MXPA02004241A

MXPA02004241A - Regulacion de la expresion de genes por agentes neurolepticos.

Info

Publication number: MXPA02004241A
Application number: MXPA02004241A
Authority: MX
Inventors: A Thomas Elizabeth
Original assignee: Digital Gene Tech Inc
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2002-10-17
Also published as: WO2001030972A3; WO2001030972A2; EP1226152A2; AU1349801A; CA2389110A1; JP2003533970A

Abstract

Se proporcionan polinucleotidos, polipeptidos, equipos y metodos relacionados con genes expresados en el sistema nervioso central que son regulados por neurolepticos.

Description

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES POB AGENTES NEUROLÉPTICOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esquizofrenia y receptores de dopamina . Se ha demostrado que las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio tienen un papel importante en funciones cerebrales normales y en estado de morbilidad. Por ejemplo, muchos trastornos 10 psiquiátricos están relacionados con la actividad dopaminérgica excesiva en el sistema de dopamina mesoestriatal el cual se relaciona tanto con la vía de • dopamina nigroestriatal (neuronas que enlazan la sustancia negra con el cuerpo estriado) así como la vía de dopamina 15 mesolímbica (neuronas que enlazan el área tegumentaria ventral con las regiones límbicas, tales como el núcleo amigdalino, bulbo olfatorio, y el núcleo auditivo, el cual con frecuencia se considera una extensión ventral del cuerpo estriado) . Adicionalmente, se sabe que la enfermedad de 20 Parkinson es provocada por la degeneración de neuronas de • dopamina en la vía nigroestriatal.

Medicamentos neurolépticos (antipsicóticos) . Los medicamentos neurolépticos, tales como haloperidol y 25 clozapina se utilizan ampliamente en el tratamiento a largo REF: 138613 plazo de diversos trastornos psiquiátricos que incluyen esquizofrenia. Los efectos antipsicóticos de los medicamentos neurolépticos generalmente se atribuyen al bloqueo de los receptores D2 en el sistema de dopamina mesolímbico (Metzler et al., Schi zophrenia Bull . , 2, 19-76 (1976)). La mejor evidencia de esto proviene de la excelente correlación que se observa entre la potencia terapéutica de • los neurolépticos y su afinidad por unión al receptor D2 (Seeman et al., Curr. Opn. Nuerol. And Neurosurg., 6, 602- 10 608 (1993); Créese et al., Science, 192, 481-483 (1976); Peroutka et al., Am. J. Psych., 137, 1518-1522 (1980); Deutch, et al., Schizophren. Res., 4, 121-156 (1991); Seeman, P., Synapse 1, 133-152 (1987)). Aunque los medicamentos neurolépticos tienen afinidad por otros 15 receptores de neurotransmisores en el cerebro, tales como los receptores muscarínicos de acetilcolina, 5-HT, - adrenérgicos y de histamina, no se ha observado correlación con la eficacia clínica y estos receptores (Peroutka et al, . Am. J. Psych . (1980); Richelson et al., Eur. J. Pharm. 103, 20 197-204 (1984) ) . Los estudios demuestran que los receptores de dopamina se bloquean a una concentración de 70% después de solo algunas horas de tratamiento neuroléptico (Sedval et al., Arch . Gen . Psych . , 43, 995-1006 (1986)). Se ha ij.L .*? ****t. vs . L. -* •' ~^^ firpiji l -'* ' demostrado que este bloqueo lleva a un incremento compensatorio en el número de receptores de dopamina y supersensibilidad de los receptores no bloqueados (Clow et al., Psychopharm. , 69, 227-233 (1980); Rupniak et al., Life Sci . , 32, 2289-2311 (1983); Rogue et al., Eur. J. Pharm . , 207, 165-169 (1991)). Además, los efectos a corto plazo de los antagonistas de dopamina en el cerebro son bien conocidos e incluyen efectos tales como un incremento en la síntesis y catabolismo de dopamina, un incremento en la velocidad de activación de las neuronas de dopamina que resultan de la inhibición de autoreceptores de dopamina presinápticos (Grace et al., J. Pharm. Exp . Ther. , 238, 1092-1100 (1986), y una potenciación de la formación de AMP cíclico que resulta de bloqueo de receptores de dopamina post-sinápticos (Rupniak et al., Psychopharm . , 84, 519-521 (1984) ) .

Efectos cola terales de los medi camentos neurolépti cos . Además de sus acciones antipsicóticas, los neurolépticos pueden provocar una serie de efectos colaterales moderados a graves. Algunos de estos efectos colaterales resultan de la naturaleza oscura de los medicamentos neurolépticos, que incluyen hipotensión y taquicardia, que resulta del bloqueo del receptor a- At<lm<l'Tn,**>-»»**1t*"~-*-í- ~*-* |fjp*- *ÍM*. adrenérgico y boca seca, visión borrosa, que resulta del bloqueo de receptores muscarínicos de acetilcolina. Los efectos predominantes y más indeseables que acompañan al tratamiento neuroléptico son las deficiencias motoras de 5 duración prolongada denominados como efectos colaterales extrapiramidales (Marsden et al., Psychol . Med. , 10, 55-72 (1980) ) . Los efectos colaterales extrapiramidales se relacionan con el bloqueo de receptores de dopamina en el estriado dorsal (Moore et al., Clin. Neuropharmacol . , 12, 10 167-184 (1989) e incluyen deficiencias motoras tales como distonias (espasmos musculares) , acatisias (intranquilidad motora), síntomas pseudoparkinsonianos y discinesia tardía.

• Aproximadamente 20% de los pacientes que reciben antipsicóticos muestran síntomas pseudoparkinsonianos, el 15 bloqueo de los receptores D2 de dopamina en el cuerpo estriado son funcionalmente equivalentes a la degeneración de neuronas de dopamina nigroestriatales que se observan en la enfermedad de Parkinson. La discinesia tardía es un síndrome de movimiento involuntario anormal que afecta a • 20 aproximadamente 25% de los pacientes en tratamiento neuroléptico (Jeste et al., Psychopharmacol . , 106, 154-160 (1992) ) . El peligro de este efecto colateral es que puede ser potencialmente irreversible, esto es, los pacientes aún pueden tener síndromes de discinesia tardía mucho después de 25 que se haya suspendido el tratamiento antipsicótico. Esto implica un componente epigenético de los efectos del tratamiento neuroléptico crónico. De manera interesante, los neurolépticos "típicos" tales como haloperidol y flufenazina tienen una propensión mucho mayor para provocar efectos colaterales extrapiramidales en comparación con los medicamentos neurolépticos "atípicos" tales como clozapina, la cual raramente causa este tipo de efectos. Aunque la clozapina difiere del haloperidol en su perfil farmacológico, el mecanismo específico que lleva a la carencia de efectos colaterales motores es poco claro. Dado que la clozapina tiene una alta afinidad por otros receptores de neurotransmisores, tales como los receptores muscarínicos, adrenérgicos y de serotonina, es posible que las acciones antipsicóticas de clozapina se deban parcialmente al bloqueo de estos otros receptores, lo cual puede restaurar el equilibrio adecuado de las vías de entrada y salida de dopamina de los ganglios básales.

Genética y genes relacionados con los trastornos neuropsiquiátricos . En la población en general, el riesgo de desarrollar un trastorno psiquiátrico es de aproximadamente 1-2% (Maier, ., y Schwab, S., Molecular genetics of schizophrenia. Current Opinión in Psychiatry 11:19-25 (1998); Kendler, K.S., Twin studies of psychiatric illness: current status and future directions. Arch Gen Psychiatry 50:9095-915 (1993)). Sin embargo, este riesgo aumenta de 10% a 40% cuando uno o los dos padres, respectivamente, presentan la enfermedad. La concordancia con gemelos monocigóticos y dicigótico permanece solo tan alta como 40-50% (Maier y Schwab (1998) ) . Aunque indudablemente existe un componente genético en la transmisión de trastornos psiquiátricos, la carencia de una concordancia completa entre gemelos dicigóticos indica que existen otros factores ambientales que contribuyen (Maier y Schwab (1998); Kendler (1993)). Un reto actual en la investigación genética en enfermedades mentales es la identificación de mutaciones que confieren susceptibilidad a, o genes relacionados con la terapéutica para tales trastornos. Un enfoque para resolver esto último es identificar genes cuya expresión es alterada durante el proceso del tratamiento con medicamentos.

Expresión de genes tempranos inmediatos que resultan del tratamiento neuroléptico agudo. Pese a la ocupación inmediata de receptores de dopamina, los medicamentos neurolépticos tienen un inicio de acción clínico retardado, lo que con frecuencia puede durar hasta varias semanas. Además, como se discute en lo anterior, los medicamentos neurolépticos están caracterizados por su «Ata. *, -^?¿_-.-»-.-átn.....¿..a. capacidad para provocar deficiencias motoras tardías y de larga duración. La discrepancia temporal distinta que existe entre la ocupación y el receptor de dopamina y el inicio de efectos colaterales terapéuticos y extrapiramidales, sugiere 5 que se producen cambios moleculares adicionales en el cerebro corriente abajo del bloqueo del receptor de dopamina. En un intento por identificar los mecanismos moleculares corriente abajo, los estudios se han enfocado en la regulación de dopa ina-receptor de genes objetivo 10 individuales en el cuerpo estriado y el núcleo auditivo. Por ejemplo, varios estudios han demostrado que el tratamiento agudo con medicamentos antipsicóticos provoca • inducción de varios genes tempranos inmediatos (Nguyen et al, Proc . Nati . Acad. Sci . , 89, 4270-4274 (1992); MacGibbon 15 et al., Mol . Brain . Res . 23, 21-32 (1994); Robertson et al., Neuro . Sci . , 46, 315-328 (1992); Dragunow et al., Neuro . Sci . , 37, 287-294 (1990); Miller J. Neurochem . , 54, 1453- 1455 (1990) ) . Algunas proteínas de gen temprano inmediato (IEGP), por sus siglas en inglés actúan como factores de • 20 transcripción mediante la unión de secuencias específicas de ADN y regulación de la transcripción del gen. De esta manera, las IEGP pueden unir efectos de señalización mediados por receptor con actividad genómica a largo plazo. Estudios recientes han demostrado que haloperidol, un 25 neuroléptico habitual, induce la expresión de c-Fos en el fr á* - -j»j.j.» -. - f^^. -^^'-"-^^, 1^^.^.-.^^^-...--M fe^ftatau cuerpo estriado de rata y el núcleo auditivo, mientras que la clozapina, y los neurolépticos atípicos inducen c-Fos únicamente en el núcleo auditivo (Nguyen et al., Proc . Nati . Acad. Sci . (1992); McGibbon et al., Mol. Brain Res. (1994); Robertson et al., Neurosci . (1992)). También se ha demostrado que haloperidol induce expresión de otras IEGP, tales como FosB, JunB, JunD y Krox24, en el cuerpo estriado y el núcleo auditivo (Rogue et al., Brain Res . Bull . 29, 469-472 (1992); Marsden et al., Psych . Med. (1980); Moore et al., Clin . Neuropharmacol . (1989)). En contraste, se ha demostrado que clozapina induce Krox24 y JunB únicamente en el núcleo auditivo (Nguyen et al. (1992); MacGibbon et al. (1994)). Estos resultados sugieren que la menor tendencia de clozapina a provocar efectos colaterales extrapiramidales en comparación con los neurolépticos "típicos" se pueden relacionar con su falla para inducir IEGP en el cuerpo estriado. La aparición de genes tempranos inmediatos después del tratamiento agudo con neurolépticos probablemente precede a muchos otros cambios moleculares responsables de los cambios adaptables retardados que se presentan con el tratamiento con medicamentos en el cuerpo estriado.

Cambios inducidos por tratamiento neuroléptico cróni co . El tratamiento crónico con medicamentos neurolépticos también se ha demostrado que provoca cambios en la expresión de ciertos neuropéptidos y receptores de neurotransmisores. En regiones distintas del cuerpo estriado, tanto la neurotensina como la encefalina son 5 ativadas después de tratamiento crónico (7-28 días) con haloperidol, mientras que disminuyen las concentraciones de /ARNm para protaquicinina (Merchant et al., J. Pharm. Exp. ^ Ther. , 271, 460-471 (1994); Delfs et al., J. Neurochem . , 63, 777-780 (1994); Ángulo et al., Neurosci. Lett. 113, 217-221 10 (1990) ) . En contraste, el tratamiento crónico con clozapina produce una disminución en las concentraciones de ARNm para encefalina y solo cambios pequeños en la expresión de neurotensina y taquicinina (Merchant et al. (1994); Mercugliano et al., Neurosci . Lett . , 136, 10-15. Estas 15 diferencias sugieren que los neuropéptidos pueden jugar un papel en las deficiencias motoras que resultan del tratamiento con neurolépticos típicos. Los investigadores también han demostrado la regulación de genes relacionados con la neurotransmisión 20 glutaminérgica. Por ejemplo, se ha observado una disminución en la expresión de ARNm del transportador de glutamato, GLT-1, en el cuerpo estriado después de 30 días de tratamiento con haloperidol, pero no después de la exposición a clozapina (Schneider et al., Neuroreport . , 9, 25 133-136 (1998)). Un tratamiento similar con haloperidol también resulta en un incremento en las subunidades de receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), NR1 y NR2, mientras que el tratamiento con clozapina genera una menor inducción (Riva et al., Mol . Brain . Res . 50, 136-142 (1997)). Se han observado cambios patológicos y estructurales en el cuerpo estriado después del tratamiento crónico con el medicamento. Los estudios utilizando animales de exprimentación han detectado una reducción en el tamaño y número de neuronas estriadas y procesos neuronales así como disminuciones en la densidad neuronal del estriado después del tratamiento crónico con haloperidol (Christensen et al., Acta . Psych . Scand. , 46, 14-23 (1970), Jeste et al., Psychopharm . , 106, 154-160 (1992); Mahadik et al., Biol . Psych . , 24, 199-217 (1988); Nielson et al., Psychopharm., 59-85-89 (1978) . Estos estudios implican que los neurolépticos pueden tener un efecto neurotóxico en el cuerpo estriado lo cual puede explicar el resultado de efectos colaterales inducidos neurolépticos. Aunque los estudios anteriores han examinado la expresión de algunos genes objetivo individuales, no ha habido un estudio amplio de los efectos de los neurolépticos en la expresión de genes con respecto al tiempo en el cuerpo estriado y el núcleo auditivo, las regiones del cerebro consideradas como relacionadas críticamente en las acciones de medicamentos neurolépticos. Por lo tanto, la cantidad identidad de los genes los cuales se expresen de manera diferencial después de tratamiento agudo y crónico con neurolépticos en estos tejidos permanecen desconocidos. Además, no ha habido un examen amplio de las diferencias entre la expresión de ARNm del estriado inducido por neurolépticos típicos y la expresión inducida por neurolépticos atípicos. Tal estudio comparativo identificaría genes que regulen las acciones antipsicóticas de los neurolépticos en comparación con los responsables de los efectos colaterales no deseados que se relacionan con estos medicamentos. Esta información podría permitir un avance en el desarrollo de una terapia antipsicótica que pueda dirigirse a acciones específicas de los medicamentos neurolépticos o, alternativamente, puede bloquear selectivamente proteínas que provocan efectos colaterales motores . Además, una caracterización sistemática permitiría la identificación de genes que contribuyen a las neuropatologías relacionadas con los trastornos neuropsiquiátricos tales como psicosis, trastornos bipolares y comportamiento relacionado con adicciones. Esta información puede revelar vías para el mecanismo de acciones de medicamentos antipsicóticos y al mismo tiempo proporcionar claridad respecto a las bases subyacentes de la disfunción psiquiátrica. Específicamente, es importante la ---^aÉ-4---- ag- <á-ais-fr-rifra-&--gau--fc-t-...aÉ.j-liT-.&L-- -. identificación de productos genéticos potencialmente dañinos para identificar moléculas que pueden ser útiles como marcadores de diagnóstico que indiquen neuropatología. Adicionalmente, la identificación de productos de genes potencialmente dañinos es importante para identificar moléculas que pueden ser susceptibles de intervención farmacéutica. Una caracterización sistemática también puede permitir la identificación de moléculas benéficas que contribuyan a las condiciones de neuroprotección. Tal identificación de productos benéficos puede llevar al desarrollo de agentes farmacéuticos útiles en el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos. Además, la identificación de productos dañinos y benéficos puede llevar a líneas nuevas de estudio para la disminución de síntomas relacionados con trastornos neuropsiquiátricos. Se han llevado a cabo estudios utilizando el método de análisis de expresión de gen total basado en PCR (TOGA, por sus siglas en inglés) para analizar la expresión de patrones de miles de genes y comparar los patrones de expresión en el desarrollo en el tiempo si después del tratamiento con el medicamento clozapina. Los genes regulados por tratamiento con clozapina se examinan en animales tratados con haloperidol, para un análisis comparativo . ^?^^?.?.b^ié?. «.Ajjtt. i....... tyft.-t-. -i,-,. ^1^11^.,^^^^ .-..^^aMfc- SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se han llevado a cabo estudios utilizando el método de análisis de expresión de gen total basado en PCR (TOGA, por sus siglas en inglés) para analizar los patrones de expresión de miles de genes y comparar los patrones de expresión en el curso en el tiempo después del tratamiento con el medicamento clozapina. Los genes regulados por el tratamiento con clozapina se examinan en animales tratados con haloperidol para un análisis comparativo. El análisis por TOGA ha identificado varios genes que tienen expresión alterada en respuesta a clozapina o administración de halopepdol en el cerebro de ratón. En particular, se ha utilizado el sistema TOGA para examinar la manera en que se regula la expresión del gen en el cuerpo estriado y el núcleo auditivo por un agente neuroléptico atípico, tal como clozapina. Estos estudios han identificado proteínas y genes los cuales son regulados por el tratamiento de medicamentos atípicos. Además, estos estudios han identificado por lo menos un gen el cual es regulado de manera diferencial por medicamentos típicos y atípicos. Los estudios también han examinado el patrón de expresión de genes regulados por sustancias neurolépticas en diversas regiones del cerebro. Entre otras cosas, estos estudios son útiles para determinar los genes relacionados específicamente con actividad antipsicótica en comparación con aquéllos relacionados con efectos colaterales extrapiramidales, información la cual hace avanzar el desarrollo de terapias antipsicóticas mejoradas. Las moléculas reguladas por neurolépticos que se han identificado son útiles en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico en el tratamiento de diversos trastornos neuropsiquiátricos tales como psicosis, trastorno bipolar y comportamiento relacionado con la adicción. Tales moléculas también son útiles como sondas, como se describe por su tamaño, secuencia nucleotídica parcial y patrón de regulación característico relacionado con la administración neuroléptica . La presente invención proporciona polinucleótidos novedosos y los polipéptidos codificados. Además, la presente invención se relaciona con vectores, células huéspedes, anticuerpos y métodos recombinantes para generar los polinucleótidos y los polipéptidos . Una modalidad de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que se elige del grupo que consiste de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. También se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido por lo menos 95% idéntico a cualquiera de las moléculas aisladas de ácido -a. ^,.,.,mt,,^^J?J.t?. ^iM?^¿teiflA...^A-fal -ii¿?.^ nucleico, y una molécula aislada de ácido nucleico de por lo menos diez bases de longitud que es hibridizable con cualquiera de estas moléculas aisladas de ácido nucleico bajo condiciones rigurosas. Cualquiera de estas moléculas aisladas de ácido nucleico puede comprender supresiones nucleotídicas secuenciales ya sea en la parte 5" o 3' terminal. También se proporciona un vector recombinante que comprende cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico y una célula huésped recombinante que comprende cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico. También se proporciona el gen que corresponde a la secuencia de ADNc de cualquiera de estos ácidos nucleicos aislados. Otra modalidad de la invención proporciona un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que se elige del grupo que consiste de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, 5 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE r IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62, SECUENCIA DE 10 IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, 15 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. También se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para cualquiera de estos polipéptidos, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un 20 fragmento de cualquiera de estos polipéptidos, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de un epítopo de cualquiera de estos polipéptidos, y un ácido nucleico aislado que codifica para una serie homologa de cualquiera de estos polipéptidos. Otra modalidad de la 25 invención proporciona un polipéptido aislado de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 109. Otra modalidad de la invención proporciona un polipéptido aislado de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 110. Preferiblemente, cualquiera de estos polipéptidos tiene actividad biológica. Opcionalmente, 5 cualquiera de los polipéptidos aislados comprende supresiones de aminoácidos secuenciales ya sea de la parte C terminal o de la parte N terminal. Se proporciona además una célula huésped recombinante que expresa cualquiera de estos polipéptidos aislados. 10 Otra modalidad adicional de la invención comprende un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que se • elige del grupo que consiste de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, 15 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 9, SECUENCIA DE • 20 IDENTIFICACIÓN NO:, 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, 25 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE tA..fe^S-i.tI^I.|^ca<^fc¿¿Maa._^.Jdmjm-A *? t* ..ll? IA?.L.^?¡¿?i±.Mu.*.

IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. Otra modalidad adicional de la invención comprende un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 109. Otra modalidad adicional de la invención comprende un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 110. El anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Otra modalidad de la invención proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir una afección, tal como un trastorno neuropsiquiátrico, que comprende administrar a un mamífero objetivo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención o un polinucleótido de la invención. En una modalidad preferida, se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir la esquizofrenia. En otra modalidad preferida, se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir trastornos bipolares. En otra modalidad adicional, se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir un comportamiento relacionado con adicciones. Una modalidad adicional de la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido aislado de la invención. Una modalidad preferida de la invención proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir una afección, tal como un trastorno neuropsiquiátrico, que comprende administrar a un mamífero objetivo, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo. En una modalidad preferida, se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir esquizofrenia. En otra modalidad preferida, se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir trastornos bipolares. En otra modalidad adicional se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir el comportamiento relacionado con adicciones.

Una modalidad adicional de la invención proporciona un método de diagnóstico de un trastorno patológico o la susceptibilidad a un trastorno patológico en un sujeto. El método comprende determinar la presencia o ausencia de una mutación en un polinucleótido de la invención. Una condición patológica o la susceptibilidad a la condición patológica, tal como un trastorno neuropsiquiátrico, se diagnostica en base en la presencia o ausencia de la mutación. En una modalidad preferida, se proporciona un método para diagnosticar esquizofrenia. En otra modalidad preferida se proporciona un método para diagnóstico de trastornos bipolares. En otra modalidad adicional se proporciona un método para evitar, tratar, modular o disminuir comportamiento relacionado con adicciones. En otra modalidad adicional de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de una condición patológica o la susceptibilidad a una condición patológica tal como un trastorno neuropsiquiétrico, en un sujeto. Las modalidades especialmente preferidas incluyen métodos de diagnóstico de esquizofrenia y trastornos bipolares. El método comprende detectar una alteración en la expresión de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención, en donde la presencia de la alteración en la expresión del polipéptido es indicativo del trastorno J?táilu? »A- -ii ... ..Jlfe?l..i,f(L-;i-lAaj. ltl¡^,l..li...1.J.!it.-J patológico o la susceptibilidad al trastorno patológico. La alteración en la expresión puede ser un incremento en la cantidad de expresión o una disminución en la cantidad de expresión. En una modalidad preferida, se obtiene una primera muestra biológica de un paciente sospechoso o que tiene un trastorno neuropsiquiátrico, por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, o comportamiento relacionado con adicciones, y se obtiene una segunda muestra de una fuente testigo comparable, adecuada. Se determina la cantidad de por lo menos un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención en la primera y segunda muestras. Se determina la cantidad del polipéptido en la primera y segunda muestras. Se diagnostica que un paciente presenta un trastorno neuropsiquiátrico si la cantidad del polipéptido en la primera muestra es mayor que o menor a la cantidad del polipéptido en la segunda muestra. Otra modalidad de la invención proporciona un método para identificar un asociado de unión a un polipéptido de la invención. Un polipéptido de la invención se pone en contacto con un asociado de unión y se determina si el asociado de unión altera la actividad del polipéptido. En otra modalidad adicional de la invención, se proporciona un método para identificar la actividad de un polipéptido expresado en un ensayo biológico. El polipéptido de la invención se expresa en una célula y se aisla. El pollpéptido expresado se prueba para determinar la actividad en un ensayo biológico y se identifica la actividad del polipéptido expresado, en base en los resultados de la prueba. Otra modalidad adicional de la invención proporciona una molécula de ADN aislada, sustancialmente pura, adecuada para uso como una sonda para genes regulados en trastornos neuropsiquiátricos, que se elige del grupo que consiste de moléculas de ADN que se muestran en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:, 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. Otra modalidad adicional de la invención proporciona un equipo para detectar la presencia de un polipéptido de la invención en una muestra de tejido de mamífero. El equipo comprende un primer anticuerpo el cual genera una inmunorreacción con una proteína de mamífero codificada por un gen que corresponde al polinucleótido de la invención o con un polipéptido codificado por el polinucleótido, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo y un material de empacado adecuado. El equipo puede comprender además un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede marcar con enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes o compuestos bioluminiscentes.

Otra modalidad de la invención proporciona un equipo para detectar la presencia de genes que codifican para una proteina que comprende un polinucleótido de la invención, o un fragmento de la misma, que tiene por lo menos 10 bases contiguas, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, y un material de empacado adecuado. Otra modalidad adicional de la invención proporciona un método para detectar la presencia de ácido nucleico que codifica para una proteína en una muestra de tejido de mamífero. Un polinucleótido de la invención o un fragmento del mismo que tiene por lo menos 10 bases contiguas se hibridiza con el ácido nucleico de la muestra. Se detecta la presencia del producto de hibridación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor con referencia a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y dibujos que la acompañan, en los que: la figura 1 es una representación gráfica de los resultados del análisis por TOGA utilizando un cebador de PCR 5' con bases de análisis AGTA, que muestran productos de PCR elaborados de ARNm extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina durante los siguientes períodos: testigo (sin clozapina), 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días, en donde la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 106 pb que está presente en la muestra control y que se enriquece en las muestras tratadas con clozapina; las figuras 2A-C son una representación gráfica de un análisis más detallado de un producto de PCR de 106 pb indicado en la figura 1. El panel superior (figura 2A) muestra el producto de PCR generado con el cebador específico de clon (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 28) y el cebador 3' PCR universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) . La figura 2B muestra los productos de PCR elaborados en la reacción de TOGA original utilizando un cebador 5' PCR, C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-T-A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 94) y el cebador PCR 3' universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) . En el panel inferior (figura 2C) se superponen los trazos del panel superior y los paneles medios, lo que demuestra que el producto de PCR elaborado utilizando un cebador extendido en base en la secuencia clonada es la misma longitud que el producto de PCR original; la figura 3 es una representación gráfica de los resultados del análisis de TOGA utilizando un cebador de PCR 5' con bases de análisis CACC, que muestra productos de PCR elaborados a partir de ARNm extraídos del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina durante los siguientes períodos: testigo (sin clozapina) , 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días, en donde la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 201 pb que está presente en la muestra testigo y que se enriquece cada vez más durante el tiempo en las muestras tratadas con clozapina; la figura 4 muestra el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_5 (CACC 201) , en donde se somete a análisis un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina así como estándares de tamaño, después de electroforesis y que se sondea con CLZ_5 radiomarcado. Los ratones fueron tratados con clozapina (durante los siguientes períodos antes de la extracción de ARNm: testigo (sin clozapina, 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días; la figura 5 muestra el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_5 (CACC 201) en donde se somete a análisis gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con haloperidol así como estándares de tamaño, después de electroforesis y que se sondean con CLZ_5 radiomarcado. Los ratones fueron tratados con 4 mg/kg de iA^.J^^..lM|?*é-t<fc. ¿t_fe.,aáÍffi>L.-i^fa-É--fe-A- j..-S.---M.L----J-----1I haloperidol durante los siguientes períodos, antes de extracción de ARNm: testigo (sin haloperidol) , 45 minutos, 7 horas, 10 días y 14 días; la figura 6 es una representación gráfica que compara los resultados del análisis por TOGA del clon CLZ_5 que se muestran en la figura 3 y el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_5 que se muestra en la figura 4; las figuras 7A-C son un análisis de hibridación in situ utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_5, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_5 en el cerebro anterior de ratón (7A) , mesencéfalo (7B) y cerebro posterior (7C), en donde CLZ_5 se expresa en células gliales dispersadas y tractos de materia blanca; las figuras 8A-I son análisis de hibridación ín si tu, utilizando una sonda de ARNc antisentido, dirigida contra el extremo 3' de CLZ_5, que muestra la expresión de ARNm para CLZ_5 en las siguientes partes del cerebro de ratón: cerebro anterior (8A-C), mesencéfalo (8D-F) y cerebro posterior (8G-I) en ratones tratados con solución salina (hilera superior) , ratones tratados con clozapina durante 5 días (hilera media) y ratones tratados con clozapina durante 14 días (hilera inferior) en donde el tratamiento con clozapina induce la expresión en células de glía; las figuras 9A-H muestran una fotomicrografía de campo oscuro de diversas regiones del cerebro, que incluyen el cuerpo calloso (cc, figura 9A, E) ; el putamen caudado (CPu, figura 9B, F) ; la comisura anterior (acá, figura 9C, G) ; y el globo pálido (GP, figura 9D, H) en animales con testigo (9A-D) y tratados con clozapina (9E-H) ; la figura 10A-D muestra una fotomicrografía en campo oscuro en la cápsula interna (ic) (10A, B) y una vista de campo brillante del tracto óptico (opt) (10C, D) de animales testigo (10A, C) y tratados con clozapina (10B, D) ; las figuras 11A-H muestran la localización conjunta de GFAP y apoD en el cuerpo estriado (HA, B, D, E) y tracto óptico (11C, F) de animales testigo tratados con solución salina (HA, B, C) y tratados con clozapina (11D, E, F) en donde las flechas gruesas indican la localización conjunta de ARNm para GFAP y apoD y las flechas delgadas indican la expresión únicamente de apoD; las figuras 11G-H muestran la inmunohistoquímica de apoD con anticuerpo primario contra apoD humano (Novocastra, Newcastle, Reino Unido) en el tracto óptico de animales testigos tratados con solución salina (11G) y tratados con clozapina (11H). La figura 12 muestra el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_5, en donde se someten a análisis de transferencia gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poliA de células de glía cultivadas tratadas con clozapina asi como estándares de tamaño, después de electroforesis y sometidos a sondeo con CLZ_5 radiomarcado. Las células de glia cultivadas se tratan con diferentes concentraciones de clozapina durante períodos de tiempo diferentes antes de la extracción de ARNm, como sigue: A = testigo (sin clozapina) , B = clozapina 100 nM, 1 día, C = clozapina 1 µM, 1 día, D = clozapina 100 nM, 1 semana, E = clozapina 1 µM, 1 semana; la figura 13 es una representación gráfica de los resultados de análisis por TOGA utilizando un cebador de PCR 5' con bases de análisis TTGT, que muestran los productos de PCR elaborados a partir de ARNm extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina, como sigue: testigo (sin clozapina), 45 minutos, 7 horas, 5 dias, 12 dias y 14 dias, en donde la linea de Índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 266 pb que está presente en la muestra control, que es inactivado en los siguientes 45 minutos en la muestra tratada con clozapina y que permanece inactivada durante 14 días, en presencia de clozapina; la figura 14 es una representación gráfica de los resultados de análisis por TOGA utilizando un cebador de PCR 5' con bases de análisis TTGT, que muestra los productos de PCR elaborados a partir de ARNm extraído del cerebro de ratones tratados con morfina, como sigue: cuerpo estriado testigo (PS) , cuerpo estriado tratado de manera aguda (AS), cuerpo estriado extraído (WS) , amígdala testigo (PA) , amígdala sometida a tratamiento agudo (AA) , amígdala sometida a tratamiento crónico (TA) y amígdala sometida a suspensión (WA) , en donde la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 266 pb que es más abundante en el cuerpo estriado testigo en comparación con la amígdala testigo y que es regulada de manera diferencial por morfina en el cuerpo estriado en comparación con la amígdala; la figura 15 muestra el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_40 (TTGT 266) , en donde se someten a análisis de transferencia un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poliA del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina asi como estándares de tamaño, después de electroforesis que se someten a sondeo con CLZ_40 radiomarcado. Los ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina durante los siguientes periodos antes de la extracción de ARNm: testigo (sin clozapina) , 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días; la figura 16 es una representación gráfica que compara los resultados de análisis por TOGA del clon CLZ_40 que se muestra en la figura 13 y el análisis de transferencia Northern del clon CLZ_40 que se muestra en la figura 15; las figuras 17A-B son un análisis de hibridación in si tu, que muestra la expresión del ARNm para el clon 5 CLZ_40 en cerebro de ratón utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_40, en donde la figura 17A muestra la expresión en el núcleo • auditivo (Acb) y la corteza piriforme (Pir) y la figura 17B muestra la expresión del giro dentado (DG) ; 10 la figura 18 es una representación gráfica de los resultados del análisis por TOGA utilizando el cebador PCR 5' con bases de análisis TATT, que muestra los productos de PCR elaborados a partir de ARNm extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con 7.5 mg/kg 15 de clozapina, como sigue: testigo (sin clozapina), 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días, en donde la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 89 pb que está presente en la muestra testigo y que es regulada de manera diferencial por el 20 tratamiento con clozapina, con respecto al tiempo. La figura 19 muestra la secuencia de consenso del grupo de las siguientes 4 secuencias: AI415388: ADNc de Mus muscul us p3NMF19.5 de ratón Soares clon IMAGE : 350746 3', secuencia de ARNm; clon de ADNc de Mus muscul us AI841003: 25 UI-M-AMO-ado-e-04-O-UI.sl NIH BMAP MAM , secuencia de ARNm; ADN de Mus muscul us NbME13.5 14.5 de embrión de ratón Soares a AI413353 IMAGE: 356159 3', secuencia de ARNm; AI425991: ADNc de Mus muscul us de NbME13.5 14.5 de embrión de ratón Soares IMAGE: 426077 3', secuencia de ARNm. La figura 20 muestra la secuencia de el ARNm MDC15 de etaloproteasa-desintegrina de Mus muscul us EST AF006196, cd completo. La figura 21 muestra la secuencia de consenso del grupo de las siguientes 3 secuencias: C86593: secuencia del extremo 3' de ADNc de huevo fertilizado de Mus muscul us, clon J0229E09 3', secuencia de ARNm; AI428410: clon de ADNc de Mus muscul us de 13 5dpc 10666014 embrión de ratón Life Tech IMAGE: 553802 3', secuencia de ARNm; AI561814: clon de ADNc de Mus muscul us de piel de ratón (#937313) Stratagene JMAGE: 1227449 3', secuencia de ARNm. La figura 22 es una representación gráfica del análisis de transferencia Northern del clon CLZ_44 (ACGG 352), en donde se somete a análisis de transferencia un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina así como estándares de tamaño después de electroforesis y aquí se someten a sondeo con CLZ_44 radiomarcado. Los ratones se tratan con 7.5 mg/kg de clozapina, 4 mg/kg de haloperidol, 4 mg/kg de ketanserina durante dos semanas antes de la extracción de ARNm. ...--^-.ái.

