MXPA04000736A - Inmovilizacion irreversible de diisopropilfluorofosfatasa en recubrimientos de poliuretano. - Google Patents
Inmovilizacion irreversible de diisopropilfluorofosfatasa en recubrimientos de poliuretano.Info
- Publication number
- MXPA04000736A MXPA04000736A MXPA04000736A MXPA04000736A MXPA04000736A MX PA04000736 A MXPA04000736 A MX PA04000736A MX PA04000736 A MXPA04000736 A MX PA04000736A MX PA04000736 A MXPA04000736 A MX PA04000736A MX PA04000736 A MXPA04000736 A MX PA04000736A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- enzyme
- reacting
- mixture
- containing coating
- includes adding
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
Abstract
Esta invencion proporciona un metodo para inmovilizar una enzima de manera irreversible en recubrimientos de poliuretano. Esta invencion proporciona tambien un recubrimiento que contiene enzima que tiene un grado de inmovilizacion de la enzima de aproximadamente 100%. La sintesis de recubrimientos de poliuretano base agua en la presencia de enzima ha permitido la union irreversible de la enzima a la matriz polimerica. La distribucion de la enzima inmovilizada asi como tambien la retencion de actividad son homogeneas dentro del recubrimiento. Disminuyendo el caracter hidrofobico de ECC, via el uso de un prepolimero de poliisocianato menos hidrofobico durante la polimerizacion, aumento significativamente la actividad intrinseca del ECC.
Description
INMOVILIZACION IRREVERSI BLE DE DI ISOPROPI LFLUORO- FOSFATASA EN RECUBRIMIENTOS DE POLIURETANO
Esta solicitud reivindica el beneficio de 35 U .S. C. § 1 1 9(c) de la solicitud provisional también pendiente No . de Serie 60/307,450 titulada "Inmovilización Irreversible de Diisopropilfluorofosfatasa en Recubrimientos de Poliuretano" presentada el 24 de julio de 2001 la cual se incorpora a la presente por referencia.
ANTECEDENTES DE LA I NVENCION
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la inmovilización irreversible de enzimas en recubrimientos de poliuretano.
ESTADO DE LA TECN ICA La inmovilización se ha empleado ampliamente para capacitar y aumentar la aplicación de enzimas como catalizadores en procesos industriales. Se ha empleado espuma de poliuretano como soporte polimérico para síntesis bioplastica con varias enzimas durante la última década. Pueden sintetizarse polímeros de poliuretano como esponja a partir de prepolímeros de poliisocianato con base en toluendiisocianato (TDI)- o metilén bis(p-fenilisocianato) (MDI)- y agua, la incorporación de enzimas en espuma de poliuretano monolítico se caracteriza con frecuencia por un grado de inmovilización cercano al 100% y una 2
retención de alta actividad. También se ha reportado el aumento de termoestabilidad vía ia inmovilización en espumas de poliuretano. La inserción de moléculas biológicas en recubrimientos y películas delgadas pueden impulsar un gran rango de aplicaciones. Por ejemplo, biodetectores potenciométricos involucran con frecuencia la unión covalente de enzima sobre una película interna adyacente a la su perficie de detección del electrodo, y la protección subsiguiente de la capa de enzima con una película externa. Otro método de inmovilización para la fabricación de biodetectores amperométricos depende del entrampamiento de enzima en una capa de gel, la cual se recubre adicionalmente mediante una película protectora externa. El tiempo de vida y uso de tales sistemas son limitados con frecuencia por la difusión de enzima a través de la membrana externa. Para superar esta desventaja principal, la enzima tiene que ser inmovilizada directamente y de manera covalente en el recubrimiento. La incorporación covalente de biocatalizador en recubrimientos sería benéfico también para otros bioprocesos tales como separación y filtración biocatalíticas, pastillas de silicio (microchips) y antiséptico. La inmovilización covalente directa de enzimas altamente activas en recubrimientos y películas ha permanecido como una meta elusiva, con algunos de los enfoques más exitosos exhibiendo solamente hasta 0.5% de actividad. Los recubrimientos de poliuretano base agua resultan de la polimerización de poliisocianatos alifáticos que se pueden dispersar en poliol con base en poliéster acuoso. Conforme cura la película a temperatura ambiente, el agua se evapora y ocurre el entrelazamiento 3
por la condensación entre grupos hidroxilo y funcionalidades isocianato. Los poliuretanos de dos componentes base agua se usan de manera creciente en aplicaciones industriales, ya que exhiben propiedades similares a aquellas de recubrimientos de poliuretano base solvente. El recubrimiento de poliuretano base agua representa una matriz polimérica potencialmente ideal para inmovilización de puntos múltiples y covalente de enzimas. En vista de lo anterior, existe una necesidad en la técnica de un método mediante el cual una enzima pueda ser agregada directamente a la fase acuosa de un sistema de dos componentes antes de la polimerización. El proceso de inmovilización depende de la habilidad de las aminas en la superficie de la enzima para reaccionar con funcionalidades isocianato a un régimen más rápido que los grupos hidroxilo en el prepolímero.
BREVE DESCRIPCION DE LA I NVENCION
La presente invención incluye un método para inmovilizar enzimas de manera irreversible en recubrimientos de poliuretano que comprende los pasos de: hacer reaccionar una mezcla de co-reactivo de dispersión de poliol y una enzima para hacer una mezcla acuosa; agregar un podisocianato alifático que se puede dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlos reaccionar para producir una emulsión ; aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para hacer un recubrimiento que contiene enzima; y curar 4
el recubrimiento que contiene enzima. Adicionalmente, la presente invención incluye un método para inmovilizar de manera irreversible diisopropilfluorofosfatasa en recubrimientos de poliuretano que comprende los pasos de: hacer reaccionar una mezcla de un co-reactivo de dispersión de poliol que tiene un contenido de agua de 70% en peso, un tensoactivo de polidimetil siloxano modificado con poliéter, un medio regulado constituido por regulador de bis-tris propano y CaC!2 y diisopropilfluorofosfatasa para hacer una mezcla acuosa; agregar un poliisocianato alifático que puede dispersarse en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlos reaccionar para producir una emulsión; aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para hacer un recubrimiento que contiene enzima; y curar el recubrimiento que contiene enzima. También, la presente invención incluye un recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso que comprende los pasos de: hacer reaccionar una mezcla de co-reactivo de dispersión de poliol y una enzima para hacer una mezcla acuosa; agregar un poliisocianato alifático que se puede dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlos reaccionar para producir una emulsión; aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para hacer un recubrimiento que contiene enzima; y curar el recubrimiento que contiene enzima durante aproximadamente 12 horas bajo condiciones ambientales. Estas y otras ventajas y beneficios de la presente invención serán 5
aparentes a partir de la Descripción Detallada de la Modalidad Preferida en la presente a contin uación.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DI BUJOS
Para que la presente invención se entienda y se practique fácilmente, la invención será descrita ahora, para propósitos de ilustración y no de limitación, en conjunto con las siguientes figuras en donde: La Tabla 1 ilustra los parámetros cinéticos para recubrimientos que contienen DFPasa y DFPasa soluble. La Figura 1 ilustra un esquema del perfil de concentración de DFP en el caso de difusión simultánea y reacción enzimática en el recubrimiento de poliuretano que contiene DFPasa. La Figura 2 ilustra una distribución de enzima en recubrimientos de poliuretano. La Figura 3 ilustra el efecto de la concentración de DFPasa en la eficiencia del recubrimiento que contiene DFPasa. La Figura 4 ilustra la difusión efectiva de DFP a través de recubrimientos. La Figura 5 ilustra perfiles para consumo de DFP en celdas de difusión. Se sintetizaron recubrimientos usando el poliol XP-7093 y polilsocianato XP-7007 y una carga de DFPasa de 3.6 mg/greoubrimiento- Las Figuras 6a y 6b ilustran perfiles para consumo de DFP en celdas de difusión.
6
La Figura 7 ilustra la termo-inactivación de recubrimiento que contiene DFPasa a 65° C. La Figura 8 ilustra la termo-activación de recubrimiento que contiene DFPasa a temperatura ambiente.
