MXPA01013204A

MXPA01013204A - Sensor electroquimico para analisis de muestras de liquido.

Info

Publication number: MXPA01013204A
Application number: MXPA01013204A
Authority: MX
Inventors: Alan Andrew Stewart
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-06-21
Also published as: GB2351153B; GB9914238D0; EP1188046A1; CA2375302A1; GB2351153A; AR024285A1; WO2000079258A1; AU4422500A; BR0011707A; AU775172B2; US6730200B1

Abstract

Una celda electroquimica que tiene un area auxiliar que contiene una especie de redox en un electrodo de trabajo. El area auxiliar proporciona una trayectoria de corriente de baja resistencia entre el electrodo de trabajo y un electrodo seudo de referencia/contrario. El area auxiliar es una parte integral del electrodo de trabajo y permite que fluya una corriente aumentada. La corriente aumentada se agrega a la senal de medicion. Esto reduce la declinacion de corriente no monotona, que puede conducir a mediciones de analito erroneas.

Description

SENSOR ELECTROQUÍMICO PARA ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LIQUIDO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los sensores para realizar el análisis electroquímico para determinar concentraciones de analitos en mezclas de líquidos. 2. DISCUSIÓN DE LA TÉCNICA 10 Los análisis electroquímicos para determinar las concentraciones de enzimas o sus substratos en mezclas complejas de líquidos han sido desarrollados. En particular, las cintas biosensoras para aplicaciones médicas (ejemplo, todos los análisis de sangre) han sido desarrolladas para la detección de los niveles de glucosa en muestras 15 biológicas. En general, las cintas biosensoras constan de celdas electroquímicas típicas, en las cuales pueden estar trabajando electrodos, electrodos contrarios, y electrodos seudo de referencia/contrarios. La potencia del electrodo de trabajo se mantiene típicamente a un valor constante relativo a aquel del electrodo seudo de referencia/contrario. 20 Las cintas biosensoras son usadas en la industria química, por ejemplo, para analizar mezclas complejas. Estas también son usadas en la industria alimenticia y en la industria de ingeniería bioquímica. Las cintas biosensoras son útiles también en la investigación médica o en pruebas externas. En la investigación médica, estas pueden funcionar 25 como sondas invasoras (es decir, donde estas entren en contacto con un -* ¿ émm¡ ttm*ft¿,.. , t,a.it.*.fc¿^ fluido corporal, como toda la sangre o fluido subcutáneo). En una prueba externa, estas pueden funcionar de una forma no invasora (es decir, donde estas entren en contacto con lo extraído de sangre por una jeringa o un mecanismo de piquete.) Un sensor de tres electrodos típico para análisis de sangre adecuado para medir la cantidad de analito en una muestra de liquido comprende (1 ) un electrodo de trabajo o activo que se cubre con una capa que contiene una enzima y un mediador de redox, (2) un electrodo simulado o pasivo que es cubierto con una capa conteniendo un mediador de redox pero careciendo de una enzima, y (3) un electrodo seudo de referencia/contrario o electrodo contrario. Cuando una muestra de líquido que contiene una especie por la cual la enzima es activada catalíticamente contacta los electrones, el mediador de redox transfiere electrones en la reacción catalizada. Cuando un voltaje se aplica a través de los electrodos, una corriente de respuesta resulta de la reducción o de la oxidación del mediador de redox en los electrodos. La corriente de respuesta en el electrodo simulado representa una respuesta antecedente del electrodo en contacto con la muestra. La corriente de respuesta en el electrodo de trabajo se refiere a la concentración del substrato. Una corriente de respuesta correcta se calcula al substraer la corriente de respuesta en el electrodo pacifico de la corriente de respuesta en el electrodo activo. Este calculo de substracción elimina substancialmente las interferencias antecedentes, mejorando así la relación de señal a ruido en el sensor. La declinación de la corriente no monótona puede ocurrir en un ?. **. sistema cuando la resistencia entre el electrodo de trabajo y el electrodo seudo de referencia/contrario es larga. Este tipo de declinación puede complicar las mediciones de concentración de analito. 5 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En general, esta invención provee una celda electroquímica teniendo un electrodo de trabajo que tiene un área auxiliar que contiene unas especies de redox. El área auxiliar provee una trayectoria de corriente de baja resistencia entre el electrodo de trabajo y seudo 10 electrodo de referencia/contrario. El área auxiliar es una parte integral del electrodo de trabajo. El área auxiliar permite que una corriente aumentada fluya. La corriente aumentada ayuda a reducir o incluso a eliminar la declinación no monótona substancialmente de la corriente transitoria. El área auxiliar del electrodo de trabajo se localiza generalmente más cerca 15 del electrodo seudo de referencia/contrario que el área de trabajo del electrodo de trabajo. El área auxiliar del electrodo de trabajo no contribuye a una medición electroquímica del analito de interés, porque no hay un componente catalizador (ejemplo, una enzima) en el área auxiliar. Como 20 un resultado, la corriente asociada con el área auxiliar es generada desde oxidación simple, o reducción de las especies de redox y seguidas por una respuesta Cottrellian. En la configuración del electrodo de esta invención, el efecto aditivo de la corriente es significante solo durante los primeros pocos segundos de la respuesta, corrigiendo cualquier conducta no 25 monótona de la declinación de corriente.

