MXPA04002575A

MXPA04002575A - Quimiocinas como adyuventes de respuesta inmune.

Info

Publication number: MXPA04002575A
Application number: MXPA04002575A
Authority: MX
Inventors: Vicari Alain
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2004-06-18
Also published as: CA2460321A1; US20070166280A1; AU2002330053A1; EP1435992A4; JP2005502723A; EP1435992A2; WO2003024404A2; US20030077247A1; US20100086560A1; WO2003024404A3

Abstract

Las celulas dendriticas juegan un papel importante en las respuestas inmunes especificas de antigeno; se proporcionan materiales y metodos para el tratamiento de estados de enfermedad, incluyendo cancer, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, transplante, y alergia facilitando o inhibiendo la migracion o la activacion de un subconjunto especifico de celulas dendriticas de presentacion de antigeno conocidas como celulas dendriticas plasmacitoides (pDC); en particular, se proporcionan metodos para el tratamiento de estados de enfermedad que comprenden la administracion de agonistas y antagonistas del receptor de quimiocina, solos o en combinacion con un antigeno asociado con la enfermedad, con o sin un agente de activacion.

Description

QUIMIOCINAS COMO ADYUVANTES DE RESPUESTA INMUNE CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere al uso de agonistas y antagonistas del receptor de quimiocina de humano en el tratamiento de estados de enfermedad, incluyendo cáncer. Los agonistas y antagonistas del receptor de quimiocina administradas dirigen o previenen la migración de un subgrupo espeGífiGO-de-Gélulas-dendrít¡Gas-En-una-modalidad7 el-antígeno(s)-y/o -porción específica de una enfermedad diseñada para activar las células dendríticas se administra junto con el agonista(s) del receptor de quimiocina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células dendríticas (DC) se especializan en la captación de antígeno y su presentación a las células T. De esta manera DC juegan un papel crítico en las respuestas inmunes especificas de antígeno. Las DC son derivadas de la médula ósea y migran como precursores a través de la corriente sanguínea a los tejidos, en donde se vuelven células residentes tales como células de Langerhans en la epidermis. En la periferia, después de la invasión de patógenos, las DC inmaduras tales como las células de Langerhans se agrupan al sitio de inflamación (Kaplan et al., 1992, J. Exp. Med. 175:1717-1728; McWilliam eí ai, 1994, J. Exp. Med. 179:1331-1336) en donde se capturan y procesan antígenos (Inaba et al., 1986. J. Exp. Med. 164:605-613; Streilein et al., 1989, J. Immunol. 143:3925-3933; Romani et al., 1989, J. Exp. Med. 169:1169-1 178; Puré et al., 1990. J. Exp. Med. 172:1459-1469; Schuler et al., 1985, J. Exp. Med. í6í;526-546). Las DC cargadas con antígeno entonces migran desde el tejido periférico por medio de los limfáticos al área rica en células T de los ganglios limfáticos, en donde las DC maduras son llamadas células de interdigitación (IDC) (Austyn ef al., 1988, J. Exp. Med. 167:646-651 ; Kupiec-Weglinski et a/., 988, J. Exp. Mec/H 67†632-645 barsen- et-al— 1 $m~J-Exp-Medr-† 72† 483-1494;-Fossum7-S. 1988, Scand. J. Immunol. 27:97-105; Macatonia et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1654-1667; Kripke et al., 1990, J. Immunol. 145-2833-2838). En este sitio presentan los antígenos procesados a células T no afectadas y generan una respuesta de células T primaria específica de antígeno (Liu eí al., 1993, J. Exp. Med. 177:1299-1307; Sornasse et al., 1992, J. Exp. Med. 175:15-21 ; Heufler ef ai, 1988, J. Exp. Med. 167:700-705). El sistema de DC se compone de una población diversa de tipos de células similares morfológicamente distribuidos ampliamente a través del cuerpo (Caux et al., 1995, Immunology Today 16:2; Steinman, 1991 , Ann. Rev. Immunol. 9:271-296). Algunas células dendríticas, tales como las células de Langerhans (LC) de la epidermis, juegan el papel de centinelas del sistema inmune. Otras subpoblaciones de DC, tal como monocitos, CD11c+ DC de sangre, y DC plasmacitoide (pDC), son células en circulación que necesitan ser agrupadas durante la infección en sitios anatómicos específicos.

Las DC plasmacitoides (pDC) se caracterizaron primero por patologías como monocitos/células T plasmacitoides que se acumulan alrededor de HEV de los ganglios linfáticos inflamados (Volienweider et al., 1983, Virchows Arch. {Cell Pathol.) 44:1-114; Facchetti ef al., 1988, Hum Pathol 19 (9):1085-92; Facchetti et al., 1988, Am. J. Pathol. 133:15-21 ). Posteriormente, identificadas como un subgrupo CD11c- DC de la sangre (O'Doherty et al., 1994 Immunology 82:487-493), se caracterizaron como plasmacitoides debido a su semejanza ultraestructural a las células plasmátieas-de-secreción— de-lg-al— momento- del— aislamiento- desde las — amígdalas. (Grouard eí al., 1997, J. Exp. Med. 185(6): 1101-1111). Se caracterizan por un fenotipo superficial único (CD4+IL-3R++CD45RA+HLA-DR+) (Grouard et al., 1997 J. Exp. Med. 185(6):1101-1111 ; Facchetti et al., 1999, Histopathology 35(1):88-9 Res eí al., 1999, Blood 94 (8):2647-57). Se ha demostrado recientemente que las pDC son idénticas a las células productoras de IFN naturales (NIPC) (Siegal et al., 1999 Science 284(5421): 1835-7; Celia eí al., 1999, Nature Med. 5.919-923), que se han conocido durante mucho tiempo como la fuente principal de IFNa en la sangre en respuestas inmunes anti-virales (Ito ef a/., 1981 , Infect Immun 31 (2):519-23; Fitzgerald-Bocarsly ef al., 1993, Pharmacol. Ther. 60:39-62; Feldman et al., 1994, Virology 204 (1)1-7; (Perussia ef al., 1985, Nat Immun Cell Growth Regul 4(3): 120-37; Chehimi et ai, 1989, Immunology 68(4):488-90; Fitzgerald-Bocarsly et al., 1988, J. Leukoc Biol 43(4):323-34; Feldman et al., 1990, J Inferieron Res 10(4):435-46). Después del encuentro del virus, estás células producen altos niveles de IFN e inducen iniciación in vitro potente y polarización Th-1 de células T no afectadas (Celia et al., 2000, Nat Immunol 1 (4):305-10; Kadowaki et al., 2000, J. Exp Med 192 (2):219-26). El origen de pDC aún no es claro, pero varios elementos sugieren que pueden derivarse de un precursor común con las células T y células B: i) carecen de expresión de antígenos mieloides (Grouard ef al., 1997, J. Exp. Med. 185, 6:1101-1 111 ;Res et al., 1999. Blood 94, 8:2647-57), ii) expresan transcrito pre-TCR (Res et al., 999, Blood 94 (8):2647-57; Bruno ef al., 1997, J. Exp. Med. 185:875-884) y SPI-B un factor de transcripción de células linfoides (Bendriss-Vermare et al., 2001 , JCI 107:835) iii) desarrollo de pDC, T y B, pero ninguna de las DC mieloides se bloquea por expresión ectópica del inhibidor de Id2 o Id3 de unión a ADN (Spits et al., 2000, J. Exp. Med. 192 (12): 1775-84). Además de su morfología, su producción de IFNa y su origen putativo, pDC también difieren de las DC mieloides en su actividad fagocítica débil (Grouard et al., 1997, J. Exp. Med. 185(6):1101-1111 )„ su capacidad de producción de IL-12 débil (Rissoan et al., 1999, Science 283:1 83- 186), y las señales que inducen su activación (Kadowaki et al., 2001 , J Immunol 166(4):2291-5). En particular, pDC responderán a CpG pero no la activación de LPS al producir IFNa, mientras las DC mieloides principalmente responderán a LPS al producir IL-12 (Celia et al., 1996, J. Exp. Med. 184:747-752; Koch ef al., 1996, J. Exp. Med. 184:741-746). pDC han demostrado inducir respuestas inmunes Th-1 (Rissoan et ai, 1999, Science 283; 1 183) o respuestas inmunes Th-2 (Kadowaki et ai, 2000, JEM 92:219), dependiendo de la presencia o ausencia de señal de activación (Liu et al., 2001 , Nature Immunol 2:585). Aunque la agrupación de pDC activadas debe iniciar la inmunidad a través de la activación de células T no afectadas, las DC inactivas han reportado inducir tolerancia inmune, de igual manera a través de la inducción de células T de regulación (Jonuleit et al., 2001 , Trends Immunol 22:394; Bell eí al., 2001 , Trends Immunol 22:1 1 , Roncarolo et al., 2001 , JEM 193:F5; Jonuleit et al., 2000, JEM 162:1213). Además, las pDC ha demostrado inducir células T células de secreción de IL-10 (Rissoan eí al., 1999, Science 283:1183; Liu eí al., 2001 , Nature Immunol 2:585) y células T de regulación de CD8 (Gilliet et al., 2002,, J Exp Med. 195(6):695-704). Además, las pDC se ha relacionado recientemente con enfermedades autoinmunes en particular Lupus (Farkas et al., 2001 , Am. J. Pathol. 159:237). Además, el agrupamiento activo de pDC en tumores de ovario se ha reportado (Curiel et al., 2001 Keystone Symposia marzo 12-18, 2001 : Dendritic Cells, Interfaces With Immunobiology and Medicine), demostrando que las pDC pueden ser favorables para el desarrollo de tumores en ciertas circunstancias, probablemente a través de la inducción de respuestas inmunes de regulación. En estos casos, el entorno del tumor se sospecha que evita la activación de pDC. Las quimiocinas son proteínas de bajo peso molecular que regulan la migración de leucocitos y la activación (Oppenheim, 1993, Adv. Exp. Med. Biol. 351 :183-186; Schall, et ai, 1994, Curr. Opln. Immunol. 6:865-873; Rollins, 1997, Blood 90:909-928; Baggiolini, eí al., 1994, Adv. Immunol. 55:97-179). También se secretan mediante leucocitos activados por sí mismos, y por células estromáticas incluyendo células endoteliales y células epiteliales al momento de un estímulo inflamatorio (Oppenheim, 1993, Adv. Exp. Med. Biol. 351 :183-186; Schall, et al., 1994, Curr. Opin. Immunol. 6:865-873; Rollins, 1997, Blood 90:909-928; Baggiolini, et al., 1994, Adv. Immunol. 55:97-179). Las respuestas a quimiocinas son mediadas por siete receptores acoplados a la proteína G que se extienden sobre las transmembranas (Rollins, 1997, Blood 90:909-928; Premack, et al., 1996, Nat. Med. 2:1174-1 78;Murphy, P.M. 1994, Ann. Rev. Immunol. 12:593-633). Se ha demostrado que varias proteínas que pertenecen a la familia estructural de la quimiocina pueden promover el agrupamiento de ciertos subgrupos de células dendríticas (DC) in vitro (Caux, et al., 2000, Springer Semin Immunopathol. 22: 345-69; Sozzani, et al., 1997, J. Immunol. 159: 1993-2000; Xu, et al., 1996, J. Leukoc. Biol. 60: 365-371 ; MacPherson, et al., 1995, J. Immunol. 154: 1317-1322; Roake, et al, 1995, J. Exp. Med. 181 : 2237-2247). Las señales que regulan el tráfico de células dendríticas, sin embargo, es complejo y no se entiende totalmente. En particular, muy poca información se encuentra disponible con respecto a la capacidad migratoria de células dendríticas plasmacitoides. Un entendimiento de las señales implicadas en agrupamiento y migración de esta subclase de DC puede ser útil en el desarrollo de terapéuticos para controlar o modular la respuesta inmune y para tratar enfermedades inmunes. En particular, las movilizaciones de pDC en tumores puede permitir la explotación de su función para inducir o amplificar la inmunidad anti-tumor. Ya que pDC son iniciadores clave de inmunidad antiviral, puede esperarse que su manipulación controlada de como resultado potente inmunidad antitumor. Existe una necesidad continua de materiales y métodos mejorados que puedan utilizarse no solamente para expandir y activar células dendríticas que presentan antígenos, sino para modular la migración de DC para ser terapéuticas como también útiles profilácticamente.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención cumple la necesidad anterior al proveer materiales y métodos para tratar estados de enfermedad al facilitar o inhibir la migración o activación de un subgrupo específico de células dendríticas que presentan antígenos. Se ha descubierto que las DC plasmacitoides de humano (pDC), la células que producen IFN naturales de la sangre, siguen rutas de tráfico únicas controladas por quimiocinas seleccionadas. De este modo, la administración de agonistas o antagonista del receptor de quimiocina específicos, solos o en combinación con un antígeno relacionado con una enfermedad, es un método terapéutico útil. Los estados de enfermedad que pueden tratarse de conformidad con la invención incluyen infecciones parasíticas, infecciones bacterianas, infecciones virales, infecciones por hongos, cáncer, enfermedades autoinmunes, rechazo al injerto y alergia.