DESCRIPCION DETALLADA DE UNA MODALIDAD PREFERIDA
La presente invención se refiere a la inmovilización de enzimas en recubrimientos de poliuretano base agua. Una de tales enzimas que puede ser usada es la diisopropilfluorofosfatasa (DFPasa, E.C. 3.8.2.1 ). Sin embargo, aquellos expertos en la técn ica reconocerán que se puede usar una amplia variedad de enzimas y anticuerpos. Se entiende que la DFPasa nativa cataliza la hid rólisis de agentes de organofosforo tóxicos a los nervios tales como soman y fluorofosfato de diisopropilo (DFP). En la técnica anterior, la DFPasa se ha copolimerizado en espumas de poliuretano monolítico con una retención de actividad de 67% y una termoestabilidad incrementada. Puesto que las alteraciones en la cualidad hidrofílica del recubrimiento que contiene enzima (ECC) podría influenciar la retención de actividad y la estabilidad, el proceso de inmovilización de la presente invención se formó previamente usando prepolímeros de poliisocianato con varias calidades hidrofílicas. Se determinó ef grado hasta ef cual la enzima se unió de manera irreversible al soporte. La distribución de enzima en el recubrimiento se observó por medio de etiquetado con oro. La influencia de la transferencia de masa en la actividad de enzima-polímeros se examinó usando un aparato de 7
celda de difusión. El aumento de termoestabilidad de DFPasa vía la inmovilización se investigó también.
MATERIALES Y M ETODOS Material Los poliisocianatos BAYHYDU R XP-7063, XP-7007, XP-7148, poliol BAYHYDROL XP-7093 y Desdomodur N3400 así como también paneles de poliolefina termoplástica (TPO) , usados en la síntesis y curado de recubrimientos que contienen proteína fueron proporcionados amablemente por Bayer Co. (Pittsburg, PA). Los poliisocianatos de BAYHYDUR XP-7063, XP-7007, XP-7148 son poliisocianatos alifáticos que se pueden dispersar en agua con base en exametilén diisocianato (HDI). El poliol BAYHYDROL XP-7093 es una dispersión de poliol. El tensoactivo BYK-345 , que es un polidimetil siloxano modificado con poliéter, se obtuvo de BYK-Chemie (Wallingford, CT). El düsopropilfluorofosfato (DFP), el reactivo Bradford, la albúmina de suero de bovino (BSA), el bis-tris propano, el tris(hidroximetil)aminometano HCI (tris-HCI), el CaCI2, NaCI, K2C03 y el isopropanol se compraron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). La DFPasa se compró de BioCatalytics, Inc. (Pasadena, CA). La resina para embeber Polybeth , que es una resina epoxí, se obtuvo de Polyscíences (Warrington , PA).
Método Síntesis de ECC Los ECC's se prepararon usando mezclas acuosas reguladas (1 0 8
m de regulador Bis-Tris-Propano, pH 7.5, CaCI2 5 mM) . Los poliuretanos de dos componentes base agua se sintetizaron usando poliisocianatos alifáticos que se pueden dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato (HDI) de BAYHYDUR y co-reactivos de dispersión de poliol BAYHYDROL. Durante la síntesis de ECC, se usó una proporción entre ¡socianato y funcionalidades hidroxilo de 2. Típicamente, el BAYHYDROL XP-7093 (2.5 g) (contenido de agua de 70% en peso), tensoactivo BYK-345 (0.1 g) y medio regulado (1 .2 g) se vertieron a un recipiente cilindrico y fue seguido por la adición de enzima, DFPasa (0.02-9 mg). La solución acuosa se agitó mecán icamente (300 rpm) después durante un minuto. Las cantidades de BAYHYDUR XP-7063, XP-7007, XP-7148 requeridas para la síntesis de SC se calcularon conociendo los pesos moleculares equivalentes del poliisocianato. Cuando se usó XP-7007, el poliisocíanato (1 g) se agregó a la solución acuosa y la mezcla bifásica se agitó durante 20 s con una cabeza diseñada a la medida unida a un taladro manual a 2,500 rpm. Después de mezclar, se obtuvo una emulsión blanca con un contenido de agua de 63% en peso, y se aplicó (0.45 g) sobre paneles de poliolefina termoplástica (TPO) limpiados previamente con isopropanol y secados bajo condiciones ambientales. El ECC se dejó curar entonces durante 1 2 horas bajo condiciones ambientales y se pesó otra vez (0.24 g). El bis-tris-propano contiene grupos hidroxilo y aminas secundarias, los cuales pueden reaccionar con los isocianatos durante la síntesis deí recubrimiento. La cantidad de sal reguladora agregada a la mezcla de reacción fue insignificante en comparación con las funcionalidades 9
reactivas del poiiisocianato y la dispersión de poliol, y, de aquí que, no pareció afectar las propiedades de los poliuretanos de dos componentes base agua resultantes.
Determinación de Concentración de Proteína Se evaluaron las concentraciones de proteína usando el reactivo de Bradford. La adición del colorante a la solución de proteína a temperatura ambiente resulta en la formación de un complejo de colorante-proteína en quince (15) minutos, con una absorción máxima a 596 nm . Se obtuvo una curva de calibración con un coeficiente de extinción de 0.0341 ml/mg para concentraciones de proteína que fluctúan desde 1 hasta 10 mg/ml.
Síntesis de Conjugados de Enzima/Oro Se prepararon coloides de oro con diámetros que fluctúan desde 25 hasta 30 nm y se conjugaron con DFPasa en medio acuoso. Específicamente, una solución de oro (1 00 mi de HauCI4.2H20 al 0.01 %) se calentó en un matraz de vidrio hasta ebullición. Se agregó citrato trisódico (5 mi al 0.015%) y la mezcla se hizo hervir adicionaímente. La formación de coloide se completó cuando se obtuvo un color anaranjado/rojo persistente. Durante la conjugación el pH se ajustó ligeramente por arriba del punto isoeléctrico de la enzima (pl 5.8) con K2C03. El pH se midió con papel litmus. Típicamente, fue necesario un peso de 0.12 g de enzima para estabilizar 30 mi de solución de coloide de oro (concentración de oro: 0.01 %). después déla adición de DFPasa, 10
la solución de enzima-oro se agitó suavemente, y se . agregó la solución de albúmina de suero de bovino (BSA) (1 0% (p/v)) hasta una concentración final de 0.1 % (p/v). La BSA bloqueó áreas de la superficie coloidal que no se recubrieron con la enzima. La solución resultante se centrífugo durante 1 hora a 1 00,000 rpm, y se recuperó el conjugado de enzima-oro en el precipitado, el cual se volvió a disolver en medio regulado (Tris-HCI 10 mM, pH 7.5). La centrifugación condujo, hasta cierto grado, a la formación de grumos de oro. Los grumos más grandes que se encontraron en áreas densas del precipitado se desecharon . Grumos más pequeños estuvieron presente aún entre ios conjugados de oro coloidal. Se prepararon adicionalmente recubrimientos con BAYHYDUR XP-7007 como se describió anteriormente usando dos concentraciones diferentes de conjugado de oro coloidal para enzima
(0.001 mg0ro/Qrecubrim¡ento y 0.012 mgoro/g recubr¡m¡ento) -
Localización de Conjugado de Oro-DFPasa en el Recubrimiento Para embeber las películas para microscopio de transmisión de electrones (TEM), se lavaron pequeñas tiras varias veces en etanol al 100% después se incubaron en varios cambios de 1 hora de resina para embeber Polybed 812. Debe entenderse que se pueden usar varios medios para embeber. La mayoría de los medios para embeber que se pueden usar están basados en resina epoxi y resina epoxi modificada o polímeros metacrílicos. Las películas se cortaron en tiras de 1 mm x 2 mm, se colocaron en moldes para embeber y se embebieron en Polybed 812. Los bloques se curaron durante una noche a 37° C, después se 11
curaron d urante dos días a 65° C. Se obtuvieron secciones transversales ultra-delgadas (60 mm) en un microtomo Reichart Ultracut E. Las secciones se observaron en un microscopio de transmisión de electrones J EOL J E 121 0 o 1 00CX a 80 KV.