La corriente aumentada no tiene ningún efecto durante el periodo de tiempo durante el cual las medición se hace, porque la duración del periodo es corta. En un sistema que contiene dos electrodos (ejemplo, un electrodo de trabajo y un electrodo simulado), un área auxiliar puede ser aplicada al electrodo simulado. El área auxiliar del electrodo simulado debe tener el mismo tamaño y forma que el área auxiliar del electrodo de trabajo. El área auxiliar del electrodo simulado y el área auxiliar del electrodo de trabajo son colocadas preferiblemente de manera simétrica con respecto al electrodo seudo de referencia/contrario. Esta configuración produce una respuesta idéntica en ambas áreas auxiliares. Por lo tanto, cualquier efecto en la corriente de medición se cancela sobre la substracción de la corriente de un electrodo de la corriente del otro electrodo. En un aspecto, la invención provee una celda electroquímica comprendiendo un primer electrodo, el cual se refiere como un electrodo de trabajo. El primer electrodo comprende una primer área de trabajo y una primer área auxiliar. La primer área de trabajo comprende una tinta de trabajo. La primer área auxiliar comprende una primer tinta simulada. La tinta de trabajo comprende una enzima y un primer mediador de redox. La primer tinta simulada comprende una especies de redox, pero carece de una enzima. La especie de redox de la primer tinta simulada pueden ser del mismo material que el mediador de redox en la tinta de trabajo. La celda electroquímica puede incluir un segundo electrodo, el cual se refiere como un electrodo simulado. El segundo electrodo comprende una segunda área de trabajo y una segunda área auxiliar. La segunda área de trabajo comprende una segunda tinta simulada, la cual comprende, el primer mediador de redox, pero carece de una enzima. La segunda área auxiliar comprende la primera tinta simulada. La celda electroquímica puede incluir un electrodo seudo de referencia/contrario. La primer área auxiliar es localizada preferiblemente más cerca al electrodo seudo de referencia/contrario que la primer área de trabajo. La segunda área auxiliar es situada preferiblemente más cerca al electrodo de seudo de refencia/contrario que la segunda área de trabajo. La primer área de trabajo puede ser más larga en área que la primera área auxiliar. La segunda área de trabajo puede ser más larga en área que ia segunda área auxiliar. La primer área de trabajo puede ser más pequeña en área que la segunda área de trabajo y la segunda área auxiliar en combinación. En otro aspecto, la invención provee una cinta biosensora. La cinta comprende un soporte de electrodo, un primer electrodo, es decir, un electrodo de trabajo, un segundo electrodo, es decir, un electrodo simulado, y un electrodo seudo de referencia/contrario. Cada uno de los electrodos es dispuesto sobre y soportado por el soporte de electrodo. El electrodo seudo de referencia/contrario aparte se separa del primer electrodo y el segundo electrodo. La cinta biosensora puede incluir una capa de cubierta, la cual define un espacio cerrado sobre los electrodos.

La capa de cubierta tiene un orificio para recibir una muestra para introducirla dentro del espacio cerrado. Las cinta biosensora también pueden incluir al menos una capa de malla interpuesta en el espacio cerrado entre la capa de cubierta y los electrodos.

En otro aspecto, la invención provee un método de elaboración de una celda electroquímica. El método incluye los pasos de aplicar una tinta de trabajo ai primer electrodo para formar una primer área de trabajo, y aplicar una primer tinta simulada al primer electrodo para formar una primer área auxiliar. El primer electrodo es un electrodo de trabajo. El método también puede incluir lo pasos de aplicar a una segunda tinta simulada a un segundo electrodo para formar una segunda área de trabajo, y aplicar la primer tinta simulada al segundo electrodo para formar una segunda área auxiliar. El segundo electrodo es un electrodo simulado. Bajo algunas condiciones, la declinación de corriente en el electrodo de trabajo parte del modelo esperado. En particular, se espera que en la corriente disminuirá monótonamente con el tiempo y mostrará la conducta predicha por la ecuación Cottrell. Sin embargo, cuando el electrodo simulado impone una carga de corriente significativa sobre el electrodo seudo de referencia/contrario, la corriente en el electrodo de trabajo parte de la conducta clásica y puede en realidad incrementar durante un periodo corto de tiempo. Las mediciones de glucosa con las cuales la cinta biosensora de esta invención se utilizan, tienen características electrónicas diseñados para detectar resultados de pruebas inválidos. Una de estas características electrónicas involucran monitorear la declinación de corriente en el electrodo de trabajo. Si esta declinación no es monótona, la medición reportará una condición de error y abortará la prueba. Las áreas auxiliares pueden reducir o eliminar Ai ,,-k^a. substancialmente la declinación de corriente no monótona durante los primeros segundos de una prueba cronoamperiométrica. De acuerdo con lo anterior, esto es posible para reducir o incluso eliminar la ocurrencia de errores en los sensores electroquímicos usados para analizar la glucosa en la sangre. Las áreas auxiliares sobre el electrodo simulado y sobre el electrodo de trabajo pueden ayudar a reducir errores al incrementar la corriente inicial frustrada del electrodo de trabajo y del electrodo simulado. El incremento de corriente resulta de la oxidación o reducción de las especies de redox adicionales introducidas por la tinta simulada. La corriente generada de la oxidación o reducción de la especie de redox tiene una trayectoria de baja resistencia al electrodo seudo de referencia/contrario, lo cual le permite una oxidación o reducción eficiente de la especies de redox sin gotas de voltaje substancial. Cada uno del primer mediador de redox y la especies de redox pueden ser un ferroceno. Preferiblemente, la enzima es oxidaza de glucosa. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de las descripciones de las modalidades de la misma. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 es una vista despiezada de una cinta biosensora de acuerdo con una modalidad de esta invención. Figura 2 es una vista en perspectiva de la cinta biosensora ensamblada de la Figura 1 . Figuras 3A a 3E son diagramas esquemáticos que representan las regiones de una cinta biosensora donde se colocan los electrodos.

