MXPA03011765A - Calendulas tagetes erecta con composiciones y proporciones de carotenoide alterado. - Google Patents

Abstract

Se describen una planta de calendula, una porcion regenerable de la misma y semillas, cuyos petalos de la flor, hojas o petalos de la flor y hojas contienen una o mas de una proporcion de zeaxantina mejorada, una proporcion de neoxantina mejorada mas violaxantina, una proporcion de ??-caroteno mejorada, una proporcion de a-criptoxantina mejorada, una proporcion de fitoeno mejorada, o una proporcion de fitoflueno mejorada en relacion con aquella proporcion en una calendula no mutante. Los petalos de la flor de tal planta tambien contienen normalmente zeta-caroteno que no se encuentra normalmente en tales petalos. Se describen tambien metodos para preparar tales plantas, resinas oleaginosas y materiales comestibles que tienen tales proporciones de carotenoide.

Description

CALÉNDULAS Tagetes erecta CON COMPOSICIONES Y PROPORCIONES DE CAROTENOIDE ALTERADO CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a una planta de caléndula que contiene pigmentos carotenoide presentes aparte de las proporciones usuales. La invención se relaciona m s particularmente a una planta de caléndula, una porción regenerable de la misma, un híbrido o generación posterior cuyos pétalos, hojas o tanto pétalos como hojas, contienen una proporción mejorada de uno o más compuestos carotenoide en relación a luteina, y también semillas que producen tal planta de caléndula, una resina oleaginosa producida a partir de tales flores u hojas y productos comestibles hechos utilizando zeaxantina y luteina. Los pétalos de la flor de tal caléndula contemplada normalmente contienen también una cantidad medible de zeta-caroteno, un compuesto no encontrado normalmente en los pétalos de la flor de caléndula.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Numerosos estudios epidemiológicos en varias poblaciones han mostrado que el consumo de cantidades sustanciales de frutas y vegetales ricos en carotenoides puede reducir el riesgo de adquirir varios tipos de cánceres. Como un resultado, los científicos se han enfocado en investigar el efecto protector de los carotenoides tales como beta- (ß- ) caroteno en la prevención de cáncer, enfermedades cardiovasculares y de los ojos. Se han llevado a cabo estos estudios a pesar del hecho que el ß-caroteno es sólo uno de los carotenoides prominentes encontrados en frutas y vegetales cuyo consumo se ha asociado con beneficios de salud. Las razones para tal enfoque pueden atribuirse a la actividad de pro-vitamina A de ß-caroteno y la disponibilidad comercial limitada de otros carotenoides alimenticios prominentes. Entre los 40 ó 50 carotenoides que están disponibles de la dieta y pueden absorberse, metabolizarse o utilizarse por el cuerpo humano, únicamente 13 carotenoides y 12 de sus estereoisómeros se encuentran habitualmente en el suero humano y la leche. [Véase hachik et al., Anal. Chem. , 69:1873-1881 (1997)]. Además, existen 8 metabolitos carotenoides y un estereoisómero en suero humano o plasma que resulta de una serie de reacciones de oxidación-reducción de tres carotenoides dietéticos: leuteína, zeaxantina y licopeno. Estos metabolitos primero se aislaron y se caracterizaron por Khachik et al. [véase Khachik et al., Anal. Chem., 64:2111-2122 (1992)]. En otro estudio, la ingestión de suplementos purificados de dieta (3R, 3'R, 6'R)-luteína y (3R,3'R)-zeaxantina se mostró no únicamente resultar en incremento en los niveles sanguíneos de estos compuestos en humanos, sino también en un incremento en la concentración de sus metabolitos oxidativos en plasma. [Véase Khachik et al., J. Cellular Biochem. , 22: 236-246 (1995)] . Estos hallazgos proporcionan evidencia preliminar de que los carotenoides pueden funcionar como antioxidantes en prevención de enfermedades. Además, estos resultados también establecen la importancia de carotenoides dietéticos activo sin vitamina A, particularmente luteína, zeaxantina y licopeno. Existe evidencia incrementada que los carotenoides de pigmento macular, luteína y zeaxantina pueden jugar un papel importante en la prevención de degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) , formación de catarata, y otro daño al ojo oxidativo inducido por la luz. En 1985 y 1993, Bone et al., demostró que el pigmento macular humano es una combinación de luteína y zeaxantina, y se especuló que estos carotenoides dietéticos pueden jugar un papel en la prevención de una enfermedad del ojo ARMD. [Véase Bone et al., Vision Research, 25:1531-1535 (1985) y Bone et al., Jnvest. Opthalmol. Vise. Sci . , 34: 2033-2040 (1993)] . Además, trabajó en un estudio epidemiológico que controló el caso en donde el consumo elevado de frutas y vegetales, ricos específicamente en luteína y zeaxantina se correlacionó a un 43 por ciento de riesgo inferior de ARMD posteriormente confirmó esa especulación. [Véase Seddon et al., J". A. Med.

Assoc, 272 (18) 1413-1420 (1994)]. Se ha reportado también que un nivel incrementado de carotenoides en suero diferentes de ß-caroteno se asocia con una incidencia inferior de enfermedad cardiaca [véase Morris et al., J". Amer. Med. Assoc., 272 (18) .1439-1441 (1994)]. Bernstein et al., identificó y cuantificó los carotenoides dietéticos y sus metabolitos oxidativos en todos los tejidos del ojo humano y reportó que casi todas las estructuras oculares examinadas con la excepción del vxtreo, córnea y esclerosis tuvieron niveles cuantificables de dieta (3R, 3'R, 6 ' R) -luteina, zeaxantina, sus isómeros geométricos (E/Z) , así como sus metabolitos, (3R, 3'S, 6' R) -luteina (3'-epiluteina) y 3-hidroxi-beta, epsilon-caroten-3 ' -ona . En el iris, estos pigmentos se pensaron jugaban un papel en filtrar luz visible de longitud de onda corta fototóxica y para actuar como antioxidante en el cuerpo ciliar. Ambos mecanismos pueden ser operativos en el epitelio/coroide del pigmento retinal (RPE/coroides) . [Véase Bernstein et al., Exp. Eye Research, 72(3): 215-223 (2001)]. Un estudio de la distribución de los estereoisómeros de pigmento macular en la retina humana identificó (3S, 3 ' S) -zeaxantina en la retina adulta, particularmente en la mácula. Se propuso que la luteina y zeaxantina dietética se transporten en una retina del individuo en las mismas proporciones encontradas en el suero sanguíneo, aunque los dos pigmentos se presentan en el ojo en proporciones diferentes de aquellas encontradas en la sangre. Así, la zeaxantina predomina sobre la luteína por una proporción mayor de 2:1 en la región foveal, con la densidad óptica del pigmento macular descendiendo por un factor de 100 y la zeaxantina en proporción de luteína invirtiendo a aproximadamente 1:2. [Véase Bone et al., Invest. Ophthalmol . Vis. Sci., 29:843-849 (1988)]. Alguna luteína se convierte en la meso- zeaxantina no dietética principalmente en la mácula. [Véase Bone et al., Exp. Eye Res., 64 (2): 211-218 (1997)]. Tales reportes prestan apoyo al papel crítico de carotenoides oculares, y por lo tanto la importancia de producción comercial de carotenoides dietéticos en general, y particularmente luteína y zeaxantina. El género Tagetes es un miembro de la familia Compositae, alternativamente conocida como Asteraceae, y comprende algunas treinta especies de hierbas fuertemente aromáticas anuales o perennes. Los tagetes son nativos de Arizona y Muevo México a Argentina. [Véase Hortus Third A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States and Canadá, MacMillan Publishing Company (1976)] . El género cultivado incluye Tagetes erecta, comúnmente mencionada como caléndula africana, Tagetes patula, comúnmente mencionada como caléndula francesa, Tagetes erecta x patula, comúnmente mencionada como caléndulas Triploide, y Tagetes tenuifolia. también conocida como Tagetes signata o caléndula de sello. Una florescencia de caléndula es una cabeza solitaria que comprende de un ramo denso de varios cientos de sésiles o subsésiles de flores pequeñas también conocidos como florecillas. Las caléndulas tienen inflorescencias con florecillas de rayo exteriores que se ligulan o en forma de lígula alrededor de las florecillas del disco en forma tubular central . Algunas formas de las inflorescencias de la caléndula tienen más de sus flores de disco transformadas en flores de rayo y contienen pocas, si las hay, flores de disco. Tales inflorescencias se refieren a doble floreado. Las flores de rayo o florecillas se refieren con frecuencia como pétalos por personas especializadas quienes pueden también referirse a las inflorescencias como flores. Para facilidad de entendimiento, las inflorescencias de la caléndula se referirán en la presente como flores o inflorescencias, mientras que las flores del componente de inflorescencia o florecillas se referirán como pétalos. Las caléndulas cultivadas poseen flores ostentosas y son útiles para propósitos ornamentales. Además, el género se reconoce como una fuente para colorantes naturales, aceites esenciales, y tiofenos . Los pétalos de caléndula secos y concentrados de pétalo de caléndula obtenidos de las caléndulas de xantofila llamada así se utilizan como aditivos alimenticios en la industria de aves de corral para intensificar el color amarillo de las yemas del huevo y piel de pollos para asar. [Véase Piccalia et al., Ind. Crops and Prod. , 8:45-51 (1998)] . Los carotenoides deseados en tejidos de aves de corral son una función de su concentración dietética, debido a que las aves de corral no tienen la capacidad para sintetizar los carotenoides de novo. [Véase Balnave et al., Asian-Australiasian J. Animal. Sci., 9(5): 515-517 (1996) ] . Las caléndulas xantofila difieren en varias características de las caléndulas ornamentales. Por encima de todo, las caléndulas xantofila se utilizan como una fuente extraíble para carotenoides y tiene hábitos de planta que difieren de la caléndula ornamental. Las caléndulas ornamentales normalmente crecen únicamente aproximadamente 45 a aproximadamente 60 cm del suelo. Mientras que las caléndulas xantofila crecen de aproximadamente 65 a 70 cm del suelo. Las caléndulas xantofila crecen en un ambiente espeso que las caléndulas ornamentales, y pueden cultivarse como cosechas en fila mientras que las caléndulas ornamentales normalmente no pueden. Las caléndulas xantofila son normalmente anaranjado oscuro en color, mientras que las ornamentales pueden ser blancas, amarillas o anaranjadas en color, o pueden tener colores mezclados, incluyendo colores caoba debido a la presencia de pigmentos de antocianina.

La capacidad de pigmentación del polvo de pétalo de caléndula reside principalmente en la fracción carotenoide oxigenada conocida como las xantofilas, principalmente ésteres de luteína. [Véase Piccalia et al., Ind. Crops and Prod., 8:45-51 (1998)]. La zeaxantina xantofila, también encontrada en pétalos de caléndula, se ha mostrado que es efectiva como un pigmentador de pollo para asar, produciendo un color amarillo altamente aceptable a amarillo-anaranjado [véase Marusich et al., Poultry Sci . , 55:1486-1494 (1976)]. De las xantofilas, los pigmentos de luteína y zeaxantina son los más abundantes en híbridos comercialmente disponibles. Las fórmulas estructurales para la luteína y zeaxantina se muestran como sigue .