De este modo, la invención provee un método para tratar estados de enfermedad que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad de un agonista o antagonista receptor de quimiocina suficiente para incrementar o disminuir la migración de células dendríticas piasmacitoides al sitio de suministro de antígeno. La presente invención provee un método para tratar un estado de enfermedad que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad de agonista del receptor de quimiocina suficiente para mejorar una respuesta inmune (a través del agrupamiento de pDC y activación), en donde el agonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un agonista CXCR3, un agonista CXCR4, un agonista CCR6, y un agonista CCR10 o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el estado de enfermedad es una infección parasítica, infección bacteriana, infección viral, infección por hongos o cáncer. Más preferiblemente, el estado de enfermedad es cáncer. En ciertas modalidades, el agonista del receptor de quimiocina es un ligando natural seleccionado del grupo que consiste en SDF-1 , IP- 0, Mig, l-TAC, CTACK, MEC, Mip-3ct o variantes de los mismos. En ciertas modalidades, el agonista del receptor de quimiocina es recombinante. En otras modalidades, el agonista del receptor de quimiocina es una pequeña molécula. El agonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse sólo o en combinación con otro agonista(s) del receptor de quimiocina.

En un aspecto preferido, el agonista(s) del receptor de quimiocina se administra con un antígeno relacionado con una enfermedad, por ejemplo, en forma de una proteína de fusión. Dichos antígenos pueden ser relacionados con el tumor, bacterianos, virales, de hongos o un auto antígeno, o un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. El agonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse en forma de una proteína de fusión, que comprende uno o más agonistas del receptor de quimiocina fusionados a uno o más antígenos relacionados con la enfermedad, o por medio de un ADN o un vector viral que codifica para el agonista(s) del receptor de quimiocina con o sin antígenos. En modalidades preferidas, el agonista(s) del receptor de quimiocina se administra local y/o sistémicamente. El agonista(s) del receptor de quimiocina también puede administrarse en forma de una construcción de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una pequeña molécula, o un vector tal como un vector viral, que se diseña para reconocer o localizar un antígeno relacionado con un tumor u objetivo u otra estructura específicamente expresada por componentes no cancerígenos del tumor, tal como la vasculatura del tumor. La estructura reconocida también puede relacionarse con otras enfermedades tales como enfermedades infecciosas, auto-inmunidad, alergia o rechazo al injerto.

El agonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse en combinación con un factor de supervivencia de pDC tal como IL-3, IFNa o un ligando/agonista RANK. El agonista(s) del receptor de quimiocina también puede administrase en combinación con un agente de activación tal como un TNF-a, ligando/agonista RANK, ligando/agonista CD40 o un ligando/agonista de otros miembros de la familia del receptor TNF/CD40, IFNa o un ligando/agonista TLR tal como CpG. En una modalidad preferida de la invención, un agonista CXCR3 y un agonista CXCR4 se administran, solos o en combinación. Preferiblemente, el agonista CXCR3 es IP-10, Mig, o l-TAC o una variante del mismo y el agonista CXCR4 es SDF-1 o un variante del mismo. Más preferiblemente, la invención provee un método para tratar un estado de enfermedad en un individuo en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad de SDF-1 o una variante del mismo en combinación con IP-10, Mig, o l-TAC, o una variante del mismo. Más preferiblemente, un antígeno relacionado con un tumor, u otro antígeno relacionado con una enfermedad también se administra. Más preferiblemente, un factor de supervivencia y/o un agente de activación también se administra. En otras modalidades de la invención, un agonista CCR6 y/o un agonista CCR10 se administran, solos o en combinación. En estas modalidades, un factor de supervivencia tal como IL-3 también puede administrarse opcionalmente. Preferiblemente, el agonista CCR6 es MIP-3a, o una variante del mismo y el agonista CCR10, es CTACK o MEC o una variante del mismo. Más preferiblemente, un antígeno relacionado con un tumor, u otro antígeno relacionado con una enfermedad, también se administra. Más preferiblemente, también se administra un agente de activación. En una modalidad adicional de la invención, un agonista CCR6 y/o un agonista CCR10 se administran en combinación con un agonista CXCR3. En estas modalidades, un factor de supervivencia tal como IL-3 también puede administrarse. Preferiblemente el agonista CCR6 es Mip-3cc, o una variante del mismo, el agonista CCR10 es CTACK, MEC o una variante del mismo, y el agonista CXCR3 se selecciona del grupo que consiste en IP- 0, Mig, l-TAC y variantes de los mismos. Los agonistas también pueden ser recombinantes, o pueden encontrarse en forma de una pequeña molécula. Preferiblemente, un antígeno relacionado con un tumor u otro antígeno relacionado con una enfermedad también se administran. Más preferiblemente, también se administra un agente de activación. Otro aspecto de la invención provee un método para tratar estados de enfermedad que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad de un agonista del receptor de quimiocina suficiente para modular una respuesta inmune (por ejemplo, inducir tolerancia a través de la inducción de células T de regulación), en donde el agonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un agonista CXCR3, un agonista CXCR4, un agonista CCR6, y un agonista CCR10, o una combinación de los mismos. En estas modalidades, el agonista del receptor de quimiocina se administra sin un agente de activación, y el estado de enfermedad preferiblemente es una enfermedad autoinmune, rechazo de injerto o alergia. En ciertas modalidades, el agonista del receptor de quimiocina es un ligando natural seleccionado del grupo que consiste en SDF-1 , IP-10, Mig, l-TAC, CTACK, EC, ip-3a, o variantes de los mismos. En ciertas modalidad, el agonista del receptor de quimiocina es recombinante. En otras modalidades, el agonista del receptor de quimiocina es una pequeña molécula. El agonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse solo o en combinación con otro agonista(s) del receptor de quimiocina. En un aspecto preferido, el agonista(s) del receptor de quimiocina se administra con un antígeno relacionado con una enfermedad, por ejemplo, en forma de una proteína de fusión. Dichos antígenos pueden ser un auto-antígeno, un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. El agonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse en forma de una proteína de fusión que comprende uno más agonistas del receptor de quimiocina fusionado a uno o más antígenos relacionados con una enfermedad, o por medio de un ADN o un vector viral que codifica para el agonista(s) del receptor de quimiocina con o sin antígenos. En modalidades preferidas, el agonista(s) del receptor de quimiocina se administra local y/o sistémicamente.

El agonista(s) del receptor de quimiocina también puede administrarse en forma de una construcción de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, una pequeña molécula, un vector tal como un vector viral, que se diseña para reconocer o localizar un antígeno relacionado con un tumor o una estructura específicamente expresada por componentes no cancerígenos del tumor, tal como la vasculatura del tumor. La estructura reconocida también puede relacionarse con otras enfermedades tales como enfermedades infecciosas, auto-inmunidad, alergia o rechazo al injerto. Otro aspecto de la invención provee un método para tratar estados de enfermedad que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad de un antagonista del receptor de quimiocina suficiente para disminuir una repuesta inmune (al bloquear el agrupamiento de pDC), en donde el agonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un antagonista CXCR3, un antagonista CXCR4, un antagonista CCR6, y un antagonista CCR10, o una combinación de los mismos. En estas modalidades, el estado de enfermedad es una enfermedad autoinmune, rechazo al injerto o alergia. En ciertas modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es un antagonista del ligando natural seleccionado del grupo que consiste en SDF- , IP-10, Mig, l-TAC, CTACK, y Mip-3oc. En ciertas modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es recombinante. En otras modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es una pequeña molécula. El antagonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse solo o en combinación con otro antagonista(s) del receptor de quimiocina. El antagonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse en forma de una proteína de fusión, o por medio de un ADN o un vector viral que codifica para el antagonista(s) del receptor de quimiocina. En modalidades preferidas, el antagonista(s) del receptor de quimiocina se administra local o sistémicamente. El antagonista(s) del receptor de quimiocina también puede administrarse en forma de una construcción de localización que comprende un antagonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, una pequeña molécula, o un vector tal como un vector viral, que se diseña para reconocer o localizar una estructura relacionada con enfermedades tales como auto-inmunidad, alergia o rechazo al injerto. Un aspecto final de la invención provee un método para tratar estados de enfermedad que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad de antagonista del receptor de quimiocina suficiente para modular una repuesta inmune, en donde el antagonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un antagonista CXCR3, un antagonista CXCR4, un antagonista CCR6, y un antagonista CCR10, o una combinación de los mismos. En estas modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina se administra sin un agente de activación, y el estado de enfermedad preferiblemente es cáncer. En particular, el estado de enfermedad es uno en donde existe un agrupamiento activo de pDC que puede desviar la respuesta inmune hacia las células T de regulación. En ciertas modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es un antagonista del ligando natural seleccionado del grupo que consiste en SDF-1 , IP-10, Mig, l-TAC, CTACK, y Mip-3 . En ciertas modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es recombinante. En otras modalidades, el antagonista del receptor de quimiocina es una pequeña molécula. El antagonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse solo o en combinación con otro antagonista(s) del receptor de quimiocina. El antagonista(s) del receptor de quimiocina puede administrarse en forma de una proteína de fusión, o por medio de un ADN o vector viral que codifica para el antagonista(s) del receptor de quimiocina. En modalidades preferidas, el antagonista(s) del receptor de quimiocina se administra local o sistémicamente. El antagonista(s) del receptor de quimiocina también puede administrarse en forma de una construcción de localización que comprende un antagonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una pequeña molécula, o un vector tal como un vector viral, que se diseña para reconocer o señalar un antígeno relacionado con un tumor o una estructura específicamente expresada por un componente no cancerígeno del tumor, tal como la vasculatura del tumor.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 : pDC expresan un patrón único de receptores de quimiocina. pDC se aislaron de la sangre de humano después de agotamiento de perlas magnéticas de células positivas de linaje, y se identificaron con base en la tinción triple, HLA-DR+, linaje, CD11c-. La figura 2: pDC no responden a la mayoría de las quimiocínas inflamatorias. La figura 2 muestra respuestas de CD11c" pDC de sangre y DC mieloide de CD11c+ a varias quimiocínas. Cada quimiocina se analizó sobre una amplia gama de concentraciones (1 a 1000 ng/ml) y únicamente se muestra la respuesta óptima. Los resultados se expresan como índice de migración (relación quimiocina/medio) y se representan los valores promedio obtenidos de los 3 a 10 experimentos independientes. La figura 3: Actividad potente de SDF-1 de quimiocina constitutiva y expresión elevada de CXCR4 en pDC. La figura 3 A muestra: respuesta de dosificación a SDF-1 de pDC. Los resultados se expresan como el número de células de migración y son representativos de 5 experimentos independientes. La figura 3 B muestra el análisis de: expresión de CXCR4 en pDC nuevamente aisladas o después de 2 horas de pre-incubación a 37°C. Los resultados son representativos de 5 experimentos independientes. La figura 3 C muestra los análisis de: varias poblaciones de DC para su respuesta a SDF-1 sobre una amplia gama de concentraciones (1 a 1000 ng/ml) y únicamente se muestra la respuesta óptima. La figura 3 D muestra el análisis de ARNm de CXCR4 mediante RT-PCR cuantitativo. Los resultados se normalizaron utilizando G3PDH como un estándar interno, y se expresan como fg/50ng de ARN total. Los valores representan promedios de 3 muestras independientes. La figura 4: pDC de humano expresan selectivamente CXCR3 y a niveles elevados diferentes a los receptores. La figura 4 A muestra la expresión superficial celular de CXCR3 en diferentes poblaciones de DC, que se determinó mediante citofluorimetría. Los resultados son representativos de más de cuatro experimentos independientes para cada población. La figura 4 B muestra la expresión ARNm de CXCR3 en diferentes poblaciones de DC que se determinó mediante RT-PCR cuantitativo como se describe en el ejemplo 1 y en la figura 3D. Los resultados se normalizaron utilizando G3PDH como un estándar interno, y se expresan como fg/50ng de ARN total. Los valores representan promedios de 3 muestras independientes. La figura 4 C muestra los resultados de los análisis de expresión de ARN de receptores de quimiocina en pDC de Facs clasificado determinado por RT-PCR cuantitativo como se describe en el ejemplo 1 y en la figura 3D. Los resultados se normalizaron utilizando G3PDH como un estándar interno, y se expresan como fg/50ng de ARN total. Los valores representan promedios de 3 muestras independientes.