Figura 4 es un diagrama esquemático que representa las regiones de una cinta biosensora de control donde los electrodos se colocan. Figura 5 es una gráfica que representa la corriente transitoria obtenida del electrodo de trabajo cuando las cintas biosensoras de las Figuras 3A-3E y 2 fueron expuestas a una muestra que contiene 15 mM de glucosa. Figura 6 es una gráfica que representa la corriente transitoria obtenida del electrodo simulado cuando las cintas biosensoras de las figuras 3A-3E y 2 fueron expuestas a una muestra que contiene 15 mM de glucosa. DESCRIPCIÓN DETALLADA Como se utiliza en la presente, la expresión "electrodo de trabajo" significa un electrodo donde la reacción de interés tiene lugar. La corriente es proporcional a la concentración del analito, por ejemplo, glucosa, en el electrodo de trabajo. La expresión "electrodo simulado" se refiere a un electrodo que es similar al electrodo de trabajo, pero carece de la sustancia que reacciona con el analito. La respuesta del electrodo de trabajo es la suma de las respuestas del analito, por ejemplo, glucosa, y el antecedente; la respuesta del electrodo simulado es la repuesta del antecedente. La expresión "tinta de trabajo" significa una tinta conductiva impresa sobre el electrodo de trabajo. La tinta de trabajo contiene tanto un mediador de redox como una sustancia para reaccionar con el analito, por ejemplo, oxidaza de glucosa en el caso de glucosa. Dependiendo de la naturaleza del analito, la sustancia para la reacción con el analito puede ser una enzima o un sustrato para una enzima. La expresión "tinta simulada" significa una tinta conductiva conteniendo una especie de redox, pero careciendo de una sustancia para reaccionar con el analito. La expresión "especie de redox" significa cualquier componente químico que puede oxidarse o reducirse. La expresión "mediador de redox" significa cualquier especie de redox que puede oxidar o reducir otra molécula, típicamente una enzima. Los mediadores de redox transmiten la información desde una reacción de oxidación/reducción desde una enzima hasta un electrodo. La expresión "electrodo seudo de referencia/contrario" significa un electrodo que funciona tanto como una referencia como un electrodo contrario. En sistemas electroquímicos de tres electrodos convencionales, hay tres electrodos: (1 ) un electrodo de trabajo, (2) un electrodo de referencia y (3) un electrodo contrario. La reacción que tiene lugar en el electrodo de trabajo es la reacción que se requiere monitorear y controlar. Las funciones de los electrodos de referencia y contrarios son para asegurar que el electrodo de trabajo actualmente experimenta las condiciones deseadas, es decir, el potencial de corriente. La función del electrodo de referencia es medir el potencial en la interfase de electrodo de trabajo/muestra con tanta exactitud como sea posible. En una situación ideal, no ocurre que los pases pasen a través del electrodo. La función del electrodo contrario es aplicar el potencial de corriente entre ella misma y el electrodo de trabajo, de manera que el potencial en el electrodo de trabajo es el potencial deseado. La diferencia potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia se asume ser el mismo que el potencial deseado en el electrodo de trabajo. Si el potencial medido no es el potencial deseado en el electrodo de trabajo, el potencial que se aplica entre el electrodo contrario y el electrodo de trabajo se altera de acuerdo con lo anterior, es decir el potencial ya sea se incrementa o reduce. La reacción en el electrodo contrario también es igual y opuesta a la reacción de transferencia de carga que ocurre en el electrodo de trabajo, es decir, si una oxidación ocurre en el electrodo activado entonces una reducción tendrá lugar en el electrodo contrario, permitiendo así que la muestra permanezca eléctricamente neutral. En un sistema de dos electrodos, hay dos electrodos: (1 ) un electrodo de trabajo (o en el caso de cintas biosensoras aquí descritas, dos electrodos activos, es decir, los así llamados, electrodo de trabajo y electrodo simulado) y (2) un electrodo seudo de referencia/contrario. La razón de que el segundo electrodo se llama un electrodo seudo de referencia/contrario es porque el electrodo no actúa como un electrodo de referencia ideal, pero aún continúa actuando como un electrodo contrario real. En un electrodo de referencia ideal, la corriente no pasa a través de este y esto mantiene un potencial estable; en caso de un electrodo seudo de referencia/contrario, la corriente no pasa a través del electrodo seudo de referencia/contrario, y de esta manera, el electrodo seudo de referencia/contrario no mantiene un potencial estable. En las corrientes bajas, el cambio potencial es suficientemente pequeño de manera que la respuesta en el electrodo de trabajo no es afectada significativamente, y por lo tanto el electrodo seudo de referencia/contrario se designa como el electrodo de seudo referencia. El electrodo seudo de referencia/contrario aún lleva una función de electrodo contrario; sin embargo, es este caso, el potencial que se aplica entre el electrodo seudo de referencia/contrario y el electrodo de trabajo no puede alterarse para compensar los cambios en el potencial en el electrodo de trabajo. Una cinta biosensora adecuada para esta invención, se ilustra en las Figuras 1 y 2. Refiriéndose a las Figuras 1 y 2, un soporte de electrodo 1 , preferiblemente una cinta alargada de material polimérico (por ejemplo, cloruro de polivinilo, policarbonato, poliéster o lo similar) soporta tres bandas 2 de tinta eléctricamente conductiva, comprendiendo preferiblemente carbono. Estas bandas 2 determinan las posiciones de contactos eléctricos 3, un electrodo de pseudo referencia/contrario 4, un electrodo de trabajo 5, y un electrodo simulado 5a. Los contactos eléctricos 3 se insertan en un dispositivo de medición apropiado (no mostrado). Aunque la Figura 1 ilustra un electrodo simulado 5a, este electrodo simulado 5a es opcional y no se requiere para la operación de esta invención. Cada una de las porciones alargadas de las bandas conductivas 2 pueden cubrirse con una banda 6a, 6b y 6c de material conductivo, preferiblemente hecho de una mezcla que comprende partículas de plata y partículas de cloruro de plata. El área expuesta alargada de la banda 6b cubre el electrodo seudo de referencia/contrario. Una capa de un material eléctricamente aislante, hidrofóbico 7 cubre además las bandas 6a, 6b y 6c. Las posiciones del electrodo seudo de referencia/contrario 4, el electrodo de trabajo 5, el electrodo simulado 5a, y los contactos eléctricos 3 no se cubren por la capa de material eléctricamente aislante, hidrofóbico 7. Este material eléctricamente ai . . » .i. . i.?, . aislante, hidrofóbico 7 sirve para evitar los cortocircuitos. Debido que este material aislante es hidrofóbico, puede causar que la muestra se restringa a los electrodos expuestos. Un material aislante preferido se encuentra comercialmente disponible como "POLYPLAST" (Sericol Ltd, 5 Broadstairs, Kent, RU). Las Figuras 3A a 3E ilustran seis configuraciones diferentes de las regiones de electrodo de las cintas biosensoras de esta invención. Aunque las Figuras 3A a 3E ilustran un electrodo simulado 5a, este electrodo simulado 5a es opcional y no se requiere para la operación de 10 esta invención. Una configuración de control de la región de electrodo de una cinta biosensora se ilustra en la Figura 4. Puede observarse que la configuración de control carece de áreas auxiliares, las cuales pueden ser descritas en detalle abajo. El electrodo 5 es una capa de material conductivo conteniendo 15 un área de trabajo 8 y un área de auxiliar 9. El área de trabajo 8 se forma de una tinta de trabajo, la cual se imprime sobre la capa de material conductivo del electrodo 5. La tinta de trabajo comprende una mezcla de un mediador de redox, una enzima, y un material conductivo. El electrodo 5a es una capa de material conductivo conteniendo un área de trabajo 8a y 20 un área auxiliar 9a. El área de trabajo 8a se forma de una tinta simulada, la cual se imprime sobre la capa de material conductivo del electrodo 5a . La tinta simulada comprende una mezcla de un mediador de redox y un material conductivo, pero carece de una enzima. Las áreas auxiliares 9 y 9a son impresas sobre capas conductivas de los electrodos 5 y 5a 25 respectivamente. Cada una de las áreas auxiliares 9 y 9a se forman de '--tfaáacis --- • * - una tinta simulada que comprende una mezcla de una especie de redox y un material conductivo, pero carece de una enzima. La especie de redox incluida en el área auxiliar 9 es preferiblemente la misma que aquella incluida en el área auxiliar 9a. La especie de redox usada en la tinta simulada por las áreas auxiliares puede ser la misma que el mediador de redox usado en la tinta simulada para el área de trabajo 8a. El mediador de redox en la tinta simulada para el área de trabajo 8a tiene que el mismo que el mediador de redox incluido en el área de trabajo 8 que se coloca sobre el electrodo 5 pero no necesita ser el mismo que la especie de redox usada en las áreas auxiliares 9 y 9a. Las áreas auxiliares 9 y 9a son localizadas más cerca del electrodo seudo de referencia/contrario 4 que el área de trabajo 8a o el área de trabajo 8. Las áreas auxiliares 9 y 9a son colocadas simétricamente con respecto al electrodo seudo de referencia/contrario 4. Refiriéndose a la Figura 4, el electrodo 5a es una capa de material conductivo conteniendo un área de trabajo 8a. El electrodo 5 es una capa de material conductivo conteniendo un área de trabajo 8. El área de trabajo 8 es formada de una tinta de trabajo, la cual se imprime sobre la capa de material conductivo del electrodo 5. La tinta de trabajo comprende una mezcla de un mediador de redox, una enzima, y un material conductivo. El área de trabajo 8a se forma de una tinta simulada impresa sobre la capa conductiva del electrodo 5a. La tinta simulada comprende una mezcla de un mediador de redox y un material conductivo, pero carece de una enzima. El área de trabajo 8a se localiza adyacente al electrodo seudo de referencia/contrario 4 y el electrodo de trabajo 5. La í. ^m fas?