MXPA02012804A - Fragmentos de acido nucleico dianobacterial que codifican las proteinas utiles para controlar las caracteristicas de la planta mediante transformacion nuclear o plastoma. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona cianobacterias como una fuente alternativa de genes ahas y pds para transformaciones de la planta y para marcado seleccionable. En particular, proporciona cianobacterias, por ejemplo, Synechocystis, como una fuente de genes que codifican proteinas insensibles a herbicidas, y elementos de genes para el control de expresion en plastidos. Se encontraron fragmentos de acido nucleico, la subunidad grande de acetolactato sintasa (ahas) y la subunidad pequeña ahas, que proporcionan resistencia a herbicidas. Tambien, la presente invencion proporciona el gen de fitoeno desaturasa (PDS) mutante novedoso de Synechocystis que confiere resistencia a 4'-fluoro-6-[(alfa, alfa, alfa,-trifluoro-m-tolil)oxi]-picolinamida, un herbicida blanqueador. La presente invencion proporciona mejoras al metodo que involucra cianobacterias para la seleccion de compuestos, incluyendo un nuevo protocolo de alta produccion que es una forma rapida y efectiva en costo para identificar sitios objetivo de genes.

Description

FRAGMENTOS DE ÁCIDO NUCLEICO CIANOBACTERIAL QUE CODIFICAN PROTEÍNAS ÚTILES PARA CONTROLAR LAS CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA MEDIANTE TRANSFORMACIÓN NUCLEAR O PLASTOMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos de selección mejorados para identificar y utilizar genes de cianobacteria para modificar rasgos vegetales, y a cianobacterias como una fuente alternativa de genes ahas y pds para transformaciones vegetales, en particular genes que codifican proteínas insensibles a herbicidas, y elementos de genes para control de expresión en plástidos .

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Las cianobacterias se consideran ser las precursoras de cloroplastos vegetales. Las cianobacterias poseen todas las características útiles de los procariotes, facilidad de manejo, rápido crecimiento bajo condiciones definidas, disponibilidad de técnicas de siembra con réplica, facilidad de manipulación genética por mutagénesis o transformación y disponibilidad de mutantes establecidas. El metabolismo de la cianobacteria también comparte características importantes con el metabolismo de plantas superiores tales como fotosíntesis V oxigénica por dos fotosistemas y autotrofía con respecto a nitrógeno reducido, azufre y dióxido de carbono. Por lo tanto, la eficiencia de los compuestos en cianobacterias puede ser indicativo de funcionamiento similar en 5 vegetales superiores. Las membranas fotosintéticas de cianobacterias, vegetales y algas contienen pigmentos esenciales llamados carotenoides, que funcionan para proteger la clorofila en contra del daño foto oxidativo por el oxígeno sencillo, 10 actuando también como pigmentos accesorios, en la cosecha de luz fotosintética. Estos carotenoides son también precursores de la vitamina A en humanos y ácido abscísico en vegetales. El primer paso comprometido en la biosíntesis de carotenoides es la condensación de dos 15 moléculas de pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP) para producir el fitoeno incoloro. La desaturación del fitoeno a través de la inserción de cuatro dobles enlaces da origen a licopeno, y reacciones de ciclización adicionales conducen a la generación de ß-caroteno. La 20 fitoeno desaturasa (pds) media los primeros dos pasos de desaturación del fitoeno, la desorganización del cual resulta en un síntoma de blanqueo observable. Como tales, se han desarrollado un número de herbicidas comerciales dirigidos a inhibir esta enzima, por ejemplo norflurazon, 25 fluridona y fluorocloridona.

Además, como precursores ancestrales a los cloroplastos, los genes de cianobacterias comparten características comunes con los genes de cloroplasto. Los elementos del gen, tales como promotores, sitios de enlace de ribosoma, etc, son similares y pueden ser de funcionalidad cruzada entre el cloroplasto y la cianobacteria. Por lo tanto, los genes de cianobacteria son candidatos ideales para la transformación seleccionada de plastoma, y en particular transformación de cloroplasto. Existe un número de referencias en la literatura para métodos y pruebas de selección que utilizan cianobacterias. Estos incluyen métodos que usan cianobacterias para la selección de compuestos para identificar inhibidores de rutas metabólicas específicas y la identificación de modos de acción herbicida novedosos. [Hirschberg et al, 1996] describe un gen de Erwinia transformado en células huésped seleccionadas de cianobacterias, específicamente Synechococcus PCC 7942 y Synechocystis PCC 6803, que se usó como un tamiz para biosíntesis de beta-caroteno y para mutantes resistentes a herbicidas específicamente herbicidas que blanquean de la familia de trialquilamina. La selección de la actividad de blanqueo se describe por [Sandmann et al, 1991] como un medio para descubrir nuevos herbicidas con diferentes estructuras de núcleo que inhiben la fitoeno desaturasa (pds) , una enzima enlazada a membrana en la ruta carotenogénica que cataliza el paso de abstracción de hidrógeno en el primer C40 precursor de beta-caroteno. [Windhoevel et al, 1994] describe un tamiz que involucra genes que codifican para pds de la bacteria no fotosintética Erwinia uredovora introducidos dentro de la cianobacteria Synechococcus como un modelo experimental conveniente para la transformación de vegetales superiores y resistencia a herbicidas. La funcionalidad de la fitoeno desaturasa heterólogamente expresada en los transformantes se demostró en las pruebas. Otras referencias tales como [Babczinski et al, 1995] identifica una nueva clase de herbicidas que inhiben pds con base en un tamiz que utiliza la cianobacteria unicelular Anacystis . [Chamowitz et al, 1993] describe una prueba carotegénica libre de células para identificar mutantes pds de algas marinas resistentes a herbicidas.

La inhibición de la biosíntesis de carotenoides por derivados del herbicida m-fenoxibenzamida se investigó en una prueba in vitro libre de células usando la cianobacteria Aphanocapsa por [Clarke et al, 1985] , y subsecuentemente por [Ko alczyk-Schroeder et al, 1992] .

[Sandmann et al, 1991], describe una prueba libre de células no radiactiva para determinar cuantitativamente la inhibición de pds de tipo vegetal por herbicidas blanqueadores. Desarrollaron adicionalmente un sistema de prueba de pds de cianobacteria, una prueba de modo de acción utilizando la cianobacteria Anacystis, y pruebas 5 que usan células de algas marinas. La presente invención, sin embargo, difiere al identificar mejoras a los métodos y pruebas de selección actuales, y usa estas mejoras para identificar fragmentos de ácido nucleico novedosos que tiene mutaciones resistentes a herbicidas en el gen pds . 10 La enzima procariótica acetolactato sintasa (ahas) existe como dos subunidades de proteína físicamente asociadas pero distintas. En procariotes, los dos polipéptidos, una "subunidad grande" y una "subunidad pequeña" se expresan a partir de genes separados. Se han 15 identificado tres enzimas ahas principales, designadas I, II, III, que tiene todas subunidades grandes y pequeñas en bacterias entéricas. En procariotes, se ha mostrado que la enzima ahas es una enzima reguladora en la ruta biosintética de aminoácidos ramificados [Miflin et al, 20 1971], y solamente se ha observado que la subunidad grande tiene actividad catalítica. A partir de estudios de enzimas ahas a partir de sistemas microbianos, se han descrito dos papeles para la subunidad pequeña: 1) la subunidad pequeña está involucrada en la inhibición de la 25 retroalimentación alostérica de la subunidad grande catalítica cuando está en la presencia de isoleucina, leucina o valina o combinaciones de los mismos; y 2) la subunidad pequeña mejora la actividad de la subunidad grande en la ausencia de isoleucina, leucina o valina. También se ha mostrado que la subunidad pequeña aumenta la estabilidad de la conformación activa de la subunidad grande. La expresión de la subunidad pequeña también puede aumentar la expresión de la subunidad grande como se ve para AHAS I a partir de E. coli [Weinstock et al., 1992]. La proteína de subunidad grande ahas se ha identificado en vegetales, y también se ha aislado y usado para transformar vegetales. Un isotipo del alelo mutante de ahas de la proteína de subunidad grande ahas III, que tiene el triptofano en la posición 557 reemplazado con leucina se ha encontrado en una línea de células de Brassica napus [Hattori et al., 1995]. El producto de proteína mutante de este gen confiere resistencia a sulfonilurea, i idazolinona y triazolopiridina a la línea de células. Este alelo mutante cuando se expresa en vegetales transgénicos, también confiere resistencia a estos herbicidas. Hasta hace poco, no había evidencia directa de que una proteína de subunidad pequeña de ahas existiera en organismos eucarióticos. Hace poco, otros grupos, a través del uso de Etiquetas de Secuencia Expresada (las EST) , han identificado secuencias homologas a los genes de subunidad pequeña ahas de microbios en un eucariote, el vegetal Arabidopsis . Estos grupos mostraron que una secuencia de .ADNc de Arabidopsis aislada aleatoriamente tenía homología de secuencia con las secuencias de subunidad pequeña de ahas a partir de sistemas microbianos. Desde entonces, se han descrito las EST a partir de genes de subunidad pequeña a partir de otros eucariotes como levaduras y algas rojas. [Duggleby et al, 1997] describe tres secuencias de EST, dos a partir de Arabidopsis y una a partir de arroz, que tienen homología con la secuencia de ADNc de subunidad pequeña procariótica conocida a partir de P. purpurea . Existen diversas referencias a tamices y pruebas de ahas que utilizan cianobacterias en la técnica anterior. [Powell et al, 1990], reportó sobre el papel de la cianobacterias para la selección de herbicidas pero no hizo mención de la "subunidad pequeña" de ahas identificado en la invención. Reportaron que el entendimiento del modo de acción de algunos herbicidas que inhiben la fotosíntesis se ha facilitado por estudios con cianobacteria. En el caso de herbicidas de sulfonilurea que inhiben la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, la resistencia mostrada por una cianobacteria se debe a una enzima acetolactato sintasa insensible. Estos estudios no son consistentes con los resultados reportados por Freiburg et al., discutidos anteriormente, en los cuales el gen de cianobacteria es sensible. Si se encontraran otras enzimas objetivo insensibles, las cianobacterias podrían ser fuentes útiles de genes para la clonación de resistencia a herbicidas en vegetales superiores. Presentaron datos que muestran altos niveles de resistencia de algunas cianobacterias al glifosato, un inhibidor de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. [Dunahay et al, 1997], describe un método para transformar algas que contienen clorofila, que incluye introducir una molécula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable dominante enlazado operativamente a una secuencia control reguladora de las algas marina dentro de las algas que contienen clorofila C. Sin embargo, a diferencia de la invención, el mutante ahas se introdujo dentro de las algas, no chanophycae, para detectar inhibidores. La WO 98/06862 (Calgene) describe vegetales transformados con el gen de fitoeno desaturasa de Erwinia para niveles de carotenoides y ácidos grasos alterados. La JP 6,343,476 (Kirin Brewery) describe la producción de vegetales resistentes a herbicidas blanqueadores por transformación con el gen pds de Erwinia . La WO 98/06862 (Zeneca) describe vegetales transgénicos resistentes a muchas clases de herbicidas, pero la fuente de los genes, ya sea pds o ahas o a partir de Synechocystis no se especifica. También, la Patente Norteamericana No. 5,378,824 (Dupont) y la Patente Norteamericana No. 5,661,017 (Dunahay et al.) reportan la transformación de un gen de ahas de vegetal, no un gen de Synechocystis, dentro de un número de razas y clases que incluyen algas. Freiburg et al, 1990, reportó sobre el gen de ahas de Synechococcus resistente a herbicidas expresado en E. coli . El reporte describe el aislamiento y caracterización molecular de los genes de acetolactato sintasa a partir de la enzima sensible a sulfonilurea y a partir de la mutante resistente a sulfonilurea, que especifica la enzima resistente a herbicidas de sulfonilurea. El gen .ALS se clonó y se mapeo por complementación de una E. coli ilv auxotrofa que requiere aminoácidos de cadena ramificada para crecer y carece de actividad .ALS. El gen de cianobacteria se expresa eficientemente en este huésped heterólogo. El fenotipo resistente es una consecuencia de la sustitución de prolína por serina en el residuo 114 de la secuencia de aminoácidos deducida. La expresión funcional del gen mutante en Synechococcus y en E. coli confirmó que esta secuencia de aminoácidos es responsable de la resistencia. [Linden et al., 1990], reportó las mutantes de cianobacterias Synechococcus PCC 7942 seleccionadas en contra de el herbicida blanqueador norflurazon. Una cepa presentó resistencia cruzada en contra de otro herbicida blanqueador fluorocloridona, pero las otras tres cepas no mostraron resistencia cruzada en contra de otros inhibidores de fitoeno desaturasa (pds) . [Sandman et al, 1991] reportó sobre mutantes a partir de Synechococcus PCC 7942, que se seleccionaron por tolerancia a diversos herbicidas blanqueadores. Una mutante NFZ4 estableció un alto grado de resistencia cruzada a norflurazon y fluorocloridona, pero no a fluridona. [Chamowitz et al, 1991] clonó y secuenció un gen pds a partir de la cianobacteria Synechococcus PCC 7942, también resistente al herbicida blanqueador norflurazon. La mutante identificada es un cambio de Val => Gly en la posición 403 en la proteína pds de Synechococcus pero no de Synechocystis . [Sandmann et al, 1998] reportó pds de bacteria y hongo como un objetivo para herbicidas blanqueadores, y discutió la identificación de mutantes de cianobacteria con resistencia a compuestos específicos y su resistencia cruzada a otros herbicidas blanqueadores . La cianobacteria Synechocystis se describió originalmente en Vioque et al, 1992. Una mutante espontánea, la cepa AV4 que es resistente al norflurazon, se aisló a partir de Synechocystis PC 6803. El ADN aislado a partir de la mutante AV4 puede transformar células de tipo silvestre para resistencia a norflurazon con alta frecuencia. El análisis de secuencia del clon identificó una estructura de lectura abierta que es altamente homologa con los genes pds previamente secuenciados a partir de Synechococcus y soya. En cianobacterias y vegetales el gen pds se conserva altamente: el pds de Synechocystis PCC 6803 es 82% y 61% idéntico a los genes pds de Synechococcus PCC 7942 y de soya respectivamente. [Sandmann et al, 1994] identificó tres mutantes de Synechocystis distintas seleccionadas en contra de norflurazon y mostró la modificación del mismo aminoácido de fitoeno desaturasa en tres diferentes. En todos los casos, el mismo aminoácido Arg195 se modificó en Cis, Pro, o Ser. El grado de resistencia fue mayor cuando se cambió Arg en Ser. Mientras que la literatura tiene diversas referencias a vegetales transgénicos resistentes a herbicidas pds, la intervención ejemplifica mejoras a los métodos de selección de cianobacterias actuales. La mejora ha identificado fragmentos de ácido nucleico novedosos a' partir de Synechocystis PCC 6803. El gen de pds (fitoeno desaturasa) mutante y las subunidades de ahas grandes y pequeñas son útiles en la identificación de inhibidores de pds y ahas novedosos y, en transformaciones vegetales para conferir resistencia y resistencia cruzada a algunos herbicidas blanqueadores y herbicidas que inhiben AHAS.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, la presente invención mejora los métodos de selección de cianobacterias actuales. La mejora, a su vez, ha identificado fragmentos de ácido nucleico novedosos a partir de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803. El gen pds (fitoeno desaturasa) mutante y las subunidades de ahas (Acetohidroxiácido sintasa) grandes y pequeñas son útiles en la identificación de inhibidores de pds y ahas novedosos y, en transformaciones vegetales para conferir resistencia y resistencia cruzada a algunos herbicidas blanqueadores e imidazolinonas . Específicamente, los métodos de selección se usaron para la identificación de mutaciones de Synechocystis novedosas que proporcionan resistencia a 4 ' fluoro-6- [ (alfa, lfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, un inhibidor de pds . La identificación de una mutación novedosa en el gen pds junto con el hecho de que este gen es altamente homólogo entre las cianobacterias y vegetales, auxiliaría en los esfuerzos para diseñar cultivos con resistencia a herbicidas a través de la introducción de la mutación dirigida al sitio en el gen pds objetivo. Las mutaciones novedosas que muestran resistencia única a 4 ' -fluoro-6 [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, auxiliarían en programas de diseños de cultivos con resistencia a 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-mtolil) oxi] -picolinamida, y potencialmente otros herbicidas que inhiben pds por medio de la transformación mediada con cloroplastos. Alternativamente, las formas mutantes de los genes pds con la o las mutaciones en la o las posiciones similares al gen de Synechocystis pueden obtenerse para cualquier especie dada de cultivo, y usadas adicionalmente para transformación genética. La identificación de mutaciones novedosas adicionales que confieren resistencia a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida deberían arrojar luz sobre la estructura del sitio de enlace de 4'-fluoro-6 [ (alfa, alfa, alfa, trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, y servir como una guía valiosa para diseñar inhibidores novedosos de esta enzima. Por lo tanto, en modalidades preferidas, la presente invención proporciona el o los genes pds mutantes de Synechocystis novedosos que confieren resistencia a 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. También, en modalidades preferidas adicionales, la presente invención proporciona un método para usar un sistema genético simple, Synechocystis, para seleccionar y aislar formas mutantes resistentes a 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. En modalidades adicionales, se proporciona un método para la preparación de fragmentos de ácido nucleico resistentes de pds a partir de las líneas de células resistente a EMS de la cianobacteria Synechocystis . En modalidades preferidas adicionales, la presente invención proporciona el o los genes pds mutantes de Synechocystis novedosos que confieren resistencia cruzada a los inhibidores de PDS conocidos y 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Otra propuesta al uso de genes de cianobacterias para controlar rasgos vegetales es usar genes de cianobacterias naturales, que ya tienen las características deseadas. Las enzimas de acetolactato sintasa (.AHAS) a partir de Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120 son naturalmente resistentes a la imidazolinona y otras enzimas que inhiben .AHAS. Los genes AHA? a partir de estas cianobacterias podrían usarse por lo tanto para transformar especies de cultivos confiriendo con eso resistencia a herbicidas. Estos genes mutantes de cianobacterias, aislados a partir de fuentes de cianobacterias, pueden ser útiles no solamente para resistencia a herbicidas sino también como marcadores seleccionables para genes de resistencia a herbicidas, fungicidas e insecticidas, así como genes de producción de rasgos, como un componente para unos sistemas de selección cuando se acoplan con las imidazolinonas y otros herbicidas. Tal sistema de marcadores seleccionables para transformación nuclear o plastídica podrían usarse para cultivos de monocotiledóneas y dicotiledóneas principales tales como maíz, trigo, cebada, cañóla, arroz, tabaco y soya. Así, la presente invención proporciona mejoras a los métodos actuales para identificar y utilizar genes de cianobacterias para modificar rasgos vegetales que incluyen resistencia a herbicida. Las mejoras incluyen métodos para selección de compuestos para identificar modos de acción de herbicidas novedosos e identificar mutaciones novedosas de resistencia a herbicidas. Así, en modalidades preferidas, la presente invención proporciona un fragmento de ácido nucleico que codifica un gen de subunidad grande de acetolactato sintasa ( ahas) resistente a herbicida a partir de la cinaobacteria Synechocystis PCC 6803 y se clonó a partir de una biblioteca de ADN genómico. En modalidades adicionales preferidas, un fragmento de ácido nucleico que codifica un gen de subunidad pequeña de acetolactato sintasa ( ahas) resistente a herbicida a partir de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803 se clonó a partir de una biblioteca de ADN genómico. En modalidades preferidas adicionales, esta invención proporciona cianobacterias como una fuente alternativa de genes ahas y pds para transformaciones vegetales, en particular genes que codifican proteínas insensibles a herbicidas, y elementos de genes para el control de expresión en plástidos. La presente invención también proporciona un método para la transformación genética mejorada de Synechocystis . Finalmente la presente invención proporciona el uso de los genes pds y/o ahas de cianobacteria como un marcador seleccionable para transformaciones, y como un medio de selección con las imidazolinonas y 4'-fluoro-6-[ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida para resistencia a herbicidas. Se proporciona adicionalmente un método para la identificación del sitio objetivo del gen, específicamente, protocolos para la manipulación molecular de "alto rendimiento" de la cianobacteria Synechocystis . Este sistema de alto rendimiento permite determinar el modo de acción de los compuestos comerciales y/o novedosos para los cuales se desconoce el modo de acción. La integración de los procesos, junto con las mejoras descritas, de; selección de las mutantes de Synechocystis resistentes a herbicidas, la preparación de ADN genómico a partir de mutantes, la transformación de Synechocystis de fragmentos de ADN mutante, y la identificación de transformantes que se les confiere resistencia a herbicidas a partir de los fragmentos de ADN, y la secuenciación del fragmento de ADN para identificar el objetivo del herbicida, la mutación que confiere resistencia a herbicidas, combinada provista para un método mejorado para identificar un Modo novedoso de acción y mutaciones dentro de los genes por rasgos alterados .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS/DIBUJOS Títulos de las figuras Figura 1. Selección de mutantes resistentes verdaderas.