Luteina Zeaxantina Cada una de las luteínas y zeaxantinas contienen un grupo hidroxilo en cada una de sus estructuras de anillo terminales, de manera que cada molécula contiene dos grupos hidroxilo. Se cree que la luteína se produce biológicamente por dos hidroxilaciones separadas de a-caroteno, mientras que la zeaxantina se cree que se produce biológicamente por dos hidroxilaciones separadas de ß-caroteno. Tanto el a-caroteno como el ß-caroteno se entienden que se forma por la acción de enzimas de ciclasa apropiadas en ?-caroteno, que por si mismo se forma por ciclización de licopeno. El licopeno, ?-caroteno, a-caroteno y ß-caroteno son cada uno carotenoides hidrocarburos. La Figura 1 muestra una representación esquemática de la trayectoria de síntesis biológica para la producción de luteína y zeaxantina y productos posteriores de fitoeno, el primer carotenoide de C4o en la trayectoria. La luteína y la zeaxantina se presentan en pétalos de caléndula principalmente como mono- y di-ésteres de ácidos grasos. La Figura 1 también advierte productos posteriores que contienen epóxido que pueden elevarse de zeaxantina, de la cual la violaxantina es un intermediario en la trayectoria biosintética del ácido abscísico. Para la industria de aditivo de alimentación, las caléndulas xantofila se producen principalmente en México, Perú, Africa, India, China y Tailandia. Variedades modernas, comerciales incluyen "anaraj ada" , una de las xantofilas originales que produce variedades, y mejoras comerciales de "Anaranjado", incluyendo "Anaranjado Intenso" que tienen flores más grandes y producción de pigmento mayor, y un mejoramiento de "Color Escarlata" para concentración de xantofila. Así, el "anaranjado" se reporta contener xantofilas en aproximadamente 9-12 mg/g de inflorescencias completas secas (incluyendo cáliz) , "Anaranjado Intenso" se reporta tener aproximadamente 10-13 mg/g de esos pigmentos, y "Escarlata" se sabe contener aproximadamente 12-18 mg/g de pigmentos xantofila en inflorescencias secas que pesadas con el cáliz. Estas variedades están disponibles de PanAmerican Seed Co., 622 Town Road, West Chicago, IL 60185. Aunque la luteína es la mayor xantofila en flores de caléndula, algunas variedades actuales producen productos de extracto con proporciones de zeaxantina (zeaxantina/ (luteína + zeaxantina) ] normalmente en el rango de 3 a 5 por ciento (Véase Product Profile, Kemin Foods L.C., 600 E. Court Ave, Suite A, Des Moines, IA 50309) . Como se ve a partir de los resultados más adelante, las relaciones de zeaxantina a luteína obtenidas utilizando "Escarlata" son de manera normal de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 por ciento . Moehs et al., Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001) analizó la biosíntesis de carotenoides en variedades ornamentales de T. Erecta, incluyendo un tipo silvestre así llamado que tuvo flores anaranjado oscuro, y plantas con flores amarillas, amarillo pálido y blancas. Entre otros hallazgos, aquellos trabajadores reportaron que aunque las diferentes plantas tuvieron un rango en color de flor de blanco a anaranjado oscuro, las diferencias en aquellos colores de las flores se dicen deberse a la acumulación de cantidades muy diferentes del mismo carotenoide, luteina, en lugar de la acumulación de diferentes productos de carotenoide o intermediarios . Las diferencias entre las plantas estudiadas parecen relacionarse principalmente a la regulación de flujo a través de la trayectoria del carotenoide, en lugar de al tipo específico de carotenoide producido o la acumulación de intermediarios biosintéticos . Además, el tipo silvestre así llamado y hojas mutantes se reportó que contenían aproximadamente la misma cantidad de pigmentos carotenoide, independientemente del color de la flor. Aquellos pigmentos fueron diferentes de los pigmentos presentes en los pétalos. Así, el único pigmento reportado para los pétalos fue luteina, mientras que las hojas se reportó que contenían luteina así como ß-caroteno, violaxantina y neoxantina. Como se ve a partir de la Figura 1, ß-caroteno, pero no la luteina puede ser un precursor a los últimos dos pigmentos. Los autores oehs et al., también compararon los genes T. Erecta, aislaron con genes que producen carotenoide similares obtenidos de las hojas de Arabidopsis thaliana (Pogson et al . , más adelante) . Las identidades entre los productos genéticos de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 por ciento se reportaron en el nivel de proteína, con un nivel más elevado si se excluyeron los péptidos de señal objetivo de la plastida putativa, y un nivel inferior de identidad en el nivel de ADN. En las hojas de A. thaliana, la lutexna es el carotenoide predominante, con ß-caroteno, violaxantina y neoxantina también siendo formada, pero no zeaxantxna que se acumula normalmente. La biosíntesis de carotenoide en T. Erecta es un sistema complejo que implica muchos genes y posiblemente dos trayectorias . El impacto de las mutaciones genéticas en la producción de carotenoide no puede predecirse a priori . Sin embargo, las técnicas de reproducción clásicas han producido variantes de T. Erecta "Anaranjado", "Anaranjado Intenso" y "Escarlata" que produce los niveles elevados de xantofilas observadas anteriormente. Estas variedades reproducidas relativamente recientemente no han sido sometidas a tratamientos que inducen mutaciones genéticas en un intento por incrementar las proporciones de zeaxantxna. Varios trabajadores han examinado los efectos de mutagenes tal como irradiación gamma, metansulfonato de etilo (EMS) y nitrosometilurea ( MU) en plantas florecientes, incluyendo caléndulas. Por ejemplo, Zaharia et al., Buletinul Institutului Agronomía Cluj-Napoca, Seria Agricultura 44(1): 107-114 (1991) reportado en los efectos deficientes de clorofila de carotenoides en la coleoptila después de las semillas de Zinnia elegans, Tagetes erecta y Callistephus chinensis se irradiaron con irradiación gamma en cantidades variantes. Un papel por Geetha et al., Acta Botánica Indica, 20(2) : 312-314 (1992) reporta en los efectos deficientes de clorofila de irradiación gamma en Tagetes patula. Diaconu, Agronomie, 34(1) :17-21 (1991) reporta en los efectos de EMS en semillas de germinación a partir de policruces F de caléndulas en maceta, o Cal ndula, que no son aún del género Tagetes. Aquellos trabajadores observaron una amplia variación en el color de la flor, estructura de inflorescencia, producción y contenido de sustancias biológicamente activas en plantas M2-M4. Un estudio de Pogson et al., Plant Cell, 8:1627- 1639 (1996) utilizó EMS a plantas de mutagénesis de Arabidopsis thaliana. Este estudio detallado de 4000 lineas de M2 reportó descubrir dos sitios en la trayectoria biosintética de carotenoide en hojas que están implicadas con la producción de luteína a partir de ?-caroteno. Estos sitios se refirieron como lutl y l t2. El sitio lut2 se reportó asociarse con la enzima de ciclasa del anillo e licopeno, mientras que el sitio lutl se reportó asociarse con la hidrolasa del anillo e licopeno. Estos trabajadores observaron (página 1631) que una disminución en la producción de luteína se compensó por un cambio equimolar en la abundancia de otros carotenoides , aunque únicamente pequeñas cantidades de aquellos cambios fueron debidos a una producción incrementada de zeaxantina. Cetl et al., Folia Fac. Sci . Nat. Univ. Purkinianae Brun Biol. , 21(l):5-56 (1980) reportó estudios extensos con T. Erecta y otras especies Tagetes que a partir de las pobres descripciones parecen ser todas variedades ornamentales . Entre aquellos estudios, aquellos autores examinaron los efectos de varias concentraciones de NMU en semillas de T. Erecta, y examinaron más de aproximadamente 2000 plantas. Todas las plantas M2 que se desvían del fenotipo del cruce paternal se registraron, y las plantas M3 de las semillas M2 de las plantas fenotípicamente diferentes se estudiaron. Aquellos trabajadores evaluaron la altura de la planta, diámetro de la planta, diámetro de la inflorescencia y altura de la inflorescencia así como tiempo de florecimiento, cantidad de ramificación, longitud de las ramas, tamaño del cotiledón y la hoja, y longitud del tallo de la flor. No se hizo mención respecto al color de la flor o niveles de carotenoide en las hojas o pétalos. La solicitud PCT publicada WO 00/32788 de DellaPenna et al., sostuvo un método para regular biosíntesis de carotenoide en caléndulas. Aquellos trabajadores proporcionan secuencias de polinucleótido para ser aquellas que codifican la ciclasa del anillo ß de licopeno e hidroxilasa del anillo ß de licopeno necesaria para la preparación de zeaxantina a partir del licopeno. También se describe una ciclasa del anillo e de licopeno útil junto con la ciclasa del anillo ß de licopeno para la preparación de -caroteno a partir del licopeno. No se proporciona ninguna enseñanza de la hidroxilasa del anillo e de licopeno necesaria para la producción de luteína. La biosíntesis de carotenoide se dice regularse en la solicitud de PCT WO 00/32788 por la expresión de un gen que codifica la enzima que sintetiza carotenoide ya presente en caléndulas tales como aquellas observadas anteriormente, o por el uso de un ARN anti-sentido que codifica para tal secuencia de nucleótido proporcionada. No se proporciona ninguna evidencia de tal regulación en la solicitud. El fenómeno conocido como co-supresión por el cual la adición de un gen homólogo provoca que tanto el gen nativo como el transgen no sea expresado ni se comercie por aquellos trabajadores, [Véase por ejemplo, Fray et al., Plaxit Mol. Biol.r 22:589-692 (1993) o Finnegan et al., Bio/ echnology, 12:883-888 (Septiembre de 1994)]. Una proporción incrementada de zeaxantina a luteína puede también proporcionar un sustrato atractivo para la producción biotecnológica de xantofilas adicionales incluyendo la xantofila roja, astaxantina. La astaxantina se utiliza ampliamente como un agente de pigmentación para cultivar peces y mariscos. Las propiedades biomédicas completas de astaxantina permanecen para aclararse, pero los resultados iniciales sugieren que podrían jugar un papel importante en la prevención de tumor y de cáncer, así como producir una respuesta positiva a partir del sistema inmune. [Véase Tanaka et al., Carcinogenesis 15(1):15-19 (1994), Jyonouchi et al., Nutrition and Cáncer 19 (3) : 269-280 (1993) and Jyonouchi et al., Nutrition and Cáncer 16(2): 93-105 (1991) ] . La astaxantina suministrada a partir de fuentes biológicas, tales como crustáceos, levadura y algas verdes se limita por producción baja y métodos de extracción costosos cuando se comparan con ese obtenido por los métodos sintéticos orgánicos. Los métodos sintéticos usuales sin embargo, producen subproductos que pueden considerarse inaceptables . Es por lo tanto deseable encontrar una fuente relativamente barata de (3S , 3 ' S) -astaxantina para utilizarse como un suplemento alimenticio en acuacultura y como un químico valioso para otros usos industriales. Un método para incrementar la productividad de la producción de astaxantina en un sistema biológico es utilizar tecnología de ingeniería genética. Se han reportado genes adecuados para esta conversión. Por ejemplo, Misawa et al. (Véase Patente Norteamericana No. 6,150,130) especifica las secuencias de ADN que incluyen un aislado a partir de la bacteria marina Agrobacterium aurantiacus sp. Nov. MK1 o Alcaligenes sp. PC-1 que codifican un gen, mencionado como crtW, utilizado en la producción de astaxantina a partir de zeaxantina como un sustrato a manera de 4-cetozeaxantin . Kaj iwara et al. (Véase Patente Norteamericana No. 5,910,433) identifica una molécula de polinucleótido, mencionada como bkt, aislada de Haematococcus pluvialis que codifica un polipeptido que tiene una actividad de beta-C-4-oxigenasa para la producción de (3S , 3 ' S) astaxatina de un microorganismo huésped o una planta. Además, hirschberg et al., (véase Patente Norteamericana No. 5,965,795) describe otra secuencia genética de ADN a partir de Haematococcus pluvialis, mencionado como crtO, que codifica una enzima que sintetiza astaxantina a partir de zeaxantina a manera de 4-cetozeaxantina. Aún todavía, Cunning am (véase WO 99/61652) reporta aislamiento de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de enzima cetolasa a partir de Adonis aestivalis, una especie de planta que tiene color de flor rojo profundo debido en parte a la acumulación de la astaxantina cetocarotenoide . Sería por lo tanto útil si una planta de caléndula pudiera proporcionarse cuyos pétalos de la flor u hojas o ambos contengan una cantidad comercialmente útil de xantofilas y una proporción alterada de luteína y zeaxantina de manera que el nivel de zeaxantina que usualmente reporta 4 a aproximadamente 7 por ciento se incrementó y la cantidad de luteína se disminuyó. Sería también útil si las proporciones de otros pigmentos pudieran también elevarse, y si tal planta tuviera sustancialmente las mismas características fenotípicas como una planta de caléndula usual que crece adyacente a ésta. La presente invención proporciona varias de tales plantas, pétalos de flor, hojas, semillas que las producen, híbridos, resinas oleaginosas, mezclas de zeaxantina y luteína y materiales comestibles que contienen zeaxantina, luteína, a-criptoxantina, anteraxantina, neoxantina y violaxantina, y ß-caroteno disuelto o dispersado en un medio comestible.