PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO BACTERIANO DE EFLUENTES QUE CONTENGAN AL MENOS UN ÉTER POR MEDIO DE GORDONIA TERRAE
CIP 1-2194 Descripción de la Invención La invención concierne a un procedimiento de tratamiento bacteriano por medio de microorganismos capaces de degradar al menos un éter, particularmente el etil terc-butil éter (ETBE) y/o el metil terc-butil éter (MTBE) y/o el terc-amil metil éter (TAME) contenidos en efluentes acuosos. Se aplica particularmente a la industria del tratamiento de aguas. Se conoce que el metil-terc-butil éter, designado a continuación bajo el término de MTBE, asi como el terc-amil metil éter, designado a continuación bajo el término de TAME son éteres que pueden utilizarse particularmente como aditivos oxigenados en las gasolinas sin plomo con el objetivo de aumentar su Índice de octano. La utilización creciente de aditivos como el MTBE, el TAME o el etil terc-butil éter, designado a continuación bajo el término de ETBE, implica volúmenes importantes almacenados y transportados, en mezcla en las gasolinas particularmente. Es entonces necesario conocer la propagación de estos compuestos en caso de derrame accidental, que conduzca a una contaminación de los suelos y de las aguas subterráneas o superficiales. El MTBE, es un éter producido por condensación del metanol sobre el isobuteno, el TAME es un
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.¿--ÉM--.. ^^?^^!í^^.^.??1?^^..^.^jB^t..?.J ,á ¡i ^ éter producido por » condensación del metanol sobre el isopenteno y el ETBE es un éter producido por condensación del etanol sobre el isobuteno. La estructura de estos compuestos que contienen una unión éter así como un carbono terciario, es de naturaleza para volverlos muy resistentes a la biodegradación por los microorganismos presentes en el ambiente. La literatura relativa a la biodegradación de estos diferentes éteres utilizados como aditivos en las gasolinas, indica que el metabolismo de estos compuestos necesita en la mayor parte de los casos de la utilización de bacterias o de cultivos mixtos previamente seleccionados, ya que su presencia en el ambiente no es común (J.P. Salanitro y colaboradores, Demonstration of the enhanced MTBE bioremediation (EMB) in situ process, In Situ y On-Site Biore ediation, 19-22 de Abril de 1999, San Diego, Ca) . La solicitante ha aislado previamente una bacteria Gordonia terrae (ex -Gordona terrae) CIP 1-1889 que se manifiesta capaz de crecer utilizando parcialmente el ETBE como fuente de carbono y de energía que es degradado hasta el estado del alcohol terc-butílico (TBA) que puede a continuación ser utilizado como fuente de carbono y de energía por otra bacteria Burkholderia cepacia (ex Pseudomonas cepacia) CIP 1-2052 igualmente aislada por la Solicitante (solicitud de patente FR 2 766 478) o por una bacteria Alcaligenes sp^ CP 1-2561 o una bacteria Mycobacterium sp. CIP 1-2562 igualmente aisladas por la Solicitante. Se ha encontrado que la bacteria G. terrae CIP 1-1889, que no es capaz de degradar el MTBE o el TAME, al utilizarlos como fuente de carbono y de energía, es capaz de degradar estos compuestos por co-metabolismo cuando es cultivada en presencia de un substrato de crecimiento adecuado, como por ejemplo el ETBE o el etanol (solicitud de patente FR2 787 783) . Si la bacteria G. terrae CIP 1-1889 es cultivada sobre etanol y en presencia de MTBE y/o de TAME en cultivo mixto con la bacteria B. Cepacia CIP 1-2052, el MTBE y el TAME son degradados respectivamente en TBA y en alcohol ter-amílico (TAA) que pueden ser a continuación utilizados como fuente de carbono y de energía por B. cepacia CIP 1-2052 (solicitud de patente FR 2 787 783) o por la bacteria Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o la bacteria Mycobacterium sp. CIP 1-2562. No obstante la bacteria G. terrae CIP 1-1889 tiene el inconveniente de presentar una fase de latencia en su crecimiento. Uno de los objetos de la invención es remediar los inconvenientes del arte anterior. Otro objeto es describir un procedimiento aerobio que utiliza esta nueva bacteria para el tratamiento de las aguas contaminadas, con el objeto de degradar el MTBE, el ETBE o el TAME contenidos en soluciones y más generalmente en