Figura 2. Identificación de mutante resistente de Synechocystis. (Colonias resistentes sembradas en placas de 5µM de placas de 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m- tolil) oxi] -picolinamida) . Figura 3. Prueba de susceptibilidad de las mutantes de Synechocystis de tipo silvestre y 4'fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] - picolinamida, usando la prueba de disco de papel. (Inhibición de Synechocystis de tipo silvestre en prueba de disco de papel) . Figura 4 Curva de respuesta de dosis de las mutantes resistentes a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, - trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida de tipo silvestre de Synechocystis después de siete días de cultivo en suspensión. Figura 5. Identificación del Sitio Objetivo del Gen de Alto Rendimiento (HTP) en Synechocystis . Figura 6. Crecimiento in vivo de Synechocystis PCC 7120 y Anabaena PCC 7120 cultivadas en un medio BG-11 en la presencia de concentraciones crecientes de imazetapir de PURSUIT© y metil sulfometuron de OUST®. Figura 7. Actividad in vitro de AHAS de Synechocysti s PCC 7120 y Anabaena PCC 7120 con concentraciones crecientes de imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®. Figura 8. Resultados de la prueba de rocío de imazetapir de PURSUIT®. Figura 9. Amplificación de los fragmentos aadA y snAHAS. Figura 10. Pruebas de Enzima .AHAS Figura 11. Construcción pl2deltaNI, también conocida como pACBC 111. Figura 12. Construcción pl2deltaNII, también conocida como pACBC 112. Figura 13. Construcción pll61 Figura 14. Construcción pll6II Figura 15. Lista de Construcciones, incluyendo pll6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Prueba basada en placa rápida para identificar compuestos directores Un requisito previo para la utilización exitosa de Synechocystis en el descubrimiento del sitio objetivo del gen es la identificación de compuestos que afectan el metabolismo de este organismo. Para este fin, se ha desarrollado y establecido una prueba basada en placa rápida para seleccionar compuestos que inhiben la actividad de fitoeno desaturasa (pds) . En modalidades preferidas la presente invención proporciona mejoras en los métodos que utilizan cianobacterias, una prueba de disco de papel y una prueba de líquido de microtítulo, para la selección de modos herbicidas de acción novedosos y para identificar mutaciones novedosas de resistencia a herbicida. La selección puede realizarse en un medio simple, preferiblemente BG-11 (Sigma, St., Louis Missouri) , sin la necesidad de mantener condiciones axenicas. Además, pueden hacerse determinaciones cuantitativas dentro de uno a tres días. Pueden diseñarse selecciones para identificar inhibidores de otras rutas metabólicas específicas, que son comunes solamente a cianobacterias fotoautotróficas y a plantas superiores y no a organismos heterotróficos tales como otras bacterias. Para identificar una actividad del sitio objetivo del gen, pueden usarse dos tipos de algas Verdeazules, Synechocystis PCC 6803 (Colección de Cultivos de Tipo Americano, Rockville, Maryland) y Anabaena PCC 7120 (Colección de Cultivos de Tipo .Americano, Rockville, Mariland) para la selección. Una se cultiva en cajas de microtítulo en un medio BG-11 suplementado con diversas concentraciones de los compuestos de prueba. La inhibición del crecimiento puede observarse por inspección visual después de dos a tres días de cultivo. Las mediciones del crecimiento cuantitativas pueden tomarse fotométricamente iniciando un día después de la inoculación. Alternativamente pueden realizarse selecciones o placas de agar con "prados" de cianobacterias y discos de papel impregnados con compuestos de prueba. En este caso, pueden detectarse zonas de crecimiento inhibido alrededor de los discos de papel después de dos o tres días. Para organizar la prueba, células de tipo silvestre de Synechocystis se mezclaron con volúmenes iguales de 2x de agar superior y 2x de BG-11 y se sobrepusieron en lo alto de placas de agar BG-11. Las células aparecen normalmente a los 3-5 días después de sembrarse. Este método producirá un prado igual y uniforme de células. Al solidificar, los compuestos de prueba se gotean después sobre discos de papel filtro Whatman antes de colocarse sobre placas de agar. Pueden probarse cuatro compuestos en una placa sencilla. Usando esta selección, en un ejemplo que emplea 160 compuestos diferentes, predominantemente compuestos de modo de acción novedoso, se han probado sobre este microbio, y en promedio, 25% de los compuestos muestran al menos alguna actividad.

Ejemplo 1: Proceso de Selección de Cianobacterias La prueba basada en placa rápida para seleccionar compuestos directores se desarrolló como sigue. Primero, uno de dos tipos de algas verdeazules, Synechocystis PCC 6803, y Anabaena PC 7120 se cultivaron en placas de microtítulo que contienen BG-11 suplementado con diversas concentraciones de 160 diferentes compuestos de prueba. Alternativamente, pueden realizarse selecciones sobre placas de agar con prados de cianobacterias y discos de papel impregnados con compuestos de prueba. Se probó la susceptibilidad de Synechocystis a ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida usando una prueba de disco de papel en la cual se goteó 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida en un disco de papel antes de colocarse sobre un prado de células. Para determinar la susceptibilidad, el tamaño de la zona de inhibición es indicativa de la potencia del compuesto. Estos experimentos establecieron también una curva de dosis-respuesta. Una concentración letal para la selección de mutantes resistentes fue l-2µM de 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida.

Los estudios de dosis-respuesta se realizaron también en placas de microtítulo de 96 pozos sobre mutantes de Synechocysti s resistentes a 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, - trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida putativas y de tipo silvestre. El crecimiento del cultivo se midió diariamente a una densidad óptica de 690 nm. Una prueba basada en placa rápida para seleccionar e identificar compuestos activos se realiza después. Las células de tipo silvestre de Synechocystis se mezclan con volúmenes iguales de 2x de agar superior y 2x de BG-11. La mezcla se sobrepone después en lo alto de una placa de agar BG-11. Las células aparecen normalmente 3-5 días después de sembrar. Este método producirá un prado igual y uniforme de células. Después de la solidificación del agar, se gotearon compuestos de prueba sobre discos de papel filtro Whatman, y se colocaron después sobre placas de agar. Se probaron cuatro compuestos diferentes en una placa sencilla. Usando este método de selección, se probaron 160 compuestos diferentes, predominantemente compuestos del nuevo modo de acción. En promedio, 25% de los compuestos muestran al menos alguna actividad.