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención contempla plantas de caléndula, cuyos pétalos, hojas o pétalos de la flor y hojas que contienen una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una relación de -criptoxantina mejorada una relación de fitoeno mejorada o una relación de fitoflueno mejorada comparado con tal relación presente en una caléndula no mutante. Además, los pétalos de la flor normalmente contienen una cantidad medible de zeta-caroteno (?-caroteno) , mientras que el compuesto no es medible, es decir, está presente en menos de 0.1 por ciento, en los pétalos de la planta de caléndula no mutante . Se determina una relación establecida como un porcentaje del primer pigmento nombrado dividido por la suma de los porcentajes de ese pigmento y la luteína como se determinó por técnicas cromatográficas discutidas más adelante. Así, la proporción de zeaxantina se define ilustrativamente en la presente como zeaxantina/ (zeaxantina + luteína) . Preferiblemente, los pétalos, hojas o tanto los pétalos y hojas de tal planta al menos exhiben una relación de zeaxantina mayor de aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10, hasta aproximadamente 1.0. Esa relación puede depender de uno porgue la luteína no puede detectarse en algunas hojas. En algunas modalidades, la flor a partir de la cual se toman los pétalos tiene un contenido de xantofila de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/g de peso seco, mientras que en otra plantas el contenido de xantofila en el pétalo puede ser inferior. El contenido de xantofila de hojas es de forma normal aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.25 mg/g de peso seco. Los pétalos de la flor y las hojas se presentan normalmente en forma desmenuzada . La planta que produce los pétalos y hojas deseados es un mutante cuyo fenotipo excepto como carotenoides pueden ser sustancialmente los mismos como ese de una planta no mutante de crecimiento adyacente, o aquel fenotipo puede ser diferente. En un aspecto, una planta de caléndula contemplada es un híbrido entre otra planta mutante contemplada y una no mutante en donde la planta no mutante es híbrida ni de cuyos padres son mutantes . Otro aspecto de la invención contempla una planta de caléndula, o una porción regenerable de la misma, cuyos pétalos de la flor u hojas o ambos contienen una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una neoxantina mejorada más proporción de violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de c-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada y preferiblemente al menos una proporción de zeaxantina que es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10 y hasta aproximadamente 1.0. Los pétalos de una planta contemplada normalmente contienen una cantidad medible de zeta-caroteno, como se discute anteriormente. Una planta contemplada en una modalidad es un híbrido o híbrido de generación posterior. Una planta de caléndula contemplada de un aspecto contiene una cantidad de xantofilas, medidas como los pigmentos saponificados extraíbles de las flores que es aproximadamente 4 a aproximadamente 25 gramos por kilogramo de flores secas o aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/g de peso seco. Una caléndula contemplada de otro aspecto contiene un contenido de xantofila menor. El polen y un óvulo de tal planta se contemplan separadamente. La porción regenerable de tal planta contemplada comprende células que incluyen embriones, meristemas, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíz, y flores, o protoplastos o callos derivados de la misma. Otra modalidad contempla una semilla que en la siembra en un ambiente adecuado y crecimiento para la madurez produce una planta de caléndula cuyos pétalos de la flor u hojas o ambos contienen una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de a-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada y preferiblemente al menos una proporción de zeaxantina que es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor que aproximadamente 2:10, y hasta aproximadamente 1.0. Los pétalos de una planta contemplada nuevamente contienen normalmente una cantidad medible de zeta-caroteno, normalmente al menos 1 por ciento o más, como se discute anteriormente . Una resina oleaginosa de la planta de caléndula mutante que tiene una o más de la proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de -criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada en relación a una resina oleaginosa a partir de una caléndula no mutante, y preferiblemente al menos una proporción de zeaxantina que es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10, y hasta aproximadamente 1.0, se contempla también. Una resina oleaginosa contemplada también contiene usualmente una cantidad medible de zeta-caroteno, como se discute anteriormente . Una composición adecuada para usarse como alimento o suplemento alimenticio se contempla también. El alimento o suplemento alimenticio comprende una mezcla de ésteres del ácido graso de zeaxantina y luteína disueltos o dispersados en un medio comestible, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor que aproximadamente 2:10, y hasta aproximadamente 1.0. Otra composición adecuada para usarse como un alimento o suplemento alimenticio comprende zeaxantina y lutelna disueltas o dispersadas en un medio comestible, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10, y hasta aproximadamen e 1.0.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos que forman una parte de esta descripción, la Figura 1 es una representación esquemática de la trayectoria de síntesis biológica para la producción de luteína y zeaxantina en plantas en donde el fitoeno, el primer carotenoide C40 en la trayectoria, se convierte en varias etapas (cuatro flechas) a licopeno y luego el ?-caroteno que contiene un anillo ß, después del cual la trayectoria se desliza para formar un a-caroteno que contiene un anillo e y un anillo ß o ß-caroteno que contiene dos anillos ß, y después varias etapas, a luteína o zeaxantina, respectivamente, y la zeaxantina se ramifica continuando a las xantofilas que contienen epóxido, anteraxantina, violaxantina y neoxantina. Como se utiliza en la presente, el término "proporción de zeaxantina" se define como la cantidad de zeaxantina presente en un pétalo de flor seco u hoja dividida por la cantidad de zeaxantina más luteína [zeaxantina/ (luteína + zeaxantina) ] presente en ese pétalo u hoja. La proporción de "neoxantina más violaxantina" se calcula similarmente como la proporción de neoxantina + violaxantina dividida por la suma de aquellos dos pigmentos más la luteína. La "proporción de ß-caroteno", la "proporción de -criptoxantina" , la "proporción de fitoeno" y la "proporción de fitoflueno" se calculan similarmente utilizando la cantidad de pigmento apropiada como el numerador y la suma de ya sea el pigmento más la luteina como el denominador. Aquellas cantidades de pigmento se determinan por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) después de saponificación de un pétalo de la flor seco o extracto de hoja como se discute más delante de manera que la cantidad de cada luteína y zeaxantina (u otro pigmento) se mide en la forma de compuesto libre, por ejemplo, forma de alcohol para luteína y zeaxantina, presente después de la saponificación en lugar de la forma esterificada que se presenta en el pétalo de la flor fresco, y la clorofila que puede presentarse en un extracto de hoja se destruye. La palabra "resina oleaginosa" se utiliza en la presente para denotar un extracto de tej idos de planta que contiene pigmentos de planta tales como las xantofilas discutidas en la presente en sus formas esterificadas , algunas veces acompañadas por cantidades de otros productos de planta y pigmentos tales como otros carotenoides como ß-caroteno, así como pequeñas cantidades de solvente tales como hexano o acetona, normalmente menos de 1 por ciento del solvente orgánico. Las xantofilas se presentan normalmente como mono- o diésteres en pétalos de flor y se presentan normalmente como alcoholes libres en hojas de caléndula. Los carotenos tales como ß-caroteno o licopeno se presentan como compuestos no químicamente combinados, libres. La clorofila se presenta en las hojas de caléndula y se ausentan principalmente en los pétalos. Así, una resina oleaginosa preparada a partir de los pétalos de la flor contienen esteres de xantofila y es en su mayor parte libre de clorofila, mientras que una resina oleaginosa preparada de hojas de caléndula contiene clorofila y xantofilas libres. Tanto la clorofila como los ésteres de xantofila se descomponen por saponificación de la resina oleaginosa. Una resina oleaginosa contemplada es un material sólido o semi-sólido .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención contempla plantas de caléndula, semillas, pétalos de la flor, hojas y materiales que pueden prepararse de la misma. Una planta contemplada adicionalmente tiene pétalos de la flor, hojas o ambos los cuales contienen una proporción de carotenoide mejorada cuando se compara a plantas de caléndula previamente conocidas. Los pétalos y/u hojas de una planta contemplada contienen así una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de a-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada. Las hojas de una planta contemplada pueden estar libres de luteína. Estas plantas de caléndula contempladas son T. Erecta como se compara a T. Patula o T. Tenuifolia u otras especies Tagetes. Además, una planta contemplada puede ser una caléndula xantofila, ya que tales plantas se han descrito anteriormente y se entienden por los trabajadores con experiencia en esta técnica. La proporción usual de zeaxantina a zeaxantina + luteína en pétalos de caléndula está en el orden de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 1:25, de manera que cuando únicamente las cantidades de zeaxantina y luteína se utilizan para cálculos, la zeaxantina es aproximadamente 5 a aproximadamente 7 por ciento de la cantidad de luteína más zeaxantina. Un artículo de Quackenbush et al., J". Assoc. Off. Agri. Chem. , 55:617-621 (1972) reportó una proporción de zeaxantina a luteína en un grupo de pétalos de flor de caléndula T. Erecta amarilla, americana que se elevó inusualmente a aproximadamente 1:4.4, mientras que la concentración total de xantofilas en aquellos pétalos fue inusualmente baja en aproximadamente 0.4 mg/g de peso seco. Una variedad mexicana se indicó por aquellos autores que contenía 11.1 por ciento de zeaxantina cuando los pétalos liofilizados se analizaron y 3.8 por ciento cuando los pétalos frescos se analizaron. El valor más elevado no es siguiendo el resto de los datos y se cree que es incorrecto. La proporción de zeaxantina preferida en pétalos contemplados aqui es aún más grande, siendo mayor que aproximadamente 1:10 y preferiblemente mayor que aproximadamente 2:10, como se discutirá posteriormente, y la cantidad de xantofilas en pétalo es preferiblemente al menos aproximadamente 4 mg/g de peso seco. Una planta de caléndula contemplada tiene pétalos de flor que contienen una proporción de zeaxantina mayor que aproximadamente 1:10 y preferiblemente mayor que aproximadamente 2:10. Más preferiblemente aún, una planta de caléndula contemplada tiene pétalos de la flor que contienen una proporción de zeaxantina mayor de aproximadamente 3:10. Más preferiblemente, esa relación es mayor que 5:10, y puede ser aproximadamente 1.0. La flor a partir de la cual se toman los pétalos tiene un contenido de xantofila de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/g de peso seco, y de preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/g de peso seco. Tal planta de caléndula también tiene preferiblemente hojas que contienen una proporción de zeaxantina mayor de aproximadamente 1:10 y preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10. Más preferiblemente aún, una planta de caléndula contemplada tiene hojas que contienen una proporción de zeaxantina mayor de aproximadamente 3:10. Más preferiblemente, esa proporción es mayor que 5:10, y puede ser aproximadamente 1.0. Las hojas contempladas tienen contenido de xantofila de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1.25 mg/g de peso seco, y de preferencia aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 mg/g de peso seco. En algunas modalidades, la concentración de luteína de los pétalos de una planta contemplada contiene aproximadamente 80 a aproximadamente 90 por ciento de la luteína presente en una planta no mutante, paterna. En otras modalidades, la cantidad de luteína es menor que aproximadamente 75 por ciento de aquella presente en una planta no mutante. En modalidades todavía adicionales, la cantidad de luteína presente en los pétalos de la flor es menor que aproximadamente 15 por ciento de aquella presente en los pétalos de una planta de caléndula no mutante. Una caléndula contemplada puede también exhibir diferencias en relaciones de uno o más pigmentos diferentes en relación con la luteína. Así, la proporción de neoxantina más violaxantina en una planta paterna puede ser aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.022 para un extracto de pétalo no mutante y aproximadamente 0.17 a aproximadamente 0.33 en hojas. Esa relación en pétalos de planta mutante contemplados y hojas de una modalidad preferida es aproximadamente 1:5 (0.2) a aproximadamente 1:1 (1). La neoxantina y la violaxantina se miden juntas ya que son difíciles para separar cromatográficamenté .