La figura 5: Ligandos CXCR3 sinergizados con SDF-1 para inducir migración potente de pDC de humano. La figura 5 A: respuesta de dosificación a ligandos CXCR3 de pDC en presencia o ausencia de bajas dosis de SDF-1 (20 ng/ml). La figura 5 B: respuesta de dosificación a SDF-1 de pDC en presencia o ausencia de ligandos CXCR3 (1 g/ml). Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. Figura 6: DC plasmacitoides CD11c de humano primarias con ligandos CXCR3 al incrementar su sensibilidad a SDF-1. La figura 6 A muestra análisis ajedrezado, en donde los ligandos CXCR4 y CXCR3 se opusieron en pozos superiores e inferiores. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. La figura 6 B muestra experimentos de pre-incubación en donde las células se incubaron primero en presencia de ligandos CXCR4 o CXCR3 durante una hora antes de realizar la prueba de migración a ambos ligandos receptores. La figura 7: los ligandos CXCR3 y SDF-1 inducen migración de pDC de ratón. La figura 7 muestra la respuesta a quimiocinas en una prueba de migración de cultivos polarizados de DC plasmacitoides de ratón que se aislaron de la médula ósea, que se enriqueció por agotamiento de perlas magnéticas y se identificó con base en la tinción triple, CD11b-, CD11c+ GR1+. La figura 7 A muestra resultados expresados como índice de migración (relación quimiocina/medio) y representan los valores promedio obtenidos de 3 experimentos independientes. Cada quimiocina se analizó en una amplia gama de concentraciones (1 a 1000 ng/ml) y únicamente se muestra la respuesta óptima. La figura 7 B muestra las curvas de respuesta de dosificación de un experimento representativo. La figura 8: En comparación con otras poblaciones de DC, pDC expresa altos niveles de L-selectina, pero también expresan CLA. Los resultados son representativos de más de cuatro experimentos independientes para cada población. La figura 9: Las expresiones de CCR6 y CCR10 se inducen en DC plasmacitoides de humano en el cultivo en IL-3. Las DC plasmacitoides aisladas mediante Facs clasificado, se cultivaron en presencia de IL-3 durante 24 a 96 horas. La expresión CCR6 y CCR10 se siguió mediante citofluorimetría en los puntos de tiempo indicados. La figura 10: DC plasmacitoides migran en respuesta a CCL20/MIP-3 únicamente después del cultivo en IL-3 mientras adquieren sensibilidad a ligandos CCR10 en respuesta a diferentes factores de supervivencia. DC plasmacitoides aisladas mediante Facs-clasificado, se cultivaron durante 48 horas en presencia de IL-3, virus de influenza inactivo con PFA, ODN. La figura 10 A muestra expresión del receptor de quimiocina CCR6 y migración en pruebas de migración de cultivos polarizados en respuesta a CCL20/MIP-3oc. La figura 10 B muestra expresión del receptor de quimiocina CCR10 y migración en pruebas de migración de cultivos polarizados en respuesta a CCL27/CTACK y CCL28/MEC. La figura 11: Al contacto con el virus, PDC adquiere expresión CCR7 y actividad de ligando CCR7. PDC se cultivaron en un medio sólo o en presencia del virus de influenza inactivo con PFA (una unidad de hameglutina/mililitro) durante 2 horas. Posteriormente las células se procesaron como en la figura 1 para expresión del receptor de quimiocina (figura 11 A) y como en la figura 2 para sensibilidad a la quimiocina (figura 11 B). Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en su totalidad por referencia. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que las células dendríticas plasmacitoides (pDC) siguen las rutas de tráfico únicas en comparación con otros subgrupos de DC, y que estas rutas de tráfico se regulan mediante una combinación de quimiocinas específicas. Los inventores han demostrado que pDC despliegan un espectro diferente de la expresión del receptor de quimiocina en comparación con otros subgrupos de DC o poblaciones precursoras, y responde a combinaciones de quimiocinas únicas. Con base en este descubrimiento, los inventores proveen métodos para modular el agrupamiento de pDC mediante la administración de un agonista o antagonista de estos receptores, solos o en combinación con un antígeno relacionado con una enfermedad, un factor de supervivencia de pDC, y/o un agente de activación. En vista del papel principal de pDC al iniciar una inmunidad antiviral, estos métodos serán útiles para lograr inmunidad terapéutica potente en enfermedades tales como el cáncer. Los inventores demuestran en la presente que mientras pDC no responden a la mayoría de las quimiocinas inflamatorias, SDF-1 de ligando CXCR4 y los ligandos CXCR3, Mig, IP-10 y l-TAC son muy potentes para inducir la migración de pDC (ejemplos 1 , 3 y 5). De manera muy importante, los inventores han demostrado que los ligandos de CXCR3 se sinergizan con SDF-1 para inducir la migración de pDC de humano al disminuir el umbral de sensibilidad a SDF-1 (ejemplos 3 y 4). Además, se demuestra que la actividad de ligandos CXCR3 es independiente de una gradiente y actúan al iniciar las pDC para responder a bajas concentraciones de SDF-1 (ejemplo 4 figura 8). También se demuestra que tanto las pDC de humano (ejemplo 1 y 3; figuras 2 y 5) como las de ratón (ejemplo 5; figura 7) responden a ligandos CXCR3 y CXCR4. pDC también expresan CLA de molécula guía cutánea, sugiriendo una capacidad de entrar a los sitios inflamatorios de la piel periférica (ejemplo 6). Además, el análisis in vivo de expresión de quimiocina revela que, en sitios de inflamación, los ligandos CXCR3 se expresan mediante células endoteliales en contacto con células epiteliales básales, expresando SDF-1 (ejemplo 8), argumentando para un efecto secuencial: primeros ligandos CXCR3, y un segundo SDF-1 para agrupamiento de pDC. De esta manera, los inventores han provisto métodos para agrupar selectivamente pDC que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un agonista CXCR3 (que es altamente selectivo para pDC) en combinación con un agonista CXCR4 (que es menos selectivo, pero quimioatrayentes más potentes). Además, ya que la actividad de ligandos CXCR3 puede ser al menos en parte independiente de gradiente, (véase ejemplo 4 y figura 8), estas observaciones sugieren que el uso sistémico de agonistas CXCR3 en combinación con suministro local de agonistas CXCR4 puede ser altamente efectivo para mejorar una respuesta inmune. Si se desea el agrupamiento de pDC de bloqueo, los antagonistas CXCR3 y antagonistas CXCR4 pueden administrarse de conformidad con la invención. Se ha observado previamente que la migración de DC mieloides requiere gradientes secuenciales y de quimiocina complementarios; en particular DC de sangre circulante CCR2+/CCR6 o precursores se agrupan mediante ligandos CCR2 desde la sangre a los tejidos (Vanbervliet et al., 2001 , Eur J Immunol. 32 (1 ):231-42). De este modo, dependiendo del microentorno, otros receptores pueden subregularse (por ejemplo, CCR6 por medio de TGF-ß) permitiendo que las células alcancen el sitio de entrada de patógenos (por ejemplo, la piel o la mucosa). Para entender mejor los diferentes pasos de la migración de pDC, los inventores han investigado los efectos de reguladores clave conocidos de fisiología de pDC, en particular IL-3 de factor de supervivencia, en la expresión del receptor de quimiocina. Se ha concluido que pDC bajo estas condiciones expresan niveles elevados de CCR6 y CCR10, y responden a MIP-3oc de quimiocina (ejemplo 7). Ya que IL-3 es un factor de supervivencia para pDC, es más probable que in vivo, la expresión CCR6 y CCR10 en pDC represente un paso fisiológico de diferenciación de pDC. En estas condiciones, CXCR3 aún se expresa altamente, sugiriendo que los agonistas CXCR3 pueden ser capaces de sinergizarse con agonistas CCR6/CCR10. Además, los análisis in vivo de la expresión de quimiocina revelan que, en el sitio de inflamación, los ligandos CXCR3, SDF-1 , CTACK y MIP-3 forman gradientes complementarios, sugiriendo que la acción secuencial de quimiocinas para pDC alcanza el sitio de entrada de patógenos. Los ligandos CXCR3 se expresan mediante células endoteliales en contacto con células epiteliales básales que expresan SDF-1 y CTACK (Morales et al., 1999, PNAS 96:14470) y MIP-3a se expresa mediante la capa externa del epitelio (ejemplo 8). Por lo tanto, además de los métodos descritos anteriormente, la invención también provee métodos para tratar estados de enfermedad en donde se desea mejorar o modular una respuesta inmune que comprende administrar a un individuo en necesidad de los mismos una cantidad de un agonista CCR6 y/o un agonista CCR10, sólo o en combinación con un factor de supervivencia tal como IL-3 u otros factores que incluyen estos receptores. Los agonistas CCR6 y agonistas CCR10 también pueden administrarse en combinación con agonistas CXCR3 y agonistas CXCR4. La actividad específica de ligandos CCR6 y CCR10 en este tipo de célula único también permite el uso de antagonistas CCR6/CCR10 (con o sin antagonistas CXCR3/CXCR4) en patologías tales como autoinmunidad, alergia y transplante, pero también en algunos tipos de tumores y enfermedades infecciosas. Finalmente, al momento del contacto con los virus, pDC superregula rápidamente la expresión de CCR7 y adquiere sensibilidad al ligando CCR7 (véase ejemplo 9), sugiriendo que después del agrupamiento local y activación, estas células tendrán la capacidad de emigrar en el ganglio linfático a través de la corriente linfática, un procedimiento controlado por CCR7 y sus ligandos (Sallusto et al., 2000, Immunol. Rev 177:134; Sozzani et al., 2000, JCI 20:151). De este modo, la combinación de agonistas del receptor de quimiocina que permite el agrupamiento de pDC, junto con señales que inducen la activación de pDC, facultará a las pDC para emigrar al ganglio linfático a través de la corriente linfática, e inducir respuestas inmunes en los ganglios linfáticos. Dependiendo de su estado de activación, pDC han demostrado inducir respuestas inmunes Th-2 (Rissoan ef al., 1999, Science 283:1 83) o respuestas inmunes Th-1 (Kadowaki et al., 2000, JEM 192:219; Liu ef al., 2001 , Nature Immunol 2:585). De este modo, dependiendo del contexto, los agonistas y antagonistas de receptores de quimiocina que se expresan selectivamente en pDC pueden utilizarse para inducir o suprimir la migración de pDC con el fin de modular la inmunidad. De este modo, una aplicación de los descubrimientos establecidos en la presente son métodos para utilizar agonistas de estos receptores específicos de pDC para mejorar ia respuesta inmune mediante el agrupamiento de pDC y activarlos, como se desee en el caso de cáncer y enfermedades infecciosas. En este contexto, el objetivo es agrupar y activar pDC al sitio de expresión de antígeno, y estos métodos pueden incluir opcionalmente la administración de un factor de supervivencia y/o un agente de activación que promueve la supervivencia de pDC y faculta a los mismos para iniciar la inmunidad a través de la activación de células T no afectadas. En otras circunstancias, los agonistas del receptor de quimiocina también pueden utilizarse para inducir tolerancia inmune. Se ha reportado que las DC inactivadas inducen tolerancia inmune, probablemente a través de la inducción de células T de regulación (Jonuleit H., 2001 , Trends Immunol 22:394; Bell E., 2001 , Trends Immunol 22:11 ; Roncarolo M.G., 2001 , JEM 193:F5; Jonuleit H., 2000, JEM 162:1213). Además, pDC han demostrado inducir las células T de secreción de IL-10 (Rissoan M.C., 1999, Science 283:1183; Liu Y. J., 2001, Nature Immunol 2:585) y células T de regulación de CD8 (Gilliet et al. IL-10-producing CD8+T supressors Cells induced by Plasmacytoid-derived DC, Submitted). De este modo la presente invención también provee métodos para utilizar agonistas del receptor de quimiocina para disminuir la respuesta inmune, como sería deseable en el caso de autoinmunidad, alergia y transplante. En este contexto, la meta es agrupar pDC inactivado; por ello, esos métodos no incluyen la administración de un agente de activación. De igual manera, los antagonistas del receptor de quimiocina se pueden utilizar para tratar diferentes estados de enfermedad. En estados de enfermedad como la autoinmunidad, la alergia y el transplante, se pueden utilizar los antagonistas para disminuir el agolpamiento de pDC activado. Como ejemplo, recientemente se ha asociado el pDC con enfermedades autoinmunes, en particular Lupus (Farkas et al., 2001 , Am. J. Pathol. 159:237). Sin embargo, también se pueden utilizar los antagonistas en ciertos cánceres cuando se desearía el agrupamiento de pDC de bloqueo. Por ejemplo se ha reportado el agrupamiento activo de pDC en tumores ováricos (Curiel et al., Kestone Symposia March 12-18 2001 ; Dendritic cells, interfaces with ¡mmunobiology and medicine), lo que demuestra que pDC puede ser favorable para el desarrollo de tumores en ciertas circunstancias, probablemente mediante la inducción de respuestas inmunes regulatorias. En estos casos, se sospecha que el ambiente del tumor previene la activación de pDC. Así, aplicarían métodos para tratar estos estados de enfermedad que comprenden administrar antagonistas de receptor de quimiocina. Así, los agonistas y antagonistas del receptor de quimiocina descritos en la presente pueden utilizarse de conformidad con la invención para inducir de manera selectiva o suprimir el agrupamiento de pDC. Se pueden utilizar combinaciones de agonistas de CXCR3, CXCR4, CCR6 y/o CCR10 y factores de supervivencia, con o sin un antígeno asociado con la enfermedad con o sin un agente de activación, para tratar los estados de enfermedad en los cuales se desea potenciar o modular una respuesta inmune. Se pueden utilizar combinaciones de antagonistas de CXCR3, CXCR4, CCR6 y/o CCR10 cuando se desee bloquear la función pDC al interferir con la migración pDC. El receptor de quimiocina CXCR4 (NPY3R) es un coreceptor con CD4 (186940) para el virus de inmunodeficiencia humana trópico con líneas de células T-linfocito tipo 1 (VIH-1 ) (Feng et al., 1996, Science 272:1955-58). Se ha encontrado que se expresa en gran medida en células de cáncer de mama humano primario y metastático, pero no se puede detectar en tejido mamario normal (Muller et al, 2001 , Nature 410:6824). Análisis histológicos y cuantitativos de PCR mostraron que se podría disminuir de manera importante la metástasis de células de cáncer de mama ortotópicamente inyectadas en ratones SCID mediante tratamiento con anticuerpos anti-CXCR4. Los factores estromales derivados de células 1-alfa y 1-beta (SDF-1) (número de acceso Swiss-prot P20991 ) es el ligando principal para CXCR4 (Nishikawa et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18(11 ): 1767-71). Las proteínas SDF-1 alfa y beta de ratón son idénticas en los aminoácidos de N-terminal 89, pero la forma beta tiene 4 residuos adicionales en la C-terminal. Número de acceso Swiss prot P30991. El SDF-1 humano conlleva aproximadamente una identidad de 92% a las proteínas de ratón (Shirozu et al., 1995, Genomics 28(3):495-500). Las isoformas alfa y beta y humanas son una consecuencia del empalme alternativo de un gen individual; la forma alfa se deriva de exones 1-3 mientras que la forma beta contiene la secuencia adicional de exon 4. Se ha mostrado que SDF1 es un quimioatrayente de linfocitos altamente eficaz (Bleul et al., 1996, J. Exp. Med 184(3):1101-9; Bleul et al., 1996, Nature 382(65994):829-33). CXCR3 es un receptor de quimiocina cuya expresión está limitada a IL-2 y a linfocitos T activos (ver WO 98/11218, publicado el 19 de Marzo de 1998). Ligandos de CXCR3 conocidos incluyen IP-10, Mig e l-TAC.

