INHIBIDORES NOVEDOSOS DE ESTROMELISINA La presente invención se refiere a estromemicina, derivados de estromemicina, procesos para su preparación y uso de los mismos como agentes farmacéuticos e inhibidores de estromelisina. La estromelisina (metaloproteinasa 3 de matriz) es una metaloproteinasa de matriz sustancialmente involucrada como enzima en la degradación de proteoglicanos, que son constituyentes importantes de tejidos cartilaginosos (A. J. Fosang et al. J. Clin. Invest. 98 (1996) 2292-2299) . Compuestos estructuralmente similares a la estromemicina han sido descritos por Yasuza a et al. (The Journal of Antibiotics, [revista de antibióticos]/ volumen XLIII, No. 4, (1990), páginas 336-343). En el intento para encontrar compuestos eficaces para el tratamiento de trastornos de tejido conectivo, se ha encontrado que la estromemicina de conformidad con la presente invención y los derivados de estromemicina son inhibidores de la metaloproteinasa de matriz estromelisina. La invención se refiere por consiguiente al compuesto de la fórmula I
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y/o una forma estereoisomérica del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerable del compuesto de la fórmula I, en donde R1 es 1. alquilo (C3-C10) , en donde alquilo es lineal o ramificado y es insustituido o monosustituido o disustituido o trisustituido por 1.1 -OR3, en donde R3 es un átomo de hidrógeno o alquilo (CL-C4) , 1.2 -NR4R5, en donde R4 y R5, independientemente entre ellos, son un átomo de hidrógeno o I alquilo (C3-C4) , 1.3 halógeno como por ejemplo -F, -Cl, -Br o bien -I, 1.4 =0 o bien 1.5 -COOH, o bien 2. alquenilo (C3-C10) , en donde alquenilo es lineal o ramificado y es insustituido o monosustituido, o disustituido, o trisustituido por 2.1 -OR3, en donde R3 es un átomo de hidrógeno o bien alquilo (C?~C4) , 2.2 -NR4R5, en donde R4 y R5, independientemente entre ellos, son un átomo de hidrógeno o alquilo (C1-C4) , 2.3 halógeno como por ejemplo -F, -Cl, -Br o bien -I,
2.4 =0 o bien 2.5 -COOH, o bien . alquilo (C3-C10) , en donde alquilo es lineal o ramificado y es insustituido o monosustituido o disustituido o trisustituido por 1.1 -OR3, en donde R3 es un átomo de hidrógeno o bien alquilo (C1-C4) , 1.2 -NR4R5, en donde R4 y R5, independientemente entre ellos, son un átomo de hidrógeno o bien alquilo (C1-C4) , 1.3 halógeno como por ejemplo -F, -Cl, -Br o bien -I, 1.4 =0 o bien 1.5 -COOH, o bien 2. alquenilo (C3-C10) , en donde alquenilo es lineal o ramificado y es insustituido o monosustituido, disustituido, o trisustituido por 2.1 -OR3, en donde R3 es un átomo de hidrógeno o alquilo (C1-C4) , 2.2 -NR4R5, en donde R4 y R5, independientemente entre ellos, son un átomo de hidrógeno o alquilo (C?-C4), 2.3 halógeno como por ejemplo -F, -Cl, -Br o bien -I, 2.4 =0 o bien
2.5 -COOH, y Z es una hexosa, en donde el azúcar es unido en forma piranoide a través de un enlace C-glicosidico. Un compuesto A preferido de la fórmula I es un compuesto en donde R1 es nonadienilo, R2 es nonadienilo y Z es D(+) -glucosa, D(+) -mañosa, D(+) -galactosa o D(+)-talosa. Un compuesto particularmente preferido es
Este compuesto es designado a continuación como estromemicina. El término hexosa se entiende significando todas las hexosas que ocurren naturalmente de la fórmula C6H?206, por ejemplo