Actividad de ECC's Usando un Electrodo de Iones de Fluoruro El ECC fue probado usando piezas de película de DFPasa desprendida que fluctúa en peso desde 0.009 hasta 0.012 g. Típicamente, las piezas se colocaron en 1 0 mi de soluciones reguladas de DF P 3 m M (CaCI2 5 m M y Bis-Tris-Popano 1 0 m M , pH 7.5) y se agitaron mediante agitación magnética. Como la DFPasa actúa aglutinando e hidrolizando el DFP (ver más adelante), la actividad se midió siguiendo la liberación de fluoruro con un electrodo de iones fluoruro a temperatura ambiente. La concentración de la solución de fluoruro en volumen se midió cada 20 s durante 5 min. La concentración de enzima en los recubrimientos se varió entre 0 y 2 mg g recubrim¡ento - Los ECC's con concentraciones mayores de enzima fueron muy activos para que se determinaran las viscosidades iniciales.
Determinación de Constantes Cinéticas Usando un Electrodo para Iones 12
Fluoruro Las constantes cinéticas se determinaron por medio de un detector de fluoruro como se describió en la sección previa. Las concentraciones de subtrato variaron desde 0 hasta 20 mM . La información se ajustó a la ecuación de Michaelis-Menten usando una regresión no lineal (Sigma Plot Versión 2).
Experimentos de Celda de Difusión El aparato de difusión está compuesto por un compartimiento donador y uno receptor, cada uno de ellos estando equipado con una chaqueta de agua. El sistema de difusión está compuesto de dos cámaras horizontales lado a lado con un volumen (3 mi) de compartimiento definido y área de sección transversal de difusión (DI = 9 mm). El ECC se montó entre los dos compartimientos, y los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22° C).
Determinación de Coeficiente de Difusión Efectiva de Substrato, Deff El coeficiente de difusión efectiva de substrato, Deff (m2/min) , se estimó siguiendo el procedimiento conocido en la técnica. Ureasa Tipo I II (EC. 3.5.1 .5), de frijoles Jack, que está disponible comercialmente de Sigma (St. Louis, MO) se inmovilizó en el recubrimiento (3.6 mg/grecubr¡m¡ento) para mimetizar la presencia de DFPasa. Inicialmente, se colocó un volumen de 3 mi de medio regulado (CaCI2 5 mM , Bis-Tris-Propano 10 mM , pH 7.5) complementado con DFP (4 mM) en la celda donadora, mientras que la celda receptora se llenó con medio regulado 13
(3 mi). Cada celda se mezcló con agitación magnética. Después de un período determinado de tiempo (5-300 min), se removieron los contenidos y se d iluyeron 4 veces con un medio regulador (CaCI2 5 mM , Bis-Tris-Propano 1 0 mM, pH 7.5). La concentración de DFP de cada muestra se determinó después mediante un ensayo de actividad con DFPasa soluble. El Deff se calculó en estado casi estable (Ecuación 1 ).
[DFP]S Ecuación 1
[DFP]D y [DFP} son las concentraciones de DFP en la celda donadora y la receptora , respectivamente (mol/m3). Voeida (3.1 0"6 m3) y A (6.36.10"5 m2) son el volumen de celda y el área de sección transversal de difusión , respectivamente. Suponiendo que el hinchado de la película de poliuretano ocurre principalmente en el espesor, el espesor dé ECC humedecido, d' , se estimó como. sigue:
i : S Ecuación 2 l-e
El espesor del recubrimiento seco, d (10 µp?), se determinó usando microscopio con barrido electrónico. La e (0.7) es la fracción del volumen total ocupada por la fase líquida en el recubrimiento húmedo.
Mediciones de Actividad Las celdas se llenaron con regulador ((CaC 5 mM , Bis-Tris-Propano 1 0 mM, pH 7.5). La celda donadora se complementó 14
inicialmente con DFP (4 m M). La concentración de DFP inicial en la celda receptora fue cualquiera 0 ó 4 mM. Los experimentos se condujeron usando una concentración fija de DFPasa-ECC (3.6 mg/grecu rimiento) , para la cual la degradación completa del substrato ocurrió en una escala de tiempo razonable. Cada celda se mezcló bien por agitación magnética. Después de un período de tiempo fijo (5-120 min), se removieron los contenidos y se diluyeron 4 veces con regulador (CaCI2 5 mM, Bis-Tris-Propano 10 mM, pH 7.5). La concentración de DFP de cada muestra se determinó entonces mediante un ensayo de actividad con DFPasa soluble. La Figura 1 es un esquema del perfil de concentración de DFP en el caso de difusión y reacción enzimática simultaneas en el recubrimiento que contiene DFPasa cuando la celda receptora no contiene DFP en t = 0 seg. 1 s d son la capa de solución estancada y el espesor del recubrimiento, respectivamente, CDFP, D,t, CDPF, R,Í son las concentraciones de DFP a granel en el momento t en la celda donadora y receptora, respectivamente. CDFP, o,t, CDpF,a,t son la concentración de DFP en la fase líquida del recubrimiento en la superficies y en el momento t. Si la resistencia de difusión de la capa limitante y el hinchado de ECC se descuida, los perfiles de concentración de DFP en la DFPasa-ECC en estado inestable se dan med iante la ecuación 3.
Ecuación 3 dt d2x K„M +lDFP)le 15
[DFP]|0 (mol/m3) es la concentración de DFP en la fase líquida en el recubrimiento, kcat, ¡nt (s~ ) y KM (mol/m3) son las constantes cinéticas intrínsecas para el ECC. Las condiciones iniciales son como sigue:
x = O nd t= 0, [2>./¾ =4 Ecuación 4
x (x ? 0)and t = 0, [PfP]fc = 0 Ecuación 5
En la inferíase entre el ECC y la celda donadora tenemos:
d[DFP]0 _^ A ^ d[DFP] _,Vsuperf¡c¡e + Vliberación) dt dx |o Ecuación 6
Donde [DFP]0 representa la concentración de DFP en la fase líquida en la superficie del ECC (X = 0). Vsupemcie (mol/m3. s)) representa el índice de hidrólisis de DFP en la superficie del recubrimiento (x = 0) (Ecuación 7), y Vibración (mol/(m3.s)) el régimen de reacción catalizada por la enzima inmovilizada de manera no covalente durante la síntesis de ECC y liberada en la celda donadora (Ecuación 8).
'smafic r „ , r nr7m Ecuación 7
Donde [DFPasa]superf¡Cie (mol/m3) es e( número de moles de enzima en la superficie del recubrimiento por unidad de volumen de celda donadora.
16
Donde [DFPasa}iiberaoión (mol/m3) se calcula con respecto al volumen de celda donadora, kcat.n ativa y KM. ñama se dan en la Tabla 1 (Experimento 1 a'). Dados los perfiles experimentales de concentración de DFP en las celdas donadora y receptora se resolvió numéricamente la Ecuación 2 utilizando las Ecuaciones 3 a 7 con Atenía Visual Versión 7.1 .1 . Las constantes cinéticas intrínsecas del ECC, KM.mt y kcatk,¡nt se calcularon después.
Modificación de Enzima con Desmodur N3400 Se agregó solución que contiene DFPasa (1 mi) ( OPS 50 m ,
CaCI2 5 mM, pH 7.5) a Desmodu r N3400 (1 g), el cual está compuesto por el dímero y el trímero de HDI. La mezcla bifásica se agitó a temperatura ambiente. Se determinó la actividad de la enzima modificada por medio de un detector de fluoruro como se describió previamente. Puesto que el grado de modificación de DFPasa no pudo ser determinado directamente, la reacción de Desmodur N3400 y los residuos de enzima Lisina se mimetizó usando un potenciador B Bradykinin , un péptido de bajo peso molecular (1 1 .82.4 Da) que contiene un residuo de Lisina. Se determinó el grado de modificación de Lisina usando MALDI- 17
TOF para varios tiempos de reacción (15 min a 17 hr). Se realizaron análisis MALDI-MS con un MALD I-TOF élite de Perseptive Biosystems Voyager. El voltaje de aceleración se fijó en 20 kV en un modo lineal. La solución de enzima PEGilatada (1 -2 mg/ml) se mezcló con un volumen igual de la solución matriz (0.5 mi de agua, 0.5 mi de acetonitrilo, 2 µ? de TFA y 8 mg de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico), y 2 µ? de la solución final se salpicó en la placa objetivo. Se registraron espectros después de la evaporación de la mezcla de solventes y se calibraron externamente con FMRP y ACTH . La DFPasa modificada con Desmodur N3400 se inmovilizó posteriormente en recubrimientos de poliuretano como se describió previamente.