La proporción de ß-caroteno en plantas no mutantes es en forma normal aproximadamente menor que 0.007 para los pétalos de la flor y aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.4 para las hojas. Esa proporción es aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.9 para los pétalos de la flor y aproximadamente uno para las hojas de plantas de caléndula mutantes . La a-criptoxantina normalmente constituye menos de uno por ciento de carotenoides coloreados de pétalos de planta no mutantes y la proporción de a-criptoxantina es en consecuencia aproximadamente 0.01 en pétalos de flores no mutantes. La proporción de a-criptoxantina es aproximadamente 0.25 a aproximadamente 0.9 en los pétalos de algunas plantas mutadas preferidas . El fitoeno puede presentarse en pétalos en aproximadamente 3 a aproximadamente 0.3 por ciento de los carotenoides en plantas no mutantes y pueden presentarse en aproximadamente 35 por ciento en algunos pétalos de flor mutantes que normalmente contienen una cantidad reducida de luteína. Las proporciones de fitoeno ejemplares pueden ser de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 1 en una planta contemplada cuando se compara con las proporciones de fitoeno de aproximadamente 0.003 a aproximadamente 0.03 en plantas no mutantes. Las concentraciones de fitoeno son principalmente inalteradas en hojas de plantas mutantes cuando se compara con hoj as de planta no mutantes . Las cantidades de fitoflueno en pétalos de plantas no mutantes son de forma normal aproximadamente las mismas como aquellas observadas para fitoeno, mientras que la cantidad presente en los pétalos de una planta mutante contemplada es en general de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 por ciento de la cantidad de fitoeno. La proporción de fitoflueno para una planta no mutante es en forma usual de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.03, mientras que la relación para una planta mutante contemplada es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1. El fitoflueno no se ha observado en extractos de hoj as . Los mejoramientos observados en las proporciones anteriores son de manera normal al menos aproximadamente dos veces. En modalidades particulares, una proporción puede mejorarse por aproximadamente diez a aproximadamente cien veces . Los pétalos u hojas o ambos de una planta particular pueden tener una o más de las proporciones mejoradas vueltas a citar anteriormen e. En la práctica usual, se presentan dos o más de las proporciones mejoradas descritas anteriormente. Así, por ejemplo, la proporción de zeaxantina y la proporción de ß-caroteno pueden mejorarse, o la proporción de zeaxantina y la proporción de neoxantina más violaxantina pueden mejorarse. De manera similar, tres o más de las proporciones pueden elevarse. La a-criptoxantina es un compuesto particularmente interesante en donde se ha encontrado que está presente en niveles relativamente elevados en un número de mutantes y no está de otra manera fácilmente disponible. Así, se presentó la a-criptoxantina en aproximadamente 20 a aproximadamente 40 por ciento de los carotenoides coloreados en algunos mutantes. La proporción de -criptoxantina de tales plantas se mejoró consecuentemente en gran medida cuando se compara con aquellas plantas cuyos pétalos contienen más cantidades usuales de carotenoides . Los pétalos de una planta contemplada normalmente contienen una cantidad medible de zeta-caroteno (?-caroteno) , mientras que ese pigmento no esté presente en una cantidad medible, es decir, presente en menos de 0.1 por ciento, en los pétalos de una planta de caléndula no mutante. Normalmente, el zeta-caroteno se presenta en una cantidad de al menos aproximadamente 1 por ciento de los carotenoides del pétalo. Esa cantidad de zeta-caroteno puede estar en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 por ciento en algunas modalidades, y en aproximadamente 20 por ciento en otras modalidades. Como ya se observó, las xantofilas tales como luteína y zeaxantina se presentan en pétalos de la flor principalmente como mono- o diésteres de ácidos grasos tales como láurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico o similares, en lugar de como compuestos libres. Como tal, cuando una zeaxantina u otra proporción de xantofila se discute en la presente, esa relación se determina extrayendo uno o más pétalos de la flor con hexano u otro solvente apropiado para obtener una composición tal como una resina oleaginosa comprendida de xantofilas esterificadas . Esa composición se saponifica entonces utilizando una base tal como hidróxido de potasio para desdoblar los esteres y formar alcoholes de carotenoide libres. Los alcoholes de xantofila libres de carotenoide se separan más tarde a partir de la mezcla de reacción de saponificación y se separa como se desea utilizando cromatografía líquida de rendimiento elevado (HPLC) . Las proporciones de materiales presentes se determinan por las áreas bajo los picos de HPLC apropiados utilizando métodos estándares de integración. El método analítico utilizados en la presente para determinar las proporciones de pigmento se ejemplifica más adelante, y proporciona resultados similares por aquellos publicados por otros, con diferentes técnicas específicas que se utilizan por diferentes laboratorios principalmente por razones de conveniencia. Al utilizar el procedimiento preferido aquí, las flores aproximadamente 98% completamente abiertas se seleccionaron por análisis. Los pétalos se removieron aproximadamente un tercio de la distancia del centro de la flor a partir de las flores seleccionadas. Las hoj as puede cosecharse y extraerse en sustancialmente cualquier tiempo. Las xantofilas se presentan normalmente como compuestos libres en hojas como son carotenos. La clorofila presente en hojas se extrae también con los pigmentos carotenoides para que los ensayos se lleven a cabo después de la saponificación del extracto ya que ese tratamiento destruye la clorofila. Las hojas se analizaron para el contenido de carotenoide como son los pétalos . Un método analítico estándar utilizado en la industria para determinar niveles de carotenoide en extractos de planta es aquel de AOAC 1984, Official Methods of Analysis (14th ed) , the Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA, los resultados de cuyos análisis son similares a aquellos obtenidos en la presente. Una planta de caléndula contemplada es un mutante de una línea paternal. Esto es, una primera línea o cruce o semilla se trata con un mutágeno (mutagenizado) para proporcionar una planta mutagenizada que se auto-poliniza normalmente (uniformemente) una o más veces. Una planta contemplada en la presente puede elevarse a partir de la mutagénesis por sí misma, a partir de una de las individualidades o de un cruce de una planta mutagenizada o de descendencia con otra planta mutagenizada o no mutagenizada.