.á^.^*...^.^^._._.-^ compuestos que contengan al menos un grupo alcoxi y en particular un grupo terc-alcoxi. Haciendo esto, las concentraciones residuales de éter en aguas residuales urbanas o industriales o mantos acuíferos contaminados por estos productos o por carburantes que puedan contener estos productos oxigenados, son abatidas significativamente. De manera más detallada, la invención concierne a un procedimiento de tratamiento de efluentes acuosos que contengan al menos un éter, de preferencia el etil tercbutil éter (ETBE) y/o metil terc-butil éter (MTBE) y/o terc- amil metil éter (TAME) a fin de reducir la concentración de dicho éter, caracterizado porque se hace crecer en condiciones aerobias al menos una bacteria Gordonia terrae CIP 1-2194 en presencia de un substrato de crecimiento y se hace degradar el éter contenido en los efluentes en presencia de dicho substrato por medio de la biomasa de las bacterias así producidas. Según una característica del procedimiento, cuando los efluentes acuosos contienen esencialmente MTBE, se puede degradar ventajosamente el MTBE contenido en los efluentes al introducir en ellos además, de manera conjunta o disociada al menos una bacteria seleccionada en el grupo formado por Burkholderia cepacia CIP 1-2052, Alcaligenes sp. CIP 1-2561, Mycobacterium sp CIP 1-2562, Arthtobacter globiformis ATCC 53596, Bacillus coagulans ATCC 53595,
Pseudomonas stutzeri ATCC 53602 y Mycobacterium vaccae J0B5 ATCC 29678. En este tipo de utilización, el grupo terc-butil éter es degradado en alcohol terc-butílico (TBA) y la degradación sensiblemente total del TBA en dióxido de carbono y en agua es realizada por medio de la agregación de las bacterias mencionadas que tienen la capacidad de crecer sobre el TBA así producido. Estas cepas, G. terrae CIP 1-2194, B. Cßpacia CIP 1-2052, Alcaligenes sp. CIP 1-2561 y Mycobacterium sp. CIP 1-2562 han sido depositadas por la Solicitante en el Instituto Pasteur (CNCM, 25 rué du Docteur-Roux, F-75724 PARÍS CEDEX) . Cualquier otra bacteria susceptible de crecer sobre el TBA puede entrar en el marco de la presente invención. Según otra característica del procedimiento, cuando los efluentes contienen esencialmente TAME, se puede degradar el TAME contenido en los efluentes, introduciéndoles además, de manera conjunta o disociada una bacteria B. cepacia CIP I- 2052 o una bacteria Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o una bacteria Mycobacterium sp CIP 1-2562, que tienen la capacidad de crecer tanto sobre el alcohol tere-amílico (TAA) producto de la degradación del TAME y degradarlo sensiblemente totalmente en dióxido de carbono y en agua. Cualquier otra bacteria susceptible de crecer sobre el TAA puede entrar en el marco de la presente invención.
Según otra característica que permita mejorar el crecimiento de la bacteria B. cepacia CIP 1-2052 o de la bacteria Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o de la bacteria Mycobacterium sp. CIP 1-2562, se puede hacerla crecer en presencia de TBA y/o de TAA y de al menos una sal de cobalto, de preferencia el cloruro de cobalto. En estas condiciones, la concentración de TBA y/o de TAA puede estar comprendida entre 0.01 y 10 g/L de efluentes y la de la sal de cobalto entre 0.01 y 4 mg/L. Según una característica de la invención, la bacteria G. terrae CIP 1-2194 seleccionada a partir de G. terrae CIP 1-1889 es en general sembrada sobre un substrato de crecimiento que puede ser, por ejemplo, al menos un compuesto seleccionado en el grupo formado por el etanol, el isopropanol, el n-butanol, el n-pentanol, un monosacárido, un disacárido, el dibutiléter, el etilbutiléter, el etil terc-butil éter, la acetona, el etilen glicol, el glicerol y la triptona. Se puede proporcionar otros substratos de crecimiento a base de carbono y de hidrógeno. Cada bacteria puede crecer diferentemente en presencia de un tipo de substrato. Se ha obtenido excelentes resultados al utilizar como substrato de crecimiento el etanol y/o la acetona. Este substrato de crecimiento particular puede introducirse a una concentración que no exceda el umbral de