Termoestabilidad de ECC Se agregaron DFPasa nativa e inmovilizada a regulador (BTP 1 0 mM, CaCI2 5 mM, pH 7.5) se incubaron a 65° C y se ensayaron a temperatura ambiente en medio regulado (BTP 1 0 mM , CaCI2 5 mM, pH
7.5) como se describió anteriormente. Se determinó la termoestabilidad de ECC's secos a temperatura ambiente. Después de periodos determinados de almacenamiento bajo condiciones ambientales, las muestras de ECC se ensayaron para actividad a temperatura ambiente en medio regulado (BTP 1 0 mM, CaCI2
5 mM, pH 7.5) como se describió anteriormente.
RESU LTADOS Y DISCUSIÓN 18
Reversibilidad de Unión de DFPasa a ECC's Se determinó el grado en el cual la DFPasa está unida de manera irreversible al polímero usando el reactivo de Bradford. Se desprendieron de paneles recubrimientos de poliuretano q ue contienen DFPasa, se cortaron en pequeñas piezas, y se enjuagaron intensamente con agua destilada. Se detectó menos de 4% (p/p) de la proteína cargada al ECC en los enjuagados, indicando que la eficiencia de inmovilización se aproximó al 100% .
Distribución de Enzima en ECC's Cuando las enzimas se incorporan a las películas, un tema clave es si la enzima se distribuye igualmente en la película. Se ha utilizado el etiquetado con oro para localizar la enzima inmovilizada en espumas monolíticas de poliuretano en la técnica anterior. Por lo tanto, en la presente invención la DFPasa se localizó en ECC's vía la conjugación con partículas coloidales de oro. La Figura 2 ilustra una distribución de enzima en el recubrimiento de poliuretano. Se analizaron recubrimientos que contienen oro/DFPasa utilizando imágenes de campo negro (A; 0.0007 mg0ro/grecubr¡m¡ento) e inversa (negativo) tomadas usando microscopio de luz (B; 0.01 1 6 m 0ro/greoubrimiento) . Se usaron imágenes negativas en este caso porque el espesor deí recubrimiento y la alta concentración de partículas de oro hizo difícil obtener imágenes enfocadas. Se obtuvieron secciones transversales de los recubrimientos usando microscopio de transmisión de electrones (C y D). Las flechas con cabezas rellenas muestran 19
algunas de las partículas de oro/enzima, mientras que las flechas con cabezas vacías muestran algunos de los grumos de conjugado de oro/enzima. Las cabezas de flechas indican las extremidades de muestras de recubrimiento con la resina embebida. Las estrellas designan algunas áreas no enfocadas como resultado de alta concentración de partículas de oro y superficie desigual. Las burbujas en el recubrimiento están indicadas por la letra h. La barra de tamaño mostrada en B representa los paneles A y B. La barra de tamaño en C y D indica tamaños en esos paneles. Las Figuras 2A y 2 B son micrografías de recubrimientos que contienen conjugados de oro/DFPasa obtenidas mediante microscopio de campo obscuro (0.001 mgoro/grecubr¡m¡ento) y microscopio de luz de imagen inversa (0.12 mg0ro/grecubrimiento) , respectivamente. A medida que se incrementa la concentración de conjugado de oro coloidal/enzima inmovilizado en 1 2 veces se hace aparente que los complejos de oro/enzima inmovilizados se distribuyen uniformemente dentro del recubrimiento. Los TEM's de la sección transversal de recubrimiento que contiene oro/enzima (0.012 mgoro/g recubrimiento) se dan en la Figura 2C (agrandada originalmente 2,500 veces) y 2D (ampliación de 10,000 veces). De manera similar al microscopio de luz, TEM muestra que las partículas y grumos de oro/enzima están distribuidas aleatoriamente al nivel de microescala. Esto implica que la síntesis de recubrimiento que contiene conjugado de oro/DFPasa conduce a la inmovilización homogénea de complejos de oro/DFPasa en la matriz polimérica. Mediante la extrapolación se puede predecir que la concentración local 20
de DFPasa en una película no debería depender de la ubicación. Actividad de ECC's Los ECC's se prepararon usando los prepolímeros de poliisocianato XP-7007, XP-7148 y XP-7063. La Figura 3 muestra ia actividad de cada ECC como una función de la carga de DFPasa inicial. La actividad es directamente proporcional a la concentración de la enzima, lo cual implica que no hay limitación significativa en la transferencia de masa. Puesto que la Figura 2 indica que las películas son no porosas, este resultado implica (como io discutiremos en detalle más adelante) que solamente la enzima en una capa externa delgada de la pelícu la puede acceder al substrato. El carácter hidrofílico del poliisocianato disminuye en el orden XP-7148>XP-7063>XP-7007. De manera interesante, la retención de actividad aparente de ECC's aumenta conforme disminuye el carácter hidrofílico del poliisocianato (ver Figura 3). Estudios de actividad enzimática en solventes orgánicos dehidratados demuestran que las enzimas prefieren entornos hidrofóbicos. Puede ser no coincidental que los poliisocianatos menos hidrofílicos son materiales de ECC superiores. Con respecto a la Figura 3, se sintetizaron recubrimientos con poliol XP-7093 y poliisocianato XP-7007 (diamante cerrado), XP-7063 (círculos cerrados) y XP-7148 (cuadros cerrados) en solución regulada (bis-tris-propano 1 0 mM, CaCI2 5 mM) a pH 7.5. Los triángulos cerrados corresponden a la actividad aparente de recubrimientos sintetizados a partir de DFPasa modificada con Desmodur N3400, poliol XP-7093 y poliisocianato XP-7007. La actividad del bioplástico se reporta a una 21
concentración de DFP de 3 m . El uso de poliisocianato XP-7007 genera ECC's con los mayores niveles de retención de actividad aparente, y así se preformaron entornos subsiguientes con ECC's que contiene XP-7007. Las características cinéticas aparentes calculadas en la suposición de que toda la enzima cargada está disponible (Tabla 1, Experimento conduce a una retención de actividad observable (11%) en lugar de retención intrínseca.
Difusividad Efectiva de DFP en ECC, Deff Para entender la retención de actividad en ECC's se evaluó la difusividad del substrato en la película. Usando la Ecuación 1, se encontró que la Deff es de (5+/-1) x 10"10 m2/min. Con referencia a la Figura 4, se sintetizaron recubrimientos usando el poliol XP-7093 y el poliisocianato XP-7007, y el experimento se condujo en medio regulado (bis-tris-propano 10 mM, CaCI2 5 mM) a pH 7.5 por medio de un aparato de difusión de celda. Se sabe que Deff es de dos a tres órdenes de magnitud menor que los coeficientes de difusión de gases en líquidos o solutos orgánicos en hidrogeles. De manera similar, en la técnica anterior se observó una resistencia elevada de recubrimiento de poliuretano de dos componentes base agua a la difusión de iones cloruro. La accesibilidad de la enzima ubicada dentro del recubrimiento al substrato está limitada claramente por la baja permeabilidad del recubrimiento. Una vez más, este resultado indica que el grado de penetración de DFP en el recubrimiento debe tomarse en cuenta con el fin de determinar la retención de actividad de ECC's.
