動物種、 体重、 投与形態な どによって異なり、 例えば、 動物が生存し得る範囲で、 標的細胞が生存し得る最 高濃度の試験化合物に一定時間以上曝露され得るのに必要な量などが挙げられる。 投与は 1回ないし数回に分けて行うことができる。 投与から試料採取までの時間 は、 用いるマーカー遺伝子の種類、 試験化合物の体内動態等によって異なるが、 通常、 初回投与から約 3時間〜約 8週間、 好ましくは約 2〜約 14日間の範囲から 適宜選択され得る。
哺乳動物から採取される試料としては、 哺乳動物 （例： ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ゥ マ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ノヽムスター、 モノレモッ ト、 マウ ス、 ラット等） のあらゆる細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細 胞、 膝臓 i3細'胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 月旨 肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細 胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細 胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 間質細胞、 またはこれら細胞の前 駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆ る組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁挑核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 眼球、 下垂体、 胃、 縢臓、 腎臓、 肝 臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織、 骨格筋など] などが例示されるが、 迅速且つ簡便に採取す ることができ、 動物への侵襲が少ないなどの点から、 血液 （例：末梢血） 、 リン パ球等が特に好ましい。
本発明の判定方法において発現変動を調べられる PLsisマーカー遺伝子は、 少 なくともその 1つが、 配列番号 n ( nは 1 ~ 5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) のいずれかに示される塩基配列と同一も しくは実質的に同一の塩基配列を有するものであれば、 特に制限されない。 好ま しくは、 上記した 5 4個の PLsisマーカー遺伝子のうちのいずれか 2個以上、 さ らに好ましくは 3個以上、 いっそう好ましくは 4個以上、 特に好ましくは 5個以 上、 最も好ましくは 6個以上を検出対象とする方法が挙げられる。
本発明の判定方法において検出対象とされ得る、 上記 5 4個以外の PLsisマー カー遺伝子としては、 例えば、 リソソーム酵素をコードする遺伝子、 脂質代謝 (例： コレステロール合成、 脂肪酸伸長反応、 不飽和脂肪酸合成等） 関連蛋白質 をコードする遺伝子、 輸送 （例：脂肪酸輸送、 蛋白質輸送、 アミノ酸輸送等） 関 連蛋白質をコードする遺伝子、 細胞増殖関連蛋白質をコードする遺伝子、 プロテ ァーゼもしくはプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子、 アミノ酸代謝関 連蛋白質をコードする遺伝子などが挙げられる。 より具体的には、 GenBankデー タベースに、 'それぞれ NM— 014960、 丽— 000859、 AL518627、 删— 002130、 AA639705、 BC005807、 AF116616、 删— 025225、 U47674、 D80010、 NM— 001731、 AW134535、 丽— 004354、 AF135266、 AC007182、 NM— 003832、 NM— 019058、 AB040875, AA488687、 顧— 018687、 丽— 021158、 BG231932、 NM— 024307、 NM_000235、 AA873600、 D63807、 AF096304, AW150953、 丽_001360、 丽_021969、 AC001305、 NM— 024090、 丽— 001443、 顧一 006214、 應— 024108、 應— 021980、 蓮— 002151、 AF003934, M— 000596、 U15979 M92934、 麗— 