B. gen pds mutante de Synechocystis La proteína fitoeno desaturasa (PDS, codificada por el gen pds) es el objetivo de un número de herbicidas blanqueadores comercialmente valiosos. El sistema genético cianobacteriano simple, Synechocystis, se usó para generar y seleccionar formas mutantes de pds resistente a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. (BASF (Previamente Cianamid) , Princeton, New Jersey) 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida es un herbicida para el control pos-emergencia de malezas de hoja ancha en trigo de invierno y primavera. Se ha determinado que su sitio de acción es PDS. Sobre un medio sólido BG-11 (Sigma, St., Louis Missouri) en una prueba de disco de papel, se encontró que 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi]picolinamida es activo en contra de Synechocystis PCC 6803 (referida como Synechocystis) a concentraciones en el rango de 1-2 µM. Además, se inhibió el crecimiento de Synechocystis con una I50 en el rango sub-micromolar inferior cuando se probó en cultivos líquidos. Así, la presente invención proporciona el o los genes novedosos de fitoeno desaturasa (pds) mutantes de Synechocystis que confieren resistencia a 4'-fluoro-6-[ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. La presente invención proporciona un método para aislar y seleccionar mutantes resistente a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida. Pueden aislarse dos tipos de mutantes, mutantes espontáneamente producidos o mutantes químicamente inducidos. Las mutaciones químicamente inducidas pueden inducirse con, por ejemplo, etil metansulfonato (EMS) . Los mutantes espontáneos se obtuvieron cultivando Synechocystis de tipo silvestre en cultivo líquido, o directamente sembrado en placas que contienen concentraciones letales de 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, - trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida o a través de la exposición paso a paso a niveles crecientes de 4'-fluoro- 6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi]picolinamida en cultivo líquido. Las colonias resistentes putativas se sembraron después sobre placas de selección para obtener líneas de células resistentes sencillas. Para aislar las mutantes inducidas por EMS, se trataron cultivos de células de Synechocystis con EMS a una concentración que da 99% de destrucción, seguido por el crecimiento sobre placas de selección. Se cosecharon muestras de 100~200 ml de cultivo líquido logarítmico y se trataron con EMS. La reacción se detuvo por la adición de tiosulfato de sodio, a una concentración final de 5%, para extinguir EMS excesivo. Las células se recolectaron después y se lavaron dos veces con BG-11. Después de recuperación durante la noche en un medio BG-11 reciente, las células se sembraron en un medio BG-11 sólido que contiene 1 µM de 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro- m-tolil) oxi] picolinamida. Para seleccionar las mutantes resistentes a 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m- tolil) oxi] picolinamida, se recogieron las colonias sobrevivientes del tratamiento con EMS y se cultivaron en BG-11 en placas de microtítulo de 96 pozos. Después de 2- 4 días de crecimiento, las células se sembraron con réplica en placas BG-11 que contienen 0, 2, o 5 µM de 4'- fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida para identificar las mutantes resistentes verdaderas. Las Figuras ÍA, IB, y 1C muestran los resultados a partir de un conjunto de placas de selección. Conforme se aumentó la concentración de 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida de 2 a 5 µM (de la Figura IB a 1C) , la mayoría de las células fallaron en crecer. De 576 (96x6) colonias resistentes putativas sembradas en placas con 5 µM de 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, se identificaron 7 colonias resistentes, como se muestra en las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D.

El fenotipo de resistencia de las líneas de células mutantes seleccionadas se probó adicionalmente en un medio sólido así como en cultivos en suspensión. A las colonias resistentes seleccionadas se les dio nombres dentro de la organización para diferenciarlas unas de otras: 5-1/12E, 5-1/12F, 7-2/1E, 7-3/11F, 7-3/12F, 7- 4/12F. Las Figuras 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, y 3g muestran que el crecimiento de Synechocystis de tipo silvestre se inhibió significativamente en una proporción de 4'- fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida tan baja como 0.5 nmol mientras que el crecimiento de las líneas mutantes se inhibió a una proporción sustancialmente menor. La diferencia entre las líneas de tipo silvestre y mutante se vuelve aún más aparente a la proporción más alta (5 nmol) probada. En este experimento particular y para las células de Synechocystis de tipo silvestre, se observaron zonas de inhibición a las dos proporciones de aplicación superiores de 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -fluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida (5 X 10"10 mol y 5 XlO"9 mol) con un diámetro de 20 y 38 mm, respectivamente. Sin embargo, se observaron solamente zonas de inhibición en 4 de las 6 mutantes a la proporción más alta de 4'fluoro-6-[ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, resultando con grado de resistencia en el siguiente orden: 7-3/llF(0)= 7-4/12F(0) > 5-l/12E(8) > 7-3/12F(12) > 5-l/12F(18) > WT(38) (tamaño de la zona en mm en paréntesis) En los cultivos en suspensión, todas las mutantes presentaron resistencia aumentada en contra de 4 ' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. La Figura 4 muestra el resultado de un experimento tal de dosis-respuesta después de siete días de cultivo. Para células de tipo silvestre (WT) , el crecimiento se inhibió a concentraciones de 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida de < 0.25 µM, con una I50 en el sub-rango µM. En contraste, los valores de I50 están entre 1-2 µM para 5-1/ 12E, 5- 1/12F, y en el rango de 5-10 µM para 7-3/12F y 7-4/12F, respectivamente. Así, existe evidencia sustancial que las líneas de células aisladas confieren niveles aumentados de resistencia a 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida.

Ejemplo 2: Aislamiento y Selección de Genes PDS Mutantes Se cultivaron 100-200 ml de cultivo líquido logarítmico y se trataron con el mutágeno etil metansulfonato (EMS) en un regulador de fosfato. Para extinguir el EMS excesivo, la reacción se detuvo con la adición de tiosulfato de sodio a una concentración final de 5%. Las células se recolectaron y se lavaron dos veces con BG-11, se colocaron después en un medio BG-11 reciente para recuperación durante la noche. Las células se sembraron después sobre un medio BG-11 sólido que contiene 1 µM de 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Las colonias sobrevivientes se cultivaron en BG-11 dentro de placas de microtítulo de 96 pozos. Para identificar las mutantes verdaderas, se sembraron células con réplica en placas de BG-11 que contienen 0, 2 ó 5 µM de 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, después de 2-4 días de crecimiento. Se muestra un resultado de un conjunto de placas de figura en las Figuras ÍA, IB, y 1C. Conforme se aumentó la concentración de 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida de 2 a 5 µM, la mayoría de las células fallaron en crecer. Solamente se identificaron 7 colonias resistentes de las 576 (96x6) colonias de resistencia putativas sembradas en 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Figuras 2A, 2B, 2C y 2D. El fenotipo resistente de las líneas de células mutantes seleccionadas se probó adicionalmente en un medio sólido así como en cultivos en suspensión. Para las pruebas de un medio sólido, se hizo una prueba del disco de papel. Como se muestra en la Figura 3, el crecimiento del Synechocystis de tipo silvestre se inhibió significativamente con 0.5 nmol de 4'fluoro-ß- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida. En contraste, el crecimiento de las líneas mutantes se inhibió a una proporción menor. La diferencia entre las células de tipo silvestre, y las líneas de células mutantes se vuelve aún más aparente con una concentración mayor de 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. En una prueba de cultivo en suspensión, todas las mutantes presentaron resistencia aumentada en contra de 4' fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. La Figura 4 muestra el resultado de un experimento de dosis de respuesta tal después de siete días. Las células de tipo silvestre se inhibieron a concentraciones de < 0.25 µM de 4'fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, con una I50 en el sub-rango µM. En contraste los valores de I50 están entre 1-2 µM para 5-1/12E, 5-1/12F, y entre 5-10µM para 7-3/12F y 5-4/12F. Así, debido a que las líneas de células con los genes pds mutantes son mucho más resistentes que las líneas de células de tipo silvestre, existe evidencia de que los cultivos seleccionados contienen resistencia a 4'fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Un método para la preparación de fragmentos de ácido nucleico resistentes pds a partir de las líneas de células resistentes a EMS de la cianobacteria Synechocystis se proporcionan en las modalidades preferidas adicionales. El ADN genómico se preparó a partir de seis líneas de células resistentes a EMS de Synechocystis obtenidas a partir del proceso de aislamiento y selección anterior. Un fragmento de ADN genómico de 1.7 Kb que abarca el pds se amplificó usando ADN Genómico como una plantilla. Los fragmentos del gen PCR amplificados por pds se subclonaron subsecuentemente dentro del vector de clonación TOPO TA de Invitrogen pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp. Carlsbad, California) para obtener el plásmido PCR2.1-TOPO-PDS. La clonación del gen pds resistente dentro de un vector se hizo como sigue. Se diseñó un par de cebadores con base en la información de secuencias disponible en una base de datos (base de datos disponible en www.ncbi .nlm.nih. gov/cgi-bin/Entrez/framik?db=Genome &gi=112 o www.kazusa.or.jp/cyano/kwd.html) . Los cebadores tuvieron la secuencia (de 5' a 3'): X62574-5' cgaattccctggtagcatttaatacaattggc, identificada como la Secuencia de IDENT. NO.: 1 y X62574-3' cgcataagctttgcagatggagacggtttgggc, identificada como la SEQ ID NO.: 2. Los cebadores se usaron para amplificar el gen pds que codifica fitoeno desaturasa, usando ADN Genómico de Synechocystis (preparado a partir de seis líneas de células resistentes a EMS de Synechocystis obtenidas a partir del proceso de aislamiento y selección anterior) como una plantilla. Se obtuvo un fragmento de PCR de 1.7 Kb y se subclonó subsecuentemente dentro del vector TOPO TA de Invitrogen para generar plásmidos TOPO TA-PDS (PDSr) .

Ejemplo 3: Clonación y Subclonación del Gen PDS Mutante La clonación de los genes pds mutante fue como sigue. Se diseñó un par de cebadores para amplificar el gen pds usando ADN de Synechocystis preparado a partir de células mutantes resistentes a 4'fluoro-6-[ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida y de tipo silvestre como plantillas. Los genes PDS se clonaron a partir de Synechocystis de tipo silvestre y líneas de células resistentes a 4 * fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi]picolinamida. Los genes de Synechocystis se clonaron de líneas de células con una estrategia basada en PCR. El ADN Genómico se usó como una plantilla. Con base en la información de secuencia disponible en una base de datos, se usaron los siguientes cebadores (de 5' a 3'): X62574-5'cgaattccctggtagcatttaatacaattggc, SEQ ID N0.:1, y X62574-3' cgcataagctttgcagatggagacggtttgggc, SEQ ID NO. : 2. Se obtuvo un fragmento por PCR de 1.7 Kb y se subclonó subsecuentemente dentro del vector TOPO TA de Invitrogen, resultando en los plásmidos TOPO TA-PDS (PDSr) los productos de PCR se subclonaron dentro de un vector de clonación TOPO TA de Invitrogen, generando TOPO TA-PDS (PDSr) . Los plásmidos que llevan la inserción pds se prepararon usando Qiaprep Spin Miniprep Kit. (Qiagen Inc., Valencia, California). Los productos de PCR del gen PDS así como los plásmidos que llevan el gen pds derivado de las seis líneas de células mutantes se usaron en una prueba de complementación funcional. La prueba se hizo para eliminar la posibilidad de que la resistencia a 4 * fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] picolinamida estuviera enlazada a una mutación distinta a, o en adición a, fitoeno insaturasa en Synechocystis . Se usó ADN de genoma de Synechocystis digerido, fragmentos de PCR del gen PDS y plásmidos TOPO TA-PDSr en un estudio de complementación genético. Todas las especies de ADN probadas transformaron Synechocystis en resistencia a 4'fluoro-d- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Esto sugiere que la resistencia a 4'fluoro-ß- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida está asociada con la mutación en el gen pds en esta línea de células mutantes. Se tomaron tres clones independientes y se secuenciaron para cada línea de células mutantes. La secuenciación del producto de gen de PCR amplificado por pds a partir de las líneas de células resistentes 7-4/12F reveló un cambio de pares de base sencillo de G = A en la posición 642 (posición 523 dentro de ORF) (Tabla 1) , resultando en un cambio de aminoácido de Ala =í> Thr en la posición 175. La secuencia se identifica como la SEQ ID NO.: 3. Esta mutación es única y diferente de la única mutación (Arg195 => Cis, Pro, o Ser) descrita en el gen pds de Synechocystis por [?andmann et al., 1998], y otras cuatro mutaciones punto (Arg195 = Pro, Leu320 => Pro, Val403 = Gly, Leu436 => Arg) reportadas previamente para el gen pds de Synechococcus sp. PCC 7942. Todas las mutaciones previamente descritas se identificaron con base en su capacidad para conferir resistencia al herbicida comercial norflurazon a las células de tipo silvestre.