La figura 23 es una representación gráfica del análisis de transferencia Northern del clon CLZ_38 (TGCA 109) , en donde se somete a análisis de transferencia un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A del 5 cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozap a así como estándares de tamaño y se somete a electroforesis y se somete a sondeo con CLZ_38 radiomarcado. Los ratones se tratan con 7.5 mg/kg de clozapina por los siguientes períodos antes de la extracción de 7?RNm: testigo 10 (sin clozapina) , 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días y 14 días. las figuras 24A-B son el resultado de un análisis ^ de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigido contra el extremo 3' de CLZ_16, que 15 muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_16 en secciones coronarias a través de los hemisferios del cerebro de ratón. La figura 24A muestra el marcado denso en la corteza y la parte circundante de la formación del hipocampo así como un marcado moderado en el tálamo dorsal y cerebro • 20 posterior. La figura 24B muestra un marcado uniforme a través de los mismos; las figuras 25A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ__17, que muestra el patrón de 25 expresión de ARN para CLZ 17 en una sección coronal a través de los hemisferios (25A) y la sección transversal a través del cerebro medio (25B) en cerebro de ratón; las figuras 26A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_24, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_24 en una sección coronal a través de los hemisferios (26A) y una sección transversal a través del tallo cerebral (26B) en cerebro de ratón; las figuras 27A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_26, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_26 en una sección coronal de los hemisferios a nivel de formación de hipocampo (27A) y sección coronal de los hemisferios a nivel del cuerpo estriado (27B) en cerebro de ratón; las figuras 28A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_28, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_28 en una sección coronal a través de los hemisferios a nivel del hipocampo (28A) y una sección coronal a través de la región posterior de los hemisferios (28B) en el cerebro de ratón; las figuras 29A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ 3 que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_3 en una sección coronal a través de los hemisferios a nivel del hipocampo (29A) y una sección transversal a través del cerebro medio (29B) en cerebro de ratón; las figuras 30A-B muestran un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_34, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_34 en una sección coronal a través de los hemisferios a nivel del hipocampo (30A) y la sección transversal a través del cerebro medio (30B) en cerebro de ratón; las figuras 31A-C son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_43, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_43 en secciones coronales de los hemisferios que muestran el marcado en el cuerpo estriado (31A), el marcado en la corteza (31B), y un marcado intenso en el cuerpo estriado (31C) en cerebro de ratón; las figuras 32A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_44 que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_44 en una sección coronal que muestra el marcado en el hipocampo, hipotálamo, corteza temporal (32A) y la sección coronal que muestra el marcado cortical (32B) en cerebro de ratón; las figuras 33A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_64, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_64 en diferentes secciones coronal de los hemisferios en cerebro de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Definiciones Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de algunos términos utilizados en esta especificación. En la presente invención, el término "aislado" se refiere a material extraído de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta de manera natural) , y por lo tanto está alterado "por la mano del hombre" de su estado de natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede ser parte de un vector o una composición de material, o puede estar contenido dentro de una célula, y aún asi estar "aislado" debido a que el vector, la composición de materia o célula particular no es el ambiente original del polinucleótido. En la presente invención, una proteina "secretada" se refiere a aquéllas proteinas capaces de ser dirigidas al fcUtat- .»- - . *- »—«... ..-..Afe.^-.... , RE (retículo endoplásmico) , vesículas secretoras o el espacio extracelular como resultado de una secuencia de señal, así como aquéllas proteínas liberadas en el espacio extracelular sin que necesariamente contengan una secuencia de señal. Si la proteína secretada es liberada al espacio extracelular, la proteína secretada puede experimentar procesamiento extracelular para generar una proteína "madura". La liberación al espacio extracelular se puede producir por muchos mecanismos, que incluyen exocitosis y separación proteolítica. Como se utiliza en la presente, un "polinucleótido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Por ejemplo, el polinucleótido puede contener la totalidad o parte de la secuencia nucleotídica de la secuencia de ADNc de longitud completa, que incluye las secuencias no traducidas 5' y 3', la región codificante con o sin la secuencia de señal, la región codificante para la proteina secretada así como fragmentos, epítopos, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico. Además, como se utiliza en la presente, un "polipéptido" se refiere a una molécula que tiene la secuencia traducida de aminoácidos generada a partir de un polinucleótido, definido de manera general. = &jey&¡att-la--?.:.«- . a a k i..

Un "polinucleótido de la presente invención también incluye aquellos polinucleótidos capaces de formar híbridos, bajo condiciones de hibridación rigurosas, con secuencias contenidas en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN 5 NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 o los complementos de las mismas, o el ADNc. El término "condiciones rigurosas de hibridación" se refiere a una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende formamida 50%, 5x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM) , fosfato de sodio 10 50 mM (Ph 7.6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a cizallamiento, desnaturalizado, seguido por lavado de los • filtros en O.lx SSC a aproximadamente 65°C. También se contemplan moléculas de ácido nucleico 15 que hibridizan con los polinucleótidos de la presente invención con condiciones de hibridación de menor rigurosidad. Los cambios en la rigurosidad de hibridación y la detección de señal se llevan a cabo principalmente mediante la manipulación de concentración de formamida • 20 (porcentajes menores de formamida generan mayor rigurosidad) ; condiciones de concentración salina o de temperatura. Por ejemplo, las condiciones de menor rigurosidad incluyen incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende 6x SSPE (20X SSPE = NaCl 3M; . .**£**,. ****A?**M?.~*.- ..*f~ .. ~ jñj*ití*ltbji*? - ?..* AA^. -AJ NaH2P04 0.2M; EDTA 0.02M, pH 7.4), SDS 0.5%, formamida 30%, 100 µg/ml de ADN bloqueado de esperma de salmón; seguido por lavados a 50°C con 1XSSPE, SDS 0.1%. Además, para obtener una rigurosidad incluso menor, los lavados que se realizan después de hibridación rigurosa se pueden llevar a cabo a concentraciones salinas más altas (por ejemplo, 5X SSC). Nótese que las variaciones en las condiciones anteriores se pueden llevar a cabo mediante la inclusión o sustitución, o ambas cosas de reactivos de bloqueo alternativos utilizados para suprimir el fondo en experimentos de hibridación. Los reactivos de bloqueo habituales incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado y formulaciones registradas disponibles comercialmente. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos puede necesitar modificación de las condiciones de hibridación descritas antes, debido a los problemas con la compatibilidad. Por supuesto, un polinucleótido el cual hibridiza únicamente para secuencias poliA+ (tales como cualquier secuencia poliA+ 3' terminal de un ADNc que se muestra en la lista de secuencias) o para una secuencia complementaria de residuos T (o U) podria no incluirse en la definición de "polinucleótido", dado que tal polinucleótido hibridizaria con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una cadena poli (A) o el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de cadena doble) . Un polinucleótido de la presente invención puede estar constituido de cualquier polirribonucleótido o 5 polidesoxirribonucleótido que pueda ser ARN o ADN no modificado o bien ADN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar constituidos de ADN de cadena sencilla o doble, ADN que es una mezcla de regiones con cadenas sencillas y dobles, ARN de cadena sencilla o doble y 10 ARN que es una mezcla de regiones con cadenas sencillas y dobles, moléculas híbridas que comprenden ADN, y ARN que puede ser de cadena sencilla, o de manera más habitual, de • cadena doble o una mezcla de regiones con cadena sencilla y con cadena doble. Además, el polinucléotido puede estar 15 constituido de regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o bien tanto ARN como ADN. Un polinucleótido también puede contener una o más bases modificadas de estructuras principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por • 20 ejemplo, bases tritiladas y bases poco comunes tales como inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones al ADN y ARN; y por lo tanto el término "polinucleótido" abarca las formas modificadas química, enzimática o metabólicamente. El polipéptido de la presente invención puede 25 estar constituido de aminoácidos unidos entre si por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, es decir, isósteros de péptidos y puede contener aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos codificados genéticamente. Los polipéptidos pueden estar modificados ya sea por 5 procesos naturales tales como procesamiento post- traduccional, o bien por técnicas de modificación química las cuales son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en las monografías más detalladas, así como en literatura de 10 investigación abundante. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo la estructura principal peptídica, las cadenas laterales de • aminoácidos y las partes amino o carboxilo terminales. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de 15 modificación en grados iguales o variables en diversos sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la incorporación de ubiquitina o pueden • 20 volverse cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y ramificados cíclicos pueden resultar de un procedimiento natural posterior a la traducción o se pueden elaborar por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, 25 amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción hemo, unión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, unión covalente de un lipido o un derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclizado, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de enlaces reticulados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formación de ?-carboxilación, glicosilación, formación de ancla GPl, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación y generación de derivados de ubiquitina (véase, por ejemplo, T. E. Creighton, Proteins - Structure And Mol ecular Properti es, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993); B. C. Johnson, Ed., Posttransla tional Coval ent Modifi cation Of Proteins, Academic Press, New York, pgs . 1-12 (1983); Seifter et al., Meth . Enzymol , 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann . N. Y. Acad. Sci . 663:48-62 (1992)). El término "un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a polipéptidos que muestran actividad similar, aunque no necesariamente idéntica a la actividad de un polipéptido de la presente invención que incluye formas maduras, medidas en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en el que exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la del polipéptido, sino más bien sustancialmente similar a la dependencia a la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato mostrará mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y de manera más preferible no más de aproximadamente 10 veces menos actividad, y de manera mucho más preferible no más de aproximadamente 3 veces menos actividad en relación al polipéptido de la presente invención) . La secuencia traducida de aminoácidos, que comienza la metionina, se identifica, aunque otros marcos de lectura también se pueden traducir fácilmente utilizando técnicas de biología molecular conocidas. Los polipéptidos producidos por la traducción de estos marcos de lectura abierta alternativos se contemplan específicamente por la prsente invención. Las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 y las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 son suficientemente precisas y de otra manera adecuadas para diversos usos bien conocidos en la técnica y que se describen adicionalmente en lo siguiente. Estas sondas también hibridizarán a moléculas de ácido nucleico en ÍÉ?^ÍO ÍLL..^^..^a^a^j.^^ii. ia^tiiaij--.^j.|^,-.-_^ -^Btjh---------------ai-tt.- ?¿Al \ká muestras biológicas, por lo que permiten la habilitación de diversos métodos forense y de diagnóstico de la invención. De manera similar, los pollpéptidos identificados de las traudcciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 se pueden utilizar para generar anticuerpos los cuales se unen específicamente a las proteínas secretadas codificadas por los clones de ADNc identificados . No obstante, las secuencias de ADN generadas por reacciones de secuenciado, pueden contener errores de secuenciado. Los errores existen como nucleótidos mal identificados, o como inserciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de ADN generada. Los nucleótidos insertados o suprimidos erróneamente provocan desplazamientos de marco en los marcos de lectura de la secuencia predicha de aminoácidos. En estos casos, la secuencia predicha de aminoácidos difiere de la secuencia real de aminoácidos aunque la secuencia de ADN generada puede ser mayor de 99.9% idéntica a la secuencia real de ADN (una inserción o supresión de una base en un marco de lectura abierta de más de 1000 bases) . La presente invención también se relaciona con genes que corresponden a las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, y las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107.

El gen correspondiente se puede aislar de acuerdo con métodos conocidos utilizando la información de secuencia que se describe en la presente. Tales métodos incluyen preparar sondas o cebadores a partir de la secuencia descrita e identificar o amplificar el gen correspondiente de las fuentes apropiadas de material genómico. También se proporciona en la presente invención homólogos de especies. Los homólogos de especies se pueden aislar e identificar al elaborar sondas adecuadas o cebadores a partir de las secuencias que se proporcionan en la presente y realizar una detección sistemática de la fuente de ácido nucleico adecuada para el homólogo deseado. Los polipéptidos de la invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales pollpéptidos incluyen polipéptidos aislados, que se presentan de manera natural, polipéptidos generados de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética o polipéptidos generados por una combinación de estos métodos. Los medios para preparar tales polipéptidos son bien comprendidos en la técnica. Los polipéptidos pueden estar en forma de una proteína secretada, que incluye la forma madura, o pueden ser parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión (véase posteriormente) . Con frecuencia es provechoso incluir una secuencia adicional de aminoácidos la t.tM ^..t^i ik. ..?tíÍLMr. LÍti*t?.,-m.tt, ^? cual contenga secuencias secretoras o lider, prosecuencias, secuencias que ayuden en la purificación, tales como residuos múltiples de histidina o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente se proporcionan en una forma aislada, y preferiblemente se purifican sustancialmente. Una versión producida de manera recombinante de un polipéptido, que incluye al polipéptido secretado, se puede purificar sustancialmente por un méteodo de una etapa descrito por Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de la invención también se pueden purificar a partir de fuentes naturales o recombinantes utilizando anticuerpos de la invención generados contra la proteína secretada en métodos los cuales son bien conocidos en la técnica.

Secuencias de señal Están disponibles métodos para predecir si una proteína tiene una secuencia de señal, asi como el punto de separación para esa secuencia. Por ejemplo, el método de McGeoch utiliza información desde una región cargada N terminal corta y una región sin carga subsecuente de la proteína completa (sin separación) ( Virus Res . , 3:271-286 (1985) ) . El método de von Heinje utiliza la información de ^*. *t** -. t ... jatom f„„,,„ «..tot-.í-tf*'^'•,MS"*•*• *--" - - -**<¿~->*?µ**:* los residuos que rodean al sitio de separación, habitualmente los residuos -13 a +2, en donde +1 indica la parte amino terminal de la proteína secretada (Nucl eic Acids Res . , 14:4683-4690 (1986)). Por lo tanto, a partir de una secuencia deducida de aminoácidos, se pueden identificar una secuencia señal y una secuencia madura. En el presente caso, la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido secretado se analiza por un programa de computadora denomiminado Signal P (Nielsen et al., Protein Engineering, 10:1-6 (1997), que predice la posición celular de una proteina en base en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción computacional de localización, se incorporan los métodos de McGeoch y von Heinje . Como una persona habitualmente experta en la técnica apreciará, sin embargo, los sitios de separación algunas veces varian de un organismo a otro y no se pueden predecir con certidumbre absoluta. En consecuencia, la presente invención proporciona polipéptidos secretados que tienen una secuencia que corresponde a las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19, las cuales tienen una parte N terminal que comienza dentro de los 5 residuos (es decir, + o - 5 residuos) del punto de separación predicho. De manera similar, también se reconoce que en algunos casos la separación de la secuencia de señal de la proteína secretada no es completamente uniforme, lo que resulta en más de una especie secretada. Estos polipéptidos y los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, se contemplan por la presente invención. Además, la secuencia de señal identificada por el análisis anterior puede no necesariamente predecir una secuencia de señal que se presente de manera natural. Por ejemplo, la secuencia de señal que se presenta de manera natural puede estar adicionalmente hacia el extremo 5' de la secuencia de señal predicha. Sin embargo, es probable que la secuencia de señal predicha sea capaz de dirigir la proteína secretada al RE. Estos polipéptidos, y los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, están contemplados por la presente invención.

Variantes polinucleotidicas y polipéptidicas El término "variantes" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de la presente invención, pero que retiene las propiedades esenciales del mismo. De manera general, las variantes son en general muy similares y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido de la presente invención.

El término "identidad" por si mismo tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas (véase, por ejemplo, Lesk, A.M., Ed., Computational Mol ecular Biol ogy, Oxford University Press, New York (1988); Smith, D.W., Ed, Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin, A.M., y Griffin, H.G., Eds., Computer Analysi s Of Sequence Da ta , Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis In Mol ecular Bi ology, Academic Press, (1987) ; y Gribskov, M. y Devereux, J., Eds., Sequence Analysi s Primer, M Stockton Press, New York, (1991)). Aunque existen diversos métodos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, el término "identidad" es bien conocido en los expertos en la técnica (véase, por ejemplo Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J. Applied Ma th . , 48:1073 (1988)). Los métodos utilizados habitualmente para determinar identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Martin J. Bishop, ed., "Guide to Huge Computers", Academic Press, San Diego, (1994), y Carrillo, H., y Lipton, D., SIAM J. Applied Math, 48:1073 (1988)). Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos están codificados en programas de computadora e incluyen el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., Nuc . Acids Res . 12(1): 387 Aita.^. M»Éa-^-^a-..^fcJ.Ji¡-i-^-..... - ^Aafe*---^ (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Mol ec . Biol . , 215:403 (1990), el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711 (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) ) . Cuando se utiliza cualquiera de los programas de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de manera que se calcula el porcentaje de identidad respecto a la longitud completa del polinucleótido de referencia y aquéllas separaciones en la identificación de hasta 5% del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia se permiten. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia total entre la secuencia solicitada (una secuencia de la presente invención) y la secuencia objetivo, también denominada como alineación de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB basada en el algoritmo de Brutlag et al. ( Comp. App. Biosci . , 6:237-245 (1990)). El término "secuencia" incluye secuencias de nucleótidos y aminoácidos. En una alineación de secuencia, las secuencias solicitada y objetivo son ambas l--8t- . --t»*—Jilt *-J*~~ ^>^«* <u> fci*l^« ^AtJfca¿fej^ja-l?>ajy**fc*jfcJto?.. ... secuencias nucleotidicas o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación de secuencia global es el por ciento de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en la investigación FASTDB de una secuencia de ADN para calcular el por ciento de identidad son: matriz = unitaria, k-registro = 4, castigo por mal pareamiento = 1, castigo por unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separación 0.05 y tamaño de intervalos = 500 o la longitud de la secuencia de solicitud en nucleótidos de bases, la que sea más corta. Los parámetros preferidos utilizados para calcular el por ciento de identidad de similitud de una alineación de aminoácidos son: matriz = PAM 150, k-registro = 2, castigo por mal pareamiento = 1, castigo por unión = 20, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de recorte = 1, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separación = 0.05 y tamaño de intervalo = 500 o la longitud de la secuencia solicitada en residuos de aminoácidos, lo que sea más corto. Como una ilustración, un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotídica de por lo menos 95% de "identidad" con una secuencia contenida en la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 significa que el polinucleótido es idéntico a una secuencia contenida en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 o el ADNc, excepto que la secuencia pol ucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la longitud total (y no solo dentro de una cadena de 100 nucleótidos dada) . En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotidica por lo menos 95% idéntica a las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, hasta 5% de nucleótidos en la secuencia contenida en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 o el ADNc se puede suprimir, insertar o sustituir con otros nucleótidos. Estos cambios se pueden presentar en cualquier parte a través del polinucleótido. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen pol ucleótidos que tienen por lo menos 80% de identidad, de manera más preferible, por lo menos 90% de identidad y de manera mucho más preferible por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con una secuencia contenida en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, una persona habitualmente experta en la técnica reconocerá de inmediato que un gran número de los polinucleótidos que tienen por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad codificará para un polipéptido idéntico a una secuencia de aminoácidos contenida en las fc-- -É.*-i-*,.i?-ki-.». ?* ****. .^** ^. .^ ^**.*** ** * traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. De manera similar, por un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos, por ejemplo, 95% de "identidad" a un polipéptido de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica al polipéptido de referencia, excepto que la secuencia polipeptidica puede inclur hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la longitud total del polipéptido de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos aminoácidos de la secuencia de referencia pueden estar suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta 5% de los residuos aminoácidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar dentro de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones amino o carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otra parte entre las posiciones terminales, interpuestas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. . t** A?*l*Jl*3¿r-*?..**?- ?****?~...t ¡r. -^ ^. ^ff„' t ~~¿Má*l ***?.l Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen por lo menos 80% de identidad, de manera más preferible por lo menos 85% de identidad, de manera más preferible por lo menos 90% de identidad y de manera mucho más preferible por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos contenida en las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Preferiblemente, los polipéptidos anteriores pueden mostrar por lo menos una actividad biológica de la proteína. En una modalidad preferida, los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen por lo menos 90% de similitud, de manera más preferible por lo menos 95% de similitud y de manera aún más preferible por lo menos 96%, 97%, 98% ó 99% de similitud con una secuencia de aminoácidos contenida en las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o en ambas. Se prefieren especialmente variantes polinucleotidicas que contengan alteraciones las cuales producen sustituciones, adiciones o supresiones silenciosas pero que no alteren las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Las variantes nucleotídicas producidas por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético son las que se prefieren. Además, también se prefieren variantes en las cuales 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o agregados, en cualquier combinación. Las variantes polinucleotídicas se pueden elaborar por diversas razones. Por ejemplo, se puede generar una variante polinucleotídica para optimizar la expresión de codones para un huésped particular, es decir, codones en el ARNm humano los cuales se pueden cambiar por los preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli ) . Las variantes que se presentan de manera natural se denominan "variantes alélicas" y se refieren a una o varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en cromosoma de un organismo (Lewin, B., Ed., Genes II, John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar ya sea a nivel polinucleotídico o polipeptídico, o ambos niveles. De manera alternativa, las variantes que no se presentan de manera natural se pueden generar por técnicas de mutagénesis o por sintesis dirigida. Utilizando métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnologías de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden suprimir uno o más aminoácidos de la parte N terminal o C terminal de la proteína secretada sin pérdida sustancial de la función biológica. Ron et al., han %??, ¡. .. *í*u*kiítmí??,jñ?.*¡mjii*£x i: --?i--.a-- .i.^a -iJt-aj...., reportado variantes de proteína KGF que tienen actividad de unión heparina incluso después de suprimir 3, 8 ó 27 residuos aminoácidos de la parte amino terminal (J. BioJ. Chem . , 268: 2984-2988 (1993)). De manera similar, el interferón ? muestra hasta diez veces mayor actividad después de suprimir 8-10 residuos aminoácidos de la parte carboxi terminal de esta proteina (Dobeli et al., J. Biotechnology, 7:199-216 (1988) ) . Además, la evidencia amplia demuestra que las variantes con frecuencia retienen una actividad biológica similar a la de la proteína que se presenta de manera natural. Por ejemplo, Gayle et al., llevan a cabo un análisis mutacional extenso de la citocina humana IL-la (J. Biol . Chem. , 268:22105-22111 (1993)). Utilizan mutagénesis aleatoria para generar más de 3,500 mutantes individuales de IL-1 que promedian 2.5 cambios aminoácidos por variante en toda la longitud de la molécula. Se examinan mutaciones múltiples en cada posición posible de aminoácidos. Los investigadores concluyen que "la mayor parte de la molécula se puede alterar con poco o nulo efecto en [la unión o la actividad biológica]". (Véase Gayle et al., (1993), Abstract.) De hecho, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3,500 secuencias nucleotídicas examinadas, producen una proteína que difiere significativamente en la actividad en comparación con la de tipo silvestre. Además, incluso si se suprime uno o más aminoácidos de la parte N terminal o C terminal de un polipéptido resulta en una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, aún se pueden retener otras actividades biológicas. Por ejemplo, la capacidad de una variante por supresión para inducir o unir anticuerpos los cuales reconocen la forma secretada probablemente se retendrán cuando menos de la mayor parte de los residuos de la forma secretada se separen de la parte N terminal o C terminal. Siempre que un polipéptido particular que carezca de los residuos N o C terminal de una proteína retenga actividades inmunogénicas se puede determinar fácilmente por métodos sistemáticos descritos en la presente o conocidos de alguna otra manera en el arte. La invención incluye además variantes polipeptídicas las cuales muestran actividad biológica sustancial. Tales variantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, secuencias repetidas y sustituciones que se seleccionan de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica de manera que tienen poco efecto en la actividad. Por ejemplo, se proporciona una guía respecto a la manera como realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie et al., -i^te***« - tfcft*>-.— ..«-. -^ft-*^ ***- » ~. *-* *a*.?M~*t ^llk** ..X.,^ Science, 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que existen dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. La primera estrategia aprovecha la tolerancia de sustituciones de aminoácidos por selección natural durante el proceso de la evolución. Al comparar secuencias de aminoácidos en especies diferentes, se pueden identificar los aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados probablemente sean importantes para la función de la proteina. En contraste, las posiciones de aminoácidos en donde se han tolerado sustituciones por selección natural indican que estas posiciones no son fundamentales para el funcionamiento de la proteína. De esta manera, las posiciones que toleran sustitución de aminoácidos se pueden modificar y aún así se mantiene la actividad biológica de la proteína. La segunda estrategia utiliza la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones especificas de un gen clonado para identificar regiones criticas para la función proteinica. Por ejemplo, se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración con alanina (la introducción de mutaciones alanina únicas en cada residuo en la molécula) (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Las moléculas mutantes resultantes se pueden someter a examen para determinar su actividad biológica. De acuerdo con Bowie et al., estas dos estrategias han mostrado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además cuáles cambios de aminoácidos es probable que sean permisivos en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteina. Por ejemplo, los residuos aminoácidos más enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras que algunas características de las cadenas laterales de la superficie generalmente se conservan. Además, las sustituciones conservadoras de aminoácidos toleradas involucran la sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrofóbicos Ala, Val, Leu e He; La sustitución de los residuos hidroxilo Ser y Thr; la sustitución de los residuos ácidos Asp y Glu; la sustitución de los residuos amida Asn y Gln, la sustitución de los residuos básicos Lys, Arg e His; la sustitución de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp; y la sustitución de los aminoácidos de tamaño pequeño Ala Ser, Thr, Met y Gly. Además de la sustitución de aminoácidos conservadoras, las variantes de la presente invención incluyen: (i) sustituciones con uno o más residuos aminácidos no conservados en donde los residuos aminoácidos sustituidos pueden o no estar codificados por el código genético, o (ii) sustitución con uno o más residuos aminoácidos que tienen un grupo sustituyente, o (iii) fusión del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como el compuesto para aumentar la estabilidad o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales tales como un péptido de fusión de IgG Fc, o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que facilite la purificación. Se considera que tales polipéptidos variantes están dentro del alcance de aquéllos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. Por ejemplo, las variantes polipeptídicas que contienen sustituciones de aminoácidos, de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros puede generar proteínas con características mejoradas, tales como agregación disminuida. Como se sabe, la agregación de formulaciones farmacéuticas reduce la actividad y aumenta la depuración debido a la actividad inmunogénica de los agregados (véase, por ejemplo, Pinckard et al., Clin . Exp. Immunol . , 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes, 36:838-845 (1987); Cleland et al., Cri t . Rev. Therapeutic Drug Carri er Systems, 10:307-377 (1993)).

Fragmentos polinucleotídicos y polipeptídicos -"^-^ta-il ¡É-án si En la presente invención, un "fragmento polinucleotídico" se refiere a un polinucleótido corto que tiene una secuencia de ácidos nucleicos contenidos en las mostradas en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Los fragmentos nucleotídicos cortos preferiblemente son de por lo menos aproximadamente 5 nt, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 20 nt, pero de manera aún más preferible de por lo menos aproximadamente 30 nt, e incluso de manera más preferible de por lo menos aproximadamente 40 nt de longitud. Un fragmento "de por lo menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se pretende que incluya 20 o más bases contiguas de la secuencia de ADNc contenida en las mostradas en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Estos fragmentos nucleotídicos son útiles como sondas de diagnóstico cebadores, como se discute en la presente. Por supuesto, se prefieren fragmentos más grandes (por ejemplo, 50, 150 y más nucleótidos) . Además, los ejemplos representativos de fragmentos polinucleotídicos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que tienen una secuencia de aproximadamente el nucleótido número 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450 hasta el fin de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107.

- -*" "*-* * -*^-' -**- *-*-* .- **?* ****** *** En este contexto, el término "aproximadamente" incluye los intervalos mencionados particularmente, más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5, 4, 3, 2 ó 1) en cada parte terminal o en ambas partes terminales. Preferiblemente, estos fragmentos codifican para un polipéptido el cual tiene actividad biológica. En la presente invención, el término "fragmento polipeptídico" se refiere a una secuencia corta de aminoácidos contenida en las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Los fragmentos de proteína pueden ser "autosustentables" o pueden estar constituidos dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma parte o región, de manera más preferible como una región continua única. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptídicos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos de aproximadamente número de aminoácidos 1-20, 21-40, 41-60 ó 61 hasta el final de la región codificante. Además, los fragmentos polipeptídicos pueden ser de aproximadamente 20, 30, 40, 50 ó 60 aminoácidos de longitud. En este contexto, el término "aproximadamente" incluye los intervalos mencionados para particularmente, más grandes o más pequeños por varios aminoácidos (5, 4, 3, 2 ó 1) en cualquiera de los extremos o en los dos extremos .

Los fragmentos polipeptídicos preferidos incluyen la proteína secretada así como la forma madura. Los fragmentos polipeptídicos preferidos adicionales incluyen la proteína secretada o la forma madura que tiene una serie continua de residuos suprimidos de la parte amino o carboxi terminal, o de ambas. Por ejemplo, se puede suprimir cualquier cantidad de aminoácidos que varían de 1-60 desde la parte amino terminal del polipéptido secretado o de la forma madura. De manera similar, cualquier cantidad de aminoácidos, que varía de 1-30 se puede suprimir de la parte carboxi terminal de la proteína secretada o la forma madura. Además, se prefiere cualquier combinación de las supresiones amino y carboxi terminales anteriores. De manera similar, también se prefieren fragmentos polinucleotídicos que codifican para estos fragmentos polipeptídicos. También se prefieren polipéptidos y fragmentos polinucleotídicos caracterizados por dominios estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden regiones de hélice a o formadoras de hélice a, regiones de lámina ß o formadoras de lámina ß, regiones de giro y formadores de giro, regiones helicoidales y formadores de helicoidales, regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones a antipáticas, regiones ß antipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión de .. J-.._,«t_-, .-i-aM^¿iS .-S-.-.r.. sustrato y regiones con un alto índice antigénico. Los fragmentos polipeptídicos de las traducciones de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 se encuentran dentro de los dominios conservados y se contemplan específicamente por la presente invención. Además los fragmentos polinucleotídicos que codifican para estos dominios también se contemplan. Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquéllos que muestran actividad similar, aunque no necesariamente idéntica a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad no deseada disminuida.

Epitopos y anticuerpos En la presente invención, el término "epítopos" se refiere a los fragmentos polipeptídicos que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, especialmente en un humano. Una modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un fragmento polipeptidico que comprende un epitopo, asi como el polinucleótido codificado por este fragmento. Una región de una molécula de proteina a la cual se puede unir un anticuerpo se define como un "epítopo _ttaMfc--M..flfc-d -- .*-^..^tfcfl^^^ antigénico". En contraste, un "epítopo inmunogénico" se define como parte de una proteína que induce una respuesta de anticuerpos (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . E. U. A. , 81:3998-4002 (1983)). 5 Los fragmentos los cuales funcionan como epítopos se pueden producir por cualquier medio convencional (véase, por ejemplo Houghten, R. A., Proc . Nati . Acad. Sci . E. O. A. , 82:5131-5135 (1985), descritas adicionalmente en la patente de E.U.A. No. 4, 631,211) . 10 En la presente invención, los epítopos antigénicos preferiblemente contienen una secuencia de por lo menos siete y de manera preferible por lo menos nueve y de manera • mucho más preferible entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Los epítopos antigénicos son 15 útiles para generar anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al epitopo (Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell , 37:767-778 (1984); Sutcliffe, J. G. et al., Science, 219:660-666 (1983)). De manera similar, se pueden utilizar los epitopos • 20 inmunogénicos para inducir anticuerpos de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra ; Chow, M. et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . E. U. A. 82:910-914; y Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol . , 66:2347-2354 (1985)). Un epitopo 25 inmunogénico preferido incluye la proteina secretada. Los epítopos inmunogénicos se pueden presentar juntos con la proteina portadora tal como albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón), o si es suficientemente grande (por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos) sin un portador. Sin embargo, los epítopos inmunogénicos que comprenden hasta 8 a 10 aminoácidos se ha demostrado que son suficientes para generar anticuerpos capaces de unirse, de manera mínima, a epítopos lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en la prueba de transferencia Western) . * Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" (Ab, por sus siglas en inglés) , o "anticuerpo monoclonal" (Mab, por sus siglas en inglés) significa incluir moléculas intactas asi como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2 los cuales son capaces de unir específicamente a proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de circulación y pueden tener menos tejido inespecífico unido en comparación con el anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí . Med. , 24:316-325 (1983)). por lo tanto, estos fragmentos son los que se prefieren asi como los productos de FAB u otras bibliotecas de expresión de inmunoglobul a. Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados. té&--É-----fcá-Tía,-i?.¡l?----É-ffl.(..-^---*g"- .

Las modalidades adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar por técnicas conocidas, y ofrecer la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o únicamente el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. De manera alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede estar constituido de un sitio de unión a antigeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la generación de anticuerpos quiméricos y de anticuerpos monoclonales sometidos a ingeniería adicionales incluyen los descritos en Riechmann et al. (Na ture, 332:323, 1988), Liu et al. ( PNAS, 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology, 7:934, 1989), y Winter y Harris ( TJPS, 14:139, mayo, 1993). Un método para generar un anticuerpo humano comprende inmunizar a un animal no humano, tal como un ratón transgénico, con un polipéptido traducido de una secuencia nucleotidica que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, por lo que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido traducido de una secuencia nucleotidica elegida de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 se generan en el animal. Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos en animales no humanos. Los anticuerpos pueden ser parcialmente humanos, o de preferencia completamente humanos. Se pueden utilizar animales no humanos (tales como ratones transgénicos) en los cuales se ha introducido el material genético que codifica para una o más de las cadenas de inmunoglobulina humana. Tales ratones transgénicos pueden ser alterados genéticamente de diversas maneras. La manipulación genética puede resultar en cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina humana que sustituyen a las cadenas de inmunoglobulina endógena en por lo menos parte (pero preferiblemente en virtualmente todos) los anticuerpos generados por el animal cuando se inmuniza. Los anticuerpos producidos al inmunizar animales transgénicos con un polipéptido traducido de una secuencia nucleotídica que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 se proporcionan en la presente. Se han preparado ratones en los cuales uno o más genes de inmunoglobulina endógenos se inactivan por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones para sustituir a los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en los animales ****¿±k* ****.. -¿-^^-.-^¡i^^l-iL ^^^ *"- l?? . incorporan cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. Los ejemplos de técnicas para la producción y uso de tales animales transgénicos se describen en las patentes 5 de E.U.A. Nos. 5,814,318; 5,569,825; y 5,545,806, los cuales se incorporan como referencia en la presente. Se pueden generar anticuerpos monoclonales por procedimientos convencionales, por ejemplo, al inmortalizar células de bazo cosechadas de animales transgénicos después 10 de completar el protocolo de inmunización. Se pueden fusionar las células de bazo con células de mieloma para generar hibridomas, por procedimientos convencionales. # Un método para producir una línea de células de hibridoma comprende inmunizar a un animal transgénico con un 15 inmunógeno que comprende por lo menos siete residuos aminoácidos contiguos de un polipéptido traducido de tal secuencia nucleotidica que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107; cosechar células de bazo del animal inmunizado; fusionar las células • 20 de bazo cosechadas a la línea de células de mieloma y de esta manera generar células de hibridoma; e identificar la línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido traducido desde una secuencia nucleotídica que se elige de las SECUENCIAS DE 25 IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Tales líneas de células de hibridoma y de anticuerpos monoclonales producidas a través de las mismas están abarcadas por la presente invención. Los anticuerpos monoclonales secretados por la linea de células de hibridoma se purifican por técnicas convencionales. Los anticuerpos se pueden utilizar en un procedimiento in vi tro o se pueden administrar in vivo para inhibir la actividad biológica inducida por un polipéptido traducido a partir de una secuencia nucleotidica que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. De esta manera se pueden tratar trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de tales polipéptidos de la presente invención con receptores de superficie celular. Un método terapéutico involucra la administración in vi vo de un anticuerpo bloqueador a un mamífero en una cantidad efectiva para reducir la actividad biológica inducida por un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Por ejemplo, una administración crónica de neurolépticos puede provocar efectos colaterales no deseados. La administración de un anticuerpo derivado de polinucleótidos identificados puede bloquear la señalización que provoca estos efectos colaterales. De manera alternativa, un anticuerpo derivado de los polinucleótidos lá jj,J -m-d. ti --- ~±^u**.-^..^r.~H*?¡iiit?a¿llMll?il ^? í. identificados puede bloquear selectivamente proteinas que provoquen efectos colaterales motores. También se proporcionan en la presente conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo de 5 diagnóstico) o terapéutico, unido a un anticuerpo dirigido contra un pollpéptido traducido de una secuencia nucleotidica que se elige de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Los ejemplos de tales agentes son bien conocidos e incluyen, pero no se 10 limitan los radionúclidos de diagnóstico, radionúclidos terapéuticos y medicamentos citotóxicos. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vi tro o in vi vo . • Proteínas de fusión 15 Cualquier polipéptido de la presente invención se puede utilizar para generar proteinas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención se puede fusionar a una segunda proteina, que se puede utilizar como • 20 etiqueta antigénica. Los anticuerpos generados contra el polipéptido de la presente invención se pueden utilizar para detectar indirectamente la segunda proteina por unión al polipéptido. Además, debido a que las proteinas secretadas se dirigen a posiciones celulares en base en las señales de 25 tráfico, los polipéptidos de la presente invención se pueden . ^3a^£...^A.^^^.M<,a^^a^^^^i-^5-aa^.^«^^.^ -^a^g-jaj^gjjgjaea utilizar para dirigir moléculas una vez fusionadas a otras proteínas. Los ejemplos de dominios que se pueden fusionar a polipéptidos de la presente invención incluyen no solo 5 secuencias de señal heterólogas sino también otras regiones funcionales heterólogas. La fusión no necesariamente necesita ser directa, sino que se puede generar a través de secuencias enlazadoras. Además, las proteinas de fusión también se pueden 10 someter a ingeniería para mejorar las características del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, se puede agregar una región de aminoácidos adicionales, • particularmente aminoácidos cargados a la parte N terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia 15 durante la purificación de la célula huésped o el manejo y almacenamiento subsecuentes. Además, se pueden agregar porciones peptídicas al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden eliminar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de porciones • 20 peptidicas para facilitar el manejo de polipéptidos es familiar para los expertos en la técnica. Además, los polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos y específicamente epítopos, se pueden combinar con partes del dominio constante de las 25 inmunoglobulinas (IgG) lo que resulta en polipéptidos ?*.L--L-i.j---E-i*.fc---.-g---^ quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media aumentada in vivo . Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4-humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero (véase, el documento EP A 394,827; Traunecker et al., Na ture, 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas unidas a disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas en comparación con los fragmentos de proteína secretada monoméricos o los fragmentos de proteínas solos (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). De manera similar, el documento EP-A-0 464 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprende diversas porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteina humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en terapia y diagnóstico y por lo tanto puede resultar, por ejemplo, en propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, EP-A 0 232 262) . De manera alternativa, la supresión de la parte Fc después de que una proteina de fusión se ha expresado, detectado y purificado, puede ser lo que se «i-iA¿Jsf*fa-f-* ' -. Alten.* ,., -.<^..,^aM^aj.^.,,,...-j^.--fe ijj-Í^| i^^ desee. Por ejemplo, la porción Fc puede impedir la terapia y diagnóstico si la proteina de fusión se utiliza como un antigeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de medicamentos, por ejemplo, las proteínas humanas tales como hIL-5, se han fusionado con porciones Fc con el propósito de ensayos de detección sistemática de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5 (véase, D. Bennett et al., J. Molecular Recogni tion, 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Bi ol . Chem. , 270:9459-9471 (1995)). Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar a secuencias marcadoras tales como un péptido que facilite la purificación del polipéptido fusionado. En las modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadores es un péptido hexahistidina tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., por ejemplo, la hexahistidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión ( Proc . Nati . Acad. Sci . E. U. A. , 86:821-824 (1989)). Otra etiqueta peptidica útil para purificación, la etiqueta "HA" corresponde a un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell , 37:767 (1984) ) . Otras proteinas de fusión pueden utilizar la capacidad de los polipéptidos de la presente invención para k^. *.l* *? . dirigir el suministro de un péptido biológicamente activo. Esto puede incluir el suministro enfocado de una toxina a células tumorales o a un factor de crecimiento a hemocitoblastos . De esta manera, cualquiera de las fusiones anteriores se puede someter a ingeniería utilizando los polinucleótidos o los polipéptidos de la presente invención.