D(+)-glucosa, D(+)-manosa, D(+) -galactosa o D(+)-talosa. La invención se refiere además a un proceso para la preparación del compuesto de la fórmula I y/o una forma estereoisomérica del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerable del compuesto de la fórmula I, que comprende a) el cultivo del microorganismo DSM 12038 o sus mutantes o variantes en un medio nutriente acuoso y el aislamiento y la purificación del compuesto estromemicina, o bien b) la conversión de estromemicina por hidrogenación reductora en un compuesto de la fórmula I en donde R1 y R2 son alquilo Cg, o bien c) la conversión de .estromemicina por ozonolisis en un compuesto de la fórmula I en donde R1 y R2 son 1.) -CH2CH2CH2-OH. 2.) -CH2CH2CH0 o bien 3. ) -CH2CH2COOH o bien d) extender un compuesto de la fórmula I preparado por el proceso c)2) por 1 a 7 grupos metileno por reacción con alquilidenfosforanos, en donde las cadenas laterales introducidas pueden tener grupos funcionales tales como hidroxilo, éter, grupos amino o bien radicales F, Cl, Br o I,
e) separar un compuesto de la fórmula I, que tomando en cuenta su estructura química ocurre en forma enantiomérica, preparado por el proceso a) , b) , c) o d) en los enantiómeros puros por formación de sal con ácidos o bases enantioméricamente puros, cromatografía en fases estacionarias quirales o derivación por medio de compuestos quirales enantioméricamente puros tales como aminoácidos, separación de los diastereómeros obtenidos de esta forma, y remoción de los grupos auxiliares quirales, o bien f) ya sea aislar el compuesto de la fórmula I preparado por el proceso a), b), c) , d) o e) en forma libre o bien, en el caso de la presencia de grupos ácidos o básicos, su conversión en sales fisiológicamente tolerables. El microorganismo DSM 12038 pertenece al grupo que consiste de los hongos y fue depositado el dia 4 de Marzo de 1998 bajo las condiciones de la Convención de Budapest en la Germán Collection for Microorganisms and Cell Cultures [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares], Mascheroder Weg Ib, D-38124 Brunswick, bajo el número DSM 12038. Variantes de DSM 12038 se refieren a cepas de DSM 12038 que han sido obtenidas por aislamiento de un cultivo de DSM 12038, en la medida en que producen estromemicina. Mutantes de DSM 12038 se refieren a cepas de DSM 12038 que fueron
obtenidas a partir de cultivo de DSM 12038 después de mutación, en la medida en que producen estromemicina. Mutantes de DSM 12038 pueden ser producidos de manera conocida per se por medios físicos, por ejemplo irradiación como por ejemplo radiación ultravioleta o por rayos X, o bien por mutágenos químicos, por ejemplo, metansulfonato de etilo (EMS); 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (MOB) o bien N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) . Los mutantes se encuentran, por ejemplo, mediante la toma de muestras a partir del medio de cultivo y mediante la determinación de la acción inhibidora sobre la estromelisina. La estromemicina es producida mediante el cultivo de DSM 12038. La solución de nutrientes contiene fuentes de carbono tales como sucrosa, almidón de maiz, dextrosa, lactosa, D-manitol, molasas o bien extracto de malta y fuentes de nitrógeno tales como harina de soya, harina de cacahuate, proteínas, peptonas, péptidos, triptonas, extracto de carne, extracto de levadura o bien sales de amonio o nitratos. La solución de nutriente contiene también sales inorgánicas tales como hidrogenfosfato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, sulfato de calcio, carbonato de calcio, sulfato de magnesio, o bien hidrogenfosfato de potasio. Grasa como por ejemplo oleato de metilo o bien aceite de soya pueden también agregarse al medio nutriente. Además, elementos menores tales como hierro, manganeso, cobre, zinc,