002087、 AK023348、 NM—002773、 NM— 000131、 BC003169、 腿— 002217、 画— 003122、 删— 001673、 丽— 000050、 應— 001085、 1108024、 NM_003167、 BC005161 AF162690、 AW517464、 AF116616、 丽— 017983、 AL136653、 腿—ひ 16061、 BE966922、 BE552428、 NM— 022823、 NM— 012445、 NM— 000792、 腿— 015930、 丽_021800、 画— 005980、 NM— 000565、 AB033025、 丽— 006931 、 All 10298、 丽— 006931、 麗_001955、 麗—003897、 丽—003186、 AA778684、 丽ー001283、 顺ー 012242、 AI934469, NM— 003186および画— 002450の I Dを付されて登録されている塩基配列 を有するヒ ト遺伝子 （上記 Sawada, H. et al. , Toxicol. Sci. , 83： 282-92 (2005) 参照） および他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ等が挙げられる, 哺乳動物から採取した試料における PLsisマーカー遺伝子の発現は、 該試料か ら RNA (例：全 RNA、 mRNA) 画分を調製し、 該画分中に含まれる該マー カー遺伝子の転写産物を検出することにより調べることができる。 R NA画分の 調製は、 グァニジン _C s C 1超遠心法、 AG P C法など公知の手法を用いて行 うことができるが、 市販の RN A抽出用キット （例： RNeasy Mini Kit; QIAGEN 製等） を用いて、 微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全 RNAを調製すること ができる。 RNA画分中の PLsisマーカー遺伝子の転写産物を検出する手段とし ては、 例えば、 ハイブリダイゼーション （ノーザンプロット、 ドットブロット、 DNAチップ解析等） を用いる方法、 あるいは PCR (RT—PCR、 競合 PC R、 リアルタイム PCR等） を用いる方法などが挙げられる。 微量試料から迅速 且つ簡便に定量性よく PLsisマーカー遺伝子の発現変動を検出できる点で競合 P CRやリアルタイム P CRなどの定量的 P CR法が、 また、 複数のマーカー遺伝 子の発現変動^一括検出することができ、 検出方法の選択によって定量性も向上 させ得るなどの点で DNAチップ解析が好ましい。
ノーザンプロットまたはドットプロットハイプリダイゼーションによる場合、 PLsisマーカー遺伝子の検出は、 標識プローブとして用いられる核酸を含有する 上記本発明の試薬またはキットを用いて行うことができる。 すなわち、 ノーザン ハイブリダィゼーシヨンによる場合は、 上記のようにして調製した RN A画分を ゲル電気泳動にて分離した後、 ニトロセルロース、 ナイロン、 ポリビニリデンジ フロリ ド等のメンブレンに転写し、 本発明の試薬または本発明のキット中に含ま れる各試薬を含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液中、 上記 「ハイストリンジェン トな条件下で」 ハイプリダイゼーシヨンさせた後、 適当な方法でメンプレンに結 合した標識量をパンド毎に測定することにより、 各 PLsisマーカー遺伝子の発現 量を測定することができる。 ドットプロッ トの場合も、 RNA画分をスポットし たメンプレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し （各 PLsisマーカー遺 伝子についてそれぞれ行う） 、 スポットの標識量を測定することにより、 各マー カー遺 子の発現量を測定することができる。
DNAチップ解析 （上記本発明の試薬において記載した固相化プローブ） によ る場合、 例えば、 上記のようにして調製した RNA画分から、 逆転写反応により T 7プロモーター等の適当なプロモーターを導入した c DNAを合成し、 さらに RNAポリメラーゼを用いて c RNAを合成する （この時ピオチンなどで標識し たモノヌクレオチドを基質として用いることにより、 標識された c RNAが得ら れる） 。 この標識 c RNAを上記固相化プローブと接触させてハイプリダイゼー シヨン反応させ、 固相上の各プロープに結合した標識量を測定することにより、 各 PLsisマーカー遺伝子の発現量を測定することができる。 当該方法は、 検出す る PLsisマーカー遺伝子 （従って、 固相化されるプローブ） の数が多くなるほど 迅速性およぴ簡便性の面で有利である。