?*.*?.tí?*^...^i ?lfi^iAu^mA?t ^ toxicidad de este substrato para la bacteria considerada, por ejemplo a una concentración al menos igual a la del éter a degradar y comprendida ventajosamente entre 0.1 mg/L y 5500 mg/L de efluentes. Así, se ha constatado que cuando la bacteria según la invención es cultivada en presencia de un substrato de crecimiento que es el ETBE, es decir de un efluente acuoso que lo contenga y que se quiere tratar, no presenta ninguna fase de latencia en el crecimiento, contrariamente a lo que se observaría en el momento de la utilización de G. terrae CIP 1-1889. Cuando se trató de degradar el MTBE y/o el TAME contenido en los efluentes acuosos a descontaminar, se comprobó que la bacteria según la invención se manifestaba capaz de iniciar la degradación de estos éteres, aún en ausencia de substrato de crecimiento. No obstante, es preferible utilizar un substrato de crecimiento tal como el descrito anteriormente y, por ejemplo, el etanol o el isopropanol . Esta bacteria G. terrae CIP 1-2194 es llamada constitutiva para la degradación de los éteres, es decir que las enzimas responsables del ataque inicial sobre los éteres son producidas de manera constitutiva y no necesitan una inducción previa para ser utilizadas. Una cepa tal, que crece en presencia de un substrato de crecimiento tal como el etanol estará asociada ventajosamente en el marco de un cultivo mixto, para degradar los éteres ETBE, MTBE y/o TAME en la bacteria B. cepacia CIP 1-2052 o en la bacteria Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o en la bacteria Mycobacterium sp. CIP 1-2562, que se hacen crecer en presencia de sal de cobalto. En estas condiciones, la degradación del éter comienza inmediatamente y el TBA y/o el TAA que resultan son degradados a su vez, de manera sensiblemente total y muy rápidamente. Las bacterias pueden tolerar una amplia gama de concentraciones en éter. De preferencia, se puede degradar efluentes acuosos que contengan una concentración en éter y, en particular en MTBE o en TAME o en ETBE, cuando más igual a 5000 mg/L y más particularmente comprendida entre 0.01 mg/L y 400 mg/L. Sin embargo, siempre es posible diluir el efluente para operar en condiciones óptimas, compatibles con las capacidades de degradación de las cepas bacterianas. En el caso en el que los efluentes acuosos contengan etil terc-butil éter (ETBE) como contaminante, este ETBE puede ser utilizado al menos en parte como substrato de crecimiento y entonces como fuente de energía. El procedimiento que se desprende de la utilización de estas bacterias es aplicable para tratar particularmente efluentes contaminados por MTBE, TAME y/o ETBE, de manera de que las concentraciones de MTBE o de TAME o de ETBE en los rechazos sean compatibles con las normas en vigor. El substrato de crecimiento puede ser proporcionado de manera continua o discontinua en una concentración tal que pueda asegurar el suministro de energía necesario para la biodegradación, por ejemplo a una concentración al menos igual a la del éter a degradar. La utilización de estas bacterias para el tratamiento de efluentes contaminados por MTBE, ETBE o TAME puede realizarse de la manera siguiente, por ejemplo en un biofiltro, en el que las bacterias son fijadas sobre un soporte mineral u orgánico o bien pueden ser añadidas como inoculo a lodos de estación depuradora. Estas bacterias pueden ser utilizadas igualmente para el tratamiento in situ de acuíferos contaminados al inyectarlas como inoculo con un substrato de crecimiento apropiado, en el pozo perforado en el acuífero. Cuando desarrollan dichas bacterias sobre un sistema de biofiltro de volumen adecuado, se puede introducir los efluentes que contengan el éter, en particular el MTBE, el ETBE, y/o el TAME, en presencia de aire o de oxígeno en el biofiltro a un gasto de alimentación adecuado de 0.05 L/L a 5 L/L, por ejemplo de 0.1 a 2 L/L de biofiltro/hora, según la concentración de contaminante a tratar y se extrae el efluente desprovisto al menos en parte del éter contaminante .