Vectores, células huéspedes y producción de proteínas La presente invención también se relaciona con vectores que contienen el polinucleótido de la presente 5 invención, células huéspedes y la producción de polipéptidos, por técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o • retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en cuanto a replicación o bien estar defectuosos en cuanto a 10 replicación. En este último caso, la propagación viral generalmente se ha producido únicamente en células huéspedes complementarias . Los polinucleótidos se pueden unir a un vector que contenga un marcador seleccionable para propagación en un 15 huésped. De manera general, se introduce un vector plasmídico en un precipitado, tal como precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo como un lipido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vi tro utilizando una línea de células de empacado apropiadas y 20 después se puede someter a transducción en células huéspedes . La pieza de inserción polinucleotidica puede unirse operablemente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL de fago ?, los promotores de E. coli , lac, trp, phoA y tac, los promotores temprano y tardío SV40 y los promotores de LTR retrovirales, por mencionar algunos. Otros promotores adecuados son conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Los montajes (plásmidos recombinantes) de 5 expresión contendrán además sitios para inicio de transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para traducción. La porción codificante de los transcritos expresados por los montajes preferiblemente incluirán un codón de inicio de traducción 10 al inicio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente en el extremo del polipéptido que se va a traducir. • Como se ha indicado, los vectores de expresión preferiblemente incluirán por lo menos un marcador 15 seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o a neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetraciclina, canamicina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huéspedes • 20 apropiados incluyen, pero no se limitan a células bacterianas tales como E. coli , células de Streptomyces y de Salmonella typhimuri um; células micóticas tales como células de levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y células de Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, 25 COS, 293, células de melanoma de Bowes y células vegetales.

Los medios de cultivo y las condiciones apropiadas para las células huéspedes descritas antes son conocidas en la técnica. Entre los vectores preferidos para uso en bacterias se incluyen pEQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Ine; vectores pBluescript, vectores Phagescppt, pNH8A, PNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán evidentes fácilmente para los expertos en la técnica. La introducción del montaje (plásmido recombinante) en la célula huésped se puede llevar a cabo por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology, (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención de hecho se pueden expresar por una célula huésped que carezca de un vector recombinante.

¿^S.áÍ---Ía---^-ate^¿^ll ^-E-^--¿ -^-- .^-- . J.^^^¿.£. »¿S---<*.¿?á-¿&_--^1-te-, Actualmente no existen marcadores de diagnóstico específicos que se puedan utilizar para evitar o retardar episodios psicóticos de esquizofrenia. Los polinucleótidos de la pésente invención se pueden utilizar como marcadores de cromosoma para diagnóstico para esquizofrenia. Un polipéptido de esta invención se puede recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografia de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía con lectina. De manera más preferible, se utiliza para purificación cromatografía líquida de alta resolución ("CLAR", por sus siglas en inglés) . Los polipéptidos de la presente invención, y preferiblemente la forma secretada, también se pueden recuperar de: productos purificados de fuentes naturales, que incluyen fluidos corporales, tejidos y células, aislados directamente o cultivados; productos de procedimiento de sintesis química; y productos generados por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, que incluye, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y de mamífero. En base en el huésped utilizado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Además, los polipéptidos de la presente invención también pueden un residuo metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de un procedimiento mediado por huésped. Por lo tanto, es bien sabido en la técnica que la metionina N terminal codificada por el codón de inicio de traducción generalmente se prepara con alta eficiencia de una proteina después de traducción en todas las células eucarióticas. Aunque la metionina N terminal en la mayor parte de las proteínas también se elimina eficientemente en la mayor parte de las procariotas, para algunas proteínas, este proceso de separación procariótica no es eficiente, en base en la naturaleza del aminoácido al cual se une covalentemente la metionina N terminal.

Usos de los polinucleótidos Cada uno de los polinucleótidos identificados en la presente se puede utilizar de muchas maneras como reactivos. La siguiente descripción se debe considerar ejemplar y utiliza técnicas conocidas. Los polinucleótidos de la presente invención son útiles para identificación de cromosomas. Existe una necesidad actual de identificar nuevos marcadores de u??*Lé4t ,» ??.-t .»• >~* -?*si?Á¿á&?iiá*i»,? M*. ?ií?á.b %k*? k?*t*?.í?í*?*-*? ?,..* 12 - cromosoma, dado que actualmente se disponen de pocos reactivos marcadores de cromosomas, en base en los datos de secuencia existentes (polimorfismos repetidos) . Cada polinucleótido de la presente invención se puede utilizar como un marcador de cromosoma. Brevemente, se puden mapear secuencias para cromosomas mediante la preparación de cebadores de PCR (preferiblemente 15-25 pb) a partir de las secuencias que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Los cebadores se pueden seleccionar utilizando análisis de computadora de manera que los cebadores no abarquen más de un exón predicho en el ADN genómico. Estos cebadores después se utilizan para detección sistemática por PCR de híbridos de células somáticas que contengan cromosomas humanos individuales. Únicamente aquéllos híbridos que contengan el gen humano que corresponde a las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 proporcionarán un fragmento amplificado. De manera similar, los híbridos somáticos proporcionarán un método rápido de mapeo de PCR de los polinucleótidos a cromosomas particulares. Se pueden asignar al día tres o más clones utilizando un ciclador térmico único. Además, se puede obtener la sublocalización de los polinucleótidos con paneles de fragmentos cromosomómicos específicos. Otras estrategias de mapeo genético que se !3 - pueden utilizar incluyen hibridación in si tu, detección sistemática previa con cromosomas clasificados en base al flujo y marcados y selección previa por hibridación para construir bibliotecas de ADNc específicas para cromosomas. La localización cromosómica precisa de los polinucleótidos también se puede obtener utilizando hibridación de fluorescencia in si tu (FISH, por sus siglas en inglés) o una difusión cromosómica en metafase. Esta técnica utiliza polinucleótidos tan cortos como 500 ó 600 bases, sin embargo, se prefieren polinucleótidos de 2,000-4,000 pb. Para una revisión de esta técnica, véase Ver a et al., Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) . Para el mapeo de cromosomas, los polinucleótidos pueden ser utilizados individualmente (para marcar un solo cromosoma o sitio único en ése cromosoma) o en paneles (para marcar sitios múltiples o cromosomas múltiples). Los polinucleótidos preferidos corresponden a las regiones no codificantes de los ADNc, debido a que es más probable que las secuencias codificantes estén conservadas dentro de familias de genes, por lo que se incrementa la posibilidad de hibridación cruzada durante el mapeo cromosómico. Una vez que se ha mapeado un polinucleótido en un lugar cromosómico preciso, se puede utilizar la posición física del polinucleótido en el análisis de enlace. El análisis de enlace establece herencia conjunta entre un lugar cromosómico y la presentación de una enfermedad particular. Los datos de mapeo de enfermedad se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheri tance in Man (disponible en linea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library) . Suponiendo una resolución de mapeo de una base de un gen por 20 kb, un ADNc que se localiza con precisión en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de 50-500 genes causales potenciales. Por lo tanto, una vez que se establece herencia conjunta, se pueden examinar diferencias en el polinucleótido y el gen correspondiente entre individuos afectados y no afectados. Los polinucleótidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 se pueden utilizar para este análisis de individuos humanos. En primer lugar, las alteraciones estructurales visibles en los cromosomas tales como supresiones o translocaciones, se examinan en difusiones de cromosoma o bien por PCR. Si no existen alteraciones estructurales, se determina la presencia de mutaciones puntuales. Las mutaciones observadas para algunos o la totalidad de los individuos afectados, pero no individuos normales, indica que la mutación puede provocar la enfermedad. Sin embargo, se requiere un secuenciado completo del polipéptido y el gen correspondiente de varios individuos normales para diferenciar la mutación de un polimorfismo. Si se identifica un polimorfismo nuevo, este polipéptido polimórfico se puede utilizar para un análisis de enlace posterior. Además, la expresión aumentada o disminuida del gen en individuos afectados, en comparación con los individuos no afectados, se puede determinar utilizando polinucleótidos de la presente invención. Se puede utilizar cualquiera de estas alteraciones (expresión alterada rearreglo cromosómico o mutación) como un marcador de diagnóstico o de pronóstico. Además de lo anterior, se puede utilizar un polinucleótido para controlar la expresión del gen mediante la formación de una triple hélice o de ADN antisentido o ARN. Ambos métodos se basan en la unión del polinucleótido a ADN o ARN. Para estas técnicas, los pol ucleótidos preferidos habitualmente tienen 20 a 40 bases de longitud y son complementarios a cualquiera de las regiones del gen involucrada en la transcripción (véae Lee et al., Nucí . Acids Res . , 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Sci ence, 251:1360 (1991) para una discusión de la formación de una triple hélice) o al /ARNm mismo (véase, Okano, J. Neurochem. , 56:560 (1991) y Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibi tors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) para una discusión de la técnica antisentido) . La formación de triple hélice de manera óptima resulta en una interrupción de la transcripción de ARN a partir de ADN, mientras que la hibridación de ARN antisentido bloquea la traducción de una molécula de ARNm en el polipéptido. Ambas técnicas son efectivas en sistemas de modelo, y la información descrita en la presente se puede utilizar para diseñar polinucleótidos antisentido o de triple hélice en un esfuerzo por tratar la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención también son útiles en terapia de genes. Un objetivo de la terapia de genes es insertar un gen en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo por corregir el defecto genético. Los polinucleótidos descritos en la presente invención proporcionan un medio para corregir tales defectos genéticos de una manera altamente precisa. Otro objetivo es insertar un gen nuevo que no está presente en el genoma del huésped, para de esta manera producir un rasgo nuevo en la célula huésped. Los polinucleótidos también son útiles para identificar a individuos a partir de muestras biológicas pequeñas. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, está considerándolo utilización del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) para identificación de su personal. En esta técnica, se l»«?ag h ÉÍ¿^ji|t-&- a---t--¿--:A-j^iü-^a---^-.-^---. 1-i-- m^ .£. -¿j?-id-¿-A-¿iia-^-i.ia6-&.-. ,, tara Wífií"t¡tllh*sá- *&&f& -á- ii ¡ digiere un ADN genómico del individuo con una o más enzimas de restricción y se someten a sondeo para transferencia Southern, para proporcionar bandas únicas para identificar personal. Este método no adolece de las limitaciones actuales de las "etiquetas de perro" las cuales se pueden perder, cambiar o robar, volviendo dificil una identificación positiva. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como marcadores adicionales de ADN para RFLP. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden utilizar como una alternativa a RFLP, al determinar la secuencia de ADN real, base por base, de las porciones seleccionadas del genoma de un individuo. Se pueden utilizar estas secuencias para preparar cebadores de PCR para amplificar y aislar tal ADN seleccionado, el cual después se puede secuenciar. Mediante la utilización de esta técnica, se puede identificar a individuos debido a que cada individuo tendrá un conjunto único de secuencias de ADN. Una vez que se establece una base de datos con identificación única para un individuo, se puede realizar una identificación positiva de este individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas. La biología forense también se beneficia de las técnicas de identificación basadas utilizando ADN como se describen en la presente. Las secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas tales como tejidos, por ejemplo pelo o piel o líquidos corporales, por ejemplo sangre, saliva, semen, etc., se pueden amplificar utilizando PCR. En una técnica anterior, las secuencias de gen amplificadas de loci polimórficos tales como el gen de HLA clase II DQa se utilizan en biología forense para identificar individuos (Erlich, H., PCR Technology, Freeman and Co. (1992)). Una vez que estos loci polimórficos específicos se amplifican, se digieren con una o más enzimas de restricción, lo que proporciona un conjunto de identificación de bandas en una prueba de transferencia Southern sondeada con ADN que corresponde al gen para HLA clase H DQa. De manera similar, se pueden utilizar los polinucleótidos de la presente invención como marcadores polimórficos con propósitos forenses. También existe la necesidad por reactivos capaces de identificar la fuente de un tejido particular. Tal necesidad surge, por ejemplo, en la medicina forense cuando se presenta un tejido de origen desconocido. Los reactivos adecuados pueden comprender, por ejemplo, sondas de ADN o cebadores específicos para un tejido particular preparado a partir de las secuencias de la presente invención. Grupos de tales reactivos pueden identificar el tejido por especie o por tipo de órgano. De una manera similar, se pueden ¡ ?í _.«-. -^??ií.<^..<'t??Í**»??u?Aa lUÍ ilfi^tlí -X ^Éi utilizar estos reactivos para realizar un análisis sistemático de cultivos para determinar contaminación. Finalmente, los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como marcadores de peso molecular en geles Southern, como sondas de diagnóstico para determinar la presencia de un ARNm especifico en un tipo de célula particular, como una sonda para "sustraer" secuencias conocidas en el procedimiento de descubrir polinucleótidos novedosos, para seleccionar y elaborar oligómeros para unión a un "chip de gen" u otro soporte, para generar anticuerpos contra ADN utilizando técnicas de inmunización con ADN, y como un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria.

Usos de los Polipéptidos Cada uno de los polipéptidos identificados en la presente se puede utilizar de muchas maneras. Las siguientes descripciones se deben considerar ejemplares y utilizan técnicas conocidas . Se puede utilizar un polipéptido de la presente invención para realizar un ensayo para determinar concentraciones de proteina en una muestra biológica utilizando técnicas basadas en anticuerpo. Por ejemplo, se puede estudiar la expresión de proteina en tejidos con métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J. Cell . Bi ol . , 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell . Biol . , 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar expresión de genes de proteina incluyen inmunoensayos tales como el ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) y el radioinmunoensayo (RÍA, por sus siglas en inglés) . Se conocen en la técnica marcas de ensayo de anticuerpo adecuadas que incluyen marcas de enzima tales como glucosa oxidasa y radionúclidos tales como yodo (125I, 121I), carbón (14C) , azufre (35S)' tritio (3H) , indio (112In) y tecnecio (99mTc), así como marcas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina así como biotina. Además de realizar ensayos para determinar las concentraciones de proteína secretada en una muestra biológica, las proteinas también se pueden detectar in vivo mediante formación de imágenes. Las etiquetas de anticuerpo o los marcadores para la formación de imágenes vivo de proteínas incluyen aquellos detectables por radiografía de rayos X, RMN o ESR. Para radiografía con rayos X, las etiquetas adecuadas incluyen radionúclicos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero que no son dañinos para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y ESR incluyen aquellos con un spín característico detectable tal como deuterio, el cual se puede incorporar en el anticuerpo mediante marcado de nutrientes para el hibridoma de interés. Se introduce un anticuerpo específico de proteína o un fragmento de anticuerpo el cual se ha marcado con una porción detectable apropiada, formadora de imagen, tal como un radionúclido (por ejemplo, 131I, 112In, 99mTc) , una sustancia radioopaca, o un material detectable por resonancia magnética nuclear (la introducción se realiza, por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema formador de imagen utilizado determinará la cantidad de porción formadora de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radionúclido, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada habitualmente variará de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. El anticuerpo marcado o el fragmento de anticuerpo después se acumulará preferencialmente en el lugar en donde las células contengan la proteína especifica. La formación de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, Eds., Masson Publishing Inc. (1982)). De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico para un trastorno el cual involucra: (a) realizar un ensayo para determinar la expresión de un polipéptido de la presente invención en células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión de genes con un nivel de expresión de gen estándar, por lo que un incremento o una disminución en el nivel de expresión de genes polipeptídicos ensayados en comparación con el nivel de expresión estándar es indicativo de un trastorno. Los trastornos psiquiátricos y el tratamiento de los trastornos psiquiátricos con neurolépticos, incluyendo la esquizofrenia, se relacionan con una falta de regulación de las concentraciones de neurotransmisor o neuropéptido, o ambas, que puede resultar en una regulación por aumento o disminución de polinucleótidos y polipéptidos. Estos cambios se pueden diagnosticar o vigilar mediante cambios de ensayo en las concentraciones de polipéptido en tejido o fluidos tales como LCR, sangre o en muestras fecales. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar para tratar enfermedades. Por ejemplo, se puede administrar a pacientes un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo por sustituir concentraciones ausentes o disminuidas del polipéptido (por ejemplo insulina) para complementar niveles ausentes o disminuidos de un polipéptido diferente (por ejemplo hemoglobina S por hemoglobina B) , para inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo un oncogén), para iniciar la actividad de un polipéptido (por ejemplo por unión a un receptor), para reducir la actividad de un receptor unido a membrana al competir con el mismo por un ligando libre (por ejemplo, receptores de TNF solubles utilizados para reducir la inflamación) , o para llevar a cabo una respuesta deseada (por ejemplo crecimiento de vasos sanguíneos) . De manera similar, también se pueden utilizar anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la presente invención, para tratar una enfermedad. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo dirigido a un polipéptido de la presente invención se puede unir y reducir la sobreproducción de polipéptido. De manera similar, la administración de un anticuerpo puede activar al polipéptido por ejemplo mediante unión a un polipéptido unido a una membrana (receptor) . Los polipéptidos también se pueden utilizar como antigenos para activar respuestas inmunitarias . La producción local de neurotransmisores y neuropéptidos modula muchos aspectos de la función neuronal . Por ejemplo, en la esquizofrenia se considera que la actividad de neurotransmisor activa en demasía y es la base del comportamiento psicótico. La administración de un anticuerpo a un polipéptido producido en demasía se puede utilizar para modular las respuestas neuronales en trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia.

Finalmente, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración de gel de tamiz molecular utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los polipéptidos también se pueden utilizar para generar anticuerpos, los cuales a su vez se utilizan para medir la expresión de proteina de una célula recombinante, como una manera de determinar la transformación de la célula huésped. Además, se pueden utilizar los polipéptidos de la presente invención para probar las siguientes actividades biológicas.

Actividades Biológicas Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar en ensayos para probar una o más actividades biológicas. Si estos polinucleótidos y polipéptidos muestran actividad en un ensayo particular, es probable que estas moléculas estén relacionadas en enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden utilizar para tratar la enfermedad asociada. «¿.«><«fa...^jy§f4f¿fL'^-"«¿''JM«'««*"fc - *a**L ****?i???i*át A?ín .

Actividad en el Sistema Nervioso Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede ser útil para tratar deficiencias o trastornos del sistema nervioso central o el sistema nervioso periférico al activar o inhibir la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotaxia) de neuroblastos, células pluripotenciales o células de glia. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede ser útil para tratar deficiencias o trastornos del sistema nervioso central o sistema nervioso periférico al activar o inhibir los mecanismos de transmisión sináptica, sintesis, metabolismo e inactivación de transmisores neurales, neuromoduladores y factores tróficos, expresión e incorporación de enzimas, proteinas estructurales, canales de membrana y receptores en neuronas y células de la glia o al alterar las composiciones de membrana neural. La etiología de estas deficiencias o trastornos puede ser genética, somática (por ejemplo cáncer o algunos trastornos autoinmunitarios), adquirida (por ejemplo por quimioterapia o toxinas) o infecciosa. Además, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se puede utilizar como un marcador o detector de un trastorno o desorden del sistema nervioso en particular. El desorden o trastorno puede ser cualquiera de la enfermedad de l¡*í ?**lJ*á**.Í- , ^^^y^M &^ ^L%M*m r ^d,?L* *^i,^M ^A^.,.

Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad de Binswanger, otra demencia senil, enfermedad de Parkinson, parkinsonismo, trastornos obsesivos convulsivos, epilepsia, encefalopatía, isquemia, adicción al alcohol, adicción a drogas, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, depresión y trastornos bipolares maniacos-depresivos. De manera alternativa, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para estudiar la variación circadania, el envejecimiento o la potenciación a largo plazo, esta última alterando al hipocampo. De manera adicional, particularmente con referencia a las especies de ARNm que se presentan en estructuras particulares dentro del sistema nervioso central, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para estudiar regiones del cerebro que se sabe están relacionadas en comportamientos complejos, tales como el aprendizaje y la memoria, las emociones, la adicción a drogas, neurotoxicidad a glutamato, comportamiento en la alimentación, el olfato, infección viral, visión y trastornos del movimiento.

Actividad Inmunitaria Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede ser útil para tratar deficiencias o trastornos del sistema inmunitario, al activar o inhibir la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotaxia) de células del sistema inmunitario. Las células del sistema inmunitario se desarrollan mediante un proceso denominado hematopoyesis, que produce células mieloides (plaquetas, eritrocitos, neutrófilos y macrófagos) y células linfoides (linfocitos B y T) a partir de hemocitoblastos pluripotenciales. La etiología de estas deficiencias o trastornos inmunitarios puede ser genético, somático, por ejemplo por cáncer o trastornos autoinmunitarios, adquirida (por ejemplo por quimioterapia o toxinas) o infecciosa.

Además, un polinucleóptido o polipéptido de la presente invención se puede utilizar como un marcador o detector de un trastorno o desorden del sistema inmunitario particular. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede ser útil para tratar o detectar deficiencias o trastornos de células hematopoyéticas. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se puede utilizar para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, que incluyen los hemocitoblastos pluripotenciales, en un esfuerzo para tratar aquellos trastornos relacionados con una disminución en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas. Los ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica incluyen, pero no se limitan a: trastornos en las proteínas sanguíneas (por i----.-- .a- ftS&li _hi--nMmHáll- ¡ fc- .--6a--i--.-a-- -j. ,-- »at,.. .«.«¿-¿A-fc-a- ....t--»a-a{J-¿- -Ai¿d itsj . ejemplo agammanglobulinemia, disgammaglobulinemia) , ataxia telangiectasia, inmunodeficiencia variable común, síndrome de Di George, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, síndrome de deficiencia de adhesión leucocitaria, linfopenia, disfunción bactericida fagocitica, inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) , trastorno de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia o hemoglobinuria. Además, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede utilizar para modular la actividad hemostática (detención de la hemorragia) o trombolítica (formación del coágulo) . Por ejemplo, al aumentar la actividad hemostática o trombolítica, se puede utilizar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención para tratar trastornos de la coagulación sanguínea (por ejemplo afibrinogenemia, deficiencias de algún factor), trastornos plaquetarios sanguíneos (por ejemplo trombocitopenia) , o heridas que resultan de trauma, cirugía u otras causas. De manera alternativa, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención que pueda disminuir la actividad hemostática o trombolitica, se puede utilizar para inhibir o disolver coágulos. Estas moléculas pueden ser importantes en el tratamiento de ataques cardiacos (infarto), apoplejías o cicatrización patológica.

Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también puede ser útil para tratar o detectar desórdenes autoinmunitarios. Muchos desórdenes autoinmunitarios resultan de un reconocimiento inadecuado de lo propio, como material extraño por células inmunitarias. Este reconocimiento inadecuado resulta en una respuesta inmunitaria que lleva a la destrucción del tejido del huésped. Por lo tanto, la administración de un polipéptido o polinucleótido de la presente invención que inhiba una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación diferenciación o quimiotaxia de linfocitos T o de alguna manera que resulte en la inducción de tolerancia, puede ser una terapia eficaz para evitar trastornos autoinmunitarios. Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios que pueden ser tratados o detectados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Addison, anemia hemolitica, síndrome antifosfolipidico, artritis reumatoide, dermatitis, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, esclerosis múltiple, miastenia grave, neuritis, oftalmía, penfigoide buloso, penfigo, poliendocrinopatias, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de Stiff-Man, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina y enfermedades oculares inflamatorias autoinmunitarias. La esquizofrenia tiene varios aspectos que sugieren un componente autoinmunitario al proceso de enfermedad. Los pacientes con esquizofrenia presentan anormalidades inmunológicas que incluyen hipersecreción de citocmas, presencia de anticuerpos antinucleares, anticitoplásmicos y antifosfolipidicos, y una relación disminuida de linfocitos CD4+/CD8+. De manera similar, las reacciones y trastornos alérgicos tales como asma (particularmente asma alérgica) u otros problemas respiratorios, también se pueden tratar por un polipéptido o polinucleótido de la presente invención. Además, estas moléculas se pueden utilizar para tratar anafilaxia, hipersensibilidad a una molécula antigénica o incompatibilidad de grupos sanguíneos. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también se puede utilizar para tratar o evitar rechazo de órganos o la enfermedad de rechazo inverso (GVHD, por sus siglas en inglés) . El rechazo de órganos se produce por la destrucción, por parte de las células inmunitanas del huésped, del tejido transplantado mediante una respuesta inmune. De manera similar, se considera que también hay involucrada una respuesta inmunitaria en GVHD, pero, en este caso, las células inmunitarias transplantadas extrañas destruyen los tejidos del huésped. La administración de un ^j eAAa-¿8.é.Aaa<l^l,_^¿j..^i^- -.a«.j- »^.- polipéptido o polinucleótido de la presente invención que inhiba una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación, diferenciación o quimiotaxia de linfocitos T, puede ser una terapia eficaz para evitar el rechazo de órganos en GVHD. De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede utilizar para modular inflamación. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido puede inhibir la proliferación y diferenciación de células relacionadas con una respusta inflamatoria. Estas moléculas se pueden utilizar para tratar trastornos inflamatorios, condiciones crónicas y agudas que incluyen inflamación relacionada con infección (por ejemplo choque séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria generalizada (SIRS, por sus siglas en inglés) ) , daño por isquemia-reperfusión, mortalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, daño pulmonar inducido por citocma o quimocina, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn o que resulte de una producción excesiva de citocinas (por ejemplo TNF o IL-1) • Trastornos Hiperproliferativos Se puede utilizar un polipéptido o polinucleótido para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos que í** í é incluyen neoplasias. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede inhibir la proliferación del trastorno mediante interacciones directas o indirectas. Alternativamente, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede hacer que proliferen otras células que inhiban el trastorno hiperproliferativo. Por ejemplo, al aumentar una respuesta inmunitaria, particularmente al aumentar la calidad antigénica del trastorno hiperproliferativo o mediante la proliferación, diferenciación o movilización de linfocitos T, se pueden tratar trastornos hiperproliferativos. Se puede aumentar esta respuesta inmunitaria ya sea mejorando la respuesta inmunitaria existente o bien iniciando una respuesta inmunitaria nueva. De manera alternativa, la disminución de la respuesta inmunitaria también puede ser un método para tratar trastornos hiperproliferativos tales como un agente quimioterapéutico. Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que pueden ser tratados o detectados por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a neoplasias que se localicen en: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, higado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroides, hipófisis, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cuello y cabeza, nervios (central y periférico) sistema linfático, región pélvica, piel, tejido suave, bazo, región torácica y sistema urogenital. De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos también pueden ser tratados o detectados por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención. Los ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia que se localice en los sistemas de órganos que se incluyen en lo anterior.

Enfermedades Infecciosas Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, mediante aumento de la respuesta inmunitaria, particularmente aumento de la proliferación y diferenciación de linfocitos B o T, se pueden tratar enfermedades infecciosas. Se puede incrementar la respuesta inmunitaria al mejorar una respuesta inmunitaria existente o bien al iniciar una respuesta inmunitaria nueva. De manera alternativa, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención también puede inhibir directamente al agente infeccioso, sin inducir necesariamente una respuesta inmunitaria. En el caso de esquizofrenia, en donde los agentes infecciosos pueden contribuir a la patología, tratamiento de pacientes con un polipéptido o polinucleótido de la presente invención que puede actuar como vacuna para activar una respuesta inmunitaria más eficiente, alterar el curso de la enfermedad. Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede provocar una enfermedad o síntomas que pueden ser tratados o detectados por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a las siguientes familias virales ADN y ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatitis) , Herpesviridae (tal como citomegalovirus, Hepes Simplex, Herpes Zoster), Mononegavirus (por ejemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae) , Orthomixoviridae (por ejemplo, Influenza), Papovaviridae, Parvoviriade, Picornaviridae, Poxviridae (tal como Viruela o Vacuna) , Reoviridae (por ejemplo Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, Lentivirus) y Togaviridae (por ejemplo Rubivirus) . Los virus que se encuentran dentro de estas familias pueden provocar diversas enfermedades o síntomas que incluyen, pero que no se limitan a: artritis, bronqueolitis, encefalitis, infeccioes oculares (por ejemplo conjuntivitis, queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, Actiova Crónica, Delta) , meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, parotiditis, parainfluenza, rabia, resfriado común, polio, leucemia, rubéola, enfermedades transmitidas sexualmente, enfermedades cutáneas (por ejemplo, verrugas de Kaposi) y viremia. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades . De manera similar, los agentes bacterianos o micóticos que pueden provocar enfermedad o síntomas y que pueden ser tratados o detectados por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a las siguientes familias de bacterias gramnegativas y grampositivas y hongos: Actinomycetales (por ejemplo Corynebacteri um, Mycobacteri um, Norcardia ) , Aspergillosis , Bacillaceae (por ejemplo Anthrax, Clostridi um) , Bacteroidaceae, Blastomicosis, Bordetella , Borrelia , brucel osi s, candidiasi s , Campylobacter, Coccidioidomicosis , Criptococcosis , Dermatocicoses , Enterobacteriaceae (Kl ebsielia , Salmonella , Serra tia , Yersinia) , Erysipelothrix, Helicobacter, l egionelosis, leptospirosis , Li steria , Mycoplasmatal es , Neisseriaceae (por ejemplo, Acinetobacter, Gonorrhea , Menigococcal) , Infecciones por Pasteurellaceae (por ejemplo Actinobacill us , Heamophil us, Pasteurella) , Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae , sifiliss e infecciones estafilococícas . Estas familias de bacterias u hongos pueden provocar las siguientes enfermedades o síntomas que incluyen, pero que no se limitan a: bacteremia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveitis) , gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo infecciones relacionadas con SIDA) , paroniquia, infecciones relacionadas con prótesis, enfermedad de Reiter, infecciones de las vías respiratorias tales como tosferina o empiema, septicemia, enfermedad de Lyme, enfermedad por rasguño de gato, disenteria, fiebre paratiroidea, envenenamiento por alimentos, tifoidea, neumonía, gonorrea, meningitis, infección por clamidia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, fiebre escarlatina, enfermedades transmitidas sexualmente, enfermedades cutáneas (por ejemplo celulitis, dermatocicosis) , toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones en heridas. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades.

«**A<.i., Además, los agentes parasitarios que provocan enfermedades o síntomas que pueden ser tratadas o detectadas por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a las siguientes familias: amibiasis, babesiosis, coccidiosis, criptoesporidiosis, dientamoebiasis, durina, enfermedades ectoparasitarias, giardiasis, helmintiasis . leismaniasis, teileriosis, toxoplasmosis, tripanosomiasis y tricomonasis . Estos parásitos pueden causar diversas enfermedades o síntomas que incluyen, pero que no se limitan a: sarna, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedades intestinales (por ejemplo disentería, giardiasis) , enfermedades hepáticas, enfermedades pulmonares, infecciones oportunistas (por ejemplo las relacionadas con SIDA) , paludismo, complicaciones en el embarazo y toxoplasmosis. Se puede utilizar un polipéptido o polinucleótido de la presente invención para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Preferiblemente, el tratamiento utilizando un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede ser al administrar una cantidad efectiva de un polipéptido al paciente, o al eliminar células del paciente, suministrar las células con un polinucleótido de la presente invención y regresar las células sometidas a ingeniería, en el paciente (terapia ex vivo) . Además, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar como un antígeno en una vacuna para generar una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas.

Regeneración Se puede utilizar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención para diferenciar, hacer proliferar y atraer células, lo que lleva a la regeneración de tejidos (véase, Science, 276:59-87 (1997)). La regeneración de tejidos se puede utilizar para reparar, sustituir o proteger tejido dañado por defectos congénitos, traumatismos (heridas, quemaduras, cortes o ulceras) , por la edad, enfermedades (por ejemplo osteoporosis, osteoartritis, enfermedades periodontales, insuficiencia renal) , cirugía que incluye cirugía plástica cosmética, fibrosis, daño por reperfusión o daño por citocinas sistémicas. Los tejidos que pueden ser regenerados utilizando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo páncreas, higado, intestino, riñon, piel, endotelio) , músculos (músculo esquelético o cardíaco), tejido vascular (que incluye endotelio vascular) , nervioso, hematopoyético y tejido esquelético (huesos, cartílagos, tendones y ligamentos) . Preferiblemente, la regeneración se produce sin cicatrización deteriorada. La regeneración también puede incluir angiogénesis. Además, un polinucleótido o polipéptido de la presenten invención puede aumentar la regeneración de tejidos difíciles de sanar. Por ejemplo, la regeneración de tendón/ligamento puede acelerar reduciendo el tiempo de recuperación después del daño. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también se puede utilizar profiláticamente en un esfuerzo por evitar daño. Las enfermedades específicas que se pueden tratar incluyen tendonitis, síndrome del túnel metacarpeano y otros defectos de los tendones o ligamentos. Un ejemplo adicional de regeneración de tejido de heridas que no sanan incluyen úlceras de decúbito, úlceras relacionadas con insuficiencua vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas. De manera similar, los tejidos nerviosos y cerebrales también se pueden regenerar mediante la utilización de un polinucleótido o polipéptido de la presente invención para hacer proliferar y diferenciar células nerviosas. Las enfermedades que pueden ser tratadas utilizando este método incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatías o trastornos mecánicos y traumáticos (por ejemplo trastornos de la médula espinal, trauma cerebral, enfermedades cerebrovasculares y apoplejia). De manera específica, las enfermedades relacionadas con daños a los nervios periféricos, neuropatía periférica (por ejemplo que se genera de quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Park son, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager) se pueden tratar, todos, utilizando el polinucleótido o polipéptido de la presente invención.