好ましい実施態様によれば、 本発明の予測方法において、 PLsisマーカー遺伝 子の発現を検出する方法として定量的 P CR法が用いられる。 定量的 PCRとし ては、 例えば、— 競合 P CRやリアルタイム PCRなどがあるが、 増幅反応後の電 気泳動が不要であるという点でリアルタイム PCRがより ¾速性に優れている。 競合 PCRによる場合、 上記本発明の試薬において記載したプライマーセット に加えて、 該プライマーセッ トで増幅でき、 増幅後に標的核酸 （すなわち、 PLsisマーカー遺伝子の転写産物） の増幅産物と区別することができる （例えば 增幅サイズが異なる、 制限酵素処理断片の泳動パターンが異なるなど） 既知量の competitor核酸が用いられる。 標的核酸と competitor核酸とはプライマーを奪い 合って増幅が競合的に起こるので、 増幅産物の量比が元の鎵型の量比を反映する ことになる。 competitor核酸は DNAでも RNAでもよい。 DNAの場合、 上記 のようにして調製される RN A画分から逆転写反応により c DNAを合成した後 に、 本発明の試薬おょぴ competitorの共存下で P C Rを行えばよく、 RNAの場 合は、 RN A画分に competitorを添加して逆転写反応を行い、 さらに本発明の試 薬を添加して P CRを実施すればよい。
一方、 リアルタイム PCRは、 蛍光試薬を用いて増幅量を.リアルタイムでモニ タリン 'する方法であり、 サーマルサイクラ一と分光蛍光光度計を一体化した装 置を必要とする。 このような装置は市販されている。 用いる蛍光試薬によりいく つかの方法.があり.、 例えば、 インターカレンター法、 TaqManTMプローブ法、. Molecular Beacon法等が挙げられる。 いずれも、 上記のようにして調製される R NA画分から逆転写反応により c DNAを合成した後に、 本発明の試薬とインタ 一力レーター、 TaqManTMプローブまたは Molecular Beaconプローブと呼ばれる蛍 光試薬 （プローブ） をそれぞれ P CR反応系に添加するというものである。 イン ターカレーターは合成された二本鎖 DNAに結合して励起光の照射により蛍光を 発するので、 蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングす ることができ、 それによつて元の铸型 c DN A量を推定することができる。 TaqManTMプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、 標的核酸 の増幅領域にハイプリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、 ァニーリング時 に標的核酸にハイプリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、 伸長反 応時に DNAポリメラーゼのェキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質 が遊離することにより蛍光を発する。 従って、 蛍光強度を測定することにより増 幅産物の生成量をモニタリングすることができ、 それによつて元の錄型 c DNA 量を推定することができる。 Molecular Beaconプローブは両端を蛍光物質と消光 物質をそれぞれで修飾した、 標的核酸の増幅領域にハイブリダィズし得るととも にヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、 ヘアピン構造をと つている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、 アニーリング時に標的核酸に ハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発す る。 従って、 蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングす ることができ、 それによつて元の鍚型 c D N A量を推定することができる。