La invención será mejor comprendida a la vista de los ejemplos siguientes y de las figuras entre las cuales: - la figura 1, muestra la capacidad de degradación del MTBE de un cultivo de Gordonia terrae CIP 1-2194, en presencia de etanol, - la figura 2 ilustra la capacidad de degradación del TAME de un cultivo de Gordonia terrae CIP 1-2194 en presencia de etanol, - la figura 3, muestra la concentración residual (CR) de substrato que es el etanol y de MTBE en función del tiempo, y - la figura 4, representa la densidad óptica (D06oo nm) , que expresa el crecimiento de los microorganismos en función del tiempo para un cultivo mixto de G. terrae CIP 1-2194 y de B. cepacia CIP 1-2052. EJEMPLO 1 (Comparativo) Aislamiento de una nueva cepa de Gordonia terrae CIP I- 2194 y comparación de su crecimiento con el crecimiento de Gordonia terrae CIP 1-1889 en presencia de ETBE La bacteria Gordonia terrae CIP 1-1889, es capaz de crecimiento sobre ETBE (Patente FR 2 766 478) que utiliza como fuente de carbono y de energía que da lugar a la acumulación de ter-butanol (TBA) . Esta bacteria ha sido cultivada por resiembras sucesivas en varias ocasiones sobre el medio mínimo MMl que contenga ETBE como fuente de carbono
y de energía y cuya composición es la siguiente: - KH2P04 6.8 g - K2HP04 8.7 g - Na2HP04.2H20 0.334 g - NH4C1 1.5 g - CaCl2.2H20 0.0364 g - FeCl3.6H20 0.0012 g - Solución de vitaminas 1 ml - H20 c.b.p. 1 litro pH=6.95 La solución de vitaminas tiene la composición siguiente para 1 litro de agua destilada: - Biotina 200 mg - Riboflavina 50 mg - Acido nicotinámico 50 mg - Pantotenato 50 mg - Acido p-aminobenzoico 50 mg - Acido fólico 20 mg - Tiamina 15 mg - Cianocobalamina 1.5 mg A este medio se añade entonces ETBE en una concentración elevada, es decir entre 300 y 500 mg/L. Al terminar estas diferentes resiembras, se obtuvo una nueva bacteria que es originaria de la bacteria Gordonia terrae CIP 1-1889. Presenta caracteres morfológicos y
j í », j % , convencionales idénticos a los de la cepa madre. Ha sido depositada en la colección del Instituto Pasteur, París- Francia como Gordonia terrae CIP 1-2194. Esta cepa nueva es constitutiva para la expresión de los genes que permiten la degradación del ETBE, es decir que la degradación del ETBE se hace sin que sea necesario poner en contacto previo la cepa con el ETBE. La bacteria-madre G. terrae CIP 1-1889 es llamada inducible para la degradación del ETBE (ETBE+X) y la nueva cepa G. terrae CIP 1-2194 es llamada constitutiva para la degradación del ETBE (ETBE+C) . A título comparativo, la bacteria G. terrae CIP 1-1889 por una parte, y la bacteria G. terrae CIP 1-2194 por otra parte, son cultivadas separadamente en un frasco de medio MMl descrito anteriormente y al cual se añade el ETBE como fuente de carbono y de energía (substrato de crecimiento) a una concentración final del orden de 1 g/L. Los cultivos son incubados a 30 °C. Las concentraciones residuales de ETBE son determinadas sobre muestras sacadas sobre cada uno de los cultivos e inyectadas sobre un cromatógrafo en fase gaseosa equipado con un integrador que calcula las concentraciones residuales de ETBE y de TBA producidos por integración de los diferentes picos obtenidos sobre los cromatogramas . Los resultados obtenidos se presentan en la tabla no. 1.