22
La Figura 5 muestra el perfil para concentración de DF P en celdas donadora y receptora con el tiempo cuando se usa una DFPasa (3.6 mg/greGubrimiento), y una concentración inicial de DFP 4 m en ambas celdas. Los experimentos se llevaron a cabo en medio reg ulado (bis-tris-propano 1 0 mM , CaCI2 5 mM) a pH 7.5 usando una concentración inicial de DFP de 4 mM en ambas celdas donadora y receptora. Las concentraciones de DFP en las celdas donadora (diamantes cerrados) y receptora (círculos cerrados) se determinaron con el tiempo. Los perfiles teóricos de DFP en las celdas donadora y receptora son idénticos debido a la simetría. Las curvas de concentración experimentales en celdas donadora y receptora son , así, descritas por el mismo perfil simulado (línea punteada) usando las Ecuaciones 2-7 y Atenía Visual 7.1 .1 . Los perfiles para la disminución en concentración de DFP en celdas donadora y receptora sigue tendencias similares. Suponiendo que una DFPasa inmovilizada está distribuida homogéneamente en el recubrimiento (como lo implica la Figura 2), la retención de actividad enzimática es por lo tanto casi la misma en ambos lados del recubrimiento. Durante el curado, las superficies superior e inferior de ECC están en contacto con el panel de TPO y expuesta al aire, respectivamente. Como se da por la pequeña diferencia en retención de actividad de las superficies externas de ECC's, la interfase de aire y el ambiente polimérico/hidrofóbico no influencia la retención de actividad de ECC. Se midieron también los perfiles de concentración de DFP en celdas donadora y receptora para una DFPasa-ECC (3.6 mg/g recu rimiento) sin DFP en la celda receptora (ver Figura 6). Se sintetizaron 23
recubrimientos usando el poliol XP-7093 y el poliisocianato XP-7007, y una carga de DFPasa de 3.6 mg/grecu brimiento- Los experimentos se llevaron a cabo en medio regulado (bis-tris-propano 1 0 mM, CaCI2 5 mM) a pH 7.5 iniciando con DFP (4 mM) en la celda donadora y sin DFP en la celda receptora. La Figura 6a muestra las concentraciones de DFP en celdas donadora (diamantes cerrados) y receptora (círculos cerrados) que se midieron con el tiempo. Los perfiles de concentración de DFP simulados en celdas donadora (línea con guiones) y receptora (línea punteada) se determinaron usando las Ecuaciones 2-7 y Athena Visual 7.1 .1 . La Figura 6b muestra el perfil de concentración de substrato en el ECC's calculado a 0 (línea con guiones medianos), 30 (línea continua), 60 (línea con guiones pequeños), 90 (línea punteada con guiones), 120 (línea punteada), 180 (línea con guiones-punteada-punteada) y 280 (línea con guiones largos). La Ecuación 3 describe bien los resultados experimentales (Figura 6a). La constante intrínseca estimada de Michaelis de DFPasa inmovilizada, KMj ¡nt (Tabla 1 , Experimento 2b"), es similar a aquella obtenida con el aparato de difusión (Tabla 1 , Experimento 1 b"). De manera interesante, tomando en cuenta la resistencia del recubrimiento a la difusión de substrato, se encontró que la kcat.int (Tabla 1 Experimento 2b") es 2.4 veces más grande que la kcat,ap aparente medida sin el aparato de difusión (Tabla 1 Experimento 1 b*). Como se muestra por lo perfiles de substrato simulados dentro del recubrimiento en momentos experimentales diferentes (Figura 6b), el substrato penetra un tercio del recubrimiento en el curso del tiempo del experimento. Claramente, la estimación de parámetros cinéticos 24
aparentes involucra únicamente la degradación de DFP en u na capa de enzima inmovilizada en la superficie del recubrimiento. En consecuencia, la eficiencia enzimática aparente de DFPasa-ECC's se basa en la retención de actividad de esta capa externa de DFPasa inmovilizada. Como se da por las constantes cinéticas intrínsecas de DFPasa-ECC, la retención de actividad intrínseca dentro de esta capa es de 38% . La relación de aparente a intrínseca ^ _ Q ^ da la
proporción de DFPasa inmovilizada en ECC's alcanzable por el substrato durante las mediciones de actividad sin el aparato de difusión .
ECC's Modificados con Desmodur N3400 El mezclado vigoroso de solución acuosa que contiene potenciador B Bradykinin con Desmodur N3400 aseguró la modificación química del residuo de péptido Usina con el dímero de HDI, según se observa usando MALDI-TOF. Se alcanzó un rendimiento de reacción que fluctúa entre 70 y 90% para un tiempo de reacción de 1 5 minutos y no se incrementó mediante mezclado adicional de la solución de péptido con la fase de Desmodur N3400. El poliisocianato Desmodur N3400 está basado en la uretdiona de
HDI que se sabe que emigra desde la masa hasta la interfase polímero/aire durante el curado del recubrimiento. Modificando la DFPasa con Desmodur N3400 antes de su inmovilización en recubrimientos, se esperaba que la enzima inmovilizada estaría concentrada principalmente dentro de una capa externa en la superficie 25
del recubrimiento. En consecuencia , la DF Pasa inmovilizada sería muy accesible al substrato, conduciendo a una retención de actividad aparente incrementada. Dada la rápida reacción favorable entre isocianatos del dímero de H DI y el residuo de Lisina del potenciador B de Bradykinin, la DFPasa se hizo reaccionar con Desmodur N3400 durante 1 5 minutos. No se observó pérdida de actividad enzimática. Como se muestra enla Figura 3 y la Tabla 1 (Experimento 1 b *), el pre-tratamiento de DFPasa con Desmodur N3400 produjo un incremento de 64% en la eficiencia aparente de ECC's.
Termoestabilidad de ECC's Como se explicó en la sección previa, no toda la enzima inmovilizada es vista por el substrato durante la medición de actividad. Puesto que la enzima inaccesible no interfiere con las determinaciones de índice, la estabilidad térmica de la película puede ser determinada sin consideración especial de resistencias de difusión . A diferencia de la DFPasa nativa, la DFPasa inmovilizada tiene un perfil bifásico de termo-inactivación a 65° C (ver Figura 7). La desactivación de DFPasa inmovilizada (cuadros cerrados) y DFPasa nativa (diamantes cerrados) se condujo en solución regulada (BTP 1 0 mM, CaCI2 5 mM, pH 7.5). La actividad enzimática restante se midió con el tiempo a temperatura ambiente en medio regulado (BTP 10 mM, CaCI2 5 mM, pH 7.5) usando DFP (3 m M) como un substrato. El comportamiento bifásico se describió con un modelo de 4 parámetros y las constantes cinéticas on (0.34 ± 0.03), a2 (0.10 ± 0.01 ), ki (1 .3 ± 0.1 ) y 26
k2 (0.042 ± 0.003), se determinaron utilizando el algoritmo de Marquardt-Levenberg (SigmaPlot Versión 2.0). Se usó una temperatura elevada de 65° C para inactivar la enzima con el fin de realizar experimentos en una escala de tiempo razonable. Para este rango de períodos de incubación, los recubrimientos de poliuretano de dos componentes no se disolvieron significativamente en la fase acuosa. Inicialmente, el ECC sigue una tendencia de desactivación similar a aquella para la enzima nativa. Esta desactivación rápida inicial conduce, sin embargo, a la formación de una forma estable y activa de enzima inmovilizada con una actividad residual de 6-7%. No se observó cambio significativo en la actividad de la forma altamente estable de la DFPasa-ECC durante 350 minutos. La cinética de desactivación bifásica del ECC puede ser modelada mediante un modelo de cuatro parámetros, lo cual supone el siguiente esquema:
ai <-2 E-^?El -^?E2 Ecuación 9
E, Ei y E2 corresponden a los estados inicial, intermedio y final de la enzima. ai y a? son las actividades residuales de E-¡ y E2, respectivamente, mientras que k-¡ y k2 representan índices de desactivación de primer orden. La solución analítica para la actividad enzimática, a, se da por la Ecuación 10.
Ecuación 10
Donde t representa el tiempo de desactivación. El acomodo de la información a la Ecuación 10 se da en la Figura 7.