cobalto o bien otras sales de metales pueden también agregarse. Una solución de nutriente preferida contiene de aproximadamente 0.1% a 2% de peptona de caseína, de preferencia de 0.3% a 1%, de aproximadamente 0.1% a 2% de peptona de carne, de preferencia de 0.3% a 2%, de 0.5% a 5% de glucosa, de preferencia de 0.5% a 2%, y de 0.5% a 5% de maltosa, de preferencia de 0.3% a 2%. Los porcentajes se refieren al peso de la solución total de nutriente. DSM 12038 se cultiva a temperaturas de 20° C a 35° C, de preferencia a temperaturas comprendidas entre 23° C y 28° C y a pHs de 5 a 9, de preferencia de 4 a 6. El cultivo se efectúa inicialmente de manera aeróbica en un frasco agitado y después en un fermentador con agitación e introducción de aire o bien oxigeno puro. Los microorganismos en los fermentadores son cultivados durante un periodo de 48 a 240 horas, de preferencia de 15 a 72 horas, en particular de 15 a 30 horas. La formación de estromemicina alcanza su máximo después de aproximadamente 15 a 30 horas. La estromemicina es aislada directamente de la solución de nutrientes o después de la separación de las células, por ejemplo, por centrifugación o filtración. La estromemicina puede ser aislada por extracción con solventes o bien mediante adsorción en resinas tales como XAD 16, HP 20, MCI Gel® CHP20P o bien intercambiadores de iones. La purificación
se efectúa, por ejemplo, por cromatografía en resinas de adsorción como por ejemplo Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokio), en Amberlite® XAD 7 (Rohm and Haas, Estados Unidos de América), en Aberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, Estados Unidos de América) . Las separaciones pueden efectuarse en un amplio rango de pH. El rango de pH 1 a pH 9, particularmente de pH 2 a pH 8 se prefiere. Soportes de fase reversa, que son empleados en cromatografía de líquido de alta presión (HPLC), son también adecuados. Un proceso de aislamiento adicional es el uso de tamices moleculares tales como Fractogel® TSK HW-40S o bien Sephadex® LH-20. Uno o dos enlaces dobles, de preferencia dos enlaces dobles, presentes en la configuración cis y/o en la configuración trans, pueden ocurrir en el radical alquenilo Cg (cadena lateral de nonadienilo) . En el caso del radical azúcar, todos los estereoisómeros Ce enlazados C-glicosídicamente apropiadamente son posibles. La estromemicina preparada microbiológicamente sirve como sustancia inicial para la preparación de los derivados de estromemicina. Los compuestos de la fórmula I en donde R1 y/o R2 es alquilo Cg se preparan mediante hidrogenación reductora de la estromemicina de una manera conocida per se, por ejemplo, de conformidad con lo descrito en P. N. Rylander en "Hydrogenation Methods" [métodos de hidrogenación], Academic
Press, Nueva York (1985), capítulo 2. Por reacción con reactivos tales como Os04, es posible hidroxilar los enlaces dobles en las cadenas laterales (ver en Chem. Rev. 80, 187 (1980)). Como se sabe, por ozonolisis del enlace doble en las cadenas laterales de nonadienilo (R1 y R2) , derivados correspondientes que tienen cadenas laterales C3 se forman los cuales, según el tratamiento oxidante o reductor llevan grupos aldehido (por ejemplo, utilizando Zn/ácido acético o bien sulfuro de dimetilo/metanol), grupos carboxilo (por ejemplo, utilizando H202) , o bien grupos OH (por ejemplo, utilizando LiAlH4 o NaBH4) como grupos funcionales (W. Carruthers, "Some Modern Methods of Organic Synthesis" [algunos métodos modernos de síntesis orgánica], Cambridge University Press (1971), capítulo 6; White, King und O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591 (1971) ; Bailey, P.S. "Ozonisation in Organic Chemistry", [ozonización en química orgánica] vol. 1 y vol. 2, Nueva York, Academic Press (1978, 1982)). Mediante la reacción de los derivados de aldehido con alquilidenfosforanos a través de la reacción de Wittig conocida, las cadenas C3 pueden ser subsecuentemente extendidas otra vez en condiciones suaves, como por ejemplo, a una longitud de 4 a 10 átomos de carbono, en donde las cadenas laterales introducidas pueden contener grupos funcionales, como por ejemplo, OR3 (R3 = H o bien un radical
alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono) , NR4R5 (R4, R5 = H o bien un radical alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono), F, Cl, Br, I, de conformidad con lo descrito en: H. J. Bestmann et al. "Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products" [temas selectos de la reacción de Wittig en la síntesis de productos naturales], Topics in Current Chemistry [temas de química actual] 109, 85, (1983) . Los azúcares en el compuesto de la fórmula I son modificados por procesos conocidos (H. Paulsen, Angew, Chem. Int. Ed. 21 (1982) página 155; R. R. Schmidt, Angew, Chem. Int. Ed. 25 (1986) páginas 212-235; T. Ogawa, Tetrahedron Lett. 31 (1990) 2439-2442) . Sales farmacológicamente tolerables del compuesto de la fórmula I significan tanto sales orgánicas como inorgánicas, tales como las sales descritas en Remington' s Pharmaceutical Sciences (décimo séptima edición, página 1418 (1985) ) . Sales fisiológicamente tolerables se preparan de manera conocida a partir de compuestos de la fórmula I que pueden permitir la formación de sales incluyendo sus formas estereoisoméricas . Con reactivos básicos tales como hídróxidos, carbonatos, hidrogencarbonatos, alcóxidos y también amoniaco o bases orgánicas, por ejemplo, trimetilamina o trietilamina, etanolamina o trietanolamina o bien alternativamente aminoácidos básicos, por ejemplo, lisina, ornitina o
arginina, el ácido carboxílico forma sales estables de metales alcalinos, metales alcalinos férreos o bien opcionalmente sustituidas con amonio. Si el compuesto de la fórmula I tiene grupos básicos, se pueden preparar también sales de adición de ácido estables utilizando ácidos fuertes. Para este propósito, ácidos adecuados son tanto ácidos inorgánicos como ácidos orgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, bencensulfónico, fosfórico, metansulfónico, p-toluensulfónico, 4-bro obencensulfónico, trifluorometilsulfónico, ciclohexilamidosulfónico, acético, oxálico, tartárico, succínico y trifluoroacético. La invención se refiere también a fármacos que comprenden una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerable del compuesto de la fórmula I y/o una forma opcionalmente estereoisomérica del compuesto de la fórmula I, junto con un vehículo, aditivo y/u otros compuestos activos y excipientes farmacéuticamente adecuados y fisiológicamente tolerables. Tomando en cuenta las propiedades farmacológicas, los compuestos de conformidad con la presente invención son adecuados para la profilaxis y terapia de todas las condiciones cuyo curso incluye una actividad incrementada de enzimas degradantes de la matriz tales como la metaloproteinasa de matriz estromelisina. Estas incluyen
condiciones de articulaciones degenerativas tales como osteoartrosis, espondilosis, condrolisis después de una lesión de las articulaciones o bien después de una inmovilización relativamente larga de las articulaciones después de lesión de menisco o patela o bien después de la ruptura de los ligamentos. Además, incluyen también condiciones del tejido conectivo como por ejemplo colagenosis, condiciones periodontales, trastornos de curación de las heridas así como condiciones crónicas del aparato locomotor como por ejemplo artritis aguda y crónica provocada por inflamación, inmunología o metabolismo, artropatía, mialgia y trastornos del metabolismo de los huesos. Además, los compuestos de la fórmula I son adecuados para el tratamiento de úlceras, aterosclerosis y estenosis. Los compuestos de la fórmula I son también adecuados para el tratamiento de inflamación, trastornos carcinomatosos, formación de metástasis tumorales, caquexia, anorexia y choque séptico. En general, los fármacos de conformidad con la presente invención se administran oral o parenteralmente. Es también posible la administración rectal, por inhalación, nasal y transdérmica. La ' invención se refiere también a un proceso para la preparación de un fármaco el cual se caracteriza porgue por lo menos un compuesto de la fórmula I se proporciona en una