Quimiotaxia Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede tener actividad quimiotáctica. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, linfocitos T, mastocitos, eosinófilos, células epiteliales o endoteliales) en un sitio particular en el cuerpo, tal como inflamación, infección o hiperproliferación en el sitio. Las células movilizadas pueden después ser eliminadas o sanadas para el trauma o la anormalidad particular. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede incrementar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas quimiotécticas se pueden utilizar después para tratar inflamación, infección, trastornos hiperproliferativos o cualquier trastorno del sistema inmune al aumentar el número de células dirigidas a un lugar particular en el cuerpo. Por ejemplo, se pueden utilizar moléculas quimiotácticas para tratar heridas y otros traumatismos a tejidos al atraer células inmunes al lugar dañado. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer fibroblastos, los cuales se pueden utilizar para tratar heridas. También se contempla que el polinucleótido o polipéptido de la presente invención pueda inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas también se pueden utilizar para tratar desórdenes. Por lo tanto, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se puede utilizar como un inhibidor de quimiotaxia.

Actividad de Unión Se puede utilizar un polipéptido de la presente invención para la detección sistemática de moléculas que se unan al polipéptido o para moléculas a las cuales se une al polipéptido. La unión del polipéptido y la molécula pueden activar (por ejemplo, un agonista), aumentar, inhibir (es decir, un antagonista) o disminuir la actividad del polipéptido o la molécula unida. Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo receptores) o moléculas pequeñas.

Preferiblemente, la molécula se relaciona estrechamente con el ligando natural del polipéptido, por ejemplo un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), capítulo 5 (1991)). De manera similar, la molécula se puede relacionar estrechamente con el receptor natural al cual se une el polipéptido, o por lo menos un fragmento del receptor capaz de ser unido por el polipéptido (por ejemplo, un sitio activo) . En cualquier caso, la molécula puede ser diseñada racionalmente utilizando técnicas conocidas. Preferiblemente, la detección sistemática de estas moléculas involucra producir células apropiadas que expresen el polipéptido, ya sea como una proteina secretada o en la membrana celular. Las células preferidas incluyen células de mamíferos, levaduras, Drosophila o E. coli . Las células que expresan el polipéptido (o la membrana celular que contiene el polipéptido expresado) después preferiblemente se ponen en contacto con un compuesto de prueba que contenga potencialmente la molécula para observar la unión, estimulación o inhibición de la actividad ya sea del polipéptido o de la molécula. El ensayo simplemente puede realizar una prueba de unión de un compuesto candidato al polipéptido, en donde la unión se detecta por una marca, o un ensayo que involucre competencia con un competidor marcado. Además, el ensayo puede probar si el compuesto candidato resulta en una señal generada por unión al polipéptido. Alternativamente, el ensayo se puede llevar a cabo utilizando preparaciones libres de células, polipéptido/molécula fija a un soporte sólido, bibliotecas químicas o mezclas de productos naturales. El ensayo también puede comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga un polipéptido, medir la actividad de unión del polipéptido/molécula y comparar la actividad del polipéptido/molécula o la unión a un estándar. Preferiblemente, un ensayo de ELISA puede medir la concentración o actividad del polipéptido en una muestra (por ejemplo una muestra biológica) utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir la concentración o la actividad del polipéptido ya sea por unión, directa o indirecta al polipéptido o al competir con el polipéptido por un sustrato. La totalidad de estos ensayos anteriores se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico o de pronóstico. Las moléculas descubiertas utilizando estos ensayos se pueden utilizar para tratar enfermedades o para llevar a cabo un resultado particular en un paciente (por ejemplo crecimiento de vasos sanguíneos) al activar o inhibir el polipéptido/molécula. Además, los ensayos pueden descubrir agentes los cuales puedan inhibir o aumentar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente . Por lo tanto, la invención incluye un método para identificar compuestos los cuales se unen a un polipéptido de la invención, que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con un polipéptido de la invención; y (b) determinar si se ha producido la unión. Además, la invención incluye un método para identificar agonistas/antagonistas, que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con un polipéptido de la invención, (b) realizar un ensayo de la actividad biológica, y (c) determinar si se ha alterado la actividad biológica del polipéptido.

Otras Actividades Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también puede aumentar o disminuir la diferenciación o proliferación de hemocitoblastos embriónicos, además, como se discute en lo anterior, de la linea hematopoyética. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede utilizar para modular las características de un mamífero tal como la altura corporal, el peso, el color de pelo, el color de ojos, la piel, el porcentaje de tejido adiposo, la pigmentación, tamaño y forma (por ejemplo cirugía cosmética) . De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para modular el metabolismo del mamífero afectando el catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar para cambiar el estado mental de un mamífero o su estado físico al alterar los biorritmos, ritmos circadianos, depresión (que incluyen trastornos depresivos) , tendencia a la violencia, tolerancia al dolor, respuesta a opiáceos y opioides, tolerancia a opiáceos y opioides, supresión de opiáceos y opioides, capacidades reproductivas (preferiblemente por actividad similar a activina o inhibina) , las concentraciones hormonales o endocrinas, apetito, libido, memoria, estrés o capacidad cognoscitiva. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede utilizar como un aditivo alimenticio o conservador, para incrementar o disminuir las capacidades de almacenamiento, contenido de grasa, lipidos, proteinas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores y otros componentes nutricionales. *??ÉÍiiLt****,A&L..«LaUALli JbÍ?É tüz* t*a-*kß¿ Otras Modalidades Preferidas Cuando un polinucleótido de la invención es regulado por disminución y exacerba un trastorno patológico, tal como psicosis u otros trastornos neuropsiquiátricos, la expresión del polinucleótido puede aumentar o bien la concentración del producto del polipéptido intacto puede aumentar con el fin de tratar, evitar, disminuir o modular la condición patológica. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al administrar un polinucleótido o polipéptido de la invención al sujeto mamífero. Un polinucleótido de la invención se puede administrar a un sujeto mamífero por vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido. Un sujeto mamífero puede ser un humano, mandril, chimpancé, macaco, vaca, caballo, borrego, cerdo, caballo, perro, gato, conejo, cobayo, rata o ratón. Preferiblemente, el vector recombinante comprende un polinucleótido que se muestra en las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 1-19; 49-52; 57-72 y 107 o un polinucleótido el cual es por lo menos 98% idéntico a una secuencia de ácido nucleico que se muestra en las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Además, preferiblemente, el vector recombinante comprende un polinucleótido variante que es por lo menos 80%, 90% o 95% idéntico a un polinucleótido que comprende las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: S 1-19; 49-52; 57-72 y 107. La administración de un polinucleótido o vector de expresión recombinante de la invención a un sujeto mamífero se puede utilizar para expresar un polinucleótido en el sujeto para el tratamiento, por ejemplo, de psicosis u otros trastornos neuropsiquiátricos. La expresión de un polinucleótido en células objetivo, que incluyen pero que no se limitan a células del cuerpo estriado y del núcleo auditivo, pueden tener efecto en una mayor producción del polipéptido codificado. En algunos casos en donde el polipéptido codificado es una proteína nuclear, la regulación de los demás genes puede ser sometida de manera secundaria a regulación por aumento o disminución. Están disponibles para los expertos en la técnica métodos múltiples, virales y no virales, adecuados para introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula objetivo, como se describe antes. Además, se puede administrar a las células objetivo un polinucleótido desnudo. Los polinucleótidos y los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden administrar como una composición farmacéutica. Tal composición comprende una cantidad efectiva de un polinucleótido o vector de expresión recombinante, y un agente de formulación farmacéuticamente t aceptable seleccionado por su condición adecuada con el modo de administración. Los materiales de formulación adecuados preferiblemente son no tóxicos a los receptores a las concentraciones utilizadas y pueden modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Véase Remington ' s Pharmaceuti cal Sciences (18th Ed. A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) . Los compuestos farmacéuticamente activos (es decir, un polinucleótido o un vector) se pueden procesar de acuerdo con métodos convencionales de farmacia para elaborar agentes medicinales para administración a pacientes, que incluye humanos y otros mamíferos. Por lo tanto, la composición farmacéutica que comprende un vector de expresión polinucleotídico o recombinante puede estar constituido en una forma sólida (que incluye granulos, polvos o supositorios) o en una forma líquida (por ejemplo soluciones, suspensiones o emulsiones) . El régimen de dosificación para tratar una enfermedad con una composición que comprende un polinucleótido o un vector de expresión se basa en diversos factores, que incluyen el tipo o gravedad de la psicosis u otros trastornos neuropsiquiátricos, la edad, peso, sexo, ííÁá, ?i? , Í*¿i¡á,.í,.-, A^ájüj-feÁ. condición médica del paciente, la vía de administración y el compuesto particular utilizado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera sistemática utilizando métodos habituales. Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, en base en los factores que se han mencionado antes. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polinucleótido o vector en la formulación que se utilice. Habitualmente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que obtenga el efecto deseado. La composición por lo tanto se puede administrar como una dosis única o como dos o más dosis (las cuales pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) respecto al tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o un catéter. Un ajuste adicional de la dosificación apropiada se realiza habitualmente por aquellos habitualmente expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas de manera sistemática por ellos. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante el uso de datos apropiados de dosis-respuesta. Las células de un sujeto mamífero se pueden trasnsfectar in vivo, ex vivo o in vi tro . La administración de un polincleótido o un vector recombinante que contiene un polinucleótido a una célula objetivo in vivo se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de diversas técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, la patente de E.U.A. número 5,672,344 describe un sistema de transferencia de un gen mediado por virus in vi vo que involucra un vector HSV-1 neurotrófico recombinante. Las composiciones descritas antes de polinucleótidos y vectores recombinantes se pueden transfectar in vi vo por administración oral, bucal, parenteral, rectal o tópica asi como por aspersión por inhalación. El término "parenteral" como se utiliza en la presente, incluye técnicas subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal o por infusión, o bien intraperitonealmente. Aunque los ácidos nucleicos o vectores de la invención se pueden administrar como un agente farmacéutico activo único, también se pueden utilizar en combinación con uno o más vectores de la invención u otros agentes. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones separadas que se suministran al mismo tiempo o en momentos diferentes o los agentes terapéuticos se pueden suministrar como una sola composición. Otro sistema de suministro para polinucleótidos de la invención es un sistema de suministro "no viral" . Las técnicas que se han utilizado o propuesto para terapias de t&j á---.?-*a -t..-. . ^»Jti..i-..,.a?. -tal-^_?-i.?1 ,i?,tJ? ¡tt..at?, ^-a?.t , . j-ét-?a^. ^i^il-lyj genes incluyen complejos de ADN-ligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación con CaP04, técnicas de pistola de genes, electroporación, lipofección y dispersión coloidal (Mulligan, R., (1993) Science, 260 (5110) : 926-32 1993)). Cualquiera de estos métodos está disponible ampliamente para una persona habitualmente experta en la técnica y será adecuado para uso en la presente invención. Están disponibles otros métodos adecuados por aquellos expertos en la técnica y se entiende que la presente invención se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de los métodos disponibles de transfección. Varias de estas metodologías se han utilizado por aquellos expertos en la técnica con éxito variable (Mulligan, R., (1993), Science, 260 (5110) : 926-32 (1993) ) . Cuando un polinucleótido de la invención es regulado por activación y exacerba un trastorno patológico en un sujeto humano, tal como psicosis u otro trastorno neuropsiquiátrico, la expresión del polinucleótido se puede bloquear o reducir, o bien se puede reducir el nivel del producto polipeptidico intacto con el fin de tratar, evitar, disminuir o modular la condición patológica. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso de oligonucleótidos antisentido o ribozimas. Alternativamente, I ? . . ^ Üiá- lA-?-_l-tidba.í. * -,.*._.,,... ...:.., -,_ los medicamentos o anticuerpos que se unan y que inactiven al producto polipeptídico también se pueden utilizar. Los oligonucleótidos antisentido son secuencias de nucleótidos las cuales son complementarias a una secuecnia específica de ADN o ARN. Una evz introducidos en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por una célula para formar complejos y bloquear la transcripción o traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido antisentido tiene por lo menos 11 nucleótidos de longitud, y puede ser de por lo menos, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 o más nucleótidos de longitud. También se pueden utilizar secuencias más grandes. Las moléculas oligonucleotidicas antisentido se pueden proporcionar en un montaje (plásmido recombinante) de ADN y se pueden introdcuir en una célula como se describe en lo anterior para disminuir el nivel de productos de gen de la invención en la célula. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser desoxirpbonucleótidos, ribonucleótidos o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o por un sintetizador automatizado al unir covalentemente el extremo 5' del nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces ternucleotidicos diferentes a fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforoamidatos, esteres de fosfato, carbamatos, acetamidato, carboximetilésteres, carbonatos y triésteres de fosfato. Véase Brown, (1994) Meth . Mol . Biol . , 20:1-8; Sonveaux, (1994) Meth . Mol . Biol . , 26:1-72; Uhlmann et al., (1990) Chem. Rev. , 90:543-583. Se pueden obtener modificaciones de la expresión de genes al diseñar oligonucleótidos antisentido los cuales formarán cadenas dobles para el control 5', o regiones reguladores de un gen de la invención. Los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de transcripción, por ejemplo entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio, son los que se prefieren. De manera similar, se puede obtener inhibición utilizando una metodología de pareamiento de bases de "triple hélice". El pareamiento de triple hélice es útil debido a que provoca inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o chaperones. Se han descrito en la literatura los avances terapéuticos utilizando el ADN triple (por ejemplo Gee et al., en Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co . , Mt . Kisco, N.Y., 1994). También se puede diseñar un oligonucleótido antisentido para bloquear la traducción de ARNm al evitar que el transcrito se una a ribosomas .

La complementariedad precisa no es necesaria para la formación exitosa de complejos entre un oligonucleótido antisentido y la secuencia complementaria de un polinucleótido. Los oligonucleótidos antisentido que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5, o más sartas de nucleótidos contiguos los cuales son complementarios con precisión a un polinucleótido, cada uno separado por una sarta de nucleótidos contiguos los cuales no son complementarios a nucleótidos adyacentes, pueden proporcionar especificidad de direccionamiento suficiente para ARNm. Preferiblemente, cada sarta de nucleótidos contiguos complementarios es de por lo menos 4, 5, 6, 7 u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias intermedias no complementarias preferiblemente son de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de longitud. Una persona experta en la técnica puede utilizar fácilmente el punto de fusión calculado de un par antisentido-directo para determinar el grado de mal pareamiento que se tolerará entre un oligonucleótido antisentido particular y una secuencia polinucleotidica particular. Los oligonucleótidos antisentido se pueden modificar sin alterar su capacidad para hibridizar con un polinucleótido de la invención. Estas modificaciones pueden ser internas en uno o ambos extremos de la molécula antisentido. Por ejemplo, se pueden modificar los enlaces de fosfato internucleósido al agregar porciones colesterilo o diamina con números variables de residuos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. Las bases modificadas o azúcares tales como arabinosa en vez de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3 ' , 5' en el cual el grupo hidroxilo 3' o el grupo fosfato 5' están sustituidos, también se pueden utilizar en un oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal et al., (1992) Trends Biotechnol . , 10:152-158; Uhlmann et al., (1990) Chem. Rev. , 90:543-584; Uhlmann et al., (1987) Tetrahedron . Lett , 215:3539-3542. Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase, por ejemplo Cech, (1987) Science, 236:1532-1539; Cech, (1990) Ann . Rev. Biochem. , 59:543-568; Cech, (1992) Curr. Opin . Struct . Biol . , 2:605-609; Couture & Stinchcomb, (1996) Trends Genet . , 12:510-515. Las ribozimas se pueden utilizar para inhibir la función del gen al separar una secuencia de ARN, como se conoce en la técnica (por ejemplo, Haseloff et al., patente de E.U.A. 5,641,673). El mecanismo de acción de ribozima involucra la hibridación especifica de secuencia de la molécula de ribozima con ARN objetivo complementario, seguido por separación endonucleolitica. Los ejemplos incluyen las moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo sometidos a ingeniería que pueden catalizar específica y eficientemente la separación endonucleolítica de secuencias nucleotídicas específicas . Se puede utilizar una secuencia codificante de un polinucleótido de la invención para generar ribozimas las cuales se unan específicamente a ARNm transcrito a partir del polinucleótido. Se han desarrollado y descrito en la técnica métodos para diseñar y construir ribozimas que puedan separar moléculas de ARN en posición trans de una manera altamente especifica de secuencia (véase Haseloff et al., (1988) Na ture, 334:585-591). Por ejemplo, la actividad de separación de las ribozimas se puede dirigir a los ARN específicos mediante ingeniería de una región de "hibridación" separada, dentro de la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN objetivo y de esta manera hibridiza específicamente con el objetivo (véase, por ejemplo, Gerlach et al., EP 321,201). Los sitios de separción de ribozima específicos dentro de un ARN objetivo se pueden identificar por exploración de la molécula objetivo para sitios de separación de ribozima los cuales incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC . Una vez identificadas, las secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos, que corresponden a la región del ARN objetivo que contiene el sitio de separación se pueden evaluar para características estructurales secundarías las cuales pueden volver inoperable al objetivo. También se puede evaluar lo adecuado de los objetivos de ARN candidato al probar su capacidad de acceso a hibridación con oligonucleótidos complementarios utilizando ensayos de protección de ribonucleasa. Las secuencias nucleotídicas que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 y sus complementos proporcionan fuentes de secuencias de región de hibridación adecuadas. Se pueden utilizar secuencias complementarias más grandes para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación por el objetivo. Las regiones de hibridación y separación de la ribozima se pueden relacionar de manera integral de manera que cuando se hibridiza el ARN objetivo a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede separar el objetivo. Se pueden introducir ribozimas en las células como parte de un montaje de ADN. Se pueden utilizar métodos mecánicos tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación o precipitación con fosfato de calcio para introducir un montaje de ADN que contiene ribozima dentro de las células en las cuales se desea disminuir la expresión de polinucleótidos. Alternativamente, si se desea que las células retengan de manera estable el montaje de ADN, se puede suministrar el montaje en un plásmido y se puede mantener como un elemento separado o se puede integrar en el genoma de las células, como se conoce en la técnica. Un montaje de ADN que codifique para una ribozima puede incluir elementos de regulación transcripcionales tales como un elemento promotor, un mejorador o un elemento UAS y una señal terminadora transcripcional para controlar la transcripción de ribozimas en las células. Como se describe en Haseloff et al., patente de E.U.A. número 5,641,673, las ribozimas se pueden someter a ingeniería de manera que la expresión de ribozima se produzca en respuesta a factores que induzcan expresión de un gen objetivo. Las ribozimas también se pueden someter a ingeniería para proporcionar un nivel adicional de regulación, de manera que la destrucción del ARNm se produzca solo cuando la ribozima y el gen objetivo sean inducidos en las células.

Producción de Pruebas de Diagnóstico Las condiciones patológicas y la susceptibilidad a condiciones patológicas tales como psicosis u otros trastornos neuropsiquiátricos se pueden diagnosticar utilizando métodos de la invención. Las pruebas para la expresión de un polinucleótido de la invención o para determinar la presencia de un producto polinucleotídico se pueden relacionar con la gravedad del trastorno y también pueden indicar un tratamiento adecuado. Por ejemplo, se puede determinar la presencia o ausencia de una mutación en un polinucleótido de la invención y se diagnostica un trastorno patológico o susceptibilidad a un trastorno patológico con base en la presencia o ausencia de la mutación. Además, se puede detectar una alteración en la expresión del polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención, cuando la presencia de una alteración en la expresión del polipéptido es indicativa del trastorno patológico o la susceptibilidad al trastorno patológico. La alteración en la expresión puede ser un aumento en la cantidad de expresión o una disminución en la cantidad de expresión. Como un método de diagnóstico adicional, se obtiene una primera muestra biológica de un paciente sospechoso de presentar una condición patológica tal como psicosis o un comportamiento relacionado con adicciones, junto con una segunda muestra de una fuente control comparable adecuada. Una muestra biológica puede comprender saliva, sangre, liquido cefalorraquídeo, fluido amniótico, orina, heces o tejido tal como tejido gastrointestinal. Una fuente de control adecuada se puede obtener de uno o más sujetos mamíferos que no tengan el trastorno patológico. Por ,- ti¿faafaaaBJ.--¡...».,- ,;aij.j ?.,...-^. -i .. '¿.^¡¿^. .»-.».-«-Aa*¿- »ai?-a 1AI , ejemplo, se pueden determinar las concentraciones promedio y la distribución de un polinucleótido o polipéptido de la invención a partir de muestras biológicas que se toman de una población representativa de sujetos mamíferos en donde los sujetos mamíferos son de la misma especie como los sujetos para los cuales se obtienen las muestras. La cantidad de por lo menos un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención se determina en la primera y segunda muestras. Se comparan las cantidades de polipéptido en la primera y segundas muestras. Se diagnóstica a un paciente con una condición patológica si la cantidad de polipéptido en la primera muestra cae dentro del intervalo de muestras tomadas de un grupo representativo de pacientes con el trastorno patológico. Otras modalidades preferidas de la invención reivindicada incluyen una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica la cual es por lo menos 80%, de manera preferible por lo menos 85%, y de manera más preferible por lo menos 90%, y de manera mucho más preferible por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en las secuencias nucleotidicas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere una molécula de ácido nucleico en donde la secuencia de nucleótidos contigua está incluida en la secuencia nucleotidica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 en el intervalo de posiciones que comienzan con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 5' de la secuencia del clon, y que terminen con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 3' de la secuencia del clon. También se prefiere una molécula de ácido nucleico en donde se incluya la secuencia de nucleótidos contigua en la secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 en el intervalo de posiciones que comienzan con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 5' del codón de inicio y que terminen con el nucleótido aproximadamente a la posición del nucleótido 3' de la secuencia de clon, como se define en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. De manera similar, se prefiere una molécula de ácido nucleico en donde la secuencia de nucleótidos contiguos está incluida en la secuencia nucleotidica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107 en el intervalo de posiciones que comienzan con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 5' del primer aminoácido del péptido señal y que terminen con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 3' de la secuencia del clon, como se define para las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos contiguos en la secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1- 19; 49-52; 57-72 y 107. Se prefiere adicionalmente una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos en la secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Una modalidad preferida adicional es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica la cual es por lo menos 95% idéntica a la secuencia nucleotidica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1- 19; 49-52; 57-72 y 107 comenzando con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 5' del primer aminoácido del péptido señal y terminando con el nucleótido aproximadamente en la posición del nucleótido 3' de la secuencia del clon, como se define para las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107.

Una modalidad preferida adicional es una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotidica completa de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para detectar en una muestra biológica una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotidica completa que se elige del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, método el cual comprende las etapas de comparar una secuencia nucleotídica de por lo menos una molécula de ácido nucleico en la muestra, con una secuencia que se selecciona del grupo y que determina si la secuencia de molécula de ácido nucleico en la muestra es por lo menos 95% idéntica a la secuencia seleccionada. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico la cual hibridiza bajo condiciones de hibridación rigurosas, con una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico que hibridiza no hibridiza bajo condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia nucleotídica consistente de únicamente residuos A o de únicamente residuos T.

Una modalidad preferida adicional es un método para detectar en una muestra biológica una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, método el cual comprende las etapas de comparar una secuencia nucleotidica de por lo menos una molécula de ácido nucleico en la muestra, con una secuencia que se selecciona del grupo y determinar si la secuencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra es por lo menos 95% idéntica a la secuencia seleccionada. También se prefiere el método anterior en el que la etapa de comparación de secuencias comprende determinar el grado de hibridación de ácido nucleico entre moléculas de ácido nucleico en la muestra y la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que se selecciona del grupo. De manera similar, también se prefiere el método anterior en el que la etapa de comparar secuencias se realiza al comparar la secuencia nucleotidica determinada de una molécula de ácido nucleico en la muestra, con la secuencia seleccionada del grupo. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN.

Una modalidad adicional preferida es un método para identificar la especie, tejido o tipo de célula de una muestra biológica, método el cual comprende la etapa de detectar las moléculas de ácido nucleico en la muestra, si 5 las hay, que comprende una secuencia nucleotídica que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 10 107. También se prefiere un método para diagnóstico en un sujeto de una condición patológica relacionada con una estructura anormal o la expresión de un gen, método el cual comprende la etapa de detectar en una muestra biológica 15 obtenida del sujeto moléculas de ácido nucleico, si las hay, que comprenden una secuencia nucleotidica que sea por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de las 20 SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Los métodos para diagonsticar una condición patológica pueden comprender la etapa de detectar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotidica 25 en un panel de por lo menos dos secuencias nucleotidicas, en - ^ >; *. i. _ ^^i&t a.-,- ^ .-¿.fes ^ «-^.4 ^ 1* -,&. Jt Jfe. ¿ k&L ?á&*&£j¡& ^ * * donde por lo menos una secuencia en el panel es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia que se selecciona de tal grupo. También se prefiere una composición de materia que comprende moléculas aisladas de ácido nucleico en donde las secuencias nucleotídicas de las moléculas de ácido nucleico comprenden un panel de por lo menos dos secuencias nucleotídicas, en donde por lo menos una secuencia en el panel es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1- 19; 49-52; 57-72 y 107. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN. También se prefiere un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos en una secuencia de aminoácidos traducida de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere polipéptido, en donde la secuencia de ácidos contiguos se incluya en los ácidos en una secuencia de aminoácidos traducida de la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, en el intervalo de posiciones que comienzan con el residuo a aproximadamente la posición del primer aminoácido de la porción secretada y que terminan con el residuo en aproximadamente el último aminoácido del marco de lectura abierta. También se prefiere un polipéptido aislado que comprenda una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos 30 nucleótidos contiguos en una secuencia de aminoácidos traducida de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Se prefiere adicionalmente un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos en una secuencia de aminoácidos traducida de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Se prefiere adicionalmente un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a los ácidos en una secuencia de aminoácidos traducida de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Se prefiere adicionalmente un método para detectar en una muestra biológica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107, método el cual comprende una etapa de comparar una secuencia de aminoácidos de por lo menos una molécula polipeptídica en la muestra con una secuencia que se selecciona del grupo y determinar si la secuencia de la molécula polipeptidica en la muestra es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos. También se prefiere el método anterior en el que la etapa de comparar una secuencia de aminoácidos de por lo menos una molécula polipeptidica en la muestra, con una secuencia que se selecciona del grupo que comprende determinar el grado de unión especifica de polipéptidos en la muestra a un anticuerpo el cual se une específicamente a un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos traducidas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere el método anterior en el que la etapa de comparación de secuencias se realiza al comparar la secuencia de aminoácidos determinada de una molécula polipeptídica en la muestra con la secuencia seleccionada del grupo. También se prefiere un método para identificar las especies, tejido o tipo de célula de una muestra biológica, método el cual comprende una etapa de detectar moléculas polipeptídicas en la muestra, si las hay, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere el método anterior para identificar la especie, tejido o tipo de célula de una muestra biológica, método el cual comprende una etapa de detectar moléculas polipeptidicas que comprenden una secuencia de aminoácidos en un grupo de por lo menos dos secuencias de aminoácidos en donde por lo menos una secuencia en el grupo es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo anterior. También se prefiere un método para diagnosticar en un sujeto una condición patológica relacionada con una estructura anormal o expresión de un gen, método el cual comprende una etapa de detectar en una muestra biológica que se obtiene del sujeto, moléculas polipeptidicas que „-J---c~,fc------„..--ASfcM .itft-. Í i comprenden una secuencia de aminoácidos en un grupo de por lo menos dos secuencias de aminoácidos, en donde por lo menos una secuencia en el grupo es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. En cualquiera de estos métodos, la etapa de detección de las moléculas polipeptídicas incluye la utilización de un anticuerpo. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que se traducen de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico, en donde la secuencia nucleotidica que codifica para un polipéptido se ha optimizado para expresión del polipéptido en un huésped procariótico.

También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico en donde la secuencia nucleotídica codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos que se traducen de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. Un método preferido adicional es aquel en donde se genera un vector recombinante que comprende insertar cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico anteriores dentro de un vector. También se prefiere el vector recombinante producido por este método. También se prefiere un método para elaborar una célula huésped recombinante que comprende introducir un vector en una célula huésped, así como la célula huésped recombinante producida por este método. También se prefiere un método para elaborar un polipéptido aislado que comprende cultivar esta célula huésped recombinante bajo condiciones tales que el polipéptido se exprese y se recupere el polipéptido. También se prefiere el método en el que se produce un polipéptido aislado, en donde la célula huésped recombinante es una célula eucariótica y el polipéptido es una porción secretada de una proteína secretada humana que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos traducidas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-72 y 107. El polipéptido aislado que se produce por este método también se prefiere. También se prefiere un método de tratamiento de un individuo en necesidad de un nivel aumentado de una actividad de proteína secretada, método el cual comprende administrar a tal individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad del polipéptido aislado, polinucleótido o anticuerpo de la invención reivindicada, efectivo para aumentar el nivel de la actividad de la proteína en el individuo. La presente invención también incluye un sistema de diagnóstico, preferiblemente en forma de equipo para realizar en un ensayo para determinar la presencia del polipéptido de la presente invención en una muestra corporal, tal como tejido de cerebro, suspensiones celulares o cortes de tejido, o muestras de fluido corporal tal como LCR, sangre, plasma o suero, cuando es deseable detectar la presencia, y preferiblemente la cantidad del polipéptido de esta invención en la muestra, de acuerdo con los métodos de diagnóstico que se describen en la presente. En una modalidad relacionada, se puede utilizar una molécula de ácido nucleico como una sonda (un oligonucleótido) para detectar la presencia de un polinucleótido de la presente invención o un gen que corresponde a un polinucleótido de la presente invención o un ARNm en una célula que es elemento de diagnóstico para determinar la presencia o expresión de un polipéptido de la presente invención en la célula. La sonda de molécula de ácido nucleico pueden ser de diversas longitudes, desde por lo menos aproximadamente 10, y de manera adecuada aproximadamente 10 a aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud, aunque habitualmente serán de aproximadamente 20 a 500 nucleótidos de longitud. Los métodos de hibridación son extramadamente bien conocidos en la técnica y no se definirán adicionalmente aqui. En una modalidad relacionada, la detección de genes correspondientes a los polinucleótidos de la presente invención se pueden generar por reacciones de extensión de cebador tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . Para este fin, se utilizan cebadores de PCR por pares, como es bien sabido, en base en la secuencia nucleotídica del gen que se va a detectar. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica es una porción de la secuencia nucleotídica de un polinucleótido de la presente invención. Los cebadores de PCR particularmente preferidos se pueden derivar de cualquier porción de una secuencia de ADN que codifique para un polipéptido de la presente invención, pero preferiblemente de regiones las cuales no están conservadas en otras proteinas celulares.

Los pares de cebadores de PCR preferidos para detectar los genes que corresponden a los polinucleótidos de la presente invención y la expresión de estos genes se describen en los ejemplos, que incluyen las tablas 5 correspondientes. Los cebadores nucleotídicos de la región correspondiente de los polipéptidos de la presente invención que se describen en la presente se preparan fácilmente y se • utilizan como cebadores de PCR para detección de la presencia o expresión del gen correspondiente en cualquiera 10 de diversos tejidos. El sistema de diagnóstico incluye, en una cantidad suficiente para llevar a cabo por lo menos un ensayo, un polipéptido objetivo de la presente invención, un anticuerpo objetivo o un anticuerpo monoclonal, o una sonda de una 15 molécula de ácido nucleico objetivo de la presente invención, como un reactivo empacado por separado. En otra modalidad, un sistema de diagnóstico, preferiblemente en forma de equipo, se contempla para realizar un ensayo para determinar la presencia del 20 polipéptido de la presente invención o un anticuerpo mmunorreactivo con el polipéptido de la presente invención en una muestra de fluido corporal por ejemplo para vigilar el destino del polipéptido administrado terapéuticamente de la presente invención o de un anticuerpo inmunorreactivo con 25 el polipéptido de la presente invención. El sistema incluye, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, un polipéptido de la presente invención o un anticuerpo objetivo como un reactivo inmunoquimico empacado por separado. Habitualmente se incluyen instrucciones para uso del reactivo o reactivos empacados. Como se utiliza en la presente, el término "empaque" se refiere a una matriz sólida o material tal como vidrio, plástico (por ejemplo polietileno, polipropileno o policarbonato) , papel, una lámina y similar capaz de sujetar dentro de límites fijos un polipéptido, anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal de la presente invención. Así, por ejemplo, un empaque puede ser un frasco de vidrio utilizado para contener cantidades en miligramos de un polipéptido contemplado o bien anticuerpo, o bien puede ser un pozo de una placa de microtitulación con cantidades en mcirogramos de un polipéptido o anticuerpo contemplado que han sido fijados operativamente, es decir, unidos de manera que son capaces de unirse inmunológicamente con un anticuerpo o antigeno, respectivamente. Las "instrucciones para uso" habitualmente incluyen una expresión tangible que describe la concentración del reactivo o por lo menos un parámetro de método de ensayo de manera que se mezclan las cantidades relativas del reactivo y la muestra, los períodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas de reactivo/muestra, la temperatura, las condiciones amortiguadoras y similares. Un sistema de diagnóstico de la presente invención preferiblemente también incluye una etiqueta o un medio indicador capaz de señalar la formación de un complejo inmunológico que contiene un polipéptido o una molécula de anticuerpo de la presente invención. La palabra "complejo" como se utiliza en la presente, se refiere al producto de una reacción de unión especifica tal como una reacción de anticuerpo-antigeno o receptor-ligando. Los complejos ejemplares son producto de reacciones inmunitarias. Como se utiliza en la presente, los términos "marca" y "medio de indicación" en sus diversas formas gramaticales se refieren a átomos y moléculas sencillas que pueden estar relacionadas directa o indirectamente en la producción de una señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Cualquier marca o medio indicador se puede unir o se puede incorporar en una proteína expresada, polipéptido o molécula de anticuerpo que sea parte de una composición de anticuerpo o anticuerpo monoclonal de la presente invención, o se puede utilizar por separado, y aquellos átomos o moléculas se pueden utilizar solos o junto con reactivos adicionales. Tales marcas en si mismas son bien conocidas en la química de diagnóstico clínico y constituyen parte de esta invención únicamente en la medida en que se utilicen con las proteinas, métodos o sistemas de otra manera novedosos. El medio de marcado puede ser un agente de marcado 5 fluorescente que se una quimicamente a anticuerpos o antígenos sin desnaturalizarlos para formar un fluorocromo (colorante) que es un trazador inmunofluorescente útil. Los agentes marcadores fluorescentes adecuados son fluorocromos tales como isocianato de fluoresceína (FIC) , isotiocianato 10 de fluoresceina (FITC) , cloruro de 5-dimetilamino-l- naftalensulfonilo (DANSC) , isotioacianato de tetrametilrodamina (TRITC) , lisamina, cloruro de rodamina 8200 sulfonilo (RB 200 SC) y similares. Una descripción de las técnicas de análisis de inmunofluorescencia se encuentra 15 en DeLuca, "Immunofluorescence Analysys", en Antibody As a Tool , Marchalonis, et al., Eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp. 189-231 (1982), la cual se incorpora en la presente como referencia. Otros agentes de marcado adecuados se conocen • por aquellos expertos en la técnica. 20 En las modalidades preferidas, el grupo indicador en una enzima, tal como peroxidasa de rábano (HRP) , glucosa oxidasa o similar. En tales casos en donde el grupo indicador principal es una enzima tal como HRP o glucosa oxidasa, se requieren reactivos adicionales para visualizar 25 el hecho de que se ha formado el complejo receptor-ligando (inmunorreactivo) . Tales reactivos adicionales para HRP incluyen peróxido de hidrógeno y un precursor de colorante de oxidación tal como diaminobencidina. Un reactivo adicional útil con glucosa oxidasa es el ácido 2,2'-amino-di- (3-etilbenzotiazolino-G-sulfónico) (ABTS). Los elementos radioactivos también son útiles como agentes marcadores y se utilizan de manera ilustrativa en la presente. Un agente de radiomarcado ejemplar es un elemento radioactivo que produce emisiones de rayos ?. Los elementos los cuales en si mismos emiten rayos ?, tales como 12 I, 125I, 128I, 132I y 51Cr representan una clase de grupos indicadores de elementos radioactivos productores de emisión de rayos ?. Se prefiere particularmente al 125I . Otro grupo de un medio marcador útil son aquellos elementos tales como 1:LC, 18F, 150 o 13N los cuales en si mismo emiten positrones. Los positrones emitidos de esta manera producen rayos ? cuando se encuentran con electrones presentes en el cuerpo de los animales. También son útiles como emisores ß tales como U1 indio o 3H. El enlace de marcadores, por ejemplo marcadores de polipéptidos y proteinas es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden marcar moléculas de anticuerpo producidas por un hibridoma mediante incorporación metabólica de aminoácidos que contengan radionúclidos que se proporcionen como un componente en el medio de cultivo (véase, por m'?,¡kÍA,A,.É¿?£* .. ejemplo, Galfre et al., Meth . Enzymol . , 73:3-46 (1981)). Las técnicas de conjugación de proteínas o acoplamiento mediante grupos funcionales activados son particularmente aplicables (véase, por ejemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol . , Vol. 8 Suppl. 7:7-23 (1978); Rodwell et al., Biotech . , 3:889-894 (1984); y la patente de los E.U.A. número 4,493,795) . Los sistemas de diagnóstico también pueden incluir, de manera preferible como un paquete separado, un agente de unión especifico. Un "agente de unión específico" es una entidad molecular capaz de unir selectivamente una especie reactiva de la presente invención o un complejo que contiene tal especie, pero que en si mismo no es una composición de molécula del polipéptido o anticuerpo de la presente invención. Los agentes de unión específicos ejemplares son moléculas de segundo anticuerpo, proteínas de complemento o fragmentos de las mismas, la proteína A de S . aureus y similares. Preferiblemente, los agentes de unión específicos se unen a las especies reactivas cuando estas especies están presentes como parte de un complejo. En las modalidades preferidas, el agente de unión específico está marcado. Sin embargo, cuando el sistema de diagnóstico incluye un agente de unión específico que no está marcado, el agente utilizado habitualmente es un medio o reactivo amplificador. En estas modalidades, el agente de unión específico marcado es capaz de unirse específicamente al medio amplificador cuando el medio amplificador se une a un complejo que contiene especies reactivas. Los equipos de diagnóstico de la presente invención se pueden utilizar en un formato de tipo "ELISA" para detectar la cantidad del polipéptido de la presente invención en la muestra. El término "ELISA" se refiere al ensayo inmunosorbente unido a enzima que utiliza un anticuerpo o antigeno unido a una fase sólida y un conjugado de enzima-antígeno o enzima-anticuerpo para detectar y cuantificar la cantidad de un antigeno presente en una muestra. Una descripción de la técnica de ELISA se encuentra en Sites et al., Basic and Clini cal Immunology, 4th Ed., Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982) y en las patentes de E.U.A. número 3,654,090; número 3,850,752; y número 4,016,043, la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Por lo tanto, en algunas modalidades, un pollpéptido de la presente invención, un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal de la presente invención se pueden fijar a una matriz sólida para formar un soporte sólido que comprende un empaque en los sistemas de diagnóstico objetivos . Un reactivo habitualmente se fija a una matriz sólida por absorción desde un medio acuoso, aunque se pueden ki?Áá-? á,^ i*í.. utilizar otros modos de fijación aplicables a proteinas y polipéptidos, que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos de absorción ejemplares se describen en la presente. Las matrices sólidas útiles también son conocidas en la técnica. Tales materiales son insolubles en agua e incluyen dextrano reticulado disponible bajo la marca comercial SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) ; agarosa; esferas de poliestireno de aproximadamente 1 micrómetro (µm) a aproximadamente 5 milímetros (mm) de diámetro disponibles de varios proveedores, por ejemplo Abbott Laboratories of Nrth Chicago, IL; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, telas basadas en nitrocelulosa o nylon tales como láminas, tiras o almohadillas; o tubos, placas o los pozos de una placa de microtitulación tales como las elaboradas de poliestireno o cloruro de polivinilo. Las especies reactivas, el agente de unión específico marcado o el reactivo de amplificación de cualquier sistema de diagnóstico descrito en la presente se puede proporcionar en solución, como una dispersión líquida o como un polvo sustancialmente seco, por ejemplo en forma liofilizada. Cuando el medio de indicación es una enzima, el sustrato de la enzima también se puede proporcionar en un paquete separado de un sistema. También se puede incluir un soporte sólido tal como la placa de microtitulación descrito en lo anterior y uno o más amortiguadores, como elementos empacados por separado en este sistema de ensayo de diaganóstico . Los materiales empacados que se discuten en la presente en relación a los sistemas de diagnóstico son aquellos habitualmente utilizados en sistema de diagnóstico. Al haber descrito de manera general la invención, la misma se comprenderá con mayor facilidad, con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan por medio de ilustración y no se intente de que sean limitantes.