27
Otro modelo cinético supone la existencia de dos d iferentes formas de DFPasa en ECC's con diferentes trayectorias de desactivación, y requiriendo solamente cuatro parámetros físicos no describe adecuadamente la información experimental. No se consideraron mecanismos adicionales más complejos ya que involucran cinco o más parámetros. La inmovilización de DFPasa en espuma de poliuretano y la PEGilación indujeron también una transición de primer orden a cinéticas de inactivación bifásicas. Creemos que la termo-inactivación de la DFPasa-ECC resulta de cambios estructurales similares a aquellos descritos previamente para la termo-inactivación de monolitos de espuma de poliuretano que contiene DFPasa. Las DFPasa-ECC's exhiben una estabilidad mayor a temperatura ambiente que a 65° C. De hecho, las DFPasa-ECC's pierden solamente 40% de actividad después de 1 00 días de almacenamiento a temperatura ambiente (ver Figura 8). Se midió la actividad enzimática restante con el tiempo en un medio regulado (BTP 10 mM , CaCI2 5 mM, pH 7.5) usando FP (mM como un substrato. Dada la alta estabilidad de ECC's mantenidos secos bajo condiciones ambientales, el catalizador resultante debe ser un descontaminante efectivo para una variedad de aplicaciones .
Por lo tanto, la incorporación covalente de DFPasa a recubrimientos de poliuretano base agua ha sido realizada en la presente invención en una síntesis de proteína-polímero de un solo paso usando polio! y poíiisocianaíos. El uso de poliisocianato XP-7007 y enzima modificada con Desmodur N3400 durante el proceso de inmovilización 28
conduce a la eficiencia catalítica intrínseca más alta (con 1 8 a 38% de retención de actividad). A temperatura elevada, las DFPasa-ECC's pierden 93% de su actividad rápidamente, pero después se vuelven super-estables. Aunque la presente invención ha sido descrita en conjunto con modalidades preferidas de la misma, aquellos con pericia ordinaria reconocerán que son posibles muchas modificaciones y variaciones de la misma. La descripción precedente y las siguientes reivindicaciones tienen el propósito de cubrir todas las tales modificaciones y variaciones.
TABLA 1 Parámetros cinéticos para recubrimientos que contienen DFPasa y DFPasa soluble KM kcat koaJKM
Experimento (mM) O"1) (s"1.mM'1)
1 a*; DFPasa nativa intrínseca 0.79+0.02 232±2 293+0.3 1 b*; ECC aparente 1 .3+0.2 43+3 33+7 1 b *; ECC aparente 1 .3±0.2 70±6 54±13 2b**; ECC intrínseco 1 .0±0.1 21 +8 21 1 +4
Los errores sobre constantes específicas se calcularon como sigue:
a: DFPasa nativa 29
b: recubrimientos de poliuretano *: los parámetros cinéticos fueron evaluados a temperatura ambiente en medio regulado (bis-tris-propano 1 0 mM, CaCI2 5 mM , pH 7.5) usando concentraciones de substrato que varían desde 0 hasta 20 mM y electrodo de iones fluoruro, aplicando la ecuación de Michaelis-Menten como un modelo y usando una regresión no lineal (SigmaPlot Versión 2). #: la DFPasa se modificó con Desmodur N3400 antes de la inmovilización en recubrimientos de poliuretano. **: los parámetros cinéticos se evaluaron a temperatura ambiente en medio regulado (bis-tris-propano 10 mM , CaCI2 5 mM , pH 7.5) usando el aparato de celda de difusión.
Claims (9)
1 . Un método para inmovilizar enzimas de manera irreversible en recubrimientos de poliuretano que comprende los pasos de: Hacer reaccionar una mezcla de un co-reactivo de dispersión de poliol y una enzima para hacer una mezcla acuosa; Agregar un polüsocianato alifático que se puede dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlo reaccionar para producir una emulsión; Aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para hacer un recubrimiento que contiene enzima; y Curar el recubrimiento que contiene enzima .
2. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar una cantidad de la dispersión de poliol que es aproximadamente 2 veces más grande que la cantidad del polüsocianato alifático en el paso de ag regar un polüsocianato alifático que se puede dispersar en agua.
3. El método de la reivindicación 2 , en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar la dispersión de poliol que tiene un contenido de agua de aproximadamente 70% en peso.
4. El método de la reivindicación 3, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar un tensoactivo de polidimetil siloxano modificado con polietileno.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar un regulador de bis-tris-propano y 31 CaCI2.
6. El método de la reivind icación 5, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar aproximadamente 2.5 g del co-reactivo de dispersión de poliol y el paso de agregar un poliisocianato alifático que se puede dispersar en agua incluye agregar aproximadamente 1 .0 g del poliisocianato alifático.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar aproximadamente 0.02-9 mg de diisopropilfluorofosfatasa.
8. El método de la reivindicación 7, que incluye el paso de hacer reaccionar y modificar la diisopropilfluorofosfatasa con una resina de poliisocianato alifático de baja viscosidad con base en hexametilén diisocianato antes del paso de hacer reaccionar una mezcla.
9. Un método para inmovilizar diisopropilfluorofosfatasa de manera irreversible en recubrimientos de poíiuretano que comprende los pasos de: Hacer reaccionar una mezcla de un co-reactivo de dispersión de poliol que tiene un contenido de agua de 70% en peso, un tensoactivo de polidimetil siloxano modificado con poliéter, un medio regulado constituido por regulador bis-tris-propano y CaCI2 y diisopropilfluorofosfatasa para hacer una mezcla acuosa; Agregar un poliisocianato alifático que se puede dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlo reaccionar para producir una emulsión; Aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para 32 hacer un recubrimiento que contiene enzima; y Curar el recubrimiento que contiene enzima . 1 0. El método de la reivindicación 9, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar una cantidad de la dispersión de poliol que es aproximadamente 2 veces más grande que la cantidad del poliisocianato alifático en el paso de agregar un poliisocianato aüfático que se puede dispersar en agua. 1 1 . El método de la reivindicación 1 0, que incluye el paso de hacer reaccionar y modificar la diisopropilfluorofosfatasa con una resina de poliisocianato alifático de baja viscosidad con base en hexametilén diisocianato antes del paso de hacer reaccionar una mezcla. 12. Un recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso que comprende los pasos de: Hacer reaccionar una mezcla de un co-reactivo de dispersión de poliol y una enzima para hacer una mezcla acuosa; Agregar un poliisocianato alifático que se puede dispersar en agua con base en hexametilén diisocianato a la mezcla acuosa y hacerlo reaccionar para producir una emulsión ; Aplicar la emulsión sobre paneles de poliolefina termoplástica para hacer un recubrimiento que contiene enzima; y Curar el recubrimiento que contiene enzima. 1 3. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 12, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar una cantidad de la dispersión de poliol que es aproximadamente 2 veces más grande que la cantidad del 33 poliisocianaío alifático en el paso de agregar un polüsocianato alifático que se puede dispersar en agua. 1 4. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 1 3, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar la dispersión de poliol que tiene un contenido de agua de aproximadamente 70% en peso. 1 5. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 14, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar un tensoactivo de polidimetil siloxano modificado con polietileno. 16. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 1 5, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar un regulador de bis-tris-propano y CaCI2. 1 7. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 1 6, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar aproximadamente 2.5 g del co-reactivo de dispersión de poliol y el paso de agregar un polüsocianato alifático que se puede dispersar en agua incluye agregar aproximadamente 1 .0 g del polüsocianato alifático. 1 8. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 1 7, en donde el paso de hacer reaccionar una mezcla incluye agregar aproximadamente 0.02-9 mg de diisopropilfluorofosfatasa. 1 9. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 12 que tiene entre 10% y 1 00% de retención 34 de actividad. 20. El recubrimiento que contiene enzima hecho mediante el proceso de la reivindicación 12 que tiene un grado de inmovilización de la diisopolifluorofosfatasa de aproximadamente 100%. 35 RESU M E N Esta invención proporciona un método para inmovilizar una enzima de manera irreversible en recubrimientos de poliuretano. Esta invención proporciona también un recubrimiento que contiene enzima que tiene un grado de inmovilización de la enzima de aproximadamente 100%. La síntesis de recubrimientos de poliuretano base agua en la presencia de enzima ha permitido la unión irreversible de la enzima a la matriz polimérica. La distribución de la enzima inmovilizada así como también la retención de actividad son homogéneas dentro del recubrimiento. Disminuyendo el carácter hidrofóbico de ECC, vía el uso de un prepolímero de poliisocianato menos hidrofóbico durante la polimerización, aumentó significativamente la actividad intrínseca del ECC.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30745001P | 2001-07-24 | 2001-07-24 | |