i-a-ic-. -a----.--.. _ *-*.„. *» ¡¡¡¡£j Tabla no. 1: Comparación del crecimiento en presencia de ETBE, de las bacterias G. terrae CIP 1-1889 y CIP 1-2194
Cepa ConcenConcenFase de Biomasa Duración % probatración tración latencia produde la de da inicial final observacida prueba ETBE de ETBE de TBA da antes (mg/L) (horas) degra¬
(mg/L) (mg/L) de la dedado gradación del ETBE (horas) G. terrae CIP I- 1889 985 714 94.5 206 190 100% G. terrae CIP I- 2194 873 633 0.0 250 78 100% Así como se ve en este experimento, no se observa ninguna fase de latencia (retardo) , con la cepa G. terrae CIP 1-2194 para la degradación del ETBE. Esto es considerado como una ventaja para la utilización de las cepas por el experto en la materia. EJEMPLO 2 Degradación del MTBE y del TAME por medio de Gordonia terrae CIP 1-2194 Se ha estudiado la capacidad de la bacteria G. terrae CIP 1-2194 para degradar el MTBE y el TAME. La bacteria G. terrae CIP 1-2194 se siembra en frascos de medio mineral MMl descrito en el ejemplo 1 y que contiene como fuente de carbono ya sea medio MTBE o bien TAME a una concentración del orden de 200 mg/L. Los cultivos se incuban a 30 °C. Se efectuaron muéstreos a intervalos regulares sobre estos cultivos a fin de determinar por cromatografía en fase gaseosa los contenidos residuales de MTBE o de TAME. Los resultados se presentan en las figuras 1 y 2. Como se ve sobre estas figuras, desde la siembra, la bacteria G. terrae CIP 1-2194 es capaz de degradar el MTBE y el TAME. Este abatimiento de la concentración de cada uno de los éteres está correlacionado con la aparición concomitante del alcohol correspondiente, es decir el TBA en el caso del MTBE y el alcohol tere-amílico (TAA) en el caso del TAME. Sin embargo, se ve que si esta degradación se produce sin fase de latencia, no es total y se detiene después de 40 a 60 horas de incubación. Si se añade entonces etanol al cultivo (después de 150 horas aproximadamente sobre las figuras) , la degradación del MTBE o del TAME por G. terrae CIP 1-2194, recomienza entonces y es total en treinta horas. Este experimento confirma bien como el comportamiento de la bacteria G. terrae CIP I- 2194 es diferente del de la
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bacteria madre G. terrae CIP 1-1889, ya que ésta no sería capaz de iniciar la degradación del MTBE o del TAME en ausencia de un substrato de crecimiento (Ejemplo 2 de la patente no. 98/16520) . Siendo la bacteria G. terrae CIP I-2194, constitutiva para las enzimas responsables del ataque de la unión éter, capaz de iniciar la degradación del MTBE o del TAME aunque estos compuestos no constituyen una fuente de carbono y de energía, sin embargo esta degradación es solo parcial ya que deben intervenir rápidamente limitaciones en las bacterias. La adición de etanol que es substrato de crecimiento, permite entonces terminar la degradación del MTBE o del TAME por cometabolismo como se decribiría para la bacteria G. terrae CIP 1-1889. Esta capacidad de iniciar la degradación del MTBE o del TAME en ausencia de substrato de crecimiento, constituye una ventaja de la bacteria G. terrae CIP 1-2194 en relación a la bacteria madre G. terrae CIP 1-1889. EJEMPLO 3 Degradación del MTBE por medio de un cultivo mixto de Gordonia terrae CIP 1-2194 y de Burkholderia cepacia CIP I- 2052 en presencia de cloruro de cobalto Se ha estudiado la degradación del MTBE por medio de un cultivo mixto que contenga G. terrae CIP 1-2194 y B. cepacia