ß& cinta biosensora de control mostrada en la Figura 4 no incluye áreas auxiliares 9 y 9a. Las capas de material conductivo de los electrodos 4,5, y 5a pueden ser impresas con una tinta conteniendo carbono. Una tinta que tiene un bajo contenido de carbono típicamente tiene un contenido de carbono desde aproximadamente 30 a aproximadamente 31 por ciento en peso y un contenido de resina de desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 9 por ciento en peso. Una tinta que tiene un alto contenido de tinta de carbono típicamente tiene un contenido de carbono desde aproximadamente 42 a aproximadamente 45 por ciento en peso y un contenido de resina desde aproximadamente 7 hasta 9 por ciento en peso. Los tamaños físicos de las áreas auxiliares para las configuraciones mostradas en las Figuras 3A a 3E y Figura 4 se establecen en la Tabla 1 . Tabla 1 El área de trabajo 8 se forma de una tinta impresa que incluye una mezcla de una enzima, un mediador de redox y un material conductivo. Alternativamente, en lugar de una enzima, un área de trabajo 8 puede l .? contener un sustrato que es catalíticamente reactivo con una enzima a analizarse. El área de trabajo 8a se forma desde una tinta de impresión que incluye una mezcla de un mediador de redox y un material conductivo con una enzima. Las áreas auxiliares 9 y 9a son formadas de tintas de 5 impresión que incluyen una mezcla de una especie de redox y un material conductivo sin una enzima. Las respectivas tintas de impresión son aplicadas a los electrodos 5 y 5a como áreas discretas o longitud fija. En una modalidad preferida, el material conductivo comprende partículas de carbono teniendo el mediador de redox absorbido en las mismas. 10 Una tinta impresa comprende una suspensión acuosa del material conductivo teniendo un mediador de redox absorbida en la misma. Para el electrodo de trabajo 5, la tinta de impresión incluye también una enzima. Por ejemplo, cuando el analito a medirse es glucosa en la sangre, la enzima es preferiblemente oxidaza de glucosa, y el mediador de redox 15 es preferiblemente ferroceno o un derivado de ferroceno. En la alternativa, para el electrodo de trabajo 5, la tinta de impresión puede incluir un sustrato en vez de una enzima cuando el analito medirse es una enzima. Las tintas impresas sobre el electrodo simulado 5a carecen de una enzima o un sustrato para una enzima. 20 Las tintas impresas pueden ser impresas de pantalla. Las tintas de impresión pueden incluir además un polisacárido (por ejemplo, una goma guar o un alginato), una gelatina hidrolizada, un estabilizador de enzima (por ejemplo, glutamato o trehalosa), un polímero de formación de película (por ejemplo, un alcohol de polivinilo), un relleno conductivo (por 25 ejemplo: carbono), un agente de despumación, un regulador o una combinación de lo anterior. El electrodo seudo de referencia/contrario 4 es sustituido preferiblemente relativo al área de trabajo 8 del electrodo de trabajo 5 y al área de trabajo 8a del electrodo simulado 5a en un a manera que no está en una posición ideal para el funcionamiento eficiente electroquímico. Los electrodos 4, 5 y 5a se instalan de manera que el efecto de la resistencia de la muestra sobre la resistencia total del circuito no se minimiza, como es convencional. En su lugar, los electrodos 4, 5 y 5a se instalan de manera que la resistencia de la muestra se maximiza a la mayor extensión posible mientras se mantiene dispuesta a generar una corriente de respuesta capaz de ser detectada por el dispositivo de medición usado. Para incrementar la resistencia de la muestra, el electrodo seudo de referencia/contrario 4 es colocado preferiblemente tan lejos como sea posible del electrodo de trabajo 5. Cuando un electrodo simulado 5a es usado, el electrodo seudo de referencia/contrario 4 es colocado preferiblemente tan lejos como sea posible del electrodo de trabajo 5a. Una limitación que debe dirigirse es la resistencia máxima de la muestra que permitirá que una corriente de respuesta sea generada con el volumen mínimo aceptable de la muestra. Los electrodos no pueden separarse demasiado lejos que tanto el electrodo de trabajo 5 como el electrodo seudo de referencia/contrario 4 no puedan cubrirse por la muestra. Cuando un electrodo simulado 5a se emplea, los electrodos 4 y 5a no pueden separarse tan lejos que tanto el electrodos simulado 5a como el electrodo de seudo referencia/contrario 4 no puedan cubrirse por la muestra. Se prefiere que la longitud de la trayectoria a atravesarse por la .j et muestra (es decir, la trayectoria de muestra) se mantiene tan corta como sea posible con objeto de minimizar el volumen de la muestra requerida. La longitud máxima de la trayectoria de muestra puede ser tan grande como la longitud de la cinta biosensora. Sin embargo, el incremento correspondiente en resistencia de la muestra limita la longitud de la trayectoria de muestra a una distancia que permite que se genere la corriente de respuesta necesaria. La resistencia de la muestra también es influenciada por la distancia desde costado del área del electrodo seudo de referencia/contrario 4 al costado del área de trabajo 8 del electrodo de trabajo 5. Al reducir esta distancia por la colocación del electrodo seudo de referencia/contrario 4 aguas abajo dei electrodo de trabajo 5 aumenta la resistencia de la muestra. La colocación de los electrodos de manera contigua es convencional. La colocación de los electrodos en la manera de esta invención tiene la ventaja adicional de prevenir la finalización de un circuito (y por lo tanto prevenir la detección de una corriente de respuesta) antes de que el electrodo de trabajo 5 haya sido cubierto completamente por la muestra. Cuando un electrodo simulado 5a se usa, la colocación del electrodo simulado 5a en relación con el electrodo seudo de referencia/contrario 4 debe de sustancialmente similar a la colocación del electrodo de trabajo 5 relativo al electrodo seudo de referencia/contrario 4, es decir, aguas abajo. Una capa de malla de grado fino 10 cubre los electrodos. Esta capa de malla 10 protege a los componentes impresos de un daño físico. También ayuda a que la muestra moje el electrodo seudo de referencia/contrario 4 y el electrodo de trabajo 5 (y el electrodo simulado 5a, cuando se usa), al reducir la tensión de superficie de la muestra, permitiéndole así que se difunda uniformemente sobre los electrodos. Preferiblemente, esta capa de malla 10 se extiende sobre la longitud completa de la trayectoria de muestra, entre e incluyendo la posición en la cual la muestra se introduce y la región donde los electrodos son colocados. Preferiblemente esta capa de malla 10 se construye de ramales finamente tejidos de nylon. Alternativamente, cualquier material tejido o no tejido puede ser usado, siempre que este no ocluya la superficie del electrodo de manera que la difusión normal de la muestra se obstruye. El espesor de la malla se selecciona de manera que la profundidad de la muestra es suficientemente baja que se produce una resistencia de muestra alta. Preferiblemente, la capa de malla 10 no es mayor a 70 µm en grosor. Preferiblemente, la capa de malla 10 tiene un por ciento de área abierta de aproximadamente 40 a aproximadamente 45%, una cuenta de fibra de aproximadamente 95 a aproximadamente 1 15 por centímetro, un diámetro de fibra de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 µm, y un espesor de desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 µm. Una malla particularmente preferida es la malla NY64 HC malla disponible de Sefar (formalmente ZBF), CH-8803, Ruschlikon, Suiza. La capa de malla 10 