EJEMPLO 1 Identificación y Caracterización de Polinucleótidos Regulados por Medicamentos Neurolépticos Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) en grupos de cuatro en un ciclo de luz-oscuridad convencional de 12/12 horas y tienen acceso a voluntad a comida de laboratorio convencional y agua corriente. Para los modelos experimentales, los ratones se dividen en grupos de 25 y se someten a los siguientes tratamientos: Grupos testigo: Los ratones reciben una sola inyección de solución salina estéril (0.1 ml volumen) o no reciben inyección, y se sacrifican después de 45 minutos.

Tratamiento neuroléptico agudo: Los ratones reciben una sola inyección intraperitoneal de 7.5 mg/kg de clozapina neuroléptica atipica. Se sacrifica a los animales después de 45 minutos.

Tratamiento neuroléptico crónico: Los ratones reciben diariamente inyecciones subcutáneas de 7.5 mg/kg de clozapina por periodos de tiempo de 5 días a 2 semanas.

Se sacrifica a todos los animales en sus jaulas con C02 en los momentos indicados. Los cerebros se extirpan rápidamente y se colocan en hielo. Se extirpan por disección el cuerpo estreado que incluye el núcleo auditivo y se coloca en solución salina amortiguada con fosfato enfriada con hielo. El ARN aislado se analiza utilizando un método de identificación especifica de secuencia simultánea de los ARNm conocida como TOGA (siglas en inglés de análisis de expresióbn de gen total) descrito en Sutcliffe et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 97 (5) : 1976-1981 (2000); la solicitud publicada internacional WO 026406; la patente de E.U.A. número 5,459,037; la patente de E.U.A. número 5,807,680; la patente de E.U.A. número 6,030,784; la patente de E.U.A. número 6,096,503 y la patente de E.U.A. número 6,110680, incorporadas en la presente como referencia. 5 Preferiblemente, antes de la aplicación de la técnica TOGA, el ARN aislado se enriquece para formar una población de ARNm que contiene poliA inicial, por métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, el método TOGA comprende además una etapa adicional de PCR que se realiza 10 utilizando cuatro cebadores de PCR 5' en cuatro reacciones separadas y las plantillas de ADNc se preparan a partir de una población de los ARNc antisentido. Una etapa final de PCR que utiliza 256 cebadores de PCR 5' en reacciones separadas genera productos de PCR que son fragmentos de ADNc 15 que corresponden a la región 3' de la población de ARNm inicial. Los productos de PCR generados después se identifican por: a) la secuencia 5' inicial que comprende la secuencia remanente del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción utilizada para cortar y aislar 20 la región 3' más la secuencia de preferiblemente cuatro bases de análisis inmediatamente 3' respecto al resto del sitio de reconocimiento, preferiblemente la secuencia de la totalidad del fragmento, y b) la longitud del fragmento. Estos dos parámetros, la longitud de la secuencia y del 25 fragmento, se utilizan para comparar los productos de PCR ?ii ái á,?áíi;.kX*í.. &faaaia¡a.fc&aM-, J i .I .-?. obtenidos en una base de datos de secuencias polinucleótidas conocidas. Dado que la longitud de los productos de PCR obtenidos incluyen secuencias de vector conocidas en los extremos 5' y 3' de la pieza de inserción, la secuencia de la pieza de inserción que se proporciona en la lista de secuencias es más corta que la longitud del fragmento que forma parte de la dirección digital. El método genera etiquetas de secuencia digitales (DST) , es decir, polinucleótidos que expresan etiquetas de secuencias del extremo 3' de los ARNm. Las DST que muestran cambios en relación a los niveles como un resultado de tratamiento con clozapina se seleccionan para estudio adicional. Se comparan las intensidades de la fluorescencia inducida por láser de los productos de PCR marcados, de las muestras aisladas del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina, durante 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 días o 14 días. En general, el ADNc de cadena doble se genera a partir de ARN citoplásmico enriquecido con poli (A) extraído de muestras de tejido de interés utilizando una mezcla equimolar o conjunto de la totalidad de los 48 cebadores de ancla 5' biotinados para iniciar la transcripción inversa. Uno de tales conjuntos adecuados es G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20) en donde V es A, C o G y N es A, C, G o T . Un miembro de esta mezcla de 48 cebadores de ancla inicia la síntesis en una posición fi a en el extremo 3' de todas las copias de cada especie de ARNm en la muestra, por lo que define un punto final 3' para cada especie, lo que resulta en un ADNc de cadena doble biotinado. Cada muestra de ADNc de cadena doble biotinado se separa con la endonucleasa de restricción MspI, la cual reconoce la secuencia CCGG. Los fragmentos resultantes del ADNc que corresponden a la región 3' del ARNm inicial después se aislan por retención de los fragmentos de ADNc biotinados en un sustrato recubierto con estreptavidina. Los sustratos adecuados recubiertos con estreptavidina incluyen placas de microtitulación, tubos de PCR, esferas de poliestireno, esferas poliméricas paramagnéticas y partículas de vidrio poroso paramagnéticas. Un sustrato preferido recubierto con estreptavidina es una suspensión de esferas de polímero paramagnéticas (Dynal, Inc., Lake Succes NY) . Después de lavar el sustrato recubierto con estreptavidina y los fragmentos de ADNc biotinados retenidos, el producto del fragmento de ADNc se libera por digestión con Notl, que se separa como una secuencia de 8 nucleótidos dentro de los cebadores de ancla, pero raramente dentro de la porción derivada de ARNm de los ADNc. Los fragmentos 3'MspI-NotI, los cuales son de longitud uniforme para cada especie de ARNm, se ligan direccionalmente en plásmido pBC SK+ separado por Clal-Notl (Stratagene, La Jolla, CA) en una orientación antisentido respecto al 5 promotor T3 del vector, y el producto utilizado para transformar células SURE de Escherichia coli (Stratagene) . La ligación genera el sitio Notl, pero no el sitio MspI, lo que deja a CGG como las primeras tres bases del extremo 5' de todos los productos de PCR que se obtengan. Cada 10 biblioteca contiene un exceso de 5 x 105 recombinantes para asegurar una alta probabilidad de que los extremos 3' de todos los ARNm con concentraciones de 0.001% o mayores estén • representados de manera múltiple. Se realizan preparaciones de plásmidos (Qiagen) a partir de la biblioteca de ADNc de 15 cada muestra bajo estudio. Se digiere una alícuota de cada biblioteca con MspI, lo que lleva a cabo la linealización por separación en varios sitios dentro del vector original mientras deja ^^ intactos a las piezas de inserción de ADNc 3' y sus 20 secuencias flanqueantes, que incluyen el promotor T3. El producto se incuba con ARN polimerasa T3 (equipo MEGAscript Ambion) para generar transcritos de ARNc antisentido de las piezas de inserción clonadas que contienen secuencias de vector conocidas que hacen contacto con los sitios MspI y 25 Notl de los ADNc originales.

En esta etapa, cada una de las preparaciones de ARNc se procesa en una manera de tres etapas. En la etapa 1, 250 ng de ARNc se convierten al ADNc de la primera cadena utilizando el cebador 5'RT (A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G, (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21) . En la etapa dos, se utilizan 400 pg de producto de ADNc como plantilla de PCR -en cuatro reacciones separadas con cada uno de los cuatro cebadores de PCR 5' de la forma G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-C-G-G-G-N (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22), cada uno pareado con un cebador PCR 3' "universal" G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) para proporcionar cuatro grupos de productos de reacción de PCR ("productos de reacción NI"). En la etapa 3, el producto de cada subacumulado se divide adicionalmente en 64 subacumulados (2 ng en 20 µl) para la segunda reacción de PCR. Esta reacción de PCR comprende agregar 100 ng del cebador de PCR 3' "universal" fluoresceinado (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) conjugado con 6-FAM y 100 ng del cebador 5 ' PCR apropiado de la forma C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24) y utilizando un programa que incluye una etapa de reasociación a una temperatura X ligeramente por encima de la Tra de cada cebador de 5' PCR para minimizar un mal cebado generado por el método usado para promover el copiado de alta fidelidad. Cada etapa de reacción en cadena de polimerasa se realiza en presencia de anticuerpo TaqStart (Clonetech) . Los productos (productos de reacción "N4") de la etapa de reacción en cadena de polimerasa final para cada una de las muestras de tejido se separa en una serie de geles de secuenciado de ADN desnaturalizante utilizando el secuenciador ABI Prizm 377 automatizado. Los datos se recolectan utilizando un paquete de elementos de programación (software) GeneScan (ABI) y se normalizan para amplitud y migración. La ejecución completa de esta serie de reacciones genera 64 subacumulados de producto para cada uno de los cuatro acumulados establecidos por los cebadores 5 ' PCR de la primera reacción de PCR, para un total de 256 subacumulados de producto para la totalidad del primer conjunto de 5 ' PCR o de la segunda reacción de PCR. Se analizan las muestras de ARNm de cada punto en el tiempo como se describe en lo anterior. La tabla 1 es un resumen de los niveles de expresión de los 495 ARNm determinados a partir de ADNc. Estas moléculas de ADNc se identifican por sus direcciones digitales, es decir, la secuencia nucleotidica 5' terminal parcial acoplada con la longitud de la molécula, así como la cantidad relativa de la molécula producida en intervalos de tiempo diferentes después del tratamiento. La secuencia nucleotídica parcial de la parte 5' terminal se determina por el sitio de reconocimiento para MspI (CCGG) y la secuencia nucleotídica de las bases de análisis del cebador 5 ' PCR utilizada en la etapa final de PCR. La longitud de la dirección digital del fragmento se determina por interpolación en una curva 5 estándar y, como tal, puede variar + 1-2 pb de la longitud real, determinada por secuenciado. Por ejemplo, la entrada en la tabla 1 que describe una molécula de ADN identificada por la dirección digital MspI AGTA, se caracteriza además por tener una secuencia 10 nucleotídica parcial 5' terminal de CGGAGTA y una longitud de dirección digital de 106 pb. La molécula de ADN identificada como MspI AGTA 106 se describe adicionalmente como expresada en concentraciones mayores después de tratamiento agudo y crónico con clozapina (véase la figura 15 1) . Adicionalmente, la molécula de ADN identificada como MspI AGTA 106 se describe por su secuencia nucleotidica que corresponde con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. De manera similar, otras moléculas de ADN identificadas en la tabla 1 por sus direcciones digitales 20 MspI se caracterizan además por: 1) el nivel de expresión de genes en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones sin tratamiento con clozapina (testigo), 2) el nivel de expresión de gen en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina durante 45 minutos, 3) el 25 nivel de expresión de genes en el cuerpo estriado/núcleo ífeii?íís! , j ftl * auditivo de ratones tratados con clozapina durante 7 horas, 4) el nivel de expresión de gen en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina durante 5 dias, 5) el nivel de expresión de gen en el cuerpo estriado/núcleo 5 auditivo de ratones tratados con clozapina durante 12 días, 6) el nivel de expresión de gen en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina durante 14 dias. Algunos productos, los cuales también fueron representados de manera diferencial, parecen migrar a 10 posiciones que sugieran que los productos son novedosos, en base en la comparación con datos extraídos de GenBank. Las secuencias de tales productos se determinan por uno de dos • métodos: clonación o secuenciado directo de los productos por PCR. 15 De manera adicional, varias de las clonas aisladas se caracterizan además como se muestra en la tabla 2 y sus secuencias nucleotídicas se proporcionan como SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-52 y 107 en la Lista de Secuencias posterior. • 20 Las secuencias de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1-19; 49-52; 57-52 y 107 han tenido el sitio MspI encontrado en el estado nativo del ARN correspondiente indicado por la adición de una "C" hacia la parte 5' de la secuencia. Como se indica en lo anterior, la ligación de la 25 secuencia en vectores no regenera el sitio MspI; la secuencia determinada experimentalmente reportada en la presente C-G-G como las primeras bases del extremo 5'. Los datos que se muestran en la figura 1 se generan con un cebador de 5 '-PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-T-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 94) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceina (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel sobre geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Las secuencias de los productos de PCR se determinan utilizando técnicas estándar o convencionales. Los resultados del análisis TOGA utilizando un cebador 5' PCR con bases de análisis AGTA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 94) se muestran en la figura 1, la cual muestra los productos de PCR producidos a partir de ARNm aislado del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina por varios periodos de tiempo, como se describe en lo anterior. La linea de Índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 106 pb que está presente en células control y cuya expresión aumenta cuando el cuerpo estriado/núcleo auditivo de los ratones se trata con clozapina durante 45 minutos, 7 horas, 5 dias, 12 dias y 14 días.

Clonación de las DST sin una coincidencia candidato y verificación de las DST clonadas utilizando el método TOGA extendido En casos adecuados, se aisla el producto de PCR, se clona en un vector TOPO (Invitrogen) y se secuencia en ambas cadenas. Las bases de datos que coinciden para cada secuencia DST clonada se incluyen en la tabla 2. Para verificar que el producto clonado corresponda con el pico de interés TOGA, se realiza el ensayo TOGA extendido para cada DST. Se designan los cebadores de PCR en base en las secuencias determinadas y se realiza PCR utilizando los productos de reacción de PCR NI como un sustrato. Se sintetizan los oligonucleótidos con la secuencia G-A-T-C-G- A-A-T-C extendida en el extremo 3' con un sitio MspI parcial (C-G-G-) y 18 nucleótidos adyacentes adicionales de la secuencia determinada del producto de PCR clonado o DST. Por ejemplo, para el producto de PCR con la dirección digital MspI AGTA 106 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1), el cebador 5' PCR es G-A-T-C-G-A-A-T-C-C-G-G-A-G-T-A-C-A-G-T-G- A-C-T-T-T-G-A-G-T SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28) . Este cebador 5 'PCR se parea con el cebador 3 ' PCR universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23) en una reacción de PCR utilizando el producto de reacción PCR NI como sustrato. La longitud del producto PCR generado con el 5 cebador específico de clona (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28) se compara con la longitud del producto de PCR original que se produce en la reacción TOGA, como se muestra w en la figura 2. Para CLZ_3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1), la parte superior (figura 2A) muestra el 10 producto de PCR generado con el cebador especifico de clon (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28) y el cebador 3 ' PCR universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN • NUMERO: 23) . La figura 2B muestra los productos de PCR producidos en la reacción TOGA original utilizando el 15 cebador 5 'PCR C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-T-A SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 94), y el cebador 3 ' PCR universal marcado fluorescente. En la parte inferior (figura 2C) , se superponen los trazos de las partes superior y media, lo que ^^ demuestra que el producto de PCR que se produce utilizando 20 un cebador extendido en base en la secuencia clonada es de la misma longitud que el producto de PCR original. Otros clones de DST verificados utilizando este método incluyen los casos (CLZ_5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2; CLZ_8 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3; CLZ_10 25 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4; CLZ 12 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 5; CLZ_15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 6, CLZ_24, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 7, CLZ_33, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 8; CLZ_34, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 9; CLZ_37, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 10; CLZ_38, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 11; CLZ_40, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 12; CLZ_6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 14; CLZ_16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 15; CLZ_22, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 16; CLZ_32, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 17; CLZ_36, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 18; CLZ_42, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 19; CLZ_18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 57; CLZ_43, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 58; CLZ_44, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 59; CLZ_47, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 60; CLZ_48, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 61; CLZ_49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 62; CLZ_50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 63; CLZ_51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 64; CLZ_52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 65; CLZ_56, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 67; CLZ_57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 68; CLZ 60, SECUENCIA DE .* - , l-ji.¿it.l »«,áa_>: 1. , ».;.»-lMi.,.IL.i.»--.iJ.,-i- .,» AAaki.j fc&.fead -lÉ „ .i3faí-.

IDENTIFICACIÓN NUMERO: 69; y CLZ_64 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 70) . La tabla 3 contiene cebadores generados de cada uno de las DST clonadas utilizadas en tales estudios.

Secuenciado directo de los productos de PCR generados por TOGA y verificación por el método de TOGA extendido En otros casos, el producto de PCR TOGA se secuencia utilizando una modificación de una metodología de secuenciado directo (Innis et al., Proc . Na t 'l . Acad. Sci . , 85:9436-9940 (1988) ) . Los productos de PCR que corresponden a los DST se purifican en gel y se amplifican nuevamente por PCR para incorporar cebadores de secuenciado en los extremos 5' y 3'. La adición de secuencia se lleva a cabo a través de los cebadores 5' y 3' de cadena doble que contienen secuencias cebadoras de secuenciado M13 (M13 directa y M13 inversa, respectivamente) en sus extremos 5', seguido por una secuencia enlazante y una secuencia complementaria a los extremos DST. Utilizando el sistema de anticuerpo Clontech Taq Start, se prepara una mezcla maestra que contiene todos los componentes excepto la plantilla de producto por PCR purificada en gel, la cual contiene H20 estéril, amortiguador 10X PCR II, dNTP 10 mM, MgCl2 25 mM, mezcla A pliTaq/anticuerpo (1.1 µg/µl de anticuerpo Taq, 5 U/µl de AmpliTaq) , 100 ng/µl de cebador 5' de cadena doble (5' TCC CAG TCA CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCT CAT ATG AAT TAG GTG ACC GAC GGT ATC GG3 ' SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 89), y 100 ng/µl de cebador 3' de cadena doble (5' CAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG GAG CTC CAC CGC GGT GGC GGC C 3', SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 90) . Después de la adición de la plantilla de PCR, se realiza la PCR utilizando el siguiente programa: 94°C, 4 minutos y 25 ciclos de 94°C, 20 segundos; 65°C, 20 segundos; 72°C, 20 segundos; y 72°C 4 minutos. El producto de PCR adaptado amplificador resultante se purifica en gel como se describe en lo anterior. El producto de PCR extendido de cadena doble purificado se secuencia utilizando un protocolo estándar para secuenciado ABI 3700. Brevemente, se preparan reacciones por triplicado en orientación directa e inversa (un total de 6 reacciones) , cada reacción contiene 5 µl de producto de PCR N5 extendido de cadena doble purificado en gel, como plantilla. Además, las reacciones de secuenciado contienen 2 µl de amortiguador de secuenciado 2.5X, 2 µl de mezcla Big Dye Terminator, 1 µl de cebador de secuenciado 5' (5' CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG 3', SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 91), o el cebador de secuenciado 3' (5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT V 3', en donde V = A, C o G, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 92) en un volumen total de 10 µl. En una modalidad alternativa, el cebador de secuenciado 3' es la secuecnia 5' GGT GGC GGC CGC AGG AAT 5 ttt ttt ttt ttt ttt tt 3, (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 93) . Se realiza PCR utilizando el siguiente programa de ciclos térmicos: 96°C, 2 minutos y 29 ciclos de 96°C, 15 segundos; 50°C, 15 segundos; 60°C, 4 minutos. Por este método se determinan las secuencias para 10 (CLZ_62, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 71 y CZL_65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 72) . La tabla 2 contiene los pareamientos de bases de datos para las secuencias • determinadas por este método. Para verificar que las secuencias determinadas por 15 secuenciado directo se derivan del producto de PCR de interés, se designan los cebadores de PCR en base en las secuencias determinadas por secuenciado directo, y se realizan reacciones de PCR utilizando los productos de reacción de PCR TOGA NI como sustrato, como se describe en • 20 lo anterior para las secuencias clonadas en el vector TOPO. Brevemente, se sintetizan oligonucleótidos con la secuencia G-A-T-C-G-A-A-T-C extendida en el extremo 3' con un sitio MspI parcial (C-G-G) y 18 nucleótidos adicionales adyacentes al sitio MspI parcial de la secuencia determinada por 25 secuenciado directo. Los cebadores 5 ' PCR se parean con el cebador 3 ' PCR universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23) en reacciones PCR con el producto de reacción PCR TOGA NI como plantilla. Se comparan las longitudes de estos productos de PCR con la longitud de los 5 productos de PCR de interés. La tabla 3 contiene las secuencias de los cebadores utilizados en estos estudios.

Verificación de coincidencia candidato utilizando el método TOGA extendido 10 En cuatro casos, CLZ_17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 49); CLZ_26, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 50); CLZ_28, SECUENCIA DE • IDENTIFICACIÓN NUMERO: 51); y CLZ_58 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 52), las secuencias incluidas para 15 los productos de PCR TOGA se derivan de coincidencias candidato con secuencias presentes en bases de datos disponibles de Genbank, EST o registradas. La tabla 4 incluye las coincidencias candidato para cada una por el número de acceso de entrada de Genbank o por los números de • 20 accesos de un conjunto de EST ensamblados por computadora utilizados para crear una secuencia de concenso. Para determinar si los productos de PCR TOGA de interés se derivan de la secuencia de la coincidencia candidato, se diseñan cebadores PCR con la secuencia G-A-T- 25 C-G-A-A-T-C- extendida en el extremo 3' con un sitio MspI parcial (C-G-G) y 18 nucleótidos adicionales adyacentes al sitio MspI terminal en la secuencia de coincidencia candidato. Cada cebador extendido se combina con el cebador 3' PCR universal marcado fluorescente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) en una reacción de PCR con el producto de la primera reacción de PCR TOGA (productos de reacción NI) como la plantilla. Los productos de PCR obtenidos utilizando un cebador alargador y el cebador 3' universal se comparan con productos obtenidos utilizando los cebadores PCR TOGA originales. Los cebadores diseñados para tales estudios se muestran en la tabla 4 junto con los números de acceso de secuencias utilizadas para derivar las secuencias de cebador.

EJEMPLO 2 Caracterización de CLZ 5 (apo D) En la figura 3 se muestra otro ejemplo de análisis de TOGA. En la figura 3, se indica un pico aproximado en 201, identificado por la dirección digital MspI CACC 201 cuando se parea un debador 5 'PCR (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25) con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 para producir un grupo de productos de PCR. El producto de PCR se clona y se secuencia como se describe en el ejemplo 1. Para verificar la identidad del clon aislado (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) , se sintetizan oligonucleótidos que corresponden al cebador 5 ' PCR en la segunda etapa de PCR para cada candidato extendido en el extremo 3' con 12-15 nucleótidos adicionales de la secuencia clonada. En este caso, el cebador 5 'PCR es G-A-T-C-G-A-A-T-C-C-G-G-C-A-C-C-T-A-C-T-G-G-A-T-C-C-T-G-G (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29) . Este cebador 5 'PCR se parea con un cebador 3 'PCR marcado fluorescentemente (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) en los PCR utilizando el ADNc producido en la primera reacción de PCR como sustrato. Como se muestra en las tablas 2 y 3, el clon CLZ_5 (CACC 201) descrito antes corresponde con la secuencia de GenBank X82648, la cual se identifica como una secuencia de apolipoproteína D (apoD) de ratón. Otros correspondientes a las secuencias de GenBank apoD incluyen L39123 (ratón) , X55572 (rata), NM_001647 (humano). El análisis de transferencia Northern se realiza para determinar el efecto de clozapina y haloperidol en la expresión de apoD en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratópn. Además, se realizan análisis de hibridación in situ para determinar el patrón de expresión de apoD en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones testigo y tratados con clozapina. jnamh ía'j"-tj'M> "^--Ü-tti-,--^ .^:-A--t---i<-a?Jrt-t«..».«*Mt»>«*«k?«>frfcJ-jirti^ ?f/t'i - • Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) en grupos de cuatro en un ciclo estándar de luz-oscuridad de 12/12 horas con acceso a voluntad a comida de laboratorio estándar y agua corriente. Se utiliza el mismo modelo experimental utilizado en el ejemplo 1 para el análisis de transferencia Northern. Brevemente, los ratones del grupo testigo reciben una sola inyección de solución salina estéril (volumen 0.1 ml) o no reciben inyección y se sacrifican después de 45 minutos. A los ratones sometidos a tratamiento neuroléptido agudo se les suministra una inyección intraperitoneal única del neuroléptido típico haloperidol (4 mg/kg) o del neuroléptico atípico, clozapina (7.5 mg/kg) y se sacrifican después de 45 minutos o 7 horas, como se describe en el ejemplo 1. Los ratones sometidos a tratamiento neuroléptico crónico reciben inyecciones subcutáneas diarias de 4 mg/kg de haloperidol durante 10 días o 14 días, o bien reciben inyecciones diarias de 7.5 mg/kg de clozapina durante 5 días, 12 días o 14 días. Todos los animales se sacrifican en sus jaulas con C02 en los momentos indicados. Los cerebros se extirpan rápidamente y se colocan en hielo. Se extrae por disección el cuerpo estriado que incluye el núcleo auditivo y se coloca en solución salina amortiguada con fosfato, enfriada con hielo. Se aisla el ARN citoplásmico por extracción con fenol : cloroformo del tejido homogeneizado, de acuerdo con el Í&M¡lÍaÍBt* i»^^? ^?I *?^ * ?*¡ lL*ÍA*Ji ? ¿ tt. M..,-j.---. -.j.^a-.--^?-t.',I--.i.... método descrito en Schibler et al., J. Mol . Bio. , 142, 93-116 (1980) . Se prepara ARNm enriquecido con poli A a partir del ARN citoplásmico utilizando métodos bien conocidos de cromatografia oligo dT. En la figura 4 se muestra el análisis de transferencia Northern realizado utilizando ARNm enriquecido con 2 µg de poli A extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones control y ratones tratados con clozapina. Los transcritos de ARNm se fraccionan por electroforesis en gel de agarosa 1.5% que contiene formaldehido, se transfieren a una membrana de biotransformación por el método de Thomas (Thomas, P.S., Proc. Nati . Acad. Sci . , 11 , 5201-5215 (1980)) y se prehibridizan durante 30 minutos en Expresshyb (Clonetech) . Se marca una pieza de inserción de 160 pb de CLZ_5 (25-100 ng) con [ -32P]-d CTP mediante marcado oligonucleotídico para actividades específicas de aproximadamente 5 x 108 cpm/µg, agregado a la solución de prehibridación y se incuba durante 1 hora. Los filtros de lavan con alta rigurosidad (0.2 X SSC (1 X SSC:NaCl 0.015 M, citrato de Na 0.0015M) a 68°C y después se expone a película Kodak X-AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) hasta por 1 semana. Se realiza análisis de densitometria de transferencia Northern mediante elementos de programación ImageQuant .