Se ha mostrado que CXCR3 se expresa preferentemente mediante células Th-1 (Campbell et al., 2000, Arch. Immunol. Ther. Exp. 48:451-6) y células NK (Taub et al., 1995, J. Immunol. 164:3112-22). Los ligandos de CXCR3 tiene actividad anti-angiogénica y representan el mediador final en la acción anti-tumores de una cascada de citocina que involucra IL-12 y IFNa (Narvaiza et al., 2000, J. Immunol. 164:3112-22; Sgadari et al., 1996, Blood 87:3877-82; Kanegane et al., 1998, J. Leukoc. Biol. 64:384-92). IP-10 (CXCL10, número de acceso Swiss-Prot P02778 para proteína humana), Mig (CXCL9, número de acceso Swiss-Prot Q07325 para proteína humana) e l-TAC (CXCL11 , número de acceso Swiss-Prot 014625 para proteína humana) son 3 ligandos para CXCR3 (Farber et al., 1997, J.

Leukoc. Biol. 61 :246-57; Colé et al., 1998, J. Exp. Med. 187:2009-21 ).

Inicialmente se reportó a IP-10 y Mig como genes inducidos por IFNy (Colé et al., 1998, J. Exp. Med. 187:2009-21 ; Luster et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1084-97; Farber et al., 1990, Nat'IAcad. Sci. 87:5238-42). IP-10 y Mig son inducidos en el ataque viral (Salazar-Mather et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:985-93) y también pueden expresarse en ausencia de IFNy (Mahalingam et al., 2001 , JBC 276:7568).

Se expresa el receptor de quimiocina de CCR6 mediante 40-50% de células T con memoria de sangre periférica, pero no afectado, en particular de células T con propiedades de guía epitelial (ver WO98/01557; Fitzhugh et al., 2000, J. Immunol. 165:6677-6681 ). También se sabe que el ligando para CCR6, MIP-3a, es LARC, éxodo y CCL20 (Filtzhugh et al., 2000, J. Immunol. 165:6677-6681 ). MIP-3a es uno de un pequeño número de quimiocinas que incluyen SDF-1 , 6Ccina y TARC de las que se ha demostrado inducen la detención de linfocitos bajo condiciones de flujo fisiológicas (Campbell et al., 998, Science 279:381 ; Campbell et al., 1999, Nature 400:776; Tangemann et al., 1998, J. Immunol. 161 :6330). Se puede encontrar la secuencia de aminoácidos de MIP-3 alfa en el acceso U77035.1 , Rossi et al., 1997, J. Immunol. 158:1033. Entre las poblaciones DC, se ha reportado que CCR6/MIP-3a está involucrado de manera selectiva en la migración de células Langerhans a la piel (Dieu et al., 1998, J. Exp. Med 188(2):373-86; Dieu-Nosjean et al., 2000, J. Exp. Med. 192(5):705-18; Charbonnier et al, 1999, J. Exp. Med., 190(12): 1755-68), así como en los subconjuntos de DC epitelial del intestino (Iwasaki et al, 2000, J. Exp. Med. 191 (8):1381 ; Cook et al., 2000, Immunity 12(5)495-503). Adicionalmente, la expresión de Mip-3 ¡n vivo se restringe al epitelio inflamado (Dieu et al., 1998, J. Exp. Me 188(2):373-86, Dieu-Nosjean et al., 2000, J. Exp. Med. 192(5):705-18; Tanaka et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29(2):633-42). Se describe el receptor de quimiocina CCR10 en Bonini et al., 1997, DNA Cell Biol. 16(10):12499-56. Ligandos CCR10 conocidos incluyen la quimiocina CTACK/CCL27 (número de acceso Swiss-prot Q9Y4X3), una quimiocina asociada con la piel que preferiblemente atrae células T con memoria de guía hacia la piel (Morales et al., 1999,. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:14470; Homey et al., 2000, J. Immunol. 164(7):3455-70). De manera más reciente, se ha identificado la quimiocina epitelial asociada con mucosa (MEC/CCL28) (número de acceso swissprot Q9NRJ3), que se expresa en diversos tejidos mucosos, como un ligando de quimiocina novedoso para CCR10 (Pan et al., 2000, The Journal of Immunology, 2000, 65:2943-2949). Un "agonista del receptor de quimiocina" para su uso en la invención es un agente que es activo en un subconjunto restringido de DC, en particular pDC, mediante un receptor expresado en pDC, como el receptor de CXCR3, CXCR4, CCR6 o CCR10. El término abarca proteínas naturales del cuerpo como los ligandos de quimiciona de los receptores de CXCR3, CXCR4, CCR6 y CCR10. Los inventores han identificado varias de estas quimiocinas, que incluyen, pero no se limitan a IP-10, Mig, l-TAC, SDF-1 , MIP-3a, CTACK/CCL27 y MEC/CCL28. De conformidad con las quimiocinas descritas en la presente, se pueden utilizar otros ligandos de CXCR3, CXCR4, CCR6 y CCR10 en los métodos de la invención. El término también incluye variantes de dichas quimiocinas. Dichas variantes continuarán poseyendo la actividad quimioatrayente de pDC deseada que se discutió anteriormente. Las variantes se refieren a un polipéptido derivado de la proteína nativa mediante la deleción o adición de uno o más aminoácidos al extremo de N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; deleción o adición de uno ó más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Dichas variantes incluyen mutantes, fragmentos, variantes alélicas, ortólogos homólogos y fusiones de proteína nativa. También se pueden modificar los agonistas del receptor de quimiocina mediante glicosilación, fosforilación, sustitución de análogos de aminoácido no naturales y similares. Adicionalmente, se puede llevar a cabo la selección del ligando utilizando receptores o fragmentos de CXCR3, CXCR4, CCR6 y CCR10 para identificar las moléculas que tengan afinidad de unión a los receptores. Posteriormente se pueden utilizar los ensayos biológicos subsecuentes para determinar si un agonista putativo puede proveer actividad. Si un compuesto tiene actividad estimulante intrínseca, puede activar el receptor y es así un agonista en el sentido de que estimula la actividad de los receptores o imita la actividad del ligando, por ejemplo, induciendo la señalización. También se pueden identificar agonistas del receptor de quimiocina que son pequeñas moléculas mediante procedimientos de detección conocidos. En particular, se conoce bien en la técnica cómo detectar pequeñas moléculas que se unen específicamente a un objetivo dado, por ejemplo moléculas asociadas con tumores como receptores. Ver por ejemplo Meetings on High Troughput Screening, International Business Communications, Southborough, MA 01772-1749. Un "antagonista del receptor de quimiocina" para su uso en la invención es un agente que disminuye la migración de un subconjunto restringido de DC, en particular pDC, al bloquear la actividad del receptor de CXCR3, CXCR4, CCR6 o CCR10. El término incluye ambos antagonistas del(los) receptor(es) y antagonistas del(los) ligando(s). Se puede derivar un antagonista del receptor de quimiocina de la invención a partir de anticuerpos o comprender fragmentos de anticuerpos. Adicionalmente, cualesquiera antagonistas de moléculas pequeñas, secuencias de nucleótidos antisentido, secuencias de nucleótidos incluidas en vectores de suministro de gen como vectores adenovirales o retrovirales que disminuyen la migración de pDC entrarían dentro de esta definición. De manera similar, se pueden utilizar formas solubles del receptor de CXCR3, CXCR4, CCR6 y CCR10 que no cuenten con los dominios de transmembrana. Finalmente, se pueden utilizar formas de antagonista mutante de los ligandos naturales que se unen fuertemente a los receptores correspondientes pero que están desprovistos esencialmente de la actividad biológica. Se pueden producir muchos otros antagonistas del receptor de quimiocina. Se pueden desarrollar ensayos de unión del receptor. Ver por ejemplo, Bieri et al., 1999, Nature Biotechnology 17:1105-1108, y observación adjunta en la página 1060. Se pueden desarrollar ensayos de flujo de calcio para detectar los compuestos que poseen actividad antagonista. Los ensayos de migración pueden aprovechar los movimientos de células a través de poros en membranas, que pueden formar la base de ensayos de antagonista. De ahí se puede medir la quimiotaxis. Alternativamente, se pueden desarrollar ensayos quimiocinéticos, los cuales miden la inducción de movimiento cinético, no necesariamente relacionado con un gradiente en sí. También se pueden identificar los antagonistas del receptor de quimiocina que son moléculas pequeñas mediante procedimientos de detección conocidos. En particular se conoce bien en la técnica cómo detectar moléculas pequeñas que se unen específicamente a un objetivo dado, por ejemplo moléculas asociadas con tumores como receptores. Ver por ejemplo Meetings on High Troughput Screening, International Business Communications, Southborough, MA 01772-1749. Un "factor de supervivencia" para el uso en esta invención se define como un agente que provee señales que promueven la supervivencia de pDC y que permiten un programa de diferenciación de pDC, incluyendo la apariencia de propiedades de guía hacia la piel y la expresión del receptor de quimiocina. Ejemplos de factores de supervivencia incluyen, pero no se limitan a productos naturales del cuerpo como IL-3, o IFN y ligandos RANK, que son factores de supervivencia para pDC sin inducir su maduración. Un "agente de activación" para su uso en la invención se define como una porción que es capaz de activar, inducir o estimular la maduración de pDC. Tales agentes proveen señales de maduración que promueven la migración a partir de los tejidos a los nodulos linfáticos y posibilitan a pDC activar las células T sin afección. Ejemplos de agentes de activación incluyen, pero no se limitan a, un producto natural del cuerpo como IFNa, TNF-a, ligando de RANK, ligando de CD40 o un ligando de otros miembros de la familia de receptores TNF/CD40, o un anticuerpo de agonista que reconozca una estructura específica en DC como un anticuerpo anti-CD-40/RANK, u otra sustancia. La sustancia de activación también puede ser una secuencia de ácidos nucleicos que contengan residuos CpG no metilados o agonistas de un receptor tipo Toll que se sabe estimula DC. En la modalidad de la invención donde el agonista/antagonista del receptor de quimiocina y/o antígeno se suministra mediante un vector plásmido, estas secuencias de ácido nucleico pueden ser parte del vector. Se puede administrar un agonista o antagonista del receptor de quimiocina ya sea solo o en combinación con uno o más agonistas o antagonistas del receptor de quimiocina adicionales. Se puede suministrar o administrar el agonista/antagonista del receptor de quimiocina en el mismo sitio o en un sitio diferente (sistémico contra local), y se puede administrar al mismo tiempo que uno o más agonistas o antagonistas del receptor de quimiocina, o después de una demora que no exceda 48 horas. La administración concurrente o combinada como se utiliza en la presente quiere decir que la quimiocina y el antígeno se administran al sujeto ya sea (a) simultáneamente en el momento, o (b) en tiempos diferentes durante el curso de un programa de tratamiento común. En este último caso, los dos compuestos son administrados en un tiempo relativamente breve entre ambos para lograr el efecto deseado. El modo de suministro de los diferentes agonistas del receptor de quimiocina y antagonistas del receptor de quimiocina puede ser mediante inyección, incluyendo intradérmica, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intravenosa o por boca, o tópica, como un ungüento o un parche. También se pueden suministrar los agonistas/antagonistas del receptor de quimiocina como una secuencia de ácido nucleico por vía de un vector, como un vector viral (por ejemplo adenovirus, poxvirus, retrovirus, lentivirus) o un ADN plásmido por ingeniería genética. Se pueden administrar los agonistas/antagonistas del receptor de quimiocina solos o combinados con sustancias que permitan su liberación lenta en el sitio de suministro (depósito). Se pueden administrar los agonistas/antagonistas del receptor de quimiocina localmente o sistémicamente. También se pueden administrar los agonistas/antagonistas del receptor de quimiocina como parte de una estructura objetivo que comprende un agonista o antagonista del receptor de quimiocina y una porción objetivo diseñada para reconocer o enfocar un antígeno asociado con enfermedad como un antígeno asociado con un tumor o una estructura expresada específicamente medíante componentes no cancerosos de un tumor, como la vasculatura del tumor. Ejemplos de porciones objetivo incluyen pero no se limitan a péptidos, proteínas, moléculas pequeñas, vectores, anticuerpos o fragmento de anticuerpo (ver por ejemplo Melani et al., 1998, Cáncer Res. 58:4146-4154). En una modalidad particularmente preferida de la invención, se administra el agonista del receptor de quimiocina o antagonistas del receptor de quimiocina con un antígeno asociado con la enfermedad. El antígeno puede ser cualquier porción molecular contra la cual se busca un incremento o decremento en la respuesta inmune. Esta incluye antígeno derivados de organismos que se sabe ocasionan enfermedades en el hombre o animal como bacterias, virus, parásitos y hongos. Esto también incluye antígenos expresados mediante tumores (antígenos asociados con tumores) y antígenos de plantas/alimentos (alérgenos) así como autoantígenos (autoinmunidad). Los antígenos asociados con tumores para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a Melan-A, tirosinasa, p97 ß-HCG, GalNAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1 , MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antígeno de melanona gp75, Hker 8, antígeno de melanoma de peso molecular elevado, K19, Tyr1 y Tyr2, miembros de la familia de genes pMel 17, c-Met-Psa, PSM, cc-fetoproteína, tiroperoxidasa, gp100, NY-ESO-1 , telomerasa y p53. Esta lista no pretende ser exhaustiva, sino meramente ejemplar de los tipos de antígenos que se pueden utilizar en la práctica de la invención. Se pueden utilizar diferentes combinaciones de antígenos que muestren la función óptima con diferentes grupos éticos, sexo, distribuciones geográficas y etapas de la enfermedad. En una modalidad de la invención por lo menos se administran dos o más antígenos diferentes en conjunción con la administración de quimiocina.