Tabla 1. Lista de mutaciones punto en genes pds que confieren resistencia a herbicidas a partir de cianobacterias Ejemplo 4: Secuenciación del Gen PDS Mutante Se tomaron tres clones independientes y se secuenciaron usando el Equipo de Secuenciación de Ciclo Terminador de dRhodamine (PE Biosystems, Norwalk, Connecticut) . Las reacciones se analizaron en un Analizador Genético ABI A310 (ABI, Foster City, CA. ) La secuenciación del producto del gen pds amplificado por PCR a partir de la línea de células de resistencia 7-4/12F reveló un cambio de par de bases sencillo de G => A en la posición 642 (posición 523 dentro de ORF) Véase Tabla 1. El resultado es un cambio de aminoácido de Ala => Thr en la posición 175. La mutación es única. Es diferente de la única mutación descrita en el gen pds de Synechocystis (ARG 195 => Cis, Pro o Ser) , y de otras cuatro mutaciones punto previamente reportadas para el gen pds de Synechocystis sp. PCC 7942 (Argl95 => Pro, Leu320 => Pro, Val403 => Gly, Leu436 = Arg) . Todas estas mutaciones se identificaron con base en su capacidad para resistir al herbicida comercial norflurazon en células de tipo silvestre. La secuencia completa de la forma mutante nueva del gen pds, identificada como SEQ ID NO. : 3 se lee como sigue: 1 ccctggtagc atttaataca aattggctat cttggcaaag tcccccgaaa tattacgaaa 61 cgtaaagtat aataacaatc aacctgtaaa ccccaaatgc cttagcgaga cagtaaccca 121 tgcgcgttgt gatcgccgga gccggattag ccggcctagc ctgtgccaaa tacttagccg 181 atgcgggctt tacccccgtc gtcttggaac gtagggatgt attaggcggg aagatcgccg 241 cgtggaaaga tgaggacgga gattggtacg aaaccggcct acacattttt tttggggcct 301 atcccaacat gttgcagtta tttaaggaat tggatatcga agatcgtctg caatggaaag 361 agcacagcat gatcticaac caaccagaga aaccaggtac ctactctcgg ttcgattttc 421 cggatattcc ggcccccatc aatggtttgg tagccattct tcgcaacaac gatatgctta 481 cctggccgga gaaaattcgc tttggcttgg gactcttgcc ggccattgtc cagggccaga 541 gctatgtgga agaaatggat aaatacactt ggtcagagtg gatggccaaa caaaatattc 601 ccccccgcat cgaaaaagaa gttttcattg ccatgagtaa g[a]cgttgaac tttattgatc 661 ccgatgaaat ttccgccacc attttactta ctgccctcaa tcgcttttta caggaaaaaa 721 atggctctaa gatggcattc ctggatgggg caccaccgga gcgtctttgc caacctttgg 781 tcgactatat tacggaacgg ggaggggaag tacacattaa taaacctctc aaagaaattt 841 tgcttaatga agatggttcc gttaagggtt acttaatccg gggcctagat ggagcccccg 901 acgaagtgat cacagcggat ttatatgtgt ctgccatgcc ggtggatccc ctgaaaacca 961 tggtgccagc gccctggaga gaatatcctg agtttaagca aatccaaggt ttggaaggag 1021 tcccggtcat taacctccac ctgtggtttg accgtaagtt aaccgacatt gatcatttgt 1081 tattctcccg atcgccgttg ttgagtgttt acgccgacat gagcaacacc tgccgagaat 1141 acagtgatcc agacaaatcc atgttggaat tggtgctggc tccggcccag gattggatcg 1201 gcaaatccga cgaagagatt gtggcggcca ccatggcgga gatcaagcaa ctctttcccc 1261 aacacttcaa cggggataat ccagcccgac tgcttaaatc ccacgtggtc aaaacccccc 1321 gctcagtcta caaagctacc cccggaaggc aggcttgtcg ccccgatcaa cggacatcgg 1381 tgcccaactt ttacctagca ggggacttca ccatgcaaaa atacttgggc agtatggaag 1441 gggcggtgct ttccggcaaa caatgcgccc aggcgatcgc cgccgatttc aacccccaaa 1501 ccgttccccc caccagggaa atagtcaccg tgggttaagc cgcctggact ccctggtaat 1561 cttcctgaca aatggcaacc ctaatgcgac aatgctaaat ggctaacggt caaatttctc 1621 cccagcgtgc agttaccaaa ccccaatcct ggtggctgac ttccgaaccc cgtccgtcct 1681 taatgttaca actgcccaaa ccgtctccat ctgcaaagcc ctgtgcttct gttga El cebador de PCR 5' con un sitio EcoR I (Promega) diseñado se realzó en letra negra, y el cebador de PCR 3' con un sitio Hind III (Promega) diseñado también se imprimió en letra negra. La sustitución novedosa de G — A en la posición 642 (posición 523 dentro del PDS ORF) se encajona. En modalidades adicionales se proporciona un método para la transformación genética mejorada de Synechocystis . En la literatura, la transformación de Synechocystis se ha realizado usando una de las dos propuestas, la transformación de punto "in si tu" reportada primero por Dzelzkalns & Bogorad ( The EMBO J. , 1998, 7: 333-338), y la transformación basada en cultivo líquido (ref. Williams, Methods in Enzymology 1988, 167: 766-778) . Para el procedimiento basado en cultivo líquido, se mezclaron muestras de ADN con células recientes de Synechocystis y se incubaron durante algún periodo de tiempo antes de dispersarse sobre filtros de membrana que descansan sobre placas de agar BG-11. Después de una incubación prolongada de las placas bajo condiciones estándar para la expresión del o de los genes insertados, los filtros se transfirieron a placas que contienen agentes de selección. Este es un procedimiento tardado, y puede no ser adecuado para la transformación de Alto Rendimiento. El procedimiento de transformación de punto " in si tu" implica la aplicación directa de la muestra de ADN (fragmentos de restricción, plásmidos clonados) en agarosa líquida o fundida sobre un prado de células de Synechocystis 6803 que contienen agentes de selección. Es rápido y conveniente, pero no se le dio a las células el tiempo para expresar el gen insertado antes de exponerse a los agentes de selección, este procedimiento es también "destructivo" porque las muestras de ADN se perderán independientemente de los resultados de transformación. Se preparó ADN de Synechocystis usando el Qiagen DNeasy Plabt Mini Kit. (Qiagen, Valencia, California) después del pretratamiento con Nal y la digestión con lisozima como se describe en Williams (1988) . Para la manipulación de ADN en E. Coli, se siguieron procedimientos de recombinación estándar. Se desarrolló un método más mejorado en el laboratorio para superar las limitaciones de los métodos de transformación de punto ?in situ' y el de transformación con base en el cultivo líquido. Para transformar Synechocystis, se arreglaron células competentes en placas de 96 pozos. Las especies de ADN a ser transformadas se agregaron después y se mezclaron con las células. Las placas de 96 pozos que contienen mezclas de ADN y células se colocaron después en una placa Sumilon (Vangard International Inc., Taipei, Taiwan) humedecida con toallas de papel estéril húmedas. Las células se sembraron con réplica a varios tiempos sobre placas de selección que contienen diversas concentraciones del mismo o diferentes agentes de selección. Este método es extremadamente adecuado para realizar transformaciones y selección de un gran número de muestras, tal como con el protocolo de Alta Producción de la Sección C. La transformación de Synechocystis de tipo silvestre con cualquier especie de ADN resulta en la resistencia a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida mejorada. Esto refuerza la noción de que la resistencia en las líneas de células originales es el resultado de la mutación dentro del gen pds . También se proporciona en modalidades preferidas mutantes resistentes a 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida que muestran resistencia cruzada en contra de otros inhibidores de PDS. Estos mutantes, cuando se probaron de nuevo en contra de herbicidas que son inhibidores de PDS, el compuesto (2E) -2- [amino (bencilsulfanil) metilen] -1- (2, -diclorofenil) -1, 3-butandiona y dos de su análogos, piridina, 2- [ (3, 3-dicloro-2-propenil) oxi] -4-metil-6- [ [2- (trifluorometil) -4-pirodinil] oxi] y 1,2,4,5-bencentetracarboxamida, N,N' , ", " ' -tetrakis [5- (benzoilamino) -9, 10-dihidro-9, 10-dioxo-l-antracenilo] , presentaron resistencia cruzada.

C. Identificación del sitio objetivo del gen de Alta Producción usando Sy echocyst±s En esta invención, se describe adicionalmente el desarrollo exitoso de diversos protocolos para la manipulación molecular de Alta Producción (HTP) de Synechocystis . Éstos incluyen pero no se limitan a procedimientos tales como identificación del compuesto director, generación y selección de la mutante resistente, transformación genética de HTP y la complementación funcional. Como un resultado, es posible diseñar ahora un programa para la identificación rápida y de costo efectiva de los sitios objetivos de los genes usando este microbio. Como se ilustra en la Figura 5, un pre-requisito para la implementación exitosa de este programa es la identificación y disponibilidad de químicos directores activos sobre este microbio. Las mutantes resistentes pueden generarse y seleccionarse en contra del compuesto de interés usando una propuesta con base química. Para aislar el gen que confiere resistencia, una de las prácticas más comúnmente adoptadas ha sido el método de fraccionación en gel. Este método implica los siguientes pasos. (1) digestión de ADN genómico preparado a partir de cultivo de células mutantes de Synechocystis, (2 ) fraccionación de ADN digerido sobre gel de agarosa y purificación de ADN a partir de rebanadas de gel, (3) identificación de la fracción positiva a través de la primera vuelta de complementación funcional, (4) construcción de una biblioteca de genes, (5) preparación de ADN plásmido a partir de colonias sencillas, y (5) identificación del gen objetivo en la segunda vuelta de la complementación funcional. Éste es un proceso que consume mucho tiempo. Existe una posibilidad de que el fragmento que confiere resistencia pueda no ser del tamaño correcto para la prueba de complementación y/o para la subclonación subsecuente dentro del vector de biblioteca. En consecuencia, el fragmento de gen de interés puede no encontrarse nunca en la biblioteca de genes. En contraste, una modalidad preferida del programa de Alta Producción requiere la preparación de ~1800 pares de cebadores para la amplificación de 1800 fragmentos de 2-kb que se traslapan (el tamaño del fragmento, así el número total de cebadores, puede alterarse para amplificación con PCR fácil y manipulación HTP) para cubrir el genoma completo de Synechocystis (~3.6 Mb) . Implica la rápida amplificación de 1800 fragmentos usando el .ADN genómico de líneas de células mutantes de Synechocystis . Sería ideal un rango de tamaño de 1.5-3 kb, para la amplificación con PCR y la recombinación homologa en Synechocystis . Los productos de PCR que son demasiado pequeños comprometerían la eficiencia de la transformación en este microbio. Por otro lado, es más difícil amplificar fragmentos de genes más grandes usando PCR. Puede hacerse algún ajuste de ensayo y error como se necesite en un sistema de PCR particular de acuerdo a métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Este proceso puede ser adaptado a cualquier organismo (por ejemplo Levadura S. cerevisiae u otra cianobacteria) para los cuales se conoce la información completa de la secuencia del genoma y es factible la transformación a través de la recombinación homologa. Los productos de PCR pueden usarse después para la transformación HTP de Synechocysti s y la prueba de complementación funcional sobre diversas placas de selección, usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El o los genes que confieren resistencia a herbicidas pueden identificarse después con base en la capacidad de sus productos de PCR para conferir resistencia a herbicidas a células de tipo silvestre durante la transformación. Todo lo cual puede realizarse usando placas de microtítulo de 96 pozos, además, solamente se necesita una vuelta de transformación para identificar el gen que confiere resistencia. Se detallan posteriormente algunos pasos principales en este proceso: (1) Identificación de compuestos directores: Esto puede hacerse razonablemente en una forma de alta producción usando la prueba de disco de papel sobre placa de agar BG-11 sólido o placa de microtítulo de 96 pozos como se describió en la Sección A y el Ejemplos 3 y Ejemplo 4. (2) Generación y aislamiento de mutante o mutantes resistentes: El o los mutantes de Synechocystis resistentes al compuesto de interés pueden generarse químicamente tratando cultivos de Synechocystis con mutágenos químicos (por ejemplo EMS) . Los procedimientos para realizar tal experimento se proporciona en los Ejemplos 6 y 10. (3) Aislamiento de ADN genómico a partir de líneas de células resistentes: El ADN genómico puede prepararse a partir de cultivos de líneas de células resistentes de Synechocystis usando equipos comerciales (por ejemplo Qiagen DNAeasy Plant Kit) como se describió en la Sección B y Ejemplo 7. (4) Diseño de cebador y amplificación con PCR de fragmentos de genes a partir de Synechocystis: Pueden diseñarse pares cebadores para la amplificación de los fragmentos de ADN que se traslapan a partir de Synechocysti s con la asistencia de un paquete de software comercial (por ejemplo Vector NT1 de InforMax, North Bethesda, MD) . La síntesis a gran escala de los cebadores puede hacerse por un vendedor comercial (por ejemplo Sigma-Genosys, The Woodlands, TX) en formato de 96 pozos. La amplificación con PCR de ~1800 fragmentos de 2-kb ( de nuevo, el tamaño del fragmento, así el número total de cebadores puede alterarse para amplificación con PCR fácil y manipulación HTP) puede realizarse usando ADN genómico preparado a partir de cultivos de células mutantes como plantillas siguiendo procedimientos de laboratorio estándar (Ejemplo 9) . (5) Transformación genética de alta producción e identificación del sitio objetivo del gen: Los procedimientos para las pruebas de transformación genética HTP y la complementación funcional se han descrito en la Sección B y el Ejemplo 8. El o los genes que confieren resistencia al herbicida pueden identificarse después con base en la capacidad de sus productos de PCR para conferir resistencia al herbicida a células de tipo silvestre durante la transformación. Este programa ofrece la flexibilidad de trabajar con más de un compuesto activo a la vez. Esta flexibilidad ocurre debido a la facilidad con la cual uno puede sembrar con réplica células sobre placas que contienen diferentes compuestos de selección, en tiempo diferente durante la transformación con productos de PCR. En forma concebible, esto será un proceso de muy alta producción para la identificación rápida de sitios objetivo de genes, una vez que los compuestos activos se identifican.

D. Genes AHAS de Synechocystls Propiedades físicas de AHAS Las cianobacterias son una fuente particularmente útil de genes para mejorar el funcionamiento del cultivo debido a su similaridad, y conexión ancestral, con cloroplastos vegetales. En particular, los genes de cianobacterias pueden ser útiles para transformación directamente dentro del genoma del cloroplasto debido a similaridades en los elementos genéticos. Las similaridades en los genes de cianobacterias y proteínas con aquellas de los cloroplastos pueden conducir a una susceptibilidad compartida a los herbicidas. Se demostró que Synechocystis PCC 6803 es susceptible a diversos herbicidas conocidos como se muestra en la Tabla 2 como se describe en detalle posteriormente.

Tabla 2 En casos en donde las cianobacterias son susceptibles, son buenos organismos para uso en la selección de mutaciones que confieren resistencia debido a los métodos fácilmente disponibles para manipulación genética tales como transformación, selección de alta producción, selección basada en líquido o agar, sembrado con réplica, vectores lanzadera, un genoma pequeño, y en algunos casos uno completamente secuenciado. Las secuencias del gen mutado que se aislan después de la selección para resistencia pueden transformarse dentro del núcleo o plastóma de vegetales, o alternativamente, el equivalente funcional de las mutaciones identificadas puede insertarse dentro de los genes a partir de vegetales u otros organismos para uso en transformaciones . En algunos casos, las cianobacterias son insensibles a los herbicidas, debido potencialmente a diferencias en captación, metabolismo, o diferencias en la proteína objetivo. En consecuencia, los genes de cianobacterias pueden ser útiles para conferir resistencia a herbicidas a vegetales de interés.

