MXPA02004601A - Derivados de espiro(2h-1-benzopiran-2,4'piperidina) como inhibidores del transporte de glicina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a derivados de espiro[2H-1- benzopiran-2,4'-piperidina]que tienen la fórmula general I:en donde los sustituyentes R1, R2, X e Y son como se definen en las reivindicaciones, o una sal farmacéuticamente aceptables de los mismos;la invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados, asícomo también al uso de estos derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina]en terapia, más específicamente para el tratamiento de trastornos del SNC.

Description

DERIVADOS DE ESPIRO(2H-1-BENZOPIRAN-2,4'-PIPERIDINA) COMO INHIBIDORES DEL TRANSPORTE DE GLICINA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina], a composiciones farmacéuticas que contienen los mismos, así como también al uso de estos derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] en terapia. El alfa-aminoácido más simple glicina desempeña numerosas funciones importantes en el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos. Junto con el ácido ?-aminobutírico (GABA), es un transmisor inhibidor post-sináptico importante en la médula espinal y el tallo cerebral, actuando a través de los canales de iones con compuerta a ligandos. La interacción de la glicina con estos receptores puede ser antagonizada por el alcaloide estricnina. Estos receptores son referidos por lo tanto como receptores de glicina "sensibles a estricnina". La neurotransmisión glicinérgica es importante en el procesamiento y control de la señalización visual, auditiva y motora. La glicina es también un co-agonista obligatorio junto con el glutamato en el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). La glicina funciona por lo tanto en la transmisión excitatoria, modulando las acciones del glutamato, el neurotransmisor excitatorio principal en el SNC. Además, el aminoácido desempeña una función en el metabolismo de péptidos y proteínas, incluyendo el intercambio de unidades de un carbono. r* El control de la disponibilidad de la glicina para cualquiera de los procesos anteriores, influirá potencialmente su función, y proveerá medios para tratar numerosas enfermedades y condiciones. Aparte del metabolismo, uno de los procesos principales que controlan las 5 concentraciones de glicina libre en la proximidad de los receptores de glicina sensibles a la estricnina e insensibles a la estricnina, es el funcionamiento de transportadores de glicina selectivos de alta afinidad. Estas proteínas pueden limitar activamente la difusión de la glicina más allá de los ambientes inmediatos de los receptores, manteniendo de esta 0 manera fidelidad espacial y temporal de la activación de los receptores. El secuestro rápido del transmisor en células neuronales o guales mediante el transportador, conservará también la glicina para liberación futura. Se han clonado transportadores de glicina que revelan dos 5 clases principales, GlyT-1 y GlyT-2. GlyT-1 se expresa por todo el cerebro, siendo detectados mayores niveles de ARNm en áreas caudales, y siendo la localización celular predominantemente glial. Tres isoformas de GlyT-1, 1a, 1b y 1c, que surgen de uso de exones y empalme diferencial, han sido identificadas por Kim et al. 0 (Molecular Pharm. 1994, 45, 608-617). La clonación y expresión de otra isoforma humana, GlyT-1d, fue descrita recientemente en la solicitud de patente europea EP 951543 (Allelix Neuroscience, Inc.). La distribución de GlyT-2, según se indica mediante estudios de inmunoquímica, corresponde estrechamente a la de los receptores de glicina inhibidores "sensibles a estricnina", en particular en la médula espinal. Mediante la regulación de los niveles sinápticos de glicina, se espera que los transportadores de glicina GlyT-1 y GlyT-2, influyan selectivamente sobre la actividad de los receptores de NMDA, y en los receptores de glicina sensibles a estricnina, respectivamente. Compuestos que alteren la actividad funcional de los transportadores de glicina, pueden producir por lo tanto cambios en los niveles de glicina en tejidos, los cuales pueden ser útiles en el tratamiento de varios estados de enfermedad. Dichos estados de enfermedad incluyen aquellos asociados con la función disminuida o exagerada de receptores de NMDA, a saber, psicosis, depresión, demencia y otras formas de cognición deteriorada, tales como trastornos del déficit de atención. Los receptores de NMDA han sido implicados además en condiciones que resultan de muerte de células neuronales y neurodegeneración tales como, por ejemplo, ataques (trauma de cabeza), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington. La transmisión glicinérgica inhibidora intensificada que resulta de la inhibición de la activad de GlyT-2 o GlyT-1, puede ser útil en el tratamiento de hiperactividad muscular asociada con espasticidad, mioclonus y epilepsia. Compuestos que eleven la glicina espinal, pueden poseer también propiedades analgésicas. Compuestos que inhiben el transporte de glicina mediante los transportadores de Gly-T1 o Gly-T2, se describen en los documentos WO 97/45115 (TROPHIX PHARM. INC.), WO 97/45423 (TROPHIX PHARM.

INC.), WO 99/34790 (ALLELIX NEUROSCIENCE INC.) y WO 00/07978 (AKZO NOBEL N.V.), como compuestos útiles en el tratamiento de los trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos descritos anteriormente. Existe la necesidad de otros compuestos adecuados para el tratamiento de trastornos psiquiátricos y neurológicos, especialmente compuestos que tengan un perfil farmacológico selectivo. Se ha encontrado ahora que derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] que tienen la fórmula general I: FORMULA PAG 3 Fórmula I en donde: la línea punteada representa un enlace opcional; Y representa de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo de (C-?_6) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos), alquiloxi de (C^.6) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos o con cicloalquilo de (C3.6)), alqueniloxi de (C2.6), alquiniloxi de (C2.6), cicloalquiloxi de (C3.6), ariloxi de (C6--?2), arilalquiloxi de (C7.15), heteroariloxi, heteroarilalquiloxi, SR3, NR3R4, OSO2R5 y NR3SO2R4; 2 sustituyentes Y pueden formar juntos O-(CH2)n-O u O- (CF2)n-O, en donde n es 1 ó 2; o Y representa un grupo arilo de (C5.6) fusionado; X representa de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquiloxi de (C1. ), SR3, NR3SO2R4 y alquilo de (C .4), sustituido opcionalmente con halógeno; R es hidrógeno, alquilo de (C1. ) o arilo de (C6-?2); R2, R3 y R son independientemente hidrógeno o alquilo de (CL,); R5 es alquilo de (C^) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos) o arilo de (C6-?2) (sustituido opcionalmente con alquilo de (CL.)); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, inhiben selectivamente el transporte de glicina por el transportador de GlyT-1 humano, en comparación con el transportador de GlyT-2 humano, y se pueden usar en el tratamiento o prevención de esquizofrenia, depresión, demencia y otras formas de cognición deteriorada, o de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington, o de hiperactividad muscular asociada con espasticidad, mioclonus y epilepsia. El término alquilo de (d.e), como se usa en la definición de la fórmula I, significa un grupo alquilo de cadena recta o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, tales como hexilo, pentilo, neopentilo (2,2-dimetilpropilo), butilo, isobutilo, butilo terciario, propilo, isopropilo, etilo y metilo. Del mismo modo, el término alquilo de (C^) se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. En el término alquiloxi de (C-|.6), alquilo de (C-|.6) significa un grupo alquilo ramificado o no ramificado como se definió anteriormente.