Adicionalmente, se puede administrar una proteína de fusión que consista de agonistas de un receptor de quimiocina como IP-10, Mig, l-TAC, MIP-3oc, CTACK, SDF-1 o una porción de los mismos y un antígeno. Se puede tratar tanto cáncer primario como metastático de conformidad con la invención. Tipos de cánceres que se pueden tratar incluyen perro no se limitan a aquellos que afectan: la cavidad oral y la faringe (lengua, boca, faringe, otros), sistema digestivo (esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, ano/ano y recto, hígado/conducto biliar intrahepático, vesícula biliar/otros biliares, páncreas, otros), sistema respiratorio (laringe, pulmón/bronquios, otros), cabeza y cuello, huesos y articulaciones, tejidos lisos (incluyendo corazón), piel (carcinoma basal y escamoso, melanoma, otros, mama, sistema genital (cerviz uterina, cuerpo uterino, ovario, vulva, vagina, testículo prostético, pene, otros), sistema ordinario (vejiga urinaria, riñón/pelvis renal), uretra, otros), ojo y órbita, cerebro y sistema nervioso, sistema endocrino (tiroides, otros), sistema sanguíneo/hepatopoyético (linfoma de Hodgkin, linfoma diferente a Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia linfocítica aguda, leucemia limfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, otra leucemia). Los cánceres pueden ser de diferente origen celular (por ejemplo carcinoma, melanoma, sarcoma, leucemia/linfoma, etc.) y pueden ser de cualquier etiología conocida o desconocida (por ejemplo rayos solares, virus, uso de tabaco/alcohol, profesión, nutrición, estilo de vida, etc.). El término "carcinoma" se refiere a malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos que incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino. Metastático, como se utiliza este término en el presente, se define como la dispersión del tumor a un sitio distante del tumor primario incluyendo ganglios linfáticos regionales. Se puede administrar convenientemente un factor de supervivencia u otra porción diseñada para inducir la expresión del receptor de quimiocina en pDC. También se puede administrar un agente de activación u otra porción diseñada para activar, inducir o estimular la madurez de pDC. En general, la(s) quimiocina(s) y/o antígeno(s) y/o factor(es) de supervivencia/agente(s) de activación y/o citocina(s) se administra(n) como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de quimiocina(s) y/o antígeno(s) y/o agente(s) de activación y/o citocina(s) en un portador farmacéutico. Estos agentes reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes adicionales activos o inertes, por ejemplo, en portadores o diluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo adyuvantes ¡nmunogénicos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Un portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible y no tóxica adecuada para suministrar composiciones de la invención a un paciente. Las cantidades de agentes reactivos necesarios para la terapia efectiva dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Así, se deben titular las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. Las pruebas en animales de dosis efectivas para el tratamiento de cánceres particulares proporcionarán un indicativo de pronóstico adicional para la dosis humana. Se describen diversas consideraciones por ejemplo en Gilman et al., (eds.) (1990) Goodmanand Gilman's; The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA. Se discuten en éstos métodos de administración y a continuación, por ejemplo para administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otras. Portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, reguladores de pH y otros compuestos descritos, por ejemplo en Merck Index Merck & Co., Rahway, New Jersey. Se pueden utilizar formulaciones de liberación lenta o un aparato de liberación lenta para una administración continua. Se podría esperar escalas de dosis para agonista(s) y antagonista(s) del receptor de quimiocina y/o antígeno(s) y/o agente(s) de supervivencia y/o agente(s) de activación en cantidades menores a concentraciones de 1 mM, típicamente menores de alrededor de concentraciones de 10 µ?, usualmente menos de alrededor de 100 nM, preferiblemente menos de alrededor de 10 pM (picomolar), y preferentemente menos de alrededor de 1 fM (fentomolar), con un portador apropiado. Generalmente, se inicia el tratamiento con dosis pequeñas que son menores que la dosis óptima del compuesto. Posterior a esto, se aumenta la dosis en incrementos pequeños hasta que se alcance el efecto óptimo bajo la circunstancia. La determinación de la dosis apropiada y régimen de administración para una situación particular está dentro de la experiencia de la técnica. Modalidades preferidas consisten de pero no se restringen a la administración de una proteína recombinante de lp-10, Mig, o l-TAC solas, o junto con SDF-1 , opcionalmente en combinación con un factor de supervivencia y/o agente de activación o combinado con sustancias que permitan su liberación lenta en el sitio de suministro (depósito); proteínas de fusión que consisten de IP-10, Mig o l-TAC, o una fracción de IP-10, Mig o I-TAC y un antígeno (péptido de más de 9 aminoácidos o proteína u otra porción antigénica); vector de ADN o viral codificado para IP-10, Mig o l-TAC o fracción de IP-10, Mig o l-TAC con o sin un antígeno (péptido con más de 9 aminoácidos o proteína u otra porción antigénica), o una secuencia de ácido nucleico incluida en un vector de suministro. Otras modalidades preferidas incluyen administración de una proteína MIP-3a, CTACK o MEP recombinante, en combinación con un factor de supervivencia o agente de activación, solo o combinado con sustancias que permitan su liberación lenta. En todas las modalidades preferidas, se pueden administrar los agonistas del receptor de quimiocina en combinación con antígeno, con o sin un agente de activación.

EJEMPLOS Se puede ilustrar la invención mediante los siguientes ejemplos no restrictivos, que se pueden entender de manera más fácil mediante referencia a los siguientes materiales y métodos.

Factores hematopovéticos, agentes reactivos y anticuerpos rhGM-CSF (actividad específica: 2. 06 U/mg, Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ), rhTNF (actividad especifica: 2 x 107 U/mg, Genzyme, Boston, MA), rhSCF (actividad específica: 4x105 U/mg, R&D Systems, Abington, Reino Unido), y rhlL-4 (actividad específica: 2.107 U/mg, Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ) fueron utilizados en las concentraciones óptimas de 100 ng/ml, 2.5 ng/ml, 25 ng/ml; y 50 U/ml, respectivamente. Las quimiocinas humanas recombinantes fueron proporcionadas por R&D Systems y se utilizaron en una concentración óptima: MCP1/CCL2 (10 ng/ml), MCP2/CCL8 (100 ng/ml), MCP3/CCL7 (100 ng(ml), MCP4/CCL13 (1 ng/ml), MIP3a/CCL20 (1 ng/ml), RANTES/CCL5 (10 ng/ml), MIP1a/CCL3 (10 ng/ml), MIPp/CCL4 (100 ng/ml), MIP15/CCL15 (100 ng/ml), Eotaxin/CCL11 (1 ng/ml), TARC/CCL17 (10 ng/ml-1 ng/ml), MDC/CCL22 (10 ng/ml-1 ng/ml), IP3 /CCL19 (1 ng/ml), 6Ccina/CCL21 (1 g/ml), I309/CCL1 (10 ng/ml-1 ng/ml), IL8/CXCL8 (10 ng/ml-1 ng/ml), IP10/CXCL10 (10 ng(ml-1 ng/ml), MIG/CXCL9 (10 ng/ml-1 ng/ml), SDF1a CXCL12 (100 ng/ml) y Fractalcina/CX3CL1 (10 ng/ml). Se compró CCR3 antihumano específico conjugado con PE (clon 61628.111) a R&D Systems. CXCR4 antihumano PE (clon 51505.1 1 ), CCR5 (clon 2D7), CCR6 (clon 1 1A9), y CXCR3 (clon 1C6) se obtuvieron con Pharmingen (San Diego, CA). Se revelaron el CCR1 antihumano acoplado con biotina (clon 53504.111 ) y CCR2 (clon 48607.211 ) con R&D Systems, mediante estreptavidina (DAKO) conjugada con PE. Anti-CCR7 (clon 2H4) fue un anticuerpo monoclonal IgM de ratón (Pharmingen) revelado mediante IgM antiratón de cabra acoplado con biotina (Caltag). Primero se validó la especificidad de todos los anticuerpos en diferentes subconjuntos de células sanguíneas. El Anti-CD83 conjugado con PE se obtuvo con Immunotech, y anti-lL-3Ra, anti-CLA, y anti-CD62L se consiguieron con Pharmingen.

Enriquecimiento para PC plasmacitoide CD 1c- y PC mieloide de CP11c+a partir de sangre periférica Se prepararon PC plasmacitoide CD 1 c- de sangre circulante (pPC) y DC de CD11c+ mieloide a partir de sangre periférica como se describe anteriormente (Grouard et al., 1997. J. Exp. Med. 185 (6):1 01-11 11 ; Grouard et al., 1996, Nature 384:364-367). En resumen, se aislaron células mononucleares de sangre periférica mediante Ficoll-Hypaque y se eliminaron las células positivas de linaje utilizando anticuerpos anti-CD3 (OKT3), anti-CD19 (4G7), anti-CD14 (MOP9), anti-CD56 (NKH1 , Coulter), anti-CD16 (ION16, Immunotech), anti-CD35 (CR1 , Immunotech), y anti-glicoforina A (JC159, DAKO) y esferas magnéticas (Dynabeads, revestidas con Ig antiratón, Dynal). Todos los procedimientos de agotamiento y tinción se llevaron a cabo en presencia de 0.5 mM EDTA. La población enriquecida contuvo entre 10-30% CD C- pDC y 15 a 25% de DC mieloide CD1 1c+ identificado en la expresión de HLA-DR (tricolor, Becton Dickinson), CD1 1c (PE, Becton Dickinson) y ausencia de marcadores de linaje (FITC) CD1 a (Ortho Diagnostic System, Raritan, NJ); CD14, CD15, CD57, CD16, CD20, CD3 (Becton Dickinson). Para algunos experimentos se purificaron adicionalmente las células mediante clasificación Facs con base en la tinción triple arriba mencionada y el nuevo análisis de las poblaciones HLA-DR+, CD11c y HLA-DR+, CD11c+ clasificadas mostraron una pureza mayor a 95%.