Bioquímica de AHAS Los productos finales de la retroalimentación de la ruta biosintética de aminoácidos de cadena ramificada (isoleucina, leucina, y valina) inhiben la actividad de acetohidroxiácido sintasa (AHAS) . Solamente la subunidad grande tiene actividad catalítica. Se ha establecido en la literatura durante muchos años que las enzimas AHAS microbianas, in-vivo, existen como dos subunidades de proteína físicamente asociadas pero distintas. Los dos polipéptidos, una "subunidad grande" y una "subunidad pequeña" se expresan a partir de genes separados. A partir del estudio de las enzimas AHAS de sistemas microbianos, se han descrito dos papeles para la subunidad pequeña: 1) la subunidad pequeña está involucrada en la inhibición de la retroalimentación alostérica de la subunidad grande catalítica cuando está en la presencia de isoleucina, leucina o valina, y 2) la subunidad pequeña mejora la actividad de la subunidad grande en la ausencia de isoleucina, leucina o valina. Por ejemplo, la subunidad grande sola tiene un nivel basal de actividad que no puede inhibirse por retroalimentación con aminoácidos. Cuando se agrega a la subunidad pequeña, el nivel de actividad de la subunidad grande aumenta. Si la subunidad pequeña se incluye con isoleucina, leucina o valina, la actividad está por debajo del nivel basal con la subunidad grande sola. Puesto que se ha mostrado que la actividad de las subunidades grandes de .AHAS procarióticas es subóptima en la ausencia de las subunidades pequeñas, el nivel de actividad de la subunidad grande de AHAS de Synechocystis y su capacidad para conferir resistencia a herbicidas, puede ser subóptima sin la co-expresión de un gen de la subunidad pequeña. La secuencia del genoma completo de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803 se ha determinado y publicado. (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/fram ik?db=Genome&gi=112 o http: //www. kazusa. or. jp/cyano/kwd.html) . Cuando se publicó el genoma de Synechocystis PCC 6803, subsecuente a la clonación del gen de subunidad grande de AHAS original se hizo una búsqueda del genoma para otros genes de AHAS. La búsqueda encontró un gen adicional con un alto grado de homología a las secuencias de AHAS. Este gen en Synechocystis se designa slll981 y se anota como ilvB. Sin embargo, antes de la publicación de la secuencia ilvB, se clonó un fragmento de ácido nucleico del Gen de Subunidad Grande AHAS de Synechocystis clonado a partir de una biblioteca de ADN genómico de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803. Este gen original que se clonó se identifica como slr2088 y se anota como ilvG. Las pruebas de susceptibilidad muestran que la actividad de AHAS es resistente a imidazolinonas tales como imazetapir de PURSUIT® (BASF, anteriormente American Cyanamid Princeton, New Jersey) y sulfonilureas tales como metil sulfometuron de OUST® (DuPont, Wilmington, Delaware) .

Resistencia in vivo de cianobacterias a imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®. Como un asunto preliminar, se probaron Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120 por susceptibilidad al imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®. Los genes de AHAS que son resistentes a estos herbicidas son excelentes candidatos para transformación en plastomas vegetales y genomas nucleares. Tales transformantes pueden usarse en una estrategia de control de malezas usando una combinación de cultivo resistente a herbicidas transgénicos y herbicidas. La prueba in vivo de Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120 se hizo cultivando los organismos a diversas concentraciones de los herbicidas comerciales. Ambos organismos demostraron un alto grado de insensibilidad a los compuestos (Figura 6) . No se vio inhibición del crecimiento a concentraciones de 100 µM de imazetapir de PURSUIT® o 100 nM de metil sulfometuron de OUST® después de una semana de cultivo en un medio BG-11. Para propósitos de comparación relativa una concentración de 1 µM de imazetapir de PURSUIT® en un medio de agar es letal a vegetales de Arabidopsis .

Resistencia in vitro de la acetohidroxiácido sintasa de cianobacteria a imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST® AHAS es el sitio objetivo de los herbicidas imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUSTS. Para determinar si la resistencia a los herbicidas se debe a una resistencia natural a la inhibición de las enzimas acetohidroxiácido sintasa de las cianobacterias, o si se debe a mecanismos alternativos (por ejemplo, falta de entrada dentro de la célula) , se probó la actividad in vitro de la enzima AHAS en la presencia de los herbicidas. Las pruebas de AHAS se realizaron con ligeras modificaciones como se describe por Singh et al (Singh BK, Stidham MA Shaner DL, 1988, Assay of acetohydroxyacid synthase from plants. Anal Biochem 171: 173-179). Los resultados de las pruebas in vitro (Figura 7) demuestran que las enzimas AHAS de Synechocystis y Anabaena son insensibles a la inhibición por los herbicidas. La I50 de las enzimas AHAS vegetales está normalmente en el rango de 1-2 µM para imidazolinonas y 10 nM para sulfonilureas (Singh, B.K., Stidham, M.A., and Shaner, D.L., J. Chromatogr., 444, 251, 1988). No se observó inhibición significativa de las enzimas AHAS de cianobacterias a concentraciones de 100 µM de imazetapir de PURSUIT® y 100 nM de metil sulfometuron de OUST®. Los datos mostrados en la Figura 7 indicaron que la resistencia a los herbicidas que inhiben AHAS podría atribuirse a la resistencia natural de la enzima objetivo. Así, los genes de AHAS de cianobacterias serían buenos candidatos para transformación en vegetales por transformación nuclear o de plástido, para conferir resistencia a herbicidas. También, existe un nivel de resistencia cruzada presentada entre el imazetapir de PURSUIT® y las sulfanilcarboxamidas. Como se discute posteriormente, algunas líneas transformadas con las construcciones de plásmido pll6 (Figura 9) descritas en detalle posteriormente, cuando se rocían con 18g/ha de imazetapir de PURSUIT® mostraron aproximadamente un 20% de aumento en resistencia del vegetal en la presencia de imazetapir de PUR?UIT® y sulfanil carboxaminas en comparación con tabacos de tipo silvestre. Interesantemente, parece que la enzima AHAS de Synechocystis muestra un nivel de resistencia cruzada a imazetapir de PURSUIT® y sulfanil carboxamidas, aunque los herbicidas son bastante desiguales estructuralmente. Ejemplo 5: Resistencia in vitro de la acetohidroxiácido sintasa de cianobacterias a imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®. Se hicieron experimentos para determinar la resistencia in vitro de la acetohidroxiácido sintasa de cianobacterias a imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®. Se cultivaron Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120 en 1.5 L de medio BG-11. Las células se recolectaron por centrífuga y se almacenaron congeladas a -80°C. Las células congeladas se descongelaron y se colocaron en una cámara desorganizadora de células de 30 mL Bead Beater (BioSpec Corp Bartlesville, OK) . Se agregaron siete mL de arena lavada con ácido. La cámara se llenó con 2X de regulador de prueba de AHAS que consiste de lOOmM de HEPES pH 7.0, 200 mM de piruvato, 20 mM de MgCl2, 2 mM de TPP (pirofosfato de tiamina) y 100 µM de FAD (flavin adenin dinucleótido) . El desorganizador de células Bead Beater se empacó en hielo y se encendió durante 10 segundos, seguido por enfriamiento durante 3 minutos. Este ciclo se repitió cinco veces. El extracto se transfirió dentro de un tubo de centrífuga, y se agitó en un rotor Beckman SA20 (Beckman, Fullerton, California) durante 15 minutos a 17,000 rpm. Se decantó el sobrenadante y se usó para pruebas de AHAS. Las pruebas se realizaron con ligera modificación como se describe por Singh et al (Singh BK, Stidham MA Shaner DL, 1988, Assay of acetohydroxyacid synthase from plants. Biochem 171:173:179). La actividad de AHAS se probó en una concentración final de IX de regulador de AHAS, excepto que se usó HEPES en lugar del regulador de fosfatos que usó Singh. Todas las pruebas que contienen imazetapir de PURSUIT®, metil sulfometuron de OUST® o los controles asociados contenían una concentración final de 5% de DMSO (Dimetil Sulfóxido) debido a la adición de los herbicidas a las mezclas de prueba como un patrón de DMSO al 50%. Las pruebas se realizaron en un volumen final de 250uL a 37 °C en placas de microtítulo durante una hora.

Aislamiento del Gen de Subunidad Grande de AHAS de Synechocystis La secuencia de las regiones de codificación y flanqueo del gen AHAS de cianobacterias aislado de la presente invención, que confiere resistencia a imazetapir de PURSUIT® y metil sulfometuron de OUST®, se determinó. Se generó una sonda para identificar el gen de AHAS de Synechocystis por PCR con cebadores degenerados. Para desarrollar estos cebadores degenerados, se hicieron alineaciones de secuencias de .AHAS conocidas a partir de vegetales, bacterias y otras cianobacterias, tales como Spirulina platensis, (M75907.Gb_BA y M75906.Gb_BA, (GenBank, Centro Nacional para Información de Biotecnología) . Se encontró que las secuencias de aminoácidos predichas de la proteína AHAS compartían muchas regiones conservadas. Así se seleccionaron los cebadores en regiones en donde las secuencias de aminoácidos estaban altamente conservadas. Se usaron cebadores degenerados para permitir diferencias en el uso del codón de las cianobacterias. Uno de los pares cebadores, identificado como SEQ ID NO.: 4 y SEQ ID NO.: 5, respectivamente tuvo una secuencia de: (SEQ ID NO. 4) #21: 5'GG(AGCT)AC(ACCT)GA(TC)GC(GACT)TT(TC)CA(AG)GA 3' (SEQ ID NO. 5) #19: 5' (CT)T(CG)CCA(CT)TG(AGCT)C(TG) (AGCT)ACCAT 3' Se aisló el ADN genómico a partir de Synechocystis PCC 6803 (ATTC #27150) de acuerdo a Methods in Enzymology 167, p 703-712 y fue una plantilla para la amplificación por PCR de un fragmento de AHAS. El producto de PCR de 1 kb correspondió en tamaño al fragmento que estos cebadores producirían con base en la distancia entre las dos regiones conservadas de las cuales se diseñaron los cebadores. El fragmento se aisló y se clonó dentro del vector pCRII (Invitrogen) . El inserto se secuenció parcialmente y se encontró que la secuencia tiene fuerte homología con ambas de las secuencias de AHAS de Spirulina (aproximadamente 80% de similaridad y aproximadamente 70% de identidad a nivel de aminoácido entre la secuencia de Synechocystis y la secuencia del M75907.Gb_BA y la secuencia de Synechocystis y la secuencia de M75906.Gb_BA Spirulina) Ejemplo 6: Aislamiento del Gen AHAS Grande de Synechocystis Se generó una sonda para identificar el gen AHAS de Synechocystis por PCR con cebadores degenerados. Se aisló el ADN genómico a partir de Synechocystis PCC 6803 de acuerdo con el método desplegado en Methods in Enzymology 167, p/ 703-712. Se realizó PCR con ADN polimerasa (Perkin Elmer AmpliTaq, Perkin Elmer, Shelton, Connecticut) usando este ADN genómico como la plantilla y una serie de cebadores degenerados que se diseñaron a partir de las regiones conservadas observadas en la alineación de las secuencias del gen de AHAS en Genbank. (www2.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/query_form.html). Una de las combinaciones cebadoras, identificada como Secuencia de IDENT No .4 y Secuencia de IDENT . No 5. , respectivamente : #21: 5'GG(AGCT)AC(AGCT)GA(TC)GC(GACT)TT(TC)CA(AG)GA 3' #19: 5' (CT)T(CG)CCA(CT)TG(AGCT)C(TG) (AGCT)ACCAT 3' produjo un producto de PCR de 1.1 kb que correspondió en tamaño con el fragmento que estos fragmentos producirían, basado en las secuencias de los dos genes de .AHAS a partir de la platensis de Spirulina de cianobacteria. El fragmento se aisló y se clonó en un vector pCRII (Invitrogen) . El inserto se amplificó y se secuenció parcialmente, y se encontró que tiene fuerte homología con ambas secuencias de .AHAS de Spirulina, aproximadamente 80% de similaridad, 70% de identidad a nivel de aminoácido.

Selección de Biblioteca Se seleccionó una biblioteca genómica a partir de Synechocystis PCC 6803 en el vector Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, California) para el gen AHAS. Para obtener la sonda para seleccionar la Biblioteca genómica de Synechocystis, el plásmido aislado en el procedimiento anterior se digirió con Eco Rl (Promega) y el fragmento de 1.1 kb resultante se aisló en gel y se purificó (GeneClean, Bio 101, Qbiogene, Carlsbad, California) .