Como se puede ver en la figura 4, se detecta ARNm de 900 pb en ratones control y tratados con clozapina, lo que corresponde al gen para apoD. La expresión de ARNm para apoD se somete a regulación por aumento progresivamente con tratamiento con clozapina durante el curso en tiempo de dos semanas. Es posible que clozapina pueda mediar su efecto antipsicótico a través de la regulación de apoD. De manera alternativa, apoD puede ser regulado de manera conjunta por clozapina, en paralelo con el mecanismo de los efectos terapéuticos de clozapina, y puede servir como un indicador de los niveles bioactivos de clozapina. En la figura 5 se muestra un análisis de transferencia Northern realizado utilizando ARNm extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones testigo y ratones tratados con haloperidol utilizando el método descrito antes y la misma sonda radiomarcada con 32P. Se detecta un ARNm de 900 pb en los ratones testigo y tratados con haloperidol, que corresponde con el gen para apoD. De manera interesante, la expresión de ARNm para apoD es ligeramente regulada por disminución con el tratamiento agudo y crónico con haloperidol. Estos resultados muestran que clozapina y haloperidol tienen un efecto diferencial en la expresión de apoD. La figura 6 es una representación gráfica que compara los resultados del análisis por TOGA del tratamiento con clozapina del clon CLZ_5 (CACC 201) que se muestra en la figura 4 y el análisis de transferencia Northern del tratamiento con clozapina del clon CLZ_5 que se muestra en la figura 5. El análisis por transferencia Northern genera una imagen utilizando un generador de imagen con fósforo para determinar la cantidad de ARNm para apoD en cada muestra tratada con clozapma en relación a la cantidad de ARNm en la muestra control. Como se puede ver, el análisis por TOGA del tratamiento con clozapina muestra relación con el análisis de transferencia Northern para el tratamiento con clozapina. Las figuras 7A-C muestran un análisis de hibridación in situ, que demuestra la expresión de apoD en cerebro de ratón. La hibridación in si tu se realiza en cortes de flotación libres (espesor de 25 µM) como se ha descrito (Thomas et al., J. Neurosci . Res . , 52, 118-124 (1998)). Los cortes coronales se hibridizan a 55°C durante 16 horas con una sonda de ARNc antisentido de 160 pb de cadena sencilla, marcada con 35S de CLZ_5 a 107 cpm/ml . La sonda se sintetiza a partir del clon de TOGA de ADNc del extremo 3' para CLZ_5 utilizando el equipo de transcripción Maxiscript (Ambion, Austin, TX) . El exceso de sonda se elimina por lavado con 2 X SSC (1 X SSC = NaCl 0.015 M/citrato de Na 0.0015 M) que contiene ß-mercaptoetanol 14 mM (30 minutos) seguido por incubación con 4 µg/ml de ribonucleasa en NaCl 0.5 M/EDTA 0.05 M/Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5, durante 1 hora a 37 °C. Se llevan lavados de alta rigurosidad a 55°C durante 2 horas en 0.5 X SSC/formamida 50%/ß-mercaptoetanol 0.01 M, y después a 68 °C durante 1 hora en 0.1 X SSC/ß-mercaptoetanol 0.01 M/sarcosil 0.5%. Los cortes se montan en placas recubiertas con gelatina y se deshidratan con etanol y cloroformo antes de la autorradiografía. Los cortes se exponen durante 1-4 días en película Kodak X-AR y después se sumergen en emulsión Ilford K-5. Después de 4 semanas, los cortes se revelan con revelador Kodak D19, se fijan y se someten a tinción contrastante con tinción azul de Richardson. La figura 7A muestra la expresión de ARNm para CLZ_5 (apoD) en cerebro anterior de ratón, la figura 7B muestra la expresión de ARNm para apoD en cerebro medio y la figura 7C muestra la expresión de apoD en cerebro posterior. En todos los cortes de cerebro se expresa apoD por células de astroglía, células de la piamadre, fibroblastos perivasculares y neuronas dispersadas. Esto concuerda con estudios previos que examinan la expresión de apoD en ratones, conejos y humanos (Yoshida et al., DNA and Cell Biology, 15, 873-882 (1996); Provost et al., J. Lipid Res . , 32, 1959-1970 (1991); Navarro et al., Neurosci . Lett . , 254, 17-20 (1998) . a,., .-A.flb.i.sj-.--*-, •...•i ajtt rrf,É | - Los resultados de transferencia Northern (figuras 4 y 6) indican que apoD se induce por clozapina en el cuerpo estriado de cerebro de ratón. Para investigar sitios adicionales de inducción de apoD, se realiza el análisis de hibridación in situ en cerebros de ratones tratados con solución salina y con clozapina. Las figuras 8A-I presentan un análisis de hibridación in si tu, que muestra la expresión de /ARNm para CLZ_5 del clon (apoD) en cerebro anterior (8A-C) , medio (8D-F) y posterior (8G-I) de ratón después de tratamiento con solución salina (hilera superior) o de tratamiento con (7.5 mg/kg) de clozapina durante 5 días (hilera media) y 14 días (hilera inferior) , utilizando métodos descritos previamente. Los animales se sacrifican por perfusión intracardíaca con paraformaldehído 4% y se extirpan los cerebros, se fijan posteriormente durante 12 horas, se crioprotegen con sacarosa 30% y se congelan rápidamente a -70°C. Con poca ampliación, se observan aumentos en ARNm para apoD en cinco días y dos semanas de tratamiento con clozapina en el cuerpo estriado, corteza, globo pálido (GP) y tálamo. Los aumentos en la expresión de apoD también se detectan en los surcos de materia gris, predominantemente en el cuerpo calloso (cc) , cisura anterior, cápsula interna (ic) y surco óptico (opt) . A mayor ampliación, es evidente que la señal de hibridación de apoD aumentada en el cuerpo estriado, globo pálido y el tálamo de .. ..-a ^t.s»- Í&&,,á.fti.tot¿,-i.jtá» ¡tt-JA los animales tratados con medicamento se debe principalmente a un aumento en el número de células que expresan apoD detectables, aunque también se observan algunas células con una expresión mayor de apoD. Utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra apoD, de longitud completa, se realizaron análisis de inmonoistoquimica para evaluar los cambios en la expresión de la proteina apoD en respuesta a clozapina. Un aumento en la expresión de proteína se correlaciona bien con aumentos en la expresión de ARNm (datos no mostrados) . Los estudios de hibridación in si tu y de inmunohistoquímica combinados demuestran que los aumentos en las concentraciones de apoD se localizan principalmente en neuronas y astrocitos del cuerpo estriado y oligodendrocitos en diversos surcos de materia blanca a través del cerebro. Las figuras 9A-H muestran una fotomicrografía de campo obscuro que demuestra la expresión de ARNm para apoD activada en diversas regiones del cerebro, que incluyen el cuerpo calloso, ( cc, figuras 9A, E) ; el putamen caudado (GP, Fig. 9B, 7F) ; la comisura anterior (acá, figuras 9C, 9G) ; y el globo pálido (GP, figuras 9D, 9H) . Las hibridaciones in si tu se llevaron a cabo como se describe antes utilizando una ribosonda para apoD marcada con 35S antisentido en cerebros de animales testigo (figuras 9A-D) y tratadas con clozapina (figuras 9E-H) . La activación observada de apoD se debe en un aumento en la cantidad de apoD expresada por célula. Las figuras 10A, B muestran una fotomicrografía de campo obscuro que demuestra la expresión de ARNm para apoD 5 activada en cápsula interna (ic) . Las figuras 10C, D muestran una vista de campo brillante del surco óptico (opt) que muestra la activación de la expresión de apoD en oligodendrocitos. Se llevaron a cabo hibridaciones in si tu como describe en lo anterior, utilizando una ribozonda para 10 apoD marcada con 35S antisentido en cerebros de animales testigo (10A, C) y tratados con clozapina (10B, D) . Como se muestra en la figura 10D, las células expresan de manera predominante apoD en el surco óptico y tienen una morfología similar a caja y están alineadas hacia arriba, en un arreglo 15 seriado, probablemente a lo largo de surcos acciónales. Tales rasgos son característicos de los oligodendrocitos, los cuales sintetizan el recubrimiento de mielina aislante de las fibras nerviosas. Los experimentos de hibridación in • si tu realizados en cerebros de ratones tratados con 20 haloperidol no mostraron aumentos sustanciales en la expresión de apoD en las regiones de materia gris o blanca (datos no mostrados) . Los surcos de materia blanca comprenden haces de fibra nerviosa que conectan diferentes regiones al cerebro. 25 Las células predominantes en estas regiones son astrocitos y oligodendrocitos de los cuales se ha demostrado que expresan apoD (Boyles et al., J. Lipid Res 31:2243-2256 (1990); Navarro et al., Neurosci Lett 254:17-20 (1995); Provost et al., J Lipid Res 32 (1991)). Para determinar qué tipo de células son las responsables del incremento en la señal de apoD, se realizaron estudios de localización conjunta utilizando una ribosonda para apoD marcada con 35C en combinación ya sea con anticuerpo específico para un marcador de astrocito, proteína ácido fibrilar glial (GFAP, por sus siglas en inglés), o un anticuerpo específico para un marcador de oligodendrocito 2', 3 ' -nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP) (Boehringer Mannheim, Alemania) . Se detectó la inmunorreacción con el equipo Vectastain ABCMR (Vector Laboratory, Inc., Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incubaron secciones de cerebro flotantes libres con solución bloqueadora (albúmina sérica bovina 4% en Tritón X-100 0.1%/PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por incubación con antisueros contra GFAP o contra CNP (dilución 1:500) en solución bloqueadora durante 16-20 horas a 4°C. Las secciones después se lavan con Tritón X-100 0.1%/PBS y se incuban con anticuerpo biotinado secundario (dilución 1:200 en solución bloqueador) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las secciones se lavan posteriormente con Tritón X-100 0.1%/PBS, se incuban durante 1 hora con reactivo ABC (1:1 en solución bloqueadora) y finalmente se lavan con Tritón X-100 0.1%/PBS. Se realizó el desarrollo o revelado enzimático con diaminobenceno 0.05% en PBS que contiene peróxido de hidrógeno 0.003% durante 3-5 minutos. La figura 11 muestra secciones de el cuerpo estriado y el surco óptico en animales testigo y tratados con clozapina. Las flechas gruesas indican la localización conjunta de GFAP y apoD, mientras que las flechas delgadas indican únicamente la expresión de apoD. Las figuras HA, B muestran que, en el cuerpo estriado sin tratar, muchas células positivas para GFAP tanto en las regiones de materia gris como blanca son positivas para apoD. Las figuras HD, E muestran que en cerebro de animales tratados con clozapina, se observa un aumento en la cantidad de apoD en un subconjunto pequeño de células positivas para GFAP en el cuerpo estriado. Adicionalmente, existe un incremento en el número de células que no son positivas para GFAP y que expresan apoD en el cuerpo estriado, asi como en globo pálido y el tálamo las cuales probablemente sean neuronas, en base en el tamaño y la morfología. Las figuras HC, F muestran la localización conjunta de GFAP y apoD en el surco óptico en animales testigo (11C) y tratados con clozapina (HF) . Aunque algunos astrocitos expresan ARNm para apoD, las células responsables para la activación del transcrito para apoD predominantes no se marcan con GFAP y por lo tanto probablemente son oligodentrocitos . En otras regiones de materia blanca, tales como el cuerpo calloso, la comisura anterior y la cápsula interna, las células que no expresan GFAP pero que expresan apoD es probable que también sean oligodendrocitos, aunque no se descarta la expresión en microglia. Las figuras 11G, H muestran la inmunohistoquímica de apoD con un anticuerpo primario contra apoD humana (Novocastra, Newcastle, Reino Unido) en el surco óptico de animales testigo tratados con solución salina (HG) o con clozapina (HH) . Los estudios de localización conjunta realizados utilizando anticuerpo contra CNP muestran inmunoreactividad para CNP en surcos de materia blanca a través del CNS, que se correlacionan con áreas de señales de hibridación de ARNm para apoD, lo que indica la expresión apoD en oligodendrocitos. Sin embargo, dentro de las regiones de materia gris del cuerpo estriado, no hay una localización conjunta consiste con la acumulación neuronal de apoD (datos no mostrados) . La figura 12 muestra el análisis de transferencia Northern de la expresión del clon CLZ_5 en células de glial cultivadas, tratadas con clozapina (100 -nM y luM) durante 1 día o 7 días. Los cultivos de células de glial se producen de ratas recién nacidas (día 2) . Las células se tratan con concentraciones diferentes de clozapina durante períodos de tiempo diferentes antes de la extracción de ARNm, como sigue: A = testigo (sin clozapina), B = clozapina 100 nM, 1 í¿X®&? n 1?*,? ??^íáSÉríit, día, C = clozapina 1 µM, 1 día, D = clozapina 100 nM, 1 semana, E = clozapina 1 µM, 1 semana. Se someten a electroforesis 20 µg de ARN citoplásmico total de cultivo de célula de glial en un gel de agarrosa 1.5% que contiene formaldehído, se somete a transferencia y sondeo como se ha descrito previamente. De manera interesante, las concentraciones de ARNm para apoD se inactivan en los cultivos de célula de glial mixtos tratados con clozapina (tanto 100 nM como 1 µM) durante 1 semana, lo que sugiere que posiblemente las neuronas y la glía muestren mecanismos diferentes para la regulación de apoD. La metodología por TOGA, el análisis por transferencia Northern y los estudios de hibridación in si tu han demostrado un aumento en la expresión de ARNm para apoD en regiones tanto de materia gris como blanca en cerebro de ratón, en respuesta a la administración crónica de clozapina. Los estudios de localización conjunta, que combinan la hibridación in si tu y los métodos de inmunohistoquímica han mostrado que se incrementan las concentraciones de ARNm para apoD tanto en neuronas como en células de glía ante la administración de clozapina. La evidencia indica que las células de glia responsables de los aumentos más notables en la expresión de apoD son principalmente oligodendrocitos, pero un subconjunto de astrocitos también tiene expresión aumentada de apoD, después del tratamiento con clozapina. En contraste, la prueba TOGA, la transferencia Northern y el análisis de hibridación in si tu muestran que la expresión de apoD no es alterada por el tratamiento con haloperidol. Además de los estudios en ratón descritos antes, los cuales muestran que apoD es regulada por la administración crónica de un medicamento antipsicótico, los estudios utilizando sujetos humanos esquizofrénicos y que presentan comportamiento bipolar muestran que la expresión de apoD está aumentada en la corteza prefrontal de tales pacientes. Los resultados combinados sugieren que apoD es un marcador que indica neuropatologia relacionada con trastornos psiquiátricos y por lo tanto se puede utilizar para corregir anomalías en regiones especificas anatómicas en el cerebro. Inicialmente se identificó a apoD como un constituyente de las lipoproteínas de alta densidad plasmáticas (HDL, por sus siglas en inglés), el cual también contiene fosfolipidos, colesterol y ácidos grasos (McConathy et al., Fed. Eur. Biochem . Soc . Lett . , 37:178(1973)). En la sangre, se considera que apoD juega un papel en el transporte inverso de colesterol, la eliminación de exceso de colesterol de los tejidos al higado para catabolismo (Oram et al., J. Lipid. Res . , 37: (1996)). Además de la expresión abundante en suero humano, apoD es un componente proteinico principal en el fluido cístico de mujeres con enfermedad cística de mama humana (Balbín et al., Biochem. - .>¿¿ -.- ..«A--tet--feJ»-«fa J. , 271:803 (1990)) y también se expresa ampliamente en muchos tejidos que incluyen hígado, riñon, intestino, bazo y cerebro (Drayna et al., J. Biol . Chem . , 261: (1986)). En el SNC de humanos, como en otras especies (Provost et al., J. Lipid Res . , 32: (1991); Seguin et al., Mol . Brain Res . , 30:242 (1995); Smith et al., J. Lipid Res . , 31:995 (1990)), apoD se expresa principalmente en células de glía, células de la piamadre, células peribasculares y algunas poblaciones neuronales (Navarro et al., Neurosci . Lett . , 254:17(1995); Kalman et al., Neurol . Res . , 22:330(2000)). Sin embargo, no se conoce el papel fisiológico de apoD dentro del SNC, y se ha demostrado que se une a varios ligados hidrofóbicos, incluyendo esteróles y hormonas esteroides (Dilley et al., Breast Canc . Res . Treat . , 16:253(1990); Lea, 0. A., Steroids, 52:337 (1988)) lo que sugiere un papel en el transporte extracelular de lípidos en el cerebro. También se ha demostrado que apoD se une a ácido araquidónico (Morais- Cabral et al., FEBS Lett . , 366:53 (1995)) implicándolo en funciones relacionadas con el remodelado de membrana celular y la síntesis de prostaglandina. En el nervio ciático en regeneración, un proceso que involucra la degradación masiva de membrana y liberación de lípidos, están aumentadas las concentraciones de apoD 500 veces (Boyles et al., J. Biol . Chem. , 265:17805 (1990)). Informes recientes han demostrado un incremento en la expresión de apoD en cerebro de ratas después de lesiones experimentales y químicas en la corteza entorhinal y el hipocampo, respectivamente (Ong et al., Neurosci . , 79:359 (1997); Terisse et al., Mol . Brain Res . , 70:26 (1999)). Adicionalmente, en humanos, apoD se acumula en el líquido cefalorraquídeo y los hipocamos de pacientes con enfermedad de Alzheimer, y otros trastornos neurológicos (Terisse et al., J. Neurochem . , 71:1643 (1998)). Por lo tanto, apoD puede estar funcionando durante situaciones patológicas, o su expresión puede representar un esfuerzo por compensar la neuropatología relacionada con tales enfermedades. El patrón de expresión de apoD en el cerebro sugiere que apoD puede tener un papel importante en las enfermedades psicóticas. Se considera ampliamente que los desequilibrios en los circuitos de ganglios básales contribuyen a comportamientos psicóticos y que el bloqueo de receptores específicos en estas regiones son las responsables de la acción neuroléptica. Los aumentos neuronales en la expresión de ARNm para apoD observados en las neuronas del cuerpo estriado y el globo pálido concuerda con esta hipótesis. Además, la inducción de apoD que se observa en la cápsula interna es de interés particular. La cápsula interna consiste de fibras nerviosas masivas que conectan el tálamo a la corteza y es un área de convergencia para los surcos de fibras que corren transversalmente a través del cuerpo estriado. El tálamo es una estación de retransmisión para &—'"•*- • " virtualmente toda la información que pasa a la corteza y la actividad coordinada corticotalámica es esencial para la condición consciente normal. Teorías recientes han relacionado el comportamiento psicótico con interrupciones en las oscilaciones corticotalámicas . Una activación de la expresión de apoD en la cápsula interna puede jugar un papel en restaurar un equilibrio adecuado de la comunicación neuronal . Además, la neuroquímica lipídica anormal que resulta del transporte o metabolismo anormal de lípidos se ha relacionado con enfermedades psicóticas tales como esquizofrenia (Walker et al., Br. J. Psych . , 174, 101-104 (1999)). Un metabolismo dañado en el colesterol relacionado con enfermedades psicóticas, y muchos informes han descrito psicosis como una manifestación de la enfermedad de Neimann-Pick, tipo C (Campo, et al., Develop . Med. and Child Neurol . , 40, 126-129 (1998); Shulman, et al., Neurol ogy, 45, 1739-1743 (1995); Turpin, et al., Dev. Neurosci., 13, 304-306 (1991)), la cual es una enfermedad recesiva autosómica relacionada con el metabolismo anormal del colesterol (Yoshida et al., DNA and Cell Biology, 15, 873-882 (1996)).

Informes adicionales han sugerido que la disfunción en la mielina puede provocar enfermedad mental. Dado que la mayor parte del colesterol en el cerebro se incorpora en la mielina, un metabolismo anormal en el colesterol puede producir disfunciones en la mielina. La mielina actúa como ^ -<«t.Sf83t.tiMM,.¿.J^a¿|^¡i.

- II un aislante a lo largo de los axones nerviosos que permite la propagación rápida de los potenciales de acción a lo largo de las fibras nerviosas. Las anormalidades moleculares de la mielina pueden resultar en una conectividad neural mal 5 regulada que se ha establecido como hipótesis como la causa de enfermedad mental (Weickert, et al., Schizophrenia Bull . , 24, 303-316 (1998) ) . Aunque no es clara la función fisiológica de apoD en el CNS, varios datos sugestivos indican un papel para 10 apoD como un vehículo para el transporte extracelular de lípidos y el movimiento de lípidos, particularmente colesterol en el sistema nervioso. apoD es un elemento constitutivo de las lipoproteínas plasmáticas de alta • densidad (HDL, por sus siglas en inglés), las cuales también 15 contienen fosfolipicos, colesterol y ácidos grasos. Aunque no se sabe mucho acerca de HDL en comparación con otras lipoproteínas plasmáticas, LDL y VLDL, se considera de manera amplia que HDL protegen contra enfermedades cardiovasculares al eliminar el exceso de colesterol de las 20 células de las paredes arteriales. Esta eliminación • involucra la interacción directa de las lipoproteínas HDL con los dominios de membrana plasmática y el transporte subsecuente al hígado para catabolismo (Oram, et al., J. Lipid Res . , 37, 2473-2491 (1996)). De manera adicional, apoD 25 se sintetiza y secreta por astrocitos cultivados, secreción la cual se ha demostrado aumenta en la presencia de ÍAtfJ -Ájt t^t^ *-& .-*-.. derivados de colesterol (Patel, et al., Neuroreport 6, 653- 657 (1995) ) . Además, también se ha demostrado que las concentraciones de apoD aumentan en la enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, lo que se relaciona con 5 concentraciones elevadas de colesterol. Estos estudios proporcionan pruebas de un papel funcionalmente importante para apoD en el transporte de colesterol en el SNC. Además de los estudios que relacionan las concentraciones de colesterol y el comportamiento psicótico, 10 otros estudios han encontrado una correlación entre las concentraciones de colesterol y el tratamiento con neurolépticos. Por ejemplo, informes que datan desde 1960 han demostrado un aumento en el colesterol sérico de • pacientes tratados con neurolépticos convencionales, tales 15 como clorpromazina o haloperidol (Spivak et al., Clin . Neuropharm . , 22, 98-101 (1999). Fleischhacker et al., Pharmacopsichia try, 19, 111-114(1986); Clark et al., Clin . Pharm . and Therapeutics, 11, 883-889 (1970)). Sin embargo, no se han observado aumentos similares con los nuevos 20 antipsicóticos atipicos tales como fluperlapina o clozapina • (Spivak et al., Clin . Neuropharm. , 22, 98-101 (1999). Fleischhacker et al., Pharmacopsychiatry, 19, 111-114 (1986); Boston, et al., Biol . Psych . , 40, 542-543 (1996)). De manera interesante, estos resultados muestran que 25 clozapina y haloperidol tienen un efecto diferencial sobre la expresión de apoD, lo que podria explicar las diferencias observadas en la regulación de colesterol. Aunque no se conoce el mecanismo para estos cambios en el colesterol, estos datos sugieren que los cambios inducidos por neurolépticos en la expresión de apoD, combinado con la capacidad de apoD para unir colesterol, pueden proiporcionar una explicación de los cambios inducidos por neurolépticos en las concentraciones de colesterol. Además de los estudios que se relacionan con el movimiento del colesterol, los informes se han enfocado en la relación entre un metabolismo interrumpido en fosfolípidos y ácidos grasos y los trastornos psiquiátricos (para una revisión véase Horrobin, et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fa tty Acids, 60, 141-167 (1999)). Por ejemplo, muchos estudios han informado de diferencias en las concentraciones en el contenido de fosfolipido de membrana total, concentraciones de ácido graso, concentraciones de colesterol y esteres de colesterilo en fibroblastos o en la corteza frontal de esquizofrénicos (Keshavan et al., J. Psychia try Res . , 49, 89-95 (1993); mahadik et al., Schizophrenia Res . 13, 239-247 (1994); Sengupta et al., Biochem. Med. , 25, 267-275 (1981); Stevens, Schizophr. Bull . , 6, 60-61 (1972) ) . Los fosfolípidos de membrana actúan como precursores en muchos sistemas de señalización (por ejemplo fosfatos de inositol, ácido araquinódico, factores de activación plaquetaria y eicosanoides) y comprenden el ambiente membranal para la transducción de señales medidada por neurotransmisores. De esta manera, un metabolismo alterado de los fosfolípidos de membrana puede tener consecuencias importantes en la comunicación neuronal, lo que resulta en anormalidades en el 5 compartimiento. Las alteraciones en la estructura de la membrana plasmática y las funciones pueden resultar de un contenido alterado y distribución de los lipidos de membrana ácidos grasos, tales como ácido araquidónico. El ácido araquidónico 10 se libera por la acción de numerosos enzimas fosfolipasa, principalmente fosfolipasa A2 y es un sustrato para prostaglandinas y síntesis de leucotrienos. Aunque no se conocen los mecanismos moleculares subyacentes a las anormalidades en el complejo sistema de bioquímica de 15 fosfolípidos, varios grupos de investigadores han demostrado un aumento de la actividad de fosfolipasa A2 en plasma y cerebros de pacientes esquizofrénicos (Gattaz et al., Biol . . Psychiatry. , 22, 421-426 (1987); Ross et al., Arch . Gen . Psychiatry. , 54, 487-494(1997); Ross et al., Brain Research , 20 821, 407-413 (1999)). Además, se ha demostrado que las • concentraciones plasmáticas de fosfolipasa A2 están disminuidas después de la terapia con neurolépticos (Gattaz et al., Biol . Psychiatry, 22, 421-426 (1987)). Otros candidatos moleculares implicados en las enfermedades 25 psicóticas incluyen enzimas de fosfolipasa C, y diacilglicerolcinasas y fosfatos de inositol (Horrobin et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fa t ty Acids, 60, 141 -167 (1999) ) . De manera interesante, además de la unión de colesterol, se ha demostrado que apoD une específicamente 5 ácido araquidónico. apoD es una apolipoproteina atípica y no comparte homología de secuencia con otras alipoproteínas (Weech et al., Prog. Lipid Res . , 30, 259-266 (1991)), más bien, es un miembro de la superfamilia de proteínas lipocalina, que funcionan en el transporte de moléculas 10 hidrofóbicas pequeñas, incluyen esteróles, hormonas esteroideas y ácido araquidónico (Balbin et al., Biochem . J. , 271, 803-807 (1990); Dilley et al., Breast Cáncer Res . , Trea t . , 16, 253-260 (1990); Lea, Steroids, 52, 337-338 (1988); Boyles et al., J. Lipid Res . , 31, 2243-2256 (1990)). 15 Como una proteina que une lipidos, apoD puede alterar la composición de ácidos grasos, las concentraciones de colesterol y los fosfolípidos de membrana, la totalidad de los cuales pueden alterar la composición y estructura de la membrana plasmática. Además, puesto que apoD une 20 específicamente colesterol, ácido araquidónico y otros • lípidos, las alteraciones en las concentraciones de apoD pueden alterar el metabolismo de lipidos y la transducción de señales al alterar la disponibilidad del sustrato para estas vías. 25 Una implicación adicional del papel de apoD en la psicosis es la observación de que apoD puede tener una relación cromosómica con la esquizofrenia. La localización cromosómica de apoD es 3q26. Estudios genéticos han establecido una asociación potencial entre la esquizofrenia y el cromosoma 3q, sin embargo, esta relación es relativamente poco concluyente (revisado por Maier, et al., Curr, Opin . Psych . , 11, 19-25 (1998)). El análisis por transferencia Northern de los cuerpos estriados de ratones tratados con haloperidol no muestra incrementos similares en la expresión de apoD como la clozapina. La esquizofrenia es un trastorno heterogéneo que abarca muchos suptipos. Las diferencias observadas en eficacia clínica entre clozapina y haloperidol pueden reflejar diferentes subtipos de esquizofrenia que están relacionados con diferentes vías o mecanismos. Por lo tanto, la regulación de apoD puede representar un mecanismo único de acción para clozapina. A este respecto, un subtipo de serotonina, tal como 5HT2a y 5HT2c puede proporcionar un mecanismo farmacológico para el efecto de clozapina en la expresión de apoD. Los resultados preliminares muestran que el tratamiento con quetancerina y mesulergina, antagonistas selectivos respectivos de 5HT2a/2c y.5HT2c, resulta en una activación aparente de la expresión de ARNm para apoD en cerebro de ratón. Se sabe que el cuerpo estriado expresa muchos subtipos de receptor 5HT, incluyendo 5HT2c, subtipo el cual puede mediar el efecto de clozapina en la expresión de apoD. En contraste, las células de glial o astrocitos cultivados no parecen expresar receptores para 5HT2c. Por lo tanto, la inactivación que se observa en estas células puede reflejar acciones de un subtipo diferente de 5HT, tal como 5 5HT2a, o un receptor diferente. Adicionalmente, en estudios de hipertensión, se ha relacionado la quetanserina con una disminución en las concentraciones totales de colesterol y Wt una activación de otra apolipoproteina, apo Al (Loschiavo, et al., Int . J. Clin . Pharmacol . Ther. Toxi col . , 28, 455-457 10 (1990) ) . Los efectos similares observados tanto con quetanserina como con clozapina sugieren que pueden estar trabajados a través de los mismos subtipos de receptores. w El hallazgo de que las concentraciones de ARNm para apoD están aumentadas por clozapina relaciona las 15 apolipoproteinas y el mecanismo de acción de los medicamentos neurolépticos. El papel propuesto de apoD en el transporte de lípidos en el SNC, combinado con las pruebas recientes de que la esquizofrenia y otras enfermedades neuropsiquiátricas están acompañadas por anormalidades en el 20 metabolismo de lípidos, sugiere que apoD puede tener un • papel importante en la acción de clozapina. EJEMPLO 3 Caracterización de CLZ 40 Se albergan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) como 25 se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental que se utilizó en el ejemplo 1 tA h e*á h,^^...y¡^A r-i^Á,..jm~.i.üttÍ»t, --^tffif- ** -¿-•-^-f;-fj#?j f-?ft^lf* ' para el tratamiento con clozapina para los diversos análisis que se describen a continuación. Brevemente, en los estudios de clozapina, los ratones del grupo testigo recibieron una sola inyección de solución salina estéril (volumen de 0.1 ml) o no recibieron inyección, y se sacrificaron después de 45 minutos. Los ratones sometidos a tratamiento agudo con clozapina se les administró una sola inyección intraperitoneal de clozapina (7.5 mg/g) y se sacrificaron después de 45 minutos o 7 horas, como se describe en el ejemplo 1. Los ratones sometidos a tratamiento crónico con clozapina recibieron inyecciones subcutáneas diarias de clozapina (7.5 mg/kg) durante 5 dias, 12 dias o 14 días. Todos los animales fueron sacrificados en sus jaulas con C02 en los tiempos indicados. El cerebro se extirpó rápidamente y se colocó en hielo. Se realizó una disección para extraer el cuerpo estriado, incluyeno el núcleo auditivo, y se colocó en solución salina amortiguada con fosfato, enfriada con hielo. Se prepara el ARNm, de acuerdo con el método descrito en el subtítulo ejemplo 2. Para los estudios con morfina, se albergaron ratones macho C57B1/6J (20-28 g) , como se ha descrito previamente en el ejemplo 1 y se dividieron en los siguientes grupos: 1) un grupo testigo, en el cual a los ratones se les implantó subcutáneamente con una pastilla placebo, bajo anestesia con halotano; 2) un grupo tratado de manera aguda con morfina, en el cual los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de morfina de 10 mg/kg; 3) un grupo crónico o tolerante, en el cual se volvió a los ratones tolerantes y dependientes al medicamento por medio de implantación subcutánea de una sola pastilla que contiene 75 mg de base libre de morfina, durante 3 días; y 4) un grupo sometido a suspensión, en el cual a los ratones que se habían vuelto tolerantes a morfina se les inyecta intraperitonealmente con naltrexona 1 mg/kg. Los animales fueron sacrificados en sus jaulas con C02 a las 72 horas después de la implantación del placebo o de la pastilla de morfina, o a las 4 horas después de una inyección única de morfina, o bien a las 4 horas después de la administración de naltrexona a los ratones tolerantes a morfina. Se extirparon rápidamente sus cerebros. Del cuerpo estriado, que incluye al núcleo auditivo y los bloques de tejidos que contienen el complejo de núcleos amigdal os bajo microscopio y se recolectaron en amortiguador de extracción para ARN enfriado con hielo. Se generaron datos de TOGA que se muestran en las figuras 13 y 14 con un cebador de 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T- C-G-G-T-T-G-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 26) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN O: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción por PCR se separan por electroforesis en gel en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizaron utilizando un programa GeneScan (Perkin-Elmer) . Los resultados del análisis por TOGA utilizando un cebador de PCT 5' con bases de análisis C-G-A-C-G-G-T-A-T-C- G-G-T-T-G-T (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 26) se muestran en las figuras 13 y 14, las cuales muestran productos de PCR elaborados a partir de ARNm aislados del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina (figura 13) o morfina (figura 14) . En la figura 13, la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 266 p.b. que está presente en células control, y cuya expresión disminuye en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina durante 45 minutos, 7 horas, 5 días, 12 dias y 14 días. La regulación por disminución de CLZ_40 se produce en un momento tan temprano como 45 minutos después del tratamiento con clozapina y permanece en regulación por disminución durante por lo menos 14 días. En la figura 14, la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 266 p.b. que está presente en células control, y cuya expresión se regula diferencialmente en el cuerpo estriado de animales testigo (PS) , el cuerpo estriado de animales con tratamiento agudo (AS) , el cuerpo estriado de animales sometidos a suspensión (WS), nucleoamigdalino de animales testigo (PA) , nucleoamigdalino de animales bajo tratamiento agudo (AA) , nucleoamigdalino de animales bajo tratamiento crónico (TA) , y nucleoamigdalino de animales sometidos a suspensión (WA) . La expresión del producto CLZ_40 es mayor en el cuerpo estriado que el núcleo amigdalino. Además, CLZ_40 muestra una regulación específica crónica o específica de supresión en ambas regiones cerebrales. En el cuerpo estriado, CLZ_40 es sometido a regulación por disminución en el cuerpo estriado sometido a suspensión, pero no en el cuerpo estriado de animales tratados de manera aguda. En el cuerpo amigdalino, CLZ_40 se somete a regulación por aumento ligera en el núcleo amigdalino de animales tratados de manera aguda y se somete a una regulación por aumento mayor en el núcleo amigdalino de animales tratados de manera crónica y el núcleo amigdalino de animales tratados con suspensión. En la figura 15 se muestra un análisis de transferencia Northern que se realiza utilizando ARNm extraído del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones control y ratones tratados con clozapina. Brevemente, se somete a electroforesis o gel de agarosa que contiene 2 µg de ARNm enriquecido con poli A asi como estándares de tamaño en un gel de agarosa 1.5% que contiene formaldehido, que se transfiere a una membrana de biotransformación y se prehibridiza durante 30 minutos en Expresshyb (Clonetech) .

Un inserto de 265 p.b. de CLZ_40 (25-100 ng) se marca con [a-32P]-d CTP mediante marcado de oligonucleótidos para especificar actividades de aproximadamente 5 x 108 cpm/µg y se agrega a la solución de prehibridación y se incuba durante 1 hora. Se lavan filtros a alta rigurosidad (0.2 X SSC) (1 X SSC: NaCl 0.015 M y citrato de Na 0.0015 M) a 68°C y después se expone a película Kodak X-AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) hasta durante 1 semana. Como se muestra en la figura 15, se detecta un transcripto de 9-12 Kb en ratones testigo y tratados con clozapina, lo cual disminuye notablemente después de 45 minutos bajo tratamiento con clozapina y permanece en regulación por disminución durante por lo menos 14 días. La figura 16 es una representación gráfica que compara los resultados del análisis por TOGA en el tratamiento con clozapina del clon CLZ_40 que se muestra en la figura 13 y el análisis de transferencia Northern tratamiento con clozapina del clon CLZ_40 que se muestra en la figura 15. Se genera una imagen de la transferencia Northern utilizando el equipo de generación de imagen con fósforo para determinar la cantidad de ARNm para CLZ_40 en cada muestra tratada con clozapina en relación a la cantidad de ARNm en la muestra control. Como se puede ver, el análisis por TOGA del tratamiento con clozapina muestra correlación con el análisis de transferencia Northern del tratamiento con clozapina.

JdAá? áA?At?. ******** --a-i--É--a---l-É- .¿. ?*»<.tMt*t*¡**.áeLl .i A Las figuras 17 -B son un análisis de hibridación in si tu, que muestran la expresión de ARNm para CLZ_40 en el cerebro de ratón. Se realiza hibridación in si tu en cortes de flotación libre (de un espesor de 25 µm) . Las secciones 5 coronales se hibridizan a 55°C durante 16 horas con una sonda de ARNc antisentido, de cadena sencilla, marcada con 35S de CLZ_40 a 107 cpm/ml . La sonda se sintetiza a partir • del clon para TOGA de ADNc en el extremo 3' utilizando el equipo Maxiscript Transcription (Ambion, Austin, TX) . Se 10 elimina el exceso de sonda mediante lavado con 2 X SSC (I X SSC = NaCl 0.015 M/citrato de NaCl 0.0015 M) que contiene ß- mercaptoetanol 14 mM (30 minutos) seguido por incubación con 4 µg/ml de ribonucleasa en NaCl 0.5 M/EDTA 0.05 M/Tris-HCl • 0.05 M, pH 7.5, durante 1 hora a 37°C. Se llevan a cabo 15 lavados de alta rigurosidad a 55°C durante 2 horas en 0.5 X SSC/formamida 50%/ß-mercaptoetanol 0.01 M y después a 68°C durante 1 hora en 0.1 X SSC/ß-mercaptoetanol 0.1 X sarcosil 0.5%. Los cortes se montan en cubreobjetos recubiertos con gelatina y se deshidratan con etanol y cloroformo antes de 20 la autorradiografia. Los cortes se exponen durante 1-4 dias • a película Kodak X-AR y después se sumergen en emulsión Ilford K-5. Después de 4 semanas, los cortes se revelan con revelador Kodak D19, se fijan y se someten a tinsión contrastante con tinsión azul de Richardson. De manera 25 interesante, ARNm para CLZ_40 se expresa específicamente en el núcleo auditivo y en la corteza piriforme (figura 17A) y la oliva cerebelosa (figura 17B) , pero no se detecta en ninguna otra región cerebral. Hasta el momento, CLZ_40 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) es de identidad desconocida. Sin embargo, el EST para CLZ_40 se ha amplificado por PCR y el clon de la secuencia extendida de CLZ_40 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13) coincide con EST en la base de datos GenBank (AI509550), como se muestra en la tabla 4. La observación de que CLZ_40 es regulado por disminución bajo el tratamiento con clozapina sugiere una relación potencial con los efectos terapéuticos de clozapina. Además, dado su patrón de expresión de gen altamente único, es como ningún otro gen identificado hasta ahora, y su presencia en el núcleo auditivo puede relacionar a CLZ_40 en muchos de los papeles funcionales relacionados con su estructura, específicamente el comportamiento límbico/mental y la adicción. La adicción a opiados y otros medicamentos susceptibles de abuso es una enfermedad crónica del cerebro, lo que muy probablemente resulte de adaptaciones moleculares y celulares de neuronas especificas a exposición repetida a opiados (Leshner, A., Science, 278, 45-47 (1997)). Un sustrato neural importante relacionado en el refuerzo opioide y la adicción es el sistema mesolimbico, principalmente el núcleo auditivo (Everitt, et al, Ann, N. Y. Acad. Sci . , 877, 412-438 (1999)). Todos los medicamentos altamente aditivos, tales como opiados, cocaína y anfetaminas, producen adaptaciones en los circuitos neurales del núcleo auditivo, pero se desconocen las relaciones precisas. La neuroadaptación molecular que se lleva a cabo 5 en esta estructura puede aclarar de manera importante los mecanismos de adicción a drogas. CLZ_40 es un candidato probable para relacionarlo en tales mecanismos debido a su • expresión específica en el núcleo auditivo. La dilucilación de la biología subyacente a la psicosis y la adicción es una 10 clave para comprender las causas subyacentes de tales trastornos y pueden llevar al desarrollo de tratamiento más efectivos, que incluyen medicamentos contra la adicción. Además, los mecanismos de comportamiento • relacionados con la adicción reflejan mecanismos de 15 aprendizaje y memoria (White, N., Addi ction, 91, 921-949 (1996) ) . El sistema del hipocampo se ha relacionado durante mucho tiempo con el aprendizaje y la memoria, incluyendo formas de aprendizaje asociativo convencional (Sziklas, et al., Hippocampus, 8, 131-137 (1998)), la cual es la forma de 20 aprendizaje relacionada con la adicción (Di Chiara, et al., Ann, N. Y. Acad. Sci . , 877, 461-85 (1999)). La expresión de CLZ_40 en el hipocampo sugiere que este gen puede proporcionar un enlace con tales procedimientos de aprendizaje . - • 10 • 15 • 20 - i¿???.?.k?J?**?.*. ílilfi tft h l-J¡-,-—'1--"e^'a' --J--- •-•^•~.M^'*a«t, tnT-j.A.-Awttorii* dsáÚ??-, 10 # 15 • 20 - fclfj-d,ái¿,-Mití :_ ;.fa. Jl^^L.i.. A?^,Í¿^-.LíÁL..ú^LÁ^LÍ¿^k*^ -¡--E¿-.¿ .Á-i « ,-i-. - j-n^^^m^ - ÍÁ,tk.?»-Í-^--'y:Í> ? ArfÉ lfat¿.n 10 • 15 20 • 25 - - 10 • 15 20 • 25 - • 10 15 20 25 IriÜÉTirf- 'faafcA**-*"J? t=í> tilm f -« <*•---«-* • - , ._-,..,.-..-... *L _-. J---J1Ak-k.-A?»M . »...lá • 10 15 20 • 25 H1 o cp o to ?-> o i o t\> to t-> cn o cp o to o cp to to cn o t-> cp EST = Etiqueta de Secuencia Expresada, N/A = no ap t to I-1 cp o ) co to Ul o Ul O to to • • to to H1 t-» ) o cp o cp to to to t to t-* cp o cn o n EST = Secuencia Tag expresada t to co • • t l-> UT O cn o cn to to • • to to t-1 cn o ui o cp t to cp • t to cp o cn o n to to • • co co t-> l o cp o ui CO to ^1 EJEMPLO 4 Caracterización de CLZ_34 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA descrito a continuación. Los datos de TOGA que se muestran en la figura 18 se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-A-T-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27) pariado con el cebador "universal" 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizaron utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Los resultados del análisis por TOGA utilizando un cebador de PCR 5' con bases de análisis C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-A-T-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27) se muestran en la figura 18, la cual muestra los productos de PCT producidos a partir de ARNm aislado del cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones tratados con clozapina durante diversos períodos de tiempo, .Í- .^-LJ....-.iít,-, ^f, .í. -í-;?¡.r.i % ;&..&.- ar ...--A-¡-?*-- -J -i.» - como se describe en el ejemplo 1. En la figura 18, la línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 89 pb que está presente en las células testigo, y cuya expresión en el cuerpo estriado/núcleo 5 auditivo de ratones tratados con clozapina es regulado de manera diferencial con tratamiento agudo versus tratamiento crónico. CLZ_34 es regulado por aumento con tratamiento con • clozapina a los 45 minutos y 7 horas, pero disminuye a un nivel control en el día 5 y permanece aproximadamente a un 10 nivel control hasta por 12 días, lo que muestra un ligero incremento en el día 14. El análisis in si tu realizado utilizando CLZ_34 como una sonda mostró que CLZ_34 se expresa ubicuamente en el cerebro (datos no mostrados) . • CLZ_34 corresponde con la secuencia de GenBank 15 U08262, la cual se identifica con el receptor de N-metil-D- aspartato de rata/subunidad NMDARl-2a (NMDAR1) . El receptor de NMDAR1 es un receptor de glutamato involucrado en el proceso subyacente al aprendizaje y la memoria. Además, muchos estudios han demostrado que el bloqueo de las 20 acciones de glutamato por antagonistas de receptor no competitivo (por ejemplo MK801 y dextrometorfano) y competitivo (por ejemplo LY274614) de NMDA bloquean o reducen el desarrollo de tolerancia a morfina después de administración de opiáceos a largo plazo (Trujillo et al., 25 Science, 251, 85-87, (1991); Elliott et al., Pain, 56, 69-75 lil ^^^J^^^-a .^?»!»iM»iafeJ.fc^»fc..-<- i»a.tt»e. -, «>« *?-tn. -->>>«. rfA"¿'n¿?- ----?-------l - (1994); iesenfeld-Hallin, Z., Neuropsychopharm. , 13, 347-56 (1995)). El cambio temprano en el nivel de expresión de CLZ_34 el cual tiene una alta homología con un receptor de NMDA es interesante en vista de la capacidad de los antagonistas de NMDA de bloquear el desarrollo de tolerancia a opioides.