| PCT/US2002/023473 WO2003066851A2 (en) | 2001-07-24 | 2002-07-24 | Irreversible immobilization of diisopropylfluorophophatase into polyurethane coatings |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA04000736A true MXPA04000736A (es) | 2005-02-17 |
Family
ID=27734194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MXPA04000736A MXPA04000736A (es) | 2001-07-24 | 2002-07-24 | Inmovilizacion irreversible de diisopropilfluorofosfatasa en recubrimientos de poliuretano. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6905733B2 (es) |
| EP (1) | EP1409663A2 (es) |
| JP (1) | JP2005516620A (es) |
| KR (1) | KR20040023672A (es) |
| AU (1) | AU2002365908A1 (es) |
| BR (1) | BR0211402A (es) |
| CA (1) | CA2454826A1 (es) |
| MX (1) | MXPA04000736A (es) |
| WO (1) | WO2003066851A2 (es) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6036924A (en) | 1997-12-04 | 2000-03-14 | Hewlett-Packard Company | Cassette of lancet cartridges for sampling blood |
| US6391005B1 (en) | 1998-03-30 | 2002-05-21 | Agilent Technologies, Inc. | Apparatus and method for penetration with shaft having a sensor for sensing penetration depth |
| US8641644B2 (en) | 2000-11-21 | 2014-02-04 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Blood testing apparatus having a rotatable cartridge with multiple lancing elements and testing means |
| US7699791B2 (en) | 2001-06-12 | 2010-04-20 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for improving success rate of blood yield from a fingerstick |
| US9795747B2 (en) | 2010-06-02 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US8337419B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-12-25 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| WO2002100252A2 (en) | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Blood sampling apparatus and method |
| JP4209767B2 (ja) | 2001-06-12 | 2009-01-14 | ペリカン テクノロジーズ インコーポレイテッド | 皮膚の性状の一時的変化に対する適応手段を備えた自動最適化形切開器具 |
| US9427532B2 (en) | 2001-06-12 | 2016-08-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| WO2002100460A2 (en) | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Electric lancet actuator |
| US7041068B2 (en) | 2001-06-12 | 2006-05-09 | Pelikan Technologies, Inc. | Sampling module device and method |
| US9226699B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-01-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling module with a continuous compression tissue interface surface |
| US7981056B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-07-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US7749174B2 (en) | 2001-06-12 | 2010-07-06 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for lancet launching device intergrated onto a blood-sampling cartridge |
| US7335400B2 (en) * | 2001-07-24 | 2008-02-26 | University Of Pittsburgh | Irreversible immobilization of enzymes into polyurethane coatings |
| US8579831B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-11-12 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7291117B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-11-06 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7547287B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-06-16 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7708701B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-05-04 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for a multi-use body fluid sampling device |
| US7232451B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7229458B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7892183B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-02-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing |
| US7717863B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-05-18 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7976476B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-07-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Device and method for variable speed lancet |
| US8267870B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-09-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for body fluid sampling with hybrid actuation |
| US7674232B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-03-09 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8784335B2 (en) | 2002-04-19 | 2014-07-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling device with a capacitive sensor |
| US7175642B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-02-13 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US7648468B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-01-19 | Pelikon Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9314194B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-04-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US7901362B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-08 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8221334B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-07-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7297122B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-11-20 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7491178B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-02-17 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9248267B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-02-02 | Sanofi-Aventis Deustchland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9795334B2 (en) | 2002-04-19 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7371247B2 (en) | 2002-04-19 | 2008-05-13 | Pelikan Technologies, Inc | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7909778B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7331931B2 (en) | 2002-04-19 | 2008-02-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8702624B2 (en) | 2006-09-29 | 2014-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Analyte measurement device with a single shot actuator |
| US6762213B2 (en) * | 2002-08-08 | 2004-07-13 | Agentase, Llc | Buffer polymers, co-immobile buffer and enzyme polymers and methods of synthesis thereof |
| US20110250626A1 (en) * | 2002-09-09 | 2011-10-13 | Reactive Surfaces, Ltd. | Visual Assays for Coatings Incorporating Bioactive Enzymes for Catalytic Functions |
| US8574895B2 (en) | 2002-12-30 | 2013-11-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus using optical techniques to measure analyte levels |
| WO2004107964A2 (en) | 2003-06-06 | 2004-12-16 | Pelikan Technologies, Inc. | Blood harvesting device with electronic control |
| WO2006001797A1 (en) | 2004-06-14 | 2006-01-05 | Pelikan Technologies, Inc. | Low pain penetrating |
| US8282576B2 (en) | 2003-09-29 | 2012-10-09 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for an improved sample capture device |
| US9351680B2 (en) | 2003-10-14 | 2016-05-31 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for a variable user interface |
| US7822454B1 (en) | 2005-01-03 | 2010-10-26 | Pelikan Technologies, Inc. | Fluid sampling device with improved analyte detecting member configuration |
| EP1706026B1 (en) | 2003-12-31 | 2017-03-01 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Method and apparatus for improving fluidic flow and sample capture |
| US8828203B2 (en) | 2004-05-20 | 2014-09-09 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Printable hydrogels for biosensors |
| EP1765194A4 (en) | 2004-06-03 | 2010-09-29 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND APPARATUS FOR MANUFACTURING A DEVICE FOR SAMPLING LIQUIDS |
| US8652831B2 (en) | 2004-12-30 | 2014-02-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for analyte measurement test time |
| US20070199816A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Zhisheng Sun | Fluoride ion selective electrode |
| US9828597B2 (en) | 2006-11-22 | 2017-11-28 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Biofunctional materials |
| US9386944B2 (en) | 2008-04-11 | 2016-07-12 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for analyte detecting device |
| US9375169B2 (en) | 2009-01-30 | 2016-06-28 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cam drive for managing disposable penetrating member actions with a single motor and motor and control system |