Sustancialmente cualquier clase de mutágeno puede utilizarse para producir una planta contemplada, y mutágenos ejemplares se discuten más adelante. Aunque algunas caléndulas imitantes contempladas tienen un fenotipo que es sustancialmente diferente de esa planta paterna de caléndula no mutante adyacentemente crecida, otros mutantes contemplados exhiben sustancialmente el mismo fenotipo como ese de una planta paterna no mutante crecida adyacentemente, excepto para los rasgos fenotípicos en relación con los carotenoides . Más específicamente para las plantas posteriores, cuando uno compara las propiedades de la planta tales como altura de la planta, diámetro de la planta, diámetro de la inflorescencia, altura de la inflorescencia, tiempo del florecimiento, cantidad de ramificación, longitud de las ramas, longitud del tallo de la flor, longitud del hipocotilo, cotiledón y anchura del cotiledón entre un patrón y una planta mutante, los valores de aquellas propiedades para algunas plantas mutantes contempladas están cada una dentro de aproximadamente 90 por ciento de aquellas de la planta paterna, incluyendo las desviaciones estándares en las mediciones. Más particularmente, los valores para aquellas propiedades del mutante están dentro de aproximadamente 95 por ciento del patrón, y más preferiblemente, los valores son los mismos, dentro de la desviación estándar. Por otro lado, otras plantas mutantes difieren en gran medida en uno más rasgos fenotípicos. Una diferencia fenotípica en relación con carotenoide entre las plantas paternas y mutantes es la cantidad de pigmento de xantofila que pueden obtenerse a partir de las flores del mutante. Las planta paternas tales como "Escarlata" o "Anaranjado Intenso" normalmente tienen aproximadamente 10 a aproximadamente 18 mg/g de inflorescencia completa en peso seco de pigmentos de xantofila extraíbles. Una planta mutante contemplada preferiblemente contiene aproximadamente la misma cantidad de carotenoide en los pétalos de la flor, pero pueden contener tan poco como aproximadamente 4 mg/g de peso seco, particularmente cuando la relación de zeaxantina a luteína es muy alta tal como aproximadamente 9:1 o mayor. Las hojas de una caléndula contemplada pueden también exhibir una diferencia fenotípica entre las plantas paternas y mutantes como el contenido de carotenoide así como una o más proporciones de carotenoide discutidas anteriormente - presentes en las hojas como se mide en una resina oleaginosa saponificada. El papel observado previamente de Moehs et al., Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001) reportó que las proporciones y contenidos de carotenoide en la hoja fueron constantes, mientras que la concentración de carotenoide en los pétalos se difiere. Aquí, se encontró que una o más relaciones de zeaxantina mencionada anteriormente, proporción de anteraxantina, proporción de neoxantina más violaxantina, proporción de fitoeno, proporción de fitoflueno, proporción de ß-caroteno y proporción de a-criptoxantina en plantas imitantes considerablemente distintas de plantas no imitantes paternas. Además, los pétalos de cada una de las plantas mutantes examinadas exhibieron una cantidad medible de zeta-caroteno, mientras que no se observó ninguna cantidad medible de zeta-caroteno para presentarse en las plantas no mutantes paternas. Las comparaciones fenotípicas se hacen entre plantas crecidas adyacentemente. Como se utiliza en la presente, el término "crecidas adyacentemente" se utiliza para denotar plantas crecidas bajo condiciones similares de luz, calor, medio de crecimiento, humedad y nutrientes ya que puede lograrse de manera que las condiciones de crecimiento no controlan el fenotipo. Para plantas crecidas en invernadero, "crecidas adyacentemente" significa plantas crecidas bajo condiciones tan similares como sea posible en la misma banca. Para plantas crecidas en el campo, "crecidas adyacentemente" significa plantas crecidas bajo condiciones tan similares como sea posible en los mismos campos o adheridos . Los agentes mutagenicos útiles para alterar plantas se conocen bien en la técnica, ya que son métodos para utilizar tales agentes. Los mutágenos químicos ejemplares incluyen nitrosometilurea ( MU) , metansulfonato de etilo (EMS) , metansulfonato de metilo, sulfato de dietilo, nitrosoguanidina, y etilnitrosourea de la cual EMS se prefiere en la presente. NMU puede utilizarse como se discute en Cetl et al., Folia Fac. Sci . Nat. Univ. Purkynianae Brun. Biol., 21(1): 5-56 (1980), mientras que EMS se utiliza normalmente en aproximadamente 0.25 a aproximadamente 1 por ciento en volumen (v/v) , y de preferencia aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.8 por ciento. La irradiación gamma es también un agente mutagénico útil cuando se utiliza para irradiar semillas en una dosis de 200 a aproximadamente 20,000 rads (0.2 a aproximadamente 20 krads) . ? pesar del mutágeno utilizado, el fenotipo de la planta mutante resultante, que incluye rasgos relacionados al carotenoide tales como la proporción de zeaxantina y la cantidad de xantofilas en los pétalos, es de manera usual sustancialmente idéntica a aquella del padre, de manera que un porcentaje muy grande de los mutantes obtenidos no son útiles. Además, las plantas que parecen tener el mismo fenotipo como el padre necesitan seleccionarse para ubicar una planta mutante deseada. Aquellos cribados, aunque tediosos, se llevan a cabo rutinariamente e implican análisis de pigmentos carotenoides de uno o más pétalos de flor sencilla u hojas o ambos. Así, la preparación de un mutante deseado es un caso relativamente raro, pero repetible. Por ejemplo, en un estudio en la presente, únicamente veintitrés mutantes útiles se obtuvieron a partir de casi 22,000 plantas imitantes examinadas. En otro estudio, aproximadamente veinticuatro mutantes útiles fuera de aproximadamente 8,200 plantas examinadas se obtuvieron. Como se ya se observó, una planta contemplada puede ser una planta que crece de la semilla rnutagenizada o puede ser una individualidad o cruce. En una modalidad preferida, una caléndula contemplada es un híbrido formado por el cruce de las flores o dos plantas que se originan de dos diferentes plantas mutagenizadas de plantas M2 independientes (M2 x M2) . En otra modalidad, una caléndula contemplada es un híbrido formado cruzando las flores de una planta que se origina de una planta rnutagenizada con una planta no rnutagenizada. En aún otra modalidad, una planta contemplada es un híbrido formado cruzando detrás un híbrido con una o la otra de sus flores paternas intermedias . El producto del cruce de dos diferentes plantas híbridas se contempla como el producto de la individualidad de un híbrido. La presente invención también contempla el polen y el óvulo de una planta contemplada. La porción regenerable de una planta contemplada es también por sí misma contemplada e incluye células seleccionadas del grupo que consisten de embriones, meristemas, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, y flores, o protoplastos o callos derivados de la misma. Los métodos para regenerar plantas a partir de células se conocen bien por aquellos expertos en la técnica, y las plantas dicotiledóneas tales como caléndulas son particularmente tratables para tal regeneración. Una resina oleaginosa de caléndula comprendida de ésteres de ácido graso de luteína y zeaxantina en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 1:10 y de preferencia mayor de aproximadamente 2:10 se contempla también. Más preferiblemente, la proporción es mayor que aproximadamente 3:10 y es de mayor preferencia aproximadamente 1.0. Una resina oleaginosa de caléndula contemplada contiene una proporción de zeaxantina como se presenta en los pétalos u hojas de una caléndula contemplada como se discute anteriormente. Las resinas oleaginosas son artículos de comercio y se venden a procesadores para tratamiento adicional en la producción de alimentos para seres humanos u otros animales o suplementos alimenticios. Una resina oleaginosa contemplada contiene también normalmente una cantidad medible de zeta-caroteno. En una preparación de resina oleaginosa de caléndula ilustrativa, los ésteres de xantofila, es decir, zeaxantina o mezcla de ésteres de zeaxantina y luteína y posiblemente otros ésteres de xantofila y carotenos tales como zeta-caroteno, se extraen de flores de caléndula secos con hexano, acetona, acetato de etilo, tolueno, tetrahidrofurano (THF) y el solvente orgánico similar, o una mezcla de los mismos. La extracción se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. El o los solventes se remueven, resultando en un extracto que normalmente contiene un nivel elevado de los esteres de xantofila y es aproximadamente 99 por ciento y de preferencia aproximadamente 99.9 por ciento libre del solvente orgánico extraído; es decir, contiene menos de aproximadamente 1 por ciento y preferiblemente menos de aproximadamente 0.1 por ciento del solvente orgánico en peso. El extracto libre de solvente resultante se refiere como una resina oleaginosa de caléndula. Un extracto de hoja se prepara similarmente , y contiene xantofilas libres, carotenos y clorofila. Una composición adecuada para usarse como alimento o suplemento alimenticio para seres humanos u otros animales tales como aves de corral como pollos y pavos, pescado como trucha y salmón y crustáceos como camarón, langosta y cangrejo se contempla también. Un alimento contemplado o suplemento alimenticio puede utilizarse para proporcionar color a la piel y grasa de aquellos animales así como a las yemas del huevo de tales animales, y particularmente pollos. Un alimento o suplemento alimenticio comprende una mezcla de esteres del ácido graso de zeaxantina sola o zeaxantina, luteína y otros carotenoides como se presentan en una resina oleaginosa de caléndula. Esa mezcla de ásteres mayormente del ácido graso se disuelve o dispersa en un medio comestible, en donde los esteres del ácido graso de zeaxantina y lutexna se presentan en una proporción de zeaxantina que es mayor que aproximadamente 1:10, preferiblemente mayor de aproximadamente 2:10, más preferiblemente mayor de aproximadamente 3:10, y hasta aproximadamente 1.0. Este alimento o suplemento alimenticio puede así prepararse por purificación adecuada de una resina oleaginosa descrita anteriormente como por disolución y filtración, seguida por disolución o dispersión de los ésteres mezclados purificados en un medio comestible apropiado . En algunas modalidades, el medio comestible es un aceite triglicérido comestible, mientras que en otras modalidades el medio comestible es un agente aglutinante de manera que se encuentra frecuentemente en productos farmacéuticos tales como pildoras y tabletas (un agente aglutinante farmacéuticamente aceptable) . Para tabletas o cápsulas, el contenido de éster xantofila de la mezcla medida como xantofila libre es de manera normal aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 25 miligramos por tableta o cápsula, y de manera más usual de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 miligramos por tableta o cápsula. Los agentes aglutinantes y adhesivos preferiblemente imparten suficiente cohesión a sólidos para permitir procesamiento normal tal como encolado, lubricación, compresión y empacado, pero aún permiten a una tableta o cápsula desintegrarse y la composición disolverse en la ingestión. Los agentes aglutinantes ejemplares incluyen monohidrato de lactosa, acacia, tragacanto, sacarosa, gelatina, glucosa, celulosa o materiales de sacárido, tales como, pero no limitados a, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, (HP C) , hidroxipropilcelulosa (Klucel™) , etilcelulosa (Ethocel™) , metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio (por ejemplo, Tylose™) , almidón pre-gelatinizado (tal como National™ 1511 y Almidón 1500) , ácidos polisacáridos, ácido alginico y sales de ácido algínico, silicato de aluminio-magnesio, polietilenglicol , goma guar, bentonitas, polivinilpirrolidona (povidona) y polimetacrilatos . Los aceites comestibles ejemplares incluyen candelilla, coco, hígado de bacalao, semilla de algodón, menhaden, oliva, palma, maiz, soya, cacahuete, semilla de amapola, aceite de cártamo y de girasol. Se prefiere el uso de un aceite que tiene una concentración relativamente elevada de ácidos grasos insaturados, es decir, el uso de un aceite que tiene un valor de yoduro de aproximadamente 100-150 se prefiere. La mezcla se lleva a cabo normalmente utilizando un aparato de mezclado de esfuerzo cortante elevado, como se sabe bien. Los co-solventes y aditivos tales como etanol y a-tocoferol, respectivamente, pueden también presentarse como se observa en la Patente Norteamericana No. 5,382,714. En otra modalidad, la mezcla de zeaxantina y luteína, zeaxantina sola u otra mezcla de carotenoide, se proporciona en la forma de gránulos pequeños generalmente esféricos que contienen 0.5 a aproximadamente 20 por ciento, y preferiblemente 1 a aproximadamente 4 por ciento, de la xantofila que se refieren convencionalmente como "perlas" . Estas perlas pueden utilizarse mezcladas en una cantidad deseada en alimento humano tal como cereales listos para comer como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,270,063 o mezclarse en pollo u otro alimento animal como son las perlas u otras partículas descritas por el aditivo alimenticio en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,849,345, 5,695,794, 5,605,699 y 5,043,170. Las perlas ejemplares son insolubles al agua y se preparan por encapsulación de una composición de xantofila por gelatina reticulada o un alginato tal como alginato de sodio como se describe en la Patente Norteamericana No . 4,670,247. Una perla insoluble al agua que contiene el o los carotenoides deseados se preparan formando una emulsión que contiene el o los carotenoides, agua, gelatina y un azúcar. La emulsión se convierte en gotas que se recolectan individualmente en una masa de polvo feculento en tal manera que las partículas de las gotas se mantienen separadas entre sí hasta que su forma particulada se establece permanentemente. Las partículas que contienen carotenoide se separan del polvo feculento recolectado, y tratado con calor a una temperatura de aproximadamente 90°C a aproximadamente 180°C. La etapa de tratamiento por calor insolubiliza la matriz de gelatina de la perla por una reacción entre el grupo carbonilo del azúcar con las porciones amino libres de la molécula de gelatina. Las perlas resultantes son solubles al agua y exhiben estabilidad incrementada a las tensiones de granulación alimenticia. El proceso de reticulación utiliza el ingrediente empleado para realizar la perla y no requiere la adición de un reactivo de reticulación o aditivo a la composición. La Patente Norteamericana No. 5,695,794 describe otra forma de perlas que pueden adaptarse para usarse en la presente como un aditivo para alimentos de aves de corral. Así, las perlas que tienen diámetros de aproximadamente 30 a aproximadamente 55 mieras se preparan rociando una solución fundida de una cantidad deseada del o de los carotenoides es decir, zeaxantina, una mezcla de zeaxantina y luteína, u otra mezcla de carotenoide descrita en la presente, en aceite vegetal hidrogenado tal como aceite de semilla de algodón hidrogenado, aceite de germen de trigo, aceite de cártamo, aceite de soya y similares, que también pueden contener mono-y diglicéridos tales como aquellos preparados de mono y diglicéridos de soya hidrogenada, mono y diglicéridos de semilla de algodón y similares, así como ácido cítrico y 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (BHT) como antioxidantes. Otros antioxidantes tales como etoxiquina, vitamina E y similares pueden también utilizarse, como se sabe bien. La mezcla fundida se rocía a una temperatura de aproximadamente 70°C (aproximadamente 160 °F) en una corriente de aire ciclónica de un enfriador de rocío tal como el disponible de Niro, Inc. , Columbra, Md, para producir las perlas que solidifican al enfriarse . Las perlas enfriadas se desempolvan con un agente anti-endurecimiento tal como sílice ahumada, fosfato de calcio, almidón pulverizado o celulosa como se sabe bien para formar las perlas que se agregan preferiblemente al alimento como suplemento. Un perla ejemplar contiene aproximadamente 10 a aproximadamente 100 miligramos de zeaxantina por gramo (mg/g) y de preferencia aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/g. Los alimentos animales a los cuales una zeaxantina contemplada o mezcla de zeaxantina-luteína se agregan son bien conocidos en la técnica. Las Patentes Norteamericanas observadas anteriormente Nos. 5,849,345, No. 5,695,794, No. 5,605,699 y No. 5,043,170 proporcionan dietas ejemplares que son particularmente útiles para aves de corral. Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,935,624 y No. 2,918,370 proporcionan dietas para aves de corral ilustrativas adicionales . La Patente Norteamericana No. 5,258,189 enseña la adición de ß-caroteno a un alcance para comer el producto de cereal para humanos en donde el ß-caroteno se mezcla con un producto de cereal cocinado dispersado en un aceite vegetal o en forma seca. La zeaxantina o una mezcla de zeaxantina y luteína como se discute por sí misma en la presente pueden utilizarse a un nivel deseado en lugar de ß-caroteno en un producto alimenticio similar. Otra composición adecuada para usarse como un alimento o suplemento alimenticio comprende una mezcla de zeaxantina y luteína disuelta o dispersada en un medio comestible, en donde la proporción de zeaxantina presente está en más de aproximadamente 1:10, preferiblemente más de aproximadamente 2:10, y hasta aproximadamente 1.0. Esta composición contiene xantofilas saponificadas que están libres de zeaxantina y luteína cuando se compara con los esteres que se presentan en una resina oleaginosa de caléndula. Los métodos se conocen bien para saponificar resinas oleaginosas de caléndula para proporcionar xantofilas libres. Véase, por ejemplo, Tyczkowski, et al., Poultry Sci . 70(3): 651-654, 1991; y la Patente Norteamericana No. 5,382,714, en donde la luteína se cristalizó a partir de la resina oleaginosa de caléndula saponificada por la adición de solventes orgánicos. Además, Ausich et al., Patente Norteamericana No. 5,648,564 enseña la producción de lutexna cristalina a partir de resina oleaginosa de caléndula mezclando la resina oleaginosa con una composición que contiene propilenglicol y un álcali acuoso, preferiblemente hidróxido de potasio, para formar una mezcla de reacción en donde la resina oleaginosa y propilenglicol juntos constituyen al menos 75 por ciento en peso. La mezcla de reacción así mismo formada se mantiene a una temperatura de aproximadamente 65°C a aproximadamente 80 °C durante un periodo de tiempo (normalmente al menos 3 horas) suficientes para saponificar el éster de xantofila y formar una mezcla de reacción saponificada que contiene xantofila libre en la forma de cristales. El extracto saponificado se mezcla con una cantidad diluida de agua para disolver las impurezas solubles en agua y reduce la viscosidad de la mezcla de reacción. La mezcla diluida se mezcla suavemente hasta ser homogénea y luego se filtra para recolectar los cristales de xantofila. Los cristales de xantofila recolectados se lavan con agua caliente, y se secan. Ningún solvente orgánico diferente del propilenglicol se utiliza en el aislamiento y purificación de xantofila a partir de la resina oleaginosa que contiene éster de xantofila. Los cristales de xantofila secos formados así mismo se mezclan normalmente con un medio comestible tal como el triglicérido discutido anteriormente. El contenido de xantofila de la mezcla es de forma normal aproximadamente 0.1 a aproximadamente 35 por ciento en peso, y de preferencia aproximadamente uno a aproximadamente diez por ciento en peso . Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior, utilizar la presente invención a su magnitud más completa. Las siguientes modalidades específicas preferidas son por lo tanto, para interpretarse como simplemente ilustrativas, y no limitan el resto de la descripción de ninguna forma en absoluto . Ejemplo 1: Tratamiento de EMS de Tagetes erecta "Escarlata" Las semillas de caléndula xantofila Tagetes erecta denominada "Escarlata" (comercialmente disponible de PanAmerican Seed Co. 622 Town Road, West Chicago, IL 60185) se trataron con metansulfato de etilo (EMS, comercialmente disponible de Sigma Chemical Co., St . Louis, MO 63178). Aproximadamente 2,500 semillas se agregaron a 400 mi de 0.4% (v/v) o 0.8% (v/v) de EMS y se agitaron suavemente por ocho horas a temperatura ambiente. Durante un periodo de cuatro horas siguiendo el tratamiento de EMS, las semillas se lavaron dieciséis veces, cada lavado utilizando agitación continua con 400 mi de agua destilada. Las semillas tratadas, identificadas como semillas Mi, se sembraron entonces en bandejas conteniendo mezcla plantada en una maceta sin tierra . Después de varias semanas, las plántulas se transplantaron en macetas, conteniendo mezcla de maceta sin tierra y manteniendo en el invernadero. Las flores producidas por aquellas plantas se autopolinizaron naturalmente. Las semillas resultantes, identificadas como semillas M2, se cosecharon a partir de aproximadamente 2,300 plantas. De estas 2,300 plantas, aproximadamente 1,500 se cultivaron de semillas tratadas con 0.4% de EMS y aproximadamente 800 se cultivaron de semillas tratadas con 0.8% de EMS. Para facilitar la identificación de las plantas imitantes, las semillas M2 de cada una de las 50 plantas Mi se combinaron en un lote, resultando en un total de 47 lotes de semillas. Durante el verano del año 2000, 500 semillas de cada uno de los 47 lotes se sembraron y las plantas resultantes se cultivaron en el campo en PanAmerican Seed Co., en Santa Paula, CA 93060. Ejemplo 2: Selección por HPLC de Tagetes erecta "Escarlata" Tratado con EMS Se cultivaron en campo plantas "Escarlata" tratadas con EMS en PanAmerican Seed. Co . , en Santa Paula, CA 93060, y se seleccionaron por HPLC para proporción de zeaxantina alterada. Las flores aproximadamente 98% completamente abiertas se seleccionaron para análisis. De cada flor, un pétalo se removió un tercio de la distancia del centro de la flor y se colocó en un frasco de vidrio de 3.5" x 0.75" conteniendo aproximadamente 5 gramos de perlas de vidrio. Los matraces se empacaron con hielo seco hasta almacenarse a -80°C. Para análisis, el suministro de solvente y remoción de alícuota se logró con un sistema robótico que comprende una sola válvula inyectora Gilson 232XL y un diluidor 402 2S1V [Gilson, Inc., USA, 3000 W. Beltline Highway, Middleton, WI] . Para saponificación, 3 mi de solución hidro-etanólica de hidróxido de potasio al 50% (4 agua : 1 etanol) se agregó a cada frasco, seguido por la adición de 3 mi de octanol. El tratamiento de saponificación se condujo a temperatura ambiente con matraces mantenidos en un agitador horizontal IKA HS 501 [Labworld-online, Inc. Wilmington, NC] durante quince horas a 250 movimientos/minutos, seguido por una fase estacionaria de aproximadamente una hora. Siguiendo la saponificación, el sobrenadante se diluyó con 0.9 mi de metanol . La adición de metanol se condujo bajo presión para asegurar la homogeneidad de la muestra. Al utilizar una jeringa de 0.25 mi, se removió una alícuota de 0.1 mi y se transfirió a matraces de HPLC para análisis.