あるいは、 哺乳動物から採取した試料における PLsisマーカー遺伝子の発現は、 該試料から蛋白質画分を調製し、 該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の翻訳産 物 （即ち、 マーカー蛋白質） を検出することにより調べることができる。 マーカ 一蛋白質の検出は、 各蛋白質に対する抗体を用いて、 免疫学的測定法 （例： ELISA、 FIA、 RIA、 ウェスタンプロッ ト等） によって行うこともできるし、 酵素 などの測定可能な生理活性を示す蛋白質においては、 該生理活性を、 各マーカー 蛋白質について公知の手法を用いて測定することによつても行い得る。 あるいは また、 マーカー蛋白質の検出は、 MALDI-T0FMS等の質量分析法を用いても行うこ とができる。
尚、 各マーカー蛋白質に対する抗体は、 配列番号 m (mは 2〜5 8の偶数また は 6 5〜9 9の奇数） に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 あるいは、 配 列番号 n ( nは 5 9〜6 3の整数、 1 0 0または 1 0 1 ) に示される各塩基配列 にコードされる部分ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の部分アミノ酸配 列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を感作抗原として、 通常 使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得 することができる。
本発明の判定方法において、 PLsis発現の有無を判定する基準は、 その基準に 基づく判定結果が該病態の診断系 （臨床 ·前臨床試験においては化合物評価系） としての使用に堪え得る程度に十分な信頼性を有する限り特に制限されない。 例 えば、 （1) 検出対象であるすベての PLsisマーカー遺伝子について発現が増加ま たは減少する （ここで 「実質的に発現が増加または減少」 とは上記と同義であ る） 場合に PLsis陽性であると判定し、 いずれかの PLsisマーカー遺伝子について 実質的に発現が変動しない （ここで 「実質的に発現が変動しない」 とは上記と同 義である） 場合に PLsis陰性であると判定する方法、 （2) 検出対象であるすベて の PLsisマーカー遺伝子について実質的に発現が変動しない場合に PLsis陰性であ ると判定し、 いずれかの PLsisマーカー遺伝子について実質的に発現が増加また は減少する場合に PLsis陽性であると判定する方法、 （3·) 検出対象である n個の PLsisマーカー遺伝子のうち一定数 （例えば、 2〜 （n— 1 ) 個） 以上について 実質的に発現が増加または減少する場合に PLsis陽性であると判定する方法など が挙げられる。 しかしながら、 上記（1)の方法によれば、 偽陽性の出現頻度を低 減する とはできるが、 偽陰性の出現頻度が多くなり、 相当数の PLsis発現が見 落とされるという欠点がある。 一方、 （2)の方法によれば、 偽陰性の出現頻度を 低減することはできるが、 偽陽性の出現頻度が多くなり、 例えば、 臨床 '前臨床 試験においては、 有望な化合物を排除して医薬品等の開発の幅を狭める可能性が める。
上記のような問題を回避し、 PLsisの発現をより高精度に判定するための判定 基準と して、 例えば、 上記 Sawada, H. et al. , Toxicol. Sci. , 83： 282-92 (2005)に記載される Phospholipidosis mRNA score (本明細書においては、 「平 均変動率」 と称する） を用いることが挙げられる。 「平均変動率」 とは以下のよ うに定義される。 すなわち、 各マーカー遺伝子について、 哺乳動物を試験化合物 に曝露したときと曝露しなかったときとでそれぞれ発現量を測定し、 曝露したと きに発現量が増加した場合はその倍率 （例えば、 2倍に増加した場合は 2) を、 減少した場合はその倍率の逆数 （例えば、 1ノ 2に減少した場合は 2) を、 それ ぞれの遺伝子 ついての発現変動率 （X) とし、 全マーカー遺伝子 （n個） の発 現変動率の平均値を平均変動率と定義する （下式） 。
[平均変動率] Xx +m2 X2 + · ■ · +mn Xn
(但し、 11^ +1112 + · ■ - +mn = 1 )
上式において m.i ( i = l〜n) は各遺伝子の重みを表す。 重みに特に制限は ないが、 好ましくは m i X n = 0 . 2 ~ 5であり、 例えば、 全て同じ重み （m = 1 / n ) が挙げられる。