Generación de DC a partir de HPC CD34* de sangre de cordón v monocitos Se cultivaron células CD34+ aisladas de fracciones mononucleares de sangre de cordón mediante selección positiva según se describe (Caux et al., 1990, Blood 75:2292-2298; Caux et al., 1996, J. Exp. Med. 184:695-706), en presencia de SCF, GM-CSF y TNFa y suero humano AB+ al 5% según se describe en Caux er a/., 1996, J. Exp. Med. 184:695-706, en un medio completo libre de endotoxina que consistía de RP 1 1640 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (v/v) (FBS) (Flow Laboratories, Irvine, Reino Unido), 0 mM Hepes, 2 mM L-glutamina, 100 µg/ml gentamicina (Schering-Plough, Levallois, Francia). Se mantuvieron las condiciones óptimas hasta el día 6 al dividir estos cultivos en el día 4 en las mismas condiciones. Se utilizaron rutinariamente las células utilizadas en el día 6 para experimentos de migración, análisis de expresión del receptor de quimiocina y/o clasificación FACS. Monocitos purificados mediante agotamiento inmunomagnético (Dynabeads, Dynal Oslo, Noruega) según se describe en Dieu et al., 1998, J. Exp. Med. 188:1-14. Se produjeron células dendríticas derivadas de monocitos al cultivar monocitos purificados durante 6-7 días en presencia de GM-CSF y IL-4 (Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118).

Enriquecimiento para PC plasmacitoide de ratón a partir de médula ósea Se aislaron DC plasmacitoide de ratón a partir de médula ósea, enriquecida mediante el agotamiento de esferas magnéticas y se identificaron con base en la tinción triple CD11b-, CD11c+, GR1+. Se utilizaron pDC de ratón para el ensayo de migración en experimentos de cultivos polarizados.

Ensayos de quimiotaxis en cultivos polarizados Se llevaron a cabo ensayos de migración utilizando cultivos polarizados (diámetro de 6.5 mm, COSTAR, Cambridge, MA) con 5x105 células/pozo. Primero se preincubaron poblaciones de DC de sangre enriquecida durante 2 horas a 37°C y posteriormente se colocaron durante 2 horas en insertos con tamaño de poro de 3 µ?? y se reveló la migración mediante tinción triple regulada en linaje CD11c7HLA-DR7 y CD1 1c7HLA- D 7. Se incubaron los precursores DC derivados de CD34+ HPC del día 6 durante 1 hora en insertos con tamaño de poro de 5 µ?? y se analizaron las células migrantes mediante tinción doble, ya sea para CD1a y CD14. Se incubaron DC derivados de monocitos y monocitos durante 2 horas en insertos de tamaño de poro de 5 µ?? y se reveló la migración mediante tinción CD14 y/o CD1a. En algunos experimentos se llevaron a cabo análisis ajedrezados en donde los ligandos CXCR4 y CXCR3 estaban opuestos en pozos superiores e inferiores. En otros protocolos se llevaron a cabo experimentos de preincubación en donde las células primero fueron incubadas en presencia de ligandos de CXCR4 o CXCR3 durante 1 hora antes de llevar a cabo el ensayo de migración para ambos ligandos de receptor.

Cultivo de pDC con virus desactivado de influenza. Se preincubaron células (1 x 106/ml) en presencia de virus de influenza inactivado con paraformaldehído (cepas Beijing 262/95, 1 unidad de hemaglutinación/ml) en medio completo, con o sin IL-3, durante 2 horas a 37°C. Posteriormente se lavaron las células dos veces en medio completo antes del ensayo de migración en cultivo polarizado.

Análisis PCR (TaqMan) cuantitativos en tiempo real de la expresión HRNm del receptor de quimiocina Se prepararon las células como se describió anteriormente, y se extrajo el ARN total mediante el método de tiocianato de guanidinio como lo menciona el fabricante (sistema de aislamiento de ARN RNAgents, Promega). Se trataron 4 µg de ARN con Dnasa I (Boehringer, Mannheim, Alemania) y se transcribieron a la inversa con oligo DT14-18 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y cebadores hexámeros aleatorios (Promega, Madison, Wl) utilizando protocolos estándares. Se diluyó ADNc a una concentración final de 5 ng/µ?. Se amplificaron 10 µ? de ADNc en presencia de 12.5 µ? de mezcla maestra universal TaqMan (Perkin Elmer, Foster Citu, CA), 0.625 µ? de sonda TaqMan específica para gen, 0.5 µ? de cebadores inversos y delanteros específicos para gen y 0. 5 µ? de agua. Como control positivo interno, se añadieron a cada reacción 0.125 µ? de sonda TaqMan especificada 18S ARN y 0.125 µ? de cebadores inversos y delanteros específicos para 18S ARN. Se obtuvieron cebadores específicos y sondas para quimiocinas y receptores de quimiocina de Perkin Elmer. Las sondas específicas para genes utilizaron FAM como indicador, mientras que las sondas para el control positivo interno (18S ARN) se asociaron con los indicadores JOE o VIC. Las muestras pasaron por las siguientes etapas: etapa 1 , 50°C durante 2 minutos, etapa 2, 95°C durante 10 minutos y etapa 3, 95°C durante 15 segundos seguidos por 60°C durante 1 minuto. La etapa 3 se repitió 40 veces, se midieron los productos PCR específicos para gen mediante un sistema ABI PRISM/-E 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer), continuamente durante 40 ciclos. Se confirmó la especificidad de la combinación de sonda de cebador en estudios de reactividad cruzados contra plásmidos de otros receptores de quimiocina conocidos (CCR1-CCR10, CXCR1-CXCR5, XCR1, CX3CR1). Se normalizó la expresión del gen objetivo entre diferentes muestras con base en los valores de la expresión del control positivo interno.

Inmunohistoquímica Se fijaron secciones de tejido congelados 6 pm (amígdalas y piel humanas) en acetona (y en paraformaldehído a 4% para tinción IP3a) antes de la inmunotinción. Para bloquear las actividades no específicas, se pretrataron las secciones con avidina D y soluciones de biotina (Blocking kit, Vector, Biosys SA, Compiégne, Francia) durante 10 minutos en cada paso y con peróxido de hidrógeno al 0.3% (Sigma, Chemical Co„ St Louis, O) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un breve lavado en PBS, se incubaron las secciones con suero de bloqueo (suero de conejo normal al 2%, misma especie que el anticuerpo secundario) durante por lo menos 30 minutos antes de añadir ambos anticuerpos primarios. Se inmunotiñeron secciones con dos de los siguientes anticuerpos (simultáneamente): anticuerpos monoclonales de ratón anti-hMIP-3cc policlonal (IgG, R&D System Inc de cabra), antih- ig (mlgG1 , clon 49106.11 , R&D System Inc), anti-hSDF1 (mlgG2a, clon K15C, Amara AlU.Biol.chem. 1999,vol274,p23916-23925) y anti-hMIP-3a (lgG1 206D9, R&D System Inc.), ant¡-hCD11c (lgG1 , clonKB90, Dako, Glostrup, Dinamarca), Ant-hE-cadherina (lgG1 , HECD-1 , Takara), anti-hCD105 (lgG1, clon 266, Pharmingen) durante 1 hora a temperatura ambiente en una atmósfera húmeda. Se detectó la unión de IgG de cabra mediante IgG anticabra de conejo biotinilado, seguido por estreptavidina-peroxidasa incluidas ambas en el kit Vectastain ABC (IgG de cabra PK-4005, Vector), y se reveló la unión de lgG1 de ratón mediante Ig antiratón etiquetado con fosfatasa alcalina de conejo (D0314, Dako) durante 30 minutos a temperatura ambiente en una atmósfera húmeda. Se revelaron las actividades de peroxidasa y fosfatasa alcalina utilizando sustrato 3-amino-9-etilcarbazola (AEC) y substrato III de fosfatasa alcalina (SK-4200, Vector) (SK-5300, Vector) durante 1 a 10 minutos a temperatura ambiente, respectivamente. Se establecieron controles negativos al añadir controles de isotipo no específicos como anticuerpos primarios.

EJEMPL0 1 A pesar de la expresión de receptores para quimiocinas inflamatorias, el PC plasmacitoide responde a la quimiocina constitutiva SDF-1 Se enriqueció pDC a partir de PBMC mediante el agotamiento con esferas magnéticas. Se determinó la expresión del receptor de quimiocina y otra expresión de marcador utilizando tinción triple en poblaciones de DC de sangre enriquecida y reguladas en Lin-,CD1 c- (FITC), HLA-DR+ (tricolor), empleando anticuerpos acoplados a PE. Posterior a este protocolo, las pDC CD11c fueron 95-98% CD45RA+ y IL-3Ra+. Pdc expresó CCR2 y CCR5 (Fig. 1) a niveles comparables a la DC CD11c+ de la sangre circulante (Vanberviiet et al., 2001 , Eur J Immunol. 32(1):231-42). CCR1, CCR3, CCR4, CCR6, CCR7, CXCR1 , CXCR2, CXCR5 no se expresaron de manera significativa según se detecta mediante citofluorometria (fig. 1) y/o RT-PCR. Para determinar la migración de pDC en respuesta a varias quimiocinas, los subconjuntos de DC de sangre circulante se enriquecieron mediante agotamiento con esferas magnéticas. Después de la purificación, se dejó descansar a las células durante dos horas a 37° C y se estudiaron en ensayo de migración de cultivo polarizado (tamaño de poro 5pm). Se reveló la migración después de dos horas mediante tinción triple: marcadores de linaje FITC, HLA-DR tricolor, y CD11c PE, y se analizaron mediante Facs. Como se muestra en la figura 2, pDC respondió únicamente de manera marginal a ligandos CCR2 (MCPs) y CCR5 (RANTES) en comparación con DC CD11c+ de sangre. En contaste, como se muestra en las figuras 2 y 3, pDC migró de manera muy eficiente en respuesta a SDF-1 , con un IC50 observado alrededor de 100ng/ml SDF-1 (Fig. 3A). Posteriormente se analizaron varias poblaciones de DC para su respuesta a SDF-1 en una amplia escala de concentraciones (1 a 1000 ng/ml). Se enriquecieron pDC CD11c de sangre circulante y DC Mieloide CD11c+ mediante agotamiento por esferas magnéticas y se estudiaron en un ensayo de migración de cultivo polarizado (tamaño de poro 3pm) como se describió anteriormente. Se probaron los monocitos y DC derivado de monocitos (7 días en presencia de G -CSF+IL-4) en un ensayo de migración de cultivo polarizado (tamaño de poro 5pm), se reveló después de dos horas mediante doble tinción CD14/CD1a. Se cultivaron HPC CD34+ en presencia de SCF, G -CSF, TNF- y suero humano al 5% durante 6-7 días y se utilizaron en ensayos de migración de cultivo polarizado (tamaño de poro 2µ) (5x105 células/poso). Después de 1 hora, se reveló la migración mediante tinción de doble color para CD1a y CD14, y se analizó mediante Facs. Comparado con otros subcojuntos DC, SDF-1 fue marcadamente más activo en pDC en comparación con otras poblaciones DC (Fig.3C). Posteriormente se analizó la expresión de ARNm CXCR4 mediante RT-PCR. Se prepararon las células como se describió anteriormente; exceptuando por CD 1c- pDC de sangre y CD 1c+ mieloide, los cuales fueron aislados mediante clasificación Facs con base en CD11c, la expresión HLA-DR y ausencia de marcadores de linaje. Se recuperaron las células, se extrajo el ARN, se trataron con ADN, se transcribieron de manera inversa y se llevó a cabo un PCR cuantitativo para CXCR4. Se encontraron altos niveles de ARNm CXCR4, como se muestra en Fig. 3D. Adicionalmente, la expresión de CXCR4 fue rápidamente regulada de manera ascendente (2 horas) en la superficie de la célula de pDC (Fig. 3B). El SDF-1 resultó muy potente para inducir la migración de pDC recientemente aisladas. Esta potente actividad del SDF-1 estuvo en línea con niveles muy altos de expresión de ARNm de CXCR4 en comparación con otras poblaciones de DC. Además, la proteína CXCR4 ya detectada en la superficie celular después del aislamiento fuer traslocada muy rápidamente en la superficie celular a 37°C. es posible que la proteína CXCR4 sea almacenada en compartimentos intracitoplásmicos en estas células, como se describió anteriormente en otros tipos de célula (Forster et al., 1998, J. Immunol. 160(3): 522-31 ; Colé er al., 1999, J. immunol. 162(3): 1392-400).