forma de administración adecuada utilizando un vehículo farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente tolerable y, en caso apropiado, compuestos activos, aditivos o excipientes adecuados adicionales. Formas de preparación sólidas o farmacéuticas adecuadas son, como por ejemplo, granulos, polvos, tabletas revestidas, tabletas (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, jugos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones inyectables y también preparaciones que tienen una liberación prolongada del compuesto activo, en cuya preparación se utilizan excipientes habituales tales como vehículos, agentes de desintegración, aglomerantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchazón, agentes de deslizamiento o lubricantes, saborizantes, endulzantes y agentes de solubilización. Excipientes frecuentemente utilizados que pueden ser mencionados son carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol, y otros azúcares, talco, lactoproteína, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, aceite de cacahuate, o aceite de ajonjolí, polietilenglicol y solventes tales como, por ejemplo, agua estéril y alcoholes onohídricos o polihídricos tales como glicerol. Las preparaciones farmacéuticas se preparan de preferencia y se administran en unidades de dosis, cada una conteniendo
como constituyente activo una dosis específica del compuesto de la fórmula I de conformidad con la invención. En e±4 caso de unidades de dosis sólidas tales como tabletas, cápsulas, tabletas revestidas o supositorios, esta dosis puede _ ser de hasta aproximadamente 1000 mg, pero de preferencia aproximadamente 50 a 300 mg, y en el caso de soluciones para inyección en forma de ampolletas, puede ser de hasta aproximadamente 300 mg, pero de preferencia de aproximadamente 10 a 100 mg. Para el tratamiento de un paciente adulto de un peso de aproximadamente 70 kg según la eficacia del compuesto de conformidad con la fórmula I, dosis diarias de aproximadamente 20 mg a 1000 mg de compuesto activo, de preferencia de aproximadamente 100 mg a 500 mg, son indicadas. En ciertas circunstancias, sin embargo, dosis diarias más altas o más bajas pueden ser apropiadas. La dosis diaria puede ser administrada tanto por administración única en forma de una unidad de dosis individual o bien a través de varias unidades de dosis más pequeñas y por administración múltiple de dosis subdivididas a intervalos específicos. Ejemplo 1 Preparación de una suspensión de espora de DSM 12038 100 mi de una solución de nutrientes (20 g de extracto de malta, 2 g de extracto de levadura, 10 g de glucosa, 0.5 g de (NH4) 2HP04 en 1 1 de agua del grifo, pH antes de
esterilización: 6.0) en un frasco Erlenmeyer estéril de 500 ml fueron inoculados con la cepa DSM 12038 e incubados en un agitador rotatorio durante 72 horas a una temperatura de 25° C y 140 revoluciones por minuto. 120 ml de fluido de cultivo fueron después agregados a un frasco Erlenmeyer estéril de 500 ml que contenía el medio nutriente, infusión de harina de avena, 2.0 g/1, al cual se agregó 15 g de agar/1 fueron agregados adicionalmente para solidificación, distribuidos uniformemente e inoculados con el cultivo del agitador. La cepa fue incubada a una temperatura de 25° C durante 10 a 14 días. Las esporas formadas a partir de la cepa DSM 12038 fueron lavadas con 500 ml de agua desionizada que contenía una gota de Tritón® X 100 (Serva) , reutilizadas inmediatamente o almacenadas a una temperatura de -22° C en glicerol al 50% o en sulfóxido de dimetilo al 10% a una temperatura de -140° C. Ejemplo 2 Preparación de un cultivo en agitador Un frasco Erlenmeyer de 500 ml estéril que contenía 100 ml de una solución nutriente de 0.5% de peptona de caseína, 0.5% de peptona de carne, 1% de glucosa y 10% de maltosa fue inoculado con 0.2 ml de una solución de esporas, preparada de conformidad con el ejemplo 1, y 'se incubó a 140 revoluciones por minuto a una temperatura de 25° C en un agitador, con extrusión de luz. La cantidad máxima de estromisina fue