例えば、 哺乳動物を、 2以上 （好ましくは 5以上、 より好ましくは 1 0.以上、 さらに好ましくは 1 5以上） の既知 PLsis誘発化合物および 2以上 （好ましくは 5以上、 より好ましくは 1 0以上、 さらに好ましくは 1 5以上） の既知 PLsis非 誘発化合物の各々に曝露し、 該哺乳動物より採取した試料において、 選択された 1以上の PLsisマーカー遺伝子 （少なくともその 1つは上記した本発明の 5 4個 のマーカー遺伝子である） の発現変動を検出し、 該マーカー遺伝子の発現の平均 変動率と、 現実の PLsis発現の有無とを比較する。 尚、 現実の PLsis発現の有無は 哺乳動 から採取した末梢血中の空胞化リンパ球率、 あるいは各種組織の 1以上 における組織病理学的所見 （例えば、 肺および腸間膜リンパ節においては泡沫細 胞浸潤、 肝臓においては肝細胞もしくは胆管上皮細胞の空胞化、 脾臓においては リンパ球の空胞化もしくは泡沫細胞浸潤、 腎臓においては尿細管上皮細胞の空胞 化、 脳においては小脳プルキンェ細胞の空胞化） を指標として決定される。
比較の結果、 上記の既知 PLsis誘発および非誘発化合物の PLsis誘発性の有無を 約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 5 %以上の確率で正しく判定することができる平均変動率の値を求 め、 これを基準値とする。 このようにして決定される基準値は、 さらに別の既知 PLsis誘発おょぴ非誘発化合物を用いて、 同様に PLsisマーカー遺伝子の発現の平 均変動率と現実の PLsis発現の有無とを比較することにより、 その妥当性を検討 することがさらに好ましい。 新たに検討した化合物についての判定結果を総合し て、 より高い確率で PLsis発現の有無を正確に判定することができる平均変動率 値が得られれば、 基準値を補正すればよい。
本発明の判定方法において適用され得る他の好ましい判定基準としては、 W0 0V10453および TO 02/095000に記載される、 化合物による肝毒性 腎毒性誘発ポ テンシャルの判定基準に準じたものが挙げられるが、 それに限定されない。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分 野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C ： シトシン
RNA ： リポ核酸
mRNA ： メッセンジャーリボ核酸
d AT P . ：デォキシアデノシン三リン酸
d TT P ：デォキシチミジン三リン酸
d GT P ：デォキシグアノシン三リン酸
d C T P ：デ才キシシチジン三リン酸
AT P ：アデノシン三リン酸
ED T A ：エチレンジアミン四酢酸
S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ：ァラニン
V a 1 ： ノ リン
L e u ： ロイシン
l i e ' ：ィソロイシン
S e r ：セリン
T h r ： スレ才ニン
C y s ：システィン
Me t ： メチォニン G 1 u ： グルタミン酸
A s ' ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ： アルギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ二ルァラニン -
T y r ：チロシン
T r p ： トリブトフアン
P r o ： プロリン
A s n ： ァスパラギン
G 1 n ： グルタミン
p G 1 u . ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシスァイン ^selenocysteme)
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 これらは単なる例 示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例 1
6種の既知 PLsis誘発化合物 （アミオダロン： 1000 mg/kg/day、 タモキシフヱ ン ： 1000 mg/kg/day s クロ 口キン ： 250 mg/kg/day、 ぺノレへキシリ ン ： 600 mg/kg/day、 フルォキセチン ： 300 mg/kg/dayおよびキナク リ ン ： 200 mg/kg/day) を、 5週齢の Crj : CD (SD) IGSラット （日本チャールズリバ一株式会社 閉鎖環境下生産） に、 投与液量 10 mL/kg/dayで、 1日 1回、 3日間 （陰性対照 （0. 5 w八。/。メチルセルロース溶液投与） については 4日間） 強制経口投与した。