El grupo alquiloxi de (C^e) puede ser sustituido con 1 a 3 halógenos o con cicloalquilo de (C3.6), lo cual significa un grupo alquilo cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Ejemplos de dichos grupos alquiloxi de (C?_6) sustituidos, son trifluorometiloxi y ciclopropilmetiloxi. El término halógeno significa F, Cl, Br o I. Cuando el halógeno es un sustituyente en un grupo alquilo, se prefiere F. Un grupo alquilo preferido sustituido con halógeno, es trifluorometilo. El término alquenilo de (C2.6), tal como se usa en el término alqueniloxi de (C2.6), significa un grupo alquenilo de cadena recta o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, tales como etenil(vinilo), 2-propenil(alquilo), isopropenilo y 2-butenilo. El término alquinilo de (C2.6), tal como se usa en el término alquiniloxi de (C2.6), significa un grupo alquinilo de cadena recta o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, tal como propargilo. En el término ariloxi de (C6-?2), como se usa en la definición de la fórmula I, arilo de (C6_ 2) significa un grupo hidrocarburo aromático que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, tales como fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indenilo o bifenilo. Estos grupos aromáticos pueden ser sustituidos con halógeno, o con alquilo de (C1. ) o alquiloxi de (C?.4), en donde alquilo de (C1.4) tiene el significado dado anteriormente, y puede ser sustituido con halógeno o alquiloxi de (C?- ). El término arilalquilo de (C7-15), como se usa en la definición de la fórmula I, significa un grupo arilalquilo que tiene de 7 a 15 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo es un grupo alquilo de (C?_6), y el grupo arilo es un arilo de (C6-?2) como se definió anteriormente. Los grupos fenilalquilo de (d.6) son grupos arilalquilo preferidos, tal como bencilo. El término heteroarilo, tal como se usa en el término heteroariloxi, significa un grupo aromático sustituido o no sustituido que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, incluyendo por lo menos un heteroátomo seleccionado de N, O y S tal como, por ejemplo, imidazolilo, tienilo, benzotienilo, quinolinilo e indolilo. El grupo heteroarilo puede tener sustituyentes tales como los indicados para el grupo arilo. Los grupos heteroarilalquilo son análogos de los grupos arilalquilo de (C7.-?5), incluyendo por lo menos un heteroátomo seleccionado de N, O y S. En la definición de la fórmula I, Y puede representar un grupo arilo de (C5.6) fusionado, lo cual significa que Y es un anillo aromático de 5 o 6 miembros fusionado al anillo de benceno al cual X está unido para formar un sistema de anillo aromático de (Cn.12), tal como un anillo de indeno o naftaleno. Además de la definición de R,, el grupo O-R1 de la fórmula I puede ser cualquier otro grupo a partir del cual se puede generar (in vivo) el ácido libre (R es hidrógeno). Dichos precursores o profármacos de ácido alternativos, tales como otros derivados de éster o amida son conocidos en la técnica, y están dentro del alcance de la presente invención. Los derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de fórmula I y sus sales, pueden contener uno o más centros estereogénicos, y pueden existir por lo tanto como estereoisómeros. La presente invención incluye estos estereoisómeros dentro de su alcance, así como también enantiómeros de los compuestos de fórmula I y sus sales sustancialmente libres, es decir, asociados con menos de 5%, de preferencia menos de 2%, en particular menos de 1% del otro enantiómero, y mezclas de dichos estereoisómeros en cualquier proporción, incluyendo las mezclas racémicas que contienen cantidades sustancialmente iguales de los dos enantiómeros. Preferidos son los derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de fórmula I, en donde la línea punteada representa un enlace, mientras que son más preferidos aquellos compuestos en donde además R1 y R2 son ambos hidrógeno. Los derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] especialmente preferidos de la invención, y sales de los mismos, corresponden a compuestos de fórmula I, en donde la línea punteada es un enlace, Ri y R2 son hidrógeno, y en donde Y representa un sustituyente para seleccionado de cloro, bromo, alquiloxi de (d. ), alqueniloxi de (C1. ), alquiniloxi de (C1. ) y NR3R4, y 1 ó 2 sustituyentes meta seleccionados entre los halógenos, siendo la selección preferida flúor. Ejemplos específicos de patrones de sustitución Y preferidos son: 3-fluoro-4-metilo; 3-fluoro-4-cloro; 3-fluoro-4-dimetilamino y 3,5-difluoro-4-dimetilamino. Especialmente preferidos son los compuestos de conformidad con la fórmula I, en donde Y representa 3-fluoro-4-alquiloxi, en particular 3-fluoro-4-n-propoxi y 3-fluoro-4-n-butox¡ y 3,5-difluoro-4-alquiloxi.

Los derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de fórmula general I se pueden preparar usando una secuencia de reacciones en las que derivados de 2'-hidroxiacetofenona de fórmula II, en donde X tiene los significados definidos anteriormente, se usan como materiales de partida que se obtienen fácilmente en el comercio, o usando métodos de síntesis conocidos por los expertos en la técnica de química orgánica de síntesis. Los derivados de 2'-hidroxiacetofenona de fórmula II son condensados con 1-metil-4-piperidona [R es metilo; como alternativa se puede usar 1-bencil-4-piperidona (R es bencilo), en donde con frecuencia el grupo bencilo es removido más fácilmente que el grupo metilo (véase esquema C)] en solución de metanol en presencia de pirrolidona, para proveer derivados de N-metil-espiro[2H-1-benzopiran- 2,4'-piperidin]-4(3H)-ona que tienen la fórmula lll, como se muestra en el esquema A.

ESQUEMA A PAG 6 Los derivados espiro-ceto de fórmula lll se tratan subsecuentemente, como se muestra en el esquema B, con un reactivo de Grignard que tiene la fórmula IV, en donde Y tiene el significado definido anteriormente, en un solvente adecuado, tal como tetrahidrofurano, para dar los derivados de 4-aril-N-metil- o N-bencil-espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de fórmula V, después de tratamiento con ácido.

ESQUEMA B PAG 7/1 En forma alternativa, se pueden preparar compuestos de conformidad con la fórmula V mediante conversión de un derivado espiro-ceto de fórmula lll, en donde R es H, metilo o bencilo, al derivado enoltriflato III", y reacción de acoplamiento de Suzuki subsecuente con un derivado de ácido fenilborónico IV" (esquema B"). ESQUEMA B" PAG 7/2 La N-desalquilación de los compuestos de conformidad con la fórmula V usando cloroformiato de 1-cloroetilo en un solvente clorado tal como 1 ,3-dicloropropano o diclorometano, da los derivados de 4-aril-espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] intermediarios de fórmula VI, los cuales son alquilados subsecuentemente mediante reacción con HalCH2R2-COOR1, en donde R-i puede ser alquilo de (C1.4) o arilo de (C6. 12), y R2 tiene el significado definido anteriormente, y Hal significa halógeno, de preferencia bromo, para dar los derivados de 4-aril-espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de fórmula I, como se muestra eh el esquema C, cuya función éster puede ser hidrolizada hasta los compuestos de fórmula I, en donde R-, es hidrógeno. ESQUEMA C PAG 8 Cuando el reactivo de Grignard requerido de conformidad con la fórmula IV no está disponible comercialmente, se prepara a partir del bromoareno relevante usando un procedimiento estándar (The Handbook of Grignard Reagents, ed. G. S. Silverman y P. E. Rakita, 1996, Marcel Dekker, New York). Los compuestos de la invención se pueden usar en el tratamiento de esquizofrenia, depresión, demencia y otras formas de cognición deteriorada, para el tratamiento o prevención de neurodegeneración consecutiva a ataque o trauma de cabeza, para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington, para el tratamiento de hiperactividad muscular asociada con espasticidad, mioclonus y epilepsia, para el tratamiento o prevención del dolor, trastornos del humor o trastornos del aprendizaje. Los compuestos de esta invención pueden poseer uno o más centros estereogénicos y se pueden obtener por lo tanto estereoisómeros puros, o como una mezcla de estereoisómeros. Métodos de síntesis asimétrica mediante los cuales se obtienen los estereoisómeros puros, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, síntesis con inducción quiral, hidrólisis enzimática enantioselectiva de esteres, cristalización de sales que se obtienen a partir de ácidos ópticamente activos y la mezcla racémica, separación de estereoisómeros o enantiómeros usando cromatografía sobre medios quirales, o sobre medios de cromatografía de fase invertida o de fase recta. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Chirality in Industry (editado por A. N. Collins, G. N. Sheldrake y J. Crosby, 1992; John Wiley). Se pueden obtener sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I tratando la base libre de los compuestos de conformidad con la fórmula I, con un ácido mineral tal como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, de preferencia ácido clorhídrico, o con un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido glucólico, ácido succínico, ácido propiónico, ácido acético, ácido metansulfónico, y similares. Se pueden obtener sales farmacéuticamente aceptables de la fórmula I, en donde Ri es hidrógeno, tratando el ácido o la forma zwitteriónica de dichos compuestos, con una base orgánica o una base mineral tal como hidróxido de sodio, potasio o litio. En otro aspecto, la invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden derivados de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] que tienen la fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en mezcla con auxiliares farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la presente invención comprenden un derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] que tiene la fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en mezcla con auxiliares farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. El término "aceptable" significa que es compatible con los otros ingredientes de la composición, y que no perjudica a quienes lo reciben. Las composiciones se pueden preparar de conformidad con técnicas estándar tal como se describe, por ejemplo, en la referencia estándar Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences (décima octava edición, Mack Publishing Company, 1990, véase especialmente la parte 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture). Las composiciones incluyen, por ejemplo, aquellas adecuadas para administración oral, sublingual, intranasal, subcutánea, intravenosa, intramuscular, local o rectal, y similares, todas en formas de dosificación unitaria para administración. Para administración oral, el ingrediente activo se puede presentar como unidades discretas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, granulados, soluciones y suspensiones. Para administración parenteral, la composición farmacéutica de la invención se puede presentar en contenedores de dosis múltiples o de dosis individual, por ejemplo, líquidos para inyección en cantidades predeterminadas, por ejemplo, en frascos y ámpulas sellados, y se puede almacenar también en una condición deshidratada congelada (liofilizada) que requiere únicamente la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua, antes de su uso. Los compuestos de la invención se pueden administrar a humanos a una dosificación de 0.001-50 mg por kg de peso corporal, de preferencia a una dosificación de 0.01-20 mg por kg de peso corporal. La invención incluye además una composición farmacéutica, como se describió anteriormente, en combinación con un material de empaque adecuado para dicha composición, dicho material de empaque incluyendo instrucciones de uso de la composición para el uso como se describió anteriormente. La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Generalidades Toda la espectrometría de masas se llevó a cabo en una máquina PE SCIEX API 150EX o PE SCIEX API 365. Los puntos de fusión están sin corregir y se determinaron usando un instrumento Leica Galen lll o un Leica VMHB System Kofler.