EJEMPLO 5 La figura 19 muestra la secuencia de consenso de un ensamblado generado en computadora de las siguientes 4 secuencias AI415388: clon de ADNc de Mus musculus de ratón Soares p3NMF19.5 AI415388 IMAGE: 350746 3', secuencia de ARNm; clon de ADNc de Mus musculus de UI-M-AM0-ado-e-04-0- UI.sl NIH_BMAP_MAM UI-M-AM0-ado-e-0 -0-UI 3' secuencia de ARNm; ADNc de Mus musculus de embrión de ratón Soares NbME13.5 14.5 IMAGE: 356159 3', secuencia de ARNm; ADNc de Mus musculus NbME13.5 14.5 de embrión de ratón Soares AI425991 IMAGE: 426077 ' 3 ' , secuencia de ARNm (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 53) . La figura 20 muestra la secuencia de el ARNm para MDC15 de mataloproteasa-desintegrina de Mus musculus EST AF006196, cds completo (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 54) - La figura 21 muestra la secuencia de consenso del ensamblado generado por computadora de las siguientes 3 secuencias : secuencia del extremo 3 ' de ADNc de óvulo fertilizado de Mus musculus C86593, clon J0229E09 3*, 5 secuencia de ARNm; clon de ADNc de Mus musculus 10666014 13 5 dpc de embrión de ratón Life Tech AI428410 IMAGE: 553802 3 ' , secuencia de ARNm; clon de ADNC de Mus musculus (#937313) de piel de ratón Stratagene AI561814 IMAGE: 1227449 3', secuencia de ARNm (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 55) . 10 EJEMPLO 6 Caracterización de CLZ_44 15 Se alojan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) como se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utilizó el mismo paradigma experimental utilizado para el ejemplo 1, para tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generaron con un cebador PCR 5' (C-G-A- 20 C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-C-G-G; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 96) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel sobre 25 geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se &&% »=.-í¡--- , - adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_44 es regulado por aumento ligeramente por el tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_44 es un EST aislado de riñon de ratón. En una caracterización adicional de CLZ_44, se realiza análisis de transferencia Northern para determinar el patrón de expresión en el cuerpo estriado/núcleo auditivo después de 2 semanas de tratamiento de ratones testigo, ratones tratados con clozapina, ratones tratados con haloperidol y ratones tratados con quetanserina (figura 22) . La quetanserina es un antagonista selectivo de 5HT2A/2C, y se utiliza para determinar la relación serotonérgica en estos efectos de medicamentos. Brevemente, un gel de agarosa que contiene 2 µg de ARNm enriquecido con poli A así como estándares de tamaño se somete a electroforesis en un gel de agarosa 1.5% que contiene formaldehído, se transfiere a una membrana de biotransformación y se prehibridiza durante 30 minutos en Expresshyb (Clonetech) . Se marca una pieza de inserción de CLZ_44 (25-100 ng) con [OÍ-32P] -d CTP por marcado oligonucleotídico para actividades específicas de aproximadamente 5 x 108 cpm/µg y se agrega a la solución de prehibridación y se incuba durante 1 hora. Los filtros se l-Uft.ft...lJ^ lavan a alta rigurosidad (0.2 X SSC) (1 X SSC: NaCl 0.015 M y citrato de Na 0.0015 M) a 68°C y después se expone a película Kodak X-AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) hasta por 1 semana. La figura 22 es una representación gráfica de los 5 resultados del análisis de transferencia Northern descritos. Como se muestra, después de 2 semanas de tratamiento, se somete a regulación por aumento a CLZ_44 con haloperidol y quetanserina, pero no con clozapina. Esto sugiere que los receptores tanto de dopaminas D2 como 5HT2A/2C están 10 involucrados en la regulación de expresión de CLZ_44. La carencia de efecto de clozapina puede indicar que el antagonismo de otros receptores (es decir, 5HT3, D4 , DI) puede superponerse a los efectos de los receptores D2 , 5HT2. • 15 EJEMPLO 7 Caracterización de CLZ_38 Se alojan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) , como 20 se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5"-PCR (C-G-A-C-G-G- T-A-T-C-G-G-T-G-C-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 97) 25 pareados con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína - (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_38 es un ARNm proteínico específico para oligodendrocito. En una caracterización adicional de CLZ_38, se realizan análisis de transferencia Northern para determinar el patrón de expresión en el cuerpo estriado/núcleo auditivo de ratones testigo y ratones tratados con clozapina durante 45 minutos, 7 horas, 5 días y 2 semanas (figura 23) . Brevemente, un gel de agarosa que contiene 2 µg de ARNm enriquecido con poli A así como estándares de tamaño se somete a electroforesis en gel de agarosa 1.5% que contiene formaldehído, se transfiere a una membrana de biotransformación y se prehibridiza durante 30 minutos en Expresshyb (Clonetech) . Una pieza de inserción de CLZ_38 (25-100 ng) se marca con [ -32P] -d CTP por marcado oligonucleotídico para actividades específicas de aproximadamente 5 x 108 cpm/µg y se agrega a la solución de prehibridación y se incuba durante 1 hora. Los filtros se lavan a alta rigurosidad (0.2 X SSC) (1 X SSC: NaCl 0.015 M y citrato de Na 0.0015 M) a 68°C y después se exponen a película Kodak X-AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) hasta por - 1 semana. La figura 23 es una representación gráfica del análisis de transferencia Northern descrito. Como se muestra, el patrón de expresión de CLZ_38 en animales tratados con clozapina es similar al patrón que se observa con el análisis por TOGA.

EJEMPLO 8 Caracterización de CLZ 16 Se alojan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) , como se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5 ' -PCR (C-G-A-C-G-G- T-A-T-C-G-G-C-T-A-G; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 97) pareados con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6 -carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis TOGA indican que CLZ_16 es ligeramente regulado por í-.---j.----«-ii ÁÁ?ii disminución mediante el tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_16 es una proteína repetida en un brazo. En una caracterización adicional de CLZ_16, se realizó un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_16, para demostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_16 en cerebro anterior (24B) y cerebro posterior (24A) . Los ratones testigo y los ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina se sacrifican después de 2 semanas. La hibridación in si tu se realiza en cortes de flotación libre (de 25 µM de espesor) . Las secciones coronales se hibridizan a 55°C durante 16 horas en una sonda de ARNc antisentido, de cadena sencilla, marcada con 35S de CLZ_16, a 107 cpm/ml . La sonda se sintetiza a partir del clon para TOGA de ADNc con terminado en la parte 3 ' del Equipo de Transcripción Maxiscript (Ambion, Austin, TX) . Se elimina el exceso de sonda por medio de lavado con 2 X SSC (I X SSC = NaCl 0.015 M/citrato de Na 0.0015 M) que contiene ß- ercaptoetanol 14 mM (30 minutos) , seguido por incubación con 4 µg/ml de ribonucleasa en NaCl 0.5 M/EDTA 0.05M/Tris-HC1 0.05 M, pH 7.5 durante 1 hora a 37°C. Los lavados de alta rigurosidad se llevan a cabo a 55 °C durante 2 horas en 0.5 X SSC/formamida 50%/ß-mercaptoetanol 0.1 M, y después a 68 °C durante 1 hora en 0.1 X SSC/ß -mercaptoetanol 0.01 M/sarcosil 0.5%. Los cortes se montan en placas recubiertas - con gelatina y se deshidratan con etanol y cloroformo antes de la autorradiografía. Los cortes se exponen durante 1-4 días a película Kodak X-AR y después se sumergen en emulsión Ilford K-5. Después de 4 semanas, los cortes se revelan con revelador Kodak D19, se fijan y se someten a tinción contrastante con tinción azul de Richardson. Como se muestra en la figura 24A y B, el ARNm para CLZ_16 se expresa de manera ubiqua en el cerebro de ratón. La figura 24A muestra un marcado denso en la corteza y circundando la formación del hipocampo así como un marcado moderado en el tálamo dorsal y cerebro posterior. La figura 24B muestra un marcado uniforme a través del mismo.

EJEMPLO 9 Caracterización de CLZ 17 Se alojan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) , como se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5 ' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-C-T-C-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 99) pareados con el cebador 31 "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de i¿¿--fcj.¿j«feA??É-, reacción de PCR se separan por electroforesis en gel en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan 5 (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_17 es ligeramente regulado por disminución mediante el tratamiento con clozapina. La tabla 4 muestra que CLZ_17 coincide con varios de los EST 10 aislados de tejido de ratón. En una caracterización adicional de CLZ_17, se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida J? contra el extremo 3' de CLZ_17, para demostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_17 en los cortes de ratón de las 15 regiones anterior (25B) y posterior del cerebro (25A) . La hibridación in si tu se realiza en cortes de flotación libre (de espesor de 25 µM) tomados de ratones testigo y ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina durante 2 semanas. Los cortes coronales se hibridizan a 55°C 20 durante 16 horas con una sonda de ARNc antisentido, de cadena sencilla marcada con 35S, de CLZ_17, a 107 cmp/ml . La sonda se sintetiza a partir del clon para TOGA de ADNc terminado en 3 ' utilizando el Equipo de Transcripción Maxiscript (Ambion, Austin, TX) . Se elimina el exceso de 25 sonda por lavado, como se describe previamente en el ejemplo - 8. Los cortes se montan en placas recubiertas con gelatina y se deshidratan con etanol y cloroformo antes de la autorradiografía. Los cortes se exponen durante 1-4 días a película Kodak X-AR y después se sumergen en emulsión Ilford K-5. Después de 4 semanas, se revelan los cortes con revelador Kodak D19, se fijan y se someten a tinción contrastante con tinción de azul de Richardson. Las figuras 25A-B muestran un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 31 de CLZ_17, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_17 en secciones coronales de las regiones posterior (25A) y anterior (25B) de cerebro de ratón. Como se muestra, el ARNm para CLZ_17 se expresa en la corteza, hipocampo, cuerpo estriado y núcleos amigdalinos.

EJEMPLO 10 Caracterización de CLZ 24 Se alojan ratones machos C57B1/6J (20-28 g) , como se describe previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G- T-A-T-C-G-G-G-G-C-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 100) pareada con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel sobre geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_24 es regulado por aumento mediante el tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_24 es un EST aislado de tejido de rata. En una caracterización adicional de CLZ_24, el análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_24, se realiza para mostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_24 en cerebro anterior de ratón (26B) y cerebro posterior (26A) . La hibridación in si tu se realiza en cortes de flotación libre (espesor de 25 µM) que se obtienen de ratones testigo y ratones tratados con 7.5 mg/kg de clozapina durante 2 semanas. Los cortes coronales se hibridizan a 55°C durante 16 horas con una sonda de ARNc antisentido, de cadena sencilla marcada con 35S, de CLZ_24, a 107 cmp/ml. La sonda se sintetiza desde el clon de TOGA de ><fe&¿Mfc*'^'~.-«"'^^yhlgi¿t---?----^ afei - ADNc que termina en el extremo 3 ' utilizando el Equipo de Transcripción Maxiscript (Ambion, Austin, TX) . Se elimina el exceso de sonda por lavado como se describe previamente en el ejemplo 8. Los cortes se montan en placas recubiertas de gelatina y se deshidratan con etanol y cloroformo antes de la autorradiografía. Los cortes se exponen durante 1-4 días a película Kodak X-AR y después se sumergen en emulsión Ilford K-5. Después de 4 semanas, se revelan los cortes con revelador Kodak D19, se fijan y se someten a tinción contrastante con tinción azul de Richardson. Las figuras 26A-B muestran un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_24, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_24 en un corte coronal a través de los hemisferios (26A) y una sección transversal a través del tronco encefálico (26B) en cerebro de ratón. Como se muestra, el ARNm para CLZ_24 se expresa de manera ubicua en la corteza.

EJEMPLO 11 Caracterización de CLZ_26 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. El mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, se utiliza para los análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-C-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 101) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6 -carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción por PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_26 es ligeramente sometido a regulación por disminución mediante el tratamiento con clozapina. La tabla 4 muestra que CLZ_26 es un ARNm de metaloproteasa-desintegrina MDC15. En una caracterización adicional de CLZ_26, se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_26 para mostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_26 en el cerebro anterior (27B) y cerebro posterior (27A) de ratón. La hibridación in si tu se realiza en cortes coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 3SS de CLZ_26 utilizando los métodos descritos en los ejemplos anteriores . Las figuras 27A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_26 que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_26 en un corte coronal de los hemisferios a nivel de la formación del hipocampo (27A) y un corte coronal de los hemisferios a nivel del cuerpo estriado (27B) en cerebro de ratón. Como se muestra, el ARNm para CLZ_26 se expresa de manera ubicua en la corteza.

EJEMPLO 12 Caracterización de CLZ 28 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se ha descrito previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para los análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5 ' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 102) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción por PCR se separan por electroforesis en gel, en - geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . 5 Como se muestra en la tabla 1, los resultados de análisis por TOGA indican que CLZ_28 es regulado por disminución mediante el tratamiento con clozapina. La tabla 4 muestra que CLZ_28 coincide con varios EST aislados de tejido de ratón. En una caracterización adicional de CLZ_28, 10 se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_28 para mostrar el patrón de expresión de ARNm para á? CLZ_28 en el cerebro anterior (28B) y el cerebro posterior (28A) de ratón. 15 La hibridación in si tu se realiza en cortes coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena única marcada con 35S de CLZ_28 utilizando los métodos descritos en los ejemplos anteriores . 20 Las figuras 28A-B muestran un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_28, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_28 en un corte coronal a través de los hemisferios a nivel del hipocampo (28A) y un 25 corte coronal a través de la región posterior de los á?*á ¿í,ii ú?.. ?k& <i m áí.?i^ hemisferios (28B) en cerebro de ratón. Como se muestra en las figuras 28A y B, el ARNm para CLZ_28 se expresa de manera ubicua en la corteza.

EJEMPLO 13 Caracterización de CLZ__3 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. El mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina se utiliza para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-T-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 94) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción por PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados de análisis por TOGA indican que CLZ_3 es regulado por aumento mediante el tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_3 es un ARNm para serina proteasa HTRA. En ?JM&.í^.t?^aatt?^tíi .-?Í? una caracterización adicional de CLZ_3 , se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_3 para mostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_3 en cerebro 5 anterior (29B) y cerebro posterior (29A) de ratón. La hibridación in si tu se realiza en cortes coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 3SS de CLZ_3 utilizando los métodos descritos en los ejemplos 10 anteriores. Las figuras 29A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_3 , que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_3 en un corte coronal a través de 15 los hemisferios a nivel del hipocampo (29A) y un corte transversal a través mesencéfalo cerebro medio (29B) en cerebro de ratón. Como se muestra en las figuras 29A y B, el ARNm para CLZ_3 se expresa en la corteza, tálamo, hipocampo, cuerpo estriado y núcleos amigdalinos. 20 • - EJEMPLO 14 Caracterización de CLZ 34 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. El mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina se utiliza para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-A-T-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 103) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción por PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_34 es regulado por activación mediante el tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestra que CLZ_34 es una ARNm para el receptor de N-metil-D-aspartato de la subunidad NMDARl-2a. En una caracterización adicional de CLZ_34, se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc .,.aa- tf&- - antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_34 para mostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_34 en el cerebro anterior (30B) y cerebro posterior (30A) de ratón. La hibridación in situ se realiza en cortes 5 coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 35S de CLZ_34 utilizando los métodos descritos en los ejemplos • anteriores . Las figuras 30A-B son un análisis de hibridación 10 in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_34, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_34 en un corte coronal a través de los hemisferios a nivel del hipocampo (30A) y un corte transversal a través del mesencéfalo medio (30B) en cerebro 15 de ratón. Como se muestra en las figuras 30A y B, el ARNm para CLZ_34 se expresa de manera ubicua.

EJEMPLO 15 20 Caracterización de CLZ_43 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. El mismo paradigma experimental utilizado en el ejemplo 1 para el tratamiento 25 con clozapina se utiliza para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G- T-A-T-C-G-G-C-T-A-A; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 104) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína 5 (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan 10 (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_43 es regulado por activación mediante el tratamiento con clozapina. Las tablas • 2 y 3 muestran que CLZ_43 coincide con EST aislado de tejido 15 de ratón que coincide con el miembro de la familia de proteína de unión de oxisterol . En una caracterización adicional de CLZ_43, se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_43 para mostrar el patrón de 20 expresión de ARNm para CLZ_43 en cerebro anterior (31C) • mesencéfalo medio (31A) y cerebro posterior (31B) de ratón. La hibridación in si tu se realiza en cortes coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 35S uí Uj^&*ALL. -m^k??J ¿k,.'.¿s^¡i?u?i? . -*?juu??stt *ut?L . de CLZ_43 utilizando los métodos descritos en los ejemplos anteriores . La figura 31A-C es un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_43, que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_43 en cortes coronales de los hemisferios que se muestran en la corteza, y el marcado antisentido en el cuerpo estriado (31A-C) en cerebro de ratón. La comparación con los cortes de cerebro que se obtienen de ratones testigo muestra que la expresión de CLZ_43 aumenta aproximadamente 10 veces por el tratamiento crónico (2 semanas) con clozapina. Después de la clonación de los ratones DST CLZ_43, se realiza un análisis BLAST. Se identifica una homología humana como una entrada de GenBank de 5556 pb (AB040884, también conocida como KIAA1451) . Se elige un oligonucleótido de esta secuencia y se utiliza para aislar el extremo 5' remanente del gen humano a partir de una biblioteca de plásmido de ADNc de cerebro humano adulto. Utilizando el método descrito en lo siguiente, se aisla un clon de ADNc de 1717 pb (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 103) que se superpone a la secuencia humana. Este clon proporciona 512 pb adicionales (novedosos) en el extremo 51 de la entrada de GenBank. El análisis de secuencia sugiere que la posición del codón de inicio metionina para el marco de lectura - abierta está en la base 562 del clon de 1717 pb (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 108) . El marco de lectura abierta para el clon de 1717 pb codifica para un péptido de 385 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 108, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 109) . Se utilizan los siguientes métodos para aislar el clon de ADNc de 1717 pb El acumulado objetivo es una biblioteca de plásmido de ADNc generada a partir de ARN de cerebro humano adulto. La secuencia oligonucleotídica utilizada para hibridación es 5' AAC AAG TCC GTC CTG GCA TGG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 88). El clon se aisla utilizando los métodos prescritos por el fabricante del equipo GeneTrapper (Life Technologies, Inc.). La captura de oligonucleótidos se prepara mediante marcado de los extremos de oligonucleótido con biotina- 14 -dCTP utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal. El acumulado de plásmido de ANDc se convierte de ADNc de cadena doble a ADNc de cadena sencilla mediante la acción específica de la proteína Genell y exonucleasa III. El acumulado de ADNc de cadena sencilla se combina con el oligonucleótido marcado en el extremo y se permite que se produzca la hibridación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción después se mezcla con esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Los plásmidos de ADNc de cadena sencilla que hibridizan con el oligonucleótido se purifican utilizando un imán para retener las esferas magnéticas en el tubo de reacción mientras que la totalidad de los componentes no unidos se eliminan por lavado. El ADN plasmídico de cadena sencilla se libera del oligonucleótido y se repara nuevamente en el plásmido de cadena doble utilizando una muestra fresca del oligonucleótido de captura y ADN polimerasa. Los plásmidos reparados se transforman en bacterias y se siembran en placa, sobre placas de agar. Al día siguiente, se toman individualmente colonias bacterianas y se hacen crecer durante la noche. El ADN plásmido se prepara a partir de estas minipreparaciones y se someten a análisis de secuencia. Las coincidencias de homología con una base de datos de genoma humano han identificado 7 exones dispersados a través de más de 22,000 pb. Además, se ha determinado que CLZ_43 mapea al cromosoma 12, el cual no es un cromosoma previamente relacionado con esquizofrenia. Los datos de secuencia muestran que el marco de lectura abierta codifica para una proteína de 472 aminoácidos (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 110) . La comparación con bases de datos de proteínas indican que la proteína es novedosa y que es un miembro de una clase de proteínas que une lípidos, especialmente oxisteroles. La observación de que, de miles de proteínas expresadas por el cuerpo estriado, apoD y la proteína de unión a oxisterol novedosa están entre las pocas moduladas por medicamentos neurolépticos refuerza la hipótesis de que ^Baia- la esquizofrenia es una enfermedad de homeostasis de esterol en el cerebro y por lo tanto puede tener etiologías tan diversas como la aterosclerosis. El cerebro tiene mucho más colesterol y 24S-hidroxiesterol que cualquier otro órgano en comparación con las glándulas suprarrenales, y la importancia especial de las actividades de membrana de neuronas y sus células mielinizantes es evidente por sí misma. La bicapa lipídica de la membrana está constituida de glicerolfosfolípidos y colesterol, y las variaciones en la composición y en el estado de saturación de la cadena de hidrocarburos determina el orden de membrana y la fluidez. Estas propiedades alteran la unión de proteínas extrínsecas de membrana y por lo tanto la señalización del segundo mensajero. Como hemos demostrado previamente, un porcentaje grande del ARNm está altamente enriquecido en las proteínas que codifican para el cuerpo estriado y que regulan la señalización del segundo mensajero a lo largo de la membrana interna. Por lo tanto, una disrupción pan neural o pan orgánica del metabolismo de los lípidos puede manifestarse primero como una enfermedad del cuerpo estriado. Como hasta ahora este es un concepto muy impresionante. Al examinar la naturaleza de los efectos de los medicamentos neurolépticos en las propiedades de la membrana puede hacer que este tema sea muy importante .

EJEMPLO 16 - Caracterización de CLZ_44 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo modelo experimental que se utilizó en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G- T-A-T-C-G-G-A-C-G-G; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 105) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados del análisis por TOGA indican que CLZ_44 es regulado por activación por tratamiento con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestran que CLZ_44 coincide con los EST aislados de tejido de ratón. En una caracterización adicional de CLZ_44, el análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_44 se realiza para mostrar el patrón de expresión de ARNm para -. ^tA- iata-t,.

- CLZ_44 en el cerebro anterior (32A) y cerebro posterior (32B) de ratón. Se lleva a cabo una hibridación in si tu en cortes coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 35S de CLZ_44 utilizando los métodos descritos en los ejemplos anteriores . Las figuras 32A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_44 que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_44 en un corte coronal que muestra el marcado en el hipocampo, hipotálamo, corteza temporal (32A) y sección coronal que muestra marcado cortical (32B) en cerebro de ratón.

EJEMPLO 17 Caracterización de CLZ 64 Se alojan ratones macho C57B1/6J (20-28 g) como se describe previamente en el ejemplo 1. Se utiliza el mismo paradigma experimental que se utilizó en el ejemplo 1 para el tratamiento con clozapina, para el análisis por TOGA. Los datos de TOGA se generan con un cebador 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-C-A-T; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 106) pareado con el cebador 3' "universal" (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en la parte 5' terminal. Los productos de reacción de PCR se separan por electroforesis en gel, en geles de acrilamida 4.5% y los datos de fluorescencia se adquieren en secuenciadores automatizados ABI377. Los datos se analizan utilizando los elementos de programación GeneScan (Perkin-Elmer) . Como se muestra en la tabla 1, los resultados de análisis TOGA indican que CLZ_64 es regulado por activación por tratamiento crónico con clozapina. Las tablas 2 y 3 muestra que CLZ_64 coincide con EST aislados de tejido de ratón y comparte homología con el ARNm para enoil-CoA hidratasa mitocondrial. En una caracterización adicional de CLZ_64, se realiza un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3' de CLZ_64, para mostrar el patrón de expresión de ARNm para CLZ_64 en cerebro anterior (33B) y mesencéfalo (33A) de ratón. La hibridación in si tu se realiza en secciones coronales de flotación libre (espesor de 25 µM) con una sonda de ARNc antisentido de cadena sencilla marcada con 3SS de CLZ_64 utilizando los métodos descritos en los ejemplos anteriores .

- Las figuras 33A-B son un análisis de hibridación in si tu utilizando una sonda de ARNc antisentido dirigida contra el extremo 3 ' de CLZ_64 que muestra el patrón de expresión de ARNm para CLZ_64 en diferentes cortes coronales de los hemisferios en cerebro de ratón. Como se muestra en las figuras 33A y B, el ARNm para CLZ_64 se expresa de manera ubicua .