| US8679825B2 (en) * | 2009-05-01 | 2014-03-25 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Method facilitating removal of bioorganic stains from surfaces |
| US8252571B2 (en) * | 2009-05-01 | 2012-08-28 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Preparation of solvent-borne polymeric bioactive coatings |
| US8367389B2 (en) | 2009-09-11 | 2013-02-05 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods, compositions and devices utilizing structurally stable cyanuric acid hydrolase |
| US8965476B2 (en) | 2010-04-16 | 2015-02-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9121016B2 (en) | 2011-09-09 | 2015-09-01 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| US11015149B2 (en) | 2010-06-21 | 2021-05-25 | Toyota Motor Corporation | Methods of facilitating removal of a fingerprint |
| US8394618B2 (en) | 2010-06-21 | 2013-03-12 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Lipase-containing polymeric coatings for the facilitated removal of fingerprints |
| US8796009B2 (en) | 2010-06-21 | 2014-08-05 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains |
| US9388370B2 (en) | 2010-06-21 | 2016-07-12 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains |
| US10988714B2 (en) | 2010-06-21 | 2021-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating |
| US8889373B2 (en) | 2010-08-12 | 2014-11-18 | Eastman Chemical Company | Enzyme catalyst immobilized on porous fluoropolymer support |
| US8911986B2 (en) | 2011-04-29 | 2014-12-16 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| US10233437B2 (en) | 2015-03-02 | 2019-03-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Hypochlorite resistant cyanuric acid hydrolases and methods of use thereof |
| CN107937381A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-04-20 | 深圳市长隆科技有限公司 | 一种增强增韧聚乙烯醇球状微生物载体及其制备方法 |
| US11576595B2 (en) | 2018-04-06 | 2023-02-14 | Zense-Life Inc. | Enhanced sensor for a continuous biological monitor |
| CN112292078A (zh) | 2018-04-06 | 2021-01-29 | 赞思健康科技有限公司 | 连续葡萄糖监测装置 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3672955A (en) * | 1970-05-20 | 1972-06-27 | Us Agriculture | Preparation of an insoluble active enzyme |
| US4342834A (en) * | 1972-05-03 | 1982-08-03 | W. R. Grace & Co. | Enzymes bound to polyurethane |
| US3929574A (en) * | 1972-05-03 | 1975-12-30 | Grace W R & Co | Use of enzymes bound to polyurethane |
| US4195127A (en) * | 1975-06-10 | 1980-03-25 | W. R. Grace & Co. | Process for immobilizing proteins |
| BE861602A (fr) * | 1976-12-10 | 1978-03-31 | Grace W R & Co | Proteines propres a la dispersion dans l'eau modifiees par des polyurethannes |
| IL108957A (en) * | 1994-03-14 | 1998-09-24 | Scidel Technologies Ltd | Video sequence imaging system |
| WO1996006392A1 (en) * | 1994-08-18 | 1996-02-29 | Interval Research Corporation | Content-based haptic input device for video |
| US5920360A (en) * | 1996-06-07 | 1999-07-06 | Electronic Data Systems Corporation | Method and system for detecting fade transitions in a video signal |
| US6154600A (en) * | 1996-08-06 | 2000-11-28 | Applied Magic, Inc. | Media editor for non-linear editing system |
| RU2161871C2 (ru) * | 1998-03-20 | 2001-01-10 | Латыпов Нурахмед Нурисламович | Способ и система для создания видеопрограмм |
| US6266100B1 (en) * | 1998-09-04 | 2001-07-24 | Sportvision, Inc. | System for enhancing a video presentation of a live event |
| JP4126126B2 (ja) * | 1998-12-11 | 2008-07-30 | 株式会社日立製作所 | 送信システム、送信方法 |
| US6771323B1 (en) * | 1999-11-15 | 2004-08-03 | Thx Ltd. | Audio visual display adjustment using captured content characteristics |
| US6870574B2 (en) * | 2000-03-08 | 2005-03-22 | Mitchell Kriegman | Method and apparatus for enhanced puppetry or similar types of performances utilizing a virtual set |
| EP1287687B1 (en) * | 2000-05-22 | 2005-11-09 | Sony Computer Entertainment Inc. | Information processing apparatus, graphic processing unit, graphic processing method, storage medium, and computer program |
| JP4327370B2 (ja) * | 2001-02-28 | 2009-09-09 | ヤマハ株式会社 | ビデオミキサー装置 |
| US7224403B2 (en) * | 2001-04-17 | 2007-05-29 | Bowden Raymond E | Televised scoreboard or statistics presentation with colors corresponding to players' uniforms |
| US6937295B2 (en) * | 2001-05-07 | 2005-08-30 | Junaid Islam | Realistic replication of a live performance at remote locations |
| US6685326B2 (en) * | 2001-06-08 | 2004-02-03 | University Of Southern California | Realistic scene lighting simulation |
| EP1433317B1 (en) * | 2001-07-19 | 2007-05-02 | Thomson Licensing | Fade resistant digital transmission and reception system |
| US7224404B2 (en) * | 2001-07-30 | 2007-05-29 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Remote display control of video/graphics data |
| US7020336B2 (en) * | 2001-11-13 | 2006-03-28 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Identification and evaluation of audience exposure to logos in a broadcast event |
| WO2003050276A1 (en) * | 2001-12-05 | 2003-06-19 | Dow Global Technologies Inc. | Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications |
| US7254268B2 (en) * | 2002-04-11 | 2007-08-07 | Arcsoft, Inc. | Object extraction |
| US7319493B2 (en) * | 2003-03-25 | 2008-01-15 | Yamaha Corporation | Apparatus and program for setting video processing parameters |
| JP4107138B2 (ja) * | 2003-04-04 | 2008-06-25 | ソニー株式会社 | 特殊効果装置、キー信号制御装置及びキー信号制御方法 |
| JP4251320B2 (ja) * | 2003-07-11 | 2009-04-08 | 株式会社沖データ | 光源推定方法およびその装置 |
-
2002
- 2002-07-24 CA CA002454826A patent/CA2454826A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-24 US US10/202,224 patent/US6905733B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-24 AU AU2002365908A patent/AU2002365908A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-24 KR KR10-2004-7001032A patent/KR20040023672A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-07-24 JP JP2003566201A patent/JP2005516620A/ja active Pending
- 2002-07-24 WO PCT/US2002/023473 patent/WO2003066851A2/en active Application Filing
- 2002-07-24 EP EP02806756A patent/EP1409663A2/en not_active Withdrawn
- 2002-07-24 BR BR0211402-0A patent/BR0211402A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-07-24 MX MXPA04000736A patent/MXPA04000736A/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003066851A2 (en) | 2003-08-14 |
| AU2002365908A8 (en) | 2003-09-02 |
| WO2003066851A3 (en) | 2003-12-04 |
| AU2002365908A1 (en) | 2003-09-02 |
| CA2454826A1 (en) | 2003-08-14 |
| US6905733B2 (en) | 2005-06-14 |
| BR0211402A (pt) | 2005-02-22 |
| US20030129314A1 (en) | 2003-07-10 |
| JP2005516620A (ja) | 2005-06-09 |
| EP1409663A2 (en) | 2004-04-21 |
| KR20040023672A (ko) | 2004-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| MXPA04000736A (es) | Inmovilizacion irreversible de diisopropilfluorofosfatasa en recubrimientos de poliuretano. | |
| US7521504B2 (en) | Irreversible immobilization of enzymes into polyurethane coatings | |
| EP1234051B1 (en) | Enzyme-containing polymeric sensors | |
| Drevon et al. | High‐activity enzyme‐polyurethane coatings | |
| Romaškevič et al. | Application of polyurethane-based materials for immobilization of enzymes and cells: a review | |
| CA2238648C (en) | Hydrophilic, swellable coatings for biosensors | |
| WO2003050276A1 (en) | Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications | |
| KR20090017515A (ko) | 수계 폴리이소시아네이트 변성체, 무황변형 도료 조성물 및접착제 조성물 | |
| US6759220B1 (en) | Enzyme-containing polyurethanes | |
| Drevon et al. | Irreversible immobilization of diisopropylfluorophosphatase in polyurethane polymers | |
| CA1088008A (en) | Immobilized biological material | |
| He et al. | α-Amylase immobilized on bulk acoustic-wave sensor by UV-curing coating | |
| CN101505808A (zh) | 包含活性成分的纳米脲的分散体 | |
| Strakšys et al. | Synthesis and characterization of poly (urethane-urea) microparticles from poly (vinyl alcohol) and binary blends of diisocyanates and their application for immobilization of maltogenic α-amylase | |
| NL7905745A (nl) | Diagnostisch preparaat, werkwijze voor het analyseren van menselijke lichaamsvloeistoffen alsmede werkwijze voor het binden van enzymen. | |
| Budriene et al. | Synthesis and characterization of polyurethane microspheres and their application for immobilization of maltogenase | |
| Poojari et al. | Immobilization and activity of pepsin in silicone elastomers | |
| JPH045435B2 (es) | ||
| Lele et al. | Enhancing bioplastic–substrate interaction via pore induction and directed migration of enzyme location | |
| Wu | Enzyme-polymer hybrids for highly stable functional materials and self-cleaning coatings | |
| Tudos et al. | Enzyme Immobilisation Studies for Sensor Applications | |
| GB2087076A (en) | Method of analysis | |
| GB2086395A (en) | Enzymatic Diagnostic Composition | |
| JPS62186792A (ja) | 生体触媒類の固定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Grant or registration |