EJEMPLO 1 Clorhidrato de 1'-carboximetil-7-metoxi-4-fenilespiror2H-1- benzopi ran -2,4'-p¡ pendí nal Paso A 7-metoxi-N-met¡espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidinl-4(3H)-ona A una solución agitada de 2-hidroxi-4-metoxiacetofenona (4.08 g, 24.58 mmoles) en alcohol metílico anhidro (60 cm3) bajo una atmósfera de nitrógeno seco, se añadió 1-metil-4-piperidinona (3 cm3, 24.58 mmoles), seguido de pirrolidina (4 cm3, 47.92 mmoles), y la solución se calentó a reflujo. Después de 7 horas, se añadió otra porción de l-metil-4-piperidinona (0.6 cm3, 4.76 mmoles), y la mezcla se calentó a reflujo durante otras 4.5 horas. Se dejó entonces que se enfriara a temperatura ambiente antes de que las fracciones volátiles se removieran bajo presión reducida. El aceite resultante se trató con diclorometano (100 cm3), se lavó con agua (5 x 100 cm3) y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, para dar un aceite viscoso oscuro (6.33 g, 24.25 mmoles), el cual se cristalizó parcialmente después de reposar durante un período largo.

Paso B 7-metoxi-N-metil-4-fen¡l-esp¡rof2H-1-benzopiran-2,4'-piperidinal A una solución agitada de 7-metoxi-N-metilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (6.19 g, 23.72 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (80 cm3) bajo una atmósfera de nitrógeno anhidro, se añadió gota a gota una solución de bromuro de fenilmagnesio en tetrahidrofurano (40 cm3, 1.0 M, 40 mmoles), manteniendo la temperatura de reacción abajo de 30°C. Cuando la adición concluyó, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 horas, tiempo en el cual la reacción no había concluido, pero no estaba presente el reactivo de Grignard. Otra porción de bromuro de fenilmagnesio (13.3 cm3) se añadió cuidadosamente a la reacción, y se dejó agitando durante la noche. Se añadió agua (30 cm3), seguido de solución de cloruro de amonio acuoso saturado (30 cm3). Los materiales volátiles se removieron en vacío antes de que el material resultante se tratara con éter dietílico (100 cm3) y agua (100 cm3). La capa orgánica se separó antes de que la porción acuosa se extrajera después con éter dietílico (2 x 100 cm3). Los extractos combinados se lavaron con agua (3 x 100 cm3), se secaron sobre sulfato de sodio, y el éter se removió en vacío. El residuo se trituró con un poco de éter dietílico, y los cristales resultantes se aislaron mediante vacuofiltración (4.57 g, 12.15 mmoles, 51%). Este sólido se recogió entonces en alcohol etílico (75 cm3), y se trató con ácido clorhídrico (75 cm3, 2 N) antes de ser calentado a reflujo durante 1.5 horas. La solución se concentró bajo presión reducida hasta que un sólido comenzara a cristalizarse. La mezcla se enfrió entonces, y el sólido se aisló mediante vacuofiltración. Este se trató entonces con una mezcla de agua (300 cm3), solución de bicarbonato de potasio acuoso saturado (50 cm3) y éter dietílico (650 cm3), y se agitó. La capa acuosa se separó y se extrajo con éter dietílico (2 x 100 cm3) antes de que los extractos combinados se lavaran con agua (3 x 250 cm3), se secaron sobre sulfato de sodio, y los materiales volátiles se removieron en vacío para dar el compuesto del título (3.91 g, 12.18 mmoles, 51% de cetona).

Paso C 7-metoxi-4-fenilespiror2H-1-benzopiran-2.4'-piperidina1 A una solución agitada de 7-metoxi-N-metil-4-fenilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] (3.76 g, 11.71 mmoles) en 1 ,2-dicloropropano anhidro (150 cm3) se añadió carbonato de potasio (4.04 g, 29.23 mmoles), y la suspensión resultante se enfrió en un baño de hielo antes de ser tratada gota a gota con cloroformiato de 1-cloroetilo (1.58 cm3, 14.64 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche, y se añadió otra porción de cloroformiato de 1-cloroetilo (0.8 cm3, 7.4 mmoles) antes de que se calentara a reflujo durante otras 24 horas. Después de enfriamiento, la mezcla de reacción se filtró a través de algodón absorbente, que se lavó subsecuentemente con diclorometano (50 cm3), y los materiales volátiles se removieron en vacío. El intermediario resultante se trató con alcohol metílico (200 cm3), y la mezcla se calentó a reflujo durante la noche. Después de enfriamiento, los materiales volátiles se removieron en vacío, antes de que el sólido resultante se disolviera en una mezcla de diclorometano (150 cm3) y solución de carbonato de sodio acuoso (5%, 30 cm3). La capa orgánica se separó, se lavó con agua (2 x 50 cm3), se secó sobre sulfato de sodio, y el solvente se removió en vacío, para dar el compuesto del título como una goma (3.93 g).

Paso D 7-metoxi-4-fen¡lespiror2H-1-benzopiran-2,4'-p¡peridinl-1'-acetato de etilo A una solución de 7-metoxi-4-fenilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] (3.85 g, 12.54 mmoles) en N,N-dimetilformamida anhidra (75 cm3) se añadió carbonato de potasio (4.32 g, 31.30 mmoles), seguido de bromoacetato de etilo (1.39 cm3, 12.53 mmoles), y la mezcla se calentó a 100°C bajo nitrógeno durante 2 horas. La mezcla resultante se vertió en agua (600 cm3), y se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 cm3). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (3 x 300 cm3), se secaron sobre sulfato de sodio, y los materiales volátiles se removieron en vacío. Este producto crudo se purificó medíante cromatografía de columna (sílice, eluyendo con diclorometano-acetato de etilo-9: 1 a 4:1), dando el éster etílico puro (3.51 g, 71%).

Paso E Una mezcla de 7-metoxi-4-fenilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1 '-acetato de etilo (3.38 g, 8.60 mmoles), alcohol etílico (250 cm3) y solución de hidróxido de litio acuoso (2 N, 6.44 cm3, 12.88 mmoles), se calentó a reflujo durante 3.5 horas. Después de enfriamiento, la mezcla se trató con ácido clorhídrico (5 N, 70 cm3), y parte del alcohol etílico se removió hasta que empezara la precipitación. La mezcla se enfrió entonces a 4°C, hasta que concluyera la cristalización. El sólido se removió mediante vacuofiltración para dar el producto del título como un sólido de color blanco. p.f. 195-230°C. ESI (M + H)+ 366.4 de ion positivo. Se prepararon los siguientes compuestos en forma similar usando el derivado de 2'hidroxiacetofenona apropiado de fórmula II (esquema A) y reactivo de Grignard de fórmula IV (esquema B): EJEMPLO 2 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-clorofenil)espiror2H-1-benzopiran- 2,4'-piperidina] p.f.259-265°C. ESI (M + H)+ 370.0 de ion positivo.

EJEMPLO 3 4-(4-fluorofenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-pi eridin1-1'-acetato de litio Esta sal de litio se preparó en forma análoga al procedimiento descrito en el ejemplo 1 (paso E), excepto que la hidrólisis del éster etílico se llevó a cabo usando 1.02 equivalentes molares de solución de hidróxido de litio acuoso (2.0 N), y cuando la reacción concluyó, los materiales volátiles se removieron en vacío. p.f.285-291°C (descomposición). ESI (M + H)+ 354.2 de ion positivo.

EJEMPLO 4 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-(4-metilf en i Des piror2H-1 -be nzo piran - 2,4'-piperidina1 p.f.247-249°C. ESI (M + H)" 352.2 de ion positivo.

EJEMPLO 5 6-fluoro-4-fenilesp¡ror2H-1-benzopiran-2,4'-p¡peridinl-1 '-acetato de litio p.f.293-298°C (descomposición). ESI (M + H)+ 354.2 de ion positivo.

EJEMPLO 6 Clorhidrato de 1 '-ca rboximeti I -6-metil-4-f en Mesp¡ror2 H-1-benzopira n- 2,4'-piperidina1 p.f.240-244°C. ESI (M + H)+ 350.2 de ion positivo.