Para análisis de HPLC, se utilizó un HPLC Hewlett Packar 1100, completo con una bomba cuaternaria, sistema de desgasificación al vacío, válvula de inyección de seis formas, automuestrario regulado de temperatura, horno de columna y detector de Disposición de Fotodiodo [Agilent Technologies disponible a través de Ultra Scientific Inc., 250 Smith Street, North Kingstown, RI] . La columna fue Waters YMC 30, 5 mieras, 4.6 x 250 mm con una columna de guardia del mismo material [waters, 34 Maple Street, Milford, MA] . Los solventes para la fase móvil fueron 81 metanol : 4 de agua: 15 de tetrahidrofurano (THF) estabilizado con 0.2% de BHT (2,6-di-ter-butil-4-metilfenol) . Las inyecciones fueron 20 µ? . La separación fue isocrática a 30°C con una velocidad de flujo de 1.7 ml/minuto. Las respuestas pico se midieron por absorbancia a 447 nm. Al utilizar este protocolo, los resultados a partir de las primeras 2,546 muestras se analizaron estadísticamente para establecer valores promedio para el contenido de luteína y zeaxantina. Debido a que esto fue una selección analítica semi-cuantitativa, se midieron los valores de área pico. Para identificar un mutante que tiene un promedio más elevado que la concentración de luteína y/o zeaxantina, un valor de tres desviaciones estándares mayores que el promedio se calculó. Los medios de área pico calculados, desviaciones estándares y proporciones de zeaxantina se muestran en la Tabla 1, posterior.