投与終了後—、 すべての動物について肝臓、 腎臓、 脾臓、 肺および腸間膜リンパ 節、 その他各試験化合物における追加器官 '組織として、 タモキシフェンでは副 腎、 下垂体おょぴ眼球、 キナクリンでは脳おょぴ大腿部筋肉、 クロ口キンでは脳 および眼球、 ペルへキシリンでは脳および皮膚、 フルォキセチンでは脳をサンプ リングし、 常法により光学顕微鏡及び電子顕微鏡学的にサンプリングした組織の 病理組織学的変化を調べた。 また、 血液塗抹標本 （ギムザ染色標本） を作製し、 顕微鏡で観察しながら、 末梢血の空胞化リンパ球率を測定した。
PLsis誘発化合物投与群における病理組織学的変化おょぴ空胞化リンパ球率の 結果を表 1に示す。 化合物投与群全ての病理組織学的検査において PLsisと考え られる変化が認められ、 同時に末梢血の空胞化リンパ球検査においてリンパ球の 空胞化率の高値も認められた。 - 表 1 PLsis誘発化合物を投与したラットにおける空胞化リンパ球率おょぴ病理 組織学的所見 化合物名 用量 空胞化リン 病理組織学的所見 （PLsis)
. mg/kg/ day) パ球率 (%) 肺 リンパ節 肝臓 脾臓 その他 アミオダロン 1000 40† + + ― + — タモキシフェン 1000 40† + + + 一 一 クロ口キン 250 66† ― + ― + 一 ぺノレへキシリ ン 600 52† + + 一 + — フルォキセチン 300 31† + + + 一 脳 キナクリン 200 32† + + + ― ―
† ：高値； + ： PLsis病変あり ；—： PLsis病変なし 実施例 2
実施例 1における 3日間連日経口投与の終了 24時間後に、 化合物投与群及び対 照 （非投与） 群 （各群3匹） から血液を採取し、 これをプールして GeneChip解析 ^行った。
PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytiX)で血液採取後、 2時間以上放置し、 - 80°Cで凍結保存した。 Total RNA抽出は PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX)を 用いて行った。 .GeneChip解析に用いるサンプルの調製ならぴに解析は、 Affymetrix社のプロ ト コ一ノレ【こ従 ヽ実施 した。 Superscript Choice system (Invitrogen) 【こ よ る cDNA合成反応を行 ヽ、 次 ヽで Enzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix)によるビォチン標識 cRNA 合成反応の後、 cRNAを断片化し標識サンプルを調製した。 標識サンプルを Rat Expression Array 230A (RAE230A、 Affymetrix)に hybridizationし、 GeneChip system (Affymetrix)によりアレイの染色と洗浄及びスキャンを行い、 1枚のァレ ィから以下の 3つの画像データを取得した。
画像データ
1. 抗体による蛍光の増幅反応を省略する方法で染色を行ったデータ
2. 体による蛍光の増幅反応を一度行うマニュアル記載の方法で染色を行つ たデータ
3. 抗体による蛍光の増幅反応を二度行う方法で染色を行ったデータ
画像データからは MicroarraySuite5. 0 (パラメータ一は Default値使用） を用 いて測定値 (Signal ) 、 Signal Log Ratioなどの数値データ及ぴ Detection、 Changeなどの判定データを取得した。 Fold Changeは画像データ 2の Signal Log Ratioから Fold Change = 2S i g n a l L o s R a t 1。の変換式を用いて計算した。
次に、 DNAマイクロアレイデータ解析ソフ トの GeneSpring (Si licon Genetics) を用いて化合物添加により変動したプローブセット *を下記の基準で抽出し、 変 動プローブセッ トとした。 （* RAE230Aを利用した GeneChip解析では一つの測定 対象の配列に対して 11か所測定し、 11か所の測定結果を組み合わせて一つの数値 及ぴ判定データが得られる。 RAE230Aには 11か所の測定セット力 5924組あり、 各 測定セットはプローブセットと呼ばれている。 ）
変動プローブセットの抽出基準
上記の 3つの画像データのうち 2つ以上が以下の 3条件を満たすプローブセッ トを変動プローブセットとした。
1. MicroarraySuite5. Increase ¾しくは Decreaseと判定されたプローブセ ッ卜 2. 測定値 （Signal) の高い方の値力 SMicroarraySuite5.ひで Presenceと判定さ れたロープセット
3. 対照群を基準にした処置群の Signal Log Ratioが 0. 6以上あるいは- 0. 6以下 を示すプローブセット .