EJEMPLO 7 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -7-f I uoro-4-f en i I es piro T2H-1 -benzo piran - 2,4'-p¡peridina1 p.f.237-242°C. ESI (M + H)+ 354.2 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 8 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-cloro-3-fluorofenil)espiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.263-274°C. ESI (M + H)+ 388.2 de ion positivo.

EJEMPLO 9 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-(1 -naf ti I les piro T2H-1 -benzo piran -2,4'- piperidinal p.f.237-252°C. ESI (M + H)+ 385.9 de ion positivo.

EJEMPLO 10 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil-4-(2-nafti hespí ro|"2H-1 -benzopiran-2, 4'- piperidinal p.f.253-264°C. ESI (M + H)+ 386.2 de ion positivo.

EJEMPLO 11 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluoro-4-metoxifenil)espiror2H-1- benzop¡ran-2,4'-piperidina1 p.f.252-261°C. ESI (M + H)+ 384.2 de ion positivo.

EJEMPLO 12 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-ter-butilfenil)espiror2H-1- benzopiran-2.4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 392.2 de ion positivo.

EJEMPLO 13 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluorofenil)espiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperídina1 ESI (M + H)+ 354.4 de ion positivo.

EJEMPLO 14 Clorhidrato de 4-(1,3-benzodioxolo)-1'-carboximetilespiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.260-265°C. ESI (M + H)+ 380.4 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 15 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,4-dimetilfenil)espiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.224-234°C. ESI (M-H)" 361.9 de ion positivo.

EJEMPLO 16 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,4-diclorofenil)espiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperid¡na1 ESI (M + H)+ 404.0 de ion positivo.

EJEMPLO 17 Clorhidrato de 1 '-carboxi metí l-4-(3, 4-d ¡metoxif en i Hespí rof2H-1 - benzopiran-2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 396.2 de ion positivo.

EJEMPLO 18 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,4,5-trifluorofenil)espiror2H-1- benzop¡ran-2,4'-piperid¡na1 p.f.242-250°C. ESI (M + H)+ 390.1 de ion positivo.

EJEMPLO 19 Clorhidrato de 1'-carboximetil-7-fluoro-4-(4-metilfenil)espiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f. 153-163°C. ESI (M + H)+ 368.0 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 20 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-metoxifenil)espiror2H-1- benzopiran-2,4'-piper¡dina1 ESI (M-H)" 399.6 de ion positivo.

EJEMPLO 21 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3-clorofen i Des piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 370.2 de ion positivo.

EJEMPLO 22 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3-metoxifenil)espiror2H-1 - benzopiran-2,4'-piper¡d¡nal ESI (M + H)+ 366.4 de ion positivo.

EJEMPLO 23 Clorhidrato de 1 '-carboximetil -4-(3-metilf en i Des piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 350.0 de ion positivo.

EJEMPLO 24 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-|"4-(N, N-di metilam i no)fen i Hespí roT2H- 1 -benzopi ran-2,4'-piperid i nal Se preparó este compuesto de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 1, excepto que en el paso final E, la reacción de hidrólisis se llevó a cabo con 1.5 equivalentes de solución de hidróxido de sodio acuoso (1 M). Cuando la reacción concluyó, la mayor parte del alcohol etílico se removió, y los cristales resultantes se recogieron mediante filtración. Este sólido se trató con un exceso de cloruro de hidrógeno metanólico durante 1 hora a temperatura ambiente. El alcohol metílico se removió en vacío, y el producto se trató con 2-propanol-metanol (1:1), y se añadió gota a gota éter dietílico hasta que el producto se precipitara. Se aisló mediante filtración, y se secó. p.f.238-250°C. ESI (M + H)+ 379.4 de ion positivo.

EJEMPLO 25 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-(4-etilf en i Des piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 364.4 de ion positivo.

EJEMPLO 26 Clorhidrato de 4-(4-bif en i D-1 '-carboxi meti les piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 412.2 de ion positivo.

EJEMPLO 27 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(4-fenoxifen¡Pespiror2H-1 benzopiran-2,4'-piper¡d¡na1 ESI (M + H)+ 428.2 de ion positivo.

EJEMPLO 28 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3-fluoro-4-metilfeniPespiror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 368.2 de ion positivo.

EJEMPLO 29 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-7-cloro-4-fenilespiro r2H-1 -benzopiran- 2.4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 370.2 de ion positivo.

EJEMPLO 30 Clorhidrato de 1 ' -carboxi metil-6-cloro-4-f en i les piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-piperid¡na1 ESI (M + H)+ 370.2 de ion positivo.

EJEMPLO 31 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -7-cloro-4-(4-etilf en i Des piror2H-1 - benzopi ran -2, 4' -pi er id i nal ESI (M + H)+ 398.2 de ion positivo.

EJEMPLO 32 Clorhidrato de 1 ' -carboxi metí I -7-cloro-4-(4- ropil en i Des piror2H-1 benzopi ran-2,4'-p¡ peri di nal ESI (M + H)+ 412.2 de ion positivo.

EJEMPLO 33 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(2,2-difluoro-1 ,3- benzodioxolo)espiror2H-1 -benzopi ran -2,4'-piperid i nal p.f. 248-250°C. ESI (M + H)+ 416.2 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 34 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(2,3,5-trifluorofeniPespiror2H-1 benzopi ran-2,4'-pi peri di nal p.f. 206-210°C. ESI (M + H)+ 390.4 de ion positivo.

EJEMPLO 35 Clorhidra to de 1 '-carboxi ¡metil-7-cl oro- 4-(3-fluoro-4- metilfen ¡Desp iror2H-1-b enzopiran -2,4 '-piper idi ¡nal ESI (M + H)+ 402.3 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 36 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-metoxifeniPespiror2H- 1 -benzopi ran -2, 4' -pi peri di nal ESI (M + H)+ 402.2 de ion positivo. Se preparó 4-Bromo-2,6-difluoroanisol, el material de partida para la preparación del reactivo de Grignard de acuerdo con la fórmula IV (esquema B), a partir de 4-bromo-2,6-difluorofenol. A una solución del fenol (49.0 g, 234 mmoles) en acetona anhidra (980 cm3), se añadió yoduro de metilo (29.4 cm3, 468 mmoles), seguido de carbonato de potasio (80.85 g, 585 mmoles). La mezcla agitada se calentó a reflujo durante 2 horas antes de que se dejara enfriar. El sólido se filtró, y el producto filtrado se evaporó en vacío. El residuo se recogió en éter dietílico (1000 cm3), y la solución se lavó con agua (3 x 300 cm3), se secó (Na2SO ), y el éter se removió en vacío, para dar el producto crudo el cual se usó para preparar el reactivo de Grignard deseado sin purificación adicional (49.4 g, 222 mmoles, 95%).

EJEMPLO 37 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(4-dimetilamino-3- fluorofeniPespiror2H-1 -benzop¡ran-2,4'-piperidina1 p.f. 231 -239°C. ESI (M + H)+ 397.4 de ion positivo.

EJEMPLO 38 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4- dimetilam¡nofen¡Despiror2H-1 -benzopiran-2,4'-p¡peridinal p.f. 231 -242°C. ESI (M + H)+ 415.0 de ¡ón positivo.

EJEMPLO 39 Clorhidrato de 4-(4-bromo-3-fluorofeniP-1 '-carboximetilespiror2H-1 benzopi ran -2,4'-piperid i nal ESI (M + H)+ 432.5 de ion positivo.

EJEMPLO 40 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3-bromo-4-metoxifen¡Pes iror2H-1 benzopi ran-2,4'-piperid i nal ESI (M + H)+ 444.1 de ion positivo.

EJEMPLO 41 Clorhidrato de 1' -carboximetil -4-(3, 5-dif luorof en i Des piror2H-1 benzopi ran-2,4'-p¡ peri di nal p.f.230-264°C. ESI (M + H)+ 372.2 de ion positivo.

EJEMPLO 42 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-etoxifeniPespiror2H-1 benzopi ran -2, 4' -piper id i nal Paso A Bromhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-hidroxifenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidinal Una mezcla del éter metílico (2.35 g) en ácido acético (15 cm3) y ácido bromhídrico a 47%, se agitó a 120°C durante 40 horas. La suspensión resultante se enfrío en un baño de hielo antes de que se añadiera agua (30 cm3). El sólido se removió mediante filtración, y se lavó con ácido acético y entonces con agua antes de ser secado en vacío.