puede revestirse con un agente tensoactivo. El revestimiento con un agente tensoactivo es necesario solo si el material de la capa de malla 10 por si mismo es hidrofóbico (por ejemplo, nylon y poliéster. Si una capa de malla hidrofílica se usa, el revestimiento con un agente tensoactivo puede ser omitido. La elección particular del agente tensoactivo no es crítica, siempre que esto permite difusión suficientemente uniforme de la muestra. Un agente tensoactivo preferido es "FC170C FLUORAD" agente tensoactivo fluoroquímico (3M, St. Paul, MN). El agente tensoactivo "FLUORAR" es una solución de un aducto de oxietileno fluorolifático, glicoles de polietileno bajo, 1 ,4-dioxano y agua. Una carga de agente tensoactivo de desde 15 hasta aproximadamente 20 µm/mg de malla se prefiere para la mayoría de las aplicaciones. La carga del agente tensoactivo preferido podría variar dependiendo del tipo de capa de malla y agente tensoactivo usado en la muestra a analizarse. La carga del agente tensoactivo preferido puede ser determinada empíricamente, al observar el flujo de la muestra a través de la capa de malla 10 con diferentes niveles de agente tensoactivo. Una segunda capa de una malla más gruesa 1 1 se aplica preferiblemente sobre la primer capa de malla. Esta segunda capa de malla controla la velocidad de flujo de la muestra a medida que pasa desde el punto de aplicación de muestra hacia las áreas del electrodo de trabajo y de referencia, al proporcionar espacios dentro de los cuales el aire desplazado dentro la trayectoria de muestra puede moverse a medida que la muestra se mueve. La muestra preferiblemente se mueve a lo largo de la capa de malla de grado fino 10 y parcialmente en la capa de malla de grado más grueso 1 1 . El espacio de las fibras más largas de la segunda capa de malla 1 1 , que se colocan perpendicularmente hacia la dirección de flujo de la muestra, ayuda a controlar la velocidad de flujo de la muestra, al presentar barreras físicas al movimiento de la muestra a medida que pasa a lo largo de la trayectoria de muestra. El patrón regular de las fibras de la malla asegura que la muestra progresa en etapas y que solamente las muestras que tienen suficiente volumen para generar una respuesta precisa son capaces de pasar a lo largo de todo el camino de la trayectoria de muestra y alcanzar el electrodo seudo de referencia/contrario 4. Preferiblemente, la capa de malla 1 1 es de una construcción tejida, de manera que presenta un patrón de repetición regular de fibras dispuestas tanto perpendiculares como paralelas al aspecto mas largo aspecto de la cinta. Generalmente, la segunda capa de malla debe ser sustancialmente más gruesa que la primer capa de malla, con fibras de malla diámetro más largo y espacios más largos entre ellas. La segunda capa de malla tiene preferiblemente un espesor desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 µm, preferiblemente desde aproximadamente 100 a aproximadamente 150 µm. Una malla preferida para la segunda capa de malla tiene un área abierta de aproximadamente 50 a aproximadamente 55%, una cuenta de fibra de desde aproximadamente 45 a aproximadamente 55 por cm, y un diámetro de fibra de desde aproximadamente 55 a aproximadamente 65 µm. Una malla preferida para la segunda capa de malla es la malla NY 151 HC, disponible también de Sefar, CH-8803, Rushchlikon, Suiza. Como es el caso con la capa de malla 10, cualquier material tejido o no-tejido puede ser usado, siempre que este no ocluya la superficie del electrodo de manera que la difusión normal de la muestra se obstruye. La capa de malla 1 1 también se proporciona preferiblemente con un revestimiento de un agente tensoactivo (al menos la malla por si misma es hidrofílica), preferiblemente el mismo agente tensoactivo como aquel usado para revestir la primera capa de malla. La carga del agente tensoactivo es más baja sobre la capa de malla 1 1 que sobre la capa de malla 10, mediante lo cual se provee una barrera adicional al movimiento de la muestra, pasando las fibras transversas de la malla 1 1 . En general, una carga de agente tensoactivo de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 µm/mg de malla se prefiere. La carga de agente tensoactivo puede determinarse empíricamente, al observar el flujo de la muestra a través de la capa de malla 1 1 con diferentes niveles del agente tensoactivo. Las capas de malla 10 y 1 1 se mantienen en su lugar por capas de tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12. Estas capas de tinta eléctricamente aislante 12 son preferiblemente aplicadas por impresión en pantalla de la tinta sobre una porción de las periferias de las capas de malla 10 y 1 1 . Juntas, las capas de malla y las capas de tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12 rodean y definen una trayectoria de muestra 13 adecuada para que la muestra pase desde la posición en la cual la muestra se introduce a un extremo de la cinta hacia el electrodo de trabajo 5 ( y el electrodo simulado 5a, cuando se usa) y el electrodo seudo de referencia/contrario 4. La tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12 impregna las capas de malla por afuera de la trayectoria de muestra 13. La tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12 define así la trayectoria de muestra, al prevenir que muestra infiltre las porciones de las capas de malla cubiertas por las capas de tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12. Una tinta eléctricamente aislante, hidrofílica 12 preferida para impregnar las capas de malla es "SERICARD" (Sericol, Ltd. Bradstairs, Kent, RU). Las superficies de los electrodos que no están en contacto con el soporte de electrodo 1 se encierran por una membrana de cubierta impermeable al líquido 14. Esta membrana 14 puede ser una cinta flexible hecha de poliéster o un material similar. La membrana 14 incluye un orificio pequeño 1 5 que permite el acceso de la muestra aplicada a las capas de malla subyacentes 1 0 y 1 1 . Esta membrana impermeable al líquido 14 encierra las superficies expuestas del electrodo de trabajo 5 (y el electrodo simulado 5a, cuando se usa) y el electrodo de seudo referencia/contrario 4. De esta manera, la membrana 14 mantiene el espacio de muestra disponible sobre los electrodos a una profundidad fija, la cual es equivalente al espesor de ambas capas de malla. La colocación de esta membrana 14 asegura que la resistencia de la muestra se mantiene a un alto nivel. Cualquier profundidad de la muestra, hasta la máxima profundidad de dos capas de malla, es adecuada para esta invención. El orificio 15 se coloca para cubrir un extremo del área de malla removida del electrodo seudo de referencia/contrario 4, de manera que el área de malla expuesta debajo del orificio 15 puede ser usado como un punto de acceso o aplicación para una muestra de liquido. Por supuesto, el orificio 15 debe cubrir un extremo del área de malla que no esta cubierta por la de tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12. El tamaño de este orificio 15 no es critico, pero este deberá ser suficientemente largo para permitir que suficiente volumen de la muestra pase a través de las capas de malla. El orificio 15 no debe ser muy largo como para permitir que cualquier porción de la muestra del liquido este en contacto con cualquiera de los electrodos antes de contactar una capa de la malla. El orificio 15 puede ser formado en la membrana de cubierta impermeable al líquido 14 por cualquier método adecuado (por ejemplo, perforación por troquel). La membrana de cubierta impermeable al líquido 14 que puede ser fijado por la cinta biosensora por medio de un método adecuado de adhesión. Preferiblemente, la fijación se logra, al revestir el lado de debajo de la cinta flexible con una capa de pegamento caliente derretido, y después termo-soldar la cinta a la superficie de la capa de tinta eléctricamente aislante, hidrofóbica 12. La capa de pegamento caliente derretido tiene típicamente un peso de revestimiento desde aproximadamente 10 a aproximadamente 50 g/m2, preferiblemente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 g/m2. Los adhesivos sensibles a la presión u otros métodos equivalentes de adhesión también pueden utilizarse. Debe tenerse cuidado cuando la cinta se aplica, porque el calor y la presión aplicadas a ia capa de cinta pueden derretir la tinta "SERICARD" y pueden causar que manche las áreas circundantes. Debe tenerse cuidado de manera que la cinta no cubra los electrodos, la trayectoria de muestra 13, o la misma área de aplicación. La superficie superior de la membrana de cubierta impermeable al líquido 14 también puede proporcionarse con una capa de silicón u otro material hidrofóbico. Esta capa adicional sirve para manejar la muestra aplicada sobre la porción de capas de malla expuestas en el punto de aplicación de la muestra, convirtiendo así a la aplicación de pequeños volúmenes de la muestra mucho más simple.