Tabla 1 Basadas en los valores anteriores, las muestras se seleccionaron teniendo áreas pico de luteína mayores de 1565 y/o áreas pico de zeaxantina mayores de 91. Las muestras también se seleccionaron únicamente para el área pico de luteina elevada, y para proporciones de zeaxantina mayores de 10 por ciento. Un total de 88 mutantes se identificaron a partir de 21,754 muestras analizadas utilizando estos parámetros de selección. El número total de mutantes que resultan de cada tratamiento de semilla EMS se muestra en la Tabla 2, posterior.

Tabla 2 Correlación de Mulantes "Escalarta" a Tratamiento de EMS Resultados más específicos de aquellos análisis como niveles relativos de luteína y zeaxantina se muestran en la Tabla 3, posterior.

Tabla 3 Mutantes "Escarlata" Identificados Identificador Área de Area de Porciento de Porciento de en Planta Luteina Zeaxantina Zeaxantina EMS utilizado 124-257 2.115 55.635 96.34 0.4 119-494 9.254 131.036 93.40 0.8 112-253 8.095 35.273 81.33 0.4 118-036 11.441 31.691 73.47 0.8 088-452 2.94 6.689 69.47 0.4 118-035 11.289 23.951 67.97 0.8 114-334 58.24 97.968 62.72 0.4 117-185 39.002 44.027 53.03 0.8 108-108 13.424 10.155 43.07 0.4 088-425 8.959 4.394 32.91 0.4 094-238 7.285 3.063 29.60 0.4 110-308 46.753 14.248 23.36 0.4 132-346 31.036 8.856 22.20 0.8 100-334 282.987 54.298 16.10 0.8 101-331 246.402 46.467 15.87 0.8 100-198 119.381 21.449 15.23 0.8 101-190 139.027 23.125 14.26 0.8 114-315 351.524 56.898 13.93 0.4 100-470 189.703 27.743 12.76 0.8 117-348 369.903 43.315 10.48 0.8 132-266 374.096 43.8 10.48 0.8 123-310 60.743 6.818 10.09 0.4 116-106 453.538 50.287 9.98 0.8 Aproximadamente 21,700 plantas exhibieron proporciones de zeaxantina normales de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 por ciento (aproximadamente 1:25 a aproximadamente 1:15) . Los datos anteriores ilustran la rareza relativa de las mutaciones contempladas, así como el número casi igual de plantas que exhiben niveles de zeaxantina reducidos . Los datos no muestran también una preferencia para el uso de un nivel de mutágeno contra el otro utilizado aquí. Ejemplo 3: Tratamiento de EMS de Tagetes erecta 13819 Las semillas de caléndula xantofila Tagetes erecta nombrada 13819 (una selección de reproducción propietaria de PanAmerican Seed. Co. 622 Town Road, West Chicago, IL 60185) se trataron con metansulfonato de etilo (EMS, comercialmente disponible de Sigma Chemical Co. St . Louis, MO 63178) . Aproximadamente, 7000 semillas se agregaron a 600 mi de 0.2% (v/v) o 0.4% (v/v) de EMS y se agitaron suavemente durante ocho horas a temperatura ambiente. Durante un periodo de cuatro horas siguiendo el tratamiento de EMS, las semillas se lavaron dieciséis veces, cada lavado utilizando agitación continua con 600 mi de agua destilada. Las semillas tratadas, identificadas como semillas Mi, se sembraron entonces en charolas conteniendo mezcla de maceta sin tierra. Después de tres a cuatro semanas, las plántulas se trasplantaron en el campo. Las flores producidas por estas plantas se pusieron en sacos para evitar la polinización cruzada, y se permitieron auto-polinizar espontáneamente. Las semillas resultantes, identificadas como semillas M2 se cosecharon de aproximadamente 2,391 plantas. De estas plantas, aproximadamente 951 se cultivaron de semillas tratadas con 0.2% de E S y aproximadamente 1,440 se cultivaron de semillas tratadas con 0.4% de EMS. Para facilitar la identificación de plantas mutantes, las semillas M2 de cada una de las 50 plantas se combinaron en un lote. Este agrupamiento resultó en un total de 48 lotes de semillas. De finales de octubre a mediados de noviembre del año 2000, 1000 semillas de cada uno de los 15 lotes del tratamiento de EMS al 0.4% se sembraron y 700 plantas de cada lote se cultivaron en invernadero en Seaview Nursery en El Rio, CA 93060. Además, 1,500 semillas de todos los 48 lotes se sembraron a finales de octubre en el año 2000, y 765 plantas de cada uno de los lotes se cultivaron en el campo en Semillas Pan American Chile LTDA, en Pichidegua, Chile. Ejemplo 4: Selección de HPLC de Tagetes erecta 13819 Tratada con EMS Se cultivaron en invernadero plantas M2 13819 tratadas con EMS en Seaview Nursery en El Rio, CA 93060 y se cultivaron en campo en Semillas PanAmerican Chile LTDA, en Pichidegua, Chile, y se seleccionaron para proporción de zeaxantina alterada. Las flores, aproximadamente 98% completamente abiertas se seleccionaron para análisis. A partir de estas flores, se removieron los pétalos un tercio de la distancia del centro de la flor. Aproximadamente 100 mg del tejido de pétalos se colocó en bolsas de plástico y se almacenó congelado hasta análisis. El peso seco se determinó por dos pétalos que se colocaron en 3.5" x 0.75" de matraces de vidrio conteniendo aproximadamente 5 gramos de perlas de vidrio. Para análisis, el suministro de solvente y remoción de alícuota se lograron con un sistema robótico que comprende una válvula inyectora sencilla Gilson 232XL y un diluidor 402 2S1V. Para saponificación, se agregó 3 mi de 50% de solución hidro-etanólica de hidróxido de potasio (4 agua: 1 etanol) a cada frasco, seguido por la adición de 3 mi de octanol. El tratamiento por saponificación se condujo a temperatura ambiente con matraces mantenidos en un agitador horizontal I A HS 501 durante quince horas a 250 movimientos por minuto seguido por una fase estacionaria de aproximadamente una hora . Siguiendo la saponificación, el sobrenadante se diluyó con 0.9 mi de metanol . La adición de metanol se condujo bajo presión para asegurar la homogeneidad en la muestra. Al utilizar una jeringa de 0.25 mi, se removió una alícuota de 0.1 mi y se transfirió a matraces de HPLC para análisis . Para análisis de HPLC, se utilizó un sistema de desgasificación de vacio Hewlett Packard 1100 completa con una bomba cuaternaria, válvula de inyección de seis formas, automuestreador regulado de temperatura, horno de columna y detector de Disposición de Fotodiodo. La columna fue Waters YMC 30, 5 mieras, 4.6 x 250 mm con una columna de guardia del mismo material. Los estándares se obtuvieron de DHI-Water & Environment, DK - 2970 Horsholm, Denmark and Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178. Los solventes para la fase móvil fueron 81 de metanol : 4 de agua: 15 de tetrahidrofurano estabilizado con 0.2% de BHT. Las inyecciones fueron 20 µ? . La separación fue isocrática a 30°C con una velocidad de flujo de 1.7 ml/minuto. Las respuestas picos se midieron a 447 nm. Al utilizar este protocolo, los resultados de las primeras 507 muestras se analizaron estadísticamente para establecer los valores promedio para el contenido de luteína y zeaxantina. Para identificar un mutante que tiene un promedio más elevado o más bajo de concentración de luteína y zeaxantina, un valor de tres desviaciones estándares mayores que o menores que el promedio se calculó. Los medios calculados, desviaciones estándares y proporciones de zeaxantina se muestran en la Tabla 4, posterior.

Tabla 4 Cálculos de Intervalo de Certidumbre de Luteína Zeaxantina Basadas en los valores anteriores, las muestras se seleccionaron teniendo proporciones de zeaxantina mayores de 10 por ciento, contenido combinado de luteína y zeaxantina mayor de 1.12 mg/g de peso reciente y contenido de luteína y zeaxantina combinadas menor de 0.24 mg/g de peso reciente. Un total de 347 imitantes se identificaron teniendo una suma de luteína más zeaxantina mayor de 1.12 mg/g, y 43 mutantes teniendo una proporción de zeaxantina mayor de 10 por ciento se identificaron a partir de 8192 muestras utilizando estos parámetros de selección. El número total de mutantes resultantes de cada tratamiento de semilla EMS se muestra en la Tabla 5, posterior.