Paso B (3,5-difluoro-4-h¡droxifenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4' piperidin1-1'-acetato de etilo Se suspendió bromhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-hidroxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] (1.7 g; preparado como se describe en el paso A) en una solución de cloruro de hidrógeno en alcohol etílico (129 cm3), y la mezcla se calentó a reflujo durante 16 horas. Después de enfriamiento, los materiales volátiles se removieron en vacío para dar un residuo sólido, el cual se separó entre acetato de etilo (100 cm3) y una combinación de agua (100 cm3) y bicarbonato de potasio acuoso saturado (30 cm3). La capa acuosa se extrajo en acetato de etilo (2 x 50 cm3) antes de que los extractos combinados se lavaran con agua (2 x 50 cm3) y se secaran (Na2SO4). El material crudo se filtró entonces a través de sílice usando acetato de etilo como eluyente, y se evaporó entonces para dar el producto sólido (1.54 g).

Paso C (3, 5-dif I uoro-4-etoxifenil)espirof2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperidinl-1'-acetato de etilo A (3,5-difluoro-4-hidroxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1 '-acetato de etilo (350 mg), carbonato de cesio (412 mg) y yoduro de sodio (13 mg), se añadió N,N-dimet¡lformamida (9 cm3), seguido de yodoetano (1.7 equivalentes molares). Las mezclas resultantes se calentaron a 65°C con agitación durante 3 horas. Después de enfriamiento, la reacción se diluyó con acetato de etilo (90 cm3), se lavó entonces con agua (5 x 35 cm3), y se secó (Na2SO ). Esta solución de material crudo se filtró entonces a través de una almohadilla de sílice antes de que el solvente se removiera en vacío, para dar el producto en un estado homogéneo.

Paso D Preparado a partir de (3,5-difluoro-4-etoxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1'-acetato de etilo de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1. Clorhidrato de 1 '-ca rboximetil-4-(3, 5-dif luo ro-4-etoxifenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 416.5 de ion positivo. Preparados también mediante este método fueron: EJEMPLO 43 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-d¡fluoro-4-n- propoxifenil)es ¡ror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 430.3 de ion positivo.

EJEMPLO 44 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-n- butoxifenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piper¡dina1 ESI (M + H)+ 444.4 de ion positivo.

EJEMPLO 45 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-benciloxi-3.5- d ifl uorofen i Des piror2H-1 -benzopi ran-2,4'-pi peri di nal ESI (M + H)+ 478.0 de ion positivo.

EJEMPLO 46 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-iso- penti loxif en i Pespiror2H-1 -benzopi ran -2, 4' -piper id i nal p.f.211-215°C. ESI (M + H)+ 458.5 de ion positivo.

EJEMPLO 47 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil-4-(4-etoxi -3-f I uorofen i Des piror2H-1 - benzopi ran-2,4'-piperid i nal ESI (M + H)+ 398.2 de ion positivo.

EJEMPLO 48 Clorhidrato de 1,-carboximetil-4-(3-fluoro-4-n-pro oxifeniPes iror2H- 1 -benzopi ran -2, 4' -pi peri di nal ESI (M + H)+ 412.0 de ion positivo.

EJEMPLO 49 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil-4-(3-fluoro-4-n-butoxifen i Des piror2H-1 benzopiran-2,4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 426.1 de ion positivo.

EJEMPLO 50 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil-4-(4-benciloxi-3-f I uorofen i Des piroT?H - 1 -benzopi ran -2, 4' -pi pendí nal ESI (M + H)+ 460.3 de ion positivo.

EJEMPLO 51 Clorh idra to de 1 '-carboxi imetil- 4-(3 -fluoro-4- iso P entiloxi ifen ¡Desp iror2H-1 -b enzop irán -2,4' -piperidi nal ESI (M + H)+ 440.2 de ion positivo.

EJEMPLO 52 Clorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(3-fluoro-4- metoxietoxifeniPespiror2H-1 -benzopiran-2.4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 428.2 de ion positivo.

EJEMPLO 53 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluoro-4-iso- buti loxif en i Des piror2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperid i nal ESI (M + H)+ 425.8 de ion positivo.

EJEMPLO 54 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-r3-fluoro-4- metoxibenciloxpfenipespiror2H-1-benzopiran-2.4'-piperidina1 ESI (M + H)+ 490.0 de ion positivo.

EJEMPLO 55 Clorhidrato de 4-(4-al i loxi -3,5-dif I uorofen i P-1 '-carboxi metilespirofSH • 1 -benzopi ran-2,4'-p¡ peri di nal Paso A N-bencil-4-(3,5-difluoro-4-aliloxifenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidinal Se añadió gota a gota bromuro de arilo (1.1 equivalentes molares) a una mezcla de N-bencil-4-(3,5-difluoro-4-hidroxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperid¡na] (750 mg, 1.79 mmoles; preparada de acuerdo a los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 42), carbonato de cesio (1.1 equivalentes molares) y N,N- dimetilformamida anhidra (15 cm3). Después de agitación durante 2 horas a temperatura ambiente, no quedó material de partida alguno. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 cm3) y se trató con agua (100 cm3), y la capa acuosa se separó y se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 25 cm3). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (4 x 100 cm3) antes de ser secados (Na2SO ), y los materiales volátiles se removieron en vacío, para dar el material deseado con alta pureza (60%).

Paso B 4-(3,5-difluoro-4-aliloxifenil)espiror2H-1-benzop¡ran-2.4'-piperidinal Se llevó a cabo la desbencilación de acuerdo al paso C del ejemplo 1 con las siguientes excepciones: se usó diclorometano como solvente (el cual no se secó específicamente), y las reacciones no se llevaron a cabo bajo una atmósfera inerte. En algunos ejemplos, la degradación del carbamato intermediario fue ineficaz cuando se calentó a reflujo en presencia de alcohol metílico. En dichos casos, se requirió la adición de un exceso de hidróxido de potasio acuoso a 10 N con calentamiento a reflujo durante la noche. A partir de este punto, la amina fue convertida hasta el compuesto final de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 1. p.f.221-225°C. ESI (M + H)+ 428.2 de ion positivo.

EJEMPLO 56 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4-iso- propiloxifeniPespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.241-243°C. ESI (M + H)+ 430.3 de ion positivo.

EJEMPLO 57 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4- propargiloxifeniPespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.211-217°C. ESI (M + H)+ 426.1 de ion positivo.

EJEMPLO 58 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3.5-difluoro-4-ciclopropi I metoxif en i Des piror2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperid i nal p.f.225-231°C. ESI (M + H)+ 442.0 de ion positivo.

EJEMPLO 59 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3,5-difluoro-4- trifluoroetox¡feniPesp¡ror2H-1-benzop¡ran-2,4'-pi eridina1 p.f.244-251°C. ESI (M + H)+ 470.2 de ion positivo.

EJEMPLO 60 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluoro-4-iso- prop¡loxifeniPespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperid¡na1 p.f. > 260°C. ESI (M + H)+ 412.4 de ion positivo.

EJEMPLO 61 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluoro-4- trifluoroetoxifeniPespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 p.f.230-235°C. ESI (M + H)+ 452.2 de ion positivo.

EJEMPLO 62 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(3-fluoro-4-fenoxifeniPespiror2H-1 benzopi ran-2,4'-piperid i nal p.f. 160-180°C. ESI (M + H)+ 446.0 de ion positivo.

EJEMPLO 63 4-fenilespiro r2H-1-benzopiran-2,4'-piper¡din1-1 '-acetato de litio p.f.280-281°C . ESI (M + H)+ 336.2 de ion positivo.

EJEMPLO 64 4-(4-trif luorometilf en i Des piror2H-1 -benzopi ran -2,4'-pi peri di ni -1'- acetato de litio ESI (M-Li+2H)+ 404.4 de ion positivo.

EJEMPLO 65 -(4-eti Ifen i Despiror2H-1 -benzopi ran-2, 4' -piperíd i nl-1 '-acetato de etilo p.f. 119-121°C. ESI (M + H)+ 392.3 de ion positivo.

EJEMPLO 66 4-(4-eti If en i Des piror2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperid i nl-1' -acetato de fenilo p.f. 104-105°C. ESI (M + H)+ 440.3 de ion positivo.

EJEMPLO 67 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-(4-¡so-penti loxif en i Des piror2H-1 - benzopi ran-2,4'-piperid i nal ESI (M + H)+ 422.0 de ion positivo.

EJEMPLO 68 r4-(2-piridinometiloxDfeninespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin1-1'- acetato de sodio Preparado de acuerdo al ejemplo 42 usando clorhidrato de 2-picolilcloruro. La hidrólisis final se llevó a cabo de acuerdo al ejemplo 1, excepto que se usó hidróxido de sodio. ESI (M + H)+ 443.4 de ion positivo.