Este material (25-50 ng) se marcó con 32p siguiendo el Protocolo Estándar del Equipo de Oligomarcado (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Así marcado, el fragmento de 1.1 kb se usó como una sonda para seleccionar el gen AHAS en la biblioteca genómica del vector Lambda Zap. La Biblioteca Genómica Synechocystis PCC 6803 se sembró en tres placas (medio NZCYM) (Sambrook, Fritsch, Maniatis "Molecular Cloning- A Laboratory Manual 2nd Ed" 1989) a un título de 5 x 10J pfu/placa. Se levantaron filtros por duplicado (BA-S NC, Scleicher & Schuell) de cada una de las placas. Los filtros se incubaron sobre 15 cm 0.5N NaOH/1.5 M NaCl durante 90 segundos, 0.5M de Tris8/1.5 M de NaCl durante 5 minutos, y después 2 x de SCC (Cloruro de sodio, Citrato de sodio, pH 7.0) (Sambrook, Fritsch, Maniatis Molecular Cloning- A Laboratory Manual 2nd Ed. 1989) durante 5 minutos. Los filtros se secaron después con aire y se hornearon en un horno al vacío 80°C durante 2 horas. Posteriormente, los filtros se prehibridizaron en 50 ml de solución prehyb (50% de formamida desionizada 5 x de SCC, 2 x de solución de Denhardt (Sambrook, Fritsch, Maniatis Molecular Cloning- A Laboratory Manual 2nd Ed. 1989), 0.1% de SDS y 100 ug/ml de ADN de testículos de salmón) durante 2 horas a 32°C. Los filtros se hibridizaron después durante la noche en un baño de agua con agitación a 42°C con la sonda marcada. Los filtros se lavaron con 2 x de SSC/0.2% de SDS a 65°C hasta que se determinó que existía mínima radioactividad pasando en la solución de lavado. Los filtros se secaron después al aire y se expusieron a película de rayos X (Kodak XAR) (Kodak, Rochester, New York) con pantallas que intensifican la imagen a -80°C durante la noche. Se tomó un total de 38 placas positivas de duplicación y se eluyeron en 1 ml de Regulador SM (0.1 M de NaCL, 0.008M de MgSO,, 7H20, 0.05M de Tris-HCl [ph 7.5], 0.01 de gelatina.) Quince de las positivas se sembraron después (0.5 ml de una dilución 10"1), y se usaron para una segunda vuelta de selección, usando el mismo protocolo de hibridización/lavado que anteriormente. Se levantó una placa hibridizante bien aislada sencilla de cada una de las 15 positivas y se eluyó en 1 ml de solución SM. Los fagos se rescataron en pBluescript (Lambda Zap II) usando ExAssist/SOLR System (Stratagene) . Se obtuvieron colonias resistentes a ampicilina de diez de los quince que se levantaron positivas de la segunda vuelta. El proceso de subclonación fue como sigue. El ADN fagémido obtenido para el proceso de selección de biblioteca se marcó pSyn23/l. pSyn23/l se digirió dos veces con las enzimas de restricción Eco Rl y Cía I (Todas ' las enzimas cebadoras de restricción están disponibles a partir de Promega, Madison, Wisconsin) para producir un fragmento de 3 kb. El fragmento aislado se ligó en pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) y se transformó en DH5alpha, (Stratagene) dando pSyn23/l-I. Este clon .AHAS se secuenció usando el Sistema de Secuenciación de ADN (Promega, Madison, Wisconsin) y un conjunto de ocho cebadores específicos de gen más el cebador de secuenciación T3 ubicado en el vector pBluescript II. Se identificó una estructura de lectura abierta de 625 aminoácidos. La secuencia resultante de la subunidad grande ilvG, identificada como SEQ ID NO.: 6, tuvo una secuencia como sigue: Acetohidroxi Ácido Sintasa (gene ±lvG de ORF) > Cepa PCC6803 de Synechocystis sp. GCCATAGGAGCCCATCGCCGATTGAGTTCAAATTAGAAGCACTTAGCCTACGCTT CCTAAACCGATTGTCCAGTGGTTGCATCAATTCCTAATCCCAAAACAAATTTCCT GAAAACTGTTCCTAGCCAACGGCAAACCGGGGCTTATATCCTGATGGATAGCCTG AAACGCCATGGGGTCAAACACATTTTTGGCTATCCCGGCGGGGCAATTTTGCCCA TCTATGATGAACTGTACCGCTTTGAAGCGGCGGGGGAAATTGAGCATATTTTGGT GCGCCATGAACAAGGAGCTTCCCATGCGGCGGATGGGTATGCCAGAGCCACAGG TAAAGTGGGAGTTTGTTTCGGTACATCTGGACCAGGGGCGACTAACTTGGTGACC GGCATTGCCAATGCCCATTTGGACTCGGTGCCCATGGTGGTGATTACTGGAGAGG TGGGCCGTGCCATGATTGGTAGCGATGCTTTCCAGGAAATTGACATTTTTGGCAT CACCTTACCGATCGTTAAGCACTCCTATGTGGTACGTAGTGCGGCGGATATGGCT CGCATTGTTACTGAGGCTTTCCATCTTGCTAGCACCGGTCGTCCCGGGCCGGTTTT GATCGATATTCCCAAGGATGTGGGCTTAGAAGAATGTGAGTACATTCCCCTCGAC CCCGGTGACGTTAATCTACCGGGTTATCGCCCCACGGTTAAAGGTAATCCCCGAC AAATTAATGCGGCATTGCAATTGTTGGAGCAGGCCAGAAATCCCTTGCTCTACGT AGGGGGAGGGGCGATCGCCGCCAATGCCCATGCCCAGGTGCAGGAATTTGCGGA AAGGTTCCAGTTGCCGGTAACAACCACCCTGATGGGAATTGGGGCTTTTGACGAA AACCATCCCCTTTCGGTGGGTATGTTGGGTATGCATGGCCACCGCTATGCCAACT TTGCCGTCAGCGAATGTGATTTGTTGATTGCAGTGGGGGCCCGTTTCGACGACCG GGTAACTGGCAAACTAGACGAATTTGCTAGCCGCGCCAAAGTAATTCACATTGAC ATCGACCCGGCGGAGGTGGGAAAAAACAGGGCTCCCGATGTGCCCATTGTGGGG GATGTACGCCATGTTTTAGAACAGCTTTTGCAGCGGGCCCGGGAATTGGATTACC CCACCCATCCCCATACCACCCAGGCATGGTTAAATCGCATTGATCATTGGCGGAC CGATTACCCCCTCCAGGTGCCCCACTATGAGGATACTATTGCCCCCCAGGAGGTA GTACACGAAATTGGTCGCCAGGCCCCCGATGCCTACTACACCACCGATGTGGGAC AACACCAAATGTGGGCGGCCCAGTTTTTGAACAATGGCCCCCGCCGATGGATTTC CAGTGCTGGCTTGGGTACGATGGGCTTTGGTTTACCTGCCGCCATGGGAGCCAAA GTGGGAGTGGGGGACGAGCGGTCATTTGCATCAGTGGAGATGCCAGCTTCCAAA TGAATCTTCAGGAACTGGGAACCCTAGCCCAGTACGACATCCAGGTTAAAACTAT TATTCTCAATAACGGTTGGCAGGGGATGGTGCGTCAGTGGCAACAAACTTTCTAC GAAGAACGTTATTCTGCTTCTAACATGTCCCAGGGCATGCCAGACATTAATCTCC TCTGTGAAGCCTATGGCATCAAGGGTATTACTGTGCGCAAGCGGGAAGATTTGGC CCCGGCGATCGCCGAAATGCTAGCCCACAATGGTCCTGTGGTGATGGATGTGGTG GTCAAAAAAGATGAAAACTGTTACCCTATGATTGCCCCCGGCATGAGTAATGCCC AAATGCTAGGTTTACCGGAAGTGCCGGTACNGGACAATGGTCCCCGGATGGTGG AGTGCAACCATTGCCAAACCCAAAATTTCATCACCCATCGTTTCTGTTCTGGTTGT GGAGCCAAACTCTAACCCATAAGCCAAAATTGAATTC La secuencia de aminoácidos predicha de la estructura de lectura abierta tenía 49% de identidad con el gen de AHAS de E. coli ilvG, 47% de identidad con el gen als2 de maíz, 46% de identidad con el gen de .AHAS de Arabidopsis, y 65% de identidad con la secuencia del gen de AHAS de la cianobacteria Spirulina pla tensis . El alto grado de identidad de secuencia y la demostración funcional del fragmento de gen de cianobacteria para complementar las mutantes de E. coli deficientes en AHAS sugiere fuertemente que el fragmento representa un gen de subunidad grande de AHAS de cianobacteria de longitud completa. Para confirmar que estos plásmidos llevan secuencias AHAS funcionales, el ADN plásmido de cada una de las diez colonias rescatadas se transformó dentro de la cepa de E. coli M 1262. (leuB6, ilvl614, ilvH612, ? -, relAl, spoTl, ilvB619, ilvG603, ilvG605 (am) , thi-1) (Genetics Stock Center, Yale University) . Esta cepa de E. coli carece de AHAS. Se encontró que tres de los plásmidos permiten el crecimiento sobre placas M9 (+Leu) , indicando así que estos plásmidos llevaron copias de AHAS funcionales. E. coli M 1262 que expresa el gen ahas de cianobacteria fue capaz de crecer en un medio mínimo en la presencia de los herbicidas metil sulfometuron OUST® y imazetapir de PURSUIT®. El gen ahas puede por lo tanto usarse para lograr tolerancia a herbicidas en cultivos por transformación dentro del genoma nuclear o plastídico.

Ejemplo 7: Clonando y Secuenciando el Gen AHAS de Synechocystis Grande El ADN fagémido de una de las líneas pSyn23/l complementarias se digirió dos veces con las enzimas de restricción Eco Rl y Cía I (Promega) para producir un fragmento de 3 kb. El Eco Rl y Cía I se cortaron del fagémido pBluescript conforme el fragmento aislado The se ligó dentro de pBluescript y se transformó en DH5alfa (Stratagene), creando pSyn23/l_I. El clon AHAS resultante se secuenció usando el Sistema de Secuenciación de ADN (Promega) y un conjunto de ocho cebadores de secuenciación específicos de gen: SYN1: 5' ATT GAC ATT TTT GGC ATC 3', identificado como la SEQ ID NO. : 7 SYN2: 5' TAT CCG CCG CAC TAC GTA C 3', identificado como la SEQ ID NO. : 8 SYN3: 5' CAG GGG CGA CTA ACT TGG TGA C 3', identificado como la SEQ ID NO. : 9 SYN4: 5' ACC GCT ATG CCA ACT TTG CCG T 3, identificado como la SEQ ID NO.: 10 SYN5: 5' GGA GGA TAG TAC ACG AAA TTG G 3', identificado como la SEQ ID NO.: 11 SYN6: 5' AAA TCT TCC CGC TTG CGC ACÁ G 3', identificado como la SEQ ID NO. : 12 SYN7: 5' CCA ATT TCG TGT ACT ACC TCC TG 3 ' , identificado como la SEQ ID NO. : 13 SYN8: 5' AAA GTG GGA GTG GGG GAC GAA 3', identificado como la SEQ ID NO.: 14 Adicionalmente, se agregó un cebador de secuenciación T3 ubicado en el vector pBluescript II. Se identificó una estructura de lectura abierta (ORF) de 635 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos predicha de la estructura de lectura abierta tuvo 49% de identidad con el gen AHAS de E. coli ilvg, 47% de identidad con el gen als2 de maíz, 46% de identidad con el gen AHAS de Arabidopsis, y 65% de identidad con la secuencia del gen AHAS de la cianobacteria S. plantensis .

Clonación de la subunidad pequeña de AHAS a partir de Synechocystis En otra modalidad de la presente invención, se clonó también un fragmento de ácido nucleico de subunidad pequeña de AHAS de Synechocystis a partir de una biblioteca de ADN genómico de la cianobacteria Synechocystis PCC 6803. Las búsquedas de la base de datos de la secuencia genómica completa de Synechocystis reveló tres diferentes genes que codifican las ORF de acetolactato sintasa, ilvG, ilvB, y ilvN. Comparaciones de similaridad de secuencia adicionales sugirieron que es probable que il vN codifique la subunidad pequeña de AHAS de Synechocystis. Para clonar ilvN a partir de Synechocystis, se adoptó una propuesta basada en PCR. Con base en los datos de secuencia, se diseñó un par de cebadores con las siguientes secuencias, cebador #1 (cebador hacia delante): 5'-cggtggaattttaccccaatgg-3' , identificado como SEQ ID NO. : 15 y cebador #2 (cebador inverso): 5'-ggccctaaaacttggattccagg-3' , identificado como SEQ ID NO.: 16 y estos cebadores se usaron para amplificar por PCR la ORF correspondiente (ilvN) a partir de ADN genómico preparado a partir de los cultivos de células de tipo silvestre de Synechocystis . El análisis en gel de agarosa de los productos PCR produjo una banda con el tamaño esperado (573 pb) . Los productos de PCR han sido subsecuentemente subclonados dentro del vector Invitrogen TOPO pCR2.1 TA. El gen se secuenció usando los mismos procedimientos que anteriormente. La cepa PCC6803 de Synechocystis sp. resultante reveló la secuencia, identificada como, SEQ ID NO: 17 GTGGAATTTTACCCCAATGGCCACCGGCGATCGCCTTCTTTGCCCCCCATGAAAC ACACCCTCTCTGTTTTAGTTGAAGATGAAGCCGGAGTGCTAACCCGCATTGCCGG ACTATTTGCCCGCCGTGGTTTTAACATTGAGAGCTTGGCGGTGGGGTCGGCGGAA CAGGGGGACGTTTCCCGCATCACCATGGTGGTGCCGGGGGATGAGAACACCATC GAACAACTGACCAAGCAACTCTACAAGTTGGTTAACGTAATTAAAGTACAGGAC ATCACCGAAACTCCCTGTGTGGAAAGGGAATTGATGCTGGTGAAGGTGAGCGCC AATGCCCCTAACCGAGCGGAAGTGATTGAGCTAGCCCAGGTATTCCGGGCCCGC ATTGTGGATATCTCCGAAGACACCGTCACCATCGAATGGTGGGGGACCCGGGTA AAATGGTAGCAATCCTCCAGATGTTGGCCAAGTTGGCATTAAAGAGGTGGCTCGA ACGGGCAAAATTGCTTTGGTGCGGGAATCCGGCGTCAATACGGAATATCTGAAAT CCCTGGAATCCAAGTTTTAG Construcción de un vector de transformación vegetal nuclear La transformación de los genes AHAS dentro del genoma nuclear requirió un vector de transformación vegetal nuclear. Puesto que la biosíntesis de aminoácidos de cadenas ramificadas se localiza en el cloroplasto en vegetales superiores, para la expresión funcional de AHAS en vegetales superiores, el gen de subunidad grande de AHAS de Synechocystis procariótico necesitaría expresarse de un promotor expresable en vegetal y la proteína necesitaría seleccionarse dentro del cloroplasto. Por lo tanto, un péptido director habrá de fusionarse sobre la AHAS de Synechocystis para que sea funcional en el genoma nuclear. Cuando el gen se importa dentro del cloroplasto, el péptido director queda sujetado. El resultado final sería el gen de AHAS de Synechocystis dentro del cloroplasto menos la secuencia de tránsito. Debido a que la AHAS de Synechocystis carece de la secuencia de proteína directora o de tránsito requerida para estar activa en el genoma nuclear y transportada dentro del cloroplasto, la secuencia promotora y de tránsito de otro organismo se fusionó con el gen AHAS de Synechocystis . La secuencia promotora y de tránsito a partir de la subunidad grande de AHAS de Arabidopsis se seleccionó para fusionarse al gen de la subunidad grande de AHAS de Synechocystis, puesto que existía un grado extenso de homología. El genoma de Arabidopsis se ha secuenciado y la información física y de secuencia para la subunidad grande de AHAS pueden encontrarse en http: //www. arabidopsis.org/serylets/mapper?value=CSRl&act ion=search. Un experto en la técnica podría usar la información en esta base de datos para realizar la clonación como sigue. El resultado final contendría la secuencia promotora y de tránsito del gen AHAS de Arabisopsis, seguida por el gen de Synechocystis, seguido por el terminador de Aribidopsis. La fuente de la secuencia promotora y de tránsito fue la construcción pAC793, (que consistió de un vector y un inserto con un fragmento genómico que contiene el promotor de AHAS de Arabidopsis, la secuencia de tránsito, la región de codificación, y el terminador) . Se hizo una alineación de las subunidades grandes de AHAS de Synechocystis y Arabidopsi s usando el programa Gap a partir de Genetic Computer Group Inc. (GCG, Inc., Madison, Wisconsin) Se seleccionó una región de homología cerca de N-terminal del gen de AHAS de Synechocystis y más allá de un sitio de procesamiento de secuencia de tránsito putativa sobre el gen de AHAS de Arabidopsi s para hacer una fusión entre la secuencia de tránsito de Arabidopsis y AHAS de Synechocystis . Se usó un sitio de restricción Eco RV común en el gen de AHAS de Arabidopsis y Synechocystis que estaba dentro de una región conservada de las proteínas como el sitio de fusión. Un sitio de restricción Age I ocurre naturalmente en el gen de Arabidopsis. El sitio se encontró que está más allá del sitio de procesamiento y justo más allá del codón de alto del gen de AHAS de Arabidopsis. Así, se seleccionó para crear una fusión entre el extremo de C-terminal del gen de AHAS de Synechocystis y la secuencia de terminación de AHAS de Arabidopsis por inserción de un sitio Age I en el gen de Synechocystis en una región homologa con el gen de Arabidopsis. Se diseñaron cebadores de PCR para insertar un sitio de restricción Age I (cebador SYNAGE) sobre el extremo 3-prima del gen de AHAS de Synechocystis . pAC793, una construcción clonada a partir de Arabidopsis abd contiene AHAS genómico en un vector pGEM (Promega) , se cortó con Eco RV y Age I para eliminar la mayoría de la secuencia de codificación del gen AHAS de Arabidopsis a partir del vector. La construcción pSyn 23/l_I que contiene un fragmento genómico subclonado a partir de Synechocystis (un subclón Eco Rl - Cía I del plásmido pSyn 23/1. pSyn23/l fue el plásmido resultante de la selección de la biblioteca genómica de Synechocystis, primer párrafo de esta sección. PSyn 23/1-1 se creó digiriendo pSyn 23/1 con Eco Rl y Cía I y purificando el fragmento resultante. El fragmento se ligó después en pBluescript II que había sido previamente cortado con Eco Rl y Cía I) que contenía el gen de AHAS completo se cortó con Neo I y Age I para confirmar que se obtuvo el fragmento correcto. Usando el vector pSYN 23/l_I como una plantilla se llevó a cabo una reacción de PCR con los cebadores. La reacción dio un fragmento de PCR de 1.9 kb esperado cuando se corrió sobre un gel de TAE agarosa al 0.8%. El fragmento se clonó dentro del vector de clonación TA (equipo de clonación TA, Invitrogen) usando una ampolleta de ligadura lista para usarse (Pharmacia) . Los productos de ligadura se transformaron dentro de células competentes a partir del equipo de clonación TA (Invitrogen) . Se transfirió suavemente un medio SOC a las células (Qbiogene, Carlsbad, California) se transfirieron después suavemente a un tubo de cultivo estéril y se incubaron. Las células se sembraron después en un medio azul-blanco y se incubaron durante la noche a 37 °C. El día siguiente se seleccionaron colonias blancas. Se hicieron minipreparaciones de plásmido a partir de cultivos de colonias blancas seleccionadas. La digestión de restricción de los plásmidos generó los fragmentos esperados sobre geles de agarosa. La construcción que contiene la fusión de la secuencia promotora y de tránsito de la subunidad grande .AHAS de Arabidopsis, la región que codifica la subunidad grande de AHAS de Synechocystis, y la secuencia de terminación de la subunidad grande de AHAS de Arabidopsis en el vector pGEM del vector pAC793, se marcó pGEKI . Esta construcción podría usarse después para la transformación de genoma nuclear en donde el gen de AHAS de Synechocystis debe transportarse a partir del genoma dentro del cloroplasto.