プロープセッ トの遺伝子名 ■ 機能 · 配列等のァノテーショ ン情報は HuraanPSD (Incyte) , NetAf fx (GeneChipに搭載されたターゲットに関するデータべ ース， Affymetrix)より入手した。
発現量が変動したプローブセットを抽出し、 その数を表 2にまとめた。
PLsis誘発化合物を投与したラットにおける発現変動プローブセット数 化合物名 . 用量（mg/kg/day) 発現増加 発現減少
アミオダロン 1000 613 282
タモキシフェン 1000 258 94
クロ口キン 250 382 318
ペルへキシリン 600 310 179
フルォキセチン 300 372 391
キナクリン 200 _ 240 392 6化合物全てで発現変動の認められたのは、 増加： 9プローブセット （8遺伝 子） （表 3 ) 、 減少： 27プローブセット （26遺伝子） （表 4 ) 。
Figure imgf000040_0001
PLs i s誘発 6化合物 3日間投与群全 で発 減少が認められたプロ一ブセット
Figure imgf000041_0001
a ) 7日間投与群でも発現減少が認められた化合物数
b ) 同一遗伝子の他の Accesion No,または部分配列を含む E S Tの Access ion
Figure imgf000042_0001
実施例 3
6種の既知 PLsis誘発化合物 （アミオダロン ： 300 rag/kg/dayN タモキシフエ ン ： 100 mg/kg/day、 ク ロ 口 キン ： 75 mg/kg/day、 ぺノレへキシ リ ン ： 200 mg/kg/day, イミプラミン： 100 mg/kg/dayおよびキナクリン； 60 mg/kg/day、 陰 性対照： 0. 5 w/v¾メチルセルロース溶液） を、 5週齢の Crj : CD (SD) IGSラット （日 本チャールズリバ一株式会社、 閉鎖環境下生産） に、 投与液量 10 mL/kg/dayで、 1日 1回、 7ョ間強制経口投与した。
投与終了後、 すべての動物について肝臓、 腎臓、 脾臓、 肺および腸間膜リ ンパ 節をサンプリングし、 常法により光学顕微鏡及び電子顕微鏡学的にサンプリング した組 の病理組織学的変化を調べた。 また、 血液塗抹標本 （ギムザ染色標本） を作製し、 顕微鏡で観察しながら、 末梢血の空胞化リンパ球率を測定した。
PLsis誘発化合物投与群における病理組織学的変化おょぴ空胞化リンパ球率の 結果を表 5に示す。 化合物投与群全ての病理組織学的検査において PLsisと考え られる変化が認められ、 同時に末梢血の空胞化リンパ球検査においてリンパ球の 空胞化率の高値も認められた。
表 5 PLsis誘発化合物を投与したラットにおける空胞化リンパ球率および病理 組織学的所見 化合物名 用量 空胞化リン 病理組織学的所昆 (PLsis)
(mg/kg/day) パ球率 （％) 肺 肝臓 脾臓 腎臓 リンパ節 _ 陰性対照 0 0. 0 一 一 - 一 ― ― アミオダロン 300 31. 5† ++ ― 一 ― ++ イミブラミン 100 12. 3† + ++ ― ― ― タモキシフェン 100 10. 3† + ― ― ― ++ キナク ン 60 16. 0† ' + ++ + + 一 クロ口キン 75 16. 3† ― + + ― ― ぺノレへキシリン 200 12. 5† + 一 ― 一 +
† ：高値； ++：重度の PLsis病変 ； + ：軽度の PLsis病変 ： PLsis病変なし 実施例 4
実施例 3における 7 B間連日経口投与の終了 24時間後に、 化合物投与群及び対 照 （非投与） 群 （各群 4匹） から血液を採取し、 これをプールして、 実施例 2と 同様にして GeneChip解析を行った。
発現量が変動したプローブセットを抽出し、 その数を表 6にまとめた。
表 6 PLsis誘発化合物を投与したラットにおける発現変動プローブセット数 化合物名 用量 mg/kg/day 発現増加 発現減少
アミオダロン 300 515 45,7
イミブラミン 100 123 320
タモキシフェン 100 546 - 368
キナクリン 60 258 103
クロ口キン 75 310 179
ぺノレへキシリン 200 49 83
6化合物全てで発現変動の認められたのは、 増加： 14プローブセット （14遺伝 子） （表 7) .、 減少： 9プローブセット （9遺伝子） （表 8 ) であった。 また、 こ の内、 chemokine (C - C motif) ligand 6 (雇— 001004202) 、 secretory leukocyte peptidase inhibitor (應一 053372) お よ び similar to hypothetical protein MGC40107 (XM— 213333)は、 3 間投与後でも調べた 6化合物全て （重複は 5化合 物） で発現変動が認められた。