EJEMPLO 69 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-r4-(4- metilfenilsulfoniloxpfen¡pespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 Paso A Ester etílico de 1 '-carboximetil-4-r4-(4-metilfen¡lsulfoniloxi)fenin-espiroí2H-1-benzopiran-2,4'piperidinal A una mezcla de (4-hidroxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1 '-acetato de etilo (182 mg, 0.5 mmoles; preparado de acuerdo al ejemplo 42), diclorometano (13 cm3) y piridina (158 mg, 2.0 cm3) siendo agitada a -5°C, se añadió cuidadosamente una solución de cloruro de p-toluensulfonilo (288 mg, 1.5 mmoles) en diclorometano (13 cm3). Se dejó entonces que la reacción alcanzara la temperatura ambiente, se agitó durante otras 2 horas, y entonces la solución se dejó reposar durante la noche. Se añadió agua (7 cm3) a la mezcla, y después de agitación durante 10 minutos, el solvente se evaporó para dar el producto como una goma, la cual se solidificó en reposo. Esta se separó con una espátula, se filtró y se lavó con agua (20 cm3). La torta se succionó casi seca, y se secó entonces finalmente en vacío a 65°C, para dar el producto (300 mg). (M + H)+ = 534.2 m/z. Este éster fue hidrolizado de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1, excepto que la hidrólisis se llevó a cabo en n-butanol. ESI (M + H)+) 506.2 de ion positivo.

EJEMPLO 70 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil-8-f I uoro-4-f en i les piror2H-1 -benzopi ran- 2.4'-piperidina1 Cuando la 2'-hidroxiacetofenona de partida requerida no está disponible comercialmente, se puede preparar como se describe a continuación: Paso A Acetato de (2-fluorofenilo) Se añadió gota a gota anhídrido acético (81 cm3, 856 mmoles) a una mezcla agitada de 2-fluorofenol (60.0 g, 535 mmoles) e hidróxido de sodio acuoso (4 N, 214 cm3, 856 mmoles) a 0°C. Después que la reacción había sido agitada durante 30 minutos, la capa acuosa se separó de la porción orgánica y se lavó con diclorometano (150 cm3). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución de hidróxido de sodio acuoso (4 N, 150 cm3) y entonces con salmuera (100 cm3). La fase orgánica se secó (Na2SO4), y el solvente se evaporó en vacío, para dar el compuesto del título (84.9 g, > 100%).

Paso B 2'-hidroxi-3'-fluoroacetofenona Se añadió tricloruro de aluminio (32.0 g, 239 mmoles) finamente pulverizado a acetato de (2-fluorofenilo) (23.0 g, 149 mmoles), y la mezcla se calentó a 180°C durante 1 hora. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió cuidadosamente en hielo/agua, y el producto se extrajo en diclorometano (150 cm3). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (150 cm3) y se secó (Na2SO4), y el solvente se removió en vacío. La mezcla de reacción cruda se purificó mediante cromatografía de columna (gel de sílice, diclorometano-alcohol metílico 99:1), para dar el compuesto del título (3.1 g, 14%).

A partir de este punto, la acetofenona fue convertida hasta el compuesto final de acuerdo a los procedimientos descritos en el ejemplo 1. p.f. 180-182°C. ESI (M + H)+ 354.0 de ion positivo. Preparados también de acuerdo a esta vía fueron: EJEMPLO 71 Clorhidrato de 1'-carboximetil-7-cloro-6-fluoro-4-fenilespiror2H-1 benzopi ran-2,4'-pi peri di nal p.f.275-293°C. ESI (M + H)+ 387.7 de ion positivo.

EJEMPLO 72 Clorhidrato de 1 '-carboxi metí I -5-f I uoro-4-f en i les piror2H-1 -benzopi ran- 2,4'-píperid¡na1 La 2'-hidroxiacetofenona de partida requerida no se pudo obtener comercialmente, y se tuvo que preparar por lo tanto como se describe a continuación: Paso A 2'-fluoro-6'-metoxiacetofenona Una mezcla de 2-fluoro-6-metoxibenzonitrílo (15.94 g, 105.5 mmoles) y una solución de yoduro de metilmagnesio en éter dietílico (3 M, 46.0 cm3, 137 mmoles) se calentó a 100°C durante 18 horas. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, se añadió ácido clorhídrico acuoso (3 M, 94 cm3), y la mezcla se calentó a reflujo durante 4 horas. Cuando la reacción se había enfriado a temperatura ambiente, la capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 cm3). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (100 cm3) antes de ser secados (Na2SO4). El solvente se removió en vacío, para dar el compuesto del título como un aceite (117.7 g, 100%).

Paso B 2'-fluoro-6'-hidoxiacetofenona Una solución de tribromuro de boro en diclorometano (69.0 cm3, 69.6 mmoles) se añadió gota a gota durante un período de 25 minutos, a una solución de 2'-fluoro-6'-metoxiacetofenona (17.72 g, 105.5 mmoles) en diclorometano (150 cm3) a -78°C. Después de dejar que la reacción se calentara a 0°C, se extinguió con agua (100 cm3), y el producto se extrajo en diclorometano (100 cm3). La solución orgánica se lavó con agua (100 cm3), salmuera (150 cm3), y se secó entonces (Na2SO ). La evaporación del solvente en vacío dio el producto crudo, el cual se usó sin purificación adicional. A partir de este punto, la acetofenona fue convertida hasta el compuesto final de acuerdo a los procedimientos descritos en el ejemplo 1 p.f.252-254°C. ESI (M + H)+ 354.2 de ion positivo.

EJEMPLO 73 Clorhidrato de 1 '-carboxi metil -4-r4-(2-etoxim orf ol i no)f en i Hespí ror2H- 1 -benzopi ran-2,4'-piperid i nal Preparado de acuerdo a los métodos descritos en el ejemplo 42, alquilando el fenol apropiado con clorhidrato de 4-(2-cloroetil)morfolina. ESI (M+2H)+ 465.2 de ion positivo.

EJEMPLO 74 Clorhidrato de 1'-carboximetil-6-hidroxi-4-fenilespiro T2H-1- benzopiran-2,4'-piperidina1 Preparado de acuerdo a los métodos descritos en los ejemplos 1 y 42. ESI (M + H)+ 352.2 de ion positivo.

EJEMPLO 75 Clorhidrato de 1'-carboximetil-7-metiltio-4-fenilespiro T2H-1- benzopiran-2,4'-piper¡dina1 Paso A 7-fluoro-N-metilespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidinl-4(3H)-ona Una solución agitada de 4'-fluoro-2'-hidroxiacetofenona (15.97 g,), 1-metil-4-piperidona (12.74 cm3) y pirrolidina (4.325 cm3) en alcohol metílico (250 cm3), se calentó a reflujo bajo nitrógeno. Después de 0.5 horas, se añadió más pirrolidina (4.33 cm3), y después de otras 0.5 horas, se dejó que la solución se enfriara. Se evaporó entonces la mezcla de reacción bajo presión reducida para dar un aceite, el cual se disolvió en diclorometano (400 cm3). Esta solución se lavó con agua (3 x 400 cm3), se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar un aceite (25.7 g). La cromatografía de vaporización instantánea sobre sílice (eluyendo con diclorometano-alcohol metílico-amoníaco acuoso a 33% = 380:20:1), dio el producto purificado como un aceite (14.41 g).

Paso B 7-metilt¡o-N-metilespíror2H-1-benzo iran-2,4'- iperid¡nl-4(3H)-ona A una solución agitada de 7-fluoro-N-metilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (4.54 g) en dimetilformamida (20 cm3) bajo nitrógeno, se añadió tiometóxido de sodio (1.40 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1.25 horas, a 60°C durante 4.5 horas y se dejó entonces enfriar, y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente. Se agitó y se calentó a 130°C durante 2.5 horas, se dejó entonces enfriar y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente antes de ser vertida en agua agitada (140 cm3). El producto sólido se filtró, se lavó con agua y se disolvió en diclorometano. La solución se secó (Na2SO ), y se evaporó para dar el producto como una goma (4.44 g). A partir de este punto, la 7-metiltio-N-metilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona fue convertida hasta el compuesto final de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1, con la siguiente excepción: en la realización del paso de desmetilación, la amina secundaria requerida fue convertida inesperadamente en un compuesto menos polar, el cual se trató con hidróxido de potasio acuoso (10 N) en alcohol metílico a reflujo, para regenerar la amina requerida. (M + H)+ = 382.0.