En uso, una cinta biosensora de esta invención se conecta, a través de los contactos de electrodo 3, a un dispositivo de medición (no mostrado). Una muestra de líquido se aplica a través del orificio 1 5 y la muestra se mueve a lo largo de la trayectoria de muestra 13. El progreso de la muestra se impide suficientemente por la capa de malla 1 1 , permitiendo así que la muestra forme un frente de flujo uniforme. El aire se desplaza a través de la porción superior de la capa de malla 1 1 hacia y a través del orificio 15. La primer muestra cubre completamente el electrodo de trabajo 5 (y el electrodo simulado 5a cuando se usa), y únicamente entonces se acerca y cubre el electrón seudo de referencia/contrario 4, complementado así el circuito y causando que una respuesta se detecte por el dispositivo de medición. Los siguientes se proponen para ser ilustrativos y no limitantes de la invención, Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra el efecto de las áreas auxiliares en respuesta de glucosa. Los grupos de cintas biosensoras que tienen las configuraciones mostradas en las Figuras 3A a 3E se produjeron. Un grupo de cintas de control que tienen la configuración mostrada en la Figura 4, se produjo. Los grupos se probaron para los errores de declinación de corriente no monótona por medio de un medidor de glucosa apropiado con el cual los electrodos fueron compatibles. La concentración de glucosa fue 30 mM. Los resultados de esta prueba se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Cada una de las cintas biosensoras que tuvieron área auxiliar (Figuras 3A a 3E) tuvieron un porcentaje inferior de error que el Control (Figura 4). Entre las cinco configuraciones de áreas auxiliares diferentes probadas, el área auxiliar más pequeña (Figura 3B) tuvo el porcentaje de error inferior. Las transitorias originadas pueden conducir a lecturas erróneas.

Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra el efecto de las áreas auxiliares en corrientes transitorias. Las cintas de los grupos de cinta biosensora y cintas del grupo de control se contactaron con las muestras sanguíneas que contienen aproximadamente 15 mM de glucosa. Las transitorias de declinación en tiempo de la corriente típica se recolectaron del electrodo de trabajo 5 y el electrodo simulado 5a bajo las mismas condiciones de prueba como se utilizaría por un medidor de glucosa apropiado por estas cintas. Las transitorias se muestran en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 es a i *. ,'.a -. < a it una gráfica que ilustra las transitorias obtenidas del electrodo de trabajo.

La Figura 6 es una gráfica que ilustra las transitorias obtenidas del electrodo simulado 5a. En las Figuras 5 y 6, las curvas para las transitorias de las diversas configuraciones de electrodo se establecen en la Tabla 3. TABLA 3 Las curvas en las Figuras 5 y 6 muestran que las configuraciones mostradas en las Figuras 3A a 3E tuvieron un impedimento de corriente más largo que el control y una corriente de respuesta mejorada en comparación con aquella del control, es decir, la corriente de respuesta no es monótona. Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra el efecto de las áreas auxiliares en la precisión del nivel de glucosa medido. El efecto de tener un área auxiliar impresa sobre la superficie de carbono puro normalmente expuesto de los electrodo de trabajo y simulado también ayuda a controlar la corriente antecedente variable, que puede originarse de la oxidación/reducción en la superficie de carbono. La corriente antecedente variable se causa por la tinta impresa en el área auxiliar. También, la magnitud de la corriente generada de la oxidación de la especie de redox en la tinta simulada es mucho más larga que aquella de la corriente antecedente variable. El control de la corriente antecedente variable mejora la precisión de cualquier resultado de glucosa reportado obtenido de estas cintas, debido a que la corriente se origina de las áreas de carbono expuestas pueden variar de cinta en cinta, y la corriente también puede variar entre las señales del electrodo de trabajo 5 y el electrodo simulado 5a de la misma cinta. El efecto en ia mejora de precisión variará dependiendo de la calidad y el pre-tratamiento del carbono utilizado para fabricar estas cintas; el carbono de baja calidad experimentará la mayor mejora en precisión, mientras que el carbono de buena calidad experimentará menos de una mejora. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Otras modalidades se encuentran dentro del alcance de las .. ««Máa ^> reivindicaciones. Por ejemplo, la celda electroquímica puede tener una capa de muestra delgada que tiene una capa de malla sencilla. La celda puede emplear volúmenes pequeños de muestra para medir los analitos en la muestra. Además, en el caso de analizar las muestras de sangre, la sensibilidad hematocrítica de la celda se mejora. La capa sencilla de malla puede tener un espesor desde aproximadamente 100 µm hasta aproximadamente 300 µm. Mas preferiblemente, la capa de malla tiene un espesor de aproximadamente1 50 µm. Además, las áreas de contacto de muestra del electrodo de trabajo 5 y el electrodo simulado 5a pueden ser igualadas. La igualación de las áreas de contacto de muestra de los electrodos incrementa la exactitud y precisión de las mediciones de concentración de analito, al equilibrar la respuesta antecedente de cada electrodo. Las áreas de contacto de muestra de los electrodos pueden ser igualadas, al restringir el grado al cual las capas aislantes de cobertura se colocan sobre las capas conductivas de los electrodos. La igualación de las áreas de contacto de muestra puede lograrse al reducir el ancho de las capas conductivas de los electrodos e incrementar el ancho de la región de exposición del electrodo de las capas aislantes de tal manera que se evita o minimiza la cobertura de la capa aislante con las capas de electrodo conductivas subyacentes. La configuración en la cual no existe cobertura entre las capas conductivas y las capas aislantes puede incrementar la tolerancia de registro de las capas aislantes, minimizando así esta fuente de imprecisión. La configuración puede simplificar el proceso de producción de electrodo al permitir mayor tolerancia durante el registro de las diferentes capas que contribuyen a la exposición de las bandas conductivas. Varias modificaciones y alteraciones de esta invención será aparentes para aquellos expertos en el la materia sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención, y debe entenderse que es invención no se limita indebidamente a las modalidades ilustradas expuestas en la presente. i ^^ . . , ..... *,... .. . .. ... ,-A..., ..i-^*- »»-JM- .i? J A***** . . . . . .. . « - l^mmfkíl ^M