Ejemplo 8: Creación de un Vector de Transformación Vegetal Nuclear Se construyó un vector de transformación vegetal nuclear como sigue. Se diseñaron cebadores PCR para insertar sitios de restricción de Eco RV (cebador SYNR5) y Age I (cebador SYNAGE) sobre los extremos 5-prima y 3-prima, respectivamente, del gen .AHAS de Synechocystis . Se identificaron como Secuencia de IDENT. No. 18 (SYNR5) y Secuencia de IDENT. No. 19 (SYNAGE). PAC793 se cortó con Eco RV (justo más allá de la secuencia de tránsito) y Age I (justo más allá del codón de alto) para eliminar la mayoría de la secuencia de codificación del gen AHAS de Arabidopsis . El fragmento de 7 kb restante que contiene el vector pGEM, el promotor AHAS de Arabidopsis, la secuencia de tránsito y la secuencia de terminación se eliminaron de un gel de agarosa y se trataron con lavados de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico. El fragmento se cortó de nuevo con Eco RV y Age I para asegurar que las digestiones de restricción estaban completas. Se obtuvo la construcción pSyn 23/l_I que contenía un fragmento genómico subclonado a partir de Synechocystis (un subclón Eco Rl - Cía I a partir del plásmido pSyn 23/1) que a su vez contenía el gen .AHAS completo cortado con Neo I y Age I para confirmar que se obtuvo el fragmento correcto. Los cebadores PCR se diseñaron para insertar un sitio de restricción Age I (cebador SYNAGE) sobre el extremo 3-prima- del gen AHAS de Synechocystis. Se diseñó un cebador 5-prima para amplificar el gen hacia el extremo 5 prima del sitio Eco RV.

SYNR5: 5' -GGC TGA TAT CCT GAT GGA TAG CCT G-3', identificado como Secuencia de IDENT. No. 18 SYNAGE: 5' -TTG GCT TAC CGG TTA GAG TTT GGC TCC ACA-3', identificado como Secuencia de IDENT. No. 19. Usando el vector pSYN 23/l_I como una plantilla, se llevó a cabo una reacción PCR con los cebadores. Las reacciones (35 ciclos de 94 °C de fusión, 55°C de templado y 72°C de elongación de polimerasa (Perkin Elmer Thermocycler) dio un fragmento PCR de 1.9 kb esperado cuando se corrió sobre un gel de azarosa al 0.8% de TAE. Se diluyeron 8X dos uL de la reacción PCR. El vector de clonación TA (equipo de clonación TA, Invitrogen) se resuspendió en 8.8 ul de TE. (Tris/EDTA. Sambrook, Fritsch, Maniatis Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd Ed. 1989) . Dos uL del vector de clonación TA se agregaron a una ampolleta de ligadura (Lista para usarse, Pharmacia) . Adicionalmente, un uL del fragmento amplificado PCR 8X diluido se agregó a la solución. Se agregó agua estéril para llevar el volumen a 20 uL. Sin mezclar, la ampolleta se mantuvo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de 5 minutos, la solución se mezcló suavemente succionando la solución dentro y fuera de una punta de pipeta. La muestra se agitó brevemente para llevar la solución al fondo del tubo. La ampolleta se colocó en un baño de agua a 16°C durante 45 minutos. Se agregaron dos uL de Beta-mercaptoetanol a cada ampolleta de células competentes proporcionadas en 5 el equipo de clonación Ta de Invitrogen (Invitrogen) . Después de 45 minutos en la reacción de ligadura, las ampolletas se colocaron en hielo durante 3 minutos. Dos uL de la mezcla de ligadura se agregaron a las células competentes. Las ampolletas se incubaron después 10 sobre hielo durante 30 minutos más, seguido por 60 segundos de choque de calor a 42 °C. Las ampolletas se ( colocaron de nuevo sobre hielo durante 3 minutos. Las células se transfirieron suavemente a 450 µL de medio SOC a temperatura ambiente (Qbiogene, 15 Carlsbad, California) después se transfirieron suavemente a un tubo de cultivo estéril y se incubaron con una hora de agitación a 225 RPM a 37 °C. Las células se sembraron después en placas LB/amp/X-gal (Sigma) (Sambrook, Fritsch, Maniatis Molecular Cloning - A Laboratory Manual 20 2nd Ed. 1989) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al siguiente día se seleccionaron las colonias blancas. Se hicieron minipreparaciones de plásmido a partir de cultivos de colonias blancas seleccionadas. La digestión de restricción de los plásmidos generó los 25 fragmentos esperados sobre geles de agarosa.

La construcción que contiene la fusión de la secuencia de terminación de subunidad grande AHAS de Arabidopsis en el vector pGEM se marcó pGEKI .

Transformación Nuclear de Genes de Cianobacteria en Vegetales Construcción del vector Agrobacteri um Se transformaron plantas de tabaco con el gen fusionado AHAS de Arabidopsis/Synechocystis. El vector pGEKI se cortó con Kpn I y Sal I para eliminar el gen fusionado AHAS completo del vector PGEM y se ligó dentro de un vector de Agrobacterium pBIN19 (Stratagene) que se cortó previamente con las mismas enzimas. El análisis de restricción indicó que el gen de fusión de pGEKI se movió exitosamente dentro del vector de transformación vegetal. Se seleccionaron plantas sobre 100 mg/L de canamicina. El cultivo de tabaco, Wisconsin-38 (North California State University, US Tobacco Germplasm Collection) se cultivó asépticamente sobre un medio MSh" (Sigma) que contiene sacarosa (20g/L) en frascos de vidrio (1 cuarto) . Se transfirieron segmentos de tallo de plantas de 8-10 semanas a nuevos frascos para propagación de hojas. Se extrajo ADN total de las líneas de tabaco usando el equipo Qiagen DNeasy Miniprep. (Qiagen, Inc., Valencia, California) .

Las pruebas mostraron que los transformantes tenían poca resistencia a los herbicidas de imidazolinona. Esto puede haberse debido a varias razones. Una razón puede ser que la subunidad grande de AHAS de Synechocystis no se acompañó por una subunidad pequeña de AHAS. Se ha mostrado que los genes AHAS de microbio están comprendidos de una subunidad grande y pequeña. La subunidad grande de AHAS a partir de E. coli no tiene actividad óptima en la ausencia de la subunidad pequeña correspondiente. Puesto que Synechocystis, igual a E. coli, es un organismo procariótico que puede compartir el mismo requerimiento. La ausencia de la subunidad pequeña puede haber disminuido la actividad de la enzima y la capacidad para conferir resistencia a imidazolinona. Otra razón potencial para la falta de resistencia puede haber sido la selección de la posición de la unión de fusión entre la secuencia de tránsito AHAS de Arabidopsis y la subunidad grande de Synechocystis . Una impropia unión de fusión puede haber producido una proteína que no podría localizarse en el cloroplasto o producir una proteína no funcional.

Transformación de Plástido Se cree que los cloroplastos de los vegetales superiores se derivaron a partir de cianobacterias. La relación ancestral entre los cloroplastos y las cianobacterias sugiere que los genes, elementos de genes, proteínas y muchas otras características de los organismos son similares y potencialmente de función cruzada. Los genes y elementos de genes de las cianobacterias pueden por lo tanto ser funcionales cuando se transforman dentro de genomas de plástido. Además, la expresión de proteínas a partir de genomas plastídicos obvia la necesidad de secuencias de tránsito para circular la proteína a la ubicación apropiada. Por lo tanto, el uso de genes de cianobacteria, o genes mutantes aislados a partir de cepas resistentes, para lograr la resistencia a herbicidas puede obtenerse por transformación dentro del plastoma. Los transgenes a partir de fuentes alternativas conferirán características diferentes de los rasgos expresados. Pueden usarse elementos reguladores de los genes de cianobacteria para control de expresión en plástido. Si un transgen se ubica en el plastoma de un cultivo, se previene su transferencia a especies relacionadas (malezas y/o cultivos) por medio de polinización. El transgen se expresará a partir de un número alto de copias por célula sugiriendo muy altos niveles de expresión. Además, la ubicación del transgen en el plastoma obvia el transporte de productos de gen dentro de los plástidos y los genes de cianobacteria pueden usarse sin modificación de la región de codificación. Así, en modalidades preferidas esta invención proporciona cianobacterias como una fuente alternativa de genes para transformaciones vegetales, en particular genes que codifican proteínas insensibles a herbicidas, y elementos de genes para control de expresión en plástidos. Además, puesto que los fragmentos de ADN secuenciados contienen elementos reguladores procarióticos, las cianobacterias pueden usarse directamente para transformaciones seleccionadas en plastoma. Específicamente, el gen de la subunidad grande de AHAS de Synechocystis se usó para transformación dentro de cloroplastos vegetales para conferir resistencia a herbicidas.

Transformación Plastídica de Genes de Cianobacteria en Cloroplastos Vegetales. Los genes se construyeron dentro de vectores para permitir la incorporación dentro y la expresión en los cloroplastos. Los siguientes vectores se construyeron para transformación dentro de genomas de plástido. pACBC 111 y pACBC 112 son construcciones relacionadas que difieren solamente en la orientación del cassette de expresión de AHA de Synechocystis . Estos vectores se construyeron como se muestra en las Figuras 11 y 12. Las secuencias aadA y el cassette de expresión pl6S se derivan a partir de las secuencias descritas en la Patente Norteamericana No. 5,877,402 (Maliga et al.). La descripción de esta patente se incorpora para referencia en la presente en su totalidad. pACBC 111 es el mismo vector que pl2 delta NI. pACBC112 es el mismo vector que pl2 delta NII. pll6 I (Figura 13) es el mismo que pACBC222 y pll6 II (Figura 14) es el mismo que pACBC223. pACBClll (o pl2 delta NI) y pACBC112 (o pl2 delta NII) son construcciones en donde el gen AHAS de Synechocystis y el gen aadA se expresan a partir de promotores individuales (Figuras 11 y 12) . Los pll6 I y pll6 II son construcciones discistrónicas, un promotor que expresa un operon con dos genes (Syn AHAS y aadA) difieren uno de otro solamente en la orientación del cassette de expresión de AHAS de Synechocystis (Figura 15) . Los vectores 222 y 223 y los vectores 111 y 112 difieren en que las construcciones p222/223 se diseñan para expresar un mensaje dicistrónico mientras que las construcciones plll/112 expresarán el gen a partir de un inserto monocistrónico .