EJEMPLO 76 Clorhidrato de 1 '-carboximetil -4-(4-trif luorometoxif en i Des piror2H-1 - benzopi ran -2,4'-piperid i nal Paso A Ester de 4-ri'-fenilmetil-espiro(2H-1-benzopiran-2,4' piperidina)! de ácido trifluorometansulfónico A una solución agitada y enfriada (-78°C) de la N-bencilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperid¡n]-4(3H)-ona (1.54 g, 5 mmoles; preparada como en el ejemplo 1) en tetrahidrofurano seco (40 cm3), se añadió gota a gota hexametíldisilazida de litio (solución a 1 M en hexano, 7.5 cm3, 7.5 mmoles) durante un período de aproximadamente 5 minutos. Después de agitación a esa temperatura durante 1 hora, la N-feniltrifluorometano sulfonamida (2.68 g, 7.5 mmoles) se añadió en una porción, y la mezcla de reacción resultante se dejó agitando y se calentó lentamente durante la noche. La reacción se extinguió con agua (10 cm3) y se extrajo en acetato de etilo (2 x 50 cm3). La porción orgánica se lavó con cloruro de amonio acuoso saturado (50 cm3), cloruro de sodio acuoso saturado (50 cm3) y agua (50 cm3), antes de ser secada (Na2SO4) y concentrada. El producto se purificó mediante cromatografía de columna sobre sílice (3:1 heptano-acetato de etilo), para dar el material deseado (1.75 g, 80%), el cual se usó de inmediato o se almacenó bajo una atmósfera inerte a -20°C.

Paso B N-benc¡ l-4-(4-trif l uorometoxifen i Hes iros H-1 -benzopi ra n-2,4'- i eridin1-4(3H)-ona Una mezcla de 4-(fenil-4-trifluorometilsulfonato) de {N-bencilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina]} (1.69 g, 3.68 mmoles), ácido 4-trifluorometoxibencenborónico (1.25 equivalentes), dimetoxietano (40 cm3), cloruro de litio (2.5 equivalentes), tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (2.5% en moles) y solución de carbonato de sodio acuoso a 2 N (2 equivalentes), fue calentada a reflujo durante 12 horas. Después de enfriamiento, la mezcla se trató con agua (75 cm3) y acetato de etilo (75 cm3). Después de agitación, la capa orgánica se separó y se lavó con agua (2 x 100 cm3), se secó (Na2SO4), y el solvente se removió para dar el producto deseado (96%), el cual se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.

A partir de este punto, la N-bencil-4-(4-trifluorometoxifenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona fue convertida hasta el compuesto final de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1. p.f.233-237°C. (M + H)+ = 420.2.

EJEMPLO 77 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-(4-metiltiofeniPespiror2H-1 benzopi ran-2,4'-piperid i nal Preparado de acuerdo a los métodos descritos en el ejemplo 76. ESI (M + H)+ 352.2 de ion positivo.

EJEMPLO 78 Clorhidrato de 1'-carboximetil-4-r4-(N-metil-N- metilsulfonamido)fenip-espiror2H-1-benzopiran-2,4'-pi eridina1 Paso A 4-(4-h¡droxifenil)espiror2H-1-benzop¡ran-2,4'-piperidin1-1 '-acetato de etilo A una mezcla de 1 '-acetato de 1 '-carboximetil-4-(4-hidroxifenil)esp¡ro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] (432 mg, 1 mmol, preparado de acuerdo al ejemplo 42), carbonato ácido de sodio (176 mg, 2.1 mmoles) en N,N-dimetilformamida seca (25 cm3), se añadió yoduro de etilo (0.088 cm3, 1.1 mmoles), y la mezcla se calentó a 80°C durante 2 horas. Después de enfriamiento, se diluyó con acetato de etilo (100 cm3), y se lavó con agua (5 x 100 cm3). La solución orgánica se secó entonces sobre sulfato de sodio antes de que se removiera el solvente en vacío. El material crudo se hizo pasar entonces a través de una almohadilla pequeña de sílice, primero con diclorometano (el cual se desechó) y después con acetato de etilo. El solvente se removió para dar el producto deseado (194 mg, 51%).

Paso B Ester ( 1 '-carboxi metí l-4-fen i lespiror2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperidinl etílico) de ácido trifluorometansulfónico A una suspensión agitada y enfriada (-20°C) de 4-(4-hidroxifenil)esp¡ro[2H-1-benzopiran-2,4'-piper¡d¡n]-1'-acetato de etilo (158 mg, 4.16 x 10"4 moles) en diclorometano anhidro (10 cm3) bajo una atmósfera inerte, se añadió trietilamina (0.065 cm3, 4.6 x 10"4 moles). Después de 10 minutos, se añadió gota a gota durante un período de aproximadamente 5 minutos, una solución de anhídrido trifluorometansulfónico (0.077 cm3, 4.6 x 10"4 moles) en diclorometano (7.7 cm3). Durante los siguientes 20 minutos aproximados, el material sólido desapareció. Sin embargo, el análisis mediante cromatografía de capa delgada reveló que la reacción no había concluido, de modo que se añadió otra porción del anhídrido trifluorometansulfónico (0.25 equivalentes). Después de alrededor de otros 20 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (60 cm3), y entonces se lavó con agua (3 x 60 cm3) antes de ser secada (Na2SO ), y el solvente se removió en vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna sobre sílice (3:1 díclorometano-aceto de etilo), para dar el material deseado (154 mg, 75%).

Paso C Ester etílico de ácido 4-í4-(difenilim¡no)fenillespirof2H-1-benzopiran-2,4'- iperidin1-1-acético Se preparó el compuesto del título mediante una modificación del procedimiento de Buchwald et al., Tetrahedron Letters, 1997, 38, 6367. A una solución de éster {1 '-carboximetil-4-fenilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin] etílico} de ácido trifluorometansulfónico (421 mg, 8.43 x 10"4 moles) en tetrahidrofurano seco (25 cm3), siendo agitada a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno seco, se añadió benzofenona imina (1.2 equivalentes, 0.283 cm3). Esto fue seguido de la adición de acetato de paladio (1.25% en moles), (R)-(+)-2,2'-bis(difeni[fosfino)-1 ,1 '-binaftilo (3.75% en moles) y carbonato de cesio (1.40 equivalentes, 385 mg). La mezcla se calentó a reflujo durante 24 horas, antes de dejar que se enfriara a temperatura ambiente. Se diluyó entonces con éter dietílico (250 cm3) (no seco), se filtró a través de una almohadilla de auxiliar de filtro, y entonces los materiales volátiles se removieron en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna sobre sílice (1:1 heptano-acetato de etilo), para dar el material deseado (547 mg; contaminado con benzofenona imina).

Paso D 4-(4-aminofenil)espiror2H-1-benzop¡ran-2,4'-p¡perid¡n1-1 '-acetato de etilo Se preparó el compuesto del título de acuerdo al procedimiento de Buchwald et al., Tetrahedron Letters, 1997, 38, 6367. A una solución agitada de 4-(4-benzofenona i mi nofen i l)espiro[2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperid i n]-1 '-acetato de etilo (542 mg, 1 mmol) en alcohol metílico (25 cm3), se añadió acetato de sodio (198 mg, 2.4 mmoles), seguido de clorhidrato de hidroxilamina (125 mg, 1.8 equivalentes), y se dejó agitando la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se removió el alcohol metílico en vacío antes de que el residuo se separara entre diclorometano (25 cm3) y solución de hidróxido de sodio acuoso (0.1 M, 25 cm3). La capa orgánica se aisló, y los materiales volátiles se removieron en vacío antes de que el producto se purificara mediante cromatografía de columna (sílice, acetato de etilo) (220 mg, 69% a partir de triflato).

Paso E 4-(met¡ l-4-fen i Isulfonam ida)espiror2H-1 -benzopi ran-2,4'-piperidinl-1 '-acetato de etilo Se preparó el compuesto del título de acuerdo al procedimiento de R. J. Sundberg et al., Journal of Organic Chemistry, 1984, 49, 249. Se dejó agitando un matraz que contenía una mezcla de 4-(4-aminofenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1'-acetato de etilo (214 mg, 0.566 mmoles), piridina (3 equivalentes, 0.137 cm3) y diclorometano anhidro (10 cm3) en un baño de hielo/alcohol metílico. Después de 10 minutos a esta temperatura, se añadió gota a gota durante un período de aproximadamente 5 minutos, una solución de cloruro de metansulfonilo (1.5 equivalentes, 0.066 cm3) en diclorometano seco (0.66 cm3). Después de agitación durante 2 horas, la mezcla de reacción se vertió sobre una solución acuosa saturada de carbonato ácido de potasio (10 cm3). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 50 cm3), y el solvente se removió en vacío. Se añadió tolueno (30 cm3), y entonces se removió en vacío (esto se repitió hasta que cesara el olor de la piridina), y entonces se añadió alcohol metílico (30 cm3), el cual se removió. El material restante era homogéneo (234 mg, 91%).

Paso F 4-(meti l-4-fen i l-N-metilsulfonam id a)espiroí2H-1 -benzopi ran- 2, 4'-piperidin11 '-acetato de etilo A una solución de 4-(metil-4-fenilsulfonamida)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1'-acetato de etilo (108 mg, 0.236 mmoles) en alcohol metílico (10 cm3), se añadió una solución de trimetilsilil diazometano (2 M en hexanos, 5 cm3) en ausencia de agitación.