P s s 6 つ曰 全てで発現増力が認められたプローブセット
Figure imgf000046_0001
a) 3日間投与群でも発現増加力認められ fe化合物数
s i s 6 7日 全てで発現減少 認められたプロ一ブセット
Figure imgf000047_0001
a ) 3日間投与群でも発現減少が認められた化合物数
産業上の利用可能性
本発明の PLsisの判定方法は、 血液ゃリンパ球における PLsisマーカー遺伝子の 発現変動を指標とすることから、 従来のインビボ毒性試験などに比べて、 非侵襲 的に、 且つ精度よく PLsisの発現を判定する とができる。 従って、 臨床 '前臨 床段階などの医薬品開発の後期における医薬候補化合物の毒性評価に有用である。 また、 その他の薬物起因性 PLsis、 病態として PLsisあるいは PLsis様変化を伴う 遺伝性もしくは非遺伝性の疾患の診断にも有用である。 このように、 本発明を好ましい実施態様を強調して説明してきたが、 好ましい 実施態悸が変更され得ること、 並びに本発明が本明細書に具体的に記載された以 外によつても実施され得ることは、 当業者には自明であろう。 従って、 本発明は 上記の特許請求の範囲によって定義される発明の精神と範囲に包含される全ての 改変を含むものである。
本明細書で引用した、 特許、 特許出願及び刊行物を含むすべての参考文献は、 ここで言及することによりそのすべてが組み込まれるものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 5— 0 4 0 6 9 8 (出願日 ：平成 1 7 年 2月 1 7 S ) および特願 2 0 0 5 - 1 2 8 4 1 2 (出願日 ：平成 1 7年 4月 2 6 0 ) を基礎としており、 その内容は全て本明細書に包含されるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 n ( nは 1〜5 7の奇数、 5 9〜 6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) のいずれかに示される塩基配列を有する核酸とハイストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸、 及び Z又は該塩基配列に相補 的な塩基配列を有する核酸とハイストリンジ ントな条件下でハイプリダイズし 得る核酸を含有してなる、 哺乳動物におけるリン脂質症の判定用試薬。.
2 . リン脂質症の発現と相関して発現が変動する遺伝子の転写産物とハイストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸、 及ぴ 又は該転写産物に相補 的な塩革配列を有する核酸とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズし 得る核酸を含有する 2以上の試薬を含んでなる、 哺乳動物におけるリン脂質症の 判定用キッ .トであって、
(a) 少なくとも 1つの試薬は請求項 1記載の試薬であり、
(b) 2以上の請求項 1記載の試薬を含む場合、 各試薬は互いに異なる遺伝子の発 現を検出し得るものであるキット。
3 . 哺乳動物から採取した試料における、 リン脂質症の発現と相関して発現が変 ■ 動する 1以上の遺伝子の発現変動を検出することを含む、 該哺乳動物におけるリ ン脂質症の判定方法であって、 少なくとも 1つの遺伝子は、 配列番号 n ( nは 1 〜 5 7の奇数、 5 9〜6 3の整数、 6 4〜 9 8の偶数、 1 0 0または 1 0 1 ) の いずれかに示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有するも のである方法。
4 . 哺乳動物が、 化合物を投与されるか化合物に曝露されたものであり、 リン脂 質症が該化合物に起因するものである、 請求項 3記載の方法。
5 . 哺乳 1¾物がヒ トである請求項 3記載の方法。
6 . 哺乳動物がラット、 マウス、 ィヌまたはサルである請求項 3記載の方法。
7 . 試料が血液またはリンパ球である請求項 3記載の方法。
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