Tabla 5 De los mutantes que tienen una proporción de zeaxantina mayores que aproximadamente 10 por ciento de zeaxantina, aproximadamente 47 por ciento tuvo entre 10 y bajo 13 por ciento, mientras que el 53 por ciento exhibió 13 por ciento o mayor. Ejemplo 5: Composición de Carotenoide en Pétalos de Caléndulas Selectas Se determinaron composiciones de carotenoide para "Escarlata" de tipo silvestre y muestras mutantes seleccionadas de aquellas identificadas en el procedimiento de selección descrito en el Ejemplo 2. Las muestras del pétalo se almacenaron en un congelador a -80°C hasta que los mutantes se identificaron. Las muestras se liofilizaron, y el tejido seco se almacenó bajo argón a -80 °C hasta estar listo para análisis . Los procedimientos de extracción se realizaron bajo luz roja. Los pétalos secos se molieron para pasar a través de un tamaño de malla de tamiz No. 40. Una muestra molida se pesó exactamente y se transfirió en un matraz volumétrico rojo de 100 mi. A la muestra, se agregaron 500 microlitros (µ?) de ¾0, y la mezcla se arremolinó durante 1 minuto. Treinta mi de solvente extraíble (10 mi de hexano + 7 mi de acetona + 6 mi de alcohol absoluto + 7 mi de tolueno) se agregaron, y el matraz se agitó a 160 rpm durante 10 minutos. Para saponificación, se agregaron 2 mi de OH metanólico al 40% en el matraz, que se arremolinó entonces-durante un minuto. El matraz se colocó en un baño de H20 a 56°C durante 20 minutos. Un condensador de aire se unió para evitar la pérdida del solvente. La muestra se enfrió en la oscuridad durante una hora con el condensador unido. Después del enfriamiento, se agregaron 30 mi de hexano, y el matraz se agitó a 16.0 rpm durante 10 minutos. La muestra agitada se diluyó a volumen (100 mi) con 10% de solución de sulfato de sodio y se agitó vigorosamente durante un minuto. La muestra permaneció en la oscuridad durante al menos 30 minutos. Se removió 35 mi de alícuota a partir de aproximadamente 50 mi de la fase superior, y se transfirió a una copa de muestra. 30 mi adicionales de hexano se agregaron en el matraz que se agito entonces a 160 rpm durante 10 minutos. Después de aproximadamente una hora, las fases superiores se combinaron. Para el análisis HPLC, se secaron 10 mi de alícuotas bajo nitrógeno y se almacenaron bajo argón a -80°C. El equipo de HPLC comprende un Alliance 2690 equipado con un automuestrador refrigerado, calentador de columna y detector Waters Photodiode Array 996 (Waters Corp., 34 Maple Street Milford, MA 01757) . La separación se obtuvo con una columna de C30 YMC, 3 µ??, 2.0 x 150 mm con una columna de guardia del mismo material . Los estándares se obtuvieron de ICC Indofine Chemicals Somerville, New Jersey 088876 y de DHI-Water & Environment, DK -2970 Horsholm, Denmark. Las muestras mutantes secas se volvieron a suspender en tetrahidrofurano y metanol a un volumen total de 200 µ? y se filtraron, mientras que el control no se concentró adicionalmente . Los carotenoides se separaron utilizando un método de gradiente. Las condiciones de gradiente iniciales fueron 90% de metanol: 5% de agua: 5% de metil ter-butiléter a una velocidad de flujo de 0.4 mililitros por minuto (mi/minuto) . A partir de cero a 15 minutos, la fase móvil se cambió de las condiciones iniciales a 80 de metanol: 5 de agua: 15 de metil ter-butiléter, y de 15 a 60 minutos a 20 de metanol : 5 de agua: 75 de metil ter-butiléter. Para los siguientes 10 minutos, la fase móvil se regresó a las condiciones iniciales y la columna equilibró durante 10 minutos adicionales. La temperatura de la columna se mantuvo a 27°C y la velocidad de flujo fue 0.4 ml/minutos. Las inyecciones fueron 10 µ? . La mayoría de las respuestas pico se midieron a 450 nm y las áreas adicionales se agregaron de 286, 348, 400 y 472 nm de canales extraídos. Los valores para los perfiles de carotenoide de mutantes seleccionados se indicaron en las Tablas 6a, 6b y 6c, siguientes, utilizando el área pico como porcentaje del área total. Las identificaciones del compuesto indicadas se basan en el espectro extraído y absorbancia máxima en etanol (lambda máxima ETOH) obtenido para picos mayores en cada cromatograma , algunos de los cuales se verificaron por tiempos de retención de estándares conocidos . Los valores combinan isómeros supuestos de los mismos compuestos. Algunos compuestos pueden contener impurezas menores . Incluidos en la Tabla están los valores para caléndulas Americanas de color amarillo (caléndula amarilla) observada en Quackenbush et al., J". Assoc. Off. Anal. Chem. , 55 (3) : 617-621 (1972) . Las entradas sencillas se utilizan en las Tablas 6a- 6c para pares de compuesto neoxantina/violaxantina y crisantemaxantina/flavoxantina que podrían no separarse por el procedimiento utilizado aquí.

Tabla 6a Distribución de Porcentaje Relativo de Carotenoides en Pétalos de Tagetes erecta y Mutantes * nf - no encontrado ** nr = no reportado Tabla 6b Distribución de Porcentaje Relativo de Carotenoides en Pétalos de Tagetes erecta y Mutantes * nf « no encontrado ** nr = no reportado Tabla 6c Distribución de Porcentaje Relativo de Carotenoides en Pétalos de Tagetes erecta y Mutantes * nf « no encontrado ** nr = no reportado Ejemplo 6: Composición de Carotenoide en Hojas de Caléndulas Selectas Las hojas de varias plantas de caléndula se evaluaron para la concentración relativa de carotenoides coloreados presentes. Las hojas de 'Escarlata' y 13819 se utilizaron como controles para la comparación a hojas de plantas mutantes. Los análisis se condujeron como en el Ejemplo 5 y se muestran en las Tablas 7a y 7b, siguiente, en donde las entradas sencillas se utilizan para pares del compuesto neoxantina/violaxantina y crisantemaxantina/flavoxantina que podría no separarse. Los datos en las Tablas 7a y 7b se recolectaron de diferentes grupos de plantas cultivadas bajo diferentes condiciones.

Tabla 7a Distribución de Porcentaje Relativo de Carotenoides en Hojas de Tagetes erecta y Mutantes Tabla 7b Distribución de Porcentaje Relativo de Carotenoides en Hojas de Tagetes erecta y M litantes Cada una de las patentes y artículos citados en la presente se incorporan para referencia. El uso del artículo "uno" o "un" se pretende para incluir uno o más . La descripción anterior y los ejemplos se pretenden como ilustrativos y no para ser tomados como limitantes. Algunas otras variaciones dentro del espíritu y alcance de

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Unos pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto pétalos de la flor como las hojas que contienen una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de ot-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada comparada a tal proporción presente en los pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de una caléndula no imitante en donde las xantofilas se analizan como alcoholes, la planta que produce los pétalos u hojas tiene pétalos que contiene una cantidad medible de zeta-caroteno.
2. 2. Los pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de la zeaxantina es mayor que aproximadamente 1:10.
3. 3. Los pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los pétalos de la flor tienen un contenido de xantofila de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/g de peso seco.
4. 4. Los pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las hojas exhiben una proporción de zeaxantina mejorada.
5. 5. Los pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las hojas tienen un contenido de xantofila de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1.25 mg/g de peso seco.
6. 6. Los pétalos de la flor de caléndula, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los pétalos de la flor exhiben una proporción de zeaxantina mejorada.
7. 7. Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 2:10.
8. 8. Los pétalos de la flor de caléndula que contiene una proporción de zeaxantina a zeaxantina más luteína de más de aproximadamente 2:10, la zeaxantina y luteína que se presenta en los pétalos como ésteres de ácido graso que se analizan como alcoholes después de la saponificación.
9. 9. Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 8, que son de un híbrido.
10. 10. Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 8 que se presentan en forma desmenuzada.
11. 11. Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 8, que exhiben además al menos una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de -criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada en relación con una planta de caléndula no mutante.
12. 12. Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 3:10.
13. 13. Una planta de caléndula o porción regenerable de la misma, cuyos pétalos de flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas contienen una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de cc-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada comparada con tal proporción presente en los pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de una caléndula no mutante en donde las xantofilas se analizan como alcoholes, la planta que produce los pétalos u hojas tiene pétalos que contienen una cantidad medible de zeta-caroteno .
14. 14. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la proporción de zeaxantina de los pétalos de la flor es mayor que aproximadamente 1:10.
15. 15. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, en donde los pétalos de la flor tienen un contenido de xantofila de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 mg/g de peso seco. 17. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las hojas exhiben una proporción de zeaxantina mejorada. 18. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, que además exhibe al menos una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de -criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada comparada con tal proporción presente en los pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de una caléndula no mutante en donde las xantofilas se analizan como alcoholes. 19. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13 , en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 2:10. 20. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, que es un híbrido . 21. La planta de caléndula o una porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la porción regenerable son células seleccionadas del grupo que consiste de embriones, meristema, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, y flores, o protoplastos o callos derivados de la misma. 22. Una planta de caléndula o porción regenerable de la misma, cuyos pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas contienen una proporción de zeaxantina a zeaxantina más luteína de más de aproximadamente 2:10, la zeaxantina y luteína que se presenta en los pétalos como ésteres del ácido graso, que se analiza como alcoholes después de la saponificación. 23. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma, de acuerdo con la reivindicación 22, cuyos pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas exhiben además al menos una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno, una proporción de a-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada comparada con tal proporción presente en los pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor como las hojas de una caléndula no mutante en donde las xantofilas se analizan como alcoholes . 24. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 23, cuyos pétalos de la flor, hojas o tanto los pétalos de la flor y hojas exhiben una proporción de neoxantina más violaxantina de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1. 25. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 23, cuyos pétalos de la flor exhiben una proporción de ß-caroteno de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.9. 26. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 23, cuyas hojas exhiben una proporción de ß-caroteno de aproximadamente uno. 27. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma, de acuerdo con la reivindicación 23, cuyos pétalos de la flor exhiben una proporción de a-criptoxantina a a-criptoxantina más luteína cuando se analizan como alcoholes después de la saponificación que es aproximadamente 0.25 a aproximadamente 0.9. 28. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 23, cuyos pétalos de la flor exhiben una proporción de fitoeno de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 1. 29. La planta de caléndula o porción regenerable de la misma de acuerdo con la reivindicación 23, cuyos pétalos de la flor exhiben una proporción de fitoflueno de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1. 30. Una planta de caléndula o porción regenerable de la misma cuyos pétalos de la flor exhiben una proporción de a-criptoxantina a a-criptoxantina más luteína cuando se analiza como alcoholes después de la saponificación que es aproximadamente 0.25 a aproximadamente 0.9. 31. El polen de la planta de caléndula de la reivindicación 13. 32. Un óvulo de la planta de caléndula de la reivindicación 13. 33. Una semilla que en la plantación en un ambiente y crecimiento adecuado para madurez produce una planta de caléndula xantofila de acuerdo con la reivindicación 13. 34. Una composición adecuada para usarse como un alimento o suplemento alimenticio que comprende una mezcla de zeaxantina y luteína disuelta o dispersada en un medio comestible, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 1:10. 35. La composición de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 2:10. 36. Una composición adecuada para usarse como un alimento o suplemento alimenticio que comprende una mezcla de esteres del ácido graso de zeaxantina y luteina disuelta o dispersada en un medio comestible, en donde la proporción de la zeaxantina que es mayor que aproximadamente 1:10. 37. La composición de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la proporción de zeaxantina es mayor que aproximadamente 2:10. 38. La composición de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el medio comestible es un aceite comestible. 39. La composición de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el medio comestible es un agente aglutinante farmacéuticamente aceptable. 40. Una resina oleaginosa de una caléndula mutante, la resina oleaginosa que tiene una o más de una proporción de zeaxantina mejorada, una proporción de neoxantina mejorada más violaxantina, una proporción de ß-caroteno mejorada, una proporción de a-criptoxantina mejorada, una proporción de fitoeno mejorada o una proporción de fitoflueno mejorada en proporción relativa con una resina oleaginosa de una caléndula no mutante. 41. La resina oleaginosa de acuerdo con la reivindicación 40, que contiene xantofilas libres, carotenos y clorofila. 42. La resina oleaginosa de acuerdo con la reivindicación 40, que contiene esteres de xantofila, carotenos y está principalmente libre de clorofila. 43. Los pétalos de la flor de caléndula que contienen carotenoides coloreados comprendidos de oc-criptoxantina . 4 . Los pétalos de la flor de caléndula de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la a-criptoxantina es el carotenoide más abundante presente en los pétalos de la flor.