Inmediatamente después de la adición, se observó la evolución de nitrógeno. Después de reposar durante 1 hora a temperatura ambiente, los materiales volátiles se removieron en vacío antes de que el residuo se purificara mediante cromatografía de columna (sílice, acetato de etilo), para dar el producto homogéneo (74 mg, 67%).

Clorhidrato de 1 ' -carboxi met i l-4-( N-met i l-4-fen il-N -metilsulf o nam¡da)-espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piper¡d¡n al A partir de este punto, la síntesis procedió de acuerdo al método descrito en el ejemplo 1. ESI (M + H)+ = 443.2 de ion positivo.

EJEMPLO 80 Diclorhidrato de 1 '-carboximetil-4-(4-am¡no-3,5- difluorofeniPes iror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina1 Se preparó (4-bromo-2,5-difluorofenil)-2,5-dimetilpirrol de acuerdo al procedimiento de Bruekelmann et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1984, 2801. Este material fue convertido al reactivo de Grignard correspondiente, y se dejó reaccionar con N-metilespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona de acuerdo al ejemplo 1, excepto que se obtuvo una mezcla no resuelta del pirrol y la anilina desprotegida. Esta mezcla fue N-desalquilada como se describe en el ejemplo 1 (junto con la desprotección concomitante de la función anilina), para dar 4-(4-amino-3,5-d¡fluorofenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina]. La amina resultante fue alquilada entonces con bromoacetato de etilo, y el éster resultante fue hidrolizado de acuerdo al ejemplo 1. ESI (M + H)+ 387.1 de ion positivo.

EJEMPLO 81 Clorhidrato de 1 '-car boxim etil-3, 4-dihidro-4-(4-m etil fe ni Despiro T2H-1 - benzopiran-2,4'-piperidina1 Paso A 3,4-dihidro-4-(4-metilfenil)espiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin1-1'-acetato de etilo A una solución de 4-(4-metilfenil)espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-1'-acetato de etilo (730 mg, 0.194 mmoles) en alcohol etílico (125 cm3), se añadió paladio sobre carbono a 10%. Esta mezcla se calentó a 40°C durante 7 horas bajo una atmósfera de hidrógeno (4 bars), y se filtró entonces mientras estaba aún caliente, y la torta del filtro se lavó con alcohol etílico caliente (3 x 50 cm3). El solvente se removió en vacío, y el compuesto resultante se recristalizó a partir de alcohol etílico (67%). Este éster fue hidrolizado de acuerdo al procedimiento del ejemplo 1. p.f.247-249°C. (M + H)+ = 352.2. Preparados también mediante este método fueron: EJEMPLO 82 3,4-d¡hidro-4-(4-fluorofeniPespiror2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin1-1'- acetato de litio p.f.274-278°C (descomposición). ESI (M-L¡)" 354.4.0 de ion negativo.

EJEMPLO 83 Método para la determinación de la absorción de glicina en células CHO que expresan en forma heteróloga el transportador GlyT-1b humano A) Clonación Se generó ADNc mediante PCR de acuerdo al método descrito por Kim, K.-M. et al. Mol. Pharmacol. 1994, 45, 608-617. Se verificó la secuencia mediante secuenciación didesoxi usando el ALF DNA Sequencer™ (Pharmacia), y se clonó en la construcción de expresión pcDNA3 (l?vítrogen).

B) Transfección Se llevó a cabo la transfección de hGlyT-1b en células CHO usando una técnica estándar de fosfato de calcio como es descrito por Sambrook, J. et al. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

C) Selección Se seleccionaron células establemente transfectadas durante 1 semana en medio de crecimiento que contenía Img.cm3 de Geneticina.

Se seleccionaron clones individuales para análisis posterior, y los clones positivos se hicieron pasar como de costumbre como se describe a continuación.

D) Condiciones de cultivo Células que expresan establemente el gen hGlyT-1b, fueron cultivadas a 37°C en una atmósfera de CO2 a 5% en DMEM - NUT.MIX. F12 con Glutamax-1 (Gibco) que contenía Geneticina (0.5 mg.cm"3, Gibco), y complementado con Fetalclone II a 10% (Hyclone). Se llevó a cabo cultivo de mantenimiento en matraces estándar ventilados de 80 cm2 (filtro de 2 x 10"6 m, Nunc), y las células fueron subcultivadas mediante tripsinización (Sigma) cuando eran confluentes.

E) Procedimiento de prueba Se sembraron células para estudios de absorción en placas de 96 cavidades (17,000 células por cavidad) en ausencia de Geneticina, y se cultivaron durante 48 horas antes de su uso. Para medir el transporte de glicina, las células fueron lavadas dos veces con solución salina balanceada de Hanks (HBSS) precalentada a 37°C, y se removió el exceso de fluido antes de la adición de los compuestos de prueba disueltos en 0.200 cm3 de HBSS. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 5 minutos, antes de la adición de [3H]glicina (0.050 cm3, 150 x "6 M, 248 Bq.nmol"1, NEN), y la incubación se continúo durante otros 10 minutos. La absorción concluyó lavando las células con HBSS enfriada en hielo antes de la remoción del exceso de fluido y la adición de 0.200 cm3 de coctel de escintilación a cada cavidad. Las placas fueron selladas con película adhesiva, y se agitaron para asegurar que las muestras fueran homogéneas antes del conteo de escintilación en un contador de placa.

F) Análisis de datos Se analizaron los datos usando procedimientos estándar de ajuste de la curva para obtener un valor de plC50 para compuestos activos (en donde plC50 es el logaritmo negativo de la concentración del compuesto de prueba que causa 50% de inhibición de la absorción).

G) Resultados Los compuestos de la invención inhiben selectivamente el transporte de glicina mediante el transportador GlyT-1b humano, en comparación con el transportador GlyT-2 humano (la clonación molecular y la expresión funcional del transportador GlyT-2 humano, son descritos por Morrow, J. A. et al. FEBS letters 1998, 439. 334-340. Los valores de plC50 para varios compuestos de la invención, se dan en el cuadro I.

CUADRO I Inhibición del transporte de glicina por hGlyT-1

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1.- Un derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina], caracterizado porque tiene la fórmula general I: FORMULA PAG 32 Fórmula I en donde: la línea punteada representa un enlace opcional; Y representa de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo de (C-?.6) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos), alquiloxi de (C?.6) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos o con cicloalquilo de (C3.6)), alqueniloxi de (C2-6), alquiniloxi de (C2_6), cicloalquiloxi de (C3.6), ariloxi de (C6.?2), arilalquiloxi, heteroariloxi, heteroarilalquiloxi, SR3, NR3R4, OSO2R5 y NR3SO2R4; 2 sustituyentes Y pueden formar juntos O-(CH2)n-O u O-(CF2)n-O, en donde n es 1 ó 2; Y representa un grupo arilo de (C5-6) fusionado; X representa de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquiloxi de (C^), SR3, NR3SO2R4 y alquilo de (C?.4), sustituido opcionalmente con halógeno; R-i es hidrógeno, alquilo de (C^) o arilo de (C6_-?2); R2, R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo de (C1.4); R5 es alquilo de (C^) (sustituido opcionalmente con uno o más halógenos) o arilo de (C6-?2) (sustituido opcionalmente con alquilo de (C^ )); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de la fórmula general I de conformidad con reivindicación 1, caracterizado además porque la línea punteada representa un enlace.

3.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque R-i y R2 son hidrógeno.

4.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque Y representa un sustituyente para seleccionado de cloro, bromo, alquiloxi de (C1. ), alqueniloxi de (C1.4), alquinoloxi de (C-,_4) y NR3R4, y 1 ó 2 sustituyentes meta seleccionados entre los halógenos.

5.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque los sustituyentes meta son fluoro.

6.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque X es hidrógeno.

7.- El derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en terapia.

8.- Una composición farmacéutica que comprende un derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] que tiene la fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en mezcla con auxiliares farmacéuticamente aceptables.

9.- El uso de un derivado de espiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidina] que tiene la fórmula general I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento que tiene actividad sobre el SNC.

10.- El uso de un derivado de espiro[2H-1 -benzopiran-2,4'-piperidina] que tiene la fórmula general I , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de esquizofrenia, depresión , demencia y otras formas de cognición deteriorada, o de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington, o de hiperactividad muscular asociada con espasticidad, mioclonus y epilepsia. m o R E S U M E N La presente invención se refiere a derivados de espiro[2H-1 -benzopiran-2,4'-piperidina] que tienen la fórmula general I : FORMULA RESU MEN en donde los sustituyentes R^ R2, X e Y son como se definen en las reivindicaciones, o una sal farmacéuticamente aceptables de los mismos; la invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados, así como también al uso de estos derivados de espiro[2H-1 -benzopiran-2,4'-piperidina] en terapia, más específicamente para el tratamiento de trastornos del SNC.