• • - LISTA DE SECUENCIAS <110> Thomas , Elizabeth A Sutcliffe, J. Gregor Pribyl , Thomas M Hilbush, Brian S Hasel, Karl W <120> ^e9ulación de la Expresión del Gen por Agentes Neurolépticos <130> 99-022-B <140> <141> 2000-10-26 <150> 60/161,379 <151> 1999-10-26 <150> 60/186,918 <151> 2000-03-03 <160> 110 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 cggagtacag tgactttgag tttcagctat taaaatactt cttcatacga aaaa 54 <210> 2 <211> 150 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 cggcacccta ctggatcctg gccaccgatt atgaaaacta tgccctcgtg tactcctgca 60 ccaccttctt ctggctcttc catgtggatt ttgtttggat tcttggaaga aatccttatc 120 tccctccaga aacaataacc tacctaaaaa 150 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 cggcatccag ctggatgtca gagccaataa agatacatgc actaaaaa 48 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Mus musculus í¡iíÁ*?ií?*'-Á,.ii¿i?i -?. ... u a^.t.?i.,i.- <400> 4 cggccagagt ctgattaggg ctttgctctt aa*gcaaaact gtttacaggg aaaaa 55 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cggccgtggc ggacaacgag aaattggaca accaacggct caagaatttt aagaacaaag 60 gccgtgactt ggagactatg agaagacaac gaaatgaagt tgtagttgaa ttaaggaaaa 120 a 121 <210> 6 <211> 166 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 cggcggtggc catcagactc tgagacagag agccaatctc acattcaagt gttcaccaac 60 cactgacgtg tttttatttc cttctatatg attttaagat gtgttttctg cattctgtat 120 agaaacatat caaactaaat aaaagcagtg tctttattac caaaaa 166 <210> 7 <211> 343 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 cggggcaagg agcaccagaa gaacagcagc caacggccag gagcgggcac catggttctg 60 ctgcagcggg agctggctca ggaagacagc ctcaacaagc tggctctcca gtatggctgc 120 aaacactcag agtgattaac agtggcaaag taagttggaa agcgtttctg gaatcgctct 180 tttctcccgc attgaaacag tctgtttccc gctgttgact ccatgctata tacatgctat 240 atacatgctg tatacatgct atatacatgc tatatagtac atgctataat catgctatat 300 actggcagaa gctttcacca agcttgcatc agctacacaa aaa 343 <210> 8 <211> 138 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 cggtactccg ctctgatcat cggcatggca tacggcgcca agcgctacac tcaagatgac 60 agcattctca agtgaggcgt cagcgagctt gcttttctct agtcgttgag aacgaataaa 120 gcttcattgt gagaaaaa 138 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 cggtattcag tggtgatgcc taaaggaatg tcagaaaaa 39 <210> 10 <211> 45 láaáiL jÍé?..&J&á. i. --- -»A».*.A, ^.^. ^¡t... - - - <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 cggtccctgc cgctcaataa acatgaactg aacaaacaac aaaaa 45 <210> 11 <211> 56 <212> DNA 5 c <213> Mus musculus <400> 11 cggtgcattt gttcaggtaa aatctgtgca ataaaataac aaactgtctc caaaaa 56 210> 12 <211> 212 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 cggttgtggt tcagtggcaa ggcggttcag cacgtatcca acgtagatga gaccctaggt 60 tcagtctcca tccagcactg ggggctgggt gggatgtgac ttagtctgta tgttgggaac 120 aggaaaaaac tccataaggt gagcaaaaca gtattgtttt caattgaaat ggttggttgg 180 ttggttgttt tgcttgtcta aagccgcaaa aa 212 <210> 13 <211> 1156 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 ttcggcagag gctcaatcgc caataaatgc atttccctgt taaatgaatg gctaattagg 60 tttattt ta ccggtttggt gttgggccat tgattttggt ctcactaact agagtctcca 120 cttccctaca aattaggtag tttaaaaaat aaccttccag gcctccgagg ttaatttata 180 ttttaatgag tattaatagt cttcatgtct tcaagcattt tcgctagagc atgtaaagta 240 aaacacatcc aatttttctt gtcttgacat acacgtggag atgttaacga aaagagattc 300 tgtatatttt acctactttt ctcccagcca cttgttcagg ttaatgagag atttttgagg 360 tactaattgc tttttataga caaacctttt aactttgtat atataaaata tacacgtact 420 cttggtgttc ttttacaaaa gctattaagt aggtgtaact aatactatga agtagttttt 480 ttaaactagc ttttaaaagg taaggccttt tcagtgtgga tgcagcatgg tgagtgatga 540 ttgtggatgc agttaacttt gaaaatttgg gtccctgtac ctttgtgaca ggttgtttta 600 aaatagagac taatatttca acttaatttc aaatgtattc tgaaaaactt attatattag 660 aaagtatgtn taaattcatt tttaaaatgg gggggtggga gatgccccat ggactaagca 720 ttttttgcct ttgcggagaa cctaagttcg gttccaccat ccacatcagg tagctaaaaa 780 ccaccagacc ctcggggctc cacagaccca cacatacatg taattaaaag tgaaatgtga 840 ctgaaaactt gctaggaagt ttctttggat caaatagtct ttgaaatgta taggcttcca 900 gtttaacatg gtatgccctc ttttgggtac cctttaagga atagaagccg gttgtggttc 960 agtggcaagt cggttcagca cgtatccaac gtagatgaga ccctaggttc agtctccatc 1020 cagcactggg ggctgggtgg gatgtgactt agtctgtttg ttgggaacag gaaaaaactc 1080 cataaggtga gcaaaacagt attgttttca attgaaatgg ttggttggtt ggttgttttg 1140 cttgtctaaa gccact 1156 <210> 14 <211> 118 <212> DNA . <^-.^i .?.^.^L^ . ^Ét&i - - <213> Mus musculus <400> 14 cggcacttgg gaggcagaga caggtggatg tctgagttta gagccagcct ggtctacaga 60 gtgaattcca gtctaggaag gtctacatag agaaatcctg tctcaaacaa aacaaaaa 118 <210> 15 <211> 122 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 cggctagcag cagaaacgtc tcagggacag cacatgggca cagacgagtt ggacgggctg 60 ctctgcgggg agaccaacgg caaagacaca gagagttctg ggtgctgggg caagaagaaa 120 aa 122 <210> 16 <211> 240 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 cgggctagaa cgccagccag aagaagcgct cgatctcggt ctagaacgcc agccaggaga 60 gggaggtcac gatccagaac accagcacga cgacgatctc gaagtagaag tcttgtgaga 120 cgtggaagat ctcactctag aacaccacaa agaagaggac gatctggctc atcctcagag 180 aggaagaaca aatctagaac atctcagagg agaagcagat ccaactcaag cccagaaaaa 240 <210> 17 <211> 220 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 cggtacgatg ctgtgacaat taagattgat cctgaattgg agaaaaaatt gaaagtgaat 60 aaaataactt tagagtcaga gtatgagagg ctgttatgtt tattgtgcag acaatgataa 120 tccaccagag aagtattgcc acaagcaagc cgtccaagta caatcacaga cagcgactct 180 acacaaggaa cagagaatga agtcagaggg cacacaaaaa 220 <210> 18 <211> 319 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 cggtcatcgc agctgtcaat ggttatgctc ttggtggggg ttgtgaactt gccatgatgt 60 gtgatatcat ctatgctggc gagaaagccc agttcggaca gccagaaatc ctcctgggga 120 ccatcccagg tgctggaggc actcagagac tcacccgagc agtcggcaaa tcgctagcaa 180 tggagatggt cctcactggt gaccgcatct cagctcagga tgcaaagcag gcaggtcttg 240 taagcaagat ttttcctgtt gaaaaactgg ttgaagaagc catccaatgt gcagaaaaa 319 <210> 19 <211> 279 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 - 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- <400> 38 gatcgaatcc ggtgcatttg ttcaggtaaa 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_40 <400> 39 gatcgaatcc ggttgtggtt cagtggcaag 30 <210> 40 <211> 30 ^ <212> DNA <2i3> secuencia Artificial <220> — 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_6 <400> 40 gatcgaatcc ggcacttggg aggcagagac 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_16 <400> 41 gatcgaatcc ggctagcagc agaaacgtct 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 20 <220> _ <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_22 <400> 42 gatcgaatcc gggctagaac gccagccaga 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA _ <213> secuencia Artificial 25 - - <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_32 <400> 43 gatcgaatcc ggtacgatgc tgtgacaatt 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Árt if icial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_36 <400> 44 gatcgaatcc ggtcatcgca gctgtcaatg 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> - <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_42 <400> 45 gatcgaatcc ggtgacagac agaagaggat 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA _ <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_17 <400> 46 gatcgaatcc ggctcagcac ttggcagctg 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_26 <400> 47 gatcgaatcc ggggctggag taggtggcgg 30 <210> 48 - - <211> 30 <212> DNA <213> secuencia Artificial <220> — <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_28 <400> 48 gatcgaatcc ggggtaggga cacccctgta 30 <210> 49 <211> 155 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 49 cggctcagca cttggcagct gtcccgtgcg gggactcagt ccaactctgt gtttgctttt 60 cttcttggcc aaagcatgtg ccactaagct gtcctggagg acattgtctt tatgaaacac 120 acctggaata aaaccacttc ttacatgtcc aaaaa 155 <210> 50 <211> 80 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 50 cggggctgga gtaggtggcg gaaggacatg gacactgtct atctctgctc tgttgtaata 60 aatgtgagat cttggaaaaa 80 <210> 51 <211> 206 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 51 cggggtaggg acacccctgt atcatagtgg aggttggagc tggcaaatgg gaagagcttc 60 taataatcac tttgggctgg gaaccttatt tattggtagt gttaggtcag agggcag ak 120 gcggagacaa ggttgtggca cctgctgatg cagctcctct ttattttgct ttttacttgg 180 gaaataaatg gatttagcca taaaaa 206 <210> 52 <211> 206 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 cgggatccca cgagggccac cagcccaggg gctcctgccc acccgccctt gggactaaaa 60 ttcggctttg taggagcggg tttggggaag tctggataga gactggacaa aggagtgtgg 120 ccacagtgag aagtggatag cgccacagct gcggcgatgg actcgttcat aggaataaaa 180 tcttgctaac agcaaatgag caaaaa 206 <210> 53 <211> 537 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 cagtttccct gcacctctgg ctctcaccag catcctctca gctgttctgt gccaaatacg 60 tctgcaccca tgggttcagc acaggggccc ctcacctcgg tgactaagct tcgcccacct 120 tgttacgatg tcttatatat atacacactg ctatttacag acctggcctt ggatcctgtg 180 accctctggg aagagtc tg ccaaagtcca ggacagcatt ggggctaagg cagaggcttt 240 tctctagagg cttgggccct gtcccaacgt ggactttggg gctaggaacc tgggcttctc 300 tctgtgaatg taaggacagc tactcagaga gccttgatgg gggcctctcc ccatttcctg 360 tggtcagacc cggctcagca cttggcagct gtcccgtgcg gggactcagt ccaactctgt 420 gtttgctttt cttcttggcc aaagcatgtg ccactaagct gtcctggagg acattgtctt 480 tatgaaacac acctggaata aaaccacttc ttacatgtcc aaaapaaaaa aaaaaaa 537 <210> 54 <211> 2833 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 agctggtgtc cggcggggcc gtggctgctc ctccacgcgt agccccgcac ctgctgcccc 60 agtccagccc ggagctccgc ggccatgcgg ctggcgctgc tctgggctct gggactcctg 120 ggcgcgggca gccctcggcc ctccccgccg ctgccaaata taggaggcac tgaggaagag 180 cagcaagcca gcccagagag gacgctgagt ggatccatgg agagccgggt tgttcaggac 240 agccccccaa tgagcctagc agacgtgctt cagactggtt tacctgaggc cctgaggatt 300 tccttggagc tggacagtga gagtcatgtc ctggagcttc tacaaaatag agatctaatc 360 cctggccgcc caactctggt gtggtaccag cctgatggca cccgaatggt cagcgagggc 420 tacagtctag aaaactgctg ctaccgagga cgagtgcagg gccaccccag ctcctgggtg 480 tccctctgtg cctgctctgg gatcaggggg ctcattgtcc tgtccccaga gagaggctat 540 acactggagc tgggccctgg ggaccttcag cgtcctgtca tttctcggat ccaagaccac 600 ctgttgctgg gccacacctg tgccccaagc tggcatgcct ctgtgcccac tcgggcagga 660 ccagacctcc ttctggaaca gcatcacgct cacaggctta agcgagatgt agtaacagag 720 acgaaaattg tggagttggt gattgtggct gataattcag aggtcagaaa gtaccctgac 780 ttccaacaac tgctgaaccg gacactagaa gcggctctct tgctagacac gttcttccag 840 cccttgaatg tccgggtagc ccttgtgggc ctagaggcat ggacccagca caacctgata 900 gaaatgagct ccaacccagc tgtcctgcta gacaacttcc tccgctggcg ccggacagac 960 ttgctgcctc gactgcccca tgacagtgcc caactggtga ctgtaacttc cttctctggt 1020 cccatggtgg gcatggccat tcagaattcc atctgttccc ctgacttctc cggaggtgtg 1080 aatatggacc actccacaag catcttaggc gttgcctcct cgattgccca tgaattgggc 1140 cacagtctgg gtttggacca tgattctccc gggcacagct gtccctgtcc aggtccagcc 1200 ccggctaaga gctgcatcat ggaggcctcc acagacttcc taccaggttt gaacttcagc 1260 aactgcagcc gacaggccct ggaaaaggcc ctcctggaag gaatgggcag ctgcctcttc 1320 gaacggcaac ccagcctggc ccctatgtcc tctttgtgtg gaaatatgtt tgtggacccc 1380 ggagagcagt gtgactgtgg cttcccagat gaatgcactg atccctgctg tgaccatttc 1440 acctgccagc tgaggccagg agcgcagtgt gcatctgatg gaccctgttg tcaaaactgc 1500 aagttgcacc cagctggttg gctgtgccgc cctcccacag acgattgtga tctgcctgag 1560 ttctgcccag gagatagctc tcagtgcccg tctgacatca gacttgggga cggtgagcct 1620 tgtgctagtg gagaggctgt gtgtatgcat gggcgctgtg cctcctatgc ccggcagtgc 1680 cagtcacttt ggggacccgg ggcccagcct gctgcgccac tttgcctcca aacagccaac 1740 actcggggta atgcctttgg gagctgtggg cgcagccctg gtggtagcta catgccttgt 1800 gcccctagag atgtcatgtg tgggcaactg cagtgccagt ggggtaggag ccagcctctg 1860 ttgggctcag tccaagatcg gctctcggag gtcctggaag ccaacgggac acagttaaac 1920 tgcagctggg tggacctgga cctgggcaat gatgtggccc agcctcttct ggctctgcct 1980 ggcactgcct gtggtcctgg cctggtgtgc atcggccacc gatgccagcc cgtggatctc 2040 ctgggagcac aggaatgtcg aagaaaatgc cacggccatg gggtctgtga cagcagcggg 2100 cactgccgct gtgaagaggg ctgggcacct ccagactgca tgacccagct caaagcaacc 2160 • - 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<213> Mus musculus <400> 70 cggtcatcgc agctgtcaat ggttatgctc ttggtggggg ttgtgaactt gccatgatgt 60 gtgatatcat ctatgctggc gagaaagccc agttcggaca gccagaaatc ctcctgggga 120 ccatcccagg tgctggaggc actcagagac tcacccgagc agtcg?caaa tcgctagcaa 180 tggagatggt cctcactggt gaccacatct cagctcagga tgcaaagcag gcaggtcttg 240 taagcaagat ttttcctgtt gaaaaactgg ttgaagaagc catccaatgt gcagaaaaaa 300 ttgccagcaa ttctaaagtc gtagtagcca tggcg 335 <210> 71 <211> 240 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 71 cggtatgtgg gtagagtggt ccattcgttt gatggcacga aggaagcagc agctgctttg 60 gttgacttgg gcctttatat aggatttaat ggttgctctc tgaaaactga agctaacttg 120 gaagttctga agtcaatacc tagtgaaaaa ctaatgattg agacagatgc accttggtgt 180 ggagttaaaa gtacacatgc tggatcaaaa tacataaacc cttgggtttc cctccaaaaa 240 <210> 72 <211> 107 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 72 cggtatccac agtaaaattg tgagtagctt aatctgttta tctccattac aattcctctg 60 caactatttt ccttgatgtt gtaataaaaa ggaggtagga tgaaaaa 107 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_18 <400> 73 gatcgaatcc ggctgcaggt gagggctggt 30 <210> 74 <211> 30 <212> QÜA <2i3> Secuencia Artificial <220> _ <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_43 <400> 74 kl?^i **^*.*^. gatcgaatcc ggctaatatt gataatcttt 30 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <2i3> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_44 <400> 75 gatcgaatcc ggacggtgta ccccgaggat 30 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_47 <400> 76 gatcgaatcc ggaatactga ggaggaagga 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA • <2i3> Secuencia Artificial 15 <220> _ _ <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_ 8 <400> 77 gatcgaatccg gccggcatg aaataaaaca 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial 20 <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: • cebador TOGA extendido para clon CLZ_49 <400> 78 gatcgaatcc ggctgacaac agactttaat 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA 25 iillllilíj ¿ I latlilii lli ifÜlllll -u^^t? ?*?^^u. .****?*^ ^í ^M i*? UA - - <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_50 <400> 79 gatcgaatcc ggccgtggtg gcgcacacca 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_51 <400> 80 gatcgaatcc ggcatgggtg gtcttcatcc 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_52 <400> 81 gatcgaatcc ggcagaccta gctcagcttg 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> secuencia Artificial <220> — <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_56 <400> 82 gatcgaatcc gggccccatc aatttcacca 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_57 k?.??**M*Aí**.*a* kí,*?^^ d L- . * .. £. ... , -... :..!. ... t — - ....... ^S*^át .. - - <400> 83 gatcgaatcc gggcgccatc aatttcacca 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> _ <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_60 <400> 84 gatcgaatcc ggggctcaaa gacaagggtt 85 <210> 85 <211> 30 <212> DNA 10 <2i3> Secuencia Artificial <220> — <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_62 <400> 84 gatcgaatcc ggtatgtggg tagagtggtc 30 • <210> 86 <211> 30 15 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ_64 <400> 86 gatcgaatcc ggtcatcgca gctgtcaatg 30 <210> 87 20 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial • <220> <223>DescripCi5n de Secuencia Artificial: cebador TOGA extendido para clon CLZ_65 <400> 87 gatcgaatcc ggtatccaca gtaaaattgt 30 25 - - <210> 88 <211> 21 <212> DNA <2i3> secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda para análisis de biblioteca de cerebro humano <400> 88 aacaagtccg tcctggcatg g 21 <210> 89 <211> 59 <212> DNA _ <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador adaptador 5' para secuenciado directo <400> 89 tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggct catatgaatt agctgaccga cggtatcgg 59 <210> 90 <211> 46 <212> DNA <2i3> secuencia Artificial <223> Descripción de~~Secuencia Artificial: cebador de secuenciado 3 • para secuenciado directo <400> 90 cagcggataa caatttcaca cagggagctc caccgcggtg gcggcc 46 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador de secuenciado 5 ' para secuenciado directo <400> 91 cccagtcacg acgttgtaaa aeg 23 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial - - <223> Descripción de Secuencia Artificial:"" cebador de secuenciado 3 ' para secuenciado directo <400> 92 tttttttttt ttttttttv 19 <210> 93 <211> 35 <212> JOHK <2i3> secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador adaptador 3 ' para secuenciado directo <400> 93 ggtggcggcc scaggaattt tttttttttt ttttt 35 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia Artificial < <222203>> D _escri . pci . ó -n d -,e S „ecuenci • a A *-r 1t.i - ^fi. ci • al -, : cebador PCR 5 ' con bases de análisis A-G-T-A <400> 94 cgacggtatc ggagta <210> 95 <211> 30 <212> DNA <2i3> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador TOGA extendido para clon CLZ 58 <400> 95 ~ gatcgaatcc gggatcccac gagggccacc 30 <210> 96 <211> 16 <212> DNA _ <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador PCR 5 para CLZ_44 con bases de análisis A-C-G-G <400> 96 cgacggtatc ggacgg 16 - <210> 97 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador PCR 5 para CLZ_38 con bases de análisis T-G-C-A <400> 97 cgacggtatc ggtgca 16 <210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5 para CLZ_16 con bases de análisis C-T-A-G <400> 98 cgacggtatc ggctag 16 <210> 99 <211> 16 <212> DNA_ <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_17 con bases de análisis C-T-C-A <400> 99 cgacggtatc ggctca 16 <210> 100 <211> 16 <212> JßNA_ <2i3> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_24 con bases de análisis G-G-C-A <400> 100 cgacggtatc ggggca 16 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> secuencia Artificial - - <220> _ <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_26 con bases de análisis G-G-C-T <400> 101 cgacggtatc ggggct 16 <210> 102 <211> 16 <212> DNA <213> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_28 con bases de análisis G-G-T-A <400> 102 cgacggtatc ggggta 16 <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_34 con bases de análisis T-A-T-T <400> 103 cgacggtatc ggtatt 16 <210> 104 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' 'para CLZ_43 con bases de análisis C-T-A-A <400> 104 cgacggtatc ggctaa 16 <210> 105 <211> 16 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador PCR 5' para CLZ_44 con bases de análisis A-C-G-G <400> 105 - - cgacggtatc ggacgg 16 <210> 106 <211> 16 <212> DNA._ <213> Secuencia Artif icial <220> - <223> Descripción de Secuencia Artificial : cebador PCR 5 1 para CLZ_64 con bases de análisis T-C-A-T <400> 106 cgacggtatc ggtcat 16 <210> 107 <211> 1717 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 gatattttaa aaattgcata catatgaaat atattgggat ttacaaacaa ctaaacacat 60 atactcacat aaataccaat atattctatt aaatttaaag tttacatttt cttcaagctt 120 gattttgaag taggatattg cttgatgtca ttgccaggtg caaagttgca aggaaacgtg 180 agtttataac tttgttattg ccagtgcatc atagaagtaa atgtagtata aaataatagg 240 ctataatatt tttgtagtgg atctcttgta tatattgttc actttgatgt ctttttcagc 300 tacecttttt tacctaagtt ttatagctat agattttatt attatttttt gtttccacat 360 ttaaagaatg cttggagtag tcctgagaag agtteatatt ttcaacatta gctggcttgt 420 ttacatatct gtctgaaata aatataatgt tttggtaatt ttcattaatt gataaaggca 480 ggtgaggctt ctcaaacaga aactgtatct gaagaaaaca aaageettat ctggacacta 540 ttgaaacaag tccgtcctgg catggaccta tccaaggtgg ttctgcctac atttattttg 600 gaaccccgtt ctttcctgga taaactttca gattactact ateatgeaga tttcctatct 660 gaggcagctc ttgaagaaaa tccttatttc cgtttgaaga aagtagtgaa atggtatttg 720 tcaggattct ataaaaagcc aaagggactg aagaaacctt ataatectat acttggcgag 780 actttccgtt gtttatggat tcatcccaga acaaacagea aaacttttta tattgctgaa 840 caggtgtccc atcatccacc aatatctgcc ttttatgtta gtaatcgaaa agatggattt 900 tgccttagcg gtagtatcct ggctaagtct aagttttatg gaaactcatt atctgcaata 960 ttagagggag aagcacggtt aactttcttg aatagaggtg aagattatgt aatgacaatg 1020 ccatacgctc attgtaaagg aattctttat ggtacaatga cactggagct tggtggaaca 1080 gtcaatatta catgtcaaaa aactggatac agtgcaatac ttgaatttaa actaaageca 1140 ttcctaggga gtagtgactg tgttaatcaa atatcaggga aacttaaact gggaaaagaa 1200 gtcctagcta ctttggaagg tcattgggat agtgaagttt ttattactga taaaaagact 1260 gataattcag aggttttctg gaatccaaca cctgayatta agcaatggag attaataagg 1320 cacactgtaa aatttgaaga acagggagat tttgaatcag agaaactctg gcaacgggta 1380 actcgagcca taaatgccaa agaccaaact gaagctaccc aagagaagta tgttttggaa 1440 gaagctcaaa gacaagctgc cagggatcgg aaaacaaaaa atgaagagtg gtcttgcaaa 1500 ttatttgaac ttgatccact cacaggagaa tggcattaca agtttgcaga tacccgacca 1560 tgggacccac ttaatgatat gatacagttt gaaaaagatg gtgttattca gaccaaagtg 1620 aaacatcgta ctccaatggt tagcgtcccc aaaatgaaac ataagecaac caggcaacag 1680 aagaaagtag caaaaggcta ttcctcecea gaaccgg 1717 <210> 108 <211> 1717 • - <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (562) .. (1716) <400> 108 gatattttaa aaattgcata catatgaaat atattgggat ttacaaacaa ctaaacacat 60 atactcacat aaataccaat atattctatt aaatttaaag tttacatttt cttcaagctt 120 gattttgaag taggatattg cttgatgtca ttgccaggtg caaagttgea aggaaacgtg 180 agtttataac tttgttattg ccagtgcatc atagaagtaa atgtagtata aaataatagg 240 ctataatatt tttgtagtgg atctcttgta tatattgttc actttgatgt ctttttcagc 300 tacccttttt tacctaagtt ttatagctat agattttatt attatttttt gtttccacat 360 ttaaagaatg cttggagtag tcctgagaag agttcatatt ttcaacatta gctggcttgt 420 ttacatatct gtctgaaata aatataatgt tttggtaatt ttcattaatt gataaaggca 480 ggtgaggctt ctcaaacaga aactgtatct gaagaaaaca aaageettat ctggacacta 540 ttgaaacaag tccgtcctgg c atg gac cta tcc aag gtg gtt ctg cct acá 591 Met Asp Leu Ser Lys Val Val Leu Pro Thr 1 5 10 ttt att ttg gaa ecc cgt tet ttc ctg gat aaa ctt tea gat tac tac 639 Phe lie Leu Glu Pro Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr 15 20 25 tat cat gca gat ttc cta tet gag gca gct ctt gaa gaa aat cct tat 687 Tyr His Ala Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ala Leu Glu Glu Asn Pro Tyr 30 35 40 ttc cgt ttg aag aaa gta gtg aaa tgg tat ttg tea gga ttc tat aaa 735 Phe Arg Leu Lys Lys Val Val Lys Trp Tyr Leu Ser Gly Phe Tyr Lys 45 50 55 aag cea aag gga ctg aag aaa cct tat aat cct ata ctt ggc gag act 783 Lys Pro Lys Gly Leu Lys Lys Pro Tyr Asn Pro He Leu Gly Glu Thr 60 65 70 ttc cgt tgt tta tgg att cat ecc aga acá aac age aaa act ttt tat 831 Phe Arg Cys Leu Trp He His Pro Arg Thr Asn Ser Lys Thr Phe Tyr 75 80 85 90 att gct gaa cag gtg tcc cat cat cea cea ata tet gcc ttt tat gtt 879 He Ala Glu Gln Val Ser His His Pro Pro He Ser Ala Phe Tyr Val 95 100 105 agt aat cga aaa gat gga ttt tgc ctt age ggt agt ate ctg gct aag 927 Ser Asn Arg Lys Asp Gly Phe Cys Leu Ser Gly Ser He Leu Ala Lys - - 110 115 120 tet aag ttt tat gga aac tea tta tet gca ata tta gag gga gaa gca 975 Ser Lys Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Ser Ala He Leu Glu Gly Glu Ala 125 130 135 cgg tta act ttc ttg aat aga ggt gaa gat tat gta atg acá atg cea 1023 Arg Leu Thr Phe Leu Asn Arg Gly Glu Asp Tyr Val Met Thr Met Pro 140 145 150 tac gct cat tgt aaa gga att ctt tat ggt acá atg acá ctg gag ctt 1071 Tyr Ala His Cys Lys Gly He Leu Tyr Gly Thr Met Thr Leu Glu Leu 155 160 165 170 ggt gga acá gtc aat att acá tgt caá aaa act gga tac agt gca ata 1119 Gly Gly Thr Val Asn He Thr Cys Gln Lys Thr Gly Tyr Ser Ala He 175 180 185 ctt gaa ttt aaa cta aag cea ttc cta ggg agt agt gac tgt gtt aat 1167 Leu Glu Phe Lys Leu Lys Pro Phe Leu Gly Ser Ser Asp Cys Val Asn 190 195 200 caá ata tea ggg aaa ctt aaa ctg gga aaa gaa gtc cta gct act ttg 1215 Gln He Ser Gly Lys Leu Lys Leu Gly Lys Glu Val Leu Ala Thr Leu 205 210 215 gaa ggt cat tgg gat agt gaa gtt ttt att act gat aaa aag act gat 1263 Glu Gly His Trp Asp Ser Glu Val Phe He Thr Asp Lys Lys Thr Asp 220 225 230 aat tea gag gtt ttc tgg aat cea acá cct gay att aag caá tgg aga 1311 Asn Ser Glu Val Phe Trp Asn Pro Thr Pro Asp He Lys Gln Trp Arg 235 240 245 250 tta ata agg cae act gta aaa ttt gaa gaa cag gga gat ttt gaa tea 1359 Leu He Arg His Thr Val Lys Phe Glu Glu Gln Gly Asp Phe Glu Ser 255 260 265 gag aaa etc tgg caá cgg gta act cga gcc ata aat gcc aaa gac caá 1407 Glu Lys Leu Trp Gln Arg Val Thr Arg Ala He Asn Ala Lys Asp Gln 270 275 280 act gaa gct acc caá gag aag tat gtt ttg gaa gaa gct caá aga caá 1455 Thr Glu Ala Thr Gln Glu Lys Tyr Val Leu Glu Glu Ala Gln Arg Gln 285 290 295 gct gcc agg gat cgg aaa acá aaa aat gaa gag tgg tet tgc aaa tta 1503 Ala Ala Arg Asp Arg Lys Thr Lys Asn Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu . 300 305 310 ttt gaa ctt gat cea etc acá gga gaa tgg cat tac aag ttt gca gat 1551 Phe Glu Leu Asp Pro Leu Thr Gly Glu Trp His Tyr Lys Phe Ala Asp 315 320 325 330 acc cga cea tgg gac cea ctt aat gat atg ata cag ttt gaa aaa gat 1599 Thr Arg Pro Trp Asp Pro Leu Asn Asp Met He Gln Phe Glu Lys Asp 335 340 345 • - ggt gtt att cag acc aaa gtg aaa cat cgt act cea atg gtt age gtc 1647 Gly Val He Gln Thr Lys Val Lys His Arg Thr Pro Met Val Ser Val 350 355 360 ecc aaa atg aaa cat aag cea acc agg caá cag aag aaa gta gca aaa 1695 Pro Lys Met Lys His Lys Pro Thr Arg Gln Gln Lys Lys Val Ala Lys 365 370 375 ggc tat tcc tcc cea gaa ceg g 1717 Gly Tyr Ser Ser Pro Glu Pro 380 385 <210> 109 <211> 385 t* <212> PRT 10 <213> Homo sapiens <400> 109 Met Asp Leu Ser Lys Val Val Leu Pro Thr Phe He Leu Glu Pro Arg 1 5 10 15 Ser Phe Leu Asp Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Tyr His Ala Asp Phe Leu 20 25 30 15 Ser Glu Ala Ala Leu Glu Glu Asn Pro Tyr Phe Arg Leu Lys Lys Val 35 40 45 Val Lys Trp Tyr Leu Ser Gly Phe Tyr Lys Lys Pro Lys Gly Leu Lys 50 55 60 Lys Pro Tyr Asn Pro He Leu Gly Glu Thr Phe Arg Cys Leu Trp He 65 70 75 80 20 His Pro Arg Thr Asn Ser Lys Thr Phe Tyr He Ala Glu Gln Val Ser 85 90 95 His His Pro Pro He Ser Ala Phe Tyr val Ser Asn Arg Lys Asp Gly 100 105 110 Phe Cys Leu Ser Gly Ser He Leu Ala Lys Ser Lys Phe Tyr Gly Asn 115 120 125 2$ - - Ser Leu Ser Ala He Leu Glu Gly Glu Ala Arg Leu Thr Phe Leu Asn 130 135 140 Arg Gly Glu Asp Tyr Val Met Thr Met Pro Tyr Ala His Cys Lys Gly 145 150 155 160 He Leu Tyr Gly Thr Met Thr Leu Glu Leu Gly Gly Thr Val Asn He 165 170 175 Thr Cys Gln Lys Thr Gly Tyr Ser Ala He Leu Glu Phe Lys Leu Lys 180 185 190 Pro Phe Leu Gly Ser Ser Asp Cys Val Asn Gln He Ser Gly Lys Leu 195 200 205 Lys Leu Gly Lys Glu Val Leu Ala Thr Leu Glu Gly His Trp Asp Ser 210 215 220 Glu Val Phe He Thr Asp Lys Lys Thr Asp Asn Ser Glu Val Phe Trp 225 230 235 240 Asn Pro Thr Pro Asp He Lys Gln Trp Arg Leu He Arg His Thr Val 245 250 255 Lys Phe Glu Glu Gln Gly Asp Phe Glu Ser Glu Lys Leu Trp Gln Arg 260 265 270 Val Thr Arg Ala He Asn Ala Lys Asp Gln Thr Glu Ala Thr Gln Glu 275 280 285 Lys Tyr Val Leu Glu Glu Ala Gln Arg Gln Ala Ala Arg Asp Arg Lys 290 295 300 Thr Lys Asn Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Phe Glu Leu Asp Pro Leu 305 310 315 320 Thr Gly Glu Trp His Tyr Lys Phe Ala Asp Thr Arg Pro Trp Asp Pro 325 330 335 Leu Asn Asp Met He Gln Phe Glu Lys Asp Gly Val He Gln Thr Lys 340 345 350 Val Lys His Arg Thr Pro Met Val Ser Val Pro Lys Met Lys His Lys 355 360 365 Pro Thr Arg Gln Gln Lys Lys Val Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Pro Glu 370 375 380 Pro 385 <210> 110 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Met Asp Leu Ser Lys Val Val Leu Pro Thr Phe He Leu Glu Pro Arg 1 5 10 15 Ser Phe Leu Asp Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Tyr His Ala Asp Phe Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ala Leu Glu Glu Asn Pro Tyr Phe Arg Leu Lys Lys Val 35 40 45 Val Lys Trp Tyr Leu Ser Gly Phe Tyr Lys Lys Pro Lys Gly Leu Lys 50 55 60 Lys Pro Tyr Asn Pro He Leu Gly Glu Thr Phe Arg Cys Leu Trp He 65 70 75 80 His Pro Arg Thr Asn Ser Lys Thr Phe Tyr He Ala Glu Gln Val Ser 85 90 95 His His Pro Pro He Ser Ala Phe Tyr Val Ser Asn Arg Lys Asp Gly 100 105 110 Phe Cys Leu Ser Gly Ser He Leu Ala Lys Ser Lys Phe Tyr Gly Asn 115 120 125 Ser Leu Ser Ala He Leu Glu Gly Glu Ala Arg Leu Thr Phe Leu Asn 130 135 140 Arg Gly Glu Asp Tyr Val Met Thr Met Pro Tyr Ala His Cys Lys Gly 145 150 155 160 He Leu Tyr Gly Thr Met Thr Leu Glu Leu Gly Gly Thr Val Asn He 165 170 175 láUj-Ali iLi-^fcM ,^ - - Thr Cys Gln Lys Thr Gly Tyr Ser Ala He Leu Glu Phe Lys Leu Lys 180 185 190 Pro Phe Leu Gly Ser Ser Asp Cys Val Asn Gln He Ser Gly Lys Leu 195 200 205 Lys Leu Gly Lys Glu Val Leu Ala Thr Leu Glu Gly His Trp Asp Ser 210 215 220 Glu Val Phe He Thr Asp Lys Lys Thr Asp Asn Ser Glu Val Phe Trp 225 230 235 240 Asn Pro Thr Pro Asp He Lys Gln Trp Arg Leu He Arg His Thr Val 245 250 255 Lys Phe Glu Glu Gln Gly Asp Phe Glu Ser Glu Lys Leu Trp Gln Arg 260 265 270 Val Thr Arg Ala He Asn Ala Lys Asp Gln Thr Glu Ala Thr Gln Glu 275 280 285 Lys Tyr Val Leu Glu Glu Ala Gln Arg Gln Ala Ala Arg Asp Arg Lys 290 295 300 Thr Lys Asn Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Phe Glu Leu Asp Pro Leu 305 310 315 320 Thr Gly Glu Trp His Tyr Lys Phe Ala Asp Thr Arg Pro Trp Asp Pro 325 330 335 Leu Asn Asp Met He Gln Phe Glu Lys Asp Gly Val He Gln Thr Lys 340 345 350 Val Lys His Arg Thr Pro Met Val Ser Val Pro Lys Met Lys His Lys 355 360 365 Pro Thr Arg Gln Gln Lys Lys Val Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Pro Glu 370 375 380 Pro Asp He Gln Asp Ser Ser Gly Ser Glu Ala Gln Ser Val Lys Pro 385 390 395 400 Ser Thr Arg Arg Lys Lys Gly He Glu Leu Gly Asp He Gln Ser Ser 405 410 415 He Glu Ser He Lys Gln Thr Gln Glu Glu He Lys Arg Asn He Met 420 425 430 Ala Leu Arg Asn His Leu Val Ser Ser Thr Pro Ala Thr Asp Tyr Phe 435 440 445 Leu Gln Gln Lys Asp Tyr Phe He He Phe Leu Leu He Leu Leu Gln 450 455 460 Val He He Asn Phe Met Phe Lys 465 470 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 9 •

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucleótido que se elige del grupo que consiste de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62,
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66 , SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, 5 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. 2. Un polipéptido aislado, caracterizado porque 10 está codificado por un polinucleótido que se elige del grupo que consiste de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5, SECUENCIA DE 15 IDENTIFICACIÓN NO: 6, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 , SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, 20 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16, ?. SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 49, SECUENCIA DE 25 IDENTIFICACIÓN NO: 50, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 51, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 52, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 58,
-
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 60, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 62, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 63, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 64, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 65, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 71, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 72 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 107. 3. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 109. 4. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 110. 5. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucleótido por lo menos 95% idéntico a la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
6. Una molécula aislada de ácido nucleico de por lo menos diez bases de longitud, caracterizada porque es hibridizable con una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, bajo condiciones rigurosas .
7. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 2. •ittiffeHfyJ.'»**-'- *** ***+*- **** ** -
8. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para un fragmento del polipéptido de conformidad con la reivindicación 2.
9. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para un epitopo polipeptídico del polipéptido de conformidad con la reivindicación 2.
10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad biológica.
11. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para una especie homologa del polipéptido de conformidad con la reivindicación 2.
12. La molécula aislada de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia nucleotídica comprende supresiones de nucleótidos secuenciales ya sea del extremo 5 ' o del extremo 3 ' .
13. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
14. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1.
15. Un método para elaborar una célula huésped recombinante, caracterizada porque es de conformidad con la reivindicación 14. -
16. La célula huésped recombinante, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende secuencias de vector.
17. El polipéptido aislado, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende supresiones secuenciales de aminoácidos de la parte C terminal o de la parte N terminal .
18. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se une específicamente al polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2.
19. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se une específicamente al polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 3.
20. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se une específicamente al polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 4.
21. El anticuerpo aislado, de conformidad con las reivindicaciones 16, 17 ó 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
22. El anticuerpo aislado, de conformidad con las reivindicaciones 16, 17 ó 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
23. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque expresa los polipéptidos aislados, de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4.
24. Un polipéptido aislado, caracterizado porque se produce por las etapas de: (a) cultivar la célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 14 bajo condiciones de manera que se exprese el polipéptido; y (b) aislar el polipéptido.
25. Un método para evitar, tratar, modular o disminuir un trastorno médico, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4, o el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el trastorno médico es un desorden neuropsiquiátrico.
27. Un método para evitar, tratar, modular o disminuir un trastorno médico, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 18, 19 ó 20.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el trastorno médico es un desorden neuropsiquiátrico.
29. Un método de diagnóstico de un trastorno patológico o la susceptibilidad a un trastorno patológico en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ; - (b) diagnosticar un trastorno patológico o la susceptibilidad a un trastorno patológico en base en la presencia o ausencia de tal mutación.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el trastorno patológico es un desorden neuropsiquiátrico.
31. Un método para el diagnóstico de un trastorno patológico o la susceptibilidad a un trastorno patológico en un sujeto, caracterizado porque comprende detectar una alteración en la expresión de un polipéptido codificado por el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia de una alteración en la expresión del polipéptido es indicativa de un trastorno patológico o susceptibilidad al trastorno patológico.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la alteración en la expresión es un aumento en la cantidad de expresión o una disminución en la cantidad de expresión.
33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el trastorno patológico es un trastorno neuropsiquiátrico.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33 caracterizado porque el método comprende además las etapas de: obtener una primera muestra biológica de un paciente sospechoso o que tenga un trastorno neuropsiquiátrico y obtener una segunda muestra de una fuente control comparable, adecuada; - (a) determinar la cantidad de por lo menos un polipéptido codificado por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 en la primera y segunda muestra; y (b) comparar la cantidad del polipéptido en la primera y segunda muestras; en donde se diagnostica al paciente con un trastorno neuropsiquiátrico si la cantidad del polipéptido en la primera muestra es mayor que o menor que la cantidad del polipéptido en la segunda muestra.
35. El uso del polinucleótido, de conformidad con la reivindicación 1 o el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neuropsiquiátrico .
36. El uso del anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 18, 19 ó 20 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neuropsiquiátrico .
37. Un método para identificar un asociado de unión a un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4, con un asociado de unión; y (b) determinar si el asociado de unión altera la actividad del polipéptido.
38. El gen, caracterizado porque corresponde a la secuencia de ADNc del ácido nucleico aislado, de conformidad con la reivindicación 1.
39. Un método para identificar una actividad de un polipéptido expresado en un ensayo biológico, caracterizado porque el método comprende: (a) expresar el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4 en una célula; (b) aislar el polipéptido expresado; (c) probar el polipéptido expresado para determinar la actividad en un ensayo biológico; y (d) identificar la actividad del polipéptido expresado en base en los resultados de la prueba.
40. Una molécula de ADN aislada sustancialmente pura, caracterizada porque es adecuada para uso como una sonda para genes regulados por neurolépticos, que se eligen del grupo que consiste de las moléculas de ADN identificadas en la tabla 1, que tiene una secuencia nucleotídica parcial 5 ' y una longitud como se describe por sus direcciones digitales, y que tiene un patrón de regulación característico por neurolépticos.
41. Un equipo para detectar la presencia del polipéptido, de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4 en una muestra de tejido de mamífero, caracterizado porque comprende un primer anticuerpo el cual genera una inmunorreacción con una proteína de mamífero codificada por un gen que corresponde al polinucleótido de conformidad con m s^ - la reivindicación 1 o con un polipéptido codificado por el polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 2, 3 ó 4 en una cantidad suficiente para por lo menos un ensayo, y un material de empacado adecuado.
42. El equipo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo.
43. El equipo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el segundo anticuerpo está marcado.
44. El equipo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la etiqueta comprende enzimas, radionúclidos compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes o compuestos bioluminiscentes.
45. Un equipo, caracterizado porque se utiliza para detectar la presencia de genes que codifican para una proteína que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que tiene por lo menos 10 bases contiguas, en una cantidad suficiente para por lo menos un ensayo, y un material de empacado adecuado.
46. Un método para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica para una proteína en una muestra de tejido de mamífero, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) hibridizar un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que tiene já-Mu**m»-"'** ^^ - por lo menos 10 bases contiguas, con el ácido nucleico de la muestra; y (b) detectar la presencia del producto de hibridación.
47. Un método para diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de apolipoproteína D; y (b) diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en base en la presencia o ausencia de tal mutación.
48. Un método para diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) determinar la presencia o la cantidad de expresión del polipéptido apolipoproteína D en una muestra biológica; y (b) diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en base en la presencia o la cantidad de expresión del polipéptido apolipoproteína D.
49. El método de conformidad con las reivindicaciones 47 ó 48, caracterizado porque el trastorno neuropsiquiátrico es esquizofrenia. t&t*tX**L~*¡ » -
50. El método de conformidad con las reivindicaciones 47 ó 48, caracterizado porque el trastorno neuropsiquiátrico es un trastorno bipolar.
51. Un método para diagnosticar un trastorno 5 neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) determinar la presencia o ausencia de una • mutación en el polinucleótido o fragmento polinucleotídico 10 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, y (b) diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en base en la presencia o ausencia de tal mutación.
52. Un método para diagnosticar un trastorno 15 neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido que comprende una secuencia de 20 aminoácidos por lo menos 95% idéntica a un fragmento polipeptídico de una traducción de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 en una muestra biológica; y (b) diagnosticar un trastorno neuropsiquiátrico o la susceptibilidad a un trastorno neuropsiquiátrico en base 25 en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
53. El método de conformidad con las reivindicaciones 51 ó 52, caracterizado porque el trastorno neuropsiquiátrico es esquizofrenia.
54. El método de conformidad con las reivindicaciones 51 ó 52, caracterizado porque el trastorno neuropsiquiátrico es desorden bipolar.
55. El método de conformidad con las reivindicaciones 51 ó 52, caracterizado porque el trastorno neuropsiquiátrico es un comportamiento relacionado con adicción. - 5N DE LA INVENCIÓN Se proporcionan polinucleótidos, polipéptidos, equipos y métodos relacionados con genes expresados en el sistema nervioso central que son regulados por neurolépticos . . **&*, ?,?*l*tLr*,* J**^*É^*M