lograda después de aproximadamente 27 horas. Para la inoculación de fermentadores de 10 1 o 100 1, se utilizó un cultivo de agitador de 72 horas, que .contenía la cepa DSM 12038 y una solución nutriente de 2% de extracto de malta, 0.2% de extracto de levadura, 1% de glucosa y 0.05% de hidrogenfosfato de amonio (cantidad de inoculación: aproximadamente 5%) . Ejemplo 3 Preparación de estromemicina Un fermentador de 10 1 fue operado bajo las siguientes condiciones : medio nutriente: peptona de caseína 5 g/1 peptona de carne 5 g/1 glucosa 10 g/1 maltosa 10 g/1 tiempo de: de 25 a 30 horas incubación temperatura de: 25° C incubación: velocidad de agitador: 300 revoluciones por minuto aeración: 0.5 l/min pH 5 ± 0.5 La formación de espuma fue suprimida' por adición de 1 a 2 ml de una solución de poliol etanólica. La producción máxima fue lograda después de 27 horas.
Ejemplo 4 Aislamiento de estromemicina 7.5 1 de la solución de cultivo obtenida de conformidad con el ejemplo 3 fueron removidas por centrifugación y el filtrado de cultivo fue adsorbido en lotes en 1.5 1 de resina de adsorción MCI Gel® CHP20P. La resina fue agregada a un filtro con succión y lavada primero con 4 1 de H20. Se efectuó después una elusión utilizando fracciones de 2 1 en cada caso de una mezcla de isopropanol/agua que comprendía 20%, 40%, 70% o 100% de isopropanol en cada caso. Después de revisión con HPLC y después de una prueba de actividad, la estromemicina fue eluida con las primeas dos fracciones
(isopropanol al 20% y 40%). Las fracciones fueron recogidas y liofilizadas. El producto fue después purificado adicionalmente a través de HPLC: 1.) Columna: RP18, Nucleosil 100 RP18-AB (Macherey & Nagel) ,
250 x 21 mm, 5 µ Eluyente: CH3CN/0.1% TFA gradiente: 37 minutos, 40% CH3CN isocrácticamente, después en 10 minutos hasta 100% CH3CN. Flujo: 9 ml/min; detección: 275 nm _¿ La estromemicina fue eluida después de 52 minutos. 2.) Columna: Fractogel TSK HW40S, 200 ml (Erimatechnik) 300 x 25 mm, Eluyente: MeOH; flujo 2 ml/min; detección 230 nm
La estromemicina fue eluida después de 75 minutos Rendimiento: 25 mg a partir de 7.5 1 de medio de fermentador. La estromemicina obtenida presentó las siguientes propiedades: Apariencia: sólido incoloro; soluble en metanol, sulfóxido de dimetilo (DMSO) ; estable en medio neutral, pero inestable en solución alcalina y fuertemente acida. Fórmula empírica: C38H48?i2 HPLC (Cromato- Columna: Purospher RP-18e (125 x 3 mm, 5 µ) grafía de líqui- Eluyente: gradiente: CH3CN/0.1% H3P04 en 20 do de alta min de 0% a 100% CH3CN presión: Flujo: 0.6 ml/min Tiempo de retención: 16.4 min Detección: 230 nm Peso molecular 696.8 Da HR-FAB-MS: 697.32332 [M+H]+ 1H- y 13C-NMR: ver tabla 1 UV/VIS: MeOH ?nm (log e) : 216 nm (4.87), 267 (4.33), 304 (4.34) FT-IR: (KBr), v=3419 cm"1 (br) , 2929 (m) , 1608 (s) , 1434 (w), 1252 (m) , 1204 (w) , 1151 (m) , 1084 (w) . Tabla 1 : Desplazamientos químicos 1H y 13C de estromemicina en
DMSO-de, ppm con relación a TMS, 300 K Posición XH 13C [ppm] [ppm] 1 - 158.29 1-OH 9.70 - 2 - 110.56 3 - 159.32 3-OH 9.81 - 4 6.33 109.58 5 - 142.46 6 - 108.83 7 - 167.36 8 2.75 34.27 9 2.32 34.02 10 5.58 130.79 11 6.0 130.72 (130.79)31
12 6.0 130.24 (130.31)a)
13 5.55 132.22 (132.38)a!