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Una celda electroquímica que comprende un primer electrodo, dicho primer electrodo comprendiendo: una primer área de trabajo, dicha primer área de trabajo comprendiendo una tinta de trabajo; y una primer área auxiliar, dicha primer área auxiliar comprendiendo una primer tinta simulada, en donde: dicha tinta de trabajo comprende una enzima y un primer mediador de redox; y dicha primer tinta simulada comprende una especie de redox pero carece de una enzima. 2. La celda electroquímica según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además un electrodo seudo de referencia/contrario. 3. La celda electroquímica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha primer área auxiliar se localiza mas cerca de dicho electrodo seudo de referencia/contrario que dicha primer área de trabajo. 4. La celda electroquímica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha primera área de trabajo es mas larga en área que dicha primer área auxiliar. 5. La celda electroquímica según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además un segundo electrodo, dicho segundo electrodo comprendiendo: una segunda área de trabajo, dicha segunda área de trabajo comprendiendo una segunda tinta simulada; y una segunda área auxiliar, dicha segunda área auxiliar comprendiendo dicha primer tinta simulada, y en donde dicha segunda tinta simulada comprende dicho primer mediador de redox pero carece de una enzima. 6. La celda electroquímica según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha segunda área auxiliar se localiza mas cerca de dicho electrodo seudo de referencia/contrario que dicha segunda área de trabajo. 7. La celda electroquímica según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha segunda área de trabajo es mas larga en área que dicha segunda área auxiliar. 8. La celda electroquímica según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha primer área de trabajo es más pequeña en área que la suma de las áreas de dicha segunda área de trabajo y dicha segunda área auxiliar. 9. La celda electroquímica según la reivindicación 5, caracterizada porque dicho primer medidor de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno y dicha especie de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno. 10. La celda electroquímica según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha enzima es oxidaza de glucosa. 1 1 . Una cinta biosensora que comprende: un soporte de electrodo; un primer electrodo colocado en dicho soporte de electrodo, dicho primer electrodo comprendiendo: una primer área de trabajo, dicha primer área de trabajo comprendiendo una tinta de trabajo; y una primer área auxiliar, dicha primer área auxiliar comprendiendo una primer tinta simulada, un segundo electrodo colocado en dicho soporte de electrodo, dicho segundo electrodo comprendiendo: una segunda área de trabajo, dicha segunda área de trabajo comprendiendo una segunda tinta simulada; y una segunda área auxiliar, dicha segunda área de trabajo comprendiendo dicha primer tinta simulada, y un electrodo seudo de referencia/contrario colocado en dicho soporte de electrodo, dicho electrodo seudo de referencia/contrario separándose de dicho primer electrodo y dicho segundo electrodo, en donde: dicha tinta de trabajo comprende una enzima y un primer mediador de redox; dicha primer tinta simulada carece de una enzima y comprende una especie de redox; y dicha segunda tinta simulada carece de una enzima y comprende dicho primer mediador de redox. 12. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha primer área auxiliar se ubica mas cerca de dicho electrodo seudo de referencia/contrario que dicha primer área de trabajo. 13. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha segunda área auxiliar se ubica más cerca de dicho electrodo seudo de referencia/contrario que dicha segunda área de trabajo. 14. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha primer área de trabajo es más larga en área que dicha primer área auxiliar. 15. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha segunda área de trabajo es más larga en área que dicha segunda área auxiliar. 16. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha primer área de trabajo es más pequeña en área que la suma de las áreas de dicha segunda área de trabajo y dicha segunda área auxiliar. 17. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicho primer mediador de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno y dicha especie de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno. 1 8. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha enzima es oxidaza de glucosa. 19. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque comprende además una capa de cobertura que define un espacio cerrado sobre dichos electrodos, dicha capa de cubierta teniendo un orificio para recibir una muestra en dicho espacio cerrado. 20. La cinta biosensora según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque comprende además al menos una capa de malla interpuesta en el espacio cerrado entre dicha capa de cubierta y dichos electrodos. 21 . Un método para elaborar una celda electroquímica, dicho método comprendiendo los pasos de: aplicar una tinta de trabajo a un primer electrodo para formar una primer área de trabajo; y aplicar una primer tinta simulada a dicho primer electrodo para formar una primer área auxiliar, en donde: dicha tinta de trabajo comprende una enzima y un primer mediador de redox; y dicha primer tinta simulada carece de una enzima y comprende una especie de redox. 22. El método según la reivindicación 21 , caracterizado porque dicha primer área de trabajo es más larga en área que dicha primer área auxiliar. 23. El método según la reivindicación 21 , caracterizado porque comprende además los pasos de: aplicar una segunda tinta simulada a un segundo electrodo para formar una segunda área de trabajo; y aplicar dicha primer tinta simulada a dicho segundo electrodo para formar una segunda área auxiliar, en donde: dicha segunda tinta simulada carece de una enzima y comprende dicho primer mediador de redox. -- - — -* [ II T í lili #i?J i ÉJ 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha segunda área de trabajo es más larga en área que dicha primer área auxiliar. 25. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicho primer mediador de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno y dicha especie de redox es un ferroceno o un derivado de ferroceno. 26. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha enzima es oxidaza de glucosa. •"*—*" - - " - "-—-- MtaMMaM¡BfeMÉMM^ . «. . , ^míá,