CIP 1-2052 en termentador . Un precultivo de G. terrae CIP I-2194 se ha efectuado sobre 200 ml de medio Luria. Un precultivo de B. cepacia CIP 1-2052 se efectuó sobre 200 ml de medio MM2 cuya composición es la siguiente: - KH2P04 1.4 g - K2HP04 1.7 g - NaN03 1.5 g - MgS04 . 7H20 0.5 g - CaCl2. 2H20 0.04 g - FeCl3. 6H20 0.012 g - Solución de vitaminas 1.0 ml - H20 c.b.p. 1.0 litro La composición de vitaminas tiene la composición siguiente para un litro de agua destilada: Biotina 200 mg Riboflavina 50 mg Acido nicotinámico 50 mg Pantotenato 50 mg Acido p-aminobenzoico 50 mg Acido fólico 20 mg Tiamina 15 mg Cianocobalamina 1.5 mg y que contenga glucosa a una concentración de 500 mg/ml y a la cual se ha adicionado a razón de 10 ml/L, de medio MM2, una solución de oligoelementos que contengan una sal de cobalto que permita un mejor crecimiento de la bacteria. Esta solución de oligoelementos tiene la composición siguiente: - Acido nitrilo triacético 1.5 g - Fe(NH4)2(S04)2.6H20 0.2 g - Na2Se03 0.2 g - CoCl2.6H20 0.1 g - MnS04.2H20 0.1 g - Na2MoO„ .2H20 0.1 g - ZnS04.7H20 0.1 g - A1C13.6H20 0.04 g - NiCl2.6H20 0.025 g - H3B03 0.01 g - CuS04.5H20 0.01 g - agua destilada c.b.p. 1.0 Lt Estos precultivos son utilizados para sembrar 4 L de medio MM2 descrito anteriormente y al cual se ha añadido, a razón de 10 ml/L de medio de cultivo, la solución de oligoelementos que contengan la sal de cobalto descrita anteriormente. En estas condiciones, las dos cepas están a concentraciones celulares después de siembra del orden de 108 ufc/ml para G. terrae CIP 1-2194 y 107 ufc/ml para B. cepacia
CIP 1-2052. El fermentador es alimentado en modalidad i alimentación-discontinua, es decir sin extracción. la alimentación contiene una mezcla del substrato, el etanol en
100 g/L, como fuente de carbono y de energía y de co-substrato a degradar, el MTBE en 50 g/L. La velocidad de alimentación es fijada en 1 ml/h. La temperatura del fermentador es fijada en 30 °C. Siendo la agitación de 900 rpm con una aereación de 12.5 L/L/h. Se realizaron muéstreos sobre el medio de cultivo y las concentraciones residuales en etanol, MTBE y TBA se determinaron después de filtración por dosificación en CPG. Al mismo tiempo, se efectuaron a intervalos regulares numeraciones de cada una de las dos cepas G. terrae CIP I-2194 y B. cepacia CIP 1-2052, por extendimiento sobre cajas de medio Luria y sobre cajas de medio MM2 gelificado que contenía TBA a razón de 500 mg/L. Los resultados de estos experimentos se presentan sobre las figuras 3 y 4. El etanol proporcionado es rápidamente utilizado por la bacteria G. terrae CIP 1-2194 y al mismo tiempo, el MTBE es igualmente degradado por la bacteria G. terrae CIP 1-2194 y al mismo tiempo, el MTBE es degradado igualmente en TBA sin que aparezca fase de latencia en la utilización a la vez del substrato, el etanol y co-substrato, el MTBE. El TBA así formado se acumula a una concentración que no rebasa 30 mg/L ya que es rápidamente reconsumido por la bacteria B. cepacia CIP 1-2052. A partir de 40 horas, las concentraciones residuales en etanol, MTBE y TBA son nulas. Las poblaciones respectivas de las dos cepas aumentan hasta 80 horas de cultivo ya que se establecen del hecho de las limitaciones en substrato (etanol o TBA) . En el transcurso de este
^m¿k* ^M**M**~--_^-__ A-hi-Lh- experimento que ha durado 210 horas, se han degradado 2.4 g de MTBE inyectados, así como 5.2 g de etanol. La cantidad de TBA formado a partir del MTBE es de 2 g, estos 2 g han sido igualmente, totalmente degradados. EJEMPLO 4 Degradación del MTBE por dos tipos de cultivos mixtos: 1) Gordonia terrae CIP 1-2194 y Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o 2) Gordonia Terrae CIP 1-2194 y Mycobacterium sp. CIP I- 2562, en presencia de etanol o de isopropanol. Se realizan tres precultivos diferentes: - un precultivo de G. terrae CIP 1-2194 sobre el medio MM2 descrito en el ejemplo 3 y que contenía ETBE en 500 mg/L como fuente de carbono. - un precultivo de Alcaligenes sp. CIP 1-2561 sobre el medio MM2 que contenía TBA en 1 g/L como fuente de carbono. - un precultivo de Mycobacterium sp. CIP 1-2562 sobre el medio MM2 que contenía TBA en 1 g/L como fuente de carbono. Después de un crecimiento de 48 horas a 30 °C bajo agitación, estos diferentes precultivos se centrifugaron a fin de recolectar el residuo de transferencia bacteriano de cada cepa. Cada residuo de transferencia es lavado con medio