14 1.99 34.02 15 1.34 21.96 (21.97)a) 16 0.85 13.50 17 4.70 74.40 18 3.68 71.53 19 3.24 78.38 20 3.27 69.65
21 3.24 81.21 22 3.54/3.66 60.51 1' - 157.17 l'-OH 10.67c) - 2' 6.63 107.31 3' - 151.55 4' 6.56 113.18 5' - 142.25 6' - 118.40 7' - 169.73 7'-COOH n.d. - 8' .2.71 33.44 9' 2.29 33.61 10' 5.58 130.79 11' 6.0 130.79 (130.72)a) 12' 6.0 130.31 (130.24)a! 13' 5.55 132.38 (132.22)3' 14' 1.99 34.02 15' 1.34 21.97 (21.96)al 16' 0.85 13.50 al Debido a empalme de señales, una asignación sin ambigüedad de los desplazamientos químicos no es posible. b) Desplazamientos químicos casi idénticos de las posiciones 10-16 y 10' -16' impiden una diferenciación sin ambigüedad de la correlación de HMBC con relación a ambas cadenas laterales
de dieno. cl "asignación tentativa". Ejemplos farmacológicos Preparación y determinación de la actividad enzimática del dominio catalítico de estromelisina humana La enzima estromelisina (MMP-3) fue preparada de conformidad con Ye et al. (Biochemistry; 31 (1992) páginas 11231-11235). Para la medición de la actividad enzimática o bien de la acción inhibidora de enzima, 70 µl de una solución amortiguadora y 10 µl de una solución enzimática fueron incubados durante 15 minutos con 10 µl de una solución acuosa de sulfóxido de dimetilo al 10% (volumen/volumen) , que contenía opcionalmente el inhibidor de enzima. Después de la adición de 10 µl de una solución acuosa de sulfóxido de dimetilo al 10% (volumen/volumen) que contenía 1 mmol/l del sustrato, la reacción enzimática fue monitoreada por espectroscopia de fluorescencia (328 nm (ex) / 393 nm (em) ) . La actividad enzimática se muestra como el incremento de extinsión/minuto. El valor IC50 fue determinado como la concentración de inhibidor que en cada caso provocaba una inhibición del 50% de la enzima. La solución amortiguadora contenía 0.05% de Brij (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y 0.1 mol/1 de tris/HCl, 0.1 mol/1 de NaCl, 0.01 mol/1 de CaCl2 y 0.1 mol/1 de piperazin-?,?' -bis[ácido 2-etansulfónico] (pH = 6.5).
La solución enzimática contenía 5 µg/ml de un dominio enzimático preparado de conformidad con Ye et al. La solución de sustrato contenía 1 mmol/l de sustrato fluorogénico (7-metoxicoumarin-4-il) acetil-Pro-Leu-Gly-Leu-3- (2, 4'-dinitrofenil) -L-2, 3-diaminopropionil-Ala-Arg-NH2 (Bachem,
Heidelberg, Alemania) . El valor IC50 para la estromemicina fue determinado como 115 µM.