Transformación y regeneración de vegetales transplastómicos Se usaron los plásmidos pACBC222, pACBClll pACBC112 para transformaciones de plástidos. Las hojas se cortaron y se colocaron con el lado abaxial abajo sobre el medio de regeneración (medio Msh" suplementado con zeatin (2mg/L) , ácido 1-naftalenacético (O.lmg/L), y sacarosa (20g/L) . Se llevaron a cabo bombardeos usando la pistola DuPont PDS lOOOHe Biolistic. (DuPont, Wilmington, Delaware) . Se usaron discos de ruptura (900psi) (BioRad, Hercules, California) , y los niveles de presión de helio y de vacío fueron llOOpsi y 27" de Hg, respectivamente. Dos días después del bombardeo, se cortaron las hojas en pedazos de 1 cm2 y se colocaron sobre estreptomicina (500 mg/L) . Los segmentos de hoja de regeneración y agrandado se pasaron por hasta 4 vueltas sobre el medio de selección. Los regenerados de la cuarta vuelta se transfirieron a cajas Magenta (Sigma, St., Louis, MO) hasta que se presentaron suficientes raíces para garantizar el transplante al invernadero.

Ejemplo 9: Transformación de Plástido Se usaron los plásmidos pll6, pl2delta NI y pl2delta NII para transformaciones de plástido en la transformación y regeneración de vegetales transplastómicos. Las hojas se cortaron y se colocaron con el lado abaxial sembrado en un medio de regeneración (un medio Msh suplementado con zeatin (2mg/L) (Sigma) , ácido 1-naftalenacético (O.lmg/L), y sacarosa (20g/L) . Se preparó oro para la transformación pesando 5mg de oro (0.6um) en tubo Treff (Treff AG, Degersheim, Switzerland) y se lavó una vez con ETOH (100%) y agua bidestilada estéril. El oro se granuló y se resuspendió en 230 uL de agua y se mezcló con 20ug de ADN (pll6, pl2delta NI, o pl2delta NII), 250uL de CaCl2(2.5M), y 50uL de espermidina (Sigma) (O.lM base libre). La mezcla de oro/ADN se incuba después sobre hielo durante 10 minutos y se centrifuga. Se realizaron dos lavados con ETOH (100%), y el oro/ADN se suspendió en 72uL de ETOH (100%). La suspensión de oro (5.4ul) se aplicó a cada macroportador (BioRad) . Los macroportadores se colocaron después en un desecador durante al menos un minuto. Se llevaron a cabo bombardeos usando la pistola DuPont PDS lOOOHe Biolistic. Se usaron discos de ruptura (900psi) , y los niveles de presión de helio y vacío fueron llOOpsi y 27" de Hg, respectivamente. Dos días después, las hojas se cortaron en pedazos de 1 cm2 y se colocaron sobre medios de regeneración selectivo que contiene espectinomicina (500 mg/L) . Se tomaron segmentos de hoja de los regenerados de primera vuelta y se colocaron sobre el mismo medio. Se tomaron después segmentos de hoja de los regenerantes de segunda vuelta y se colocaron en dos placas de selección paralela. Un medio de regeneración contuvo solamente 500 mg/L de espectinomicina, y el otro medio de regeneración contuvo 500 mg/L de espectinomicina y 500 mg/L de estreptomicina. Los segmentos de hoja que permanecieron verdes y mostraron signos de formación de callo o regeneración sobre el medio de selección dual se seleccionaron y colocaron en un medio de regeneración que contenía solamente espectinomicina para una tercera vuelta de regeneración. Los regenerantes se transfirieron a cajas Magenta (Sigma, St., Louis, MO) hasta que se cultivaron suficientes raíces para garantizar el transplante a un invernadero .

E. Marcador de Resistencia Seleccionable para Transformaciones La presente invención, además, incluye el uso de los genes pds y ahas de cianobacteria como un marcador seleccionable para transformaciones. Para probar la capacidad de los genes pds y ahas como marcadores seleccionables, aadA, un marcador conocido para estreptomicina y espectinomicina se usó como un control.

Durante la transformación, un vegetal transformado con pds o ahas y aadA debería mostrar resistencia a la estreptomicina, espectinomicina así como a las imidazolinonas o 4' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. En este caso, aadA, un marcador conocido para estreptomicina y espectinomicina se usó como un control. Así, un vegetal cultivado con pds o ahas y aadA debería mostrar resistencia a estreptomicina, espectinomicina e imidazolinonas o 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida. Para probar la capacidad de pds o ahas de cianobacteria como marcadores seleccionables, se transfirieron explantes de hoja a un medio que contiene espectinomicina y estreptomicina siguiendo dos vueltas de regeneración bajo selección de espectinomicinas . Los números de línea resistentes a espectinomicina/estreptomicina para cada construcción pueden verse en la Tabla 3.

Tabla 3. Selección in vi tro de transformantes de plástido.

Se hicieron observaciones y se tomaron fotos (Figura 8) de la prueba de aspersión de imazetapir de PURSUIT® 5 semanas después de la prueba que se llevó a cabo. Las líneas de tipo silvestre (W-38), plll, y pll2 mostraron necrosis de hoja ampliamente esparcida e impedimento del crecimiento cuando se rociaron a una concentración de 18 g/ha, y se vieron efectos aún más extremos a 35g/ha. Línea pll6. G-98 1208-1.1, no mostró daño visible de la hoja a 18 o 35g/ha. El crecimiento no se inhibió a 18g/ha, aunque podría observarse impedimento ligero a 35g/ha. El imazetapir de PURSUIT® pareció actuar como un regulador de crecimiento fuerte sobre la línea pll6 resultando en el brote prolífico y anormalidades morfológicas de los nuevos brotes. Las hojas adoptaron una forma delgada espinosa. La amplificación PCR confirmó la integración del gen AHAS de Synechocysti s dentro de la línea transplastómica G-98 1208-1.1 (a-d) (Figura 9A y 9B) . El clon a se roció a 35g/ha de imazetapir de PURSUIT®, los clones b y c se rociaron a 18g/ha, y el clon d no se roció. Las bandas apropiadamente dimensionadas pueden verse para el fragmento AHAS. Por lo tanto, el gen ahas se integró exitosamente dentro del plastoma y proporcionó resistencia a herbicida. Debido a esto, las mutantes pds y ahas de cinobacterias pueden usarse como unos marcadores seleccionables de control para probar otros tipos de transformaciones. Los genes pds y ahas resistentes a herbicidas puede acoplarse con selección sobre 4 '-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida u otros inhibidores de PDS conocidos, y las imidazolinonas y otro compuestos que inhiben AHAS tales como imazetapir de PURSUIT® para un sistema de selección eficiente para transformación. Las selecciones pueden aplicarse a transformación nuclear o de plástido, dependiendo de la construcción de los genes. La línea pACBC222, G-98 1208-1.1, cultivo de tabaco, Wisconsin-38 transformado con la construcción pACBC22 (o pllß I) (Figura 10) rociado con 18g/ha de imazetapir de PURSUIT® mostró aproximadamente un 20% de aumento en resistencia de la enzima AHAS en la presencia de imazetapir de PURSUIT® y sulfanilcarboxamidas en comparación con la enzima de AHAS a partir del tabaco de tipo silvestre sin rociar. Bastante interesantemente, parece que la enzima snAHAS muestra un nivel de resistencia cruzada al imazetapir de PURSUIT© y las sulfanilcarboxamidas, aunque son bastante desiguales estructuralmente .

F. Células, Tejido, Vegetales derivados a partir de transformaciones mediadas con cloroplastos . Un objeto adicional de esta invención proporciona células, tejido, vegetales, polen, derivados de la transformación del gen pds de Synechocystis mutante y usando los genes ahas dentro de células vegetales no transformadas. Alternativamente, pueden obtenerse formas mutantes de los genes pds con la o las mutaciones en la o las posiciones similares al gen de Synechocystis para cualquier especie de cultivo dada, y usarse adicionalmente para transformación genética. El o los genes pds mutantes de Synechocystis resistentes a 4'-fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida y el gen AHAS mutante que comprende la subunidad pequeña ahas y la subunidad grande ahas identificadas en estos procesos pueden introducirse respectivamente, directamente dentro de cultivos para diseñar resistencia a 4 ' -fluoro-6- [ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida por medio de la transformación medida con cloroplasto y la resistencia a imidazolinona. También pueden usarse los genes para generar resistencia a otros herbicidas que inhiben pds o AHAS. Aunque se han ilustrado y descrito las modalidades preferidas de la invención, se apreciará que pueden hacerse diversos cambios en los mismos sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Referencias Patentes WO 9,628,014 Hirschberg et al 1996 WO 9,806,862 Calgene 1997 WO 9,820,144 Zeneca 1998 JP 6,343,473 Kirin Brewery 1994 US 5,378,824 Dupont 1995 US 5,661,017 Dunahay et al 1995 Otras Referencias Babczinski, P., Sandmann, G., Sehmidt, R., Shiokawa, Kozo, Yasui, Katzucsmi, Pestic. Biochem. Physiol., 1995, 52, 1, p33-44 Boger, P. Sandmann, G., Pesticide Outlook, 1998, 9, 6, p.29-35 Chamowitz, D. Sandmann, G. Hirschberg, J., J. Biol.

Chem., 1993, 268, 23, p. 17348-53 Chamovitz, D., Pecker, I., Hirschberg, J., Plant Molecular Biology, 16, pp. 967-974 (1991) Clarke, I. E. Sandmann, G. Brawley, P.M.' Boeger, P., Pestic. Biochem. Physiol., 1985, 23, 3, p. 335-340 Duggleby et al, Gene, 1997, 190, p.245 Dzelzkalns & Bogorad, 1998, The EMBO Journal , 7, p. 333- 338 Freiberg, D. Seijffers, J., Z Naturforsch, 1990, C, 45, 5, P. 538-543 Kowalczyl-Schroder, S. Sandmann, G., Pestic. Biochem.

Physiol., 1992, 42, 1, p. 7-12 Hattori et al, Mol. & Gen. Genet., 1995, 246, p. 419-425 Linden, H., Sandmann, G., Chamovitz, D., Hirschberg, J., Booger, P. Pesticide Biochemistry and Physiology, 36, pp. 46-51 (1990) Martinez-Ferez, I., Vioque, A., Plant Molecular Biology, 18, pp.981-983, (1992) Mifflin, B.J., Arch. Biochm. Biophys., 1971, 146, p.542- 550 Powell, H.A. Kerley, N.W. Powell, P., Br. Phycol. J., 1990, 25 1, p.93 Sandmann, G. Schmidt A. Linden, H. Boger, P., Weed Science, 39, pp.474-479 (1991) Sandmann, G. Schneider, C. Boger, P., Z Naturforsch 1996, 51, 7-8, p.534-538 Sandmann, G. Fraser, P.D., Z Naturforsch 1993, C,48, 3-4, p.307-311 Sandmann, G. Schneider, C. Boger, P., Z Naturforsch 1996, 51, 7-8, p.534-538 Sandmann, G. Fraser, P.D. Linden, H., Res. Photosynth.

Proc. Int. Congr . , 1992, 3,p.51-4 Sandmann, G. Kowalczyl-Schroder, S. Taylor, H.M. Boeger, P., Pestic. Biochem. Physiol., 1992, 42, 1, p.1-6 Sandmann, G., Target Assays Mod. Herbic. Relat.

Phytotoxic Compd., 1993, p. 15-20 Sandmann, G., Chamovitz, D., Hirchberg, J., The Journal of Biological Chemistry, Vol.268, No.23, pp.17348-17353 (1993) Singh BK, Stidham MA, Shaner DL, Anal. Biochem., 1998, 171:173-179 Singh BK, Stidham MA, Shaner DL, J. Chromatography, 1998, 444,251 Weinstock et al., J. Bacteriol., 1992, 174, p.5560-5566 Williams et al., 1998, Methods in Enzymology, 167, p.766- 778 Windhoevel, U. Geiges, B. Sandman, G. Boeger, P., Pestic.

Biochem. Physiol., 1994, 49, 1, p.63-71 Windhoevel, U. Sandman, G. Boeger, P. Pestic, Biochem.

Physiol., 1997, 57, 1, p.68-78 Windhoevel, U., Geiges, B. Sandman, G. Boeger, P., Plant Physiol., 1994, 104, 1, p.6371 Methods in Enzymology, 167, 703-712

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado y purificado caracterizado porque comprende la secuencia de ID No. 6. 2. El polinucleótido aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un fragmento de ácido nucleico de cianobacteria que codifica un gen de subunidad grande de AHAS resistente a herbicidas. 3. El fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cianobacteria es Synechocystis PCC 6803. 4. Un polinucleótido aislado y purificado caracterizado porque comprende la secuencia de ID No. 17. 5. El polinucleótido aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polinucleótido es un fragmento de ácido nucleico de cianobacteria que codifica un gen de subunidad pequeña de AHAS resistente a herbicida. 6. El fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la cianobacteria es Synechocystis PCC 6803. 7. Un método para identificación del sitio objetivo del gen en cianobacterias, el método, el desarrollo exitoso de diversos protocolos para la 5 manipulación molecular de alta producción de Synechocystis está caracterizado porque comprende (I) identificación del compuesto director, (II) generación y selección de la mutante resistente, 10 (III) aislamiento de ADN genómico a partir de líneas de células resistentes, fjft (IV) diseño de cebador y amplificación PCR de fragmentos de gen a partir de Synechocystis (V) transformación genética de alta producción 15 e identificación del sitio objetivo del gen. 8. Un polinucleótido aislado y purificado caracterizado porque comprende la secuencia de ID No. 3. 9. El polinucleótido aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque 20 el polinucleótido es un fragmento de ácido nucleico de cianobacteria que codifica un gen pds mutante resistente a herbicidas. 10. Un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque 25 la cianobacteria es Synechocystis PCC 6803. fk Jd ooi/oJt SOi RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona cianobacterias como una fuente alternativa de genes alias y pds para transformaciones de la planta y para marcado seleccionable. En particular, proporciona cianobacterias, por ejemplo, Synechocystis, como una fuente de genes que codifican proteínas insensibles a herbicidas, y elementos de genes para el control de expresión en plástidos. Se encontraron fragmentos de ácido nucleico, la subunidad grande de acetolactato sintasa (ahas) y la subunidad pequeña ahas, que proporcionan resistencia a herbicidas. También, la presente invención proporciona el gen de fitoeno desaturasa ( PDS) mutante novedoso de Synechocystis que confiere resistencia a 4'-fluoro-6-[ (alfa, alfa, alfa, -trifluoro-m-tolil) oxi] -picolinamida, un herbicida blanqueador. La presente invención proporciona mejoras al método que involucra cianobacterias para la selección de compuestos, incluyendo un nuevo protocolo de alta producción que es una forma rápida y efectiva en costo para identificar sitios objetivo de genes.