MM2, luego es recolectado por centrifugación. El residuo de transferencia de G. terrae CIP 1-2194 es tomado en 4.5 ml de medio MM2, el residuo de transferencia
de Alcaligenes sp. CIP 1-2561 así como el residuo de transferencia de Mycobacterium sp. CIP 1-2562 son tomados cada uno en 20 ml . Las densidades ópticas a 600 nm (D.O.ßoonm) de estas suspensiones pudieron medirse para G. terrae CIP 1-2194 y
Mycobacterium sp. CIP 1-2562 y fueron de 7.32 y 2.72 respectivamente. La D.O.ßoonm no pudo medirse para Alcaligenes sp. CIP 1-2561 ya que esta cepa forma floculados. Estas suspensiones celulares han sido utilizadas para sembrar frascos de medio MM2 (50 ml) que contengan ya sea isopropanol (300 mg/L final) y MTBE (100 mg/L final), o bien etanol (300 mg/L final) y MTBE (100 mg/L final) . Las suspensiones son utilizadas a razón de 1 ml para la cepa G. terrae CIP 1-2194 y de 0.5 ml de una o de la otra de las suspensiones para Alcaligenes sp. CIP 1-2561 y Mycobacterium sp. CIP 1-2562. Ensayos testigos no sembrados, constituidos por frascos de medio MM2 que contenían isopropanol y MTBE o etanol y MTBE se realizaron en las mismas condiciones. Los frascos se incubaron bajo agitación a 30 °C durante 72 horas. La D.O.600 nm inicial ha podido calcularse en el caso de los cultivos mixtos de G. terrae CIP 1-2194 y Mycobacterium sp. CIP 1-2562, es de aproximadamente 0.17. Después de 72 horas, se sacaron muestras de cada cultivo así como de los testigos, se filtraron (0.22 µm) y se
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dosificaron en CPG para determinar los substratos residuales. Los resultados se presentan en la Tabla no. 2. Tabla no. 2: Contenidos residuales de MTBE y etanol o isopropanol de los cultivos mixtos de G. terrae CIP 1.2194 con Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o Mycobacterium sp. CIP I- 2562 Cultivo mixto. Contenido Contenido Contenido Contenido DOßoonm utilizado final de final de final de final de final MTBE TBA etanol isopro¬
panol G. terrae CIP 1-2194 Alcaligenes sp. CIP 1-2561 15 (etanol+MTBE) 0 n.d. G. terrae CIP 1-2194 Alcaligenes sp. CIP 1-2561 20 (isopropanol+ MTBE) 0 n.d. G. terrae CIP 1-2194 Mycobacterium 25 sp. CIP 1-2562
, ' .
Tabla 2 (continuación) Cultivo mixto. Contenido Contenido Contenido Contenido DOeoonm utilizado final de final de final de final de final MTBE TBA etanol isopropanol (etanol+MTBE) 0 n.d. G. terrae CIP 1-2194 Mycobacterium sp.CIP 1-2562 (isopropanol+ MTBE) 0 3.3 mg/L 0 0.44 *n.d. no determinado Se ha verificado que en los testigos, no fueron degradados ni el MTBE ni el etanol o el isopropanol en mezcla. Como se ve, de acuerdo a los resultados de este experimento, el MTBE es totalmente degradado en presencia de isopropanol o de etanol por G. terrae CIP 1-2194. El TBA formado en el transcurso de esta degradación es utilizado a continuación por Alcaligenes sp. CIP 1-2561 o por Mycobacterium sp. CIP 1-2562 como fuente de carbono y de energía. El etanol o el isopropanol son utilizados completamente . Se efectuó una segunda adición de MTBE y de substrato,
i * I- etanol o isopropanol, en las mismas cantidades que en la primera adición, y los frascos se incubaron de nuevo. Se realizaron las dosificaciones después de 24 horas, luego después de 48 horas de incubación. Después de 24 horas de incubación; no había más MTBE, etanol o isopropanol en ninguno de los frascos. Igualmente no había más TBA residual en los frascos de los cultivos mixtos G. terrae CIP 1-2194/Alcaligenes sp. CIP 1-2561. Por el contrario quedaba TBA residual en los cultivos mixtos de G. terrae CIP I-2194/Mycobacterium sp. CIP 1-2562, pero después de 48 horas de incubación no había más TBA residual en estos cultivos mixtos. La degradación completa de una segunda adición de MTBE/etanol o de MTBE/isopropanol confirma bien la capacidad de degradación de los diferentes cultivos mixtos probados. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.