EJEMPLO 2 Las PC plasmacitoides expresan niveles altos de CXCR3 en comparación con otras poblaciones de PC Para CD1 c-pDC, de la sangre, se determinó el receptor de quimiocina y otra expresión de marcador, mediante tinción triple en poblaciones de DC de sangre enriquecida y admisión en Lin-, CD11c, (FITC), HLA-DR+ (tricolor), utilizando anticuerpos unidos a PE. Después de este protocolo los CD11 c-pDC fueron 95-98% CD45RA+y IL-3Ra+. Para la DC mieloides de CD11c+ de la sangre, se determinó el receptor de quimiocina y otro marcador, mediante tinción triple admitida en Lin-, CD45RA- (FITC), HLA-DR+ (tricolor), utilizando anticuerpos unidos a PE. Después de este protocolo, las DC mieloides de CD11c+ fueron 95-98% CD11c+, IL-3Ro Las DC derivadas de CD11c+ o las FITC derivadas de monocito fueron procesadas mediante tinción doble utilizando DC conjugadas con CD1a o CD14 y anticuerpos monoclonales conjugados con PE contra receptores de quimiocina humana. Como se puede ver en la figura 1 , las pDC expresaron niveles altos de CXCR3 en la superficie en la superficie celular. En contraste, las DC de la sangre de CD11c+ circulante, así como otras poblaciones de DC, no expresaron niveles significativos de CXCR3, como se detectó por FACS o por RT-PCR cuantitativo de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1 (Fig. 4A&B). La expresión de ARNm de CXCR3 se analizó después como se describe en el ejemplo 1. En comparación con otros receptores de quimiocina, el ARNm de CXCR3 fue el receptor expresado en el nivel más alto de pDC (Fig.4C), incluso más alto que el ARNm de CXCR3. Tomando en cuenta los resultados descritos anteriormente en lo referente al nivel alto de expresión de receptores de CXCR3 en pDC, después se probaron los ligandos IP- 0, Mig y l-TAC CXCR3 en el análisis de quimiotaxis descrito anteriormente. Contrario a lo que se esperaba, sólo se observó una migración marginal (figura 2), y solamente a una concentración alta (Fig. 5, 1^g/ml), incluso después del contacto con virus (ver ejemplo 9), o en pruebas de migración trans-endotelial.

EJEMPLO 3 Los ligandos CXCR3 se sinergizan con SDF-1 para inducir una potente migración de pDC Se realizaron pruebas de migración en respuesta a diferentes combinaciones de ligandos SDF-1 y CXCR3 Como se puede ver en la figura 5, en la presencia de una dosis sub-optima de SDF-1 (10ng/ml) se observó la actividad de los tres ligandos CXCR3 a una concentración más baja (100-500 ng/ml) (Fig. 5B). También, cuando se probaron en combinación con SDF-1 , se permitió que los tres 3 ligandos CXCR3 bajaran el umbral de sensibilidad a SDF1 por un orden de magnitud de 2.

EJEMPLO 4 Los ligandos CXCR3 inician las CP11c-pDC humanas aumentando su sensibilidad a SDF-1 Se realizó un análisis ajedrezado en donde los ligandos CXCR4 y CXCR3 fueron opuestos en pozos superiores e inferiores. Se observó actividad sinergística cuando se colocaron dos quimiocinas juntas en el pozo inferior, así como cuando el IP-10 se encontraba en el pozo superior junto con pDC y SDF-1 , en el pozo inferior, pero no a ia inversa (Fig. 6A). Luego se realizaron experimentación pre-incubación, en donde primero se encubaron las células en presencia de los ligandos CXCR4 o CXCR3 durante 1 hora antes de realizar la prueba de migración a los dos ligandos receptores. Cuando se inició por primera vez a las células con IP-10, se observó una respuesta incrementada a SDF-1 , pero no en el experimento inverso (Fig. 6B). Estos resultados sugieren que la actividad CXCR3-L depende del gradiente y que sintetizan pDC para responder a concentraciones bajas de SDF-1. Finalmente, estas observaciones también demuestran que la actividad sinergística es el resultado de un acción secuencial, con los ligandos CXCR3 actuando primero y SDF-1 actuando en segundo lugar. Estas conclusiones están de acuerdo con la expresión observada de los ligandos CXCR3 y la expresión de SDF-1 ¡n vivo en el sitio de la inflamación (ver ejemplo 8).

EJEMPLO 5 Los ligandos CXCR3 y SDF-1 inducen la migración de pDC de ratón Se aislaron DC plasmacitoides de ratón e la médula ósea, enriquecidas por el vaciado de perlas magnéticas y se identificaron basándose en la tinción triple, CD11b-, CD11c+, GR1 +. Las pDC se ratón se utilizaron parta la prueba de migración en experimentos de cultivos polarizados. Cuando se probaron en ligandos PDC, CXCR3 de ratón recientemente identificados IP-10, MIG y l-TAC solos indujeron su migración en los experimentos de cultivo polarizado (figura 7). El nivel de migración inducida con ligandos CXCR3- fue comparable con el que se observó con SDF-1, pero la selectividad de los ligandos CXCR3 fue mucho más importante que la de SDF-1.

EJEMPLO 6 Las DC plasmacitoides expresan niveles altos de selectina L en comparación con otras poblaciones de DC, pero también expresan CLA Las pDC han demostrado expresar CD62L (Celia et al., 1999, Mature Med. 5:919-923). En este punto se compara la expresión de selectina L en diferentes poblaciones de DC. Para CD11c- pDC, de la sangre se realizó el análisis de selectina L y expresión de CLA en la población de DC enriquecida mediante tinción triple: lin" CD11c" (FITC), HLA-DR+ (Tricolor) y anti-CD62L o CLA (PE). Para las DC mieloides de CD11c+ de la sangre, la expresión fue determinada por tinción triple: In" CD45RA" (FITC), HLA-DR+ (Tricolor) y anti-CD62L o CLA(PE). Para ios monocitos y las DC derivadas de monocito, el análisis se obtuvo mediante tinción doble contra el anticuerpo Anti-CD14 o Anti-CD a (FITC), respectivamente. Para los precursores de CD a+ y CD144 DC derivados de CD34+ HPC, la tinción doble con anti-CD62L o CLA (PE) y los anticuerpos CD1a o CD145 (FITC). Como se puede ver en la figura 8 encontramos que con el aislamiento las pDC expresaron niveles muy altos de selectina L, a una densidad comparada con la de las células T no afectadas. En contraste, las DC de la sangre CD11c+ expresaron niveles de 20 a 50 veces más bajos de selectina L en comparación con los de los monocitos circulantes. Las DC generadas in vitro a partir de monocitos o de precursores de CD34+ no expresaron niveles significativos de selectina L. Además, después de 2 a 16 horas de cultivo la expresión de CD62-L se mantuvo en pDC, mientras que desapareció en CD 11 c+ DC. Estas observaciones sugieren que las pDC pueden tener la capacidad de entrar a nodos de linfa provenientes de la sangre a través del HEV como células T no afectadas a través de pozos. Sin embargo las pDC también expresaron la molécula guía cutánea CLA a una densidad si8milar a ia expresada en la mayoría de las otras DC circulantes y los monocitos Fig. 4B), sugiriendo que también podrían tener la capacidad de entrar al tejido no linfoide.

EJEMPLO 7 La expresión de CCR6 y CCR10 en pDC humanas y la migración a sus lígandos respectivos se induce con el cultivo en IL-3 Las DC plasmacitoides aisladas por clasificación de hechos, fueron cultivadas en presencia de IL-3 y otros factores de supervivencia (virus desactivado de la influenza PFA, ODN, CD40L), o combinaciones durante 24 a 72 horas. Cuando se cultivaron en presencia de IL-3 (Fig. 9 o IL-3+CD40-L, las pDC humanas adquirieron específicamente la expresión de CCR6 y CCR10, pero no la de otro receptores y perdieron la expresión de los receptores presentes en el aislamiento. Con el cultivo en IL-3, pDC migraron fuertemente en pruebas de migración polarizadas en respuesta a CCR6 y CCR10 ligandos, CCL20 y CCL27/CCL28, respectivamente (Fig. 10A, B). Las pDC cultivadas en IL-3 empiezan a responder a CCL20 de 10 ng/ml mientras se requirieron ligandos CCr10 más altos (1 pg/ml), como se reportó previamente para las células T de memoria (Morales et al., 1999, PNAS 96(25): 14470-5; Hudak et al., 2002, J Immunol. 169 (3); 1189-96). La expresión de CCR6 y la respuesta a CCL20 fue inducida solamente por IL-3 (Fig. 10A), mientras que la expresión de CCR10 y la respuesta a sus ligandos fue inducida por otros factores de supervivencia tales como un virus y ODN (Fig. 10B). Esto podría sugerir que la expresión de CCR 0 podría formar parte de un programa de diferenciación durante el ciclo de vida de pDC, y podría jugar un papel fisiológico importante en el control del tráfico de pDC. La expresión de CCR6 parece estar más estrictamente regulada y podría jugar un papel en el correcto posicionamiento de pDC en los tejidos.

EJEMPLO 8 Mig expresado por células endoteliales forma gradientes complementarios con SDF-1. CTACK y MIP-3a Se realizó la inmunohistoquímica en las amígdalas y piel inflamada (lesiones psoriáticas) utilizando anticuerpos contra las diferentes quimiocinas. En la piel inflamada se expresó Mig en los vasos en la papila dérmica, en las cercanías de las células epiteliales que expresaban CTACK y MIP-3oc. De forma similar, en las amígdalas, Mig fue expresado por los vasos sanguíneos en contacto con las células epiteliales fueron SDF-1 y MIP-3oc provenientes de gradientes complementarios.

EJEMPLO 9 Con el contacto con el virus, las pDC adquieren actividad de expresión de CCR7 y ligandos de CCR7 v pierden rápidamente la expresión de selectina L Como se sabe que las pDC son mediadoras para la producción de INFoc al encontrarse con virus (Siegal et al., 1999, Science 284(5421 ): 835-7; Celia et al., Nature Med. 5:919-923), la expresión del receptor de quimiocina y la respuesta de quimiocina de pDC se midió enseguida después de la exposición, durante 2 a 16 horas, al virus desactivado de influenza PFA.

Después de un contacto de dos horas con el virus, los niveles de expresión de CCR2, CCR5, CXCR3 y CXCR4 permanecieron sin cambio (Fig. 11A),o aumentaron ligeramente, pero la respuesta a los ligandos CCR2 y CXCR3 desapareció totalmente (Fig.11B), mientras que SDF-1 seguía activo (una pérdida de actividad de menos del 50%). Después de 16 horas se perdió la expresión del receptor CCR2, CCR5, CXCR3 y CXCR4 y la respuesta al ligando. En contraste, después de dos horas en la presencia del virus, ya se observaba claramente la sobrerregulación de CD83 y CCR7 (Fig. 11 A), y se acentuaron después de 16 horas. En paralelo con la expresión inducida de CCR7, 6Ckine y ???-3ß indujeron una migración potente de pDC activadas con virus a 2 horas (Fig. 11B) y a 16 horas, mientras que no se observó ninguna migración o hubo una migración marginal de las pDC no activadas. Para ambos ligandos la concentración activa óptima fue de 100ng/ml. Esta observación sugiere que después del agrupamiento local y de la activación, estás células tendrán la capacidad de emigrar en el ganglio linfático a través del torrente linfático, un proceso controlado por CCR7 y sus ligandos. De este modo, las combinaciones de quimiocina que permiten el agrupamiento de pDC, junto las señales que inducen la activación de pDC, harán posible que las pDC emigren en el ganglio linfático y que inicien una respuesta inmune, en particular, respuestas inmunes de tipo Th-1 a través de la producción de IFNa.

Tomándolos juntos, estos resultados sugieren que además de la capacidad de percolarse al ganglio linfático provenientes de la sangre, a través de la vénula endotelial alta, las pDC pueden tener la capacidad de alcanzar los tejidos inflamados por medio de la expresión de CLA. Este agrupamiento en los tejidos no linfoides muy probablemente requieren de la acción secuencial de diferentes gradientes de quimiocina. Primero, los ligandos CXCR3 juntos con los ligandos CXCR4 inducen el agrupamiento de pDC provenientes de la sangre al tejido. Después, las señales provenientes del microambiente (por ejemplo, IL-3 de las células madre) puede inducir la expresión de CCR6 y/o CCR10, permitiendo que las pDC alcancen el sitio de la entrada del virus, el epitelio, en donde se producen los ligandos CCR6 y CCR10. Alternativamente, como un mediador soluble, el IL-3 puede alcanzar la sangre permitiendo la expresión de CCR6/10 en las pDC circulantes y su agrupamiento directo desde la sangre hasta los tejidos a través de los ligandos CCR6/10. En resumen, los resultados que se reportan en la presente apoyan el uso de los agonistas del receptor de quimiocina que se describieron antes, solos o en combinación uno con otro, un factor de supervivencia y/o un antígeno asociado con la enfermedad, con o sin un agente de activación para agrupar pDC ya sea (ocalmente en el sitio de la inyección de quimiocina, o directamente en los tumores. Con estos resultados también se soporta el uso de los antagonistas del receptor de quimiocina descritos anteriormente, solos o en combinación uno con otro, para bloquear la migración de pDC.

Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención, sin apartarse del espíritu y alcance, como lo podrán apreciar los expertos en la técnica. Las modalidades especificas que se describieron en la presente se ofrecen únicamente a manera de ejemplos, y la invención sólo estará limitada por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con todo el alcance de los equivalentes a los cuales están suscritas dichas reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - El uso de un agonista o antagonista del receptor de quimiocina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad con el aumento o la disminución de la migración de las células dendríticas plasmacitoides en un individuo. 2. - El uso de un agonista del receptor de quimiocina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad aumentando o modulando una respuesta inmune, en donde el agonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un agonista de CXCR3, un agonista de CXCR4, un agonista de CXCR6, y un agonista de CCR10, o una combinación de los mismos. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en IIP-10, Mig, l-TAC, SDF-1, MIP-3a, MEC y CTACK. 4. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina es recombinante. 5 - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina es una molécula pequeña. 6. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en combinación con uno o más de otros agonistas del receptor de quimiocina. 7. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el estado de enfermedad es una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o cáncer. 8 - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el estado de enfermedad es un trastorno autoinmune, alergia o transplante. 9 - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde el medicamento también se puede administrar con por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad. 10. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el antígeno es un antígeno asociado con el tumor. 11. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el antígeno es un antígeno bacteriano, viral o fúngico. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el antígeno es un autoantígeno, un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el antígeno asociado con el tumor se selecciona del grupo que consiste en Melan-A, tirosinasa, p97, ß-HCG, GalNAc. MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1 , MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antigeno de melanoma con alto peso molecular, K19, Tyr1 y Tyr2, los miembros de la familia de genes pMe) 17, c-Met, PSA, PSM, a-fetoproteína, tiroperoxidasa y gp 100. 14.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el estado de enfermedad que será tratado es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cánceres que afectan la cavidad oral, la faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, la cabeza y el cuello, los huesos y las articulaciones, los tejidos suaves, la piel, el pecho, el sistema reproductor, el sistema urinario, el ojo y la órbita, el cerebro y el sistema nervioso, el sistema endocrino, el sistema sanguíneo/hematopoyético. 15.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el cáncer que será tratado es cáncer de próstata y el antígeno asociado con tumor es PSA y/o PSM. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el estado de enfermedad que será tratado es melanoma y el antígeno asociado con tumor es Meian-A, gp100 o tirosinasa. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el medicamento también se puede administrar con un factor de supervivencia. 18. - El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde el factor de supervivencia se selecciona del grupo que consiste en IL-3, IFNoc y RANK-L. 19. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde el medicamento también se puede administrar con un agente de activación. 20.- El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde el agente de activación se selecciona del grupo que consiste en ligando/agonista de IFNa, NTFa, RANK, ligando/agonista de CD40 y un ligando/agonista del receptor de tipo Toll. 21.- El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el (los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, por la boca, tópicamente, o en forma de un vector. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en forma de una estructura de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña, un vector que ha sido modificado para reconocer o localizar un antigeno asociado con la enfermedad. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede admimistrar en forma de una proteína de fusión. 24. - El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde la proteína de fusión también comprende un antígeno asociado con la enfermedad. 25. - El uso de un agonista de CXCR3 en combinación con una cantidad efectiva de un agonista de CXCR4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad en un individuo. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el agonista de CXCR4 es SDF-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo y el agonista de CXCR3 se selecciona del grupo que consiste en IP-10, MIG, l-TAC, y fragmentos biológicamente activos de los mismos. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el agonista de CXCR3 o el agonista de CXCR4 es recombinante. 28. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el agonista de CXCR3 o el agonista de CXCR4 es una molécula pequeña. 29. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el estado de enfermedad es una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o cáncer. 30. - El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento también se puede administrar con por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad. 31. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde el antígeno es un antígeno asociado con el tumor. 32. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde el antígeno es un antígeno bacteriano, viral o fúngico. 33. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde el antígeno es un auto antígeno, un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. 34. - El uso como se reclama en la reivindicación 31, en donde el antígeno asociado con tumor se selecciona del grupo que consiste en Melan-A, tirosinasa, p97, ß-HCG, GalNAc. MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1 , MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma con alto peso molecular, K19, Tyr1 y Tyr2, los miembros de la familia de genes pMel 7, c-Met, Psa, PSM,a fetoproteína, tiroperoxidasa, y gp 100. 35. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el estado de enfermedad que será tratado es cáncer seleccionado del grupo que consiste en cánceres que afectan la cavidad oral y la faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, la cabeza y el cuello, los huesos y las articulaciones, los tejidos suaves, la piel, el pecho, el sistema reproductor, el sistema urinario, el ojo y la órbita, el cerebro y el sistema nervioso, el sistema endocrino, el sistema sanguíneo/hematopoyético. 36.- El uso como se reclama en la reivindicación 35, en donde el cáncer que será tratado es cáncer de próstata y el antígeno asociado con tumor es PSA y/o PSM. 37. - El uso como se reclama en la reivindicación 35, en donde el estado de enfermedad que será tratado es melanoma y el antígeno asociado con tumor es Melan-a, gp100 o tirosinasa. 38. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento también se puede administrar con un factor de supervivencia. 39. - El uso como se reclama en la reivindicación 38, en donde el factor de supervivencia se selecciona le grupo que consiste en IL-3, IFNa y RANK-L. 40. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento también se puede administrar con un agente de activación. 41. - El uso como se reclama en la reivindicación 40, en donde el agente de activación se selecciona del grupo que consiste en ligando/agonista de IFNa, TNFa, RANK, ligando/agonista de CD40, y un ligando/agonista del receptor de tipo Toll. 42.- El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el (los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, por la boca, tópicamente, o en forma de un vector. 43. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el(los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma de una estructura de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña o un vector que se modifican para reconocer o localizar un antígeno asociado con la enfermedad. 44. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el (los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma de una proteína de fusión. 45. - El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la proteína de fusión también comprende un antígeno asociado con tumor. 46. - El uso de un agonista de CCR6 y/o un agonista de CCR10 en combinación con una cantidad efectiva de un factor de supervivencia, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad en un individuo. 47. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el agonista de CCR6 es MIP-3a o una variante del mismo y el agonista de CCR10 es CTACK, EP o una variante de los mismos. 48.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el agonista de CCR6 o el agonista de CCR10 es recombinante. 49. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el agonista de CCR6 o el agonista de CCR10 es una molécula pequeña. 50. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el factor de supervivencia se selecciona del grupo que consiste en IL-3, IFNa y RANK-L. 51. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el medicamento también se puede administrar con un agente de activación. 52. - El uso como se reclama en la reivindicación 51 , en donde el agente de activación se selecciona del grupo que consiste en ligando/agonista de IFNa, TNFa, RANK, ligando/agonista de CD40 o un ligando/agonista del receptor de tipo Toll. 53. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el estado de enfermedad es una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o cáncer. 54. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el medicamento también se puede administrar con por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad. 55. - El uso como se reclama en la reivindicación 54, en donde el antígeno es un antígeno asociado con tumor. 56. - El uso como se reclama en la reivindicación 54, en donde el antígeno es un antígeno bacteriano, viral o fúngico. 57. - El uso como se reclama en la reivindicación 54, en donde el antígeno es un auto antígeno, un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. 58. - El uso como se reclama en la reivindicación 55, en donde el antígeno asociado con tumor se selecciona del grupo que consiste Melan-A, tirosinasa, p97, ß-HCG, GalNAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1 , MUC, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, antígeno de melanoma gp75, HKer 8, antígeno de melanoma de alto peso molecular K19, Tyr1 y Tyr2, los miembros de la familia de genes pMEl 7, c-Met, PSA, PSM, a-fetoproteina, tiroperoxidasa y gp100. 59. - El uso como se reclama en la reivindicación 53, en donde el estado de enfermedad que será tratado es cáncer seleccionado del grupo que consiste en cánceres que afectan la cavidad oral y la faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, la cabeza y el cuello, los huesos y las articulaciones, los tejidos suaves, la piel, el pecho, el sistema reproductor, el sistema urinario, el ojo y la órbita, el cerebro y el sistema nervioso, el sistema endocrino, el sistema sanguíneo/hematopoyético. 60.- El uso como se reclama en la reivindicación 59, en donde el cáncer que será tratado es cáncer de próstata y el antígeno asociado con tumor es PSA y/o PSM. 61. - El uso como se reclama en la reivindicación 59, en donde el estado de enfermedad que será tratado es melanoma y el antígeno asociado con tumor es Melan-A, gp100 o tírosinasa. 62. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el (los) agonista (s) del receptor de quimiocina se administra de manera intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, por la boca, tópicamente, o en forma de un vector. 63.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede admimistrar en forma de una estructura de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña, o un vector que es modificado para reconocer o localizar un antígeno asociado con enfermedad. 64. - El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en forma de una proteína de fusión. 65. - El uso como se reclama en la reivindicación 64, en donde la proteína de fusión también comprende un antígeno asociado con enfermedad. 66. - El uso de un agonista de CCR6 y/o un CCR10 en combinación con una cantidad efectiva de un agonista de CXCR3 y un factor de supervivencia para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad en un individuo. 67.- El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el agonista de CCR6 es MIP-3a, o un fragmento biológicamente activo del mismo, el agonista de CCR10 es CTACK o un fragmento biológicamente activo del mismo, y el agonista de CXCR3 se selecciona del grupo que consiste en IP-10, Mig, l-TAC, y fragmentos biológicamente activos de los mismos. 68. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el agonista de CCR6 o el agonista de CCR10 o el agonista de CXCR3 es recombinante. 69. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el agonista de CCR6 o el agonista de CCR 0 o el agonista de CXCR3 es una molécula pequeña. 70. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el factor de supervivencia se selecciona del grupo que consiste en IL-3, IFNa y RANK-L 71. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el medicamento también se puede administrar con un agente de activación. 72. - El uso como se reclama en la reivindicación 71, en donde el agente de activación se selecciona del grupo que consiste en ligando/agonista de IFNa, TNFa, RANK, ligando/agonista de CD40 y un ligando/agonista del receptor de tipo Toll. 73. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el estado de enfermedad es una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o cáncer. 74. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el medicamento también se puede administrar con por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad. 75 - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde el antígeno es un antígeno asociado con tumor. 76. - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde el antígeno es un antígeno bacteriano, viral o fúngico. 77. - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde el antígeno es un auto antígeno, un antígeno de histocompatibilidad o un alérgeno. 78. - El uso como se reclama en la reivindicación 75, en donde el antígeno asociado con tumor se selecciona del grupo que consiste en Melan-A, íirosina, p97, ß-HCG, GalNAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-12, MART-1, MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC 8, CEA, DDC, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma de alto peso molecular, K19, Tyr1 y Tyr2, los miembros de la familia de genes pMel 17, c-Met, PSA, PSM, -fetoproteína, tiroperoxidasa y gp100. 79. - El uso como se reclama en la reivindicación 73, en donde el estado de enfermedad que será tratado es cáncer seleccionado del grupo que consiste en cánceres que afectan la cavidad oral y la faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, la cabeza y el cuello los huesos y articulaciones, los tejidos suaves, la piel, el pecho, el sistema reproductor, el sistema urinario, el ojo y la órbita, el cerebro y el sistema nervioso, el sistema endocrino, y el sistema sanguíneo/hematopoyético. 80.- El uso como se reclama en la reivindicación 79, en donde el cáncer que será tratado es cáncer de próstata y el antígeno asociado con tumor es PSA y/o PSM. 81. - El uso como se reclama en la reivindicación 79, en donde el estado de enfermedad que será tratado es melanoma y el antígeno asociado con tumor es Melan-A, gp100 o tirosina. 82. - El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el(los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, por la boca, tópicamente, o en forma de un vector. 83.- El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en forma de una estructura de localización que comprende un agonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña, o un vector que es modificado para reconocer o localizar un antígeno asociado con la enfermedad. 84.- El uso como se reclama en la reivindicación 66, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en forma de una proteína de fusión. 85. - El uso como se reclama en la reivindicación 84, en donde la proteína de fusión también comprende un antígeno asociado con la enfermedad. 86. - El uso de un antagonista del receptor de quimiocina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad mediante la disminución de la migración de pDC en un individuo, en donde el antagonista del receptor de quimiocina se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de CXCR3, un agonista de CXCR4, un antagonista de CCR6, y un antagonista de CCR10, o una combinación de los mismos. 87. - El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el estado de enfermedad es una enfermedad autoinmune, un rechazo de injerto o alergia. 88. - El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el estado de enfermedad es cáncer o una enfermedad infecciosa. 89. - El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el antagonista del receptor de quimiocina es recombinante. 90. - El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el antagonista del receptor de quimiocina es una molécula pequeña. 91.- El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el (los) agonista(s) del receptor de quimiocina se pueden administrar en forma intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, por la boca, tópicamente, o en forma de un vector. 92.- El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde el agonista del receptor de quimiocina se puede administrar en forma de una estructura de localización que comprende un antagonista del receptor de quimiocina y una porción de localización, en donde la porción de localización es un péptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña, o un vector que se modifica para reconocer o localizar un antígeno asociado con la enfermedad.